JPH03133382A - 腫瘍壊死因子―αおよび―βレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にサイト力インレセプターに関し、より詳
細には腫瘍壊死因子レセプターに関する。

（従来の技術） 腫瘍壊死因子−＊（ＴＮＦｇ、カケクチンとも呼ばれる
）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦｔ、リンフォトキシ
ンとも呼ばれる）は、多くの細胞型に対して様々な作用
を誘導しうる相同な哺乳類内因性分泌蛋白である。これ
ら２種類のサイト力インま構造的および機能的特性が非
常に類似しているために、−まとめにしてＴ　Ｎ　Ｆ　
”　と把載された。

ＴＮ　Ｆ　ｓ　（Ｐｔｎｎｉｃａ　ｅｊ　ｘｉ、、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１２ニア２４．１９ｇ（）およびＴＮＦ
ｔ（Ｇｒａｙ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２
ニア２１、　＋ｑｇ＜）をコードする相補ｃＤＮＡクロ
ーンが単離され、ＴＮＦの更なる構造的および生物学的
特性決定が可能となった。

ＴＮＦ蛋白は、ＴＮＦ応答細胞の原形質膜上に発現され
た特定のＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）蛋白に結合す
ることによって、細胞に対するそれらの生物学的作用を
開始する。ＴＮＦｔおよびＴＮＦｔは最初、ヒト子宮頚
癌細胞株ＭＥ−１８０上の共通のレセプターに結合する
ことが示されたＣＡｇｇ＊ｒｖｒ！Ｉ　ｅ（ａｌ、、　
Ｎ１ｊｕｒｅ　３１ｇ：６６５．１９８５）。

アフィニティーラベル実験により測定されたＴＮＦ−Ｒ
の大きさの概算値は５４〜１７５ｋＤａののこれらのＴ
ＮＦ−Ｒ間の関係ははっきりしないが、ｌ（ｏｂｍａｎ
ｎ　ｅｒ　ａｌ、　（Ｊ、Ｂ。１０ｌ、Ｃｂｓｎ、　２
６１：１４９２７゜９８９）はＴＮＦの少なくとも２つ
の異なる細胞表面レセプターが異なる細胞型に存在する
ことを報告した。これらのレセプターはそれぞれ約８０
ｋＤａと約５５〜６０ｋＤａの見掛は分子量を有する。

しかしながら、上記刊行物はどれも細胞表面ＴＮＦレセ
プターの均質精製を報じていない。

ＴＮＦの細胞表面レセプターのほかに、ＴＮＦに結合し
うるヒト尿からの可溶性蛋白も同定され９１１８；　　
５ｃｃｋｉＢｔｒ　　ｅｔ　　ｔｌ、、Ｊ、Ｂ。１０ｌ
、Ｃｂｃｍ、　　２６４＋ｌｌ９６６、１９８９；　５
ｅｃｋｉｎｕｒ　ｅｔ　ａｌ、のＵＫ特許出願、公開番
号２２１８１０　ｉ　Ａ　；　Ｅｎ（ｅｌｍａｎｎ　ｅ
ｔ　！１．．　Ｊ。

Ｂ。１０ｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：１１９７４，１９ｇ９
）　　。ＵＫ　２２　１　８　１０１Ａに開示された可
溶性床ＴＮＦ結合蛋白は、Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｖａｔ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏ−の部分Ｎ末端アミノ酸配列を有し、これ
はＥｎｇｅｌｍａｎｎｅｌ　ａｌ、（１９８９）によっ
てあとで開示された部分配列と一致する。上記の可溶性
尿結合蛋白類の関係は、本出願のもとの親出願（米国特
許出願第４０３２４１号）が提出された後でさらに解明
され、そのとき　Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、は
Ｖａｌ−Ａｌａ　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−のＮ末端
アミノ酸配列を有する第二の別個の可溶性床ＴＮＦ結合
蛋白の同定および精製を報告した（Ｊ、Ｂ。１０ｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　２６５：１５３１、１９９０）。ＵＫ２２１
８１０１ＡおよびＥｎｇｅｌｍａｎｎ　ｅｔ−１，の刊
行物に開示された２種類の尿蛋白は、ある種の細胞への
ＴＮＦ結合を阻止する結合蛋白に対する抗血清の能力に
より、２つの明らかに異なる細胞表面蛋白に免疫化学的
に関係があると分かった。

最近になって、２つの別々のグループがヒト５５ｋＤａ
ＴＮＦ−Ｒの分子クローニングおよび発現を報告した（
Ｌｏｔｌｓｃｂｔｒ　ｅｔ　１＋、、　Ｃｅ１ｌ　６１
：３５１、１９９０；　５ｃｂａｌｌ　ｅｔ　！１．．
　Ｃｅ１ｌ　６１：３６１．１９９０）。

両グループのＴＮＦ−ＲはＵＫ２２１８１０１Ａ。

Ｅｎｇｅ１ｍ＆ｎｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９１９）および
Ｅｎ（ｅｌｍａｎｎ　ｅＬｉｌ、（１９９０）により開
示された尿結合蛋白の部分アミノ酸配列に一致するＮ末
端アミノ酸配列をもっている。

多数の形態のＴＮＦ−Ｒと可溶性床ＴＮＦ結合蛋白の関
係を明らかにするために、またはＴＮＦ−Ｒの構造的・
生物学的性質並びにＴＮＦまたは他のサイト力イン刺激
に対する各種細胞集団の応答においてＴＮＦ−Ｒが果す
役割を研究するために、あるいは治療、診断またはアッ
セイにおいてＴＮＦ−Ｒを効果的に使用するために、Ｔ
ＮＦ−Ｒの精製組成物が必要とされる。しかしながら、
この種の組成物は、組換えＤＮＡ技術を使って、これら
のレセプターをコードする遺伝子をクローニングし、発
現させることによってのみ得ることができる。しかし、
生化学的分析用のＴＮＦ−Ｒ分子を精製しようとする努
力、またはＴＮＦ−Ｒをコードする哺乳類遺伝子をクロ
ーニングして発現させようとする努力は、レセプター蛋
白またはｍＲＮＡの適当な供給源がないために妨げられ
ている。本発明以前には、高レベルのＴＮＦ−Ｒを構成
的にかつ連続して発現する細胞株は全く知られておらず
、その結果シーフェンシング用のレセプターの精製また
はｃ　ＤＮＡクローニング用の遺伝子ライブラリーの作
製が阻まれていた。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、単離したＴＮＦレセプターおよび哺乳類腫瘍
壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）、特にヒトＴＮＦ−
ＲをコードするＤＮＡ配列を提供する。このようなりＮ
Ａ配列には（ａ）天然ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域か
ら誘導されたヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクロー
ン；（ｂ）適度なストリンジェント条件下で（ａ）のｃ
　ＤＮＡクローンにハイブリダイズすることができ、か
つ生物学的に活性なＴＮＦ−Ｒ分子をコードするＤＮＡ
配列：または（ｃ）（ａ）および（ｂ）で定めたＤＮＡ
配列に遺伝暗号の結果として縮重しており、かつ生物学
的に活性なＴＮＦ−Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；が
含まれる。特に、本発明は可溶性ＴＮＦレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列を提供する。

また、本発明は上で定義したＤＮＡ配列を含む組換え発
現ベクター、その組換え発現ベクターを使って生産され
た組換えＴＮＦ−Ｒ分子、およびその発現ベクターを使
って組換えＴＮＦ−Ｒ分子を生産する方法を提供する。

本発明はまた、ＴＮＦ−Ｒ１特に可溶性形態のＴＮＦ−
Ｒから成る単離したまたは精製した蛋白組成物を提供す
る。

さらに、本発明は、上記方法により生産された有効量の
可溶性天然または組換えレセプター蛋白を含む、ＴＮＦ
−Ｒの治療、診断、アッセイに用いるための、あるいは
ＴＮＦ−Ｒに対する抗体を誘導するための組成物を提供
する。

ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）に特異的に結合するＴ
ＮＦの能力ゆえに、精製ＴＮＦ−Ｒ組成物はＴＮＦの診
断アッセイに、または診断や治療に用いるＴＮＦレセプ
ターに対する抗体の誘導に有用であるだろう。さらに、
精製ＴＮＦレセプター組成物は、ＴＮＦを結合または捕
捉するための治療に直接使用され、これによりこのサイ
ト力インの免疫活性を調節するための手段を提供する。

本発明のこれらの面および他の面は以下の詳細な記述よ
り明らかになるであろう。

（課題を解決するための手段） 乳１ 本明細書中で用いる゛’ＴＮＦレセプター”および’Ｔ
ＮＦ−Ｒ”なる用語は、天然哺乳類ＴＮＦレセプターア
ミノ酸配列配列質的に類似しＩ；アミノ酸配列を有し、
かつＴＮＦ分子を結合することができる；細胞へのＴＮ
Ｆ分子の結合により開始される生物学的信号を伝達する
ことができる；または天然（すなわち、弁組換え）源由
米のＴＮＦ−Ｒに対して誘導された抗ＴＮＦ−Ｒ抗体と
交差反応することができるという点で、以下で定義する
ように、生物学的に活性である蛋白を意味する。

成熟全長ヒトＴＮＦ−Ｒは約８０キロダルトン（ｋＤａ
）の分子量をもつ糖蛋白である。本明細書全体を通して
用いられるパ成熟″゛なる用語は、天然遺伝子の全長転
写物に存在しうるリーダー配列を欠いた形態で発現され
る蛋白を意味する。全長ヒトＴＮＦ−Ｒをコードするｃ
ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯ５細胞を用いた実験
により、ＴＮＦ−Ｒは約５ｘｌＯ’Ｍ−’の見掛けＫａ
で１２５ｔ　　ＴＮＦ＃を結合し、また約２　Ｘ　１０
　’Ｍ−’の見掛けＫａで１２Ｊ−ＴＮＦβを結合する
ことが判明した。”　Ｔ　Ｎ　Ｆレセプター″または”
　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｒ”なる用語には、限定するものでは
ないが、少なくとも２０個のアミノ酸を有する天然蛋白
の類縁体まｔ二はサブユニ・ントであって、少なくとも
いくらかのＴＮＦ−Ｒと共通した生物学的活性を示すも
の、例えばトランスメンブラン領域を欠く（従って細胞
から分泌される）がＴＮＦを結合する能力を保持する可
溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物が含まれる。

種々の生物学的に均等な蛋白およびアミノ酸類縁体は以
下で詳しく述べることにする。

本明細書中で用いるＴＮＦ−Ｒ類縁体の命名法よ、ｈｕ
（ヒト）またはｍｕ（マウス）が先行し、△（欠失を表
す）とＣ末端アミノ酸の番号が後に続く蛋白（例、ＴＮ
Ｆ−Ｒ）の慣例的な命名法に従う。例えば、ｈ　ｕＴＮ
Ｆ−Ｒ△２３５はＣ末端アミノ酸としてＡＳｐ２３５を
もつヒトＴＮＦ−Ｒ（つまり、第２Ａ図のアミノ酸１−
２３５の配列をもつポリペプチド）を表す。ヒトまたは
マウスの種指示がない場合には、ＴＮＦ−Ｒは総称的に
哺乳類ＴＮＦ−Ｒを意味する。同様に、欠失変異体の特
定指示がない場合には、用語ＴＮＦ−ＲはＴＮＦ−Ｒの
生物学的活性を有する変異体および類縁体を含めて、あ
らゆる形態のＴＮＦ−Ｒを意味する。

本発明との関係において用いられる“可溶性ＴＮ　Ｆ　
−Ｒ”または”　ｓ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｒ”は、天然ＴＮ
Ｆ−Ｈの細胞外領域の全部または一部に一致するアミノ
酸配列（例えば、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５、ｈｕＴＮＦ
−ＲΔ　１８５、　ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１６３）、あるい
は第２Ａ図のアミノ酸１−１６３、アミノ酸１−１８５
、またはアミノ酸１−２３５の配列に実質的に類似した
アミノ酸配列を有し、しかもＴＮＦリガンドに結合する
という点で生物学的に活性である蛋白、または実質的に
均等な類縁体を意味する。均等な可溶性ＴＮＦ−Ｈには
、１以上の置換、欠失または付加によりこれらの配列と
異なるポリペプチドであって、ＴＮＦ結合能力を保持す
るか、または細胞表面結合ＴＮＦレセプター蛋白による
ＴＮＦ信号伝達を阻止するもの、例えばｈｕＴＮＦ−Ｒ
△Ｘ（ここで、Ｘは第２Ａ図のアミノ酸１６３−２３５
のいずれか１つより成る群から選ばれる）が含まれる。

ｍｕＴＮＦ−Ｒに対しても類似の欠失を作ることができ
る。ＴＮＦ信号伝達活性の阻止は、細胞を組換えＴＮＦ
−ＲＤＮＡでトランスフェクトして組換えレセフターを
発現させ、その後細胞をＴＮＦと接触させて、生じた代
謝結果を調へることにより確認できる。リガンドの作用
によると考え得る結果が得られるならば、その組換えレ
セプターは信号伝達活性をもつといえる。ポリペプチド
が信号伝達活性をもつかどうかを調べる方法は、例えば
Ｉｄｚｅｒｄｓｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、ＩＪｅｄ
、　１７１：８６１　（１９９０）；　Ｃｏｒｔｉｓ　
ｔ（ａｌ、、　Ｐｒｏｅ−Ｎｘ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
劃Ｓ側　ｇ６＋３０４５　（１９ｇ９）；Ｐｒｙｖｅｓ
　ｅＬ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　Ｓ：２１７９　（ｌ
Ｈ５）；およびＣｈｏｕ　ｃｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂ。１
０ｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２：１８４２　（１９Ｂ？）に
記載されている。また、内因性ＴＮＦレセプターを発現
し、ＴＮＦに対して検出しうる生物学的応答を有する一
次細胞または細胞株も利用できるだろう。

ＴＮＦ−Ｒ蛋白または蛋白組成物の純度を定義するため
に本明細書との関係において用いられる゛′単離された
′または゛精製された″なる用語は、蛋白または蛋白組
成物が実質的に天然または内因性起源の他の蛋白を実質
的に含まず、しかも生産プロセスの蛋白汚染残留物を約
１％より少ない量で含むことを意味する。しかしながら
、この種の組成物は安定剤、担体、賦形剤または補助治
療剤として添加された他の蛋白を含むことができる。

ＴＮＦ−Ｒはポリアクリルアミドゲルで銀染色により単
一の蛋白バンドとして検出しうるならば単離できる。

アミノ酸または核酸配列を定義するために用いられる゛
′実質的に類似した″なる用語は、特定の対象配列（例
えば、変異体配列）が１以上の置換、欠失、または付加
により基準配列からはずれ、その最終的な作用が、例え
ば以下の実施例１に示すＴＮＦ−Ｒ結合検定の１つで測
定されるような、ＴＮＦ−Ｒ蛋白の生物学的活性を保持
すべきであることを意味する。また、核酸サブユニット
および類縁体は、（ａ）そのＤＮＡ配列が天然哺乳類Ｔ
ＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域から誘導される場合；　（
ｂ）そのＤＮＡ配列が適度なストリンジェント条件（５
０°Ｃｌ２ＸＳＳＣ）下で（ａ）のＤＮＡ配列にハイブ
リダイズすることができ、かつ生物学的に活性なＴＮＦ
−Ｒ分子をコードする場合：または（Ｃ）そのＤＮＡ配
列が（ａ）または（ｂ）で定義したＤＮＡ配列に遺伝暗
号の結果として縮重しており、かつ生物学的に活性なＴ
ＮＦ−Ｒ分子をコードする場合に、ここに開示した特定
のＤＮＡ配列に゛′実質的に類似している″といえる。

本明細書中で用いる組換え体″なる用語は、蛋白が組換
え体（例、微生物または哺乳類）発現系から誘導される
ことを意味する。パマイクロバイアル″′は細菌または
真菌（例、酵母）発現系により作られた組換え蛋白を意
味する。産物として、組換えマイクロバイアル″は天然
内因性物質を本質的に含まない微生物発現系により生産
された蛋白を表す。大部分の細菌培養物（例、　Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）により発現された蛋白はグリカンを含まないで
あろう。酵母内で発現された蛋白は哺乳類細胞内で発現
されたものと異なるグリコジル化パターンを示すことが
ある。

ＴＮＦレセプターの特性として明細書全体を通して用い
られる゛生物学的に活性パとは、特定の分子が検出可能
な量のＴＮＦを結合でき、ＴＮＦ刺激を例えばハイブリ
ノドレセフリー構築物の−成分として細胞に伝達でき、
または天然（つまり弁組換え体）源からのＴＮＦ−Ｒに
対して誘導された抗ＴＮＦ−Ｒ抗体と交差反応できるよ
うに、ここに開示した本発明の具体例と十分なアミノ酸
配列類似性を共有することを意味する。好ましくは、本
発明の範囲内の生物学的に活性なＴＮＦレセプターは標
準結合検定（以下参照）でレセプターｌｎｍｏｌｅ当た
りＴＮＦを０．１ｎｍｏｌｅより多く結合でき、最も好
ましくは、レセプター１　ｎｍｏ　Ｉ　ｅ当たりＴＮＦ
を０．５ｎｍｏｌｅより多く結合できる。

゛′単離されたＤＮＡ配列パは、実質的に純粋な形態で
（すなわち、内因性汚染物質を含まない）かつ標準生化
学的方法（例えば、クローニングベクターを使用）によ
るその配列およびその構成ヌクレオチド配列の同定、操
作および回収を可能にする量または濃度で少なくとも一
度単離されたＤＮＡから誘導される、分離断片の形をし
たまたは大きいＤＮＡ構築物の一成分としてのＤＮＡポ
リマーを意味する。このような配列は好ましくは、真核
生物遺伝子中に一般に存在する内部非翻訳配列すなわち
イントロンが介在しないオーブン・リーディング・フレ
ームの形で提供される。関係した配列を含むゲノムＤＮ
Ａはコード配列の供給源としても用いられるだろう。非
翻訳ＤＮＡの配列はオーブン・リーディング・フレーム
の５′または３′側に存在してもよく、その場合非翻訳
ＤＮＡ配列はコード領域の遺伝子操作または発現を妨げ
ない。

゛ヌクレオチド配列″はデオキシリボヌクレオチドのヘ
テロポリマーである。本発明により提供される蛋白をコ
ードするＤＮＡ配列は、組換え転写単位内で発現されう
る合成遺伝子を得るために、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴ
ヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレ
オチドから構築することができる。

ＴＮＦ−ＲをフードするｃＤＮＡの単離ＴＮＦ−Ｈのコ
ード配列は、組換えｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブ
ラリーからＴＮＦ−Ｒをコードする相補ＤＮＡ　（ｃＤ
ＮＡ）配列を単離することにより得られる。ｃＤＮＡラ
イブラリーは好ましくは、哺乳類ＴＮＦ−Ｒを発現する
特定の細胞株（例えば、ヒト線維芽細胞株Ｗｌ−２６Ｖ
Ａ４　（ＡＴＣＣＣＣＬ９５．１）がらポリアデニル化
ｍＲＮＡを分離し、このｍＲＮＡを鋳型として用いて二
本鎖ｃＤＮＡを合成することにより作製される。その後
、二本鎖ｃＤＮＡは組換えベクターにパッケージングし
、そのベクターを適切なＥ、ｃｏｌｉ株内に導入して増
幅させる。ＴＮＦ−Ｒを発現するマウスまたは他の哺乳
類細胞株も使用できる。ｃＤＮＡライブラリー中に含ま
れるＴＮＦ−Ｒ配列は、そのライブラリーをＴＮＦ−Ｒ
ｃＤＮＡとハイブリダイズしうる適当な核酸プローブを
使ってスクリーニングすることにより簡単に同定できる
。別法として、ＴＮＦ−Ｒ蛋白をコードするＤＮＡは、
第２Ａ−２Ｂ図または第３Ａ−３Ｃ図の配列の全部また
は一部に対応する合成オリゴヌクレオチドサブユニット
を連結して完全なコード配列を得ることにより構築する
ことができる。

本発明のヒトＴＮＦレセプターｃＤＮＡは直接発現クロ
ーニング法により単離した。ｃＤＮＡライブラリーは初
めにヒト線維芽細胞株Ｗｒ−２６ＶＡ４から細胞質ｍＲ
ＮＡを分離することにより作製した。ポリアデニル化Ｒ
ＮＡを分離し、これを用いて二本鎖ｃＤＮＡを作製した
。精製ｃＤＮＡ断片はその後、以下の実施例２に詳述さ
れる、ｐＤｃ２０１　（ｐＭＬＳＶの誘導体、Ｃｏｓｍ
ａｎ　ｅｔａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニアＧ８．
１９Ｎに以前に開示された）由来の調節配列、ＳＶ４０
およびサイトメガロウィルスＤＮＡを使用する１）ＣＡ
Ｖ／ＮｏＴベクターＤＮＡに連結した。ｐＣＡＶ／ＮＯ
Ｔはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
受託番号ＡＴＣＣ６８０１４として寄託された。Ｗ１２
６−ＶＡ４　　ｃＤＮＡ断片を含むｐ　ＣＡ　Ｖ　／　
ＮＯＴベクターはＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ　ＨＳ　を株に形質
転換させた。形質転換体は平板培養して、平板当たり約
８００コロニーを得た。形成されたコロニーを収穫し、
各プールは、本質的にＣｏｓｍａｎ　ｔＩａｔ。

（Ｎｘｔｕｒｅ　３Ｎ＋７６８．１９８４）およびＬｕ
ｌｈｍａｎ　ｔｔ　ａｌ。

（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｓｓ、　ＩＩ：Ｉ２９Ｓ、　
１９Ｎ）に記載されるようなＣＯ５−７細胞へのトラン
スフェクションのためのプラスミドＤＮＡを作るべく使
用した。

生物学的に活性な細胞表面ＴＮＦレセプターを発現する
形質転換体は、１２Ｊ−ＴＮＦと結合するそれらの能力
についてスクリーニングして同定した。このスクリーニ
ング法では、トランスフェクトされたＣＯ３−７細胞を
”Ｊ−ＴＮＦ含有培地を用いてインキュベートし、細胞
を洗って未結合標識ＴＮＦを除き、細胞単層をＸ線フィ
ルムと接触させて、５１ｍ５　ｅｊ　ａｔ、、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２４１：５８５　（１９８８）に記載される
ように、ＴＮＦ結合の濃度を検出した。この方法で検出
される形質転換体は、比較的明るいバックグラウンドに
対して暗い点として現れる。

この手法を使って、１つのトランスフエクタントブール
のアッセイがＴＮＦ結合について陽性を示すまで、約８
００のｃＤＮＡブールにおいて約２４００００のｃ　Ｄ
ＮＡをスクリーニングしｔ二。

陽性プールからの細菌凍結物は培養下に増殖させ、平板
培養して個々のコロニーを形成させ、検出しうるＴＮＦ
結合活性を有する表面蛋白の合成を導きうる単一クロー
ン（クローン１１）が同定されるまでこれらのコロニー
をスクリーニングした。

上記方法により単離されたｃ　ＤＮＡクローン１１の配
列は第３Ａ−３Ｃ図に示しである。

別のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは他の哺乳類種のｃＤＮＡ
ライブラリーから交差種ハイブリダイゼーションにより
単離することができる。ハイブリダイゼーションで使用
するために、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡは、当分野
でよく知られた方法により検出可能な物質（例えば、蛍
光基、放射性原子または化学発光基）で共有結合的に標
識される。この種のプローブは特定疾患のｉｎ　ｖｉｌ
ｒｏ診断にも利用されるだろう。

たいていの哺乳類遺伝子と同様に、哺乳類ＴＮＦレセプ
ターも恐らく多重エクソン遺伝子によりコードされる。

転写後に異なるｍＲＮＡスプラインング現象を受けたた
めと考えられ、ここで請求したｃＤＮＡと同一性または
類似性の大きい領域を共有する別のｍＲＮＡも本発明の
範囲内であるとみなされる。

他の哺乳類ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡは、特定の哺乳類ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａライブラリーを交差種ハイブリダイゼーション
によりスクリーニングするためのプローブとして、適当
なヒトＴＮＦ−ＲＤＮＡ配列を使用することにより単離
される。

蛋白および類縁体 本発明は、単離された組換え哺乳類ＴＮＦ−Ｒポリペプ
チドを提供する。本発明の単離ＴＮＦ−Ｒポリペグチド
は実質的に天然または内因性起源の他の汚染物質を含ま
ず、生産プロセスの残留蛋白汚染物を約１％より少ない
量で含む。天然ヒトＴＮＦ−Ｒ分子は５ＤＳ−ＰＡＧＥ
により約８０キロダルトン（ｋＤａ）の見掛は分子量を
もつ糖蛋白として細胞リゼイトから回収される。本発明
のＴＮＦ−Ｒポリペプチドには、天然パターンのグリコ
ジル化結合が存在しなくてもよい。

本発明の哺乳類ＴＮＦ−Ｈには、例えば霊長類、ヒト、
マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびブタ
ＴＮＦ−Ｒが含まれる。哺乳類ＴＮＦ−Ｒは、哺乳類ｃ
ＤＮＡライブラリーからＴＮＦＲｃＤＮＡを単離するた
めのハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＴＮＦ
−ＲＤＮＡ配列から誘導された一本鎖ｃＤＮＡを使って
、交差種ハイブリダイゼーションにより得ることができ
る。

本発明の範囲内のＴＮＦ−Ｒ誘導体には、生物学的活性
を保持するいろいろな構造形態の一次蛋白が含まれる。

イオン化可能なアミン基およびカルボキシル基が存在す
るために、例えば、ＴＮＦ−Ｒ蛋白は酸性または塩基性
塩の形をとることができ、また中性の形であってもよい
。さらに、個々のアミノ酸残基は酸化または還元によっ
て修飾されてもよい。

一次アミノ酸構造は、他の化学成分（例えば、グリコジ
ル基、脂質、ホスフェート、アセチル基）との共有結合
複合体または集合複合体を形成するか、あるいはアミノ
酸配列変異体を形成すξことにより修飾される。共有結
合誘導体は特定の官能基をＴＮＦ−Ｒアミノ酸側鎖に、
あるいはＮまたはＣ末端に結合させることによって作ら
れる。本発明の範囲内の他のＴＮＦ−Ｒ誘導体には、Ｎ
末端またはＣ末端融合体として組換え体の培養により合
成されるような、ＴＮＦ−Ｒまたはその断片と他の蛋白
またはポリペプチドとの共有結合もしくは集合複合体が
含まれる。例えば、結合されるペプチドは翻訳と同時に
または翻訳後に蛋白をその合成部位から細胞膜または細
胞壁の内側もしくよ外側の機能部位へ移動させる蛋白の
Ｎ末端領域にあるシグナル（またはリーダー）ポリペプ
チド配列（例、酵母Ｃ−因子リーダー）でありうる。

ＴＮＦ−Ｒ蛋白融合体はＴＮＦ−Ｒの精製または同定を
容易にするために付加されたペプチド（例。

ポリ−Ｈ１ｓ）を含むことができる。また、ＴＮＦレセ
プターのアミノ酸配列はペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＡＳ　＋）−Ｌｙ　ｓ　
（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に結合させてもよい（Ｈｏｐｐ　
ｃｌ　ａｌ、、　Ｂ。１０／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６
：１２Ｇ４゜１９Ｎ）。後者の配列は高度に抗原性があ
り、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエビ
ト−プを提供して、発現された組換え蛋白の迅速なアッ
セイおよび容易な精製を可能にする。この配列はまたＡ
ｓｐ−Ｌｙｓ対のすぐ後の残基でウシ粘膜エンテロキナ
ーゼにより特異的に切断される。

このペプチドでキャップされた融合蛋白は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉによる細胞内分解に抵抗するだろう。

また、ＴＮＦ−Ｒ誘導体は免疫原、レセプターに基づく
イムノアッセイ用の試薬、またはＴＮＦや他の結合リガ
ンドのアフィニティー精製用の結合剤として使用される
。ＴＮＦ−Ｒ誘導体はシスティンおよびリシン残基にＭ
−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステルおよび
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのような作用物質を架橋
することによっても得られる。また、ＴＮＦ−Ｒ蛋白は
反応性側基を介して臭化シアン活性化、ビスオキンラン
活性化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル
活性化アガロース構造物のような種々の不溶性支持体へ
共有結合で結合させることができ、あるいはポリオレフ
ィン表面（グルタルアルデヒド架橋を含むまたは含まな
い）へ吸着させることもできる。ひとたび支持体に結合
されると、ＴＮＦ−Ｒは抗ＴＮＦ−Ｒ抗体またはＴＮＦ
を（アッセイや精製の目的で）選択的に結合させるべく
用いられる。

本発明はまた、天然パターンのグリコジル化結合を含む
または含まないＴＮＦ−Ｒを包含する。

酵母または哺乳類発現系（例、ＣＯ３−７細胞）により
発現されたＴＮＦ−Ｒは、発現系に応じて、天然分子と
類似しているか、あるいは分子量およびグリコジル化パ
ターンがわずかに異なる。Ｅ。

ｃｏｌｉのような細菌によるＴＮＦ−ＲＤＮＡの発現は
非グリコジル化分子をもたらす。不活性化Ｎグリコジル
化部位をもつ哺乳類ＴＮＦ−Ｒの機能的な変異類縁体は
、オリゴヌクレオチドの合成および連結により、または
特定部位の突然変異誘発法により作ることができる。こ
れらの蛋白類縁体は、酵母発現系を使って、良好な収量
で均質な還元炭水化物形態として生産される。真核生物
蛋白のＮグリコジル化部位はアミノ酸トリプレット＝Ａ
ｓｎ　　Ａ＋−Ｚ（ここで、Ａ１はＰｒｏ以外のアミノ
酸で、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒである）により特徴づけ
られる。この配列において、アスパラギンは炭水化物の
共有結合のための側鎖アミノ基を提供する。このような
部位はＡｓｎまたは残基Ｚを他のアミノ酸で置換するか
、ＡＳｎまたはＺを欠失させるか、あるいはＡ１とＺの
間にＺ以外のアミノ酸を、またはＡｓｎとＡ１の間にＡ
ｓｎ以外のアミノ酸を挿入することにより排除しうる。

さらに、Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｒ誘導体はＴＮＦ−Ｒまたはそ
のサブユニットの突然変異によっても得られる。

本明細書中で述べるＴＮＦ−Ｒ変異体はＴＮＦ−Ｒに相
同であるが、欠失、挿入または置換のために天然ＴＮＦ
−Ｒと相違するアミノ酸配列をもつポリペプチドである
。

ＴＮＦ−Ｒ蛋白の生物学的均等類縁体は、例えば残基ま
たは配列の各種置換をつくるか、あるいは末端残基、内
部残基もしくは生物学的活性に必要でない配列を欠失さ
せることにより構築できる。

例えば、システィン残基を欠失させたり（例。

Ｃｙｓ　ｌ　７８　）、再生の際の不必要なまたは不正
確な分子内ジスルフィド橋の形成を防ぐために他のアミ
ノ酸と置換させたりすることができる。その他の突然変
異誘発法には、ＫＥＸ２フロテアーゼ活性が存在する酵
母系での発現を高めるための隣接二塩基性アミノ酸残基
の修飾が含まれる。一般に、置換は保存的に行われるべ
きである；すなわち、最適な代替アミノ酸は置換しよう
とする残基の物理化学的特性と似通った特性をもつもの
である。同様に、欠失または挿入戦略を採用する場合、
欠失または挿入が生物学的活性に与える影響を考慮すべ
きである。先に定義した実質的に類似したポリペプチド
配列は、一般に同数のアミノ酸配列から成るが、可溶性
ＴＮＦ−Ｒを構築するためのＣ末端切断はより少ないア
ミノ酸配列を含むであろう。ＴＮＦ−Ｈの生物学的活性
を保持するために、欠失および置換は好ましくは相同な
または保存的に置換された配列（すなわち、所定の残基
が生物学的に類似した残基によって置換されることを意
味する）をもたらすだろう。保存的置換の例には、ある
脂肪族残基の他の脂肪族残基との置換（例えば、Ｉｌｅ
％Ｖａｌ、Ｌ　ｅ　ｕ　％　またはＡｌａの互いとの置
換）、あるいはある極性残基の別の極性残基との置換（
例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌ
ｎとへｓｎ間の置換）が含まれる。その他のこのような
保存的置換、例えば類似の疎水特性をもつ全領域の置換
もよく知られている。さらに、ヒト、マウスおよび他の
哺乳類ＴＮＦ−Ｒ間の特定のアミノ酸の差異は、ＴＮＦ
−Ｒの本質的な生物学的活性を変えずに行うことのでき
る別の保存的置換を示唆している。

ＴＮＦ−Ｈのサブユニットは末端または内部の残基もし
くは配列を欠失させることにより構築される。特に好適
な配列には、ＴＮＦ−Ｈのトランスメンプラン領域およ
び細胞内ドメインが培地へのレセプターの分泌を促すた
めに欠失されたか、または親木性残基で置換されたもの
が含まれる。

生成した蛋白はＴＮＦ結合能を保持する可溶性ＴＮＦ−
Ｒ分子と呼ばれる。特に好適な可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物
はＴＮＦ−ＲΔ２３５（第２Ａ図のアミノ酸１−２３５
の配列）であり、これはトランスメンプラン領域に隣接
したＡｓｐ”’で終わるＴＮＦ−Ｈの全細胞外領域を含
んでいる。追加のアミノ酸がＴＮＦ結合活性を保持しつ
つトランスメンプラン領域から欠失される。例えば、第
２Ａ図のアミノ酸１−１８３の配列から成るｈｕＴＮＦ
−ＲΔ１８３、および第２Ａ図のアミノ酸１−１６３の
配列から成るＴＮＦ−ＲΔ１６３は、以下の実施例１で
述べる結合検定を使って調べたとき、ＴＮＦリガンド結
合能を保持している。しかし、ＴＮＦ−ＲΔ１４２はＴ
ＮＦリガンド結合能をもっていない。これはＣｙｓｌｓ
′とＣｙｓ１６３の一方または両方がＴＮＦ−Ｒの適切
な折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）のための分子内ジスル
フィド橋の形成に必要であることを暗示している。可溶
性ＴＮＦ−ＲのＴＮＦ結合能に対して明らかな悪影響を
及ぼすことなく欠失されたＣｙ　ｓ　ｌ　７　Ｂは、Ｔ
ＮＦ−Ｒの適切な折りたたみに必要ではないらしい。

従って、Ｃ末端からＣｙｓ１６３までのいずれの欠失も
生物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒをもたらすことが期
待される。本発明はＣｙＳ１６３以後のアミノ酸で終わ
るＴＮＦ−Ｒの細胞外領域の全部または一部に相当する
この種の可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物を包含するものである
。ＴＮＦ−ＲΔ１５７のような他のＣ末端欠失物は、便
宜上、ＴＮＦＲｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必
要に応じて、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて
特定配列を再構築することにより作られる。

その後、得られた可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物は適当な発現
ベクターに挿入して発現させ、実施例１に記載するよう
にＴＮＦ結合能を検定する。このような構築から得られ
た生物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒも本発明の範囲内
に含まれるものである。

ＴＮＦ−Ｒ類縁体の発現のために構築されたヌクレオチ
ド配列中の突然変異は、もちろん、コード配列のリーデ
ィング・フレームを保持しなければならず、好ましくは
レセプターｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼすループやヘ
アピンのような二次ｍＲＮＡ構造をもたらすようにハイ
ブリダイズする相補領域を形成しないであろう。変異部
位は前厄て特定しうるが、突然変異の性質それ自体を予
め決定することは必要でない。例えば、特定部位の突然
変異体の最適性質を選ぶために、標的コドンでランダム
な突然変異誘発を行い、発現されたＴＮＦ−Ｒ変異体を
目的の活性についてスクリーニングすることができる。

ＴＮＦ−Ｒをコードするヌクレオチド配列中のすべての
変異が最終産物において発現されるわけではなく、例え
ば、発現を高めるために、主として転写されたｍＲＮＡ
中の二次構造ループを避けるために（欧州特許公開第７
５４４４Ａ号参照）、あるいは所定の宿主によって翻訳
されやすいコドン（例、　Ｅ、ｃｏｌｉ発現の場合はよ
く知られたＥ。

（ｏｌｉ　ｆＩ先コドン）を与えるために、ヌクレオチ
ド置換が行われる。

突然変異は、天然配列の断片への連結を可能にする制限
部位が両末端に存在する変異配列を含むオリゴヌクレオ
チドを合成することにより、特定の箇所に導入すること
ができる。連結後に得られる再構築配列は目的のアミノ
酸の挿入、置換または欠失を含む類縁体をコードする。

また、オリゴヌクレオチドにより誘導される特定部位の
突然変異誘発法は、必要な置換、欠失、または挿入によ
り変更された特定のコドンをもつ変異遺伝子を与えるた
めに使用される。上記の変異を作る方法は、例えばＷｉ
ｌｄｅｒ　ｃｌ　ａｌ、、（Ｇｓ＋＋ｓ　４２：Ｈ３，
１９Ｒ６）；　Ｂｘｕｅｒ　ｓ［ｘｌ、、（Ｇｅｎｅ　
３７：７３．１９８５）；　Ｃｒ５ｉｋ　（Ｂ。１０Ｔ
ｅｃｂｎｉｑｕｓｓ、　Ｊａｎｕｘｒｙ　１９１１５．
　Ｎ−１９）；　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ｘｌ、、（Ｇｓｎ
ｅ口ｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉＢ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ
　ａｎｄ　Ｍｅｔｂａｄｓ、　Ｐｌｃｎａｍ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　１９Ｎ）；米国特許第４５１８５８４号および同
第４７３７４６２号に記載されている。これらの文献は
適切な技術を開示しており、参照によりここに引用され
る。

ＴＮＦ−Ｒの１価形態および多価形態は両方とも本発明
の組成物および方法において有用である。

多価形態はＴＮＦリガンドの結合部位を複数もっている
。例えば、２価の可溶性ＴＮＦ−Ｒはリンカ−領域によ
って隔てられた第２Ａ図のアミノ厳１−２３５の直列反
復から成っている。また、別の多価形態は、例えば、Ｔ
ＮＦ−Ｒを臨床的に許容しうる担体分子（フィコール、
ポリエチレングリコールまたはデキストランより成る群
から選ばれるポリマー）に通常のカップリング技術を使
って化学的にカップリングすることにより構築できる。

別法として、ＴＮＦ−Ｒはビオチンに化学的にカップリ
ングすることができ、その後ビオチンーＴＮＦ−Ｒ複合
体をアビジンに結合させて、４価のアビジン−ビオチン
−ＴＮＦ−Ｒ分子を得ることができる。ＴＮＦ−Ｒはさ
らにジニトロフェノール（ＤＮＰ）　またはトリニトロ
フェノール（ＴＮＰ）に共有結合でカップリングさせ、
生成した複合体を抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−Ｉ　ｇＭで
沈澱させて、１０価のＴＮＦ−Ｒ結合部位をもつデカマ
ー複合体を形成することができる。

また、免疫グロブリン分子重鎮および軽鎖のいずれか一
方または両方の可変部ドメインの代わりにＴＮＦ−Ｒ配
列を有しかつ未修飾不変部ドメインを有する組換えキメ
ラ抗体分子を作ることができる。例えば、キメラＴＮＦ
−Ｒ／ＩｇＧ１は、２つのキメラ遺伝子−−ＴＮＦ−Ｒ
／ヒトＥ軽鎖キメラ（ＴＮＦ−Ｒ／Ｃｒ）およびＴＮＦ
−Ｒ／ヒトγ８重鎖キメラ（Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｒ／　Ｃ７
−＋）から作られる。２つのキメラ遺伝子の転写・翻訳
後に、これらの遺伝子産物は２価のＴＮＦ−Ｒをもつ単
一のキメラ抗体分子に組み立てる。このようなＴＮＦ−
Ｒの多価形態はＴＮＦリガンドに対する結合親和性が増
強される。この種のキメラ抗体分子の構築に関する細部
は、国際出願ＷＯ３９１０９６２２および欧州特許第３
１５０６２号に記載されている。

組換えＴＮＦ−Ｒの発現 本発明は、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡを増幅または
発現するための組換え発現ベクターを提供する。組換え
発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウィルス、または昆
虫の遺伝子から誘導された適当な転写または翻訳調節要
素に機能しうる状態で連結された、哺乳類ＴＮＦ−Ｒま
たは生物学的に均等な類縁体をコードする合成またはｃ
ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含む、複製可能なりＮＡ構築
物である。転写単位は一般に、（１）遺伝子発現におい
て調節の役割をもつ１以上の遺伝要素、例えば転写プロ
モーターまたはエンハンサ−；　（２）ｍＲＮＡに転写
され、蛋白に翻訳される構造配列またはコード配列；お
よび（３）以下で詳述するような、転写および翻訳の開
始および終結配列；の集合体から成る。前記の調節要素
には転写を制御するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡ
リポソーム結合部位をコードする配列が含まれる。通常
複製起点によって与えられる宿主内での複製能力、およ
び形質転換体の確認を容易にする選択遺伝子がさらに組
み込まれる。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関
係がある場合、機能しうる状態で連結される。例えば、
シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それが
ポリペプチドの分泌に関与する前駆物質として発現され
るとき、ポリペプチドのＤＮＡに機能しうる状態で連結
される；プロモーターは、それがコード配列の転写を制
御するとき、コード配列に機能しうる状態で連結される
；また、リポソーム結合部位は、それが翻訳を可能にす
るように配置されるとき、コード配列に機能しうる状態
で連結される。一般に、゛機能しうる状態で連結される
″という表現は隣接することを意味し、分泌リーダーの
場合には、隣接してしかも同じリーディング・フレーム
で連結されることを意味する。酵母発現系での使用を目
的とした構造要素は、好ましくは、宿主細胞による翻訳
蛋白の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。ま
た、徂換え蛋白がリーダーまたは輸送配列なしで発現さ
れる場合、それはＮ末端メチオニン残基を含むことがで
きる。場合により、この残基は発現された組換え蛋白か
らその後切断されて、最終産物を与える。

微生物により発現される哺乳類ＴＮＦレセプターをコー
ドするＤＮＡ配列は、好ましくは、ＤＮＡのｍＲＮＡへ
の転写を早まって終止させるイントロンを含まないだろ
う。しかしながら、転写の早期終止は、例えば、それが
有利なＣ末端切断（例えば、細胞膜に結合しない可溶性
レセプターをもたらすトランスメンプラン領域の欠失）
をもつ変異体を生じさせる場合には、望ましいかも知れ
ない。遺伝暗号の縮重のために、同一のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列に相当の変動が存在しうる
。他の実施態様には、適度のストリンジェント条件（５
０°Ｃ！、２ＸＳＳＣ）下で所定のｃＤＮＡ配列にハイ
ブリダイズしうる配列、および生物学的に活性なＴＮＦ
レセプターポリペプチドをコードする配列にハイブリダ
イズまたは縮重している他の配列が含まれる。

組換えＴＮＦ−ＲＤＮＡは、組換え転写単位を染色体Ｄ
ＮＡに（形質転換またはトランスフェクションにより）
安定した状態で組み込んだ、または組換え転写単位を内
在プラスミドの一成分として保有する、適当な宿主微生
物（例えば、Ｅ、ｅｏｌｉのような細菌、またはＳ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母）の実質的に均質な単
一培養から成る組換え発現系により発現または増幅され
る。一般に、この系を構成する細胞は単一の先駆形質転
換細胞の子孫である。ここで定義される組換え発現系は
、発現しようとするＤＮＡ配列または合成遺伝子に連結
された調節要素の誘導の際に異種蛋白を発現するであろ
う。

形質転換宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を使って構築され
たＴＮＦ−Ｒベクターで形質転換またはトランスフェク
ションされた細胞である。形質転換された宿主細胞は通
常ＴＮＦ−Ｒを発現するが、ＴＮＦ−ＲＤＮＡのクロー
ニングまたは増幅のために形質転換された宿主細胞はＴ
ＮＦ−Ｒを発現する必要がない。発現されたＴＮＦ−Ｒ
は、選択したＴＮＦ−ＲＤＮＡに応じて、細胞膜にとど
まるか、まｌ；は培養上清に分泌されるだろう。

哺乳類ＴＮＦ−Ｒの発現に適する宿主細胞（ま、適当な
プロモーターの支配下にある原核生物、酵母または高等
真核生物の細胞である。原核生物（こけダラム陰性また
はグラム陽性生物、例えばＥ、ｃｏｌｉまたはバチルス
が含まれる。高等真核生物細胞には以下で述べるような
哺乳類由来の樹立された細胞株が含まれる。また、本発
明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使って哺乳類
ＴＮＦ−Ｒを作るために、無細胞翻訳系も使用できるだ
ろう。細菌、真菌、酵母、および哺乳類の細胞宿主と共
に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクター
はＰｏｕｖｅｌｓ　ｅｔ　ａｔ、　（ＣｌａｗｉｎｇＶ
ｅｃｔｏｒｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９
Ｂ５）に記載されており、この文献の関連内容は参照に
よりここに引用される。

原核生物発現宿主は広範な蛋白加水分解およびジスルフ
ィドプロセッシングを必要としないＴＮＦ−Ｒの発現に
使用される。原核生物発現ベクターは一般に１以上の表
現型選択マーカー（例えば、抗生物質耐性を与える蛋白
をコードする遺伝子または独立栄養要求を与える遺伝子
）、および宿主によって認識されて宿主内での増幅を確
突にする複製起点を含む。形質転換用の適当な原核生物
宿主には大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、枯草菌（Ｂｘｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　、ネズミチフス菌（Ｓａ
ｌｍａｎｅｌｌａｌｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　、および
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、スト
レプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ）、ブドウ
球菌属（５ｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に属する様々
な種が含まれるが、他の微生物を選んで使用してもよい
。

細菌用の有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび公
知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７
０１７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから誘導さ
れる細菌の複製起点を含む。

このような市販ベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３
　（Ｐｈ＊ｒａ＋ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ、　Ｕｐｐｓｘｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐ　Ｇ　ＥＭ　１　（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ　Ｂ。１０ｔｅｃ。

Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ、　ＵＳＡ）が含まれる。これ
らのＩ）ＢＲ３２２”バックボーン″部分は適当なプロ
モーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。

Ｅ、ｃｏｌｉは一般にＥ、ｃａｌｉ種から誘導されたプ
ラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を使って形質転換される
（Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　２：９
５．１９）？）、ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って形質転換細
胞の簡単な同定手段を提供する。

組換え微生物発現ベクターにおいて常用されるプロモー
ターには、！−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および
ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｎａｔｏｒｅ　２７５：６１５．１９０；Ｇｏｅｄ
ｄｔＩ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｊｕｒ　ｃ　２８１：
５４４．　１９７９）　　、　　ト　リプトファン（ｔ
ｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌｅｌ　ａｌ、、
　Ｎｕｃ！、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０Ｓ７．１
９８０；欧州特許公開第３６７７６号）、およびｔａｃ
プロモータ　−　（Ｍａｏｉｉｔｉｓ、　　Ｍｏ１ｓｃ
ｏｌａｒ　　ＣＩｏｎｉＢ：　　＾Ｌ！ｂａｒａｔｏｒ
ｙ　　！Ｊａｎｏａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｇ　
　Ｉｌ［ａｒｂｏｒＬａｂｏｒｓｔｏｒｙ、　ｐ、４１
２．１９０）が含まれる。特に有用な細菌発現系はファ
ージＡＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定
リプレッサーを使用する。λＰＬプロモーターの誘導体
を組み込んだアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから入手しうるプラスミドベクターは、Ｅ、ｃａ
ｌｉ　　Ｊ　Ｍ２Ｏ株（ＡＴＣＣ３７０９２）中に存在
するプラスミドｐＨＵＢ２、およびＥ、ｃｏｌｉ　ＲＲ
１株（ＡＴＣＣ５３０８２）中に存在するｐＰＬｃ２８
である。

また、組換えＴＮＦ−Ｒ蛋白は、酵母宿主、好ましくは
Ｓ、ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなサツカロミセス種か
らの宿主により発現させてもよい。ピキア属（Ｐｉｅｈ
ｉｉ）またはクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｃｒ。

ｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母も使用される。酵母
ベクターは一般にｌ酵母プラスミド由来の複製起点また
は自律複製配列（ＡＲ５）、プロモーター、ＴＮＦ−Ｒ
をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結の
配列、および選択遺伝子を含むであろう。好ましくは、
酵母ベクターは酵母と　Ｅ、ｃａ　ｌ　ｉの両方の形質
転換を可能にする複製起点および選択マーカー、例えば
、Ｅ、ｃｏｌｉおよびＳ、ｃｅｒｅｙｉｓｉａｅのアン
ピシリン耐性遺伝子、トリプトファン中での生育能を欠
く酵母変異株のための選択マーカーを提供するＴＲＰＩ
またはＵＲＡ３遺伝子、および下流の構造配列の転写を
誘導するための高度発現酵母遺伝子由来のプロモーター
を含むであろう。酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰｌまた
はＵＲＡ３欠損の存在は、トリプトファンまたはウラシ
ルの不在下で生育させることによって形質転換を検出す
るための有利な環境を提供する。

酵母ベクター用の適当なプロモーター配列には、メタロ
チオネインプロモーター　３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍλｎ　ｓｌ　ａｌ。

１９６！１；およびＨｏ１ｌａｎｄ　ｒｔ　ａｔ、、　
Ｂ。１０ｃｈｅｍ、　１７：１９ＧＧ、　１９０）　、
例えばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６
−リン酸インメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸インメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナ
ーゼが含まれる。酵母発現に適したベクターおよびプロ
モーターはＲ，Ｈｉｌｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、の欧州
特許公開第７３６５７号に詳しく記載されている。

好適な酵母ベクターは、Ｅ、ｃｏｌｉでの選択および複
製に適するｐＵｃ１８からのＤＮＡ配列（Ａｍ　ｐ　Ｔ
遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制ＡＤ）
１２プロモーターおよびｄ−因子分泌リーダーを含む酵
母ＤＮＡ配列を使って作製することができる。ＡＤ）Ｉ
２プロモーターはＲｕ５ｓｅｌｌｅｔ　ｘｌ、（Ｊ、Ｂ
。１０ｌ、Ｃｂｅｍ、　２Ｈ：２６７４．１９１２）お
よびＢｅ１ｅｒ　ｅｌ　ｘｌ、（Ｎａｔｕｒｅ　３００
ニア２４．１９ｇりに記載されている。異種蛋白の分泌
を支配する酵母コー因子リーダーは、プロモーターと発
現される構造遺伝子の間に挿入することができる。例え
ば、Ｋｕｒｊ＆ｎ　ｅｌ　ｍｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３０：
９３３．１９８２；　Ｂ口Ｌｅｔ　ｅｔａｌ、　　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎｔｌｌ、Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　Ｈ：５３
３Ｇ、　１９Ｎを参照されｔ；い。このリーダー配列は
、その３′末端近傍に、外米遺伝子へのリーダー配列の
融合を容易にするための１以上の有用な制限部位を含む
ように修飾されてもよい。

適当な酵母形質転換プロトコールは当分野で知られてお
り、代表的な技術がＨｉｎｎｅｎ　ｓｔ　ｘｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　？Ｓ
：ｌ９２９．１９７ｇに記載され、この技術は０．６７
％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース
、１０Ｎｇ／　ｍ　ｌアデニンおよび２ｅｒｇ７ｍｌウ
ラシルから成る選択培地中のＴｒｐ＋形質転換体を選択
するものである。また、アミノ酸と塩基を含む０．６７
％ＹＮＢから成る培地中のＵＲＡ＋形質転換体を選択す
る技術は、５ｂｓｒ旧ｎ　！Ｌ　ａｌ、。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｃｏｕｒｓｅ　　Ｍａｎｕａ
ｌ　　Ｉｏｒ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　１ｎＹｅａｓｔ　
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉａＨＨａｒ
ｂｏｒＬｓｂｅｒｘｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　　１９
８６に記載されている。

ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターで形質転換された
宿主細胞は、８０Ｎｇ　／　ｍ　１アデニンおよび８０
Ｎｇ　／　ｍ　＋ウラシルを補給した１％酵母エキス、
２％ペプトン、および１％または４％グルコースから成
るリッチ培地中で発現のために増殖させる。ＡＤＨ２プ
ロモーターの抑制解除は培地グルコースの枯渇により起
こる。粗製酵母上清は濾過により回収し、精製に先立っ
て４°Ｃに保持する。

また、種々の哺乳類または昆虫細胞培養系も組換え蛋白
の発現のために有利に使用される。哺乳類細胞による組
換え蛋白の発現は、この種の蛋白が一般に正しく折りた
たまれ、適切に修飾されて、完全に機能するので、特に
好適である。適当な哺乳類宿主細胞株の例には、Ｇｌｕ
ｚｍａｎ　（Ｃｅ旦２３：Ｉ７Ｓ。

１９Ｎ）に記載されるサル腎細胞のＣＯ５−７細胞、お
よび適当なベクターを発現しうる他の細胞株、例えばＬ
細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）　、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が含まれる
。哺乳類発現ベクターは、発現される遺伝子に連結され
た、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサ−
のような非転写要素、および他の５′または３′隣接非
転写配列、並びに必要なリポソーム結合部位、ポリアデ
ニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止
配列のような５′または３′非翻訳配列を含む。

昆虫細胞により異種蛋白を生産するためのバキュロウィ
ルス系はしｕｃｋｏｖ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｂ
。１０／ＴｅｃｈｎｏｌＢｙ　６：４７　（１９８８）
に載っている。

を椎動物細胞の形質転換に使用される発現ベクター中の
転写・翻訳調節配列はウィルス源から得ることができる
。例えば、常用されるプロモーターおよびエンハンサ−
はポリオーマ、アデノウィルス２、シミアンウィルス４
０．（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウィルス
から誘導される。

ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、Ｓ
Ｖ４０複製起点、初期および後期プロモーター、エンハ
ンサ−スプライス、およびポリアデニル化部位は、異種
ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝要素を提供すべく使
用される。初期および後期プロモーターは、これらがＳ
Ｖ４０ウィルス複製起点を含む断片としてこのウィルス
から容易に得られるので特に有用である（Ｆｉｅｒｓ　
ｓｔ　ｓｌ、。

Ｎｘ１ｕｒｅ　２７３：１１３．１９７８）　−より小
さいまたはより大きいＳＶ４０断片も、Ｈｉｎｄ１１１
部位からＢｇｌＩＩ部位（ウィルス複製起点中に位置す
る）まで延びる約２５０ｂｐの配列が含まれるという条
件で、使用することができる。さらに、哺乳類ゲノムＴ
ＮＦ−Ｒプロモーター、調節および／または／グナル配
列も、この種の調節配列が選ばれた宿主細胞と適合しう
るという条件で利用される。

組換え哺乳類ＴＮＦレセプターを生産するための哺乳類
高発現ベクターの使用に関する細部は以下の実施例２お
よび７に示しである。代表的なベクターはＯｋａｙａｍ
ａ　ａｎｄ　ＢｔＢ　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ。１０ｌ
、　３：２８０．１９８３）の方法により構築できる。

Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞による哺乳類レセプターｃ
ＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系は、実質的に
Ｃｏｓｍｘｎ　ｅｔ　ａｌ、（Ｍｏ１．Ｉｍ＋ａｍｎｏ
１．２３−：９３５．１９１６）によって開示されるよ
うに構築することができる。

本発明の好適な面において、ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡを含む
組換え発現ベクターは宿主細胞のＤＮＡに安定して組み
込まれる。発現産物のレベル上昇は増幅された数のベク
ターＤＮＡをもつ細胞株を選択することにより達成され
る。増幅された数のベクターＤＮＡをもつ細胞株は、例
えば、既知薬剤によって阻害される酵素をコードするＤ
ＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形質転換すること
により選択される。このベクターは目的の蛋白をコード
するＤＮＡ配列も含む。これとは別に、目的の蛋白をコ
ードするＤＮＡ配列を含む第二ベクターを用いて、宿主
細胞を同時形質転換することができる。その後、形質転
換または同時形質転換された宿主細胞は次第に増加する
濃度の既知薬剤の存在下で培養し、これにより薬剤耐性
細胞を選択する。このような薬剤耐性細胞は、しばしば
その酵素をコードする遺伝子の増幅の結果として、薬剤
により阻害される酵素を過剰生産するために、増加した
濃度の毒性薬剤の存在下で生き残る。薬剤耐性が阻害可
能な酵素をコードするベクターＤＮＡのコピー数の増加
によって起こる場合は、宿主細胞のＤＮＡにおいて目的
蛋白（ＴＮＦ−Ｒ）をコードするベクターＤＮＡの同時
増幅が起こっているだろう。

このような同時増幅のための好適な系は、薬剤メトトレ
キセート（ＭＴＸ）によって阻害されるジヒドロ葉酸還
元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）の遺伝子を使用する。同時増幅
を達成するためには、ＤＨＦＲをコードする活性遺伝子
を欠く宿主細胞を、ＤＨＦＲと目的蛋白をコードするＤ
ＮＡ配列を含むベクターで形質転換するか、またはＤＨ
ＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むベクターと目的蛋白
をコドするＤＮＡ配列を含むベクターとで同時形質転換
する。形質転換または同時形質転換された宿主細胞は次
第に増加する濃度のＭＴＸを含む培地で培養し、生き残
る細胞株を選択する。

特に好適な同時増幅系は、グルタミン酸とアンモニアの
合成（この反応を進行させるためにＡＤＰとリン酸への
ＡＴＰの加水分解を使用）に関与するグルタミンシンテ
ターゼ（ＧＳ）の遺伝子を使用する。ＧＳはいろいろな
阻害剤、例えばメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）に
よる阻害を受ける。従って、ＧＳと目的蛋白のＤＮＡ配
列を含むベクターで形質転換された細胞、またはＧＳを
コードするＤＮＡ配列を含むベクターと目的蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列を含むベクターとで同時形質転換され
た細胞を同時増幅し、この宿主細胞を次第に増加する濃
度のＭＳＸを含む培地で培養し、生存細胞を選択するこ
とによって、ＴＮＦＲを高濃度で発現させることが可能
である。ＧＳ同時増幅系、適当な組換え発現ベクター、
および細胞株は次のＰＣＴ出願：ＷＯ３７１０４４６２
、ＷＯ３９１０１０３６、ＷＯ３９／１０４０４、およ
びＷＯ３６１０５８０７に開示されている。

組換え蛋白は好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類宿主細胞、あるいはＰＣ
Ｔ出［ＷＯ３９／１０４０４およびＷＯ８６１０５８０
７ｉ：記載される、Ｓ　Ｐ　２１０−Ａｇ１４またはＮ
ＳＯのようなマウス・ミエローマ細胞株またはＹＢ２／
３．０−Ａｇ２Ｏのようなラット・ミエローマ細胞株に
おけるＤＨＦＲまたはＧＳの同時増幅により発現される
。

ＴＮＦ−ＲＤＮＡ発現用の好適な真核細胞ベクターは以
下の実施例２に示しである。ｐ　ＣＡ　Ｖ／ＮＯＴと呼
ばれるこのベクターは哺乳類の高発現ベクターｐＤＣ２
０１から誘導され、ＳＶ４０゜アデノウィルス−２、お
よびヒト・サイトメガロウィルス由来の調節配列を含ん
でいる。

組換えＴＮＦ−Ｒの精製 精−製された哺乳類ＴＮＦレセプターまたは類縁体は、
適当な宿主／ベクター系を培養して本発明ＤＮＡの組換
え翻訳産物を発現させ、その後培地または細胞抽出物か
らその産物を精製することにより得られる。

例えば、組換え蛋白を培地中に分泌する系からの上清は
、初めに市販の蛋白濃縮濾過装置、例えば、Ａｍ１ｃｏ
ｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒＣＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過
装置を使って濃縮される。濃縮工程後、濃縮物は適当な
精製マトリックスに加えられる。例えば、適当なアフィ
ニティーマトリックスは適当な支持体に結合されたＴＮ
Ｆ、レクチンまたは抗体分子を含むことができる。また
、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）基を宵するマトリックスまたは基
剤も使用できる。マトリックスはアクリルアミド、アガ
ロース、デキストラン、セルロース、または蛋白精製に
おいて普通に用いられる他の種類でありうる。

また、カチオン交換工程も使用される。適当なカチオン
交換体にはスルホプロピル基またはカルボキシメチル基
を有する不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピ
ル基が好適である。

最後に、１以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（
ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（
例、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシ
リカゲル）を使用して、ＴＮＦ−Ｒ組成物をさらに精製
するために行われる。

また、前記精製工程の一部または全部をいろいろに組み
合わせることにより、均質な組換え蛋白を得ることもで
きる。

細菌培養物により生産された組換え蛋白は、通常、細胞
ペレットからの抽出、これに続く１回以上の濃縮、塩析
、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー
工程により単離される。最後に、最終精製工程として高
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を行うこ
とができる。組換え哺乳類ＴＮＦ−Ｒの発現に使用した
微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的
破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた通常の方法で破
壊できる。

分泌蛋白として哺乳類ＴＮＦ−Ｒを発現する酵母の発酵
は精製を非常に単純化する。大規模発酵から得られる分
泌組換え蛋白は、Ｕｒｄａｌ　ｅｔ　ａｌ。

（Ｊ、ＣｈｒｏｍａｔＢ、２９６：１７１．１９８４）
により開示された方法と類似した方法により精製できる
。この文献は分離用ＨＰＬＣカラムで組換えヒトＧＭ−
Ｃ５Ｆを精製するための２連続逆相ＨＰＬＣ工程を述べ
ている。

組換え培養物により合成されたヒトＴＮＦ−Ｒよ、培養
物からヒトＴＮＦ−Ｒを回収するために採用した精製工
程に左右される量および性質の、蛋白を含む非ヒト細胞
成分の存在により特徴づけられる。これらの成分は通常
、酵母、原核生物、またはヒト以外の高等真核生物に由
来するものであり、好ましくは約１重量％より少ないく
らいの、無毒の汚染量で存在するであろう。さらに、組
換え細胞培養は、ＴＮＦ−Ｒが自然界でその起源様（例
、細胞、細胞浸出物または体液）中に存在するときＴＮ
Ｆ−Ｒと通常結合される蛋白を含まないＴＮＦ−Ｒの生
産を可能にする。

組換え可溶性ＴＮＦ−Ｈの治療上の投与本発明は、有効
量の可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白および適当な希釈剤および担
体を含有する治療用組成物の使用方法、並びに有効量の
可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白を投与することから成るヒトにお
けるＴＮＦ依存性炎症応答の抑制方法を提供する。

治療用途の場合、精製した可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白は、症
状に適したやり方で処置するために患者（好ましくはヒ
ト）に投与される。こうして、例えば、可溶性ＴＮＦ−
Ｒ蛋白組成物はポーラス注射、連続輸液、移植物からの
持続放出、または他の適当な手法により投与される。一
般に、可溶性ＴＮＦ−Ｒ治療剤は、生理学的に許容しう
る担体、賦形剤または希釈剤と共に精製蛋白を含有する
組成物の形で投与されるであろう。このような担体は投
与量および使用濃度で受容者に無毒性であるだろう。通
常、この種の組成物の調製はＴＮＦ−Ｒと緩衝剤、酸化
防止剤（例、アスコルビン酸）、低分子量（約１０残基
以下）ポリペプチド、蛋白、アミノ酸、炭水化物（グル
コース、スクロース、デキストリンを含む）、キレート
剤（例、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、他の安定剤または
賦形剤とを組み合わせることを必要とする。中性緩衝塩
溶液または同種血清アルブミンと混合した塩溶液が適当
な希釈剤の例である。好ましくは、製剤は希釈剤として
適当な賦形剤溶液（例、スクロース）を使って凍結乾燥
物として製剤化される。適切な投与量は試験により決定
できる。投与量および投与回数は、もちろん、治療すべ
き症状の性質および重症度、希望する応答、患者の健康
状態などの諸要因に左右されるであろう。

可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白はＴＮＦ依存性応答を抑制するた
めに投与される。いろいろな病気および疾患（例えば、
悪液質や敗血症性ショック）がＴＮＦによって引き起こ
されると考えられる。さらに、他の重要なサイト力イン
類（ＩＬ−１、ＩＬ−２、および他のコロニー形成刺激
因子）もＴＮＦの有意な宿主生産を誘発することができ
る。従って、可溶性ＴＮＦ−Ｒ組成物は、例えば、悪液
質や敗血症性ショックを治療するために、あるいはサイ
ト力イン療法に伴う副作用を治療するために使用される
。ＩＬ−１およびＩＬ−２はＴＮＦの生産において重要
な役割を演するので、両方のＩＬ−ルセプターまｌ；は
Ｔ　Ｌ−２レセプターを用いる併用療法がＴＮＦ関連臨
床疾患の治療に好適であるかも知れない。

以下の実施例は、制限としてではなく、例示として提供
されるものである。

（実施例） 実施例１ 結合検定 Ａ、ＴＮＦ＊およびＴＮＦ／の放射性ラベリング二Ｎ末
端に親水性オクタペプチドを含む融合蛋白の形の組換え
ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　ｔは酵母により分泌蛋白として発現さ
せ、アフィニティークロマトグラフィーで精製した（［
１ｏｐｐ　ｅｌ　３１．、　ＢｉＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　６：Ｉ２Ｇ４．１９８８）　、精製された組換え
ヒトＴＮＦβはＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｍｉｎｎｓ
ａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ）から購入した。両蛋白は市販の
固相剤、Ｉ　０ＤＯＧ　Ｅ　Ｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ）を使
って放射性標識化した。

この方法では、５μｇのｌ０ＤＯ−ＧＥＮを１０１０Ｘ
７５ガラス試験管の底に入れ、７５μｌの０．１Ｍリン
酸ナトリウムｐＨ７，４および２０７１１　（２ｍＣｉ
）のＮ　ａ　”’　Ｉと共に４°Ｃで２０分インキュベ
ートした。その後、この溶液をＰＢＳ４５μｌ中のＴＮ
ＦＩ（またはＴＮＦＩ）５μｇを含む第二のガラス試験
管に４℃で２０分間移した。

この反応混合物は２．５ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）　、０．２ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム、および
２０ｍＭヘペスｐＨ７，４を含むＲｏｓｖｃｌｌ　Ｐａ
ｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　１ｎｓｌｉｔｕｔｅ（ＲＰ　
Ｍ　！　）１６４０媒体（結合媒体）で平衡化した、２
ｍｌｍ各床のセファデックスＧ　−２５（Ｓｉｇｍａ）
でゲル濾過することにより分画化した。１２ｓｒ　　Ｔ
ＮＦの最終プールは結合媒体中ｌＸｌ０−’Ｍの原液に
希釈し、レセプター結合活性の検出しうる損失なしに４
°Ｃで１力月までの間貯蔵した。比活性は通常１　ｘ　
１０’ｃ　ｐｍ／ｍＭ　ＴＮＦである。

Ｂ、完全細胞への結合：完全細胞を用いた結合検定は２
つの方法で行った。第一の方法では、初めに細胞を懸濁
させて（例、Ｕ９３７）または組織培養皿に付着させて
（例、ＷＩ２６−ＶＡ４、組換えＴＮＦレセプターを発
現するＣＯ８細胞）増殖させた。付着細胞はその後５ｍ
ＭＥＤＴＡを用いて３７℃で１０分処理して培養皿から
はがした。結合検定は、本質的にＰａｒｋ　ｓｔ　ａｌ
、（Ｊ。

Ｂ。１０ｌ、Ｃｂｔｍ、　２６１：４１？７．１９８６
）によって開示されたフタレート油分離法（Ｄｏｗｅｒ
　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＩｍｚｕｎｏｌ、　１３２ニア５
１．　１９８４）により行った。１２５■−ＴＮＦの非
特異的結合は２００倍またはそれ以上の過剰モル量の未
標識ＴＮＦの存在下で測定した。アジ化ナトリウム（０
，２％）は細胞による”１−ＴＮＦのインターナリゼー
ション（取す込み）を阻害するために結合検定において
使用された。第二の方法では、ＴＮＦ−Ｒ含有プラスミ
ドでトランスフェクトされて細胞表面にＴＮＦレセプタ
ーを発現するＣＯＳ細胞が、５ｉｎｓ　ｅｌ　ａｔ。

（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２（１：５８５．１９８８）により
開示されたプレート結合検定によって”’Ｉ　　ＴＮＦ
を結合する能力について試験された。

Ｃ１固相結合検定：ＴＮＦ結合活性を保持下るヒト細胞
の洗剤抽出物からニトロセルロースに安定した状態で吸
着されるＴＮＦ−Ｒの能力は、ＴＮＦ−Ｒを検出する手
段を与えた。細胞抽出物は細胞ペレットを１％トリトン
Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害剤のカクテル（２ｍ
Ｍフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μＭペプスク
チン、１０μＭロイヘフチン、２ｍＭｏ−フェナントロ
リンおよび２ｍＭＥＧＴＡ）を含む２倍容量のＰＢＳと
激しくヴオルテックス混合することにより調製した。こ
の混合物を氷上で３０分インキュベートし、次に１２０
００ｘｇ、８°Ｃで１５分遠心して核と他の細胞破片を
除いた。細胞抽出物の２μｍアリコートを乾燥ＢＡ８５
／２１ニトロセルロース膜（Ｓｃｂｌｅｉｃｂｅｒ　ａ
ｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）の上に
おき、乾燥させた。これらの膜は組織培養皿に入れた３
　ｗ　／　ｖ％ＢＳＡを含むトリス（０，０５Ｍ）緩衝
塩溶液（０，１５Ｍ）中で３０分インキュベートして非
特異的結合部位をブロックした。その後、膜をＰＢＳ＋
３％ＢＳＡ中の５Ｘ　１０−”Ｍ　１２ｓＴ　−ＴＮＦ
　’Ｔ”７ｆ１つ”Ｃ１４℃テ振とうしながら２時間イ
ンキュベートした。この時間の終わりに、膜をＰＢＳ中
で３回洗い、乾燥し、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯｍａＬ　ＡＲ
７イルムの上に一７０℃で１８時間おいた。

実施例２ 各種のヒト細胞株は１２Ｓ　■−標識ＴＮＦを結合する
能力に基づいてＴＮＦ−Ｈの発現についてスクリーニン
グした。ヒト線維芽細胞株Ｗ！−２６ＶＡ４は細胞光た
り相当量のレセプターを発現することが分かった。平衡
結合実験により、この細胞株は細胞光たり約４００ｏ高
親和部位（Ｋａ＝１×１０１°Ｍ−１）および約１５０
０低親和部位（Ｋａ−ＩＸ１０’Ｍ−つと”’Ｉ−ＴＮ
Ｆとの２段階的結合を示すことが判明した。

標準技術（Ｇｕｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　
２５：２６３．１９８３；　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｌ　ａ
ｌ、、ｅｄｓ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ。１０ｌｏＢ、　Ｖｏ
ｌ、Ｉ、　１９８７）を使って、アメリカヤマゴボウ（
ｐｏｋｅｖｅｅｄ）マイトジェンの存在下に増殖させた
ヒト線維芽細胞ＷＩ−２６ＶＡ４細胞より抽出した全Ｒ
ＮＡがら単離したポリアデニル化ｍＲＮＡの逆転写によ
り、大きさにょって分画化されていないｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。細胞はグアニジン塩酸塩溶液中で溶
解することにより回収し、以前に開示された方法（Ｍａ
ｒｃｈ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｎａｊｕｒｃ３１５：６７１
．１９８５）により全ＲＮＡを単離した。

ポリＡ”ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースクロマトグラフ
ィーで単離し、Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆ１１ｓ
ｎ（Ｇｅｎｔ　２５＋２６３．１９８３）の方法と類似
した方法により二本鎖ｃＤＮＡを作製した。簡単に述べ
ると、ポリＡ　”ＲＮ　ＡはオリゴｄＴをプライマーと
して使って逆転写酵素によりＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリ
ッドに変換した。その後、ＲＮ　Ａ　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
　”イブリッドはＤＮＡポリメラーゼＩと共にＲＮＡア
ーゼＨを使って二本鎖ｃＤＮＡに変換した。得られた二
本ｇ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡをＴ４　　ＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端とした。この平滑末端化ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ニ、
一端のみでリン酸化されたＥｃｏＲｒリンカ−アダプタ
ー（内部Ｎｏｔ１部位をもつ）（ＩｏｖｉｔｒｏＢｎ）
を付加した。リンカー−アダプター付加ｃＤＮＡはＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼで処理してリンカー−アダプ
ターの５′突出領域をリン酢化し、未連結リンカ−はセ
ファロースＣＬ４ＢカラムにｃＤＮＡを流すことにより
除去した。リンカー−アダプター付加ｃＤＮＡは等モル
濃度のバクテリオファージλｇｔ　１０のＥｃｏＲ■切
断／脱リン酸化アームに連結した（Ｈｕｙｎｈ　ｅｔａ
ｌ、、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

Ｇ。１０ｖｔｒ、　ｃｄ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　
ｐ、４９−７８）　ａ連結ＤＮＡは市販のキットを使っ
てファージ粒子にパッケージングして組換え体のライブ
ラリーを作製した（Ｓｔｒｉｔ！ｇｅｎｅ　Ｃ１ｏｎｉ
ｎ！　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ
。

ＵＳ人）　、組換え体はＥ、ｃｏｌｉ　ｃ６００（ｈｆ
ｌ−）株の菌叢上にファージをまいてさらに増幅させた
。

ファージＤＮＡは得られたＪｇｔｌＯｃＤＮＡライブラ
リーから精製し、制限酵素Ｎｏｔｌで消化してｃＤＮＡ
挿入物を切り取った。アガロースゲルによる消化物の電
気泳動後、２０００ｂｐより大きいｃ　ＤＮＡを単離し
た。

得られたｃ　ＤＮＡは、哺乳類細胞にトランスフェクト
したとき多重クローニング部位に挿入されたｃＤＮＡ配
列を発現するようにデザインされた、真核生物発現ベク
ターｐ　ＣＡ　Ｖ　／　Ｎ　ＯＴに連結した。ｐＣＡＶ
／ＮＯＴはｐＤｃ２０１　（ｐＭＬＳＶの誘導体、以前
にＣｏｓｍｘｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ！ｔｕｒｅ　３１
２ニアＮ、１９０１：よッテ開示された）、ＳＶ４０、
およびサイトメガロウィルスＤＮＡから構築され、複製
起点から転写の方向で順に、（１）複製起点、エンハン
サ−配列、初期および後期プロモーターを含むコオーデ
ィネート５１７１−２７０のＳＶ４０配列：（２）プロ
モーターおよびエンノ＼ンサー領域を含むサイトメガロ
ウィルス配列（Ｂｏｅｃｈｘｒｌ　ｅｌ　ｓｌ、、　Ｃ
ｅ１ｌ　４１：５２１．１９８５により発表された配列
からのヌクレオチド６７１から＋６３まで）；　　（３
）３分節（ｔｒｉｐｓｒｔｉｔｅ）リーダーの第一エク
ソンおよび第一エクソンと第二エクソン間のイントロン
の一部、３分節リーダーの第二エクソンおよび第三エク
ソンの一部、並びにＸｈｏｌ、ＫｐｎｌＳ　Ｓｍａｌ、
Ｎｏ　ｔ　Ｉ、およびＢｇ１１部位を含む多重クローニ
ング部位（ＭＣ３）を含むアデノウィルス−２配列；　
（４）初期転写のためのポリアデニル化および終結シグ
ナルを含むコオーディ不−ト４１２７−４１００および
２７７０−２５３３からのＳＶ４０配列；（５）ＶＡＩ
およびＶＡＩ［遺伝子を含むアデノウィルス配列１０５
３２−１１１５６の後にアンピシリン耐性遺伝子と複製
起点を含む４３６３−２４８６および１０９４−３７５
からのｐＢＲ３２２配列が続く、ｐＢＲ３２２由来の配
列およびｐＤＣ２０１のウィルス関連配列ＶＡＩおよび
ＶＡ■：を含んでいる。

得られたｐＣＡＶ／ＮＯＴ中のＷＩ−２６ＶＡ４　　ｃ
ＤＮＡはＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ１１５ｊ株を形質転換するた
めに使用した。形質転換体はプレート当たり約８００コ
ロニーを与えるようにまき、スクリーン当たり約５ｏｏ
ｏｏの全コロニーを与えるに足るプレートを使用した。

コロニーを各プレートからかき取り、プールし、そして
各プールからプラスミドＤＮＡを調製した。その後、プ
ールしたＤＮＡＩｎ５ｔ、　４１：３Ｓｌ、　１９８６
）により開示されたように、ＤＥＡＥ−デキストランと
その後のクロロキン処理を使ってサルＣＯ３−７細胞の
不完全生長層をトランスフェクトするために使用した。

次いで、細胞を３日間培養して、挿入した配列を一時的
に発現させた。３日後、培養上清を捨て、各プレートの
細胞単層はＴＮＦ結台について次のように検定した。１
　、　２　Ｘ　１０−”Ｍ　　１２Ｊ−漂識ＦＬＡＧ（
商標名）−ＴＮＦを含む結合媒体３ｍｌを各プレートに
加え、プレートを４°Ｃで１２０分インキュベートした
。次に、この媒体を捨て、各プレートを冷結合媒体（標
識ＴＮＦ不含）で１回、冷ＰＢＳで２回洗った。その後
、各プレートの縁を壊し、平らなディスクを残し、この
ディスクは増感スクリーンを使ってＸ線フィルムと一７
０℃で７２時間接触させた。ＴＮＦ結合活性は比較的均
一なバックグラウンドに対して黒点として露光フィルム
上に視覚化された。

この方法で、ライブラリーからの約２４００００個の組
換え体をスクリーニングした後で、１つのトランスフェ
クタントプールはバックグラウンド露光に対して明らか
なＴＮＦ結合黒点を与えることが観察された。

その後、陽性プールからの細菌の凍結物は約１５０コロ
ニーのプレートを得るために使用した。

これらのプレートのレプリカをニトロセルロースフィル
ター上につくり、その後プレートからコロニーをかき取
り、プラスミドＤＮＡを調製し、上記のようにトランス
フェクトして陽性プレートを同定した。このプレートの
ニトロセルロースレフリカからの個々のコロニーの細菌
は０．２ｍｌ培地中で増殖させ、細菌からプラスミドＤ
ＮＡを回収し、これを上記のようにＣＯ５−７細胞にト
ランスフェクトした。この方法で、単一のクローン、ク
ローン１１が単離され、これはＣＯ８細胞によるヒトＴ
ＮＦ−Ｒの発現を誘導することができた。

ＴＮＦ−ＲｃＤＮＡクローン１を含む発現ベクターｐＣ
ＡＶ／ＮＯＴはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖ！。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２．　ＵＳＡ）
に受託番号６８０８８としてｐｃＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦ
−Ｒという名称のもとに寄託された。

実施例３ 可溶性ｈ　ｕＴＮＦ−ＲΔ２３５をコードするｃＤＮＡ
の構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５（第２Ａ図のアミノ酸１
−２３５の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔｌおよびＰｖｕＩ［を用いてｐＣＡＶ／Ｎ０
Ｔ−ＴＮＦ−Ｒから８４０ｂｐ断片を切断することによ
り構築した。ＮｏｔＩはｐＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦ−Ｒ
の多重クローニング部位を切断し、そしてＰｖｕＵはト
ランスメンプラン領域の５′側から２０ヌクレオチドの
ＴＮＦ−Ｒコード領域内を切断する。ＴＮＦ−Ｒ配列の
３／末端を再構築するために、２つのオリゴヌクレオチ
ドを合成し、アニーリングして次のオリゴヌクレオチド
リンカーを作った：ＡｌａＧｌｕＧｌｙＳｅｒＴｈｒＧ
ｌｙＡＳｐ７このオリゴヌクレオチドリンカーは末端Ｐ
ｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を有し、ＴＮＦ−Ｒ
の２０ヌクレオチド、これに続く終結コドン（下線が引
いである）およびＢａｍＨＩ制限部位（ＮｏｔＩ　／　
Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１消化により全可溶性ＴＮＦ−Ｒを単離
するのに便利）を再生する。このオリゴヌクレオチドは
その後ＢｇｌＩ［／Ｎｏｔｌ切断ｐＣＡＶ／Ｎ　ＯＴ中
の８４０ｂｐのＮ　ｏ　ｔ　Ｉ　／　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ［
ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結してｐｓｏｌｈｕＴＮＦＲΔ２
３５／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のようにＣＯ
３−７細胞にトランスフェクトした。この発現ベクター
は可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現されたＴ
ＮＦ−ＲはＴＮＦを結合することができた。

実施例４ 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８５をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８５　（第２Ａ図のアミノ酸
１−４８５の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制
限酵素ＮｏｔｌおよびＢｇｌＩＩを用いてｐＣＡＶ／Ｎ
０Ｔ−ＴＮＦ−Ｒから６４０ｂｐ断片を切断することに
より構築した。ＮｏｔＩよＩ）ＣＡＶ／Ｎ０Ｔ−ＴＮＦ
−Ｒの多重クローニング部位を切断し、そしてＢｇｌＩ
［はトランスメンブラン領域の５′側から２３７ヌクレ
オチドのヌクレオチド６３７でＴＮＦ−Ｒコード領域内
を切断する。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合成し
た： 哨 Ｕ〕 上記のオリゴヌクレオチドリンカーはヌクレオチド７０
８までのレセプター分子の３′末端、これに続く終結コ
ドン（下線が引いである）を再構築する。これらのオリ
ゴヌクレオチドはその後Ｎ。

ｔｒ切断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の６４０ｂｐのＮ。

ｔＩ　　ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結させて発現ベクタｐｓ
ｏｌＴＮＦ−ＲΔ１８５／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これ
を上記のようにＣ０８−７細胞にトランスフェクトした
。この発現ベクターは可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘
導し、発現されたＴＮＩ”−ＲはＴＮＦを結合すること
ができた。

実施例５ 可溶性ｈｕＴＮＦ−Ｒ△１６３をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−Ｒ△１６３（第２Ａ図のアミノ酸１
−１６３の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、実施
例４に記載したように制限酵素ＮｏｔｌおよびＢｇｌＩ
ｌを用いてｐＣＡＶ／Ｎ。

Ｔ−ＴＮＦ−Ｒから６４０ｂｐ断片を切断することによ
り構築した。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合成し
た： Ｂｇｌ　ＩＩ　　　　　　　Ｎｏｔ　１５”−ＧＡＴＣ
ＴＧＴ工Ｇ△ＧＣ−３瞥ＡＣＡＡＣＴＣＧＣＣＧＧ 工１ｅｃｙｓＥｎｄ 上記のオリゴヌクレオチドリンカーはヌクレオチド６４
２（アミノ酸１６３）までのレセプター分子の３′末端
、これに続く終結コドン（下線が引いである）を再構築
する。このオリゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ切断ｐ
ＣＡＶ／ＮＯＴ中の６４０ｂｐのＮｏｔＩＴＮＦ−Ｒ挿
入物と連結させて発現ベクターｐＳＯＩＴＮＦ−ＲΔ１
６３／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のようにＣＯ
５−７ｍａにトランスフェクトした。この発現ベクター
は可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現されたＴ
ＮＦ−Ｒは実施例１で述べた結合検定においてＴＮＦを
結合することができた。

実施例６ 可溶性ｈｕＴＮＦ−Ｒ△１４２をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−Ｒ△ｌ　４２　（第２Ａ図のアミノ
酸１−１４２の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、
制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｌｗＮＩを用いてｐＣＡＶ／
Ｎ０Ｔ−ＴＮＦ−Ｒから５５０ｂｐ断片を切断すること
により構築した。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合
成したｎｄ 上記のオリゴヌクレオチドリンカーはヌクレオチド５７
９（アミノ酸１４２）までのレセプター分子の３′末端
、これに続く終結コドン（下線が号イテする）を再構築
する。このオリゴヌクレオチトハソ（７）後ＮｏｔＩ／
Ｂｇｌｌ［切％ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の５５０ｂｌ）のＮ
ｏ　ｔ　Ｉ／Ａ　Ｉ　ｗＮ　Ｉ　　ＴＮＦ−Ｒ挿入物と
連結させて発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦ−Ｒ△１４２／
ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のようにＣＯ３−７
細胞にトランスフェクトした。この発現ベクターはＴＮ
Ｆを結合しうる可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導しな
かった。この特定構築物は、（ＴＮＦ−Ｒ分子の適切な
三次構造を形成するための）分子内結合に必要なシステ
ィン残基（例えば、Ｃｙｓ１５７または（ｙ　ｓ　ｌ　
６１　）が１個またはそれ以上除かれたために、生物学
的に活性なＴ　Ｎ　Ｆ　、−Ｒを発現するのに失敗した
と考えられる。

実施例７ ＣＨＯ細胞による可溶性ＴＮＦレセプターの発現可溶性
ＴＮＦレセプターは、実質的にＰＣＴ特許出願ＷＯ３７
１０４４６２およびＷＯ３９１０１０３６に記載される
ように、グルタミン−シンテターゼ（ＧＳ）遺伝子増幅
系を使ってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
により発現させた。簡単に説明すると、ＣＨＯ細胞はＴ
ＮＦ−ＲとＧＳの両方の遺伝子を含む発現ベクターでト
ランスフェクトされる。ＣＨＯ細胞は、トランスフェク
トされたＤＮＡが低レベルのメチオニンスルホキフミン
（Ｍ　Ｓ　Ｘ　）に対する耐性を賦与するその能力に基
づいてＧＳ遺伝子発現について選択される。このような
細胞内のＧＳ配列増幅現象はＭＳＸ濃度の上昇を用いて
選択される。この方法では、隣接するＴＮＦ−Ｒ配列も
増幅され、ＴＮＦ−Ｒ発現の増加が達成される。

Ｇ５発現系で用いるベクターはｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６
／ＰＳＶＬＧＳであり、これは次のように構築した。初
めに、ベクターｐｓＶＬＧｓ、１（ＰＣＴ出願ＷＯ３７
１０４４６２およびＷＯ５９１０Ｉ　Ｑ　３６に開示さ
れており、Ｃｅ１Ｈｅｃｂ。

ｔ、ｔｄ、、　Ｂｅｔｋｓｈｉｒｅ、　ＵＫから入手で
きる）をＢａｍＨ１制限酵素で切断し、ウシ腸アルカリ
性ホスファターゼ（（ＩＡＰ）で脱リン酸化してベクタ
ーがそれ自体に再連結しないようにした。その後、Ｂａ
ｍＨＩ切断ｐＳＶＬＧＳ、１断片は、Ｂｇｌ■、Ｂａｍ
ＨＩおよびＦｓｐＩ　　（同じ大きさの２つの断片を回
避するため）で切断したｐＥＥ６ｈＣＭＶ　（ＰＣＴ出
願ＷＯ３９１０１０３６に開示されており、Ｃｅ１ｌｌ
ｅｃｈから入手できる）の２゜４、ｋｂ　　ＢａｍＨＩ
／Ｂｇｌｌ［断片に連結させて、ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ、
１と呼ばれる１１．２ｋｂベクターを作製した。Ｉ）Ｓ
ＶＬＧＳ、１１；ＬＳＶ４０後期プロモーターの支配下
にあるグルタミンシンテターゼ選択マーカー遺伝子を含
む。ｐＥＥ６ｈＣＭＶのＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ［断片はヒ
ト・サイトメガロウィルス主要即時（ｉｍｍｅｄ目１ｅ
　ｅａｒｌｙ）プロモーター（ｈＣＭＶ）、ポリリンカ
ー、およびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含む
。

可溶性ＴＮＦ−Ｒのコード配列は、発現ベクターｐ　ｓ
　ｏ　ＩＴＮＦＲ／ＣＡＶＮＯＴ　（上記実施例３に従
って作製した）からＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片を切断し
、Ｋｌｅｎｏｖで平滑末端となし、ＳｍａＩ切断脱リン
酸すｐ６／ＰＳＶＬＧＳ、１と連結させることによって
ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ、　　１に挿入し、これにより５ｏ
ｌＴＮＦ−Ｒコード配列をｈＣＭＶプロモーターの支配
下においた。これはＳＶ４０／ＧＳおよびｈ　ＣＭＶ／
　ｓ　ｏ　ｌ　ＴＮＦ　−Ｒ転写単位が相反する方向で
転写される単一のフラスミドベクターをもたらした。こ
のベクターはｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ
と命名された。

ｐｓｏ　ＩＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳを使ってＣＨ
Ｏ−Ｋｌ細胞（Ａ　Ｔ　ＣＣ、Ｒｏｃｂｖｉｌｌｅ、　
ＭＤから受託番号ＣＣＬ　　６１として入手可能）を次
のようにトランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞の単
層は１０％透析ウシつ児血清（Ｇｉｂｃｏ：　２２０６
３００ＡＪ）、１．ｍＭピルビン厳ナナトリウムＳｉｇ
ｍａ）　、ＭＥＭ非必須アミノＨ（Ｇｉｂｃｏ：　３２
０−ＩＨＩＡＧ）　、５００μＭアスパラギンおよびグ
ルタミン酸（ＳｉＨｎａ）およびヌクレオシド類（３０
ｐＭアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン
および１０μＭチミジン）　　（Ｓｉｇｍｘ）を補給し
たグルタミン不合最少必須培地（ＭＥＭ）ＩＯＸ（Ｇｉ
ｉ＋ｃｏ：３３０−１ｓ８１ＡＪ）で不完全集密的（ｓ
ａｂ−ｃｏｎｌｌｕｅｎｃｙ）に増殖させた。

約ｌＸｌ０’細胞／　１０　ｃ　ｍベトリ皿は、実質的
に　Ｇｒａｂａｍ　＆　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｙｉ
ｒｏｌｏｇｙ　５２：１５６　（１９８３）に開示され
るように、標準的なリン酸カル／ウム沈降により１ｏｐ
ｇのｐ　ｓ　ｏ　Ｉ　ＴＮＦＲｉＰ６／ＰＳＶＬＧＳで
トランスフェクトした。その後、実質的にＦｒｏｓｔ　
＆　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　ＶｉｒａｌｏＢ　９１：３９
　（１９７８）に記載されるように、細胞はトランス７
エクノヨンの約４時間後にグリセロールンヨック（無血
清培地中の１５％グリセロールで約１゜５分）に付し、
無血清培地で洗った。１日後、トランスフェクトした細
胞に２５μＭの最終濃度でＭＳＸを含む新しい選択培地
を供給した。Ｍ　Ｓ　Ｘ耐性生存細胞のコロニーは３〜
４週間以内に肉眼で見えた。生存コロニーを２４−ウェ
ルプレートに移し、選択培地で集密的に増殖させた。集
密的ウェルからのならし培地はその後上記の実施例１で
説明した結合検定を用いて、可溶性ＴＮＦ−Ｒ活性につ
いて調べた。これらの検定は、コロニが生物学的に活性
な可溶性ＴＮＦ−Ｒを発現することを示した。

ＧＳ遺伝子の増幅について選択するために、数種類のＭ
ＳＸ耐性細胞株をｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧ
Ｓでトランスフェクトし、いろいろな濃度のＭＳＸ中で
増殖させた。各細胞株において、約ｌＸｌ０’細胞を次
第に増加する濃度の１００１１Ｍ、　　２５０μＭ、　
　５００μＭおよび１ｍＭＭ　Ｓ　Ｘの存在下にまき、
１０〜１４日間インキュベートした。１２日後、比較的
高濃度のＭ　Ｓ　Ｘに対して耐性を示すコロニーが出現
した。生き残っているコロニーは実施例１に記載した結
合検定を使ってＴＮＦ−Ｒ活性について調べた。これら
の高度に耐性の細胞株は、複数の独立した増幅現象より
生じた細胞を含んでいる。これらの細胞株から、１つま
たはそれ以上の最も強く耐性を示す細胞株が単離された
。その後、高生産性の増幅細胞は限界希釈クローニング
によりクローン化した。

トランス７エクタントの大量培養物は生物学的に活性な
可溶性ＴＮＦ−Ｒを分泌した。

実施例８ 酵母による可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現可溶性ヒトＴＮ
Ｆ−Ｒは、酵母発現ベクターｐＩＸＹ１２０およびプラ
スミドｐＹＥＰ３５２から誘導された発現ベクターｐＩ
ＸＹ４３２を用いて酵母により発現させた。ｐＩＸＹ１
２０は、それがｃＤＮＡ挿入物を含まず、ポリリンカー
／多１クローニング部位（Ｎｃａｌ制限部位を含む）を
有することを除いて、ｐ　ＹｇＨｕ　ＧＭ　（ＡＴＣＣ
５３１５７）と同一である。

ＴＮＦレセプターをコードし、酵母発現ベクターｐｒｘ
ｙｉ２ｏにクローニングするのに適しｔ：ＤＮＡ断片は
、ｐ　Ｃ／、　Ｖ　／　Ｎ　ＯＴ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｒ
カらの全長レセプターの細胞外部分のポリメラーゼ鎖反
応’（ＰＣＲ）増幅により生成させた。このＰＣＲ増幅
では、次のプライマーを使用しｌ；：Ａｓｐ”７１８−
＞Ｐ　ｒＯＬｅｕＡ５ｐ：ＬｙＳＡｒ９Ａ５ｐＴｙｒＬ
ｙＳＡＳｐ増幅に用いた５′末端オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、その５′末端にＡｓｐ７１８制限部位、こ
れに続いて酵母Ｃ−因子リーダー配列の３′末端（Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）をコードするヌ
クレオチド、および成熟レセプタの５′末端をコードす
る配列に融合されたＦＬＡＧ（商標名）ペプチド（Ａｓ
ｐＴｙｒＬｙｓＡｓ　ｐＡｓ　ｐＡｓ　ｐＡｓ　ｐＬｙ
　ｓ）の８アミノ酸をコードする配列を含んでいた。Ｆ
ＬＡＧペプチド　　（Ｉｌｃｐｐ　　　ｔｌ　　　ａｔ
、、　　　Ｂｉｃ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ（ｙ　　　６：１
２０４．　　１９８ｇ）はモノクローナル抗体Ｍｌ　（
ＡＴＣＣ）（Ｂ　　９２５９）を可逆的に結合する高度
に抗原性のある配列である。ＰＣＲ誘導断片の３′末端
を生成させるために使用したオリゴヌクレオチドは、Ｔ
ＡＡ停止コドン（下線が引いである）を導入することに
よって成熟コード領域のヌクレオチド７０４の後（トラ
ンスメンブランドメインに先行するＡｓｐ残基の後）で
レセプターのオーブン・リーディング・フレームを終わ
らせるＤＮＡコード配列のアンチセンス鎖である。停止
コドンの後にＢａｍＨＩ制限部位が存在する。ＴＮＦ−
ＲをコードするＤＮＡ配列はその後、実質的に　１ｎｎ
ｉｓ　ｅｒ　ａｔ、。

ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔ。１０ｎｓ　
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９９０）に開示
されるように、ＰＣＲによって増幅される。

可溶性ヒトＴＮＦ−ＲをコードするＰＣＲ誘導ＤＮＡ断
片は、ＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＡｓ　ｐ７
１８制限酵素で消化し、ｐｌＸＹ１２０をＢａｍＨＩと
Ａｓｐ７１８で消化し、ＰＣＲ断片を切断ベクターに７
４　　ＤＮＡリガーゼを用いてｉｎ　ｖｉ＋ｒｏで連結
することにより、酵母発現ベクターＩ）ＩＸＹ１２０に
サブクローニングした。得られた構築物（ｐｌＸＹ４２
４）はＦ　Ｌ　、ＡＧ−可溶性ＴＮＦレセプターのオー
プン・リーディング・フレームを完全なぜ一因子リーダ
ー配列に同調融合させ、そして酵母による発現を調節さ
ｉｔた酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プ
ロモーターの支配下に置いた。ｐＩＸＹ４．２４に保有
される可溶性ＴＮＦレセプターのヌクレオチド配列とｃ
ＤＮＡクローン１中の配列との同一性は、ジデオキシヌ
クレオチド・チエイン・ターミイ・−ジョン法を使って
ＤＮＡ塩基配列を決定することにより証明した。ｐＩＸ
Ｙ４２４はその後Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲ１株に形質転換し
た。

また、可溶性ヒトＴＮＦレセプターは第二ベクターを使
って酵母により発現・分泌させた。この第二ベクターは
、ｐｌＸＹ４２４プラスミドを　Ｅ。

ｃｏｌｉから回収し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨｒ制限酵素
で消化して、ＡＤＨ２プロモーター、ｌ−因子リーダー
　ＦＬＡＧ−可溶性ＴＮＦレセプターおよび停止コドン
をコードする領域にわたる断片を単離し、この断片をＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ切断プラスミド
ｐＹＥＰ３５２　（Ｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｙｅａｓｔ　２：１６３　（１９８６））に　ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏで連結して、発現プラスミドｐＩＸＹ４３２を
得ることにより作製した。この発現プラスミドｐＩＸＹ
４３２はＥ、ｃｏｌｉ　ＲＲ１株に形質転換した。

可溶性ヒトＴＮＦレセプターの酵母からの分泌を評価す
るために、ｐｌＸＹ４２４はＭ！ｌ−ｃ、エレクトロポ
レーションにより　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ＊ｅ　（ＸＶ
　２１．８１　）の２倍体酵母株に導入し、トリプトフ
ァン欠損培地でプラスミド由来酵母ＴＲＰＩ”遺伝子の
獲得について選択した。ｐｌＸＹ４３２により誘導され
たレセプターの分泌を評価するために、このプラスミド
はエレクトロポレーションにより酵母ＰＢ１４９−６ｂ
に導入し、次いでウラシル欠損培地で増殖させてプラス
ミド由来ＵＲＡ３＋選伝子について選択した。培養物は
適当な選択培地中３０°Ｃで一晩増殖させた。ＰＢ１４
９−６ｂ／ｐｌＸＹ４３２形質転換体はＹＥＰ−１％グ
ルコース培地に希釈し、３０°Ｃで３８〜４０時間増殖
させた。遠心して細胞を除き、０．４５μフイルターを
通して濾過することにより上清を調製した。

上清中に分泌されたレセプターのレベルはイムノ−ドツ
トプロットにより測定した。簡単に説明すると、１μｍ
の上清と上清の希釈物を二ｌ−ロセルロースフィルター
に点在させ、乾燥させた。３％ＢＳＡ溶液で非特異的蛋
白結合をブロックした後、このフィルターを希釈したＭ
１抗ＦＬＡＧ抗体とインキュベートし、過剰の抗体を洗
浄して除き、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス
ＩｇＧ抗体の希釈物をフィルターとインキュベートした
。過剰の第二抗体を除去した後、ベルオキンダーゼ基質
を加え、約１０分間発色させた後で基質溶液を除去した
。

上清中に存在する抗ＦＬＡＧ反応性物質は、有意なレベ
ルのレセプターが両方の発現系により分泌されたことを
立証した。両発現系の比較により、ｐｌＸＹ４３２系は
ｐｌＸＹ４２４糸よりも約８〜１６倍多い可溶性ヒトＴ
ＮＦレセプターを分泌することが分かった。上溝は、実
施例１に記載したように、”’Ｉ−ＴＮＦσを結合して
ＴＮＦＩ結合を阻止する能力により、可溶性ＴＮＦ−Ｒ
活性について検定した。ｐＩＸＹ４３２上清は有意なレ
ベルの活性可溶性ＴＮＦ−Ｒを含むことが見いだされた
。

実施例９ マウスＴＮＦ−ＲｃＤＮＡの単離 マウスＴＮＦ−ＲｃＤＮＡは、ヒトＴＮＦＲフローブと
の交差種ハイブリダイゼーションにより、Ｃ５７ＢＬ／
６マウス由来の抗原依存性へ。

ルバーＴ細胞株、マウス７Ｂ９細胞より作製されｆ：　
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから単離した。ｃＤＮＡラ
イブラリーは、実質的に実施例２に記載したように、７
Ｂ９細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離することによ
り、２Ｚ　Ａ　Ｐ　（Ｓｉｒ！（ａｇｅｎｔ、　Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ）中に作製した。

二本鎖ヒトＴＮＦ−ＲｃＤＮＡプローブは、ヒトＴＮＦ
−Ｒクローン１の約３．５ｋｂＮｏｔｌ断片を切断し、
このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをランダムブライ？　−（Ｂｏｅｂ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｏａｂｅｉｍ）を使って３２ｐ−ラ
ベリングすることにより作った。

マウスｃＤＮＡライブラリーは一度増幅させ、全部Ｔ９
００，０００プラークをヒトＴＮＦ−ＲｃＤＮＡグロー
ブで実質的に実施例２に記載したようにスクリーニング
した。約２１の陽性プラークを精製し、ＥｃｏＲＩリン
カ−付加挿入物を含む　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ＋　　プラ
スミドを切断した（Ｓｌｔａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄ
ｉｅｇｏ）　。マウスＴＮＦ−Ｒクローン１１の部分の
核酸配列解析により、マウスＴＮＦ−Ｒのコード配列は
ヒトＴＮＦ−Ｒの対応ヌクレオチド配列と約８８％相同
であると判明した。マウスＴＮＦ−ＲｃＤＮＡクローン
１１の部分ヌクレオチド配列は第３Ａ−３Ｂ図に示しで
ある。

実施例１０ ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体の調製精製した
組換えＴＮＦ−Ｒ（例、ヒトＴＮＦ−Ｒ）の調製物、ま
たは高レベルのＴＮＦ−Ｒを発現するトランスフェクト
されたＣＯ５細胞を使用して、慣用技法により、例えば
米国特許第４４１１９９３号に記載される方法により、
ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体を製造した。こ
の種の抗体はＴＮＦレセプターへのＴＮＦ結合を妨げる
のに、例えばＴＮＦの毒性または他の望ましくない作用
を改善するために、あるいはＴＮＦまたは可溶性ＴＮＦ
レセプターの診断または検索アッセイの成分として、有
用であるだろう。

マウスを免疫するために、ＴＮＦ−Ｒ免疫原を完全フロ
インドアジュバントで乳化し、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに１
０〜１００μｇの量を皮下注射した。１０〜１２日後、
免疫した動物に不完全フロインドアジュバントで乳化し
た追加免疫原を投与し、その後定期的に毎週または隔週
免疫スケジュールで追加免疫を施した。血清サンプルを
トンドブロット検定（抗体サンドイッチ）またはＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）で試験する
ために、眼窩後方採血もしくは尾先端切除により定期的
にす〉・プルを採取した。その他のアッセイ法も適して
いる。適当な抗体価の検出後、陽性動物に食塩水中の抗
原を静脈内注射した。３〜４日後、動物を殺し、肺細胞
を回収し、マウス・ミエローマ細胞株ＮＳＩに融合させ
た。この方法によって得られたハイブリドーマ細胞株は
、多重マイクロタイタープレートを使って、非融合細胞
、ミエローマハイブリッドおよび肺細胞ハイブリッドの
増殖を抑制するＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミ
ノグチリンおよびチミジン）にまいた。

このようにして得られたハイブリドーマクローンは、例
えばＥｎＨｖａｌｌ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｂｅｍ、８：８月（１９７＋）および米国特許第４７０
３００４号に記載された技術を用いて、ＴＮＦ−Ｒとの
反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングすることが
できる。その後、陽性クローンを同系Ｂａ１ｂ／Ｃマウ
スの腹腔内に注射して、高濃度（＞　ｌ　ｍ　ｇ／　ｍ
　Ｉ　）の抗ＴＮＦ−Ｒモノクローナル抗体を含む復水
を得た。このモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム
沈澱とその後のゲル排除クロマトグラフィーおよび／ま
たは５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのプ
ロティンＡへの抗体の結合に基づいたアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製した。

・１　　〔図面の簡単な説明１ 第１図は、ヒトおよびマウスＴＮＦ−Ｒをコードする種
々のｃ　ＤＮＡのコード領域の模式図である。リーダー
配列は斜線で、トランスメンブラン領域は黒で示しであ
る。

第２Ａ−２Ｂ図は、ヒトＴＮＦ−Ｒクローン１０部分ｃ
ＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。ヌクレオチ
ドは５′非翻訳領域の始めから番号がつけである。アミ
ノ酸はシグナルペプチド配列の始めから番号がつけであ
る。推定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２な
いし−１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端
ロイシンは位置ｌに下線が引いである。アミノ酸２３６
−２６５の推定トランスメンプラン領域にも下線が引い
である。種々の可溶性ＴＮＦ−ＲのＣ末端には矢印（↑
）がつけである。

第３Ａ−３Ｃ図は、マウスＴＮＦ−Ｒクローン１１のｃ
ＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推定上のシ
グナルペプチド配列はアミノ酸２２ないし−ｌにより表
される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリンは位置１に
下線が引いである。

アミノ酸２３４−２６５の推定トランスメンプラン領域
にも下線が引いである。

代　　理　　人　　弁理士　　　湯　　浅　　恭　　三
（−、、−ｗ （外４名） Ｌ−１１１ 乙社−二五一１１ Ｍ−τ）ＴＦ−Ｒ ＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧ
ＣＧＣ’ｒＧＧｅｅＧＴＣＧＧＡＣＯＧＧＡＧＭｌｌｔ
入１ａＰｒｏＶａｌ入工ａＶａ１丁ｒＰ入１ａ入１ａＬ
４ｕ入１ａＶａｌＧｌｙＬａｕＧｌｕＧｕｙ　ｋｓｐ ８だ　ご口　冒ε　輝屑　定曝　起Ｓ　熔２　とぷ　８
０　ごＵ話３芝底５葺ヨ圏コ蛋茨ｇＥ　５３ｉ舅？Ｌ茨
Ｕ肘底５韮韮旧慕コＸ；味ｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的に活性な哺乳類ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ
   −Ｒ）蛋白をコードする単離されたＤＮＡ配列。 ２、（ａ）天然哺乳類ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域か
   ら誘導されたヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクロー
   ン； （ｂ）適度なストリンジェット条件（５０℃、２×ＳＳ
   Ｃ）下で（ａ）のクローンにハイブリダイズすることが
   でき、かつ生物学的に活性なＴＮＦ−Ｒ蛋白をコードす
   るＤＮＡ配列；および （ｃ）（ａ）および（ｂ）で定めたＤＮＡ配列に遺伝暗
   号の結果として縮重しており、かつ生物学的に活性なＴ
   ＮＦ−Ｒ蛋白をコードするＤＮＡ配列； より成る群から選ばれる、請求項１記載の単離されたＤ
   ＮＡ配列。 ３、可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒ蛋白をコードする、請求項１
   記載の単離されたＤＮＡ配列。 ４、可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒ蛋白は第２Ａ図のアミノ酸残
   基１−ｘの配列（ここで、ｘはアミノ酸１６３−２３５
   より成る群から選ばれる）から成るアミノ酸配列を有す
   る、請求項３記載の単離されたＤＮＡ配列。 ５、可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒ蛋白は第２Ａ図のアミノ酸１
   −２３５の配列から成る、請求項３記載の単離されたＤ
   ＮＡ配列。 ６、アミノ酸残基４６はＩｌｅおよびＴｈｒより成る群
   から選ばれ、そしてアミノ酸残基１１８はＶａｌおよび
   Ｉｌｅより成る群から選ばれる、請求項５記載のＤＮＡ
   配列。 ７、可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒ蛋白は第２Ａ図のアミノ酸１
   −１８５の配列から成る、請求項３記載の単離されたＤ
   ＮＡ配列。 ８、可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒ蛋白は第２Ａ図のアミノ酸１
   −１６３の配列から成る、請求項３記載の単離されたＤ
   ＮＡ配列。 ９、請求項１〜８のいずれか１項記載のＤＮＡ配列を含
   む組換え発現ベクター。 １０、請求項９記載のベクターを含む適当な宿主細胞を
   発現促進条件下で培養することから成る、生物学的に活
   性な哺乳類ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）蛋白の生産
   方法。 １１、均質な生物学的活性哺乳類ＴＮＦレセプター（Ｔ
   ＮＦ−Ｒ）蛋白組成物。 １２、均質な生物学的活性可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒ蛋白組
   成物。 １３、第２Ａ図のアミノ酸残基１−２３５の配列を含む
   、請求項１２記載の均質な生物学的活性ＴＮＦ−Ｒ蛋白
   組成物。 １４、第２Ａ図のアミノ酸残基１−１８５の配列を含む
   、請求項１２記載の均質な生物学的活性ＴＮＦ−Ｒ蛋白
   組成物。 １５、第２Ａ図のアミノ酸残基１−１６３の配列を含む
   、請求項１２記載の均質な生物学的活性ＴＮＦ−Ｒ蛋白
   組成物。 １６、有効量の請求項１１記載の哺乳類ＴＮＦ−Ｒ蛋白
   組成物および適当な希釈剤または担体を含有する、ヒト
   患者への非経口投与に適した免疫応答調節用の薬学的組
   成物。 １７、哺乳類の免疫応答を調節するための医薬の製造に
   おける、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の哺乳類
   ＴＮＦ−Ｒ蛋白の使用。 １８、ＴＮＦ−ＲはヒトＴＮＦ−Ｒであり、治療すべき
   哺乳類はヒトである、請求項１７記載の使用。 １９、ヒト患者への非経口投与に適した免疫応答調節用
   薬学的組成物の製造における、哺乳類ＴＮＦ−Ｒ蛋白の
   使用。 ２０、請求項１１記載の蛋白組成物を使用することから
   成る、ＴＮＦまたはＴＮＦ−Ｒ分子もしくはその相互作
   用を検出するためのアッセイ法。 ２１、哺乳類ＴＮＦレセプターと免疫反応性の抗体。