JPH04164099A - Ｔｎｆ結合タンパク質 - Google Patents

Ｔｎｆ結合タンパク質

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JPH04164099A
JPH04164099A JP2240176A JP24017690A JPH04164099A JP H04164099 A JPH04164099 A JP H04164099A JP 2240176 A JP2240176 A JP 2240176A JP 24017690 A JP24017690 A JP 24017690A JP H04164099 A JPH04164099 A JP H04164099A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ある種の腫瘍に及ぼす出血−壊死活性の結果として発見
された腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα、カシエフチンとも称
する）およびリンフォトキシン（ＴＮＦβ）はリンフォ
カイン／サイトカインのクラスに属する２つの緊密に関
連したペプチド因子［参考文献３１であり、双方とも以
下ＴＮＦと称する［参考文献２および３参照１゜ＴＮＦ
は広範囲な細胞活性スペクトルを有する。例えば、ＴＮ
Ｆは一連の腫瘍細胞系に対して阻害または細胞障害活性
を有し［２゜３１、繊維芽細胞の増殖および骨髄細胞の
食作用／細胞障害活性を刺激し［４，５，６］　、内皮
細胞における付着分子を誘導するか、または内皮に対し
て抑制作用を示し［７，８，９，１０１、脂肪細胞にお
いて特定の酵素の合成を阻害し［１１１そして組織適合
性抗原の発現を誘導する［１２１゜これらのＴＮＦ活性
の多くは、他の因子の誘導を介するかまたは例えばイン
ターフェロンまたはインターロイキンのような他の因子
との相乗作用によりもたらされる［１３−１６１゜ ＴＮＦは一連の病的状態、例えば髄膜炎菌敗血症［１７
］、マウス自己免疫系球体腎炎の発生［１８］またはマ
ウス［１９］およびヒト［４１１の脳マラリアにおける
ショック状態に関与している。最も一般的には、内毒素
の毒性作用はＴＮＦにより媒介されていると考えられる
［２０１゜更にＴＮＦはインターロイキン−１発熱を誘
発しつる［３９１゜ＴＮＦの多面発現性の機能特性に基
づけば、ＴＮＦは他のサイトカインとの相互作用におい
て、免疫応答、炎症または他の過程のメジエータ−とし
て、付加的な病理学的状態のすべての系列に関わってい
るといえる。
これらの生物学的作用は特異的なレセプターを介してＴ
ＮＦによりは媒介されており、このため、現在の知識に
よれば、ＴＮＦαのみならずＴＮＦβも同じレセプター
に結合する［２１１゜異なる種類の細胞は、ＴＮＦレセ
プターの数が異なる［２２．２３．２４］。
このような極めて一般的に語られるＴＮＦ結合タンパク
質（ＴＮＦ−ＢＰ）は放射性標識ＴＮＦへの供存結合に
より検出され［２４−２９１、それにより、得られたＴ
ＮＦ／ＴＮＦ−ＢＰ複合体の見かけの分子量が以下のと
おり測定されている。即ち９５／１００ｋＤおよび７５
ｋＤ［２４］。
９５ｋＤおよび７５ｋＤ［２５］、　１３８ｋＤ、　９
０ｋＤ、　７５ｋＤおよび５４ｋＤ［２６１，１００±
５ｋＤ［２７］、　９７ｋＤおよび７０ｋＤ［２８］お
よび１４５ｋＤ［２９］。かかるＴＮＦ／ＴＮＦ−ＢＰ
複合体の１つは抗−ＴＮＦ抗体免疫アフィニテイクロマ
トグラフィーおよび調製用ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により単離できた［
２７１゜この複合体の還元的分解および続＜　ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により、ＴＮＦ結合活性に関して試験対象
とならなかった幾つかのバンドが得られた。複合体の分
解に用いなければならなかった特定の条件が結合タンパ
ク質を不活性化させるため［３１］、後者方法もまた不
可能であった。ヒトの血清または尿からのイオン交換ク
ロマトグラフィーおよびゲル濾過（分子量範囲５０ｋＤ
）による可溶性ＴＮＦ−ＢＰの分離は０１ｓｓｏｎ等［
３０１により報告されている。
Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ等［３２１は、ＴＮＦ　ａ−リガン
ドアフィニティクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣによ
り、ＨＬ、。
細胞の膜抽出物から、ＴＮＦ−ＢＰ富化調製物を得てお
り、これをＴＮＦ−ＢＰに対するモノクローナル抗体の
生産のための抗原調製物として使用した。かかる固定化
された抗体（免疫アフィニティクロマトグラフィー）を
用いることにより、ＬｏｅｔｓｃｈｅｒとＢｒｏｃｋｈ
ａｕｓ　［３１］は、ＴＮＦ　ａ−リガンドアフィニテ
ィクロマトグラフィーおよび）ＩＰＬｃを用いてヒト胎
盤の抽出物からＴＮＦ−ＢＰに富む調製物を得ており、
これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、３５ｋＤに強く
広いバンド、約４０ｋＤに弱いバンド、そして５５ｋＤ
〜６０ｋＤの領域に非常に弱いバンドを示した。さらに
、このゲルは３３ｋＤ〜４０ｋＤの範囲にタンパク質バ
ックグラウンドじみを示した。しかしながら、このよう
にして得られたタンパク質バンドの意義は、使用された
出発物質（胎盤組織：幾つかの胎盤から得られた混合材
料）の非均質性を考慮すると、はっきりしなかった。
本発明の目的はＴＮＦ（ＴＮＦ−ＢＰ）に結合する均質
な形態の不溶性タンパク質、即ち例えばタンパク質また
はいわゆるレセプター、およびその可溶性または不溶性
断片、並びに生理学的に適合性のあるその塩である。好
ましいタンパク質は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によれば、見かけの分子量的５５ｋＤ。
５１ｋＤ、　３８ｋＤ、　３６ｋＤおよび３４ｋＤまた
は７５ｋＤおよび６５ｋＤ。
特に５５ｋＤおよび７５ｋＤを特徴とするタンパク質で
ある。さらに、下記に示すアミノ酸部分配列（ただしＸ
は明確に判定できなかったアミノ酸残基を示す）の少な
くとも１つにより特徴付けられるタンパク質が好ましい
。
（ＩＡ）　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｌ）−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｎ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（ＩＢ）　Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ（ＩＩＡ）　Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ（ＩＩＢ）　Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ　　　−（ＩＩＣ）　Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａ　
１ａ−Ｓｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１
ｕ−Ａ　１ａ（ＩＩＤ）　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ（ＩＩＥ）　Ｉｌｅ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ （ＩＩＰ）　Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＩＩＧ
）　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ａｓｐ（ＩＩＨ）　Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ−
Ｉｌｅ−Ｘ−Ａｌａ−Ｐｒｏ 現在の技術水準では、ＴＮＦ−ＢＰは既にＮ−末端部分
配列により特性決定されており　［欧州特許出願公開３
０８３７８号］、それによれば、この配列は本発明の式
（ＩＡ）のＮ末端部分配列とは異なる。さらに、現在の
技術水準において記載されているＴＮＦ結合タンパク質
は、可溶性、即ち膜以外に結合したＴＮＦ−ＢＰであり
そして尿から単離された膜結合即ち不溶性ＴＮＦ−ＢＰ
ではない。
本発明によるＴＮＦ−ＢＰの単離方法もまた本発明の目
的の一つである。この方法は、本質的に以下の精製工程
、即ち、細胞または組織抽出物の調製、免疫アフィニテ
ィクロマトグラフィーおよび／または単一または複数リ
ガンドアフィニティクロマトグラフィー、高分解液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および調製用ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を
順次行なうことを包含する。
現在の技術水準で知られている個々の精製工程の組合せ
が本発明の方法を成功させるための必須要件であり、こ
のため解決すべき問題点に関して個々の工程は変更およ
び改良されている。即ち、例えば、ヒト胎盤からＴＮＦ
−ＢＰを富化させるために本来用いられた免疫アフィニ
ティクロマトグラフィー／ＴＮＦαリガンドアフィニテ
ィクロマトグラフィー工程の組合せ［３１を、ＢＳＡ−
セファロース４Ｂプレカラムを用いることにより変更を
加えである。
細胞または膜の抽出物を適用するために、このプレカラ
ムを順次、免疫アフィニティカラム、次にリガンドアフ
ィニティカラムに連結した。抽出物の適用の後、２つの
上記したカラムを結合させ、それぞれ溶離しそしてＴＮ
Ｆ−ＢＰ活性フラクションをリガンドアフィニティカラ
ムで再度精製した。逆相ＨＰＬＣ工程を実施するために
界面活性剤含有溶媒混合物を使用することが本発明にと
って必須要件である。
更に、ＴＮＦ−ＢＰを単離できる哺乳類細胞を高い細胞
密度で調製するための工業的方法もまた本発明の目的で
ある。かかる方法は、使用される細胞系に特異的な増殖
要件に合せて開発された培地を例えば実施例２に詳細に
記載する潅流装置と組わ合せて用いることを包含する。
かかる方法により、例えばＭＬ−６０細胞の場合通常よ
り２０倍以上までの高い細胞密度を生成できる。
これらに加え本発明はまた、ＴＮＦに結合するタンパク
質およびその可溶性または不溶性断片をコードするＤＮ
Ａ配列にも関する。ここで、例えば、ＴＮＦに結合する
不溶性タンパク質またはその可溶性および不溶性断片を
コードするＤＮＡ配列とは、下記より選択されるＤＮＡ
配列であると理解されたい。
（ａ）　　第１図または第４図に示されるＤＮＡ配列、
およびその相補鎖、またはこれらの配列を含有する配列
； （ｂ）　　（ａ）項で定義された配列とハイブリダイズ
するＤＮＡ配列またはその断片； （ｃ）　　遺伝暗号の縮重ゆえに上記（ａ）項および（
ｂ）項で定義した配列とハイブリダイズしないが、厳密
に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列。
即ち、本発明は対立変種のみならず、第１図または第４
図に示す配列の１つまたはそれ以上のヌクレオチドから
欠失、置換および付加により生ずるＤＮＡ配列をも包含
し、従って、これらによりコードされるタンパク質の場
合、前記と正に同様にＴＮＦ−ＢＰも意図される。かか
る欠失により生じる配列の１つは、例えば５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２４８．１０１９−１０２３（１９９０）に記載さ
れている。
見かけの分子量的５５ｋＤを有するかかるタンパク質を
コードするＤＮＡ配列が第１番目に好ましいものであり
、従って第１図に示す配列が特に好ましく、かかるタン
パク質の不溶性および可溶性断片をコードする配列も好
ましい。例えば、ががる不溶性タンパク質断片をコード
するＤＮＡ配列は、第１図に示す配列のヌクレオチド−
１８５から１１２２に及んでいる。可溶性タンパク質断
片をコードするＤＮＡ配列は、例えば、第１図に示す配
列のヌクレオチドの−１８５から６３３までまたは−１
４から６３３に及ぶ配列である。約７５／６５ｋＤのタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列も好ましく、従って第
４図に示すｃＤＮＡ部分配列を含有するものも好ましい
。この場合特に好ましいＤＮＡ配列はヌクレオチド２〜
１，１７７の読み枠の配列である。ペプチドＨＡ、　　
ＩＩＣ，ＩＩＥ。
ＩＩＦ、　ＩＩＧおよびＩＩＨは、第４図のｃＤＮＡ部
分配列によりコードされており、実験的に決定されたア
ミノ酸配列における有意でない偏りは気相配列決定の限
られた分解能から生ずるｃＤＮＡＤＮＡ部分配列く可能
性が最も高い。見かけの分子量６５／７５ｋＤを有する
ＴＮＦ結合タンパク質の不溶性および可溶性フラクショ
ンをコードするＤＮＡ配列も好ましい。
かかる可溶性断片のＤＮＡ配列は、このような不溶性Ｔ
ＮＦ−ＢＰをコードする核酸配列に由来するアミノ酸配
列に基づいて決定できる。
本発明はまた、７方の部分配列がＴＮＦに結合する不溶
性タンパク質の可溶性断片をコードしており（前記参照
）、そして他方の部分配列がＩｇＧ。
ＩｇＡ、　ＩｇＭまたはＩｇＥのようなヒト免疫グロブ
リンの重鎖の不変領域の第１のドメイン以外の全ドメイ
ンをコードしているものである２つのＤＮＡ部分配列の
組合せを含有するＤＮＡ配列にも関する。
本発明はまた、かかるＤＮＡ配列によりコードされる組
み換えタンパク質にも関する。従って当然ながら、アミ
ノ酸配列中においてアミノ酸が、例えば計画的突然変異
誘発により交換されてそれによりＴＮＦ−ＢＰまたはそ
の断片の活性、即ちＴＮＦの結合またはシグナル転移に
関与しているその他の膜部分との相互作用が所望の様式
で変化または維持されているようなタンパク質も包含さ
れる。かかる分子の活性を一般的に変化させないタンパ
ク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は従来知られ
ており、そして例えばＨ，ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ，Ｌ
。
ＨｉｌｌのｒＴｈｅ　ＰｒｏｔｅｉｎｓＪ　（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９７９
、特に第６図、第１４図参照）に記載されている。最も
普通に起こる交換は、以下のとおりである。Ａｌａ／Ｓ
ｅｒ、　Ｖａｌ／ｆｌｅ、　Ａｓｐ／Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ。
Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ／Ａｓｎ、
　Ａｌａ／Ｖａｌ、　Ｓｅｒ／Ｇｌｙ。
Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、　Ｌｙｓ／Ａｒｇ、
　Ａｓｐ／Ａｓｎ、　Ｌｅｕ／Ｉｌｅ。
Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、　Ａｓｐ／Ｇｌｙお
よびこれらの逆。本発明はまた、本発明によるＤＮＡ配
列を含有しており、そして好適な原核生物および真核生
物宿主系の形質転換に適するベクターにも関し、その場
合その使用により本発明のＤＮＡ配列によりコードされ
るタンパク質の発現をもたらすベクターが好ましい。最
後に、本発明はかかるベクターで形質転換された原核生
物および真核生物宿主系、ならびに、かかる宿主系を培
養し次いで宿主系それ自体またはその培養上清からこれ
ら化合物を単離することによる本発明の組み換え化合物
の製法にも関する。
本発明はまた、所望の場合は他の医薬上活性な物質およ
び／または無毒性、不活性で治療上適合する担体物質と
組合せた、ＴＮＦ−ＢＰまたはその断片の少なくとも１
種を含有する医薬製剤にも関する。
最後に、本発明は一方では医薬製剤の製造のため、そし
て他方では好ましくはＴＮＦがその経過に関与する疾病
の治療の為のかかるＴＮＦ−ＢＰの使用に関する。
本発明のＴＮＦ−ＢＰを得るための出発物質は、膜結合
形態でかかるＴＮＦ−ＢＰを含有しそして一般的に当業
者が制限なく入手できるきわめて一般的な細胞、例えば
ＨＬ６０　［ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　２４０１．　Ｕ　
９３７　［ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ　１５９３］、　ＳＷ
　４８０　［ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　２２８］および）
ＩＥｐ２細胞［ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　２３１である。
これらの細胞は従来知られた方法［４０１で培養するか
、またはより高密度の細胞を得るためには、既に一般的
に記載されておりそしてＨＬ６０細胞に関して実施例２
で詳細に記載される方法により培養できる。次に、培地
から遠心分離により採取しそして例えばトリトンＸ−１
１４，１−０−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（オクチルグルコシド）または３−［（３−コリルア
ミドブロビル）−ジメチルアンモニウム】−１−プロパ
ンスルホネート（ｃ）ｆＡＰｓ）　、特に好ましくはト
リトンＸ−１００のような適当な界面活性剤を用いて、
従来知られた方法で洗浄された細胞からＴＮＦ−ＢＰを
抽出できる。かかるＴＮＰ−ＢＰを検出するには、ＴＮ
Ｆ−ＢＰに通常用いられる検出方法、例えば’　”　’
　Ｉ−ＴＮＦ／ＴＮＦ−ＢＰ複合体のポリエチレングリ
コールにより誘導される沈澱［２７１、特に実施例１記
載の放射性標識ＴＮＦを用いるフィルター結合試験を使
用できる。本発明によりＴＮＰ−ＢＰを調製するために
は、タンパク質、特に膜タンパク質の精製に従来用いら
れる一般的方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いることができる。本
発明によるＴＮＦ−ＢＰの調製に特に好ましい方法は、
特に固相に結合されたリガンドとしてＴＮＦ−αを用い
るアフィニティクロマトグラフィー、および免疫アフィ
ニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離されたＴ
ＮＦ−ＢＰバンドの溶離は、タンパク質化学で知られた
方法、例えばＨｕｎｋａｐ　ｉ　ｌ　ｌｅｒ等［３４１
による電気溶離方法で行なうことができるが、その際、
現在の知識によれば、そこに記載されている電気透析時
間を一般的に２倍する必要がある。
その後、なお残存している痕跡のＳＤＳはＢｏｓｓｅｒ
ｈｏｆｆ等［５０１の方法に従って除去できる。
このようにして精製されたＴＮＦ−ＢＰは現在知られて
いるペプチド化学の方法、例えばＮ末端アミノ酸配列決
定または酵素的および化学的ペプチド分解により特性決
定できる。酵素的または化学的分解により得られる断片
は、通常の方法、例えばＨＰＬＣで分離でき、そしてそ
のものを更にＮ末端配列決定に付すことができる。それ
自体ＴＮＦに結合するかかる断片は、上記したＴＮＦ−
ＢＰの検出方法を用いて同定でき、これらも同様に本発
明の目的である。
このようにして得られたアミノ酸配列の情報、または第
１図および第４図に示すＤＮＡおよびアミノ酸配列から
、遺伝暗号の縮重を考慮して、現在知られている方法に
従って、適当なオリゴヌクレオチドを調製できる［５１
１゜これら分子生物学でも知られている方法により［４
２，４３］、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡバンクを検索
して、ＴＮＦ−ＢＰをコードする核酸配列を含有するク
ローンを探索することができる。さらに、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）　［４９］を用いて、遺伝暗号を考
慮しながら２つの離れた比較的短いセグメントのアミノ
酸配列を完全に縮重させ、そしてそれらの相補的に適す
るオリゴヌクレオチドに「ブライマー」として導入する
ことによりｃＤＮＡ断片をクローニングすることができ
、これによりこれら２つの配列の間に存在する断片を増
幅し、同定できる。かかる断片のヌクレオチド配列の決
定により、それがコードするタンパク質断片のアミノ酸
配列を独立して決定できる。
ＰＣＲにより取得できるｃＤＮＡ断片はまた、オリゴヌ
クレオチドそのものについて既に記載されているように
、知られた方法により、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの
バンクから、ＴＮＦ−ＢＰをコードする核酸配列を含有
するクローンを探索するのに使用できる。
次にかかる核酸配列を知られた方法で配列決定できる［
４２１゜このようにして決定された配列および特定のレ
セプターに関して既に知られた配列に基づいて、可溶性
ＴＮＦ−ＢＰ断片をコードする部分配列を決定して既に
知られた配列に基づいて、可溶性ＴＮＦ−ＢＰ断片をコ
ードする部分配列を決定して知られた方法で完全な配列
から切り出すことができる［４２１゜ 次にこの完全な配列またはかかる部分配列を知られた方
法で、原核生物における増殖および発現に関する当該分
野で記載されているベクターに組み込むことができる［
４２１゜好適な原核生物体宿主体は例えば、ゲノム陰性
およびゲノム陽性の細菌、例えばＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌ
ｏｌ［ＡＴＣＣＮｏ、３３６９４］またはＥ、ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０［ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５］のようなＥ、
Ｃ０１ｉ株またはＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ株である。
更に、ＴＮＰ−ＢＰおよびＴＮＦ−ＢＰ断片をコードす
る本発明の核酸配列を、知られた方法を用いて、真核生
物宿主細胞例えば酵母、昆虫細胞および哺乳類細胞にお
ける増殖および発現に適するベクターに組み込むことが
できる。かかる配列の発現は、好ましくは哺乳類および
昆虫の細胞で行われる。
哺乳類細胞にとって代表的な発現ベクターは、良好な転
写速度を得るための効率の良いプロモーターエレメント
、発現すべきＤＮＡ配列、および効率の良い転写の終止
およびポリアデニル化のためのシグナルを含有する。使
用できる付加的なエレメントは、「エンハンサ−」であ
り、これは転写増強、および例えばｍＲＮＡのより長い
半減期をもたらしつる配列である。シグナルペプチドを
コードする内生配列断面が欠落している核酸配列を発現
させるには、他の知られたタンパク質のシグナルペプチ
ドをコードしている適当な配列を含有するベクターを使
用できる。例えばＣｕ１ｌｅｎ、　Ｂ、　Ｒ，によりＣ
ｅ１ｌ　４６：９７３−９８２　（１９８６）に、およ
びＳｈａｒｍａ、　Ｓ。
らにより“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　”、
Ｇｅｔｈｉｎｇ、　Ｍ、　Ｊ、編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　（１９８５）、　ｐ７３
−７８に記載されているベクターｐＬＪ２６８が使用で
きる。
哺乳類細胞における特定のＤＮＡ配列の一時的発現に用
いられるこれらベクターの大部分は、ＳＶ４０ウィルス
の複製源を含有している。ウィルスのＴ抗原を発現する
細胞（例えばＣＯ８細胞）においてこれらのベクターは
豊富に再製される。しかしながら−時的発現はＣＯ８細
胞に限−らない。原則的にすべてのトランスフェクショ
ン可能な哺乳類細胞系をこの目的に使用できる。強力な
転写をもたらすシグナルは、例えばＳＶ４０の初期およ
び後期のプロモーター、ＨＣＭＶ　（ヒトサイトメガロ
ウィルス）の「主要極初期」遺伝子プロモーターおよび
エンハンサ−、レトロウィルス、例えばＲ３Ｖ、　ＨＩ
ＶおよびＭＭＴＶのＬＴＲ（ｒ長い末端反復」）である
。しかしながら、例えばアクチンおよびコラゲナーゼ遺
伝子のプロモーターのような細胞遺伝子のシグナルも使
用できる。
しかしながら、別法として、ゲノム（染色体）に組み込
まれた特定のＤＮＡ配列を有−する安定な細胞系も得る
ことができる。このためには、ＤＮＡ配列を選択可能な
マーカー、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、ジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）またはヒポキサン
チングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇ
ｐｔ）と共に同時トランスフェクションする。染色体に
安定に導入されたＤＮＡ配列もまた豊富に再製されうる
。このための適当な選択マーカーは、例えばジヒドロ葉
酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）である。トランス感染実施
後に無傷のｄｈｆｒ遺伝子を全（含まない哺乳類細胞（
例えばＣＨＯ細胞）を、漸増量のメトトレキセートとイ
ンキュベートする。この方法により、所望のＤＮＡ配列
１０００コピー以上を含有する細胞系を得ることができ
る。
発現に用゛いることのできる哺乳類細胞は、例えばヒト
細胞系の細胞Ｈｅ１ａ［ＡＴＣＣＣＣＬ２］、および２
９３［ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３］　、ならびに３Ｔ３
［ＡＴＣＣＣＣＬ　１６３］およびＬ細胞、例えば［Ａ
ＴＣＣＣＣＬ　１４９］、　（ｃＨＯ）細胞［ＡＴＣＣ
ＣＣＬ　６１１．　ＢＨＫ［ＡＴＣＣＣＣＬ　１０１細
胞およびＣＶ　１［ＡＴＣＣＣＣＬ　７０］、およびＣ
ＯＳ細胞系［ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０、　ＣＲＬ　１６
５１１である。
適当な発現ベクターには、例えばｐＢｃ１２ＭＩ　［Ａ
ＴＣＣ６７１０９］、　ｐＳＶ２ｄｈｆｒ［ＡＴＣＣ３
７１４６］、　ｐｓＶＬ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎｌ、　ｐＲｓＶｃａｔ
［ＡＴｃｃ　３７１５２］およびｐＭＳＧ［Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎｌが包含
される。
実施例９で用いられるベクターｐＫ１９およびｐＨ１２
３が特に好ましいベクターである。これらは、これらで
形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ株１（ＢＩＯＩ（ｆｌＫ１
９）およびＨＢＩＯＩ　（ｐＨ１２３）から知られた方
法で単離できる［４２１゜これらのＥ、ｃｏｌｉ株は、
ＨＢＩＯＩ（ＰＫ１９）については０３Ｍ５７６１、そ
してＨＢｌｏｌ（ｐＨ１２３）については０ＭＳ５７６
４の下に西独ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃ
ｈｅｎ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇ
ｍｂＨ（ＤＳＭ）に１９９０年１月２６日に寄託されて
いる。不溶性ＴＮＦ−ＢＰの可溶性断片および免疫グロ
ブリン断片、即ち重鎖の最初の不変領域を除く全ドメイ
ンよりなるタンパク質の発現には、例えばＧｅｒｍａｎ
、　Ｃ。
が“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　、　ｖｏｌ、　ＩＬ　
Ｇｌｏｖｅｒ　Ｄ、　Ｍ、編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　
０ｘｆｏｒｄ、　１９８５　、に記載の特に適するｐＳ
Ｖ２−由来ベクターがある。西独Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ
ｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ
　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄＺｅｌｌｋ
ｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に寄託されており
欧州特許出願９０１０７３９３．２号に詳細に記載され
ているベクターｐｃＤ４−Ｈμ（ＤＳＭ５３１５）、　
　１）ＤＣ４−Ｈγｌ（ＤＳＭ　５３１４）およびｐＣ
Ｄ４−Ｈγ３（ＤＳＭ５５２３）が特に好ましいベクタ
ーである。この欧州特許明細書および同等の出願は実施
例１１で参照されており、これらもまた、このようなｃ
ｈｉｍａｒｙタンパク質の発現（実施例１１参照）およ
び他の免疫グロブリン断片を有するかかるｃｈｉｍａｒ
ｙタンパク質を発現させる為のベクターの構築の為にこ
れらのベクターを更に使用することに関するデータを含
んでいる。
細胞をトランスフェクションする方法は、選択された発
現系およびベクター系の如何による。これらの方法の概
略は、例えばＰｏ１ｌａｒｄ等の“ＭｅｔｈｅｄＳｉｎ
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ″中の”ＤＮＡ
　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ　Ｃｅ１ｌｓ’［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｖ
ｏｌ、２．１９８４゜Ｗａｌｋｅｒ、　Ｊ、　Ｍ、、　
Ｈｕｍａｎａ編、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ
ｓｅｙ］に記載されている。さらに別の方法は、Ｃｈｅ
ｎおよびＯｋａｙａｍａの“Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ　Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮ
Ａ”、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　７．２７４５−２７５２．１９８７、および
Ｆｅｌｇｎｅｒ　らの“Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：　Ａ　
ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ。
ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆ
ｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”。
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　８４．７４１３−７４１７゜１９８７、に記載さ
れている。
バキュロウィルス発現系は、すでに一連のタンパク質の
発現にうまく用いられているが（概説はＬｕｃｋｏｗお
よびＳｕｍｍｅｒｓのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
６：４７−５５゜１９８８参照）、これらは昆虫細胞に
おける発現に使用できる。組み換えタンパク質は真正形
態または融合タンパクとして生産できる。このようにし
て産生されたタンパク質はまた、例えばグリコジル化の
ような修飾を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ等、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　
８２：８４０４−８４０８．１９８７）。
所望のタンパク質を発現する組み換えバキュロウィルス
を生成させるには、いわゆる「転移ベクター」が使用さ
れる。この用語は強力なプロモーター、例えば多面体遺
伝子のプロモーターの制御下にあり、それによりウィル
ス配列によって両側が囲まれている異種ＤＮＡ配列を有
するプラスミドが理解されるべきである。実施例１０で
用いられるベクターｐＮ１１３、ｐＮ１１９およびｐＮ
１２４が特に好ましいベクターである。これらベクター
は、これらで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１
（１）Ｎ１１３）、ＨＢＩＯＩ（１）Ｎｌ　１９）およ
びＨＢＩＯＩ（ｐＮ１２４）から知られた方法で単離で
きる。これらのＥ、ｃｏｌｉ株はＨＢＩＯＩ（１）Ｎｌ
　１３）についてはＤＳＭ５７６２．　ＨＢＩＯＩ（１
）Ｎ１１９）についてはＤＳＭ　５７６３そしてＨＢｌ
ｏｌ（１）Ｎ１２４）についてはＤＳＭ５７６５の番号
のもとに、西独ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓ
ｃｈｅｎ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　
ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に１９９０年１月２６日に寄託され
ている。次に転移ベクターを野生型バキュロウィルスの
ＤＮＡとともに昆虫細胞にトランスフェクションする。
次に相同組み換えにより細胞中に生ずる組み換えウィル
スを知られた方法に従って同定および単離することがで
きる。バキュロウィルス発現系およびそこで用いられる
方法の概略は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓの文
献に記載されている］５２］。
次に、発現されたＴＮＦ−ＢＰおよびその不溶性または
可溶性フラクションを、タンパク質化学において従来知
られた方法、例えば前述した方法で、細胞塊または培養
上清から精製できる。
本発明により得られるＴＮＦ−ＢＰは、知られた方法［
４４，４５］または実施例３に記載される操作に従って
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成させる
ための抗原としても使用で・きる。かかる抗体、特に７
５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ種に対するモノクローナル抗体も
また、本発明の目的である。７５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰに
対する抗体は当業者によく知られた実施例４〜６に詳述
する精製操作の変法によりＴＮＦ−ＢＰの単離に使用で
きる。
ＴＮＦに対する本発明のＴＮＦ−ＢＰの高い結合アフィ
ニティ（Ｋｄ値１０−”−１０−１ｏＭ）　Ｇ、：基ツ
キ、コレラマたはその断片は、当該分野で知られた方法
により、例えば固相結合試験において、または、いわゆ
る「サンドイッチ」試験において抗−ＴＮＦ−ＢＰ抗体
と組合せて血清または他の体液中におけるＴＮＦ検出の
ための診断剤として使用できる。
更に本発明のＴＮＦ−ＢＰは当該分野で知られた操作に
従って、一方ではＴＮＦの精製に、そして他方ではＴＮ
ＦアゴニストおよびＴＮＦアンタゴニストの検出に使用
できる。
本発明のＴＮＦ−ＢＰおよび、当該技術分野で知られた
方法により製造できる生理学的に適合するその塩は、医
薬製剤、主に、その経過にＴＮＦが関与している疾病の
治療の為の医薬製剤の製造にも使用できる。この目的に
は、これらの化合物の１種またはそれ以上を所望による
かまたは必要な場合は他の医薬上活性な物質と組合せて
、通常用いられる固形または液体の担体物質とともに、
知られた方法で製剤化できる。かかる製剤の用量は、同
様の活性および構造を有する製剤で既に用いられている
ものと同様の通常の基準を考慮して決定できる。
以上のように本発明を一般的に説明したが、以下の実施
例により本発明をより詳細に説明する。
これにより本発明が制限されるわけではない。
実施例Ｉ ＴＮＦ結合タンパク質の検出 ヒト放射性ヨウ素標識１２’Ｉ−ＴＮＦを用いるフィル
ター試験でＴＮＦ−ＢＰを検出した。ＴＮＦ（４６，４
７）はＮａ”Ｊ（１ＭＳ４０．　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　
Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）およびヨード遺伝子（＃２８
６００．　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｅｕｒｏｃｈｅｍｉｅ、　０
ｕｄ−Ｂｅｉ　ｊｅｒｌａｎｄ、オランダ）を用い、Ｆ
ｒａｋｅｒおよび５ｐｅｃｋの方法［４８］に従い放射
性標識した。ＴＮＦ−ＢＰを検出するには、細胞から単
離した膜、またはそれを可溶化、濃縮および精製したフ
ラクションを湿潤ニトロセルロースフィルター（０，４
５μ、　ＢｉｏＲａｄ。
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、米国）に
適用した。次に、１％スキムミルク末金含有緩衝液中フ
ィルターをブロックし、続いて未標識ＴＮＦα５μｇ／
−を添加したバッチおよび未添加バッチの２種のバッチ
中で、５・１１０６Ｃｐ／ｒｎｌの”’Ｉ−ＴＮＰα（
０，３〜１．０−１０”ｃｐｍ／μｇ）とインキュベー
トし、洗浄しそして風乾した。結合した放射能をオート
ラジオグラフィーで半定量的に検出するか、またはガン
マカウンターで計数した。特異的”’Ｉ−ＴＮＦα結合
は、過剰量の未標識ＴＮＦ−αの存在下における非特異
的結合について補正した後に測定した。フィルター試験
における特異的ＴＮＦ−結合を種々のＴＮＦ濃度で測定
しそしてスキャッチャード分析したところ、ｋｄ値は〜
１０−１ないしは１０−”Ｍであった。
実施例２ ＨＬ−６０細胞の細胞抽出物 ２ｇ／ｉ７　ＮａＨＣＯｓおよび５％ウシ胎児血清を含
有するＰＲＭ１１６４０培地［ＧＩＢＣＯ，カタログ番
号０７４−０１８００１中、実験室規模でＨＬ６０細胞
［ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　２４０１を５％ＣＯｔ雰囲気
下培養し続いて遠心分離した。
工業的規模で高密度の細胞を得るために以下の操作を用
いた。処理容量５８Ｉ！の７５１Ａｉｒｌｉｆｔ醗酵器
（Ｆａ、　Ｃｈｅｍａｐ、スイス）中で培養を行なった
。
これには、外部循環回路に組み込まれた、膜表面積０．
３２ｒｒｆ（１カセツト当たり）を有するカセット膜シ
ステムｒＰＲＯｓＴＡＫ　Ｊ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、
スイス）を用いた。５Ｉ！／分の流量で、Ｗａｔｓｏｎ
−Ｍａｒｌｏｗポンプ６０３型を用いて培養基（第１表
）を送り込んだ。
ｒＰＲＯ３ＴＡＫ　Ｊを個々にオートクレーブ滅菌して
装置を蒸気滅菌後、２０１　Ａｉｒｌｉｆｔ醗酵器（ｃ
ｈｅｍａｐ）から出発してｆ（Ｌ−６０細胞の増殖を開
始した。接種醗酵話中における細胞培養は、慣用のバッ
チ工程で、第１表記載の培地中初期細胞濃度２Ｘ１０’
個／ｍｅで行なった。４日後、ｆ（Ｌ６０バッチを４．
９Ｘ１０’個／１ｎｌの細胞濃度で７５１！容の醗酵器
に移した。ｐＨは７．１に、ｐ０２値は２５％飽和に維
持し、ミクロ細孔フリットを通して酸素を導入した。初
期バッチ醗酵の後、２日目に細胞濃度４Ｘ１０＠個／ｍ
ｌで潅流を培地交換３０１／日で開始した。培地の濾液
側で馴化培地を除き、新しい培地を加えることにより交
換した。添加した培地には、ブリマトン（Ｐｒｉｍａｔ
ｏｎ）０．２５〜０．３５％、グルタミン５ｍＭ〜６ｍ
Ｍおよびグルコース４ｇ／Ｉ〜６ｇ／ｌを添加してあっ
た。次に潅流量を３日目および４日目には培地７２１！
７日に、そして５日目には培地１００ｊ’／日に増大さ
せた。
連続培養１２０時間後に醗酵が終了した。所定の醗酵条
件下で４０ＸｌＯ＠個ノーまでの指数増殖が起こった。
細胞数倍増時間はｌ０ＸＩＯ”個／−までは２０〜２２
時間であり、その後細胞密度の増加とともに３０〜３６
時間に増大した。全醗酵期間を通じ、生存細胞の割合は
９０〜９５％であった。次にＨＬ−６０バツチを醗酵器
中、約１２°Ｃまで冷却し、そして細胞を遠心分離によ
り回収した（Ｂｅｃｋｍａｎ遠沈器Ｊ−６Ｂ型、Ｒ。
ｔａｒ　ＪＳ　３０００ｒｇ）Ｉｎ、　　１０分、４℃
）。
（本頁以下余白） 第１表 ＨＬ−６０培地 成　　分　　　　　　　　　　　　濃度（ｍｇ＃）Ｃａ
Ｃ１ｔ（無水’）　　　　　　　　　　１１２．６４４
Ｃａ（ＮＯｘ）ｚ　　ｅ　４Ｈｔ０　　　　　　　　　
２０ＣｕＳＯ４’　５Ｈｔ０　　　　　　　　　　　　
０．４９８　”　１０−’Ｆｅ（ＮＯｘ）ｓ　’　９Ｈ
ｔ０　　　　　　　　　　　０．０２ＦｅＳＯ４＠　７
ＨｔＯＯ，１６６８ ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３３６．
７２ＫＮＯ！　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．０３０９ＭｇＣ１ｔ（無水”）１１．４４４ Ｍｇ５０４（無水）　　　　　　　　　　　６８．３７
ＮａＣ１５８０１，８ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）　　　　　　　　　１８８．４
０８ＮａＨ＊ＰＯ４”　Ｈ＊０　　　　　　　　　　　
７５ＮａｚＳｅＯｓ　　”　５Ｈ２０９，６・１０−’
ＺｎＳＯｓ　　・７Ｈ＊０　　　　　　　　　　　　０
．１７２６Ｄ−グルコース　　　　　　　　　４０００
グルタチオン（還元型）０．２ Ｈｅｐｅｓ緩衝液　　　　　　　　２３８３．２ヒボキ
サンチン　　　　　　　　０．９５４リルン酸　　　　
　　　　　　０．０１６８リボ酸　　　　　　　　　　
　　　０．０４２フエノールレツド　　　　　　　１０
．２４プトレツシン２ＨＣ１０，０３２２ ピルビン酸ナトリウム　　　　　８８ チミジン　　　　　　　　　　　　０．１４６ビオチン
　　　　　　　　　　　　０．０４６６６Ｄ−パントテ
ン酸カルシウム　　　　２．５４６塩化コリン　　　　
　　　　　　５．７９２葉酸　　　　　　２．８６ １−イノシトール　　　　　　　　１１．３２ナイアシ
ンアミド　　　　　　　２．６ニコチンアミド　　　　
　　　　０．００７４パラアミノ安息香酸　　　　　　
０．２ピリドキサールＨＣｌ２．４１２４ ピリドキシンＭＣＩ　　　　　　　　　０．２リボフラ
ビン　　　　　　　　　　０．２８７６チアミンＨＣ１
２，６６８ ビタミンＢ、　！０．２７８２ し−アラニン　　　　　　　　　　　１１．７８Ｌ−ア
スパラギン酸　　　　　　　１ＯＬ−アスパラギンＨ２
０１４，３６２ Ｌ−アルギニン　　　　　　　　　４０Ｌ−アルギニン
ＨＣ１９２，６ Ｌ−アスパルテート　　　　　　　３３．３２Ｌ−シス
チン２ＨＣ１６２，０４ Ｌ−システィンＨＣＩ−Ｈｔ０　　　　　７．０２４Ｌ
−グルタミン酸　　　　　　　　　３６．９４Ｌ−グル
タミン　　　　　　　　　７３０Ｌ−グリシン　　　　
　　　　　　　２１．５Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　
　　３ Ｌ−ヒスチジンＨＣＩ　−Ｈ２Ｏ２７，３９２Ｌ−ヒド
ロキシプロリン　　　　　　４Ｌ−イソロイシン　　　
　　　　　７３．７８８Ｌ−ロイシン　　　　　　　　
　　７５．６２Ｌ−リジンＨＣＩ　　　　　　　　　　
１０２．９Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　２１．８
９６Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　４３．５９２Ｌ
−プロリン　　　　　　　　　　　２６．９し一セリン
　　　　　　　　　　　　３１．３Ｌ−トレオニン　　
　　　　　　　５３Ｌ−トリプトファン　　　　　　　
１１．００８Ｌ−チロシン−２Ｎａ　　　　　　、　　
６９．７６Ｌ−バリン　　　　　　　　　　　　６２．
７４ペニシリン／ストレプトマイシン　　　　　　　１
０００／ｍｊ’インスリン（ヒト）　　　　　　　　５
μｇ／ＴＡｌトランスフェリン、（ヒト）１５μｇ／ｍ
ｌウシ血清アルブミン　　　　　　６７μｇ／ｍｌブリ
マトン（Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ）ＲＬ　　　　　０．２５
％（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｎｏｒ
ｗｉｃｈ　ＮＹ、　ＬＪＳＡ）プルロニックＦ６８　　
　　　　　０．０１％（Ｓｅｒｖａ、　Ｈｅｉｄｅｌｂ
ｅｒｇ、　ＦＲＧ）　　′ウシ胎児血清　　　　　　　
　　０．３−３％５％ジメチルホルムアミド、１０ｍＭ
ベンズアミジン、１００Ｕ／ｍｌアプロチニン、１０μ
Ｍロイペプチン、１μＭペプスタチン、ｌｍＭｏ−フエ
ナントロリ３．５ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライドで処理しておいた等
張リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ；　０．２ｇ＃７　ＫＣＩ、
　０．２ｇ／ＩＫ８２ＰＯ４，８，０ｇ＃７　ＮａＣ１
，２，１６ｇ＃７　Ｎａ２ＨＰＯ４”７ＨｚＯ）（以下
ＰＢＳ−Ｍと称する）で、遠沈物を洗浄した。
洗浄した細胞を、トリトンｘ−ｉｏｏ添加（最終濃度１
．０％’）　ＰＢＳ−Ｍ中、細胞密度２．５−１０”個
／ｍｅで抽出した。細胞抽出液は遠心分離（１５，００
０ｘｇ、　　１時間、　１００．ＯＯＯＸｇ、　　１時
間）により清澄化した。
実施例３ モノクローナル（ＴＮＦ−ＢＰ）抗体の生産実施例２に
より得られた実験室規模のＨＬ６０細胞培養物の遠沈上
清を１：１０にＰＢＳで希釈した。希釈した上清を製造
者の推奨に従って組み換えヒ）ＴＮＦ−ａ　［Ｐｅｎｎ
１ｃａ、　Ｄ、等、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３
１２．７２４；５ｈｉｒａｉ　Ｔ、等、　（１９８５）
　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．８０３；　Ｗａｎｇ。
Ａ、Ｍ、等、（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．
１４９）　２０ｍｇを結合させたＡｆｆｉｇｅｌ　１０
　（ＢｉｏＲａ３．カタログＮａ　１５３−６０９９）
２艷を含有するカラムに４°Ｃで加えた（流量２０．２
ｍ１１分）。４°Ｃで、まず０．１％トリトンＸ１１４
含有３３ＢＳ　２０−を用い、次にＰＢＳ　２０ｍ１７
を用いて、流量１ｍｌ／分でカラムを洗浄した。このよ
うにして富化されたＴＮＦ−ＢＰを２２℃、流量２ｍ１
１分で、１００　ｍＭグリシン、ｐＨ２，８，０，１％
デシルマルトシド４−を用いて溶離した。溶出液をＣｅ
ｎｔｒｉｃｏｎ　３０ユニツト［Ａｍ１ｃｏｎｌ中１０
μｌまで濃縮した。
この溶出液ｌＯμｌをフロイント完全アジュバント２０
μｌと混合して乳濁液とした。この乳濁液１０μｌを、
Ｈｏｌｍｄａｈｌ、　Ｒ，等の方法［（１９８５）、　
Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８３．３７９］
に記載される操作に従い、第０日、７日および１２日目
に、麻酔下のＢａ１ｂ／ｃマウスの後足に注射した。
免疫化されたマウスを１４日に層殺し、膝窩リンパ節を
摘出し、２　ｇ／　Ｉ！　ＮａＨＣＯｓを含有するｌ５
ｃｏｖｅ培地（ｒＭＥＭ、　ＧＩＢＣＯカタログＮα０
７４−２２００）中で反復ピペッティングすることによ
り、粉砕懸濁した。Ｄｅ　Ｓｔ、　ＧｒｏｔｈおよびＳ
ｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒの変法［Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８０）、　
３５：１１に従い、リンパ節細胞５Ｘ１０’個を対数増
殖期にあるＦＡＩマウスミエローマ細胞（Ｊ、　Ｗ、　
５ｔｏｃｋｅｒ等、　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＤｉｓｃｌｏ
ｓｕｒｅ、　２１７．　１９８２年５月、　　１５５−
１５７）５　ＸＩＯ’個と融合させた。細胞を混合し、
遠心分離により回収しそしてわずかに振とうしながら室
温でｒＭＥＭ中の５０％（Ｖ／Ｖ）ポリエチレングリコ
ール２ｍｌ中に再懸濁しそして１０分分間型に振とうし
ながら［ＭＥＭｌｏｍｌをゆっくり添加して希釈した。
遠心分離により細胞を回収し、そして完全培地［ＩＭＥ
Ｍ＋２０％ウシ胎児血清、グルタミン（２，０ｍＭ）、
２−メルカプトエタノール（１００μＭ）、　１００μ
Ｍヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリンおよび１
ｃａＭチミジン（ＨＡＴ）］　２００−中に再懸濁した
。再懸濁液を９６ウ工ル組織培養皿１０枚に分注し、５
％Ｃｏ２雰囲気下、相対湿度９８％で培地交換すること
なく、１１日間３７℃でインキュベートした。
）ＩＬ６０細胞へのＴＮＦの結合に及ぼす阻害作用また
は実施例１のフィルター試験における抗原への結合に基
づいて抗体を識別した。抗（ＴＮＦ−ＢＰ）抗体の生物
活性を検出する為に以下の方法を用いた。即ち、５Ｘ１
０’個の８１，６０またはＵ９３７細胞を、濃度範囲ｌ
ｎｇ／ｍｍ１−１Ｏｎ／−のアフィニティ精製モノクロ
ーナル抗−（ＴＮＦ−ＢＰ）抗体または対照抗体（すな
わちＴＮＦ−ＢＰに対しない抗体）とともに完全ＲＰＭ
Ｉ　１６４０培地中でインキュベートした。１時間３７
℃でインキュベートした後、細胞を遠心分離により回収
し、０°ＣでＰＢＳ　４．５　ｍｌを用いて洗浄した。
これらを、未標識のＴＮＦα（前述）を添加するかまた
はしないで、０．１％アジ化ナトリウムおよび”’Ｉ−
ＴＮＦα（１０”ｃｐｍ／ｍｌ）をさらに含有する完全
ＲＰＭＩ　１６４０培地（実施例２）　１１ｎ１中に再
懸濁した。”’１−ＴＮＦαの比放射能は７００Ｃｉ／
　ミリモルであった。細胞を４℃で２時間インキュベー
トし、回収して、１％ＢＳＡおよび０．００１％トリト
ンＸ１００（Ｆｌｕｋａ）を含有するＰＢＳ４、５　ｍ
ｌを用い０°Ｃで４回洗浄した。細胞に結合した放射能
をγ−シンチレーションカウンターで測定した。抗（Ｔ
ＮＦ−ＢＰ）抗体で処理しなかった細胞の細胞結合放射
能を比較実験で測定した（約１０．０００ｃｐｍ／　５
　Ｘ　１０”細胞）。
実施例４ アフィニティクロマトグラフィー さらに精製するには、実施例３で得られたモノクローナ
ル抗（５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ）抗体（２，８■／−ゲ
ル）、ＴＮＦα（３，０■／−ゲル）およびウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ、　８．５ｍｇ／Ｔｎｌゲル）を各々
、製造者の指示書に従ってＣＮＢｒ−活性化セファロー
ス４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に共有結合させた。こ
のようにして調製したカラムに実施例２に従って得られ
た細胞抽出液を通した。このカラムは以下の順序、即ち
ＢＳＡ−セファロ−スプレカラム、免疫アフィニティカ
ラム［抗−（５５ｋＤ−ＴＮＦ−ＢＰ）抗体１、ＴＮＦ
α−リガンドアフィニティカラムの順で連結して用いた
。適用終了後最後の２つのカラムを分け、それぞれ以下
の緩衝溶液：　（１）　ＰＢＳ、　　１．０％トリトン
Ｘ−１００，１０ｍＭベンズアミジン、　　１００Ｕ／
ｍｌアプロチニン；　（２）　ＰＢＳ、　０．１％トリ
トンＸ−１００，０，５ＭＮａＣ１，１０ｍＭ　ＡＴＰ
、　　１０ｍＭベンズアミジン、　１０００／ｍｌアプ
ロチニン；および（３１ＰＢＳ、　０．１％トリトンＸ
−１００゜１０ｍＭベンズアミジン、　１０００／ｍｌ
アプロチニン１０〇−ずつを用いて洗浄した。次に免疫
アフィニティカラムおよびＴＮＦα−リガンドアフィニ
ティカラムを各々、１００ｍＭグリシンＩ）Ｈ２，５，
１００ｍＭ　ＮａＣ１゜０．２％デシルマルトシド、１
０ｍＭベンズアミジン、１０００／ｍｌアプロチニンで
溶離した。実施例１のフィルター試験で活性を示した各
カラムのフラクションを合わせ、１ＭトリスｐＨ８，０
を用いて中和した。
一方は免疫アフィニティクロマトグラフィーそして他方
はＴＮＦα−リガンドアフィニティクロマトグラフィー
のこのように合一したＴＮＦ−ＢＰ活性フラクションを
さらに精製するために、再度各々小型のＴＮＦα−リガ
ンドアフィニティカラムに適用した。次に、これら２本
のカラムを、（１）　ＰＢＳ。
１．０％トリトンＸ−１００，１０ｍＭベンズアミジン
。
１００ＬＩ／ｍｌアプロチニン、　（２Ｊ　ＰＢＳ、　
　０．１％トリトンＸ−１００，０，５Ｍ　ＮａＣ１，
１０ｍＭ　ＡＴＰ、　　１０ｍＭベンズアミジン、　１
００Ｕ／ｍｌアプロチニン、　（３）　ＰＢＳ、　０．
１％トリトンＸ−１００，（４）　５０ｍＭ　）リスｐ
Ｈ７，５，１５０ｍＭＮａＣ１，１，０％ＮＰ−４０，
１，０％デスオキシコレート。
０、１％ＳＯＳ　（５１ＰＢＳ、　　０．２％デシルマ
ルトシドの各々４０−で洗浄した。次にカラムを１００
ｍＭグリシンｐＨ２，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１，０，
２％デシルマルトシドで溶離した。各カラムから０．５
　ｍｌずつのフラクションを回収し、フィルター試験（
実施例１）で活性を示した各カラムのフラクションを合
わせＣｅｎｔｒｉｃｏｎユニット（Ａｍｉｃｏｎ、分子
量排除１０．０００）で濃縮した。
実施例５ ＨＰＬＣによる分離 実施例４で得られた活性フラクションを、０．１％トリ
フルオロ酢酸、０．１％オクチルグルコシドで平衡化さ
せておいたＣＩ／Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラム（ＰｒｏＲＰ
Ｃ。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　５Ｘ２０ａｕｎ）に、それらの
異なる調製光（免疫またはりガンドアフィニティクロマ
トグラフィー）に従って適用した。次にカラムを、０．
５−７分の流量で、同一緩衝液中アセトニトリルの直線
状グラジェント（０〜８０％）で溶離した。各カラムか
ら１．０−ずつのフラクションを回収し、各カラムから
得られた活性フラクションを合わせた（検出は実施例１
のとおり）。
実施例６ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離 実施例５により得られ、フィルター試験（実施例１）で
活性を示したフラクションを更に文献［３４１に従って
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。この目的には、試料
をＳＯ３試料緩衝液中３分間９５°Ｃに加熱し、次に５
％回収ゲルを有する１２％アクリルアミド分離ゲル上で
の電気泳動により分離した。以下の標準タンパク質即ち
、ホスホリラーゼＢ　（９７，４ｋＤ）、　ＢＳＡ（６
６，２ｋＤ）、卵アルブミン（４２，７ｋＤ）、カルボ
アンヒドラーゼ（３１，０ｋＤ）、大豆トリプシン阻害
剤（２１，５ｋＤ）およびリゾチーム（１４，４ｋＤ）
を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の見かけの分子量の測定の
為の標準物質として用いた。
上記した条件下では、免疫アフィニティクロマトグラフ
ィー溶出液のＴＮＦαリガンドアフィニティクロマトグ
ラフィーにより実施例４で得られ、そして更に実施例５
のＨＰＬＣで分離された試料については、５５ｋＤおよ
び５１ｋＤの２つのバンド、および３８ｋＤ、　３６ｋ
Ｄおよび３４ｋＤの３つの弱いバンドが得られた。Ｍｉ
ｎｉ　Ｔｒａｎｓ　Ｂｌｏｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲ
ａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、米国）を用いて、２５ｍＭ　）
リス、１９２　ｍＭグリシン、２０％メタノール中、１
００Ｖで１時間電気泳動することによりこれらのバンド
をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、　Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ、　Ｂｅｄｆａｒｄ、　Ｍａｓｓ、米国）に移した
。次にＰＶＤＦ膜をメタノール／水／氷酢酸（５０／４
０／１０容量部）中の０．１５％Ｓｅｒｖａ−Ｂｌｕｅ
（Ｓｅｒｖａ。
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、西独）でタンパク染色するか、
または、スキムミルク末でブロックし、続いて実施例１
に記載されたフィルター試験の条件に従って”Ｊ−ＴＮ
Ｐαとインキュベートし、ＴＮＦ−ＢＰ活性を育するバ
ンドを検出した。これにより、タンパク質染色で生成し
た全てのバンドが特異的にＴＮＦαに結合したことが示
された。Ｔｏｗｂｉｎ等［３８］によるウェスタンプロ
ットにおいては、これらのバンドの全てがまた、実施例
３で調製したモノクローナル抗−５５ｋＤ　ＴＮＦ−Ｂ
Ｐ抗体に結合していた。この場合、Ｎａ１２５１放射性
標識、アフィニティ精製（マウス免疫グロブリン−セフ
ァロース４Ｂアフイニテイカラム）ウサギ抗−マウス免
疫グロブリン抗体を用いた実施例１に記載の方法を用い
てこの抗体のオートラジオグラフィー検出を行なった。
免疫アフィニティクロマトグラフィー回収物の２回ＴＮ
Ｆαリガンドアフィニティクロマトグラフィーにより実
施例４で得られ、そして、実施例５のＨＰＬＣで更に分
離された試料は、上記に詳細に記載したＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよびプロット転移条件下では、２個の付加的なバン
ド７５ｋＤおよび６５ｋＤを示し、これらは共に、フィ
ルター試験（実施例１）でＴＮＦに特異的に結合した。
Ｔｏｗｂｉｎ等によるウェスタンプロット（前述）では
、これらの２つのバンドのタンパク質は実施例３で生産
された抗−（５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ）抗体とは反応し
なかった。しかしながらこれらは実施例３に従って７５
ｋＤバンドから出発して生産されたモノクローナル抗体
（抗−７５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ抗体）とは反応した。
実施例７ アミノ酸配列分析 アミノ酸配列分析には、実施例５により得られ、そして
フィルター試験（実施例１）で活性を示したフラクショ
ンを、実施例６記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件を用いるが
ただし今回は還元条件下（ＳＤＳ試料緩衝液に１２５ｍ
Ｍジチオトレイトールを添加）で分離した。実施例６と
同じバンドが見られたが、実施例６に比較してＳＤＳ−
ＰＡＧＥが還元条件下であったため、全てが約１〜２ｋ
Ｄ高い分子量を示した。次にこれらのバンドを実施例６
に従ってＰＶＤＰ膜に移し、そしてメタノール／水／氷
酢酸（５０／４０／１０容量部）中の０．１５％Ｓｅｒ
ｖａ−Ｂｌｕｅを用いて１分間染色し、メタノール／水
／氷酢酸（４５／４８／７容量部ンで脱色し、水ですす
ぎ、風乾して切り出した。Ｈｕｎｋａｐ　ｉ　Ｉ　ｌｅ
ｒ［３４１の条件を全段階に適用することにより、Ｎ末
端ブロッキングを回避した。先ず、精製されたＴＮＦ−
ＢＰを未変化のまま用いてアミノ酸配列決定を行なった
。更に配列情報を得るために、還元およびＳ−カルボキ
シメチル化［Ｊｏｎｅｓ、　Ｂ、　Ｎ、（１９８６）。
“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”Ｊ、　Ｅ、　５ｈ
ｉｖｅｌｙ編、　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃ１１
ｆｔｏｎ、　ＮＪ。
１２４−１２５１後のＴＮＦ−ＢＰを臭化シアン（Ｔａ
ｒｒ、　Ｇ、　Ｅ、前記“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ”。
１６５−１６６）、トリプシンおよび／またはブロティ
ナーゼにで分解し、そしてペプチドをタンパク質化学上
知られた方法に従って）ＩＰＬＣにより分離した。
このようにして調製された試料を次に、出口に連結され
たオンライン自動ＨＰＬＣＰＴＨアミノ酸分析基（Ａｐ
ｌ）ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　１
２０．　ＡＢｌ、　ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、　Ｃａ１ｉ
ｆ、米国）を備えた自動気相ミクロ配列決定装置（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７
０Ａ。
ＡＢ［前記）で配列決定して、以下のアミノ酸配列が決
定された。
１、５５ｋＤバンド（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に関し
：Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｘ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｔ−Ｉｌｅ。
および Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（式中Ｘは決定できなかったアミノ
酸残基を示す）２、５１ｋＤおよび３８ｋＤバンド（非
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に関し： Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ３．６５ｋＤバンド（非還元５Ｏ
Ｓ−ＰＡＧＥ）に関し：６５ｋＤバンドのＮ末端配列決
定では、２つの平衡配列が中断なく１５番目の残基まで
決定された。２つの配列の１方がユビキチン［３６，３
７］の部分配列であったため、以下の配列を６５ｋＤバ
ンドのものとした。
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（式中Ｘは決
定できなかったアミノ酸残基を示す）７５（６５）ｋＤ
ａ−ＴＮＦ−ＢＰについて更にペプチド配列を決定した
。
Ｉｌｅ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ および Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕおよび Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ および Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａおよび Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ および Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｓｐおよび Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ （式中Ｘは決定できなかったアミノ酸残基を示す）。
実施例８ 相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列決定式ＩＡのアミ
ノ酸配列から出発し、アミノ酸残基２〜７および１７〜
２３の遺伝暗号を考慮しながら、適当な相補性の相当す
る完全縮重オリゴヌクレオチド（「センス」および「ア
ンチセンス」オリゴヌクレオチド）を合成した。全細胞
ＲＮＡをＨＬ６０から単離し［４２，４３］そして最初
のｃＤＮＡ鎖をオリゴ−ｄＴプライミングまたは「アン
チセンス」オリゴヌクレオチドによるプライミングによ
りｃＤＮＡ合成キット（ＲＰＮ　１２５６．　Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　　英国）を用いて、
製造元の指示書に従って合成した。この、　ｃＤＮＡ鎖
および２つの合成縮重「センス」および「アンチセンス
」オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応に用いて
（ＰＣＲ，Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ。
Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ、米国、製造元の指示書による
）アミノ酸残基８〜１６（式ＩＡ）をコードする塩基配
列をｃＤＮＡ断片として合成した。このｃＤＮＡ断片の
塩基配列は５’−ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＡＧ
ＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣ−３″であった。このｃＤＮＡ断
片を、ヒト胎盤からのλｇｕｔ−ｃＤＮＡ遺伝子バンク
における５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰをコードするｃＤＮＡ
クローンを、知られた方法により同定するためのプロー
ブとして用いた［４２．４３］。次にこのクローンをλ
−ベクターから常法により切り出しそしてプラスミドｐ
Ｕｃ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ。
スウェーデン）およびｐＵｃ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、　Ｕｐｐｓａｌａ。
スウェーデン）およびＭ１３ｍｐ１８／Ｍ１３ｍｐ１９
バクテリオファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓ
ａｌａ、スウェーデン）にクローニングした［４２．４
３］。このｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は製造
元の指示に従い５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（Ｕ、　Ｓ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　
０ｈｉｏ。
米国）を用いて決定した。５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰに対
するヌクレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸配
列およびそのシグナルペプチド（アミノ酸−２８〜アミ
ノ酸０）を当該分野で通常のアミノ酸のような塩基に関
する略号を使用して第１図に示す。
その他の既に知られたレセプタータンパク質配列と比較
することにより、約１８０アミノ酸を含有するＮ末端ド
メインおよび２２０アミノ酸を含有するＣ末端ドメイン
を決定でき、これらはお互いに１９アミノ酸（第１図下
線部）のトランスメンブレン領域により隔てられており
、これは配列比較より明らかである仮説上のグリコジル
化部位は、第１図中、相当するアミノ酸の上に星印を付
して示した。
本質的に同様の方法を用いて、７５／６５ｋＤ　ＴＮＦ
−ＢＰ−コードｃＤＮＡ部分配列を同定したが、ここで
はゲノムヒトＤＮＡおよびペプチドＩ［Ａ由来完全縮重
１４量体および１５量体「センス」および「アンチセン
ス」オリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反
応において一次２６ｂｐ　ＣＤＮＡプローブを生成させ
た。次にこのｃ’ＤＮＡプローブをＨＬ−６０ｃＤＮＡ
ライブラリーに対して使用し、種々の長さのｃＤＮＡク
ローンを同定した。このｃＤＮＡライブラリーは、製造
元の指示に従い、単離したＩ（Ｆ６０　ＲＮＡおよびｃ
ＤＮＡクローニングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い
て調整した。かかるｃＤＮＡクローンの配列を第４図に
示し、ここでは、反復した配列決定により以下の補正が
なされる。
即ち、ｒＴＣＣＪではなく「ＡＣＣ」でコードされるト
レオニンがセリンの代わりに３−位に位置しなければな
らない。
実施例９ ＣＯ３Ｉ細胞における発現 プラスミドｐＮ１１から出発するベクターをＣＯ８細胞
での発現用に作製した。プラスミドｐＮ１１はヒトサイ
トメガロウィルスの「主要極初期」遺伝子の効率良いプ
ロモーターおよびエンハンサ−を含有している（　ｒＨ
ＣＭＶＪ　；　Ｂｏｓｈａｒｔ等、　Ｃｅ１ｌ、　４１
．５２１−５３０．１９８５）。プロモーターの後に位
置する短いＤＮＡ配列はそのプラスミド中に１か所しか
存在しない（「ポリリンカー」）いくつかの制限酵素切
断部位、特にＨｉｎｄＩ［１，Ｂａ１１．　Ｂａｍ旧お
よびＰｖｕ　Ｉ［の切断部位を含有する（配列参照）。
Ｐｖｕ　ｌｌ ５−ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡ
ＣＴＧＡＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣ−３’３−ＴＴ
ＣＧＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＡＣＴ
ＧＡＣＴＡＧＣＧＣＴＣＴＡＧ−５’これらの切断部位
の後に、全ての３つの読み枠内に３つの翻訳終止コドン
が位置する。ポリリンカー配列の後にラットプレプロイ
ンシュリン遺伝子の２番目のイントロンおよびポリアデ
ニル化シグナルが位置する（Ｌｏｍｅｄｉｃｏ等、　Ｃ
ｅ１ｌ　１８：５４５−５５８゜１９７９）。このプラ
スミドはまたＳＶ４０ウィルスの複製起点および１）Ｂ
Ｒ３２２由来断片を有しており、これがＥ、　ｃｏｌｉ
細菌にアンピシリン耐性を付与しそしてＥ、　ｃｏｌ　
ｉ内でのプラスミドの複製を可能にする発現ベクターｐ
Ｎ１２３を作製するには、このプラスミドｐＮ１１を制
限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　ＩＩで切断し、次にアル
カリホスファターゼで処理した。
次に脱ホスホリル化されたベクターをアガロースゲルか
ら単離した（Ｖｌ）。５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ−ｃＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ切断１．３ｋｂ断片の５′突出ヌクレオ
チド（実施例８参照）をフレノウ酵素を用いて充填した
。次にこの断片をアガロースゲルから単離した（Ｆｌ）
。然るのちＴ４−リガーゼを用いてＶｌとＦｌを連結し
た。次に知られた方法［４２１に従ってこの連結バッチ
でＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換した。制限
分析および知られた方法によるＤＮＡ配列決定［４２］
により、プラスミドで形質転換されそしてＨＣＭＶ−プ
ロモーターによる発現にとって正しい方向に５５ｋＤ　
ＴＮＦ−ＢＰ−ｃＤＮＡの１．３　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断
片を含有する形質転換体を同定した。このベクターには
ｒｐＮ１２３　Ｊの名称を付した。
以下の方法を用いてベクターｐＫ１９を作製した。
５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰの細胞外部分（アミノ酸−２８
〜１８２゜第１図中）をコードするｃＤＮＡのみを含有
するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により得た（Ｓａｉｋｉ等、
　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０−１３５４．１９
８５．実施例８も参照）。下記のオリゴヌクレオチドを
用いて５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰの細胞外部分をコードす
るｐＮ１２３からのｃＤＮＡを増殖させた。
（本頁以下余白） ＡＭＨＩ ５’　−ＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＴ
ＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣ−３゜５Ｐ７１８ ３’　−ＣＧＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴ
ＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣ−５
゜ これらのオリゴヌクレオチドを用いて、アミノ酸１８２
の後の翻訳終止コドン２つも導入した。このようにして
増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ　７１
８で切断し、それにより生成する突き出た末端をフレノ
ウ酵素で充填しそしてこの断片をアガロースゲルから単
離した（Ｆ２）。次にＦ２をＶｌと連結しそして全バッ
チを用いて前記したようにＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩの形
質転換を行なった。ＨＣＭＶ−プロモータによる発現に
とって正しい方向にＤＮＡ断片を含有するプラスミドで
形質転換された形質転換体をＤＮＡ配列決定（前述）に
より同定した。これから単離したプラスミドには名称ｒ
ｐＫ１９Ｊを付した。
プラスミドｐＮ１２３またはｐＫ１９によるＣＯ３細胞
のトランスフェクションはＦｅｌｇｎｅｔ等によるリボ
フエクション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４ニア４１３−７４１７．１
９８７）に従って行なった。トランスフエクション７２
時間後、ｐＮ１２３でトランスフェクションされた細胞
を”’Ｉ−ＴＮＦαとの結合に関し、知られた方法で分
析した。かくして得られた結合データ（第２Ａ図）のス
キ＋１チヤード分析［５ｃａｔｃｈａｒｄ。
Ｇ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
５１：６６０．１９４９］の結果を第２Ｂ図に示す。ｐ
Ｋ１９でトランスフェクションされた細胞の培養上清を
［サンドイッチＪ試験で調べた。この目的には、ＰＣ■
マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ａｒ
ｌｉＡｒｌｌｎ、　ＶＡ、米国）をウサギ抗−マウス免
疫グロブリン（１０μｇ／ＴＩＬＩＰＢＳ）１００μｌ
／ウエルで感作した。次に、プレートを洗浄し、そして
実施例３で抗原結合性により検出され単離されたが細胞
へのＴＮＦの結合は阻害しない抗−５５ｋＤ　ＴＮＦ−
ＢＰ抗体とインキュベート（３時間、２０°Ｃ）シた。
次にプレートを再度洗浄しそして培養上清（１％スキム
ミルク末、　５０ｍＭ）リス／塩酸ｐＨ７，４、１４０
ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＢＤＴＡ、　０．０２％アジ
化ナトリウムを含有する緩衝液Ａで１：４に希釈）１０
０μＩ！／ウエルと４°Ｃで一夜インキユベートした。
プレートを空にし、未標識ＴＮＦ　２μｇ／ｒｎｌを添
加するかまたはしないで１２″Ｉ−ＴＮＦα含有緩衝液
Ａ（１０εｃｐｍ／ｍｌ、　　１００ｔｔ　１　／ウェ
ル）と２時間４°Ｃでインキュベートした。次にプレー
トをＰＢＳで４回洗浄し、各ウェルを切り離し、γ−カ
ウンターで測定した。５つの平行トランスフェクション
（カラム＃２．　３．　４．　６および７）　、１）Ｎ
ｉｌベクターによる２つの対照トランスフェクション（
カラム＃１゜５）および１（Ｌ６０細胞溶解物を用いた
対照（カラム＃８）の結果を第３図に示す。
実施例１０ 昆虫細胞での発現 プラスミドｐＶＬ９４１（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍ
ｅｒｓ、　　１９８９゜ｒＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　Ｃａ
１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓウィルス発現ベクターによる非融合外来遺伝子
の高レベル発現Ｊ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３ｌ−
３９）に以下のとおり改変を加えてバキュロウィルス発
現系における発現を行なった。ｐＶＬ９４１中の１個の
ＥｃｏＲＩ切断部位を、ＥｃｏＲＩでプラスミドを切断
することにより除去し、５°突出末端をフレノウ酵素で
充填した。
これより得られたプラスミドｐＶＬ９４１／ＥをＢａｍ
旧およびＡｓｐ７１８で消化し、そしてベクター本体を
アガロースゲルから単離した。この断片を以下に示す配
列の合成オリゴヌクレオチドと連結した。
ＢａｍＨＩ　　ＥｃｏＲＩ　　Ａｓｐ７１８５’−ＧＡ
ＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＡＧ　　　−３゜３’
−ＧＴＣＴＴＡＡＧＴＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧ−５’連結
バツチでＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換し、オリ
ゴヌクレオチドが正しく導入されたプラスミドを含有す
る形質転換体を既知方法（前出）に従い制限分析および
ＤＮＡ配列決定により同定した。このプラスミドをｐＮ
Ｒ７０４と命名した。転移ベクターｐＮ１１３を作製す
るには、このプラスミドｐＮＲ７０４をＥｃｏ旧で切断
し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてこのよう
にして得られたベクター本体（■２）を次にアガロース
ゲルから単離した。前記したようにＥｃｏＲＩで切断し
た５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ−ｃＤＮＡの１．３ｋｂ断片
を断片■２と連結した。この連結バッチを用いて得られ
た形質転換体で、多面体プロモーターによる発現にとっ
て正しい方向のｃＤＮＡ挿入物を有するプラスミドを含
有するものを同定した（前記）。
これより単離されたベクターをｐＮ１１３と命名した。
以下の操作を用いて転移ベクターｐＮ１１９を作製した
。ｐｔＪｃ１９プラスミド中の５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ
　ｃＤＮＡの１、３　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断
片（実施例８参照）をＢａｎ　１で消化しそして以下に
示す合成オリゴヌクレオチドと連結した。
ＢａｎＩ　　　　　　　　　　　Ａｓｐ７１８５’　−
ＧＣＡＣＣＡＣＡＴＡＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣ
ＣＧＧＧＡＡ−３’３’−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＴ
ＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣ−５゜アミノ酸１８２の後の
２つの翻訳終止コドンおよび制限エンドヌクレアーゼＡ
ｓｐ７１８の切断部位を上記アダプターを用いて導入し
た。連結した後、バッチをＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１
８で消化し、部分的５５ｋＤＴＮＦ−ＢＰ断片（Ｒ３）
を単離した。さらに、同様にしてＡｓｐ７１８およびＥ
ｃｏＲＩで切断されたプラスミドＩ）ＮＲ７０４をＲ３
と連結し、そして連結バッチをＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏ
ｌに形質転換させた。部分的５５ｋＤ　ＴＮＰ−ＢＰ　
ｃＤＮＡが正しく発現されるように組み込まれたプラス
ミドを含有する形質転換体の同定はすでに記載したよう
にして行なった。これらの形質転換体から単離されたプ
ラスミドをｐＮ１１９と命名した。
以下の操作を用いて、転移ベクターｐＮ１２４の作製を
行なった。実施例９記載の５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰの細
胞外部分をコードするｃＤＮＡ断片を、実施例９記載の
ＰＣＲ技術により、特定のオリゴヌクレオチドで増幅さ
せた。この断片をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で切断
し、そしてアガロースゲルから単離した（Ｆ４）。プラ
スミドｐＮＲ７０４もまたＢａｍＨおよびＡｓｐ７１８
で切断し、そしてベクター本体（■４）を単離した（前
記）。
断片■４およびＦ４を連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯ
Ｉをこれで形質転換し、そして組換え転移ベクターｐＮ
１２４を前述のようにして同定および単離した。
以下の操作を用いて昆虫細胞をトランスフェクションし
た。転移ベクターｐＮ１１３の３μｇをＳｆ９細胞（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ　１７１１）中Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓウィルス（ＡＣＭＮＰＶ）　（ＥＰ１２７８３
９）のＤＮＡ　１μｇでトランスフェクションした。多
面体陰性ウィルスを同定しそして「プラーク」から精製
した［５２］。Ｓｆ９細胞を文献［５幼記載のようにし
てこれら組換えウィルスに再度感染させた。培養３日後
、感染した細胞を、”’ｒ−ＴＮＦαを用いてＴＮＦ−
結合に関して調べた。この目的には、トランスフェクシ
ョンされた細胞をパスツールピペットを用いて細胞培養
皿から洗い取り、そして未標識ＴＮＦα５μｇ／ｍｊ＋
の存在下、または非存在下で、”’Ｉ−ＴＮＦαｌＯｎ
ｇ／ｍｊを含有する培養基［５２１中に細胞密度５Ｘ１
０＠個／ｍｌで再懸濁し、氷上２時間インキュベートし
た。その後、純粋な培養基で細胞を洗浄しそして細胞に
結合した放射能をγ−カウンターで計数した（第２表参
照）。
第２表 未感染細胞（対照）　　　　　　６０　ｃｐｍｌ）４実
験の平均および標準偏差 実施例１１ 実施例９記載の方法と同様にして、５５ｋＤ　ＴＮＦ−
ＢＰの細胞外領域をコードするｃＤＮＡ断片をポリメラ
ーゼ連鎖反応で増幅させたが、今回はプライマーとして
以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
オリゴヌクレオチド１： ５ｔＩ ５’　−ＴＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＧＣＣＡＴ　ＡＧＣＴ
ＧＴ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＧ−３゜オリゴヌクレオチド
２： ５ｔＩ ５’　−ＡＴＡ　ＧＡＧ　ＣＴＣＴＧＴ　ＧＧＴ　ＧＣ
ＣＴＧＡ　ＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’このｃＤＮＡ断片を
、５ｓｔｌ制限切断部位であらかじめＣＤ４−ＣＤＮＡ
を除いておいたｐＣＤ４−Ｈγ３ベクター［ＤＳＭ５５
２３　；欧州特許出願９０１０７３９３．２；日本国特
許出願１０８９６７／９０　；米国特許出願５１０７７
３／９０　］中に連結した。５ｓｔｌ切断部位はベクタ
ーｐＣＤ４−Ｈγ３中では、ＣＤ４一部分配列断片の前
のみならず中および後に位置している。この構造物を、
Ｏｌ等のプロトプラスト融合法（Ｐｒｏｃｄ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　８０：８２
５−８２９．１９８３）を用いてＪ５５８ミエローマ細
胞（ＡＴＣＣＮａＴＩＢ６）にトランスフィックスした
。トランスフィクスントは、基礎培地（ダルベツコ改変
イーグル培地、ｌＯ％ウシ胎児血清、５　Ｘｌ０−’Ｍ
　２−メルカプトエタノール）中ミコフェノール酸５μ
ｇ／ｍｌおよびキサンチン２５０μｇ／ｍｌを添加する
ことにより、選択した［Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、Ｅｕ
ｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６：８５１−８５４（
１９８６）］　、　　）ランスフィックスされた細胞か
ら分泌された発現産物は、タンパク質化学の常法、例え
ばＴＮＦ−ＢＰ抗体アフィニティクロマトグラフィーに
より精製できた。特段の記載が無い限り、例えば、Ｆｒ
ｅｓｈｎｅｙ、　Ｒ，１，のｒｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆＡ
ｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓＪ　、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５
ｓ、　Ｉｎｃ、、　ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８３）記載の
標準操作を用いて、使用細胞系の培養、クローニング、
クローン化細胞の選択または増殖を行なった。
（本頁以下余白） ケ献 り、　　Ｇ、Ｅ、ＮｅｄｗＬｎ、　　Ｓル、Ｎａｙｌｏ
【、Ａ、Ｙ、Ｓａｋａｇｕｅｈｉ。Ｄ、　　５ａｉｔｈ
、Ｊ。
Ｊａｔｔ＠ｔｔ−Ｎｅｄｗｌｎ、ｏ、ｐｅｎｎｌｃａ、
ｏ、ｖ、ＧｏａｄｄａｌＪしＪｌ、＆Ｐ、Ｗ。
Ｇｒａｙ：　Ｎｕｃｌ、　　ＡｃＬｄ＋　Ｒｅｇ、　　
１，１．　６１６１．　１９８５２、　　９．Ｂａｕｔ
ｌｅｆろＪ／Ａ八、ＣａｔａｒａＬ：　　Ｎｅｔ、＋　
Ｅｎｇｌａｒｕｌ　Ｊ、Ｍｅｄ、　　ユλゑ。
コア９．　１９８７ ３、　　Ｌ、Ｊ、　Ｏｌｄ：　　Ｓｃｉ＠ｎｃｅ　ｌ護
Ｌ６３０．　１９８５４、　　Ｇ、　Ｔｒｌｎｅｈｌｓ
ｃＬ、　　Ｍ、　　Ｋａｂａｙａ＠ｈ１．　　Ｍ、　　
Ｒｏｓｅｎ、　　Ｒ，Ｔ、ｏｕｄｏｎ、　Ｍ。
ＭｕｒｐｈｙろＪｌ＜Ｂ、　Ｐｅ【ｕｓｓｌａ：　Ｊ、
　１１Ｘｐ、　Ｍｅｄ、　月ホ、１２０６．　１９８６
Ｓ、　　Ｊ、　Ｖｌｌｃｅｋ、　Ｖ、Ｊ、　Ｐａ１ｏ＋
５ｂｅｌｌａ、　Ｄ、　Ｈｅｎｔｌｋｍｅｎ−ｄｅ　１
５ｔｅｆａｎｏ。
Ｃ，ｆｉｗｅｎｓｏｎ、Ｒ，Ｆｅ１ｒａ＋ａｎ、Ｍ、Ｈ
ｌｔａｌＪよｔｃ　Ｍ、Ｔｇｕｊｌｍｏｔｏ：　　Ｊ。
ｅｘｐ、Ｍａｄ、ＩＪｌ、６３２．１９１１６６、　　
Ｂ、Ｊ、　　ｓｕｇａｒｎａｎ、！１．＋１．　Ａｇｇ
ａ【ｗａｌ、　　Ｐ、Ｅ、　Ｈａｌｌ、　　１．５．　
　Ｆｉｇａｒｉ。
Ｍ、Ａ、　Ｐａ１ｌａｄｌｎｏ　４Ｊｔ（Ｈ，Ｈ，Ｂｈ
ｅｐａｔｄ：　　５ｃｌｓｎｃ＠１Ｊｆ１．　９４１．
　１９１１ｓ７、　　Ｊ、Ｒ，Ｇａｍｂｌｓ、Ｊ、Ｍ、
Ｈａｃｌａｎ、Ｓ、Ｊ、ＫＬｅｂａｎｏＥＥ　ＩＪびＭ
、Ａ。
Ｖａｄａｓ：　　Ｐｃｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｅｔ、　　ＵＳＡ　　８２．　８６６７、　
１９１１５８、　　Ｎ、　　５ａｔｏ、Ｔ、ｃｏｔｏ、
に、Ｈａ【ａｎａｋａ、？Ｊ、５ａｔｏＩ＋ＩＬ、Ｈ，
ＮａｒＬｕｃｈｌＹ、　Ｎａｎｏ、’１（１（Ｙ、　　
Ｓａｗａｓａｋｌ：　Ｊ、　　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅ
ｒ　　Ｉｎ５ｔ、　　７６゜１１１３、　１９８６ ９、　　Ａ、）１．　５ｔｏｌｐｅｎ、　　Ｅ、Ｃ，Ｇ
ｕｉｎａｎ、　　Ｗ、　　Ｆｌｅ＋：ｓ　ＨＩＩＪｌＳ
、Ｐｏｂｅｃ：Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、　　ｂａ、１
６．１９８６１Ｑ、Ｊ、Ｓ、ＰＯｂｅＣ，Ｌ、八、Ｌａ
ｐｉｅｒｒｅ、Ａ、Ｈ，５ｔｏｌｐｅｎ、Ｔ、Ａ、Ｂｒ
ｏｃｋ。
Ｔ、Ａ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　％４．Ｆｉｅｃｓ、Ｍ、
Ｐ、Ｂｅｖ（ｌａｅｑｕａ、Ｄ、Ｌ。
Ｍｅｎｄ【ｉｃｋ　　４Ｊｚ；Ｍ、Ａ　　ＧＬｍｂｔｏ
ｎｅ＋　　Ｊ、　　１ｍ１Ｉｕｎｏ１．　　ＩＪ３．、
　３コＩＪ、　　１９８）１１、Ｍ、　　にａｗａｋａ
＋＋＋１．ｐ、Ｐａｋａｌａ、Ｍ、Ｌ、ａｎ＠Ｊｌ’Ｊ
Ｚｌｌ’Ａ、Ｃ＠ｔａｍＬ＋　　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｊ７．　９１
２．　１９８２１２　　丁、　Ｃｏ１１ｌｒｕ＋、　Ｌ
、Ａ、　Ｌａｐｌｅｒｒｅ、％４．　Ｆｉｓ【ｓ、　Ｊ
ル、　ＢｔｒｏｍｌｎｇｅｒＪｌｌＪ、！ｌｉ　　　Ｐ
ｏｂｅｒ：　　Ｐｔｏｅ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ
　　　Ｓｅ１．　　ＵＳＡ　　８３．　４４６゜１１　
ＧＩＬＬ’ｌ　　Ｗｏｎｇ　ＬＪムＤ、’Ｊ、Ｇｏａｄ
ｄｅｌ：　　Ｎａ１ｔｅ　３２３．ｆｌ１９．１９８６
１４、　　Ｊ、Ｗ　　　しｏｗｅｎ乞ｈａｔ、　　Ｄ、
Ｗ、Ｂａ１ｌａｃｄ、　　Ｅ、　　ＢｄｈｎｌｅＬｎ　
Ｊｙ’Ｊ９１　Ｗ、Ｃ。
Ｇｒｅｅｎｅ：　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　８６．　２］コＬ、
　　１９１＋９１５、　Ｍ、ｊ、　Ｌｅｎａｒｄｏ、　
Ｃ，Ｍ、　Ｆａｎ、　Ｔ、　ＭａｎＬａｔｔｓ　ＪＩｔ
ＸＤ、　Ｂａ１ｔｌｎ＋ｏｔｅ：Ｃｅ１ｌ　５７．２ｅ
７．１９８９ １６、　Ａ、Ｅ、　Ｇｏｌｄ［ｅｌｄ　ＡＪＬＡＴ、　
Ｍａｎｄａｔｅｓ：　Ｐ【ｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｅｔ。
ｕｓＡ　　並、　　１４９０．　１９８９１７、　Ａ、
　Ｗａａｇｅ、　Ａ、　ｕａｔｓｃｅｕｒｅｎ　ｊ５Ｊ
ｖ：　Ｔ、　Ｆ：５ｐｅｖｌｋ：　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｆ
ｅｂｒ。
１４、　１９８７．３５５゜ １Ｂ、Ｃ，Ｏ，ＪａｃｏｂＩＩ７１１＜’Ｈ，Ｏ，Ｍｃ
ＤｅｖＬｔｔ：Ｎａｔｕｒｅ２≦１−１．３５６．１９
８８１９、０．Ｅ、　Ｇ【ａｕ、　Ｌ、Ｆ、　ＦａＪａ
ｒｄｏ、　　Ｐ、　Ｐｉｇｕａｔ、　　Ｂ、　Ａ１１ｎ
ｅ、　Ｐ。
Ｌ、ａｒａｂｅｃｔ　ｈ（ｖ：Ｆ’、　Ｖａｉｓａｌｌ
ｌ：　５ａｌｅｎｃｓ　ｊＪｌ、　　１２１０．　１９
８７２０、　Ｂ、　Ｂｅｕｔｌ＠ｃ、　１．％４．　Ｍ
ｉｌｇａｔｋ　ＪｊｌｒＡ、Ｃ，ＣｓｒａｍＬ：　１ｉ
ａｌｅｎｃｅ　ｔｌ。
１１６９、１９８５ ２１、Ｂ、！１．　ＡｇｇａｒｗａＬ、　Ｔ、Ｅ、　Ｅ
ｅｓｇａｌｕ　Ｊ、ＪｄＰ、Ｅ、　）ｌａｍｓ＋　Ｎａ
Ｌｕ【ａ　３Ｌ８゜６６５、　１９１１５ ２２、　Ｍ、　Ｔｓｕｊｌｍｏｊｏ、　Ｙ、に、　Ｙｌ
ｐ　ＦｉＪＩＡ’Ｊ、　ＶＬｌｃｅｋ：　Ｐ（ＱＣ，Ｎ
ａ１ｌ。
Ａｃａｄ、ＳｃＬ、　ＵＳＡ　８２．　７６２６．　１
９１１５２３、　Ｃ，ＢａｇｌＬｏｎｉ、　ｓ、　Ｍｃ
Ｃａｎｄｌｅｇｓ、　Ｊ、τａｖｅｒｎＬｓ＋＋：　８
Ｉ〆Ｗ、　Ｆｉｓｔｓ：Ｊ、　ＢＩＯｌ、　Ｃｈｅｍ、
　２ｊｕ、　　１３］９５．　　Ｌ９８ｓ２４、　　Ｐ
、　　Ｈｏｈｍａｎｎ、　　Ｒ，Ｒｅｍｙ、　　Ｍ、　
　ｔｌｃｏｃｋｈａｕｓ　ｆ（Ｊｂ：　Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｍ
、　　ｖａｎＬｏｏｎ：　　Ｊ、　　Ｂｌｏｔ、　　Ｃ
ｈｓｍ、、ｌｎ　ｐ【ｅ＋＋ｉ２５、　Ｆ、Ｃ，Ｋｕｌ
ｌ、　Ｂ、　Ｊａｃｏｂｓ　９Ｊｆ　Ｐ、　Ｃｕａｔｃ
ｅｃａ＊ａ＊：　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｅｌ、Ａｃａｄ、
ＳｃＬ、　ＵＳＡ　１．　５７５６．１９１１５２６、
Ａ、八、ＣｒｅａｌＩｙ、Ｒ，Ｙａｍａｍｏｅｏ　ｊ＞
９（ｃｈ、Ｒ，ｖｔｔｅ：　　Ｐｔｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　υ！ｉＡ　　Ｂ！Ｌ、　　
３２９３．　１９８７２７、　　Ｇ、Ｂ、　　５ｔａｕ
ｂｅｒ、　　Ｒ，Ａ、　　八ｌｙｅ【　Ｊ、Ｊ〆ｎｙ１
］、　　八ｇｇａｒｗａｌ＋　　Ｊ、　　１ｌｌｏｌ。
Ｃｈｅｗ、ｊＪｌ、　　１９０９θ、　１９８８２Ｂ、
　　Ｋ、　　１（ｉｒａｎｏ、　　に、　　Ｙａｒｎａ
ｍｏｔｏ、　　Ｙ、　　Ｋｏｂａｙａ＠ｈｌ　ｆｉ’Ｊ
ｂ：’Ｔ、　　Ｏ＋ａｗａ：　Ｊ。
Ｂｌｏｃｈｅｍ、　　旦臣、１２０．１９８９２９、Ｙ
、Ｎ１Ｌｔ＋＋ｕ、Ｎ、Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｈ，！１ｏ
ｎｅ、Ｈ，Ｎｅｄａ、　　Ｎ、Ｙａｍａｕｃｈｌ。
Ｍ、Ｍａｅｄａ　ＪＩＪび！、ＵｒｕｓｈＬｚａｋｉ：
　　Ｊ、Ｂｌｏｔ、Ｒａ５ｐ、Ｍｏ１ｙｎｅｕｘヱ、２
７６．１９８８ ３０．１．０１＋＋ｓｏｎ、Ａ、Ｇｃｕｂｂ、Ｕ、Ｇｕ
ｌｌｂｅｒｇ、Ｍ、Ｌａｎｔｚ、Ｅ。
Ｎ１１ｓｓｏｎ、　　Ｃ，Ｐｅｅ＋ｔｅ　ＪＩＪムｌ（
、Ｔｈｙｓｅｌｌ：　Ａｂｓｔｒａｃｔ、２ｎｄＩｎｔ
ｅｃｎ、Ｃｏｎｆｅｃｅｎｅｅ　ｏｎ　Ｔｕｍｏｃ　Ｎ
ｅｃ【ｏｓｔｓ　Ｆａｃｔｏｒ　にｊぴＲｅ１ａｔｅｄ
　　Ｃｙｔｏｋｌｎｅｓ、　　Ｎａｐａ、　　Ｃａ１ｌ
ｆｆｏ【ｎＬａ、　　ｌｓ、−２０，Ｊａｎｕａｒ１１
、　　Ｈ，Ｒ，Ｌ？５Ｌｓｅｈｅｒ　ｊ）’ｉＷＨ，Ｂ
【ｏｃｋｈａｕｓ：　　八ｂｓｔ【ａｃｔ、　　２ｎｄ
　　Ｉｎｔ！ｆｎ。
Ｃｏｎｆｅｃｅｎｃｅ　Ｏｎ　Ｔｕｎａｆ　Ｎｅｃ【ｏ
ｓＬｓ　ｒａｃｔｏｒ　ｆｉＪＬｔ　Ｒｅ１ａｔｅｄＣ
ｙｔｏｋＬｎｅｓ、Ｎａｐａ、Ｃａ１ｉｆｏｃｎＬａ、
ＬＳ、−２０，Ｊａｎｕａｒ　１９８９３２、Ｍ、Ｂｒ
ｏｃｋｈａｕｓ、Ｈ，Ｌａ１．５ｃｈｅ【、Ｈ，−Ｐ、
Ｈｏｈｍａｎｎ　Ｊ、Ｊ２Ｉｌ’ｗ、　　Ｈｕｎｚｉｋ
ｅｃ：　　Ａｂｓｔ【ａｃｔ、　２ｎｄ　　Ｉｎｊｅｒ
ｎ、　　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　　ｏｎ　　τｕｒａｏ
【Ｎ＠ＣｔＯＧＬ＠　ＦａｃｔｏｒスＪ７ｙ’Ｒｅ１ａ
ｔｅｄ　Ｃｙｔｏｋｌｎｅｇ、　Ｎａｐａ。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　　ｌｓ、−２０，Ｊａｎｕａ
ｒ　１９８９３４、　Ｍｊｌ、　Ｉ（ｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅ＋：、　Ｅ、　Ｌｕ３ａｎ、　Ｆ、　Ｏｇｔｒａｎｄ
ａｒ、　Ｌ、Ｅ、　Ｈｏｏｄ；Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、　！ｕ、　　２２７．　　ＩＨ１３コ５．　
υ、に、　　Ｌ１１ｍ＋ａｌｌ：　　Ｎａｔｕ【ｅ　　
Ｚヱヱ、　　６８０．　１９７０３６、　Ｔ、ｆｔ、Ｊ
ｏｈｎ、％１．？’１．　Ｇａ１ｌれｌｎ、　Ｍ、　ｓ
Ｌｓｇ＊１ｍａｎ、　Ｈ，Ｔ、　５ｏｉｔｈ。
３８、　Ｈ，Ｔｏｗｂｌｎ、　Ｔ、　ＳｍａｅｈｅＬｌ
ｎみＪびＪ、　Ｇｏｒｄｏｎ：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。
ＡｃａｄＪｃｉ、　　ＵＳＡ　ヱＬ　　４３５０．　１
９）９３９、　Ｄｌｎａｒｅｌｌｏ、　Ｃｈ、Ａ、、　
ｉｎ　Ｌｙ＋ａｐｈｏｋｌｎｅ＠、　Ｖｏｌ、　１４．
　Ｅ、　Ｐｉｃｋ。
ｅｄ、、　　Ｉ）、１．　　Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　　Ｌｏｎｄｏｎ、　　１９１１７４０、　　Ｄ
、Ｊ、　　Ｍｅｃｃｈａｎｔ、　　Ｒ，Ｈ，Ｋａｈｎ　
４ｊｂ：％４．）１．　　Ｍｕｔｐｈｙ：　　Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ　　ｏｒＣ＠１ｌＪＪびＯｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔ
ｕｃ＠、Ｂｕｃｇｓｓｇ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、。
剛、ｎｎｅａｐｏｌｌｇ、１９６９ ４１、　　Ｇ、Ｅ、Ｇｒａｕ、　　Ｔ、Ｅ、　　Ｔａｙ
ｌｏｒ、　　Ｍ、Ｅ、　　Ｍｏ１ｙｎｅｕｘ、　Ｊ、Ｊ
、　　ＷＬｒｌｍａ、　　Ｐ。
Ｖａｓｇａｌｌｌ、　Ｍ、　Ｈｏｍｍａｌ　Ｊ、Ｊｚｒ
ｐ、、　Ｌａｍｂｅｃｔ：　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、
　Ｍｅｄ。
Ｌ囚、　　１５１１６．　１９８９ ４２、Ｊ、　　ＳａｍｂｒＯＯｋ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ／７Ｊｂ’Ｔ、Ｍａｎｌａｔｌｓ：　　Ｎｏ１＠Ｃ
ｕ１＆ｔＣ１ｏｎｌｎｇ、　　＾Ｌａｂａｒａｔｏ【ｙ
　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　　ｅｃｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
【ｌｎｇＨａｒｂｏ【　Ｌａｂｏ【ａ乞ｏ【ｙ、Ｃｏ１
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ｎｇＨａｒｂｏ【　Ｌａｂｏ【ａｔｏｔｙ　Ｐ【ｅｓｓ
、１９１１９４３、Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂ＠１．Ｒ，Ｂ【
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ｓ。
Ｊ、Ａ、　Ｓ＋５Ｌｔｈ、　Ｊ、Ｇ、　Ｇｏｌｄｍａｎ
　９↓Ｌ（Ｋ、　Ｓｔ【ｕｈｌ：　Ｃｕ【ｔｅｎｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ　ｋｎ　Ｍｏ１ｓｃｕｌａｃ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　１９ａ７−１９ｅａ、　Ｓ、　ｗＬｌｅｙ　ｉ
Ｊｕｌｉｏｎｇ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　　１９［１
７４４、Ｅ、　　Ｈａｒｌｏｗ　　４Ｊｚｘ’Ｄ、　　
Ｌａｎｅ：　　Ａｎｔｌｂｏｄｌｅｓ、　　Ａ　　Ｌａ
ｂｏ【ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ【Ｌ
ｎｇ　Ｈａ【ｂａ【Ｌａｂｏｔａｔｏ【ｙ　Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ。
Ｎｅｗ　ＹＯｆに、　　１９１１ｆ１ ４５、　Ｓ、Ｆａｚｅｋａｓ　ｄｅ　Ｓｔ、　Ｇｒｏｔ
ｈ　Ｊ）ｚｐ；　ｏ、　Ｓｃｈｅｌｄｅｇｇｅｒ：　Ｊ
、　ｔｍｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　３５．１．１９８０４６、　Ｄ、　
Ｐｅｎｒ＋ｔｃａ　ｉＪｐ　Ｄ、Ｖ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ
、　　ｉｎ　ＬｙｍｐｈｏｋＬｎａｓ、　Ｖｏｌ、　Ｌ
３゜Ｄ、Ｒ，Ｗｅｂｂ　９Ｊ７．：Ｄ、’Ｊ、　Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ、　ｅｄｓ、　　ｐ、　　１６：１．　Ａｃａ
ｄｅｍｌｃＰ【ｅｓｓ、　　Ｌｏｎｄｏｎ、　　１９［
１７４７、Ｊ、Ｔａｖｅｚｎｌａｒ、Ｌ、Ｆｔａｎｚｅ
ｎ、Ａ、　Ｍａｔｍｅｎｏｕｔ、Ｊ、ｖａｎ　ｄｅ【）
１ｅｙｄａｎ、Ｒ，Ｍｕｌｌｅ【、Ｍ、　Ｒｕｙｓｓｅ
ｈａｓｒｔ、　　Ａ、　　ｖａｎ　Ｖｌｉｅｔ、Ｒ。
Ｂａｎｄａｎ　４ｒｙ　ｗ、　Ｆｌａｒ＋＋、　　ｉｎ
　Ｌｙｍｐｈｏｋｌｎａｓ、　Ｖｏｌ、　　１３．　Ｄ
、Ｒ。
Ｗｅｂｂ　ＪＪｉｊＤ、Ｖ、　Ｇｏｅｄｄ＠１．　ｅｔ
３ｇ、、　　ｐ、　　１８１．　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐ【ａｓｓ。
Ｌｏｎｄｏｎ ４Ｂ、　Ｐ、Ｊ、　Ｆ【ａｋ＠【ろＪＶＪ、Ｃ，５ｐｅ
ｃｋ：Ｂｌｏｃｈａｍ、　ＢＬｏｐｈｙｇ、　Ｒａｇ。
Ｃｏｍｍｕｎ、８０．　　［１４９，１９８７４９、Ｄ
、Ｈ，Ｅｔｌｉｃｈ、　Ｄ、Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｒ
，に、　５ａＬｋｌ：　Ｎａｔｕ【ｅ　３ＪＪ−、６１
゜Ｓｏ、　Ｂｏ＋＋ｓｅ【ｈｏｆｆ、　Ｊ、　Ｗａｌｌ
ａｃｈ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、　Ｆｃａｎｋ：　Ｊ、　Ｃｈ
ｒｏｎａｔｏｇｔ。
１ムし　）１．１９４１９ ５１、　Ｒ，Ｌａｔｈｅ：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ
、　ＬＬｌ、　　１．１９８５５２、　　Ｌｕｃｋｏｗ
　　Ｊ７１び’　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　　Ａ　　Ｍａｎｕ
ａｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ＥｏｔＢａｃｕｌ
ｏｖｉｔｕｓ　Ｖｅｃｔｏｔｇ　ｆ、ＪＴ；　Ｉｎ５ｅ
ｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｔａＰ【ｏｃｅｄｕｒｅｃ
”、　Ｔｅｘａｓ　　Ａｇ【Ｌｃｕｌｔｕ【ａｌ　　Ｅ
ｘｐｅｅｉｍａｎｔａｌ　　５ｔａｔｔｏｎ。
Ｔｅｘａｓ　Ａ　＆　Ｍ　Ｌｌｎｌｖｅ【＠ｌｔｙ、Ｂ
ｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　　ｌ５５Ｓ、２ｎｄｓｄｉｔ
ｉｏｎ、　　１９８Ｂ
【図面の簡単な説明】
第１図は見かけの分子量約５５ｋＤを有し、ＴＮＦに結
合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。 第２Ａ図は５５ｋＤ　ＴＮＦ−ＢＰ−ｃＤＮＡを含有す
るベクターでトランスフェクションされたＣＯ８細胞の
１２１−ＴＮＦαとの結合データを示し、そして第２Ｂ
図はスキャッチャード分析の結果を示す（実施例９参照
）。 第３図はトランスフェクションされたＣＯ８細胞の培養
上清の”Ｊ−ＴＮＦαとの結合能を示す。 第４図は見かけの分子量約７５／６５ｋＤを有し、ＴＮ
Ｐに結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す
。 ■担胆ユ」凶竺ユ １９１５　　ＡＡＣＣＣ（ａＡ’Ｌ”ＩＬ是已今／禾紹
今 ｃｐｍ　　シ貝・」　定イコ［ ム皿匹」 肛匝り虹国狐ユ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ＴＮＦに結合する均質な形態の不溶性タンパク質お
    よび可溶性または不溶性のその断片、並びに生理学的に
    適合性のあるそれらの塩。 ２）非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が５
    ５ｋＤおよび７５ｋＤである請求項１記載の化合物。 ３）下記アミノ酸配列： Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
    ｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅ
    ｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
    −Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ａｓ
    ｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ；Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
    −Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
    Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ；Ｌｅｕ−Ｐ
    ｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｘ−
    Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇ
    ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ；Ｉｌｅ−Ｘ−Ｐｒｏ−
    Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐ
    ｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ； Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
    ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
    ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ；Ｖａｌ
    −Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ； Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
    ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
    ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ；Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ
    −Ｐｒｏ；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
    Ａｌａ−Ａｓｐ；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐ
    ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｉｌ
    ｅ−Ｘ−Ａｌａ−Ｐｒｏ ［上記配列中Ｘは未決定アミノ酸残基を示す］の少なく
    とも１つを含有する請求項１または２記載の化合物。 ４）ＴＮＦに結合する不溶性タンパク質またはその可溶
    性および不溶性断片をコードしており、（ａ）第１図ま
    たは第４図に示されるＤＮＡ配列、およびその相補鎖、
    またはこれらの配列を含有する配列； （ｂ）（ａ）項で定義された配列とハイブリダイズする
    ＤＮＡ配列またはその断片； （ｃ）遺伝暗号の縮重ゆえに上記（ａ）および（ｂ）項
    で定義された配列とハイブリダイズしないが、正確に同
    じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ
    Ａ配列、 から選択されるＤＮＡ配列。 ５）一方の部分配列がＴＮＦに結合する不溶性タンパク
    質の可溶性断片をコードしておりそして他方の部分配列
    がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥのようなヒト免
    疫グロブリンの重鎖の不変領域の第１のドメインを除く
    全ドメインをコードするものである２種のＤＮＡ部分配
    列の組み合せを含有してなる請求項４記載のＤＮＡ配列
    。 ６）ヒト免疫グロブリンがＩｇＭまたはＩｇＧクラスの
    ものである請求項５記載のＤＮＡ配列。 ７）ヒト免疫グロブリンがＩｇ１またはＩｇ３タイプの
    ものである請求項５記載のＤＮＡ配列。 ８）請求項４〜７のいずれか１項記載のＤＮＡ配列によ
    りコードされる組み換えタンパク質、およびその対立変
    種、または欠失、置換または付加類似体。 ９）請求項４〜７のいずれか１項記載のＤＮＡ配列を含
    有しており、そしてこれらのＤＮＡ配列によりコードさ
    れるタンパク質の原核生物および真核生物宿主系におけ
    る発現に好適なベクター。 １０）請求項９記載のベクターで形質転換された原核生
    物および真核生物宿主系。 １１）哺乳類または昆虫の細胞である請求項１０記載の
    宿主系。 １２）請求項１〜３または８項の何れか１項に記載の化
    合物に対する抗体。 １３）本質的に以下の精製工程、即ち：細胞抽出物の調
    製、免疫アフィニティクロマトグラフィーおよび／また
    は単一または複数リガンドアフィニティクロマトグラフ
    ィー、ＨＰＬＣおよび調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、そして
    所望の場合はこのようにして単離された化合物の化学的
    または酵素的な分解および／またはこれを好適な塩に変
    換する工程を順次実施することを包含する、請求項１〜
    ３の何れか１項記載の化合物の単離方法。 １４）適当な培地中で請求項１０または１１記載の形質
    転換された宿主系を培養しそして宿主系自体または培地
    から化合物を単離することを包含する、請求項８記載の
    化合物の製造方法。 １５）所望の場合は付加的な医薬上活性な物質および／
    または無毒性、不活性で治療上適合する担体物質と組合
    せた、請求項１〜３または８項の何れか１項記載の化合
    物の１種またはそれ以上を含有する医薬製剤。 １６）所望の場合は付加的な医薬上活性な物質および／
    または無毒性、不活性で治療上適合する担体物質と組合
    せた、請求項１〜３または８項の何れか１項記載の化合
    物の１種またはそれ以上を含有する、ＴＮＦが関与する
    疾病の治療の為の医薬製剤。 １７）疾病の治療のための請求項１〜３または８項の何
    れか１項に記載の化合物の使用。１８）ＴＮＦが関与す
    る疾病の治療のための請求項１〜３または８項の何れか
    １項に記載の化合物の使用。 １９）請求項１３または１４項に記載の方法に従って製
    造された、請求項１〜３または８項のいずれか１項に記
    載の化合物。
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