MX2008013863A

MX2008013863A - Proteinas de fusion de rage y sus metodos de uso.

Info

Publication number: MX2008013863A
Application number: MX2008013863A
Authority: MX
Inventors: Robert Rothlein; Jeffrey C Webster; Adnan M M Mjalli; Ye Edward Tian; Eric J Benjamin
Original assignee: Transtech Pharma Inc
Priority date: 2006-05-05
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2008-11-14
Also published as: AU2007248784A1; DOP2007000089A; EA017291B1; UY30324A1; NZ571692A; US20110282035A1; US7981424B2; WO2007130302A3; SG171670A1; JP2009536201A; EP2380983A3; WO2007130302A2; EP2380983A2; CA2651348A1; ZA200809394B; US8344120B2; BRPI0711193A2; AU2007248784B2; PE20080397A1; AR060862A1

Abstract

Se describen proteínas de fusión de RAGE que comprenden secuencias de polipéptido de RAGE unidas a un segundo, polipéptido distinto de RAGE. La proteína de fusión de RAGE puede utilizar un dominio de polipéptido de RAGE que comprende un sitio de unión de ligando de RAGE y un conector de interdominio directamente unido al término N de un dominio CH2 de inmunoglobulina. También se describen las formulaciones de la proteína de fusión de RAGE y el uso de las proteínas de fusión de RAGE y las formulaciones de la proteína de fusión de RAGE como terapéuticos para las patologías mediadas por RAGE.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE RAGE Y SUS MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la regulación del receptor para Productos Finales Altamente Glicosilados (RAGE). Más particularmente, la presente invención describe proteínas de fusión que comprenden un polipéptido RAGE, los métodos de preparación de tales proteínas de fusión y formulaciones de dichas proteínas de fusión RAGE y el uso de tales proteínas de fusión RAGE para el tratamiento de trastornos basados en RAGE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La incubación de proteínas o lípidos con azúcares de tipo aldosa resulta en glicosilación no enzimática y oxidación de grupos amino de las proteínas para formar aductos de Amadori. Con el tiempo, los aductos experimentan reordenamientos, deshidrataciones y reticulaciones adicionales con otras proteínas para formar complejos conocidos como productos finales altamente glicosilados (AGE's). Los factores que promueven la formación de los AGEs incluyen el recambio de proteínas retardado (por Ej. como en la amiloidosis), acumulación de macromoléculas que tienen alto contenido de lisina y altos niveles de glucosa sanguínea (por ej. como en la diabetes) (Hori ef al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761 , (1995)). Los AGEs se han vinculado a una variedad de trastornos que incluyen las complicaciones asociadas con la diabetes y el envejecimiento normal.

Los AGE presentan una unión específica y saturable a los receptores de la superficie celular de los monocitos, macrófagos, células endoteliales de la microvasculatura, células del músculo liso, células mesangiales y neuronas. El receptor para productos finales altamente glicosilados (RAGE) es un miembro de la familia de moléculas del supergen inmunoglobulínico. El dominio extracelular (N-terminal) de RAGE incluye tres regiones del tipo de la inmunoglobulina: un dominio tipo V (variable) seguido por dos dominios tipo C (constantes) (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)). Un dominio único que abarca la transmembrana y un extremo citosólico corto altamente cargado sigue al dominio extracelular. El dominio extracelular N-terminal, se puede aislar por proteólisis de RAGE o por métodos de biología molecular para generar el RAGE soluble (RAGEs) que comprende los dominios V y C.

El RAGE se expresa en múltiples tipos celulares que incluyen leucocitos, neuronas, células microgliales y del endotelio vascular (por ej., Hori eí al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). Los niveles aumentados de RAGE también se encuentran en tejidos envejecidos (Schleicher eí al., J. Clin. Invest, 99 (3): 457-468 (1997)) y la retina, vasculatura y riñon diabéticos (Schmidt eí al., Nature Med., 1 : 1002-1004 (1995)).

Además de los AGEs, otros compuestos se pueden unir y modular el RAGE. El RAGE se une a múltiples ligandos funcional y estructuralmente diversos que incluyen beta amiloide (?ß), amiloide A sérico (SAA), productos altamente glicosilados (AGE), S100 (un miembro proinflamatorio de la familia Calgranulina), carboximetilisina (CML), anfoterina y CD1 1 b/CD18 (Bucciarelli eí al., Cell Mol. Life Sci., 59:1 1 17-128 (2002); Chavakis eí al. Microbes Infect, 6:1219-1225 (2004); Kokkola eí al., Scand. J. Immunol., 61 :1 -9 (2005); Schmidt eí al., J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001 ); Rocken eí al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003)).

Se ha demostrado que la unión de ligandos tales como AGE, S100/calgranulina, ß-amilida, CML (Ns-Carboximetil lisina) y anfoterina al RAGE modifica la expresión de una variedad de genes. Estas interacciones pueden iniciar posteriormente los mecanismos de transducción de señales que incluyen activación de p38, p21 ras, MAP quinasas, fosforilación de Erk1 -2 y la activación del mediador de la transcripción de las señales inflamatorias, NF-?? (Yeh eí al., Diabetes, 50: 1495-1504 (2001 )). Por ejemplo, en muchos tipos celulares, la interacción entre el RAGE y sus ligandos puede generar el estrés oxidativo, que de este modo produce la activación del factor de trascripción NF-?? sensible a los radicales libres y la activación de los genes regulados por NF-??, tales como las citoquinas IL-1 ß y TNF-a. Además, la expresión de RAGE se regula por aumento por medio del NF-?? y muestra la expresión en los sitios de inflamación o estrés oxidativo (Tanaka eí al., J. Biol.

Chem., 275:25781 -25790 (2000)). De este modo, una espiral ascendente y con frecuencia perjudicial puede ser impulsada por un ciclo de retroalimentación positiva iniciado por la unión al ligando.

La activación de RAGE en diferentes tejidos y órganos puede conducir a varias consecuencias fisiopatológicas. El RAGE ha sido implicado en una variedad de afecciones que incluyen: inflamación aguda y crónica (Hofmann eí al., Ce// 97:889-901 (1999)), el desarrollo de las complicaciones tardías diabéticas tales como permeabilidad vascular aumentada (Wautier ef al., J. Clin. Invest, 97:238-243 (1995)), nefropatia (Teillet ef al., J. Am. Soc. Nephrol., 11 :1488-1497 (2000)), arteriosclerosis (Vlassara et. al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)) y retinopatía (Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607 (1999)). El RAGE también ha sido implicado en la enfermedad de Aízheimer (Yan eí al., Nature, 382:685-691 (1996)) y en la invasión y metástasis tumoral (Taguchi eí al., Nature, 405:354-357 (2000)).

A pesar de la amplia expresión de RAGE y su aparente papel pleiotrópico en múltiples modelos de diversas enfermedades, el RAGE no parece ser esencial para el desarrollo normal. Por ejemplo, los ratones que carecen del gen de RAGE están sin un fenotipo anormal manifiesto, lo cual sugiere que mientras el RAGE puede cumplir un papel en la patología de la enfermedad cuando se estimula en forma crónica, la inhibición de RAGE no parece contribuir a algún fenotipo agudo no deseado (Liliensiek eí al., J. Clin. Invest., 113: 1641 -50 (2004)).

La antagonización de la unión de los ligandos fisiológicos al RAGE puede regular por disminución los cambios fisiopatológicos causados por las concentraciones excesivas de los AGE y otros ligandos de RAGE. Por medio de la reducción de los ligandos endógenos de RAGE, se pueden reducir los síntomas asociados con los trastornos mediados por RAGE. El RAGE soluble (RAGEs) puede antagonizar en forma efectiva la unión de los ligandos de RAGE al RAGE. Sin embargo, el RAGEs puede tener una vida media cuando se administra in vivo que puede ser demasiado corta para ser terapéuticamente útil para uno o más trastornos. De este modo, existe la necesidad de desarrollar compuestos que antagonicen la unión de los AGE y otros ligandos fisiológicos al receptor RAGE cuando el compuesto tenga un perfil farmacocinético deseable.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención comprenden las proteínas de fusión de RAGE y los métodos de uso de tales proteínas. La presente invención se puede realizar en una variedad de maneras. Las modalidades de la presente invención pueden comprender la proteina de fusión de RAGE que comprende un polipéptido de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE comprende un sitio de unión del ligando de RAGE. La proteína de fusión de RAGE puede comprender además un polipéptido de RAGE directamente conectado a un polipéptido que comprende el dominio CH2 de una ¡nmunoglobulina o una porción del dominio CH2. En ciertas modalidades, la proteína de fusión RAGE comprende una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:56 o la SEQ ID NO:57 o una secuencia en al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ? 99% idénticas a la misma. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencia de al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 comprende la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal.

La presente invención también comprende un método para preparar una proteína de fusión de RAGE. En una modalidad el método comprende la unión de un polipéptido de RAGE a un segundo polipéptido distinto de RAGE. En una modalidad el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión del ligando de RAGE. El método también puede comprender la unión de un polipéptido de RAGE directamente a un polipéptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción del dominio CH2. En ciertas modalidades, la proteina de fusión RAGE comprende una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 o una secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencia de al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 comprende la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal.

En otras modalidades, la presente invención puede comprender métodos y composiciones para tratar trastornos mediados por el RAGE en un sujeto. El método puede comprender la administración de una proteína de fusión de RAGE de la presente invención al sujeto. La composición puede comprender una proteína de fusión de RAGE de la presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable.

En otras modalidades, la presente también proporciona formulaciones que comprenden una mezcla liofilizada de un lioprotectante, una proteína de fusión de RAGE y un estabilizante. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la presente invención puede comprender una formulación reconstituida estable que comprende una proteína de fusión de RAGE en una cantidad de al menos 50 mg/ml y un diluyente, en donde la formulación reconstituida se ha preparado de una mezcla liofilizada de la proteína de fusión RAGE y un lioprotectante.

Las modalidades de la presente invención también pueden comprender artículos de fabricación. En ciertas modalidades, los artículos de fabricación pueden comprender un contenedor que sostiene una formulación que comprende una proteína de fusión RAGE liofilizada. El artículo de fabricación también puede comprender instrucciones para reconstituir la formulación liofilizada con un diluyente.

En otras modalidades, la presente invención también puede comprender métodos para preparar una formulación reconstituida estable de una proteína de fusión de RAGE. En ciertas modalidades, el método puede comprender reconstituir una mezcla liofilizada de una proteina de fusión RAGE y un lioprotectacte en un diluyente de manera que la concentración de proteína de fusión RAGE en la formulación reconstituida es al menos 50 mg/ml. Por ejemplo, en una modalidad, el método puede comprende las etapas de liofilizar una mezcla que comprende una proteína de fusión RAGE y una cantidad de lioprotección de un lioprotectante y reconstituid la mezcla liofilizada en un diluyente.

Existen varias ventajas que se pueden asociar con modalidades particulares de la presente invención. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención puede ser metabólicamente estable cuando se administra a un sujeto. También, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención puede exhibir una unión de alta afinidad para los ligandos de RAGE. En ciertas modalidades, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se une a los ligandos de RAGE con afinidades del rango alto nanomolar a bajo rango micromolar. Por la unión con alta afinidad con los ligandos fisiológicos de RAGE, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se puede usar para inhibir la unión de los ligandos endógenos al RAGE, de este modo se proporciona un medio para mejorar las enfermedades mediadas por RAGE.

También, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se puede proporcionar en forma de proteína o ácido nucleico. En una modalidad ejemplarizadora, la proteína de fusión de RAGE se puede administrar sistémicamente y permanecer en la vasculatura para tratar potencialmente las enfermedades vasculares mediadas en parte por el RAGE. En otra modalidad ejemplarizadora, la proteína de fusión de RAGE se puede administrar localmente para tratar enfermedades cuando los ligandos de RAGE contribuyen a la patología de la enfermedad. Alternativamente, se puede administrar una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de RAGE en un sitio por el uso de un vehículo apropiado tal como un virus o ADN desnudo en donde la expresión local transitoria puede inhibir localmente la interacción entre los ligandos y receptores de RAGE. De este modo la administración puede ser de naturaleza transitoria (por ej, como cuando se administra la proteína de fusión de RAGE) o más permanente (por ej., como cuando se administra la proteína de fusión de RAGE como ADN recombinante).

Existen características adicionales de la invención que se describirán de aquí en adelante. Se entenderá que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en las siguientes reivindicaciones, descripción y figuras. La invención permite que otras modalidades se practiquen o lleven a cabo de diferentes maneras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Diversas características, aspectos y ventajas de la presente invención se tornarán más evidentes con referencia a las siguientes figuras.

Las Figuras 1 -1 L muestran diversas Secuencias de RAGE y Secuencias de inmunoglobulina de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención: Panel A, SEQ ID NO: 1 , la Secuencia de aminoácidos de RAGE humano y SEQ ID NO: 2, la Secuencia de aminoácidos de RAGE humano sin la Secuencia señal de los aminoácidos 1 -22; Panel B, SEQ ID NO: 3, la Secuencia de aminoácidos de RAGE humano sin la Secuencia señal de los aminoácidos 1 -23; Panel C, SEQ ID NO: 4, la Secuencia de aminoácidos de RAGEs; SEQ ID NO: 5, la Secuencia de aminoácidos de RAGEs sin la Secuencia señal de los aminoácidos 1 -22, y SEQ ID NO: 6, la Secuencia de aminoácidos de RAGEs sin la Secuencia señal de los aminoácidos 1 -23; Panel D, SEQ ID NO: 7, una Secuencia de aminoácidos que comprende el dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 8, una Secuencia de aminoácidos alterna que comprende el dominio V-de RAGE humano; SEQ ID NO: 9, un fragmento N-terminal del dominio V del RAGE humano; SEQ ID NO: 10, un fragmento N-terminal alterno del dominio del RAGE humano; SEQ ID NO: 1 1 , la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 124-221 de RAGE humano; SEQ ID NO: 12, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 227-317 de RAGE humano; SEQ ID NO: 13, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-123 de RAGE humano; Panel E, SEQ ID NO: 14, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-123 de RAGE humano; SEQ ID NO: 15, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-136 de RAGE humano; SEQ ID NO: 16, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-136 de RAGE humano; SEQ ID NO: 17, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-226 de RAGE humano; SEQ ID NO: 18, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-226 de RAGE humano; Panel F, SEQ ID NO: 19, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-251 de RAGE humano; SEQ ID NO: 20, la Secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-251 de RAGE humano; SEQ ID NO: 21 , un conector interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 22, un segundo conector interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 23, un tercer conector interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 24, un cuarto conector ¡nterdominio de RAGE; Panel G, SEQ ID NO: 25, ADN que codifica los aminoácidos 1 -1 18 de RAGE humano; SEQ ID NO: 26, ADN que codifica los aminoácidos 1 -123 de RAGE humano; y la SEQ ID NO: 27, ADN que codifica los aminoácidos 1 -136 de RAGE humano; Panel H, SEQ ID NO: 28, ADN que codifica los aminoácidos de RAGE humano 1-230; y SEQ ID NO: 29, ADN que codifica los aminoácidos de RAGE humano 1 -251 ; Panel I, SEQ ID NO: 38, una Secuencia de aminoácidos parcial de los dominios CH2 y CH3 de la IgG humana; SEQ ID NO:39, ADN que codifica una porción de los dominios CH2 y CH3 de la IgG humana; SEQ ID NO: 40, una Secuencia de aminoácidos de los dominios CH2 y CH3 de la IgG humana; Panel J, SEQ ID NO: 41 , un ADn que codifica los dominios CH2 y CH3 de la IgG humana; SEQ ID NO: 42, una Secuencia de aminoácidos del dominio CH2 de la IgG humana; SEQ ID NO: 43, una Secuencia de aminoácidos del dominio CH3 de la IgG humana y SEQ ID NO: 44, un quinto conector interdominio de RAGE, Panel K, SEQ ID NO:45, la secuencia de aminoácidos del sRAGE humano sin la secuencia de señal de aminoácidos 1 -23 en donde el residuo glutamina en el término N se ha ciclizado para formar el ácido piroglutámico, SEQ ID NO:46, una secuencia de aminoácido alterna que comprende el dominio V del sRAGE humano en donde el residuo glutamina en el término N se ha ciclizado para formar el ácido piroglutámico, la SEQ ID NO:47, un fragmento N-terminal alterno del dominio V de RAGE humano, en donde el residuo glutamina en el término N ha ciclizado para formar el ácido piroglutámico, SEQ ID NO:48, la secuencia de aminoácido para los aminoácidos 24-123 de RAGE humano, en donde el residuo glutamina en el término N ha ciclizado para formar el ácido piroglutámico; Panel L, SEQ ID NO:49, la secuencia de aminoácido para los aminoácidos 24-136 de RAGE humano, en donde el residuo glutamina en el término N ha ciclizado para formar el ácido piroglutámico, SEQ ID NO:50, la secuencia de aminoácido para los aminoácidos 24-226 de RAGE humano en donde el residuo glutamina en el término N ha ciclizado para formar ácido piroglutámico, SEQ ID NO:51 , la secuencia de aminoácido para los aminoácidos 24-251 de RAGE humano en donde el residuo glutamina en el término N ha ciclizado para formar ácido piroglutámico; Panel M, SEQ ID NO:52, una secuencia de ADN que codifica una porción de los dominios CH2 y CH3 para el IgG humano en la SEQ ID NO:38 y la SEQ ID NO:53, una secuencia de ADN alterna que codifica los dominios CH2 y CH3 humanos de IgG humano en la SEQ ID NO:40.

Las Figuras 2 y 2A muestran la Secuencia de ADN alterna SEQ ID NO: 30 (Panel A) y la SEQ ID NO:54 (Panel B) que codifica una primera proteína de fusión de RAGE (TTP-4000) que codifica la región de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La Secuencia codificadora 1 -753 destacada en negrita codifica la Secuencia proteica N-terminal de RAGE mientras que la Secuencia 754-1386 codifica la Secuencia de la proteína de IgG (?1 ) humana.

Las Figuras 3 y 3A muestran las Secuencias de ADN alternas SEQ ID NO: 31 (Panel A) y la SEQ ID NO:55 (Panel B) que codifica una segunda proteina de fusión de RAGE (TTP-3000) que codifica la región de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La Secuencia codificadora 1 -408 destacada en negrita codifica la Secuencia proteica N-terminal de RAGE mientras que la Secuencia 409-1041 codifica la Secuencia de la proteína de IgG (?1 ) humana.

La Figura 4 muestra las Secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO:56 cada una de las cuales codifica cuatro dominios de la proteína de fusión de RAGE de acuerdo con modalidades alternativas de la presente invención. La Secuencia de RAGE está destacada con negrita.

La Figura 5 muestra las Secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO:57 cada una de las cuales codifica tres dominios de la proteína de fusión de RAGE de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención. La Secuencia de RAGE está destacada con negrita.

Las Figuras 6 y 6A, muestran el Panel A, que es una comparación de los dominios de la proteína en el RAGE humano y la proteína del FC de la Ig gamma-1 humana, y los puntos de penetración usados para preparar TTP-3000 (en la posición 136) y TTP-4000 (en la posición 251 ) de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención y el Panel B que es la estructura del dominio para TTP-3000 y TTP-4000 de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención, en donde: SE = señal CO = conector CY = citoplásmico y Bl = bisagra.

La Figura 7 muestra resultados de una prueba de enlace in vitro para el RAGEs, y una primer proteína de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) y una segunda proteína de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3), para los ligandos de RAGE amiloide-beta (A-beta), S100b (S100) y anfoterina (Ampho), de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en donde: A' = absorbencia@405 B' = ligando.

La Figura 8 muestra los resultados de una prueba de enlace in vitro para una primer proteína de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) ("Proteína") al amiloide-beta en comparación con un control negativo que incluye solo los reactivos de inmunodetección ("solo complejo") y el antagonismo de tal unión por un antagonista de RAGE ("ligando de RAGE") de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en donde: A' = absorbencia@405 C = proteína.

La Figura 9 muestra los resultados de una prueba de enlace in vitro para una segunda proteína de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) ("Proteína") al amiloide-beta en comparación con un control negativo que incluye solo los reactivos de inmunodetección ("solo complejo") y el antagonismo de tal unión por un antagonista de RAGE ("ligando de RAGE") de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en donde: A' = absorbencia@405 D' = dilución de la proteína.

La Figura 10 muestra los resultados de una prueba basada en células que mide la inhibición de la producción de TNF-a inducida por S100b-RAGE por las proteínas de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4), y RAGEs de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en donde: A' = absorbencia@405 E' = tratamiento.

La Figura 11 muestra los resultados de una prueba basada en células que mide la inhibición de la producción inducida por HMGB1 -RAGE de TNF-a por la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 y una anticuerpo anti-RAGE de conformidad con una modalidad de la presente invención, en donde: F' = Niveles de TNF G' = dosis de TTP4000 ó anticuerpo anti-RAGE.

La Figura 12 muestra un perfil farmacocinético de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 de acuerdo con una modalidad de la presente invención donde cada curva representa un animal diferente en las mismas condiciones experimentales, en donde: H' = niveles de TTP-4000 en plasma G = tiempo.

La Figura 13 muestra los valores relativos de TNF-a liberado de las células THP-1 debido a la estimulación por la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 y la estimulación de la IgG humana como una medida de una respuesta inflamatoria de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en donde: J' = TNF alfa ' = estimulante.

Las Figuras 14 y 14A muestran el uso de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir la restenosis en animales diabéticos de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención, donde el panel A muestra que TTP-4000 RAGE-proteína de fusión redujo la relación íntima/media en comparación con un control negativo (IgG) y el panel B muestra que la proteína de fusión del TTP-4000 RAGE redujo la proliferación de célula del músculo liso vascular en una forma que responde a la dosis, en donde: 1 = íntima 2 = media L' = células marcadas m = dosis baja n = dosis alta.

Las Figuras 15 y 15A muestran el uso de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir la formación del amiloide y la disfunción cognitiva en animales con enfermedad de Alzheimer (AD) de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención donde el panel A muestra que la proteína de fusión TTP-4000 RAGE redujo la cantidad de amiloide del cerebro y el panel B muestra que la proteína de fusión TP-4000 RAGE mejoró la función cognitiva, en donde: M' = carga amiloide N' = compuesto O' = tiempo de latencia ' = compuesto.

La Figura 16 muestra las curvas de unión-saturación con TTP-4000 a diversos ligandos de RAGE conocidos inmovilizados de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en donde: A' = absborbencia@405.

La Figura 17 muestra el uso de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir el rechazo de los trasplantes alogeneicos de células del islote pancreáticos de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención donde los círculos abiertos (vacíos) designan a los animales control no tratados; círculos con rayas diagonales designan a los animales tratados con TTP-4000 con una primera dosis; círculos con líneas onduladas designan a los animales tratados con TTP-4000 con una segunda dosis; círculos con rombos llenos designan a los animales tratados con PBS control y los círculos sólidos designan a los animales tratados con IgG control, en donde: I = cum. de supervivencia II = días.

La Figura 18 muestra el uso de las proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir el rechazo de los trasplantes singenésicos de células del islote pancreático de acuerdo con modalidades alternas de la presente invención donde los círculos abiertos (vacíos) designan a los animales control no tratados y los círculos sólidos designan a los animales tratados con TTP-4000, en donde: I = cum. de supervivencia II = días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente descripción son aproximaciones que pueden variar de acuerdo con las propiedades deseadas que se intenta obtener por medio de la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico se debe interpretar por lo menos a la luz del número de dígitos significativos informados y por la aplicación de técnicas de rutina ordinarias.

A pesar de que los rangos y parámetros numéricos que muestran el alcance amplio de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se informan en forma tan exacta como sea posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, contiene en forma inherente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en respectivas mediciones de prueba. Además, se entiende que todos los rangos descritos en este documento abarcan a cualquiera y todos los subrangos incluidos en el mismo. Por ejemplo, un rango indicado de "1 a 10" se deberá considerarse que incluye cualquiera y todos los subrangos entre (e inclusive) el valor mínimo de 1 y el valor máximo de 10; es decir, todos los subrangos que comienzan con un valor mínimo de 1 o más, por ej., 1 a 6.1 , y finalizan con un valor máximo de 10 o menos, por ej., 5.5 a 10. Adicionalmente, cualquier referencia con respeto a estar "incorporada en este documento" se considera que está incorporada en su totalidad.

Además se indica, como se usa en este documento, las formas singulares "un" "una" y "el/la" incluye a los referentes plurales a menos que se limite en forma expresa e inequívoca a un referente. El término "o" se usa en forma intercambiable con el término "y/o" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

También, los términos "porción" y "fragmento" se usan en forma indistinta para referirse a partes de un polipéptido, ácido nucleico u otra construcción molecular.

"Polipéptido" y "proteína" se usan en forma indistinta en este documento para describir las moléculas de proteína que pueden comprender las proteínas tanto de longitud parcial como completa.

Como es conocido en la técnica, "proteínas", "péptidos", "polipéptidos" y "oligopéptidos son cadenas de aminoácidos (típicamente L-aminoácidos) cuyos carbono alfa se unen por medio de enlaces peptídicos formados por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo del carbono alfa de un aminoácido y el grupo amino del carbono alfa de otro aminoácido. Típicamente, los aminoácidos que constituyen una proteína se numeran en orden, comenzando del residuo amino terminal y aumentando en dirección hacia el residuo carboxi terminal de la proteína.

Como se usa en este documento, el término "ascendente" se refiere a un residuo que es N-terminal a un segundo residuo donde la molécula es una proteína, o 5' a un segundo residuo donde la molécula es un ácido nucleico. También tal como se usa en este documento, el término "descendente" se refiere a un residuo que es C-terminal a un segundo residuo donde la molécula es una proteína o 3' a un segundo residuo donde la molécula es un ácido nucleico.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que es considerado comúnmente por un experto en la técnica. Los médicos se dirigen particularmente a los Protocolos Actuales en Biología Molecular (ver por ej., Ausubel, F.M. ef al., Short Protocols in Molecular Biology, 4ta Ed., Capítulo 2, John Wiley & Sons, N.Y.) para las definiciones y términos de la técnica. Las abreviaturas para los residuos de aminoácidos son las estándares 3 letras y/o los códigos de 1 letra usados en le arte para referirse a uno de los 20 L-aminoácidos comunes.

Un "ácido nucleico" es un polinucleótido tal como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN).EI término se usa para incluir ácidos nucleicos de cadena simple, ácidos nucleicos de cadena doble y ARN y ADN obtenidos de análogos de nucleótido o nucleósido.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se puede usar para transportar una segunda molécula de ácido nucleico en una célula. En una modalidad, el vector permite la replicación de las Secuencias de ADN insertadas en el vector. El vector puede comprender un promotor para aumentar la expresión de la molécula de ácido nucleico en al menos algunas células huésped. Los vectores pueden replicar en forma autónoma (extracromosómica) o pueden estar integrados en un cromosoma de la célula huésped. En una modalidad, el vector puede comprender un vector de expresión capaz de producir una proteína derivada de al menos parte de una Secuencia de ácido nucleico insertada en el vector.

Como se conoce en la técnica, las condiciones para hibridar las Secuencias de ácido nucleico entre sí se pueden describir como que pueden variar de rigurosidad baja a alta. Generalmente, las condiciones de hibridación muy rigurosas se refieren al lavado de los híbridos en estabilizador de baja salinidad a temperaturas elevadas. La hibridación puede ser para filtrar el ADN unido usando soluciones de hibridación estándares en el arte tales como NaHP04 0.5M, sulfato de dodecil sodio 7% (SDS) a 65°C, y lavados en NaHP0 0.25 M, SDS 3.5% seguido por lavado en SSC 0.1 /SDS 0.1 % a una temperatura que varía de temperatura ambiente a 68°C de acuerdo con la longitud de la sonda. Por ejemplo, un lavado de alta rigurosidad comprende un lavado en SSC 6x/pirofosfato de sodio 0.05% a 37°C para una sonda de oligonucleótidos de 1 bases o a 48°C para una sonda de oligonucleótidos de 17 bases o a 55°C para una sonda de oligonucleótidos de 20 bases o a 60°C para una sonda de oligonucleótidos de 25 bases o a 65°C para una sonda de nucleótidos de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Las sondas de ácido nucleico se pueden marcar con radionucleótidos por marcado final con, por ejemplo, [?-32P]ATP, o incorporación de nucleótidos radiomarcados tales como [a-32P]dCTP por marcado del iniciador en forma aleatoria. Alternativamente, las sondas se pueden marcar por la incorporación de nucleótidos biotinilados o marcados con fluoresceína y la sonda se detecta mediante estreptavidina o anticuerpos anti-fluoresceína.

Como se usa en este documento, "moléculas orgánicas pequeñas" son moléculas de peso molecular menor de 2,000 Daltons que contienen al menos un átomo de carbono.

El término "proteína de fusión" se refiere a una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de dos o más proteínas. La proteína de fusión también puede incluir regiones de unión de los aminoácidos entre las porciones del aminoácido derivados de las proteínas separadas.

Como se usa en este documento, un "RAGE no polipéptido" es cualquier polipéptido que no deriva de RAGE o un fragmento de la misma. Tales RAGE no polipéptidos incluyen péptidos ¡nmunoglobulínicos, polipéptidos dimerizantes, polipéptidos estabilizantes, péptidos anfifílicos o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que proporcionan "marcas" para la identificación o purificación de la proteína.

Como se usa en este documento, los "péptidos ¡nmunoglobulínicos" pueden comprender una cadena pesada de la inmunoglobulina o una porción de la misma. En una modalidad, la porción de la cadena pesada puede ser el fragmento Fe o una porción de la misma. Como se usa en este documento, el fragmento Fe comprende la cadena pesada del polipéptido bisagra, y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de una inmunoglobulina, en forma monomérica o dímérica. O, el CH1 y el fragmento Fe se puede usar como el polipéptido inmunoglobulínico. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. Un ejemplo de actividad biológica que se puede alterar incluye la reducción de una capacidad del isotipo para unirse a algunos receptores del Fe como por ejemplo, por la modificación de la región bisagra.

Los términos "identidad" o "porcentaje de identidad" se refieren a la identidad de secuencia entre las dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de ácidos nucleicos. El porcentaje de identidad se puede determinar por la alineación de dos secuencias y se refieren al número de residuos idénticos (es decir, aminoácido o nucleótido) en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. El alineamiento y comparación de secuencias se puede realizar mediante los algoritmos estándares en la técnica (por ej., Smith y Waterman, 1981 , Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 85:2444) o por versiones computarizadas de estos algoritmos (Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7,0, Genetics Computer Grupo , 575 Science Drive, Madison, Wl) disponibles públicamente como BLAST y FASTA. También, el ENTREZ, disponible a través de National Institutes of Health, Bethesda MD, se puede usar para la comparación de secuencia. En una modalidad, el porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar mediante GCG con un peso de brecha de 1 , de manera tal que cada brecha de aminoácidos se pesa como si fuera un mal apareamiento de aminoácidos único entre dos secuencias.

Como se usa en este documento, el término "residuos conservados" se refiere a los aminoácidos que son los mismos entre una pluralidad de las proteínas que tiene la misma estructura y/o función. Una región de residuos conservados puede ser importante para la estructura o función de la proteína. De este modo, los residuos conservados contiguos como se identifican es una proteína tridimensional puede ser importante para la estructura o función de la proteína. Para encontrar los residuos conservados o regiones conservadas de estructura 3-D, se puede hacer una comparación de secuencias para las proteínas iguales o similares de diferentes especies o de individuos de especies iguales.

Como se usa en este documento, el término "homólogo" significa un polipéptido que tiene un grado de homología o identidad con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. Las comparaciones de homología se pueden realizar a ojo o más usualmente con la ayuda de los programas de comparación de secuencias disponibles. Estos programas de computación comercialmente disponibles en el mercado pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias (por ej., Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 80:726-730). Por ejemplo, se pueden tomar las secuencias homologas que incluyan secuencias de aminoácidos, las cuales en modalidades alternativas son al menos 70% idénticas, 75% idénticas, 80% idénticas, 85% idénticas, 90% idénticas, 95% idénticas, 97% idénticas, o 98% idénticas, o 99% idénticas entre sí.

Como se usa en este documento, el término al menos 90% idéntica al mismo incluye las secuencias que varían del 90 a 99,99% de identidad a las secuencias indicadas e incluyen a todos los rangos intermedios. De este modo, el término al menos 90% idéntica incluye a las secuencias que son 91 , 91 .5, 92, 92.5, 93, 93.5. 94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5 por ciento idénticas a la secuencia indicada. De modo similar el término "al menos 70% idéntica incluye a las secuencias que varían de 70 a 99.99% idénticas, con todos los rangos intermedios. La determinación del por ciento de identidad se determina mediante los algoritmos aquí descritos.

Como se usa en este documento, un "dominio" de polipéptido o proteína comprende una región a lo largo de un polipéptido o proteína que comprende una unidad independiente. Los dominios se pueden definir en términos de estructura, secuencia y/o actividad biológica. En una modalidad, un dominio del polipéptido puede comprender una región de una proteína que se pliega de una manera que es sustancialmente independiente del resto de la proteína. Los dominios se pueden identificar mediante bases de datos de dominios tales como, pero sin limitación a PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT y PROCLASS.

Como se usa en este documento, "dominio de inmunoglobulina" es una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homologa o idéntica, a un dominio de una inmunoglobulina. La longitud de la secuencia de aminoácidos de un dominio de la inmunoglobulina puede ser de cualquier longitud. En una modalidad, un dominio de la inmunoglobulina puede ser menos de 250 aminoácidos. En un ejemplo de modalidad, un dominio de la inmunoglobulina puede tener aproximadamente 80-150 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, la región variable y las regiones CH1 , CH2 y CH3 de una IgG son dominios inmunoglobulínicos. En otro ejemplo, las regiones variables CH1 , CH2, CH3 y CH4 de una IgM son dominios inmunoglobulínicos.

Como se usa en este documento, un "dominio de inmunoglobulina de RAGE" es una secuencia de aminoácidos de la proteína de RAGE que es estructuralmente homologa, o idéntica al dominio de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, el dominio tipo 1 similar C2-lg de RAGE ("dominio C1 "), o el dominio tipo 2 similar a C2 RAGE Ig-lg de RAGE ("dominio C2").

Como se usa en este documento, un "conector interdominio" comprende un polipéptido que une dos dominios juntos. Una región bisagra del Fe es un ejemplo de un conector interdominio en una IgG.

Como se usa en este documento, "conectado directamente" identifica un enlace covalente entre dos grupos diferentes (por ej., secuencias de ácido nucleico, polipéptidos, dominios de los polipéptidos) que no tiene ningún átomo interviniente entre los dos grupos que se unen.

Como se usa en este documento, "dominio de unión al ligando" se refiere a un dominio de una proteína responsable de la unión de un ligando. El término dominio de unión al ligando incluye a los homólogos de un dominio de unión al ligando o porciones de los mismos. En este aspecto, las sustituciones deliberadas de aminoácidos se pueden realizar en el sitio de unión con el ligando sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilicidad de los residuos, siempre que la especificidad de unión del dominio de unión al ligando se retenga.

Como se usa en este documento, un "sitio de unión con el ligando" comprende los residuos de una proteína que interactúa directamente con un ligando o residuos involucrados en la ubicación del ligando en estrecha proximidad a los residuos que interactúan directamente con el ligando, La interacción de los residuos en el sitio de unión con el ligando se puede definir por la proximidad espacial de los residuos a un ligando del modelo o estructura. El término sitio de unión con el ligando incluye a los homólogos de un sitio de unión con el ligando o porciones de los mismos. En este aspecto, las sustituciones deliberadas de aminoácidos se pueden realizar en el sitio de unión con el ligando sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilicidad de los residuos, siempre que la especificidad de unión del dominio de unión al ligando se retenga. Un sitio de unión con el ligando puede existir en uno o más dominios de unión con el ligando de una proteína o polipéptido.

Como se usa en este documento, el término "interactuar" se refiere a la condición de proximidad entre un ligando o compuesto o porciones o fragmentos de los mismos y una porción de una segunda molécula de interés. La interacción puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de los enlaces hidrógeno, interacciones de van der Waals o interacciones electrostáticas o hidrofóbicas, o puede ser no covalente.

Como se usa en este documento, un "ligando" se refiere a una molécula o compuesto o entidad que interactúa con un sitio de unión con el ligando, que incluye sustratos o análogos o partes de los mismos. Como se describe en este documento, el término "ligando" puede referirse a los compuestos que se unen a la proteína de interés. Un ligando puede ser un agonista, un antagonista o modulador. O un ligando puede no tener un efecto biológico. O un ligando puede bloquear la unión de otros ligandos de este modo se inicia la inhibición de un efecto biológico. Los ligandos pueden incluir, pero sin limitación a, inhibidores de moléculas pequeñas. Estas pequeñas moléculas puede incluir péptidos, peptidomiméticos, compuestos orgánicos y similares. Los ligandos también pueden incluir polipéptidos y/o proteínas.

Como se usa en este documento, un "compuesto modulador" se refiere a una molécula que cambia o altera la actividad biológica de una molécula de interés. Un compuesto modulador puede aumentar o disminuir la actividad o cambiar las características físicas o químicas, o propiedades funcionales o inmunológicas de la molécula de interés. Para el RAGE, un compuesto modulador puede aumentar o disminuir la actividad o cambiar las características o propiedades funcionales o inmunológicas de RAGE o una porción del mismo. Un compuesto modulador puede incluir péptidos naturales y/o sintetizados químicamente o péptidos artificiales, péptidos modificados (por ej., fosfopéptidos), anticuerpos, carbohidratos, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, glicolípidos, compuestos heterocíclicos, nucleósidos o nucleótidos o partes de los mismos, y pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas. Un compuesto modulador puede ser un compuesto fisiológico endógeno o puede ser un compuesto natural o sintético. O el compuesto modulador puede ser una molécula orgánica pequeña. El término "compuesto modulador" también incluye un ligando o compuesto modificado químicamente e incluye a los isómeros o formas racémicos.

Un "agonista" comprende un compuesto que se une a un receptor para formar un complejo que estimula una respuesta farmacológica específica para el receptor involucrado.

Un "antagonista" comprende un compuesto que se une a un agonista o a un receptor para formar un complejo que no origina una respuesta farmacológica sustancial y puede inhibir la respuesta biológica inducida por un agonista.

Los agonistas de RAGE pueden en consecuencia unirse al RAGE y estimular los procesos celulares mediados por RAGE y los antagonistas de RAGE pueden inhibir los procesos mediados por RAGE que son estimulados por un agonista de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad los procesos celulares estimulados por los agonistas de RAGE comprenden la activación de la transcripción del gen de TNF-a.

El término "péptido miméticos" se refiere a estructuras que actúan como sustitutos para los péptidos en interacciones entre moléculas (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252). Los péptidos miméticos pueden incluir estructuras sintéticas que pueden o no pueden contener aminoácidos y/o enlaces de péptidos pero que retienen las características estructurales y funcionales de un péptido o agonista, o antagonista. Los péptidos miméticos también incluyen peptoides, oligopeptoides (Simón et al., 1972, Proc. Nati. Acad, Sci., EUA, 89:9367); y genotecas de péptidos que contienen péptidos de una longitud diseñada que representa todas las posibles secuencias de aminoácidos que corresponden a un péptido o agonista o antagonista de la invención.

El término "tratamiento" o "tratar" se refieren a mejorar un síntoma de una enfermedad o trastorno y puede comprender la cura del trastorno, prevención sustancial del comienzo del trastorno o mejora de la afección del sujeto. El término "tratamiento" como se usa en este documento, se refiere al espectro completo de tratamiento para un trastorno del cual, esta sufriendo el paciente, que incluye el alivio de un síntoma o la mayoría de los síntomas que resultan de ese trastorno, una cura para el trastorno particular o la prevención del comienzo del trastorno.

Como se usa en este documento, el término "EC50" se define como la concentración de un agente que produce 50% de un efecto biológico medido. Por ejemplo, la EC50 de un agente terapéutico que tiene un efecto biológico medible puede comprender el valor al que el agente presenta el 50% del efecto biológico.

Como se usa en este documento, el término "IC50" se define como la concentración de un agente que produce 50% de inhibición de un efecto medido. Por ejemplo, la IC50 de un antagonista de la unión de RAGE comprende el valor al que el antagonista reduce la unión del ligando al sitio de unión del ligando de RAGE en 50%.

Como se usa en este documento, una "cantidad efectiva" significa la cantidad de un agente que es efectiva para producir un efecto deseado en un sujeto. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" indica la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que estimulará la respuesta terapéutica de un animal o ser humano que se requiere. La dosis real que comprende la cantidad efectiva puede depender de la vía de administración, el tamaño y salud del sujeto, el trastorno tratado y los similares.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento se puede referir a los compuestos y composiciones que son adecuadas para uso en sujetos humanos o animales, como por ejemplo, para composiciones terapéuticas administradas para el tratamiento del trastorno o enfermedad mediado por RAGE.

El término "composición farmacéutica" se usa en este documento para indicar una composición que se puede administrar a un huésped mamífero, por ej., vía oral, parenteral, tópica, por inhalación de aerosol, intranasal o rectal, en formulaciones de dosis unitarias que contienen portadores, diluyentes, adyuvantes, vehículos convencionales no tóxicos y los similares.

El término "parenteral" como se usa en este documento, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intracisternal o técnicas de infusión.

Como se usa en este documento "rechazo" se refiere a la respuesta inmune o inflamatoria del tejido que conduce a la destrucción de células, tejidos u órganos o que conduce al daño de las células, tejidos u órganos. Las células, tejidos u órganos se pueden extraer del mismo sujeto que esta desarrollando la respuesta de rechazo o se puede trasplantar de un sujeto diferente que esta presentando rechazo.

Como se usa en este documento, el término "célula" se refiere a las unidades estructurales y funcionales de un sistema vivo de mamífero que comprende un sistema vivo independiente. Como se conoce en la técnica, las células incluyen un núcleo, citoplasma, organelos ¡ntracelulares y una pared celular que envuelve a la célula y permite que sea independiente de otras células.

Como se usa en este documento, el término "tejido" se refiere a un agregado de células que tiene una función y estructura similar o que actúan juntas para realizar una función particular. Un tejido puede incluir una colección de células similares y las sustancias intercelulares que circundan a las células. Los tejidos incluyen pero no se limitan al tejido muscular, tejido nervioso y hueso.

Como se usa en este documento un "órgano" se refiere a una unidad estructural y funcional completamente diferenciada de un animal que esta especializada para alguna función específica. Un órgano puede comprender un grupo de tejidos que realizan una función o grupo de fusiones específicas. Los órganos incluyen pero no se limitan a, corazón, pulmones, cerebro, ojo, estómago bazo, páncreas, ríñones, hígado, intestinos, piel, útero, vejiga y hueso.

Una formulación "estable" es una en la cual la proteína de fusión de RAGE en la misma esencialmente retiene su estabilidad física y química y la actividad biológica en almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas están disponibles en la técnica y están revisadas en la Liberación de Fármacos de Péptidos y Proteínas, 247-301 , Vincent Lee Ed. Marcel Dekker, Inc. Nueva York, N.Y. Pubs. (1991 ) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993). La estabilidad puede medirse en una temperatura seleccionada para un periodo de tiempo seleccionado. Para el análisis rápido, la formulación puede conservarse a 40°C por 1 semana a 1 mes, en cuyo tiempo la estabilidad se mide. Por ejemplo, la extensión de la agregación seguida por la liofílización y almacenamiento puede usarse como un indicador de la estabilidad de la proteina de fusión de RAGE (ver los Ejemplos en este documento). Por ejemplo, una formulación "estable" puede fabricarse en donde menos de aproximadamente 10% y de preferencia menos de aproximadamente 5% de la proteína de fusión RAGE está presente como un agregado en la formulación. En otras modalidades, un incremento en la formación de agregado siguiendo a la liofílización y el almacenamiento de la formulación liofilizada puede determinarse. Por ejemplo, una formulación liofilizada "estable" puede ser una en donde el incremento en el agregado en la formulación liofilizada es menor que aproximadamente 5% o menos que aproximadamente 3%, cuando la formulación liofílización se incuba a 40°C por al menos una semana. En otras modalidades, la estabilidad de la formulación de proteína de fusión de RAGE puede medirse usando una prueba de actividad biológica tal como una prueba de enlace como se describe en este documento.

Una formulación "reconstituida" es una que se ha preparado mediante disolver una formulación de proteína de fusión de RAGE liofilizada en un diluyente tal como la proteína de fusión RAGE se dispersa y/o disuelve en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida puede ser apropiada para la administración (por ejemplo, administración parenteral) para un paciente a tratarse con la proteína de fusión y en ciertas modalidades de la invención, puede ser una que es apropiada para la administración subcutánea.

Por "isotónica" se entiende que la formulación de interés tiene una presión osmótica de aproximadamente 240 a aproximadamente 340 mOsm/kg. En una modalidad, una formulación isotónica es una que tiene una presión osmótica que es esencialmente la misma como la sangre humana (285-310 mOsm/kg). La isotonicidad puede medirse usando una presión de vapor o un osmómetro de tipo de presión de punto de congelamiento.

Un "lioprotectante" es una molécula que cuando se combina con una proteína de fusión de RAGE significativamente previene o reduce la inestabilidad física y/o química de la proteína en la liofilización y el almacenamiento subsecuente. Los lipoprotectantes ejemplarizadores incluyen azúcares tales como sucralosa o trahalosa, un polio! tal como los alcoholes de azúcar, por ejemplo, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol o combinaciones de los mismos. En una modalidad, el lioprotectante puede comprender un azúcar. En una modalidad adicional, el lioprotectante puede comprende un azúcar de no reducción tal como la sacarosa. El lioprotectante puede agregarse a la formulación pre-liofilizada en una "cantidad de lioprotección" que significa que la siguiente liofilización de la proteína en la presencia de la cantidad de lioprotección del lioprotectante, la proteína de fusión de RAGE esencialmente retiene su estabilidad química y física y la actividad biológica en la liofilización y almacenamiento.

El "diluyente" para una formulación liofilizada en este documento es una que es farmacéuticamente aceptable (segura y no tóxica para la administración a un humano) y es útil en la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplarizadores incluyen agua estéril, agua bacterioestática para inyección (BWFI), una solución de pH estabilizado (por ejemplo, solución salina estabilizada de fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. En una modalidad, el diluyente proporciona una formulación reconstituida apropiada para inyección. En otra modalidad, en donde el diluyente proporciona una formulación reconstituida apropiada para inyección, el diluyente puede comprender agua para inyección (WFI).

Un "preservativo" para una formulación reconstituida es un compuesto que puede agregarse al diluyente o para la formulación reconstituida para reducir esencialmente la acción bacterial en la formulación reconstituida. En una modalidad, la cantidad de preservativo puede agregarse en una cantidad útil para facilitar la producción de una formulación reconstituida de uso múltiple. Los ejemplos de preservativos potenciales incluyen cloruro de amonio octadecildimetilbencilo, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en las cuales los grupos alquilos son compuesto de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de preservativos incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, butilo y alcohol bencílico, parabenos alilo tales como metil o parabeno de propilo, catecol, resocinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol.

Un "agente de volumen" para una formulación liofilizada es un compuesto que ayuda a amasar la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física del pastel liofilizado (por ejemplo, facilita la producción de un pastel esencialmente uniforme liofilizado que mantiene una estructura de poro abierto). Los agentes de volumen ejemplarizadores incluyen pero no se limitan a manitol, glicina y xorbitol.

Proteínas de fusión de RAGE Las modalidades de la presente invención comprenden las proteínas de fusión de RAGE, métodos para fabricar dichas proteínas de fusión y métodos de uso de tales proteínas de fusión. La presente invención se puede realizar de diferentes maneras.

Por ejemplo, las modalidades de la presente invención proporcionan las proteínas de fusión de RAGE que comprenden un polipéptido de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un sitio de unión con el ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando comprende la mayor parte del dominio N-terminal de la proteína de fusión de RAGE. El sitio de unión con el ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia al menos 90% idéntica al mismo o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 47 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma (Figura 1 ).

En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede unirse a un polipéptido que comprende un dominio o una porción de inmunoglobulina (por ejemplo, un fragmento de los mismos) de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio inmunoglobulina comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 O CH3 de un IgG humano.

En ciertas modalidades, la proteína de fusión de RAGE comprende una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID N0.57 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica al mismo. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencial en al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 comprende la secuencia de la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal.

Una proteína o polipéptido de RAGE puede comprender una proteína de RAGE humano de longitud completa (por ej., SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. Como se usa en este documento, un fragmento de un polipéptido RAGE tiene al menos 5 aminoácidos de longitud, puede ser mayor de 30 aminoácidos de longitud, pero es menor que la secuencia de aminoácidos completa. En modalidades alternas de las proteínas, métodos y composiciones de la presente invención, el polipéptido RAGE puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica al RAGE humano o un fragmento de la misma. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender el RAGE humano o un fragmento de la misma, con Glicina como el primer residuo más que una metionina (ver por ej., Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender el RAGE de longitud completa con la secuencia señal eliminada (por ej., SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (FIGS. 1 y 1 A) o una porción de esta secuencia de aminoácidos.

Las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también pueden comprender los RAGEs (por ej., SEQ ID NO: 4), un polipéptido al menos 90% idéntico al RAGEs o un fragmento de RAGEs. Como se usa en este documento, el RAGEs es la proteína de RAGE que no incluye la región transmembrana o la cola citoplasmática (Park et al., Nature Med., 4: 1025-1031 (1998)). Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender el RAGEs humano o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo más que una metionina (Ver por ej., Neeper ef al., (1992)). O, un polipéptido de RAGE puede comprender RAGEs humano con la secuencia de señal eliminada (Ver por ej., SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO: 45 en la Figura 1 ) o una porción de esa secuencia de aminoácidos.

En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V de RAGE (Ver por ej., SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO:46 en la Figura 1 ) (Neeper ef al., (1992); Schmidt et al. (1997). O, puede usarse una secuencia al menos 90% idéntica al dominio V de RAGE o un fragmento de la misma.

O, la proteína de RAGE puede comprender un fragmento del dominio V del RAGE (por ej., SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ó SEQ ID NO:47 en la Figura 1 ). En una modalidad la proteína de RAGE puede comprender un sitio de unión del ligando. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o SEQ ID NO: 10, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 47, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento de RAGE es un péptido sintético.

En otra modalidad, el sitio de unión de ligando puede comprender 23-53 aminoácido de la SEQ ID NO:1 (Figura 1 ). En otra modalidad, el sitio de unión del ligando puede comprender 24-52 aminoácidos de la SEQ ID NO:1. En otra modalidad, el sitio de unión del ligando puede comprender 31 -52 aminoácidos de la SEQ ID NO:1 . En otra modalidad, el sitio de unión del ligando puede comprender 31 -1 16 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 . En otra modalidad, el sitio de enlace del ligando puede comprender los aminoácidos 31 -1 16 de la SEQ ID No: 1 . En otra modalidad, el sitio de enlace del ligando puede comprender 19-52 aminoácidos de la SEQ ID NO:1 . Por ejemplo, el sitio de enlace del ligando puede comprender, un dominio RAGE V o una porción del mismo tal como el dominio de enlace del ligando de RAGE (por ejemplo, aminoácidos 1 -1 18, 23-1 18, 24-1 18, 31 -118, 1 -1 16, 23-1 16, 24-116, 31 -116, 1 -54, 23-54, 24-54, 31 -54, 1 -53, 23-53, 24-53 ó 31 -53 dé la SEQ ID NO:1 o fragmentos de los mismos). O pueden usarse fragmentos o los polipéptidos que enlazan funcionalmente un ligando RAGE. O puede usarse una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% idéntica al dominio V de RAGE o un fragmento del mismo (por ejemplo, como se describió anteriormente). Además como se conoce en la técnica, en las modalidades en donde el término N de la proteína de fusión es glutamina, como por ejemplo en la remoción de la secuencia de señal que comprende los residuos 1 -23 de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, Q24 para un polipéptido comprende 24-118 aminoácidos o la SEQ ID NO:1 ), la glutamina puede ciclizar para formar el ácido piroglutámico.

De este modo, el polipéptido de RAGE usado en la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un fragmento de RAGE de longitud completa. Como se sabe en la técnica, el RAGE comprende tres dominios del polipéptido tipo ¡nmunoglobulina, el dominio V y cada uno de los dominios de C1 y C2 unidos entre si por un conector interdominio. El RAGE de longitud completa también incluye un polipéptido transmembrana y una cola citoplasmática descendente (C-terminal) del dominio C2 y conectado al dominio C2.

En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye a cualquiera de los residuos de la secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender tanto a los residuos 1 -22 o residuos 1 -23 de RAGE de longitud completa. Además, como se conoce en la técnica, en las modalidades donde el extremo N-terminal de la proteína de fusión es glutamina, (por ej., la secuencia de señal comprende los residuos 1 -23), la glutamina N-terminal (Q24) puede ciclizar para formar ácido piroglutámico (pE). Los ejemplos de construcciones de tales moléculas son polinucleótidos que tienen las secuencias de aminoácidos como se establecen en las SEQ ID NOS: 45, 46, 47, 48, 49, 50 y 51 (Figura 1 ), así como las proteínas de fusión de RAGE que tienen las secuencias de aminoácidos como se establecen en las SEQ ID Nos: 56 y 57 (Figura 4).

Como se reconoce en la técnica, la región CH3 de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede tener su aminoácido C-terminal penetrado fuera a través de una modificación post-traduccional cuando se expresa en ciertos sistemas recombinantes. (Ver por ej., Li, et al., BioProcessing J., 2005; 4, 23-30). En una modalidad, el aminoácido C-terminal penetrado es lisina (K). Además, en modalidades alternas, la proteína de fusión RAGE de la presente invención puede comprender un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NOs: 32-37, 56 y 57 sin la lisina C-terminal (K).

De este modo en diversas modalidades, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-1 16 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-1 16 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24- 6 de RAGE humano donde Q24 se cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 46) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio V de RAGE. O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 1 1 ) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 del RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio C2 de RAGE. O, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio V de RAGE y un conector interdominio descendente. O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 24-123 de RAGE humano donde Q24 se cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 48) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio V, el dominio C1 y el conector interdominio que se une a estos dos dominios. O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 24-226 de RAGE humano donde Q24 se cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 50), o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma ó 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponde al RAGEs (es decir, que codifica los dominios V, C1 y C2 y conectores interdominio). O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 24-339 de RAGE humano donde Q24 se cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 45) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. O, los fragmentos de cada una de estas secuencias pueden usarse. Ver la Figura 1 para las secuencias de aminoácidos de estos polipéptidos.

La proteína de fusión de RAGE puede incluir varios tipos de péptidos que no derivan de RAGE o un fragmento de la misma. El segundo polipéptido de la proteína de fusión de RAGE puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido de inmunoglobulina puede comprender una cadena pesada de la inmunoglobulina o una porción (es decir, fragmento) de la misma. Por ejemplo, el fragmento de cadena pesada puede comprender un polipéptido derivado del fragmento Fe de una inmunoglobulina, donde el fragmento Fe comprende el polipéptido bisagra de cadena pesada y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina como un monómero. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o porciones de alguno o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplarizados, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO: 40 (Figura 1 ) o una porción de la misma. En una modalidad, el péptido comprendiendo los dominios CH2 y CH3 de un lgG1 humano o una porción del mismo puede comprender la SEQ ID NO:38 o un fragmento de la misma. El péptido inmunoglobulínico se puede codificar por la Secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 39 ó SEQ ID NO: 41 (Figura 1 ). La secuencia de la inmunoglobulina de la SEQ ID NO: 38 ó SEQ ID NO: 40 también puede ser codificada por la SEQ ID NO: 52 ó SEQ ID NO: 53 (Figura 1 ), donde los cambios de bases silenciosos para los codones que codifican para prolina (CCG a CCC) y glicina (GGT a GGG) en el extremo C-terminal de la secuencia eliminan un sitio críptico de empalme del ARN cercano al codón terminal, (por ejemplo, nucleótidos 622-627 de la SEQ ID NO:39 se modifican para generar la SEQ ID NO:52 ó los nucleótidos 652-657 de la SEQ ID NO:41 se modifican para generar la SEQ ID NO:53).

La región de bisagra de la porción Fe de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. De este modo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un conector interdominio derivado de RAGE más que de un polipéptido bisagra del interdominio derivado de una inmunoglobulina.

De este modo en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un polipéptido de RAGE directamente conectado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento o porción del dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el dominio CH2, o un fragmento de la misma comprende la SEQ ID NO: 42 (Figura 1 ). En una modalidad, el fragmento de la SEQ ID NO: 42 comprende la SEQ ID NO: 42 con los primeros diez aminoácidos comprendiendo al menos una porción de la región de bisagra Fe removida. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un sitio de unión con el ligando. El sitio de unión con el ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o la SEQ ID NO: 47, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

El polipéptido de RAGE usado en la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención puede comprender un dominio de la inmunoglobulina RAGE. En forma adicional o alternativa, el fragmento de RAGE puede comprender un conector interdominio. O, el polipéptido de RAGE puede comprender un dominio de la inmunoglobulina de RAGE conectado a un conector interdominio ascendente (es decir, el más cercano al extremo N-terminal) o descendente (es decir, el más cercano al extremo C-terminal). En aún otra modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender dos (o más) dominios de la inmunoglobulina de RAGE ligados entre sí por un conector interdominio. El polipéptido de RAGE puede comprender también múltiples dominios de la inmunoglobulina de RAGE unidos entre sí por uno o más conectores interdominio y que tiene un conector interdominio terminal unido al N-terminal del dominio de la inmunoglobulina de RAGE y/o el dominio de la inmunoglobulina C-terminal. Las combinaciones adicionales de los dominios de la inmunoglobulina de RAGE y los conectores interdominio están dentro del alcance de la presente invención.

En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende un conector interdominio de RAGE conectado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE de modo que el aminoácido C-terminal del dominio de la inmunoglobulina de RAGE está conectado al aminoácido N-terminal del conector interdominio, y el aminoácido C-terminal del conector interdominio de RAGE está directamente conectado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o una porción de alguno o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplarizadora, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 o una porción del mismo de una lgG1 humana puede comprender la SEQ ID NO:40 o una porción del mismo. En una modalidad, el polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de un lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO:38 o un fragmento de la misma. O la lgG1 humana puede comprender la SEQ ID NO:38 ó la SEQ ID NO:40 con la lisina terminal (K) removida.

Como se describió anteriormente, la proteina de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un único o múltiple dominio de RAGE. También, el polipéptido de RAGE que comprende un conector interdominio conectado a un dominio del polipéptido de RAGE puede comprender un fragmento de la proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24- 36 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-136 de RAGE humano donde Q24 cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 49), o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponde el dominio V de RAGE y un conector interdominio descendiente. O, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-251 de RAGE humano donde Q24 cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 51 ), o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio V, el dominio C1 , el conector interdominio que une a estos dos dominios y un segundo conector interdominio descendiente de C1 .

Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender dos dominios de la inmunoglobulina derivados de la proteína de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido del Fe humano. La proteína de fusión de RAGE puede comprender un primer dominio de la inmunoglobulina de RAGE y un primer conector interdominio de RAGE conectado a un segundo dominio de la inmunogiobulina de RAGE y un segundo conector interdominio de RAGE, de modo que el aminoácido N-terminal del primer conector interdominio está conectado al aminoácido C-terminal del primer dominio de la inmunogiobulina RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de la inmunogiobulina de RAGE está conectado al aminoácido C-terminal del primer conector interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo conector interdominio está conectado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de la inmunogiobulina de RAGE y el aminoácido C-terminal del segundo conector interdominio de RAGE esta conectado directamente al aminoácido N-terminal del dominio CH2 de la inmunogiobulina. En modalidades alternas, el cuarto dominio de la proteína de fusión RAGE se codifica por la SEQ ID NO:30 ó la SEQ ID NO:54 (Figura 2). En una modalidad, un cuarto dominio de la proteína de fusión de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 32 (Figura 4). En modalidades alternas, un cuarto dominio de la proteína de fusión de RAGE comprende la SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34 ó la SEQ ID NO:56 (Figura 4).

Alternativamente, los tres dominios de la proteína de fusión de RAGE pueden comprender un dominio de inmunogiobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunogiobulina derivados de un polipéptido del Fe humano. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un dominio único de la inmunogiobulina de RAGE conectado por medio de un conector interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal de un dominio de inmunogiobulina CH2 o una porción de un dominio de inmunogiobulina CH2. En modalidades alternas, los tres dominios de la proteína de fusión de RAGE se codifican por la SEQ ID NO:31 ó la SEQ ID NO:55 (Figura 3). En una modalidad, uno de los tres dominios de la proteína de fusión de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 35 (Figura 5). En modalidades alternas, uno de los tres dominios de la proteina de fusión de RAGE puede comprender las SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, o la SEQ ID NO: 57 (Figura 5).

Un fragmento del conector interdominio de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está naturalmente descendente de, y de este modo, unida a un dominio de la inmunoglobulina RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el conector interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente descendentes del dominio V. En una modalidad, el conector puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 1 17-123 de RAGE de longitud completa. O, el conector puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un conector interdominio que comprende varios aminoácidos (por ej., aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15) ascendentes y descendientes de la SEQ ID NO: 21 . De este modo, en una modalidad, el conector interdominio comprende la SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 1 17-136 de RAGE de longitud completa. O, se pueden usar los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 que suprimen por ejemplo, 1 , 2, o 3, aminoácidos de cualquier extremo del conector. En modalidades alternas, el conector puede comprender un péptido que es al menos 70% idéntico, 75% idéntico, 80% idéntico, 85% idéntico, 90% idéntico, 95% idéntico, 97% idéntico, 98% idéntico o 99% idéntico, a la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE, el conector puede comprender una secuencia de péptidos que está naturalmente descendente del dominio C1 . En una modalidad, el conector puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el conector puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia natural de RAGE. Por ejemplo, se puede usar un conector que comprende varios aminoácidos (aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15) ascendentes y descendentes de la SEQ ID NO: 22. O, se pueden usar los fragmentos de la SEQ ID NO: 22, suprimiendo por ejemplo, los aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15 de cualquier extremo del conector. Por ejemplo, en una modalidad, un conector interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. En modalidades alternas, el conector puede comprender un péptido que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticos a la SEQ ID NO:22 ó la SEQ ID NO:24.

O un conector interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos 318-342 de RAGE. En modalidades alternas, el conector puede comprender un péptido que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico a la SEQ ID NO:44.

Además, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alteran, adicionan o suprimen un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos de aproximadamente 5%, más típicamente menos de aproximadamente 1 %) en una secuencia codificada son variaciones modificadas en forma conservadora donde las alteraciones resultan en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes ejemplos de grupos contienen los aminoácidos que son sustituciones conservadoras para otros: 1 ) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Una sustitución conservadora es una sustitución en la que el aminoácido sustituyente (natural o modificado) está relacionado estructuralmente con el aminoácido que se va a sustituir, es decir, tiene aproximadamente el mismo tamaño y propiedades electrónicas que el aminoácido que se sustituye. De este modo, el aminoácido sustituyente debe tener un grupo funcional igual o similar en la cadena lateral como el aminoácido original. Una "sustitución conservadora" también se refiere a la utilización de un aminoácido sustituyente que es idéntico al aminoácido que se sustituye excepto que un grupo funcional de la cadena lateral sea protegido con un grupo protector adecuado.

Como se sabe en la técnica, los aminoácidos pueden transformarse por modificación química a partir de su estructura natural, tanto por mecanismos de reacción enzimáticos o no enzimáticos. Por ejemplo, en una modalidad, un ácido glutámico o glutamina N-terminal pueda ciclizar, con pérdida de agua para formar ácido piroglutámico (piroE o pE) (Chelius ef al., Anal. Chem, 78: 2370-2376 (2006) y Burstein ef al., Proc. National Acad. Sci. , 73:2604-2608 (1976)). Alternativamente, una proteína de fusión que tiene un ácido piroglutámico N-terminal podría accesar potencialmente a través de una secuencia de ácido nucleico que codifica para el ácido glutámico en la posición en la proteína vía el procesamiento post-translacional que llega al término N (por ejemplo, en donde el residuo 24 de la SEQ ID NO:1 es glutámico en lugar de una glutamina).

Métodos de producción de las proteínas de fusión de RAGE La presente invención también comprende un método para preparar una proteína de fusión de RAGE. De este modo, en una modalidad, la presente invención comprende un método para preparar una proteína de fusión de RAGE que comprende la etapa de unión en forma covalente a un polipéptido de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión del ligando de RAGE. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE conectado y el segundo polipéptido distinto de RAGE puede estar modificado por una construcción de ADN recombinante. El método también puede comprender la etapa de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión. Asimismo, el método puede comprender la etapa de inserción del vector de expresión en una célula huésped.

Por ejemplo, las modalidades de la presente invención proporcionan las proteínas de fusión de RAGE que comprenden un polipéptido de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un sitio de unión del ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando comprende la mayor parte del dominio N-terminal de la proteína de fusión de RAGE. El sitio de unión con el ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma ó la SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma ó la SEQ ID NO: 47 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

En una modalidad, el polipéptido RAGE puede estar conectado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobuiina o una porción (por ej., un fragmento de la misma) de un dominio de la inmunoglobuiina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobuiina comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 o CH3 de una IgG humana.

Además, las modalidades de la presente invención pueden comprender las moléculas de ADN aislado que codifican las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención. En ciertas modalidades, las moléculas de ADN codifican una proteína de fusión RAGE que comprende una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. Por ejemplo en algunas modalidades, una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 comprende la secuencia de la SEQ ID NO:56 o la SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal. Además, en ciertas modalidades, la presente invención puede comprender una molécula de ADN que tiene la secuencia como se establece en la SEQ ID NO:54 ó la SEQ ID NO:55 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

La proteína de fusión de RAGE puede ser manipulada genéticamente por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que comprende, es complementaria o tiene identidad significativa con una secuencia de polinucleótidos que codifica a un polipéptido de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un sitio de unión con el ligando de RAGE.

La proteína o polipéptido de RAGE puede comprender el RAGE humano de longitud completa (por ej., SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye a ninguna secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender los residuos 1 -22 o los residuos 1 -23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternas, el polipéptido de RAGE puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica al RAGE humano o un fragmento de la misma. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender el RAGE humano o un fragmento del mismo con glicina como el primer residuo más que una metionina (Ver por ej., Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender el RAGE de longitud completa con la secuencia de señal eliminada (por ej., SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 3) (FIGS. 1 y 1 A) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también pueden comprender el RAGEs (por ej., SEQ ID NO: 4), un polipéptido al menos 90% idéntico al RAGEs, o un fragmento de RAGE. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGEs humano o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo más que una metionina (Ver por ej., Neeper ef al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGEs con una secuencia de señal eliminada (Ver por ej., SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO:45 en la Figura 1 ) o una porción de la secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V (Ver por ej., SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO:46 en la Figura 1 ). O, se puede usar una secuencia al menos 90% idéntica al dominio V o un fragmento de la misma. O, la proteina de RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (Ver por ej., SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10 ó SEQ ID NO:47 en la Figura 1 ). En una modalidad, el sitio de unión con el ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o SEQ ID NO: 10, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o SEQ ID NO: 47, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. En otra modalidad, el fragmento de RAGE es un péptido sintético.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 25 para codificar los aminoácidos 1 -1 18 de RAGE humano o un fragmento de la misma. Por ejemplo, se puede usar una secuencia que comprende a los nucleotidos 1 -348 de la SEQ ID NO: 25 para codificar los aminoácidos 1 -1 16 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 26 para codificar los aminoácidos 1 -123 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 27 para codificar los aminoácidos 1 -136 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 28 para codificar los aminoácidos 1 -230 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 29 para codificar los aminoácidos 1 -251 de RAGE humano. O se pueden usar los fragmentos de estas secuencias de ácidos nucleicos para codificar los fragmentos del polipéptido de RAGE.

La proteína de fusión de RAGE puede incluir varios tipos de péptidos que derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión de RAGE puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de alguno de los isotipos de cadena pesada de conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de alguno de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (c¡2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de alguno o ambos de estos dominios. Como un ejemplo de las modalidades, el polipéptido comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO: 38 ó SEQ ID NO: 40. En una modalidad, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de un lgG1 humano o una porción del mismo, pueden comprender la SEQ ID NO:38 o un fragmento del mismo. El péptido inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:39 o la SEQ ID No: 41 . En modalidades alternas, la secuencia de la inmunoglobulina de la SEQ ID NO: 38 ó SEQ ID NO: 40 también pueden codificarse por la SEQ ID NO: 52 ó SEQ ID NO: 53, respectivamente.

La porción de bisagra de la porción Fe de la cadena de la inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. De este modo, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un conector ¡nterdominio derivado de RAGE más que un polipéptido de la bisagra del ¡nterdominio derivado de una inmunoglobuíina.

De este modo, en una modalidad, la presente invención comprende un método para preparar una proteína de fusión de RAGE que comprende la etapa de unión covalente de un polipéptido de RAGE a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobuíina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobuíina. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un sitio de unión con el ligando de RAGE. El sitio de unión con el ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, ó la SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma ó la SEQ ID NO: 47, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede codificarse por una construcción de ADN recombinante. El método puede comprender la etapa de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión. También, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en una célula huésped. Además, las modalidades de la presente invención también comprenden los vectores de expresión que codifican las moléculas de ADN que codifican las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención. En ciertas modalidades, las moléculas de ADN que codifican una proteína de fusión de RAGE que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a la misma. Por ejemplo en algunas modalidades, una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 comprende la secuencia de la SEQ ID NO:56 ó la SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal.

Aún otras modalidades de la presente invención también comprenden células transfectadas con un vector de expresión que codifica las moléculas de ADN que codifican las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención. En ciertas modalidades, las moléculas de ADN que codifican una proteína de fusión de RAGE que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. Por ejemplo en algunas modalidades, una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 comprende la secuencia de la SEQ ID NO:56 o la SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal.

Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de RAGE conectado directamente a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. En una modalidad, el dominio CH2 o un fragmento del mismo, comprende la SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el fragmento de la SEQ ID NO: 42 comprende la SEQ ID NO: 42 con los primeros diez aminoácidos eliminados. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana. Como un ejemplo de las modalidades, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana puede comprender la SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. En una modalidad, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO:38 o un fragmento de la misma. El péptido de la inmunoglobulina puede estar codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41 . La secuencia de la inmunoglobulina de la SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40 también puede ser codificada por la SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 53, donde los cambios de bases silentes para los codones que codifican para prolina (CCG a CCC) y glicina (GGT a GGG) en el extremo C-terminal de la secuencia elimina un sitio de empalme críptico cercano al codón terminal (es decir, los nucleótidos 622-627 de la SEQ ID NO:39 se modifican para generar la SEQ ID NO:52 o los nucleótidos 652-657 de la SEQ ID NO:41 se modifican para generar la SEQ ID NO:53).

En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un conector interdominio de RAGE conectado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE de modo que el aminoácido C-terminal del dominio de la inmunoglobulina de RAGE está conectado al aminoácido N-terminal del conector interdominio y el aminoácido C-terminal del conector interdominio de RAGE está directamente conectado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de la misma, puede comprender un polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de ambos a alguno de estos dominios. Como un ejemplo de las modalidades, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. En una modalidad, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana, o una porción de la misma, pueden comprender la SEQ ID NO:38 o un fragmento de la misma. En ciertas modalidades, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una gG1 humana o una porción de la misma pueden comprender la SEQ ID NO:38 o la SEQ ID NO:40 con la lisina C-terminal (K) removida.

La proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un dominio único o múltiple de RAGE. También, el polipéptido de RAGE que comprende un conector interdominio conectado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de la proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender dos dominios de la inmunoglobulina derivados de la proteína de RAGE y dos dominios de la inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fe humano. La proteína de fusión de RAGE puede comprender un primer dominio de la inmunoglobulina de RAGE y un primer conector interdominio conectado a una segunda inmunoglobulina del dominio de RAGE y un segundo conector interdominio de RAGE, de modo tal que el aminoácido N-terminal del primer conector interdominio está conectado al aminoácido C-terminal de la primera inmunoglobulina del dominio de RAGE, el aminoácido N-terminal de la segunda inmunoglobulina del dominio de RAGE está conectado al aminoácido C-terminal del primer conector interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo conector interdominio está conectado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de la inmunoglobulina de RAGE y el aminoácido C-terminal del segundo conector interdominio de RAGE esta conectado directamente al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-251 de RAGE humano donde Q24 cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 51 ) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio V, el dominio C1 , el conector interdominio que une estos dos dominios y un segundo conector interdominio descendente del C1 . En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar para cuatro dominios de la proteína de fusión de RAGE (Figura 2). En otra modalidad, construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 54 (Figura 2A) puede codificar para cuatro dominios de la proteina de fusión de RAGE, donde los cambios de base silentes para los codones que codifican para prolina (CCG a CCC) y glicina (GGT a GGG) en el extremo del C-terminal de la secuencia se ingresan para eliminar un sitio de empalme con ARN críptico cercano al codón terminal (por ejemplo, en los nucleótidos 1375-1380 de la SEQ ID NO:30 se modifican para generar la SEQ ID NO:54).

Alternativamente, los tres dominios de una proteína de fusión de RAGE pueden comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios inmunoglobulinicos derivados de un polipéptido del Fe humano. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un dominio único de la inmunoglobulina de RAGE conectado por medio de un conector interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio inmunoglobulínico CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o aminoácidos 24-136 de RAGE humano donde Q24 cicliza para formar el pE (SEQ ID NO: 49) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un conector interdominio descendente. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma puede codificar para los tres dominios de la proteína de fusión RAGE (Figura 3). En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 55 puede codificar para los tres dominios de la proteína de fusión RAGE, donde los cambios de base silentes para los codones que codifican para prolina (CCG a CCC) y glicina (GGT a GGG) en el extremo del C-terminal de la secuencia eliminan un sitio de empalme con ARN críptico cercano al codón terminal (es decir, nucleótidos 1030-1035 de la SEQ ID NO:31 se modifican para generar la SEQ ID NO:55) (Figura 3A).

Un conector interdominio del fragmento de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está naturalmente descendente, y de este modo, unida a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el conector interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente descendentes del dominio V. En una modalidad, el conector puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 1 17-123 de RAGE de longitud completa. O, el conector puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un conector interdominio que comprende varios aminoácidos (por ej., aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15) ascendentes y descendentes de la SEQ ID NO: 21 . De este modo, en una modalidad, el conector interdominio comprende la SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 1 17-136 de RAGE de longitud completa. O, se pueden usar los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 suprimiendo, por ejemplo, 1 , 2, o 3, aminoácidos de cualquier extremo del conector. En modalidades alternas, el conector puede comprender una secuencia que es al menos 70% idéntica, o 80% idéntica, ó 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 ó SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE C1 , el conector puede comprender una secuencia peptídica que está naturalmente descendente del dominio C1 . En una modalidad, el conector puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el conector puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia natural de RAGE. Por ejemplo, se puede usar un conector que comprende varios aminoácidos (aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15) descendentes y ascendentes de la SEQ ID NO: 22. O, se pueden usar los fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que suprimen por ejemplo, 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15 aminoácidos de cualquier extremo del conector. Por ejemplo, en una modalidad, un conector interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. En modalidades alternas, el conector puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la SEQ ID NO:22 ó la SEQ ID NO:24.

O un conector interdominio puede comprender la SEQ ID NO:44, que corresponde a los aminoácidos 318-342 de RAGE. En modalidades alternas, el conector puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la SEQ ID NO:44.

El método además puede comprende el paso de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión. De este modo, en una modalidad, la presente invención comprende un vector de expresión que codifica a una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptido RAGE directamente conectado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende construcciones, tales como las descritas en este documento, que tienen un conector interdominio de RAGE conectado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE de modo que tal aminoácido C-terminal del dominio de la inmunoglobulina de RAGE está conectado al aminoácido N-terminal del conector interdominio y el aminoácido C-terminal del conector interdominio de RAGE está directamente conectado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de la misma. Por ejemplo, el vector de expresión usado para transfectar las células puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 30, o un fragmento de la misma, SEQ ID NO: 54, o un fragmento de la misma, SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de la misma o SEQ ID NO: 55, o un fragmento de la misma.

El método también comprende la etapa de transfección de una célula con el vector de expresión de la presente invención. De este modo, en una modalidad, la presente invención comprende una célula transfectada con el vector de expresión que expresaba la proteína de fusión de RAGE de la presente invención, de modo que la célula exprese una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptido de RAGE directamente conectado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende las construcciones, tales como las descritas en este documento que tiene un conector interdominio de RAGE conectado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE de modo que el aminoácido C-terminal del dominio de la inmunoglobulina de RAGE está conectado al aminoácido N-terminal del conector interdominio y el aminoácido C-terminal del conector interdominio de RAGE está conectado directamente al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de la misma. Por ejemplo, el vector de expresión puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 30, o un fragmento de la misma, SEQ ID NO: 54, o un fragmento de la misma, SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de la misma, o SEQ ID NO: 55, o un fragmento de la misma.

Por ejemplo, los plásmidos se pueden construir para expresar las proteínas de fusión de RAGE-lgG por la fusión de diferentes longitudes de una secuencia 5' del ADNc de RAGE humano con una secuencia 3' de ADNc de la lgG1 (?1 ). Las secuencias del cásete de expresión se pueden insertar en un vector de expresión tal como el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen, CA) mediante técnicas recombinantes estándares.

Asimismo, el método puede comprender la transfección del vector de expresión en una célula huésped. Las proteínas de fusión de RAGE se pueden expresar en sistemas de expresión de mamíferos, que incluyen a los sistemas en los que reintroducen las construcciones de expresión en las células de mamíferos mediante virus tales como retrovirus o adenovirus. Las líneas de células de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen las lineas celulares inmortalizadas disponibles en American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovarios de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ej., Hep G2), células A549 y muchas otras líneas celulares. Las líneas se pueden seleccionar por medio de la determinación de lineas celulares las cuales tienen altos niveles de expresión de una proteína de fusión de RAGE. Otras líneas celulares que se pueden usar son líneas celulares de insectos, tales como las células Sf9. Las células huésped de planta incluyen, por ej., Nicotina, Arabidopsis, lemna, maíz, trigo, papa, etc. Las células huésped bacterianas incluyen las especies de E. coli y Streptomyces. Las células huésped de levaduras incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de la proteína de fusión de RAGE se introducen en las células huésped de mamífero, las proteínas de fusión de RAGEs se producen por el cultivo de las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de la proteína de fusión de RAGE en las células huésped o la secreción de la proteína de fusión de RAGE en el medido de cultivo en que crecen las células huésped. Las proteínas de fusión de RAGE se pueden recuperar del medio de cultivo mediante el uso de métodos estándares de purificación de proteínas.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de RAGE y los vectores de expresión que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden usar para transfección de una célula huésped de mamífero, planta, bacteria o levadura adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped. Los usos de introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión protoplástica, electroporación, encapsulado de los polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en las células mamíferas por medio de vectores virales. Los métodos de transformación de células de planta son bien conocidos en la técnica e incluyen por ej., transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Los métodos de transformación de células bacterianas y de levaduras también son bien conocidos en la técnica.

Un vector de expresión también se puede administrar a un sistema de expresión que usa ADN biolisticos, en donde el plásmido se precipita en partículas microscópicas, con preferencia oro y las partículas se propulsan en una célula o sistema de expresión blanco. Las técnicas biolisticas con ADN son bien conocidas en la técnica y los dispositivos, por ej., una "pistola de genes", están disponibles en el mercado para la liberación de micropartículas en una célula (por ej., Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA) y en la piel (PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK).

La expresión de las proteínas de fusión de RAGE a partir de la producción de líneas celulares se puede aumentar mediante varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) y el sistema de resistencia a neomicina codificado por el plasma son usos comunes para aumentar la expresión en determinadas condiciones.

Las proteínas de fusión de RAGE expresadas por diferentes líneas celulares pueden tener diferentes patrones de glicosilación entre sí. Sin embargo, todas las proteínas de fusión de RAGE codificadas por las moléculas de ácido nucleico proporcionada en este documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en este documento son parte de la presente invención, independientemente de la glicosilación de la proteína de fusión de RAGE.

En una modalidad, un vector de expresión recombinante se puede transfectar en las células ováricas de hámster chino (CHO) y se optimiza la expresión. En modalidades alternativas, las células pueden producir 0.1 a 20 gramos/litro, o 0.5 a 10 gramos/litro o aproximadamente 1 -2 gramos/litro.

Como se sabe en la técnica, tales construcciones de ácido nucleico se pueden modificar por la mutación, como por ejemplo, por amplificación PCR de un templado de ácido nucleico con iniciadores que comprenden la mutación de interés. De esta manera, se pueden diseñar los polipéptidos que comprenden una variada afinidad de los ligandos de RAGE. En una modalidad, las secuencias mutadas pueden ser 90% o más idénticas al ADN inicial. Como tales, las variantes pueden incluir secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas (es decir, equivalente a aproximadamente 20-27°C por debajo de la temperatura de fusión (TM) del dúplex de ADN en una sal 1 molar).

La secuencia codificadora se puede expresar por la transfección del vector de expresión en un huésped apropiado. Por ejemplo, los vectores recombinantes se pueden transfectar en forma estable en las células ováricas de hámster chino (CHO) y seleccionan y clonan las células que expresan la proteína de fusión de RAGE. En una modalidad, las células que expresan la construcción recombinante se seleccionan por la resistencia a neomicina codificado por plasma por aplicación del antibiótico G418. Los clones individuales se pueden seleccionar y se pueden expandir los clones que expresan altos niveles de proteína recombinante detectada por análisis de transferencia Western del sobrenadante celular y el producto génico se purifica por cromatografía de afinidad mediante columnas de Proteína A.

Las modalidades de la muestra de los ácidos nucleicos recombinantes que codifican la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se muestran en las FIGS. 2 y 3. Por ejemplo, como se describió anteriormente, la proteína de fusión de RAGE producida por la construcción del ADN recombinante puede comprender a un polipéptido de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE. La proteína de fusión de RAGE puede comprender dos dominios derivados de la proteína de RAGE y dos dominios derivados de una inmunoglobulina. Un ejemplo de construcción del ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de RAGE, TTP-4000 (TT4), que tiene este tipo de estructura se muestra en la FIG. 2 (SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO:54). Como se muestra para la SEQ ID NO:30 y la SEQ ID NO:54, la secuencia codificadora 1 - 753 (destacada en negrita) codifica la secuencia de la proteína N-terminal de RAGE mientras que la secuencia de 754-1386 codifica la secuencia de la proteína de IgG.

Cuando deriva de la SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 54, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, la proteína de fusión de RAGE puede comprender los cuatro dominios de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32, o el polipéptido con la secuencia de señal eliminada (Ver por ej., SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO:56 en la FIG. 4). En la SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 o la SEQ ID NO:35, la secuencia de aminoácido de RAGE está destacada en negritas. La secuencia de la inmunoglobulina está en los dominios inmunoglobulínicos CH2 y CH3 de la IgG sin la región de bisagra.

La Figura 6 muestra la comparación de los dominios polipéptidos encontrados en RAGE e IgG (Figura 6) y la estructura de dominio de las proteínas de fusión de RAGE TTP-3000 y TTP-4000. Como se muestra en la FIG. 6A, los primeros 251 aminoácidos de la proteína de fusión TTP-4000 de longitud completa de RAGE contiene como Secuencia del polipéptido de RAGE una Secuencia señal que comprende los aminoácidos 1 -22/23, el dominio de inmunoglobulina V (que incluye el sitio de unión con el ligando) que comprende los aminoácidos 23/24-1 16, un conector interdominio que comprende los aminoácidos 1 17 a 123, un segundo dominio de inmunoglobulina (C1 ) que comprende los aminoácidos 124-221 y un conector interdominio descendente que comprende los aminoácidos 222-251.

En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede no necesariamente comprender el segundo dominio de la inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios inmunoglobulínicos derivados de un polipéptido del Fe humano. Un ejemplo de construcción de ácido nucleico que codifica este tipo de proteína de fusión de RAGE se muestra en la FIG. 3 (SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 55). Como se muestra en la SEQ ID NO:31 y la SEQ ID NO:55, la secuencia de codificación de los nucleótidos 1 a 408 (destacada en negritas) codifica la secuencia de la proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de 409-1041 codifica la secuencia de la proteína de lgG1 (?1 ).

Cuando se deriva de la SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 55, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, la proteína de fusión de RAGE puede comprender la secuencia de aminoácidos de los tres dominios de la SEQ ID NO: 35, o el polipéptido con la secuencia de señal eliminada (Ver por ej., SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o la SEQ ID NO:57 en la FIG. 5). En la SEQ ID NO:35, la SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 o la SEQ ID NO:57 en la Figura 5, la secuencia de aminoácido RAGE se resalta en negritas. Como se muestra en la FIG. 6A, los primeros 136 aminoácidos de la proteína de fusión de RAGE TTP-3000 de longitud completa contiene como polipéptido de RAGE una secuencia de señal que comprende los aminoácidos 1 -22/23, el dominio de ¡nmunoglobulina V (que incluye el sitio de unión con el ligando) que comprende los aminoácidos 23/24-1 16, y un conector interdominio que comprende los aminoácidos 1 17 a 136. La secuencia de 137 a 346 incluye los dominios inmunoglobulínicos CH2 y CH3 de la IgG sin la región de bisagra.

Las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden comprender la estabilidad in vivo aumentada por encima de los polipéptidos de RAGE que no comprenden un segundo polipéptido. La próteína de fusión de RAGE también se puede modificar para aumentar la estabilidad, eficacia, potencia y biodisponibilidad. De este modo, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se puede modificar por el procesamiento post-traduccional o por modificación química. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE puede ser preparada sintéticamente para incluir aminoácidos L-, D-, o no naturales, aminoácidos alfa-disustituidos o N-alquil aminoácidos. Adicíonalmente, las proteínas se pueden modificar por acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión de lipidos tales como fosfatidilinositol, formación de enlaces disulfuro y similares. Además, se puede agregar polietilenglicol para aumentar la estabilidad biológica de la proteína de fusión de RAGE.

Unión de los antagonistas de RAGE a las proteínas de fusión con el RAGE Las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden comprender varias aplicaciones. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención se puede usar en la prueba de unión para identificar los ligandos RAGE, tal como agonistas, antagonistas o moduladores de RAGE.

Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona un método de detección de los moduladores de RAGE que comprenden: (a) proporcionar una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptido de RAGE conectado a un segundo, polipéptido distinto de RAGE, donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión con el ligando; (b) mezclar un compuesto de interés y un ligando que tiene una afinidad de unión conocida para el RAGE con la proteína de fusión de RAGE; y (c) medición de la unión del ligando de RAGE conocido a la proteína de fusión de RAGE en presencia del compuesto de interés. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando comprende la mayor parte del dominio N-terminal de la proteína de fusión de RAGE.

Las proteínas de fusión de RAGE también pueden proporcionar equipos para la detección de los moduladores de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad, un equipo de la presente invención puede comprender (a) un compuesto que tiene afinidad de unión conocida al RAGE como control positivo; (b) una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptido de RAGE conectado a un segundo, polipéptido distinto de RAGE, donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión del ligando de RAGE y (c) instrucciones de uso. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando comprende la mayor parte del dominio N-terminal de la proteína de fusión de RAGE.

Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE se puede usar en una prueba de unión para identificar los potenciales ligandos de RAGE. En un ejemplo de modalidad de tal prueba de unión, un ligando de RAGE conocido se puede recubrir en un sustrato sólido (por ej., placas Maxisorb) en una concentración de aproximadamente 5 microgramos por pozo, donde cada pozo contiene un volumen total de aproximadamente 100 microlitros (µ?). Las placas se pueden incubar a 4°C durante toda la noche para permitir que el ligando se absorba o una al sustrato. Alternativamente, se pueden usar períodos de incubación más cortos a temperaturas superiores (por ej., temperatura ambiente). Después de un período de tiempo para dejar que el ligando se una al sustrato, los pozos de prueba se pueden aspirar y se puede agregar un estabilizador bloqueante (por e/., BSA 1 % en estabilizador de imidizol 50 mM, pH 7.2) para bloquear la unión no específica. Por ejemplo, se puede agregar estabilizador bloqueante a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas luego se pueden aspirar y/o lavar con un estabilizador de lavado. En una modalidad, se puede usar un estabilizador que comprende imidizol 20 mM, NaCI 150 mM, Tween-20 0,05%, CaCI2 5 mM y MgCI25mM, pH 7.2 como un estabilizador de lavado. La proteína de fusión de RAGE luego se puede agregar en diluciones crecientes a los pozos de prueba. La proteína de fusión de RAGE luego se puede dejar incubar con el ligando inmovilizado del pozo de prueba de modo que la unión pueda alcanzar el equilibrio. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE se deja incubar con el ligando inmovilizado durante aproximadamente una hora a 37°C. En modalidades alternas, se pueden usar períodos de incubación más prolongados a temperaturas inferiores. Después de que la proteína de fusión de RAGE y el ligando inmovilizado han sido incubados, la placa se puede lavar para eliminar cualquier proteína de fusión de RAGE no unida. La proteina de fusión de RAGE unida al ligando inmovilizado se puede detectar de varias maneras. En una modalidad, la detección emplea un ELISA. De este modo, en una modalidad, se puede agregar un complejo de inmunodetección que contiene una lgG1 monoclonal antihumano de ratón monoclonal, IgG anti-ratón de cabra biotinilado y una fosfatasa alcalina unida a avidina a la proteína de fusión de RAGE inmovilizada en el pozo de prueba. El complejo de inmunodetección se puede dejar unir a la proteína de fusión de RAGE inmovilizada de modo que esta unión entre la proteína de fusión de RAGE y el complejo de inmunodetección alcance el equilibrio. Por ejemplo, el complejo se puede dejar unir a la proteína de fusión de RAGE durante una hora a temperatura ambiente. En este punto, cualquier complejo no unido se puede eliminar por lavado del pozo de prueba con estabilizador de lavado. El complejo unido se puede detectar por la adición del sustrato de fosfatasa alcalina, para-nitrofenilfosfato (PNPP), y medición de la conversión del PNPP a para-nitrofenol (PNP) como un aumento de la absorción a 405 nm.

En una modalidad, el ligando de RAGE se une a la proteína de fusión de RAGE con afinidad nanomolar (nM) o micromolar (µ?). Un experimento que ilustra la unión de los ligandos de RAGE a las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se muestra en la FIG. 7. Se prepararon soluciones de TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4) que tienen concentraciones iniciales de 1 .082 mg/ml, y 370 µg ml, respectivamente. Como se muestra la FIG. 7, a diversas diluciones, las proteínas de fusión TTP-3000 y TTP-4000 de RAGE son capaces de unirse a los ligandos de RAGE inmovilizados Amiloide-beta (Abeta) (Amiloid Beta (1 -40) de Biosource), S100b (S100), y amfoterina (Ampho), lo cual produce un aumento de la absorbencia. En ausencia del ligando (es decir, recubrimiento con BSA solo) no hubo aumento de la absorbencia.

La prueba de unión de la presente invención puede usarse para cuantificar la unión del ligando al RAGE. En modalidades alternas, los ligandos de RAGE se pueden unir a la proteína de fusión de RAGE de la presente invención con afinidades de unión que varían de 0.1 a 1000 nanomolar (nM), o de 1 a 500 nM, o de 10 a 80 nM.

La proteina de fusión de RAGE de la presente invención también se puede usar para identificar los compuestos que tienen la capacidad de unirse al RAGE. Como se muestra en las FIGS. 8 y 9, respectivamente el ligando RAGE se puede probar para determinar su capacidad para competir con el beta amiloide inmovilizado para unirse a las proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) o TTP-3000 (TT3). De este modo, se puede observar que un ligando de RAGE con una concentración de ensayo final (FAC) de 10 µ? puede desplazar la unión de la proteína de fusión de RAGE a beta-amiloide en concentraciones de 1 :3, 1 :10, 1 :30, y 1 :100 o de la solución inicial de TTP-4000 (FIG. 8) o TTP-3000 (FIG. 9).

Modulación de los Efectores Celulares Las modalidades de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para modular una respuesta biológica mediada por RAGE. Por ejemplo, se pueden diseñar las proteínas de fusión de RAGE para modular el RAGE que induce un aumento de la expresión génica. De este modo, en una modalidad, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para modular la función de las enzimas biológicas. Por ejemplo, la interacción entre el RAGE y sus ligandos puede generar estrés oxidativo y activación del NF- ?, y NF-?? regula a los genes, tales como las citoquinas ??_-1 ß, TNF-ß, y similares. Además, se ha demostrado que otras vías regulatorias tales como las que involucran el p21 ras, quinasas MAP, ERK1 y ERK2 se activan por la unión de los AGE y otros ligandos de RAGE.

El uso de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención para modular la expresión de la célula efectora del TNF-a se muestra en la FIG. 10. Las células mieloides THP-1 se pueden cultivar en medio RPMI-1640 suplementado con FBS 10% e inducen a secretar TNF-ß por medio de la estimulación de RAGE con S100b. Cuando se produce tal estimulación en presencia de una proteína de fusión de RAGE, se puede inhibir la inducción del TNF-a por la unión S 00b al RAGE. De este modo como se muestra en la FIG. 10, la adición de 10 pg de la proteína de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) reduce la inducción por S100b de T F-a en aproximadamente 50% a 75%. La proteína de fusión de RAGE TTP-4000 puede ser al menos tan efectiva en el bloqueo de la inducción por S100b del TNF-a como es RAGEs (FIG. 10). La especificidad de la inhibición de las secuencias de RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se demuestra por el experimento en que se agregó IgG sola a las células estimuladas con S100b. La adición de IgG y S 00b a la prueba muestra los mismos niveles de TNF-a que S100b solo.

En otra prueba basada en células, la habilidad de TTP-4000 para prevenir al ligandos MHGB1 de RAGE de interactuar con RANGE y otros receptores HMGB1 se evalúan. A pesar de que los anticuerpos anti-RAGE que se unen a RAGE y previenen la interacción de un ligandos RAGE con RAGE, TTP-4000 puede bloquear la interacción de un ligandos RAGE con RAGE mediante unirse al ligando de RAGE. El HMGB1 se ha reportado para ser un ligando para RAGE y los receptores como enlace 2 y 4 (Park et al., J. Biol. Chem. 2004; 279(9):7370-7). Todos los tres receptores (RAGE, receptor 2 como enlace y el receptor 4 como enlace) se expresan en las células THP (Parker, et al., J Immunol., 2004,172(8):4977-86).

En este experimento, las células THP-1 se estimularon para producir TNF-a por HMGB1 (50 mg/ml) en la presencia o ausencia de TTP4000 o anticuerpos anti-RAGE. Bajo las condiciones usadas en la prueba, el HMGB1 debe ser solamente el inductor de TNF-a. Los resultados en la Figura 1 1 demuestran que el anticuerpo anti-RAGE y la proteína de fusión RAGE TTP-4000 bloquea el HMGB1 de interactuar con el RAGE expresado en las células THP-1 y que el TTP-4000 inhibe la producción de TNF- HMGB1 -inducido a una extensión mayor que no hace el anticuerpo anti-RAGE. Además, los datos indican que el TTP-4000 puede inhibir la actividad H GB1 a una extensión mayor que el anticuerpo anti-RAGE mediante inhibir el HMGB1 de interactuar con los receptores 2 y 4 como enlace, asi como el RAGE presente en las células THP-1 .

Características fisiológicas de las proteínas de fusión de RAGE Mientras el RAGEs puede tener un beneficio terapéutico en la modulación de las enfermedades mediadas por RAGE, el RAGEs humano puede tener limitaciones como una terapéutica autónoma basada en la vida relativamente corta de RAGEs en plasma. Por ejemplo, mientras que el RAGEs de roedores tiene una vida media en ratas normales y diabéticas de aproximadamente 20 horas, el RAGEs humano tiene una vida media de menos de 2 horas cuando se mide por retención de la inmunorreactividad de RAGEs (Renard et al. , J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)).

Para generar una terapéutica de RAGE que tenga similares características de unión que el RAGEs, pero con un perfil farmacocinético más estable se puede usar una proteína de fusión de RAGE que comprenda un sitio de unión con el ligando de RAGE conectado a uno o más dominios de la inmunoglobulina humana. Como se sabe en la técnica, los dominios inmunoglobulinicos pueden incluir la porción Fe de la cadena pesada de la inmunoglobulina.

La porción FC de la inmunoglobulina puede conferir varios atributos a una proteína de fusión de RAGE. Por ejemplo, el Fe de la proteina de fusión puede aumentar la vida media sérica de tales proteínas de fusión, con frecuencia de horas a varios días. El aumento de la estabilidad farmacocinética es generalmente un resultado de la interacción del conector entre las regiones CH2 y CH3 del fragmento Fe con el receptor de FcRn (Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)).

Si bien las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido del Fe de una inmunoglobuiina pueden proporcionar la ventaja de aumento de estabilidad, las proteínas de fusión de la inmunoglobuiina pueden estimular una respuesta infamatoria cuando se introducen en un huésped. La respuesta inflamatoria se puede deber, en gran parte, a la porción del Fe de la inmunoglobuiina de la proteína de fusión. La respuesta proinflamatoria puede ser una característica deseable si el blanco se expresa en un tipo celular enfermo que necesita ser eliminado (por ej., una célula cancerosa, una o una población de linfocitos que causa una enfermedad autoinmune). La respuesta proinflamatoria puede ser una característica neutral si el blanco es una proteína soluble, ya que la mayoría de las proteínas solubles no activan las inmunoglobulinas. Sin embargo, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si el blanco se expresa en los tipos celulares cuya destrucción produciría efectos secundarios adversos. Asimismo, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si se establece una cascada inflamatoria en el sitio de unión de una proteína de fusión a un tejido blanco, ya que muchos mediadores de la inflamación pueden ser perjudiciales a los tejidos circundantes y/o pueden causar efectos sistémicos.

El sitio proinflamatorio principal de los fragmentos Fe de la inmunoglobuiina reside en la región de bisagra entre CH1 y CH2. Esta región de bisagra interactúa con el FcR1 -3 en diversos leucocitos y provoca que estas células ataquen al blanco. (Wines eí al. , J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)).

Como terapéutica en las enfermedades mediadas por RAGE, las proteínas de fusión de RAGE pueden no requerir la generación de una respuesta inflamatoria. De este modo las modalidades de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden comprender una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptido de RAGE unido a un dominio(s) de la inmunoglobulina donde la región bisagra del Fe de la inmunoglobulina se elimina y reemplaza con un polipéptido de RAGE. De esta manera, la interacción entre la proteína de fusión de RAGE y los receptores de Fe en las células inflamatorias se pueden minimizar. Puede ser importante, sin embargo, mantener el apilamiento apropiado y otras interacciones estructurales tridimensionales entre los diversos dominios de la inmunoglobulina de la proteína de fusión de RAGE. De este modo, las modalidades de la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención puede sustituir de modo biológicamente inerte pero estructuralmente similar al conector interdominio de RAGE que separa los dominios V y C1 de RAGE, o el conector que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en vez de la región de bisagra normal de la cadena pesada de la inmunoglobulina. De este modo, el polipéptido de RAGE de la proteína de fusión de RAGE puede comprender una secuencia del conector interdominio que se encuentra naturalmente descendente de un dominio de una inmunoglobulina de RAGE para formar un dominio de una inmunoglobulina de RAG E/fragmento conector. De esta manera, se pueden mantener las interacciones tridimensionales entre los dominios de la inmunoglobulina contribuidas por RAGE o la inmunoglobulina.

En una modalidad, una proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un aumento sustancial de la estabilidad farmacocinética en comparación con el RAGEs. Por ejemplo, la FIG. 12 muestra que una vez que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 ha saturado sus ligandos, puede conservar una vida media de más de 300 horas. Esto se puede contrastar con la vida media para el RAGEs de solo unas pocas horas en el plasma humano.

De este modo, en una modalidad, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para antagonizar la unión de los ligandos fisiológicos al RAGE como un medio para tratar la enfermedad mediada por RAGE sin generar una cantidad inaceptable de inflamación. Las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden exhibir una disminución sustancial para generar una respuesta proinflamatoria en comparación con la IgG. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 13, la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 no estimula la liberación del TNF- de las células en condiciones donde se detecta la estimulación de IgG humana de la liberación de TNF-a.

Tratamiento de la enfermedad con proteínas de fusión de RAGE La presente invención también puede comprender los métodos para el tratamiento del trastorno mediado por RAGE en un sujeto humano. En una modalidad, el método puede comprender la administración a un sujeto de una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptido de RAGE que comprende un sitio de unión con el ligando de RAGE conectado a un segundo polipéptido distinto de RAGE.

En ciertas modalidades, la formulación de RAGE comprende una proteína de fusión de RAGE liofilizada. En ciertas modalidades, la presente invención puede comprender métodos para tratar un desorden mediado por RAGE en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación constituida que comprende una proteína de fusión de RAGE, un lioprotectante y un estabilizante.

Cualquiera de las modalidades de las proteínas de fusión de RAGE descritas en este documento puede usarse para el tratamiento de la enfermedad en las composiciones terapéuticas y formulaciones de la presente invención. Además, la proteína de fusión de RAGE puede comprender una secuencia derivada de un sitio de enlace de ligando RAGE unido a un polipéptido de ínmunoglobulina. Las modalidades de la proteína de fusión de RAGE pueden comprender un polipéptido de RAGE directamente unido a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una ínmunoglobulina o una proteína de un dominio CH2 de una ínmunoglobulina. En ciertas modalidades, el polipéptido de RAGE puede comprender un conector de interdominio de RAGE unido a un dominio de ínmunoglobulina de RAGE de manera que el aminoácido C-terminal del dominio de Ínmunoglobulina de RAGE se une al aminoácido N-terminal del conector de interdominio y el aminoácido C-terminal del conector de interdominio RAGE se une directamente al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de la misma. Por ejemplo, ciertas modalidades de la proteína de fusión pueden comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer interconector de dominio de RAGE unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo conector de interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N-terminal del primer conector de interdominio se une al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE se une al aminoácido C-terminal del primer conector de interdominio, se une al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el aminoácido C-terminal del segundo conector de interdominio de RAGE se une directamente al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2 o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

En modalidades alternas de esta proteína de fusión de dominio múltiple, el polipéptido de RAGE puede comprender la secuencia de aminoácido como se establece en SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:47 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. En otras modalidades alternas, la proteína de fusión de RAGE puede comprender la secuencia de aminoácido como se establece en al menos una SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57 sin la lisina C-terminal. Ú otras modalidades como se describen en este documento pueden constituir la proteína de fusión de RAGE usada en las formulaciones de la presente invención.

Una variedad de lioprotectantes pueden usarse en la formulación de proteína de fusión de RAGE liofilizada. En algunas modalidades, el lioprotectante puede comprender un azúcar de no reducción. Por ejemplo, el azúcar de no reducción puede comprender sacarosa, manitol y trehalosa. También, una variedad de estabilizadores puede usarse en la formulación de la proteína de fusión de RAGE liofilizada. En ciertas modalidades, el estabilizador puede comprender histidina.

La proteína de fusión de RAGE liofilizada puede comprender componentes adicionales. En ciertas modalidades, la formulación de proteína de fusión de RAGE además puede comprender al menos uno de un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen. En una modalidad, la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida comprende aproximadamente 40-100 mg/mL de proteina de fusión de RAGE comprendiendo la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM de histidina, aproximadamente 60 mM a aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.05% de Tween 80 y un pH de aproximadamente 6.0 a 6.5. Por ejemplo, la formulación de la proteína de fusión de RAGE reconstituida puede en ciertas modalidades comprender aproximadamente 40-50 mg/mL de proteína de fusión de RAGE que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.01 % de Tween 80 y en un pH de aproximadamente 6.0. U otras modalidades de la proteína de fusión de RAGE pueden usarse en las formulaciones para tratar los desórdenes mediados por RAGE como se requiera.

La formulación de la proteína de fusión de RAGE puede comprender un agente terapéutico estable que se formula para usarse en una medicina de prescripción médica o clínica. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la formulación de proteína de fusión de RAGE puede exhibir menos de 10% o menos de 5% o menos de 3% de descomposición después de una semana a 40 grados centígrados.

También, la formulación de proteína de fusión de RAGE puede ser estable en la reconstitución en un diluyente. En ciertas modalidades, menos de aproximadamente 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ó 1 % de la proteína de fusión de RAGE está presente como un agregado en la formulación de la proteína de fusión de RAGE.

La formulación de la proteína de fusión de RAGE reconstituida puede ser apropiada para la administración por varias rutas y como se requiere para el tratamiento de la enfermedad mediada por RAGE de interés. La administración de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención se puede emplear inyección intraperitoneal (IP). Alternativamente, la proteína de fusión de RAGE se puede administrar por vía oral, intranasal o como aerosol. En otra modalidad, la administración es intravenoso (IV). La proteína de fusión de RAGE también se puede inyectar por vía subcutánea. En otra modalidad, la administración de la proteína de fusión de RAGE es intra-arterial. En otra modalidad, la administración es sublingual. También, la administración puede emplear una cápsula de liberación con el tiempo. En otra modalidad, la administración puede ser transrectal, como por medio de un supositorio o similares. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar trastornos crónicos cuando es deseable la auto-administración.

Como se describe en mayor detalle en este documento, el RAGE ha sido implicado en la patogénesis de una variedad de estados de enfermedad y las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se han encontrado que son efectivas para aminorar dichos estados de enfermedad. Además, las formulaciones de proteína de fusión de RAGE de la presente invención pueden usarse para tratar una variedad de enfermedades mediadas por RAGE.

En ciertas modalidades, una formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida de la presente invención puede usarse para tratar un síntoma de diabetes o un síntoma de las complicaciones tardías diabéticas. Por ejemplo el síntoma de la diabetes o las complicaciones tardías diabéticas comprenden al menos uno de nefropatía diabética, retinopatía diabética, una úlcera en el pie diabético, una complicación cardiovascular o neuropatía diabética.

En otras modalidades, una formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida de la presente invención puede usarse para tratar al menos una de amiloidosis, enfermedad de Alzheimer, cáncer, falla renal o inflamación asociada con autoinmunidada, enfermedad del intestino irritable, artritis reumatoide, soriasis, esclerosis múltiple, hipoxia, apoplejía, ataque cardiaco, choque hemorrágico, sepsis, transplante de órganos o curación de heridas deteriorada.

O la formulación de la proteína de fusión de RAGE puede usarse para tratar la osteoporosis. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la administración de una formulación de proteína de fusión de RAGE de la presente invención incrementa la densidad del hueso del sujeto o reduce la proporción de una disminución en la densidad ósea de un sujeto.

En algunas modalidades, la autoinmunidad tratada usando las formulaciones de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender el rechazo de al menos una de las células de la piel, células pancreáticas, células nerviosas, células musculares, células endoteliales, células del corazón, células del hígado, células del riñon, un corazón, células de la médula espinal, células sanguíneas, células arteriales, células venosas, células del cartílago, células de la tiroides o células madre. O la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida puede usarse para tratar la falla del riñon.

En ciertas modalidades, la formulación de la proteína de fusión de RAGE puede usarse para tratar la inflamación y/o rechazo asociado con el transplante de al menos un órgano, un tejido, o una pluralidad de células de un primer sirio a un segundo sitio. El primero y segundo sitios pueden estar en diferentes sujetos o en el mismo sujeto. El transplante de una variedad de diferentes tipos celulares puede mejorarse usando las formulaciones de proteína de fusión de RAGE de la presente invención. Por ejemplo, las células transplantadas ú órgano transplantado pueden comprender una célula, tejido u órgano de un páncreas, piel, hígado, riñon, corazón, médula espinal, sangre, hueso, músculo, arteria, vena, cartílago, tiroides, sistema nervioso o células madre.

Los ejemplos para usar las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención en el tratamiento de dichas enfermedades y desórdenes se describen en este documento.

Por ejemplo, una variedad de modelos animales se han usado para validar el uso de los compuestos que modulan el RAGE como terapéutica. Los ejemplos de estos modelos son los siguientes: a) RAGEs inhibió la formación de la neoíntima en un modelo de rata de restenosis siguiendo la lesión arterial en las ratas diabéticas y normales por la inhibición de la activación endotelial, músculo liso y macrófagos por medio del RAGE (Zhou eí al., Circulation 107:2238-2243 (2003)); b) La inhibición de las interacciones de RAGE/ligando empleando tanto RAGEs o un anticuerpo anti-RAGE, redujo la formación de la placa amiloide en un modelo de ratón de amiloidosis sistémica (Yan ef al., Nal Med., 6:643-651 (2000)). Acompañando a la reducción de las placas amiloideas se produjo una reducción de las citoquinas inflamatorias, interleuquina-6 (IL-6) y factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF) además de la reducción de la activación del NF-kB en animales tratados; c) Los ratones transgénicos RAGE (que sobreexpresan el RAGE y los que expresan el RAGE dominante negativo) exhiben la formación de placa y déficit cognitivos en un modelo de ratón del AD (Arancio ef al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)); d) El tratamiento de las ratas diabéticas con RAGEs redujo la permeabilidad vascular (Bonnardel-Phu eí al., Diabetes, 48:2052-2058 (1999)); e) El tratamiento con RAGEs redujo las lesiones arterioscleróticas en ratones diabéticos nulos en apolipoproteína E y previno los índices funcionales y morfológicos de la nefropatía diabética ratones db/db (Hudson et al., Aren. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); y f) El RAGEs atenuó la gravedad de la inflamación en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Hofmann ef al., Genes Immunol., 3:123-135 (2002)), un modelo de ratón de encefalomielitis alérgica experimental (Yan ef al., Nat. Med. 9:28-293 (2003)) y un modelo de ratón de enfermedad inflamatoria intestinal (Hofmann ef al., Cell, 97:889-901 (1999)).

De este modo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se puede usar para tratar un síntoma de diabetes y/o complicaciones que resultan de la diabetes mediadas por el RAGE. En modalidades alternas, el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías pueden comprender la neuropatía diabética, retinopatía diabética, una úlcera de pie diabético, una complicación cardiovascular de la diabetes, o neuropatía diabética.

Originalmente identificado como un receptor para moléculas cuya expresión se asocia con la patología de diabetes, el RAGE por sí mismo es esencial para la fisiopatología de las complicaciones diabéticas. Se ha demostrado que la inhibición ¡n vivo, de la interacción de RAGE con sus ligando(s) es terapéutica en múltiples modelos de complicaciones diabéticas e inflamación (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)). Por ejemplo, un tratamiento de dos meses con anticuerpos anti-RAGE normalizó la función renal y redujo la histopatología renal anormal en ratones diabéticos (Flyvbjerg ef al., Diabetes 53: 166-172 (2004)). Además, el tratamiento con un forma soluble de RAGE (RAGEs) que se une a los ligandos de RAGE e inhibe las interacciones de RAGE/ligando, redujo las lesiones arterioscleróticas en los ratones diabéticos nulos en apolipoproteína E y atenuó la patología funcional y morfológica de la nefropatía diabética en ratones db/db (Bucciarelli ef al., Circulation 106:2827-2835 (2002)).

También, se ha demostrado que la glicoxidación de macromoléculas no enzimáticas que finalmente produjo la formación de productos finales de alta glicosilación (AGE) está aumentada en los sitios de inflamación, en insuficiencia renal, en presencia de hiperglicemia y otras afecciones asociadas con estrés sistémico u oxidativo local (Dyer ef al., J. Clin. Invest, 91 :2463-2469 (1993); Reddy ef al., Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer ef al., J. Biol. Chem., 266:1 1654-1 1660 (1991 ); Degenhardt ef al., Cell Mol. Biol., 44: 1 139-1 145 (1998)). La acumulación de los AGE en la vasculatura se puede producir en forma focal, como en el amiloide de la articulación compuesto de microglobulina AGE^2-hallado en pacientes amiloidosis relacionados con la diálisis (Miyata ef al., J. Clin. Invest, 92:1243-1252 (1993); Miyata ef al., J. Clin. Invest, 98:1088-1094 (1996)), o generalmente está ejemplificado por la vasculatura y tejidos del paciente con diabetes (Schmidt ef al., Nature Med., 1 :1002-1004 (1995)). La acumulación progresiva de los AGE con el transcurso del tiempo en pacientes con diabetes sugiere que los mecanismos de depuración endógena no son capaces de funcionar efectivamente en los sitios del depósito del AGE. Tales AGE acumulados tienen la capacidad de alterar las propiedades celulares por varios mecanismos. Si bien el RAGE se expresa en bajos niveles en los tejidos y vasculatura normal, en un ambiente en el que los ligandos del receptor se acumulan, se ha demostrado que el RAGE se regula por aumento (Li eí al., J. Biol. Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al., J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781 -25790 (2000)). La expresión del RAGE está aumentada en endotelio, células del músculo liso e infiltración de fagocitos mononucleares en la vasculatura diabética. También, los estudios de cultivos celulares han demostrado que la interacción AGE-RAGE causa cambios en las propiedades celulares importantes en la homeostasis vascular.

El uso de las proteínas de fusión de RAGE para el tratamiento de patologías relacionadas con la diabetes se ilustra en la FIG. 14. La proteína de fusión de RAGE TTP-4000 se evaluó en un modelo de rata diabética de restenosis que incluye la medición de la proliferación de músculo liso y la expansión de la íntima que sigue a la lesión vascular. Como se ilustra en la FIG. 14, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir significativamente la relación intima/media (l/M) (FIG. 14; Tabla 1 ) en restenosis asociada con diabetes en forma de dosis-respuesta. Asimismo, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir significativamente la proliferación de las células del músculo liso vascular asociado con restenosis de un modo sensible a la dosis. (Figura 1 A).

Tabla 1 Efecto de la TTP-4000 en un modelo de restenosis en rata *P<0,05; ** para dosis alta y baja se usó una dosis de carga de 3 mg/animal.

En otras modalidades, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también se pueden usar para tratar o revertir la amiloidosis o enfermedad de Alzheimer. El RAGE es un receptor para amiloide beta (?ß además de otras proteínas amiloidogénicas que incluyen SAA y amilina (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan ef al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997); Yan ef al., Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa ef al., Lab Invest, 80:1 101 -1 1 10 (2000)). Asimismo, los ligandos de RAGE, que incluyen a los AGE, S100b y proteínas ?ß se encuentran en los tejidos que rodean la placa senil del hombre (Luth et al., Cereb. Cortex 15:21 1 -220 (2005); Petzold ef al, Neurosci. Lett.., 336:167-170 (2003); Sasaki ef al. Brain Res., 12:256-262 (2001 ; Yan ef al., Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)). Se ha demostrado que el RAGE se une al material fibrilar de hoja ß independientemente de la composición de las subunidades (péptido amiloide-ß, amilina, amiloide A sérico, péptido derivado del prion) (Yan ef al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan ef al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Además, se ha demostrado que el depósito de amiloide produce expresión aumentada de RAGE. Por ejemplo, en los cerebros de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD), la expresión de RAGE aumenta en las neuronas y glia (Yan, ef al., Nature 382:685-691 (1996)). Junto con la expresión de los ligandos de RAGE, el RAGE se regula por el aumento en los astrositos y células microgliales del hipocampo de los individuos con AD pero no se regula por aumento en individuos que no tienen AD (Lúe ef al., Exp. Neurol., 171 :29-45 (2001 )). Estos hallazgos sugieren que las células que expresan el RAGE se activan por medio de las interacciones RAGE/ligando de RAGE en la vecindad de la placa senil. Asimismo, in vitro, la activación mediada por ?ß de las células microgliales se puede bloquear con anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión con el ligando de RAGE (Yan et al., Proa Nati. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)). También se ha demostrado que el RAGE puede actuar como un punto focal para el ensamble fibrilar (Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003)).

También, la inhibición in vivo de las interacciones RAGE/ligando que usan RAGEs o un anticuerpo anti-RAGE pueden reducir la formación de la placa amiloide en un modelo de ratón de amiloidosis sistémica (Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Los ratones transgénicos dobles que sobreexpresan el RAGE humano y la proteína precursora del amiloide (APP) con las mutaciones Swedish y London (muíante hAPP) en las neuronas desarrollan defectos de aprendizaje y anormalidades neuropatológicas más temprano que sus homólogos transgénicos hAPP mutantes simples. En contraste, los ratones transgénicos dobles con capacidad de señalización ?ß disminuida debido a las neuronas que expresan una forma dominante negativa de RAGE en el mismo entorno de hAPP mutante muestran un comienzo retardado de las anormalidades neuropatológicas y de aprendizaje en comparación con su homóloga transgénica APP simple (Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)).

Además, se ha demostrado que la inhibición de la interacción de RAGE-amiloide disminuye la expresión de RAGE celular y los marcadores del estrés celular (además de la activación del NF-KB), y disminuyen el depósito del amiloide (Yan eí al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)) lo cual sugiere un papel para la interacción de RAGE-amiloide en la perturbación de las propiedades celulares en un ambiente enriquecido por amiloide (aún en estadios tempranos) además en la acumulación del amiloide.

De este modo, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar también para tratar de reducir la amiloidosis y reducir las placas amiloide y la disfunción cognitiva asociada con la enfermedad de Alzheimer (AD). Como se describió anteriormente, se ha demostrado que el RAGEs reduce la formación de la placa amiloide en el cerebro y el aumento posterior de los marcadores inflamatorios en un modelo animal de AD. Las FIGS. 15 y 15A muestran que los ratones que tienen AD, y se tratan durante 3 meses con TTP-4000 o RAGEs de ratón presentaron menos placas beta amiloide (?ß) y menos disfunción cognitiva que los animales que recibieron un vehículo o un control negativo de IgG humana (lgG1 ). Como el RAGEs, TTP-4000 también puede reducir las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF-a (datos no mostrados) asociados con AD.

También, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar la arterosclerosis y otros trastornos cardiovasculares. De este modo, se ha demostrado que la enfermedad cardiaca isquémica es particularmente alta en pacientes con diabetes (Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel eí al, J. Am. Med. Assoc, 241 :2035-2038 (1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)). Además, los estudios han demostrado que la arterosclerosis en pacientes con diabetes es más acelerada y extensa que en pacientes que no sufren de diabetes (Ver por ej.,. Waller er al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221 -230 (1978); Hamby et al., Chest, 2:251 -257 (1976); y Pyorala er al., Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)). Si bien las razones para la arterosclerosis acelerada en establecimiento de la diabetes son muchas, se ha demostrado que la reducción de los AGE puede reducir la formación de la placa.

Por ejemplo, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también se pueden usar para tratar accidentes cerebrovasculares. Cuando se comparó el TTP-4000 en el RAGEs en modelo animal de enfermedad importante del accidente cerebrovascular, se encontró que el TTP-4000 proporciona una reducción significativamente mayor del volumen del infarto. En este modelo, la arteria carótida del medio de un ratón está ligada y luego se reperfundió para formar un infarto. Para evaluar la eficacia de las proteínas de fusión de RAGE para tratar o prevenir el accidente cerebrovascular, los ratones se trataron con RAGEs o TTP-4000 o control inmunoglobulina inmediatamente antes de la reperfusión. Como se observa en la Tabla 2, el TTP-4000 fue más eficaz que el RAGEs para limitar el área del infarto en estos animales lo cual sugiere que el TTP-4000, debido a su mejor vida media en plasma, pudo mantener mayor protección que RAGEs.

Tabla 2 Reducción del infarto en el accidente cerebrovasular •Significativo para p<0,001 ; "Comparada con solución salina En otra modalidad, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar cáncer. En una modalidad, el cáncer tratado mediante las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención comprende las células cancerosas que expresan el RAGE. Por ejemplo, los cánceres que se pueden tratar con la proteína de fusión de RAGE de la presente invención incluyen algunos cánceres de pulmón, algunos gliomas, algunos papilomas y los similares. La anfoterina es una proteína de unión al ADN cromosómico de la no histona I con grupo de alta movilidad (Rauvala er a/., J. Biol. Chem., 262:16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993)), la cual se ha demostrado que interactúa con el RAGE. Se ha demostrado que la anfoterina promueve el crecimiento de las neuritas además de actuar como una superficie para el ensamblaje de los complejos de proteasa del sistema fibrinolítico (también se sabe que contribuye a la movilidad celular). Además, se ha observado un efecto inhibidor del crecimiento tumoral local al bloquear el RAGE en un modelo tumoral primario (glioma C6), el modelo de metástasis pulmonar de Lewis (Taguchi er al., Nature 405:354-360 (2000)), y que espontáneamente origina papilomas en ratones que expresan el transgén de v-Ha-ras (Leder ef al., Proc. Nati. Acad. Sci., 87:9178-9182 (1990)).

En otra modalidad, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar la inflamación. En modalidades alternas, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar la inflamación asociada con enfermedad inflamatoria intestinal, inflamación asociada con artritis reumatoide, inflamación asociada con soriasis, inflamación asociada con esclerosis múltiple, inflamación asociada con hipoxia, inflamación asociada con accidente cerebrovascular, inflamación asociada con ataque cardíaco, inflamación asociada con choque hemorrágico, inflamación asociada con sepsis, inflamación asociada con trasplante de órgano, inflamación asociada con mala cicatrización de heridas o inflamación asociada con rechazo de células, tejido y órganos propias (por ej., autoinmune) o no propias (por ej., trasplantado).

Por ejemplo, después del tratamiento trombolítico, las células inflamatorias tales como granulocitos infiltran el tejido isquémico y producen radicales oxígeno que pueden destruir más células que las que fueron destruidas por la hipoxia. Se ha demostrado que la inhibición del receptor en los neutrófilos responsables de que los neutrófilos puedan infiltrar el tejido con anticuerpos u otros antagonistas de la proteína mejora la respuesta. Debido a que el RAGE es un ligando para este receptor del neutrófilo, una proteina de fusión de RAGE que contiene un fragmento de RAGE puede actuar como un señuelo y evitar que los neutrófilos circulen del sitio reperfundido y de este modo evitar la destrucción del tejido adicional. El papel de RAGE para la prevención de la inflamación puede estar indicado por los estudios que muestran que el RAGEs inhibió la expansión de la neoíntima en un modelo de rata de restenosis después de la lesión arterial en ratas diabéticas y normales, presumiblemente por inhibición de la proliferación de la célula del músculo liso endotelial y la activación de los macrófagos por medio de RAGE (Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003)). Además, el RAGEs inhibió los modelos de inflamación que incluyen hípersensibilidad de tipo retardada, encefalitis autoinmune experimental y enfermedad inflamatoria intestinal (Hofman er a/., Cell, 97:889-901 (1999)).

En una modalidad, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar trastornos autoinmunes. Por ejemplo, en una modalidad, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar la insuficiencia renal. De este modo, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para tratar nefritis lúpica sistémica o nefritis lúpica inflamatoria. Por ejemplo, se ha demostrado que S100/calgranulina comprende una familia de polipéptidos de unión al calcio estrechamente relacionados caracterizados por dos regiones EF-hand unidas por un péptido conector (Schafer ef al., TIBS, 21 :134-140 (1996); Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995); Rammes ef al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995)). Si bien estos carecen de péptidos señal, se sabe hace mucho tiempo que S100/calgranulina aumenta el acceso al espacio extracelular, especialmente en los sitios de respuestas inflamatoria/inmune crónica, como en la fibrosis quística y artritis reumatoide. El RAGE es un receptor para muchos miembros de la familia S100/calgranulina, que media sus efectos proinflamatorios sobre células tales como linfocitos y fagotitos mononucleares. También, los estudios de la respuesta de hipersensibildad retardada, colitis en ratones nulos en IL-10, artritis inducida por artritis y los modelos de encefalitis autoinmune experimental sugieren que la interacción RAGE-ligando (presumiblemente con S-100/calgranulinas) tiene una función proximal de la cascada inflamatoria.

La diabetes tipo I es un trastorno autoinmune que se puede prevenir o mejorar por el tratamiento con las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado que el RAGEs puede permitir la transferencia de los esplenocitos de los ratones diabéticos no obesos (NOD) a los ratones NOD con inmunodeficiencia combinada grave (ratones NOD-scid). Los ratones NOD-scid no desarrollan diabetes espontáneamente, pero requieren la presencia de los inmunocitos capaces de destruir las células del islote de modo que luego se induce la diabetes. Se encontró que los recipientes de NOD-scid tratados con RAGEs mostraron un comienzo reducido de la diabetes inducido por los esplenocitos transferidos de un ratón diabético (NOD) en comparación con los receptores NOD-scid no tratados con RAGEs (Publicación de Patente Estadounidense 2002/0122799). Como está indicado en la US 2002/0122799, los resultados experimentales que usan RAGEs en este modelo son relevantes para la enfermedad humana tal como los establecimientos clínicos en los que se pueden producir las terapias inmunes futuras y el trasplante de islotes.

De este modo, en una modalidad, una proteína de fusión de RAGE de la presente invención se puede usar para tratar la inflamación asociada con trasplante de al menos uno de un órgano, un tejido o una pluralidad de células de un primer sitio a un segundo sitio. El primer y segundo sitio pueden estar en diferentes sujetos, o en el mismo sujeto. En modalidades alternas, las células, tejidos u órgano trasplantados comprenden células de páncreas, piel, hígado, riñon, corazón, pulmón, hueso, médula ósea, sangre, hueso, músculo, células endoteliales, arteria, vena, cartílago, tiroides, sistema nervioso o células madre. Por ejemplo, la administración de la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención se puede usar para facilitar el trasplante de las células del islote de un primer sujeto no diabético a un segundo sujeto diabético.

En otra modalidad, la presente invención puede proporcionar un método para tratar la osteoporosis por la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de RAGE de la presente invención. (Zhou et al., J. Exp. Med., 203:1067 - 1080 (2006)). En una modalidad, el método para tratar la osteoporosis también puede comprender la etapa de aumentar la densidad el hueso del sujeto o reducir la velocidad de disminución de la densidad del hueso de un sujeto.

De este modo, en diversas modalidades seleccionadas, la presente invención puede proporcionar un método para inhibir la interacción de un AGE con RAGE en un sujeto por la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de RAGE de la presente invención. El sujeto tratado mediante las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede ser un animal. En una modalidad, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede sufrir de una enfermedad relacionada con AGE tal como diabetes, complicaciones diabéticas tales como nefropatía, neuropatía, retinopatía, úlcera del pie, amiloidosis, o insuficiencia renal e inflamación. O, el sujeto puede ser un individuo con enfermedad de Alzheimer. En una modalidad alternativa, el sujeto puede ser un individuo con cáncer. En otras modalidades, el sujeto puede sufrir de lupus eritematoso sistémico o nefritis lúpica inflamatoria. Otras enfermedades pueden ser mediadas por RAGE y de este modo, se pueden tratar mediante las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención. De este modo, en modalidades alternativas adicionales de la presente invención, las proteínas de fusión de RAGE se pueden usar para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, artritis, vasculitis, nefropatías, retinopatías y neuropatías en sujetos humanos o animales. En otras modalidades, la inflamación que incluye las respuestas autoinmunes (por ej., rechazo de lo propio) y respuestas no autoinmunes (por ej., rechazo de lo no propio) puede estar mediada por RAGE y de este modo se puede tratar mediante las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención.

Una cantidad terapéuticamente efectiva puede comprender una cantidad capaz de impedir la interacción de RAGE con un AGE u otros tipos de ligandos endógenos RAGE de un sujeto. Por consiguiente, la cantidad variará con el sujeto tratado. La administración del compuesto puede ser por horas, diaria, semanal, mensual, anual, o como un evento único. En diversas modalidades alternativas, la cantidad efectiva de la proteína de fusión de RAGE puede variar de aproximadamente 1 ng/kg en peso corporal a 100 mg/kg peso corporal o de aproximadamente 10 pg/kg peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg peso corporal o de aproximadamente 100 pg/kg peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg peso corporal. La cantidad efectiva real se puede establecer por ensayos de dosis/respuesta que usan usos estándares del arte (Johnson et al., Diabetes. 42: 1 179, (1993)). De este modo, como es sabido en el arte, la cantidad efectiva puede depender de la biodisponibilidad, bioactividad y biodegradabilidad del compuesto.

Composiciones La presente invención puede comprender una composición que comprende una proteína de fusión de RAGE de la presente invención mezclada con un portador farmacéuticamente aceptable. La proteína de fusión de RAGE puede comprender un polipéptido de RAGE ligado a un segundo polipéptido distinto de RAGE. En una modalidad, la proteina de fusión de RAGE puede comprender un sitio de unión con el ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando comprende la mayor parte del dominio N-terminal de la proteína de fusión de RAGE. El sitio de unión con el ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión con el ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 47 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede unirse a un polipéptido que comprende un dominio o una porción de inmunoglobulina (por ejemplo, un fragmento de la misma) de un dominio inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido comprendiendo un dominio de inmunoglobulina en al menos una porción de uno de los dominios CH2 o CH3 de un IgG humano. En ciertas modalidades, la proteína de fusión de RAGE comprende una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:56 o la SEQ ID NO:57, o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico a la misma. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 comprende la secuencia de SEQ ID NO:56 ó SEQ ID NO:57 sin la lisina C-terminal.

La proteína de RAGE o polipéptido puede comprender el RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO:1 ) o un fragmento de RAGE de humano. En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye ningún residuo de la secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender residuos 1 -22 o residuos 1 -23 de longitud completa de RAGE (SEQ ID NO:1 ). En modalidades alternas, el polipéptido de RAGE puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticos al RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender el RAGE humano o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (ver por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O el RAGE humano puede comprender el RAGE de longitud completa con la secuencia de señal removida (por ejemplo, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3) (Figuras 1 y 1 A) o una opción de la secuencia de aminoácido.

Las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también pueden comprender RAGE (es decir SEQ ID NO:4), un polipéptido al menos 90% idéntica a sRAGE o un fragmento de sRAGE. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano o un fragmento del mismo con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (ver por ejemplo, Neeper et al. (1992)). O el RAGE humano puede comprender sRAGE con la secuencia de señal removida (Ver por ejemplo, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ó SEQ ID NO:45 en la Figura 1 ) o una porción de esa secuencia de aminoácido. En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V (Ver por ejemplo, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO:46 en la Figura 1 ). O una secuencia al menos 90%% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo puede usarse. O la proteína de RAGE puede comprender un fragmento de RAGE comprendiendo una porción del dominio V (Ver, por ejemplo, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 ó SEQ ID NO:47 en la Figura 1 ). En una modalidad, el sitio de unión del ligando puede comprender la SEQ ID NO:9 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o la SEQ ID NO:47 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento de RAGE es un péptido sintético.

Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender 23-1 16 aminoácido de RAGE de humano (SEQ ID NO:7) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o 24-1 16 aminoácidos de RAGE de humano (SEQ ID NO:8) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o 24-1 16 aminoácidos de RAGE de humano en donde Q24 cicliza para formar pE (SEQ ID NO:46) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE. O el polipéptido de RAGE puede comprender 124-221 aminoácidos de RAGE de humano (SEQ ID NO:1 1 ) o una secuencia al menos 90% idéntica a las mismas correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender 227-317 aminoácidos de RAGE humano (SEQ ID NO:12) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O el polipéptido de RAGE puede comprender 23-1 123 aminoácidos de RAGE de humano (SEQ ID NO:13) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o 24-123 aminoácidos de RAGE de humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un conector interdominio descendente. O el polipéptido de RAGE puede comprender 24-123 aminoácidos de RAGE de humano en donde Q24 cicliza para formar pE (SEQ ID NO:48) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma. O el polipéptido de RAGE puede comprender 23-226 aminoácidos de RAGE de humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o 24-226 aminoácidos de RAGE de humano (SEQ ID NO:18) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el conector de interdominio que se une a estos dos dominios. O el polipéptido de RAGE puede comprender 24-226 aminoácidos de RAGE De humano en donde Q24 cicliza para formar pE (SEQ ID NO:50) o una secuencia 90% idéntica a la misma. O el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE de humano (SEQ ID NO:5) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, correspondiente a sRAGE (por ejemplo, codificando los dominios V, C1 y C2 y los conectares interdominio). O el polipéptido de RAGE puede comprender 24-339 aminoácidos de RAGE de humano en donde Q 24 cicliza para formar pE (SEQ ID NO:45) o una secuencia al menos 90% idéntica al mismo. O fragmentos de cada una de estas secuencias puede usarse.

En otra modalidad, el sitio de unión con el ligando puede comprender los aminoácidos 22-51 de la SEQ ID NO. 1 . En otra modalidad, el sitio de unión con el ligando puede comprender los aminoácidos 23-51 de la SEQ. ID NO: 1 . En otra modalidad, el sitio de unión con el ligando puede comprender los aminoácidos 31 -51 de la SEQ ID NO: 1 . En otra modalidad, el sitio de unión con el ligando puede comprender los aminoácidos 31 -1 16 de la SEQ ID NO: 1 . Por ejemplo, el sitio de enlace del ligando puede comprender un dominio RAGE V o una porción del mismo, tal como el dominio de enlace del ligando de RAGE (por ejemplo, aminoácidos 1 - 18, 23-1 18, 24-1 18, 31 -1 18, 1 -1 16, 23-1 16, 24-1 16, 31 -1 16, 1 -54, 23-54, 24-54, 31 -54, 1 -53, 23-53, 24-53 ó 31 -53 de la SEQ ID NO:1 o fragmentos de los mismos) (Figura 1 ). O fragmentos de los polipéptidos que funcionalmente se unen a un ligando de RAGE pueden usarse. O una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica al dominio V de RAGE o fragmentos del mismo (por ejemplo, como se describió anteriormente) pueden usarse. Además, como se conoce en la técnica, en modalidades en donde el N-término de la proteína de fusión es glutamina, como por ejemplo en la remoción de la secuencia de señal que comprende los residuos 1 -23 de la SEQ ID N0: 1 (por ejemplo, Q24 para un polipéptido comprende 24-118 aminoácidos o la SEQ ID NO:1 ), la glutamina puede ciclizar para formar el ácido piroglutámico (pE).

La proteína de fusión de RAGE puede incluir varios tipos de péptidos que no derivan de RAGE o un fragmento de la misma. El segundo polipéptido de la proteína de fusión de RAGE puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (y), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (y1 ), lgG2 (y2), lgG3 (y3), lgG4 (y4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de uno o ambos de estos dominios. Como ejemplo de modalidades, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO: 40 o una porción de la misma. En una modalidad, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 de humano o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO:38 o una porción de la misma. Por ejemplo, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de los mismos puede comprender la SEQ ID NO:38 o la SEQ ID:40 con la lisina terminal (K) removida. El péptido de la inmunoglobulina puede estar codificado por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41 . La secuencia de la inmunoglobulina de la SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40 también puede ser codificado por la SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 53, respectivamente.

La porción Fe de la cadena de la inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. De este modo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un conector interdominio derivado de RAGE más que polipéptido de la bisagra del interdominio derivado de una inmunoglobulina.

De este modo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE también puede comprender un polipéptido de RAGE directamente conectado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. En una modalidad, el dominio CH2 o un fragmento de la misma comprende la SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el fragmento de la SEQ ID NO: 42 comprende la SEQ ID NO: 42 con los primeros diez aminoácidos eliminados.

En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende un conector interdominio de RAGE ligado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE de modo que el aminoácido C-terminal del dominio de la inmunoglobulina de RAGE esté unido al aminoácido N-terminal del conector interdominio y el aminoácido C-terminal del conector interdominio de RAGE está directamente conectado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de la misma, puede comprender los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana, o una porción de ambos o alguno de estos dominios. Como ejemplo de las modalidades, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO: 40 o una porción de la misma. En una modalidad, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 de humano o una porción de la misma puede comprender la SEQ ID NO:38 o una porción de la misma. Por ejemplo, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 de humano o una porción de la misma puede comprender SEQ ID NO:38 o la SEQ ID NO:40 con la lisina terminal (K) removida.

La proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender dominios únicos o múltiples de RAGE. También, el polipéptido de RAGE que comprende un conector interdominio conectado a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de la proteína del RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE puede comprender dos dominios ¡nmunoglobulínicos derivados de la proteína de RAGE y dos dominios inmunoglobulinicos derivados de un polipéptido del Fe humano. La proteína de fusión de RAGE puede comprender una primer inmunoglobulina del dominio de RAGE y un primer conector interdominio conectado a un segundo dominio de la inmunogiobulina de RAGE y un segundo conector interdominio de RAGE, de modo que el aminoácido N-terminal del primer conector interdominio está conectado al aminoácido C-terminal del primer dominio de la inmunogiobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de la inmunogiobulina de RAGE está conectado al aminoácido C-terminal del primer conector interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo conector interdominio está conectado al aminoácido C-terminal del segundo dominio del dominio de la inmunogiobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo conector interdominio de RAGE está conectado al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunogiobulina CH2 o fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano donde Q24 cicliza para formar el pE, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma (SEQ ID NO: 51 ), que corresponden al dominio V, el dominio C1 , el conector interdominio que une estos dominios y un segundo conector interdominio descendente de C1. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar a cuatro dominios de la proteína de fusión de RAGE. En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 54 puede codificar para uno de los cuatro dominios de la proteína de fusión de RAGE, donde los cambios de bases silentes para los codones que codifican para prolina (CCG a CCC) y glicina (GGT a GGG) en el extremo C-terminal de la secuencia ingresan para eliminar un sitio de empalme del ARN críptico cercano al codón terminal (es decir, en los nucleótidos 1375-1380 de la SEQ ID NO:30 se modifican para generar la SEQ ID NO:54).

Alternativamente, los tres dominios de la proteína de fusión de RAGE pueden comprender un dominio de inmunogiobulina derivado de RAGE y dos dominios de la inmunogiobulina derivados de un polipéptido del Fe humano. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE puede comprender un dominio de la inmunogiobulina de RAGE único conectado por medio de un conector interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una Secuencia por lo menos 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano donde Q24 cicliza para formar el pE, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma (SEQ ID NO: 49), que corresponde al dominio V de RAGE y descendente a un conector interdominio. En una modalidad, construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma puede codificar para uno de los tres dominios de la proteína de fusión de RAGE. En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 55 puede codificar para uno de los cuatro dominios de la proteína de fusión de RAGE, donde los cambios de bases silentes para los codones que codifican para prolina (CCG a CCC) y glicina (GGT a GGG) en el extremo C-terminal de la secuencia ingresan para eliminar un sitio de empalme del ARN críptico cercano al codón terminal.

Un fragmento del conector interdominio de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está naturalmente descendente y de este modo unida a un dominio de la inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE V, el conector interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente descendentes del dominio V. En una modalidad, el conector puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 1 17-123 de RAGE de longitud completa. O, el conector puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la Secuencia natural de RAGE. Por ejemplo, se puede usar un conector interdominio que comprende varios aminoácidos (por ej., aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15) ascendentes o descendentes de la SEQ ID NO: 21. De este modo, en una modalidad, el conector interdominio comprende la SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 1 7-136 de RAGE de longitud completa. O, se pueden usar los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 suprimiendo ejemplo, 1 , 2, o 3, aminoácidos de cualquier extremo del conector. En modalidades alternas, el conector puede comprender una secuencia que es al menos 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE C1 , el conector puede comprender una secuencia peptídica que está naturalmente descendente del dominio C1 . En una modalidad, el conector puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el conector puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia natural de RAGE. Por ejemplo, se puede usar un conector que comprende varios aminoácidos (aminoácidos 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15) descendentes y ascendentes de la SEQ ID NO: 22. O, se pueden usar los fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que suprimen por ejemplo, 1 -3, 1 -5, o 1 -10, o 1 -15 aminoácidos de cualquier extremo del conector. Por ejemplo, en una modalidad, un conector interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. En modalidades alternas, el conector puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica para la SEQ ID NO:22 ó la SEQ ID NO:24.

O un conector interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos 318-342 de RAGE. En modalidades alternas, el conector puede comprender una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica para la SEQ ID NO:44.

Los vehículos aceptables para uso farmacéutico pueden comprender alguno de los vehículos aceptables para uso farmacéutico estándares conocidos en la técnica. En una modalidad, los vehículos farmacéuticos pueden ser un líquido y la proteína de fusión de RAGE o construcción de ácido nucleico puede estar en forma de solución. En otra modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido en forma de polvo, un polvo liofilizado o un comprimido. O, el portador farmacéutico puede ser un gel, supositorio o crema. En modalidades alternas, el portador puede comprender un liposoma, una microcápsula, una célula encapsulada en un polímero o un virus. De este modo, el término portador farmacéuticamente aceptable comprende pero no se limita a cualquier de los vehículos aceptables para uso farmacéutico estándares, tales como agua, alcoholes, solución salina estabilizada con fosfato, azúcares (por ej., sacarosa o manitol), aceites o emulsiones tales como emulsiones aceite/agua o una emulsión de triglicérido, diversos tipos de agentes humectantes, comprimidos, comprimidos recubiertos y cápsulas.

En ciertas modalidades, las proteína de fusión de RAGE pueden estar presentes en una forma neutral (incluyendo formas iónicas anfotéricas) o como especias negativamente o positivamente cargadas. En algunas modalidades, las proteínas de fusión de RAGE pueden ser complejas con un contra ión para formar la sal farmacéuticamente aceptable.

Los términos "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a un complejo que comprende una o más proteínas de fusión de RAGE y uno o más contra iones, en donde los contra iones se derivan de ácidos y bases orgánicas e inorgánicas farmacéuticamente aceptables.

Las bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen iones metálicos. Los iones metálicos más preferidos incluyen pero no se limitan a sales alcalimetálicas apropiadas, sales metálicas alcalinotérreas y otros iones metálicos fisiológicamente aceptables. Las sales derivadas de las bases inorgánicas incluyen aluminio, amonio, calcio, cobalto, níquel, molibdeno, vanadio, manganeso, cromo, selenio, estaño, cobre, férrico, ferroso, litio, magnesio, sales mangánicas, mangano, potasio, rubidio, sodio y zinc y en sus valencias usuales.

Las sales ácidas de adición farmacéuticamente aceptables de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden prepararse de los siguientes ácidos, incluyendo sin limitación fórmico, acético, acetamidobenzoico, atípico, ascórbico, bórico, propiónico, benzoico, canfórico, carbónico, ciclámico, dehidrocólico, masónico, edético, etilsulfúrico, fendizoico, metafosfórico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, málico, tartárico, tánico, cítrico, nítrico, ascórbico, glucorónico, maleico, fólico, fumárico, propiónico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, clorhídrico, hidrobrómíco, hidroyodico, lisina, isocítrico, trifluoroacético, pamoico, propiónico, antranílico, mesílico, erótico, oxálico, oxalacético, oleico, esteárico, salicílico, aminosalicílico, silicato, p-hidroxibenzoico, nicotínico, fenilacético, mandélico, embónico, sulfónico, metanosulfónico, fosfórico, fosfónico, etanosulfónico, etanodisulfónico, amonio, bencenosulfónico, pantoténico, naftalenosulfónico, toluenosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, sulfanílico, sulfúrico, nítrico, nitroso, éster monometílico del ácido sulfúrico, ciclohexilaminosulfónico, ß-hidroxibutirico, glicina, glicilglicina, glutámico, cacodilato, diaminohexanoico, canforsulfónico, glucónico, tiociánico, oxoglutárico, piridoxal-5-fosfato, clorofenoxiacético, undecanoico, N-acetil-L-aspértico y ácidos galactárico y galacturónico.

Las bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen trimetilamina, dietilamina, N.N'dibenciletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dibencilamina, dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N-metilglucamina), procaína, aminas cíclicas, cationes de amonio cuaternario, arginina, betaína, cafeína, clemizol, 2-etilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanodiamina, butilamina, etanolamida, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiridina, etilglucamina, glutamina, glucosalina, histidina, hidrabamina, imidazol, isopropilamina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piridina, piridoxina, neodimio, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purines, teobromuro, trietilamina, tripropilamina, trietanolamina, trometamina, metilamina, taurina, colato, 6-amino-2-metil-2-heptanol, 2-amino-2-metil-1 -1 ,3-propanodiol, 2-amino-2-metil-1 -propanol, ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil sustituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos alifáticos y aromáticos sulfónicos, estrontio, tricita, hidracina, fenilciclohexilamina, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano, ácido A/-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico, ácido 1 ,4-piperazinadietanosulfónico, ácido 3-morfolin-2-hidroxipropanosulfónico, 1 ,3-bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano, ácido 4-morfolinopropanosulfónico, ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1 -etanosulfónico, ácido 2-[(2-hidroxi-1 ,1 -bis(hidroximetil)etil)amino]etanosulfónico, ácido N,N-bis(2-hidroetil)-2-aminoetanosulfónico, ácido 4- (N-morfolino)butanosulfónico, ácido 3-(/V,A/-bis[2-hidroxietil]amino-2-hidroxipropanosulfónico, ácido 2-hidroxi-3-[tris(hidroximetil)metilamino]-1 -propanosulfónico, 4-(2-hidroxietil)piperazina-1 -(ácido 2-hidroxipropanosulfónico), dihidrato de piperazina-1 ,4-bis(ácido 2-hidroxipropanosulfónico), ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinopropanosulfónico, /V,/V-bis(2-hidroxietil)glicina, N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 4-butanosulfónico), ácido N-[tris(hidroximetil)metil)metil]-3-aminopropanosulfónico, ácido N-tris(Hidroximetil)metil-4-aminobutanosulfónico, ácido N-(1 ,1 -dimetil-2-hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanosulfónico, ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico, ácido 3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1 -propanosulfónico, ácido 3-(ciclohexilamino)-1 -propanosulfónico, ácido N-(2-acetamido)iminodiacético, ácido 4-(ciclohexilamino)-1 -butanosulfónico, N-[tris(hidroximetil)metil]glicina, 2-amino-2-(hidroximetil)-1 ,3-propanodiol y trometamol .

La administración de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede emplear varias rutas. De este modo, la administración de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede emplear inyección intraperitoneal (IP). Alternativamente, la proteína'de fusión de RAGE se puede administrar por vía oral, intranasai o como aerosol. En otra modalidad, la administración es intravenosa (IV). La proteína de fusión de RAGE también se puede inyectar por vía subcutánea. En otra modalidad, la administración de la proteína de fusión de RAGE es intra-arterial. En otra modalidad, la administración es sublingual. También, la administración puede emplear una cápsula de liberación con el tiempo. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar trastornos crónicos cuando es deseable la auto-administración.

En un aspecto adicional de la presente invención, las proteínas de fusión de RAGE de la invención se pueden utilizar en la terapéutica adyuvante o combinación de tratamientos terapéuticos con otros agentes terapéuticos conocidos. La siguiente es una lista no exhaustiva de adyuvantes y agentes terapéuticos adicionales que se pueden utilizar en combinación con los moduladores de la proteína de fusión de RAGE: Clasificaciones farmacológicas de agentes anticancerosos: 1. Agentes alguilantes: Ciclofosfamida, nitrosoureas, carboplatino, cisplatino, procarbazina 2. Antibióticos: Bleomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina 3. Antimetabolitos: Metotrexato, Citarabina, Fluorouracilo, Azatioprina, 6-Mercaptopurina y agentes quimioterapéuticos para el cáncer citotóxico 4. Alcaloides de plantas: Vinblastina, Vincristina, Etopósido, Paclitaxel, 5. Hormonas: Tamoxifeno, acetato de Octreotide, Finasteride, Flutamida 6. Modificadores de la respuesta biológica: Interferones, Interleuquinas Clasificaciones farmacológicas del tratamiento de la artritis reumatoide 1. Analgésicos: Aspirina 2. NSAID (fármacos anti-inflamatorios no esteroideos): Ibuprofeno, Naproxeno, Diclofenaco 3. DMARD (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad): Metotrexate, preparaciones de oro, idroxicloroquina, sulfasalazina 4. Modificadores de la respuesta biológica, DMARD: Etanercept, Infliximab Glucocorticoides, tales como beclometasona, metilprednisolona, betametasona, prednisona, dexametasona e hidrocortisona Clasificaciones farmacológicas del tratamiento de la Diabetes Mellitus 1. Sulfonilureas: Tolbutamida, Tolazamida, Gliburida, Glipizida 2. Biguanidas: Metformina 3. Agentes orales misceláneos: Acarbosa, Troglitazona 4. Insulina Clasificaciones farmacológicas del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer 1. Inhibidor de colinesterasa: Tacrina, Donepezil 2. Antipsicóticos: Haloperidol, Tioridazina 3. Antidepresivos: Desipramina, Fluoxetina, Trazodona, Paroxetina 4. Anticonvulsivos: Carbamazepina, ácido Valproico En una modalidad, las composiciones de la presente invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de RAGE en combinación con agentes terapéuticos adicionales simples y múltiples, Además de los agentes descritos hasta este momento, se pueden usar los siguientes agentes terapéuticos en combinación con las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención: inmunosupresores, tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina y otros tipos de inmunosupresores FK-506.

En una modalidad, la presente invención puede por consiguiente proporcionar un método para tratar las enfermedades mediadas por RAGE, el método comprende administrar a un sujeto que requiere del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de RAGE en combinación con agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de planta, antibióticos, hormonas, modificadores de la respuesta biológica, analgésicos, NSAID, DMARD, modificadores de la respuesta biológica (por ej., glucocorticoides), sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de colinesterasa, antipsicóticos, antidepresivos, anticonvulsivos e inmunosupresores, tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina y otros tipos de inmunosupresores FK-506. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona la composición farmacéutica de la invención como se describió anteriormente que además comprende uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de planta, antibióticos, hormonas, modificadores de la respuesta biológica, analgésicos, NSAID, DMARD, modificadores de la respuesta biológica (por ej., glucocorticoides), sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de colinesterasa, antipsicóticos, antidepresivos, anticonvulsivos e inmunosupresores, tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina y otros tipos de inmunosupresores FK-506.

Formulaciones Liofilizadas En otras modalidades, la presente invención también proporciona formulaciones que comprenden una proteína de fusión de RAGE. Las modalidades de las formulaciones pueden comprender una mezcla liofilizada de un lioprotectante, una proteína de fusión de RAGE y el estabilizante.

Una variedad de lioprotectantes pueden usarse en las formulaciones de proteína de fusión de RAGE liofilizada de la presente invención. En algunas modalidades, el lioprotectante puede comprender un azúcar de no reducción. Por ejemplo, el azúcar de no reducción puede comprender sacarosa, manitol o trehalosa. También una variedad de estabilizantes pueden usarse en la formulación de la proteína de fusión de RAGE liofilizada. En ciertas modalidades, el estabilizante puede comprender histidina.

La proteína de fusión de RAGE liofilizada puede comprender los componentes adicionales. En ciertas modalidades, la formulación de la proteína de fusión de RAGE además puede comprender al menos un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen. En una modalidad, la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida comprende aproximadamente 40-100 mg/mL de proteína de fusión de RAGE que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs:32, 33, 34, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM de histidina, aproximadamente 60 mM a aproximadamente 65 mM de sacarosa; aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.05% de Tween 80 y un pH de aproximadamente 6.0 a 6.5. Por ejemplo, la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida puede en ciertas modalidades comprender aproximadamente 40-50 mg/mL de proteína de fusión de RAGE comprendiendo la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 10 mM de histidina; aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.01 % de Tween 80 y un pH de aproximadamente 6.0. U otras concentraciones de la proteína de fusión de RAGE pueden usarse como se describe adicionalmente en este documento.

En una modalidad, la presente invención comprende una formulación reconstituida que comprende una proteína de fusión de RAGE liofilizada reconstituida en un diluyente en donde la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está dentro de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 400 mg/ML U otras concentraciones de la proteína de fusión de RAHE pueden usarse como se describe en este documento.

En otras modalidades, la presente invención también puede comprender métodos para preparar la formulación reconstituida estable de una proteína de fusión de RAGE. La formulación reconstituida puede comprender una concentración que es apropiada para el uso directo (por ejemplo, administración directa a un sujeto) o que puede además diluirse y/o mezclarse con un agente de liberación.

En ciertas modalidades, el método puede comprender reconstituir una mezcla liofilizada de la proteína de fusión de RAGE y un lioprotectante en un diluyente tal como la concentración de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está en un rango de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL. U otras concentraciones como se describen en este documento pueden usarse como se describe en este documento.

Una variedad de lioprotectantes pueden usarse en las formulaciones de proteína de fusión de RAGE reconstituida de la presente invención. En algunas modalidades, el lioprotectante puede comprender un azúcar de no reducción. Por ejemplo, el azúcar de no reducción puede comprender sacarosa, manitol o trehalosa. También, una variedad de estabilizadores puede usarse en la formulación de proteína de fusión de RAGE liofilizada. En ciertas modalidades, el estabilizador puede comprender histidina.

La formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida puede comprender componentes adicionales. En ciertas modalidades, la formulación de proteína de fusión de RAGE puede además comprender al menos un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen. En una modalidad, la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida comprende aproximadamente 40-100 mg/mL de la proteína de fusión de RAGE que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM de histidina, aproximadamente 60 mM a aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.05% de Tween 80 y un pH de aproximadamente 6.0 a 6.5. Por ejemplo, la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida en ciertas modalidades puede comprender 40-50 mg/mL de proteína de fusión de RAGE que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.01 % de Tween y en un pH de aproximadamente 6.0.

Una variedad de diluyentes para los farmacéuticos pueden usarse para reconstituir la proteína de RAGE liofilizada. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE liofilizada es estéril. También en una modalidad, el diluyente es estéril. En una modalidad, el diluyente puede comprender agua para inyección (WFT). También, en ciertas modalidades, la cantidad de diluyente agregado se basa en la dosis terapéutica y el perfil farmacocinético de la proteína de fusión de RAGE, asi como la biocompatibilidad de la formulación y el portador siendo administrado. En una modalidad, la formulación reconstituida es isotónica.

La proteína de fusión de RAGE puede comprende un agente terapéutico estable que se formula para usarse en un clínico o como un medicamento de prescripción. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida puede exhibir menos del 10% o menos del 5% o menos del 3% de descomposición después de una semana en 40 grados centígrados.

También la comulación de la proteína de fusión de RAGE puede ser estable en la reconstitución en un diluyente. En ciertas modalidades menos de aproximadamente 10% o aproximadamente 5% o aproximadamente 4% o aproximadamente 3%, o aproximadamente 2% o aproximadamente 1 % de la proteína de fusión de RAGE está presente como un agregado en la formulación de la proteína de fusión de RAGE.

La formulación de proteína de fusión de RAGE reconstituida puede ser apropiada para la administración por varias rutas y como se requiere para el tratamiento del desorden mediado por RAGE de interés. En ciertas modalidades, la formulación de la proteína de fusión de RAGE reconstituida es apropiada por al menos una de la administración intravenosa, intraperitoneal o subcutánea de la formulación a un sujeto.

Por ejemplo, en ciertas modalidades, la presente invención puede comprender una formulación reconstituida estable que comprende una proteína de fusión de RAGE en una concentración de al menos 10 mg/mL o al menos 20 mg/mL o al menos mg/mL y un diluyente, en donde la formulación reconstituida se ha preparado de una mezcla liofilizada de proteína de fusión de RAGE y un lioprotectante. En modalidades alternas, la concentración de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede ser al menos 100 mg/mL o al menos 200 mg/mL o al menos 400 mg/mL. En aún modalidades alternas, la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está en una cantidad dentro del rango de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL o aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL o aproximadamente 40 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL, aproximadamente 40 a 100 mg/mL o aproximadamente 40-50 mg/mL. La formulación también puede comprender un estabilizador.

En aún otras modalidades, la presente invención puede comprender artículos de fabricación que incluyen proteínas de fusión de RAGE. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el artículo de fabricación puede comprender un contenedor que sujeta una proteína de fusión de RAGE e instrucciones para reconstituir la formulación liofilizada con un diluyente. En ciertas modalidades, los artículos de fabricación pueden comprender un contenedor que sujeta una formulación que comprende una mezcla liofilizada de un lioprotectante, una proteína de fusión de RAGE y un estabilizante. El artículo de fabricación también puede comprender instrucciones para reconstituir la formulación liofilizada con un diluyente.

Una variedad de lioprotectantes pueden usarse en los artículos de fabricación de la presente invención. En algunas modalidades, el lioprotectante puede comprender un azúcar de no reducción. Por ejemplo, el azúcar de no reducción puede comprender sacarosa, manitol o trehalosa. También una variedad de estabilizantes pueden usarse en la formulación de proteína de fusión de RAGE liofilizada. En ciertas modalidades, el estabilizador puede comprender histidina.

La formulación de proteína de fusión de RAHE de los artículos de fabricación de la presente invención puede comprender componentes adicionales. En ciertas modalidades, la formulación de proteína de fusión de RAGE liofilizada además puede comprender al menos un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen. En una modalidad de los artículos de fabricación de la presente invención, en la reconstitución de conformidad con las instrucciones proporcionadas, la formulación de proteína de fusión de RAGE, en la reconstitución de conformidad con las instrucciones proporcionadas, la formulación de proteína de fusión de RAGE comprende aproximadamente 40-100mg/mL de proteína de fusión de RAGE que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57, aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM de histidina, aproximadamente 60 mM a aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.05% de Tween 80 y un pH de aproximadamente 6.0 a 6.5. Por ejemplo, la formulación de la proteina de fusión de RAGE puede, en ciertas modalidades, comprender aproximadamente 40-50 mg/mL de la proteína de fusión de RAGE que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57; aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 65 mM de sacarosa, aproximadamente 0.01 % de Tween 80 y un pH de aproximadamente 6.0. U otras concentraciones de la proteína de fusión de RAGE pueden usarse como se describe en este documento.

Una variedad de sustituyentes para los farmacéuticos puede proporcionarse para la reconstitución de la proteína de fusión de RAGE liofilizada. En una modalidad, la formulación liofilizada es estéril. Alternativamente o adicionalmente, el diluyente puede ser estéril. En una modalidad. El diluyente puede comprender agua para inyección (WFI). Además, el artículo de fabricación puede comprender un segundo contenedor que contiene un diluyente para reconstituir la formulación liofilizada, en donde el diluyente es agua para inyección (WFI). En una modalidad. La formulación reconstituida es isotónica.

También, en ciertas modalidades, la cantidad del diluyente agregado se basa en la dosis terapéutica y el perfil farmacocinético de la proteína de fusión de RAGE, así como la biocompatibilidad de la formulación y el portador siendo administrado. En la modalidad alterna, las instrucciones son para la reconstitución de la formulación liofilizada de manera que tiene las concentraciones como se describen en este documento. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las instrucciones son para reconstituir la formulación liofilizada de manera que la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está dentro del rango de aproximadamente 40 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL.

La formulación de la proteína de fusión de RAGE proporcionada como artículo de fabricación puede comprender un agente terapéutico estable que se formula para usarse en una clínica o como una medicina de prescripción. Por ejemplo, en ciertas modalidades, cuando se reconstituye de conformidad con las instrucciones proporcionadas, la proteína de fusión de RAGE puede exhibir menos de 10% o menos de 5% o menos de 3% de descomposición después de una semana a 40 grados centígrados. También, la formulación de proteína de fusión de RAGE puede ser estable en la reconstitución en un diluyente. En ciertas modalidades, menos de aproximadamente 10% o aproximadamente 5% o aproximadamente 4% o aproximadamente 3% o aproximadamente 2% o aproximadamente 1 % de la proteína de fusión de RAGE está presente como un agregado en la formulación de la proteína de fusión de RAGE.

También, en ciertas modalidades, cuando se reconstituye de conformidad con las instrucciones proporcionadas, la formulación de la proteína de fusión de RAGE reconstituida puede ser apropiada para la administración por varias rutas y como se requiere para el tratamiento del desorden mediado por RAGE de interés. En ciertas modalidades, la formulación de la proteína de fusión de RAGE reconstituida es apropiada por al menos una de administración intravenosa, intraperitoneal o subcutánea de la formulación al sujeto.

En ciertas modalidades de las formulaciones, los artículos de fabricación y los métodos para hacer las formulaciones que comprende una proteína de fusión de RAGE, la concentración de la proteina de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede ser al menos 10 mg/mL o al menos 20 mg/mL o al menos 50 mg/mL. En modalidades alternas, la concentración de la proteina de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede ser al menos 100 mg/mL, o 200 mg/mL o 400 mg/mL. Por ejemplo, en modalidades alternas, la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida es al menos aproximadamente 0.5 a 400 mg/ml o aproximadamente 1 a 200 mg/mL, 40 a 400 mg/mL, 50 a 400 mg/mL, 40 a 100 mg/mL, 50 a 100 mg/mL o aproximadamente 40-50 mg/mL. Por ejemplo en una modalidad, la proteina de fusión de RAGE se administra en una formulación como una solución acuosa estéril que tiene un pH que oscila de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5 y que comprende desde aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL de la proteína de fusión de RAGE de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolares de estabilizador de histidina, de aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente .0 milimolar de dihidrato de EDTA de disodio.

Cualquiera de las modalidades descritas en este documento puede usarse como la proteína de fusión de RAGE en las formulaciones de la presente invención. Además, para cada una de las formulaciones liofilizadas, las formulaciones liofilizadas reconstituidas o los métodos para fabricar las formulaciones liofilizadas o formulaciones liofilizadas reconstituidas o los artículos para la fabricación que comprenden las formulaciones liofilizadas o las formulaciones liofilizadas reconstituidas de la presente invención, la proteína de fusión de RAGE puede comprender una secuencia derivada de un sitio de enlace del ligando de RAGE unido a un polipéptido de inmunoglobulina.

Además, las modalidades de la proteína de fusión de RAGE pueden comprender un polipéptido de RAGE directamente unido a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina como se describe en este documento. En ciertas modalidades, el polipéptido de RAGE puede comprender un conector de interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE tal como el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE se une al aminoácido N-terminal del conector de interdominio y el aminoácido C-terminal del conector de interdominio de RAGE se une directamente al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción del mismo. Por ejemplo, ciertas modalidades de la proteina de fusión pueden comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer conector de interdominio de RAGE unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo conector de interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N-terminal del primer conector interdominio se une al aminoácido C-terminal del primer dominio inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE se une al aminoácido C-terminal del primer conector de interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo conector de interdominio se une al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina RAGE y el aminoácido C-terminal del segundo conector de interdominio de RAGE se une directamente al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2 o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

Por ejemplo, en modalidades alternas de la proteína de fusión de RAGE, el polipéptido de RAGE puede comprender la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:10 o una secuencia al menos 90% idéntica al mismo o la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:47 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. En otras modalidades alternas, la proteína de fusión de RAGE puede comprender la secuencia de aminoácido como se establece en al menos una de SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 o una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la misma. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57 comprende el polipéptido de la SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 ó 57 sin la Usina C-terminal.

Preparación de Formulaciones Liofilizadas En otra modalidad, la presente invención proporciona una formulación pre-liofilizada, una formulación liofilizada, una formulación reconstituida y métodos para preparación de las mismas.

Después de la preparación de una proteína de fusión de RAGE de interés como se describió anteriormente, una "formulación pre-liofilizada" puede producirse. La cantidad de la proteína de fusión de RAGE presente en la formulación pre-liofilizada puede determinarse tomando en cuenta los volúmenes de dosis deseada, el modo de administración, etc. En una modalidad, la cantidad de proteína de fusión en la formulación pre-liofilizada puede ser mayor que 1 mg/mL. También en ciertas modalidades, la cantidad de proteína de fusión en la formulación pre-liofilizada puede ser menor que aproximadamente 5 mg/mL, 10 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL o 200 mg/mL.

En una modalidad adicional, la formulación de pre-liofilizada puede ser una solución pH estabilizada en un pH de aproximadamente 4-8. En otra modalidad, la formulación pre-liofilizada puede ser una solución pH-estabilizada en un pH de aproximadamente 5-7. En otra modalidad, la formulación pre-liofilizada puede ser una solución pH estabilizada en un pH de menos de 6.7. En otra modalidad, la formulación pre-liofilizada puede ser una solución pH estabilizada en un pH de aproximadamente 6.0. Los estabilizadores ejemplarizadores incluyen histidina, fosfato, Tris, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos como se describe en este documento. La concentración de estabilizador puede ser desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM o menos de aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM o menos de aproximadamente 15 mM o de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 15 mM dependiendo, por ejemplo del estabilizador y la isotonicidad deseada de la formulación (es decir, de la formulación reconstituida). En una modalidad, el estabilizador es histidina.

El lioprotectante puede agregarse a la formulación pre-liofilizada. En una modalidad, el lioprotectante comprende un azúcar. En otra modalidad, el lioprotectante comprende un azúcar de no reducción. En otra modalidad, el lioprotectante comprende la sacarosa de azúcar de no reducción. O el azúcar de no reducción puede comprender manitol. O el azúcar de no reducción comprende trahalosa. La cantidad de lioprotectante en la formulación pre-liofilizada generalmente es tal que en la reconstitución, la formulación resultante será isotónica. Sin embargo, una formulación reconstituida hipertónica también puede ser apropiada, por ejemplo en formulaciones para la administración parenteral periférica. Además, la cantidad de lioprotectante no debe ser muy baja de manera que una cantidad no aceptable de degradación y/o agregación de la proteína ocurra en la liofilización. En modalidades alternas, una cantidad no aceptable de agregación puede ser en donde 20% o 10% ó 5% o más de la proteína de fusión de RAGE está presente como un agregado en una formulación. Un rango ejemplarizador de concentración lioprotectante en la formulación pre-liofilizada puede ser menos de . aproximadamente 400 mM. En otra modalidad, el rango de concentración lioprotectante en la formulación pre-liofilizada es menor que aproximadamente 100 mM. En modalidades alternas, el rango de concentración lioprotectante en la formulación pre-liofilizada puede por lo tanto oscilar de aproximadamente 0.5 mM a 400 mM o de aproximadamente 2 mM a 200 mM o de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 60-65 mM. También, en algunas modalidades, el lioprotectante se agrega en una cantidad para producir la formulación reconstituida isotónica.

La proporción de proteína de fusión de RAGE para el lioprotectante en la formulación pre-liofilizada se selecciona para cada combinación de proteína de fusión de RAGE y lioprotectante. En una modalidad de una formulación reconstituida isotónica con una concentración alta de proteína de fusión de RAGE (por ejemplo mayor que o igual a aproximadamente 50 mg/mL), la proporción molar del lioprotectante para la proteína de fusión de RAGE puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 moles de lioprotectante a 1 mol de proteína de fusión de RAGE. En otra modalidad, la proporción molar del lioprotectante para la proteína de fusión de RAGE puede ser de aproximadamente 150 a aproximadamente 1000 moles de lioprotectante para 1 mol de proteína de fusión. En otra modalidad, la proporción molar de lioprotectante para la proteína de fusión de RAGE puede ser de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 moles de lioprotectante a 1 mol de proteína de fusión de RAGE. Por ejemplo, estos rangos pueden ser apropiados en donde el lioprotectante es un azúcar de no reducción, tal como sacarosa, trehalosa o manitol.

En otra modalidad de la invención, un surfactante puede agregarse a la formulación pre-liofilizada. Alternativamente o en adición, el surfactante puede agregarse a la formulación liofilizada y/o formulación reconstituida. Los surfactantes ejemplarizadores incluyen surfactantes isotónicos tales como polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 ó 80) (Tween 20TM o Tween 80 T ); poloxámeros (es decir, poloxámero 188). La cantidad de surfactante agregado es tal que reduce la agregación de la proteína reconstituida y minimiza la formación de partículas después de la reconstitución. Por ejemplo, el surfactante puede estar presente en la formulación pre-liofilizada en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a 0.5%. Por ejemplo, en una modalidad en donde el surfactante comprende polisorbato 80, el surfactante puede estar presente en la formulación pre-liofilizada en una cantidad de aproximadamente 0.005% a 0.05% o aproximadamente 0.008% a 0.012% o en aproximadamente 0.01 %. Alternativamente, el surfactante puede estar presente en la formulación de manera que comprenda una concentración final oscilando de 0.001 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL o aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL.

En ciertas modalidades de la invención, una mezcla de lioprotectante (tal como sacarosa o histidina) y un agente de volumen (por ejemplo, manitol o glicina) pueden usarse en la preparación de la formulación de pre-liofilización. El agente de volumen puede permitirse para la producción de un pastel liofilizado uniforma sin bolsas excesivas en el mismo, etc.

Otros portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ava. Edición, Osol, A. Ed. (1980) puede incluirse en la formulación pre-liofilizada (y/o la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida) proporcionada que no afecta adversamente las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen agentes estabilizantes adicionales, preservativos, co-solventes, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina, agentes de quelación tales como EDTA, complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína Zn); polímeros biodegradables tales como poliésteres y/o contra iones de formación de sal tales como sodio.

Las formulaciones de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención también pueden contener proteínas adicionales como sean necesarias para la indicación particular siendo tratada. Las proteínas adicionales pueden seleccionarse de manera que las proteínas cada una tiene actividades complementarias que no afectan adversamente a la otra o a la proteína de fusión de RAGE. Dichas proteínas están presentes apropiadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito intentado.

Las formulaciones de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención pueden ser estériles para la administración in vivo. Esto puede llevarse a cabo mediante filtración a través de las membranas de filtración, antes de o siguiendo la liofilización y reconstitución.

Después de la proteína de fusión de RAGE, el lioprotectante y otros componentes opcionales se mezclan juntos, la formulación puede liofilizarse. Muchos secadores en congelación diferentes están disponibles para este propósito como secadores en congelación Hull50™ (Hull, EUA) o GT20TM (Leybold-Heraeus, Alemania). El secado por congelación se lleva a cabo mediante congelar la formulación y subsecuentemente sublimitar el hielo del contenido congelado en una temperatura apropiada para el secado primario. Bajo esta condición, la temperatura del producto es debajo del punto eutectico o temperatura de colapso de la formulación. Típicamente, la temperatura autónoma para el secado primario oscilará de aproximadamente -50 a 25°C (proporcionó el producto restante congelado durante el congelamiento primario) en una presión apropiada, oscilando típicamente de aproximadamente 50 a 250 mTour. En una modalidad, la presión es aproximadamente 100 mTorr y la muestra puede liofiiizarse entre aproximadamente -30 y 25°C. La formulación, el tamaño y el tipo del contenedor que contiene la muestra (por ejemplo, ampolleta de cristal) y el volumen del líquido pueden dictar el tiempo requerido para el secado, que puede oscilar de un poco de horas a varios días (por ejemplo 40-60 horas). Las condiciones de secado por congelamiento pueden variar dependiendo de la formulación y el tamaño de ampolleta.

En algunos ejemplos, puede ser deseable para liofilizar la formulación de proteína en el contenedor en que la reconstitución de la proteína se lleva a cabo para evitar una etapa de transferencia. El contenedor en esta etapa puede, por ejemplo ser una ampolleta de 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 ó 250 ce. En una modalidad, el contenedor es cualquier contenedor apropiado para preparar una formulación reconstituida que tiene un volumen de menos de o igual a 100 mL.

Como una proposición general, la liofilización resultará en una formulación liofilizada en que el contenido de humedad del mismo es menor que aproximadamente 5%. En una modalidad, el contenido de humedad de la formulación liofilizada es menor que aproximadamente 3%. En otra modalidad, el contenido de humedad de la formulación liofilizada es menor que aproximadamente 1 %.

Reconstitución de la Formulación Liofilizada En el estado deseado, típicamente cuando es tiempo de administrar la proteina de fusión de RAGE a un paciente o sujeto, la formulación liofilizada puede reconstituirse con un düuyente tal como la concentración de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida es aproximadamente mayor que 10 mg/mL o mayor que 20 mg/mL o mayor que 50 mg/mL. En modalidades alternas, la concentración de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede ser al menos 100 mg/mL o 200 mg/mL o 400 mg/mL. Por ejemplo, en modalidades alternas, la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede estar en el rango de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 600 mg/mL o de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 500 mg/mL o de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL o de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL o de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL o de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL o de aproximadamente 40 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL o de aproximadamente 40 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL o de aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL o de aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL. En otras modalidades, la concentración de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida es desde aproximadamente 40 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL o aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL o aproximadamente 40 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL. Dichas concentraciones de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida se consideran para ser particularmente útiles en donde la administración subcutánea de la formulación reconstituida se intenta. Sin embargo, para otros propósitos de administración, dicha administración intravenosa, las concentraciones más bajas de la proteína en la formulación reconstituida puede ser deseable (por ejemplo de aproximadamente 5-50 mg/mL o de aproximadamente 10-40 mg/mL de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida). Además, en algunas modalidades, la concentración de la proteína de fusión en la formulación reconstituida puede ser la misma o menor que 2 veces la concentración de la proteína de fusión en la formulación pre-liofilizada.

En ciertas modalidades, la concentración de la proteína de fusión en la formulación reconstituida es significativamente mayor que en la formulación pre-liofilizada. Por ejemplo, la concentración de la proteína de fusión en la formulación reconstituida puede en ciertas modalidades, ser aproximadamente 2-40 ó 2-10 ó 3-8 veces que la formulación pre-liofilizada. En una modalidad, la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede ser aproximadamente 3-6 veces que la formulación pre-liofilizada. En otra modalidad, en donde la concentración de la proteina de fusión de RAGE en la formulación pre-liofilizada es aproximadamente 15 mg/mL, la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida es mayor que o igual a aproximadamente 50 mg/mL (por ejemplo al menos tres veces o al menos cuatro veces mayor).

La liberación de una concentración alta de proteína comúnmente es ventajosa o requerida para la administración subcutánea debido a las limitaciones de volumen (menos que o igual a 1 .5 mi) y los requerimientos de dosificación (mayor que o igual a 100 mg). Sin embargo, las concentraciones de proteína (mayores que o iguales a 50 mg/ml) pueden ser difíciles para lograr en el proceso de fabricación dado que en altas concentraciones, una proteína puede tener una tendencia para agregarse durante el procesamiento y llega a ser difícil de manipular (por ejemplo, bomba) y filtro estéril. Alternativamente, el proceso de liofilización puede proporcionar un método para permitir la concentración de una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión de RAGE puede llenarse en ampolletas en un volumen (Vf) y posteriormente liofilizarse. La proteína de fusión de RAGE liofilizada posteriormente se reconstituye con un volumen más pequeño (Vr) de agua o preservativo (por ejemplo, BWFI) que el volumen original (por ejemplo Vr = 0.25 Vf) resultando en una concentración de proteína de fusión de RAGE más alta en la solución reconstituida. Este proceso también resulta en la concentración de los estabilizadores y receptores. Para administración subcutánea, la solución es deseablemente isotónica.

La reconstitución generalmente se lleva a cabo en una temperatura de aproximadamente 25°C para asegurar la hidratación completa, aunque otras temperaturas pueden emplearse como se desee. El tiempo requerido para la reconstitución puede depender, por ejemplo del tipo de diluyente, cantidad de excipiente y proteína. Los diluyentes ejemplarizadores incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución de pH estabilizada (por ejemplo, solución salina estabilizada), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextros. En una modalidad, el diluyente proporciona una formulación reconstituida apropiada para inyección. En otra modalidad, en donde el diluyente proporciona una formulación reconstituida apropiada para inyección. En otra modalidad, en donde el diluyente proporciona una formulación reconstituida apropiada para inyección, el diluyente comprende agua para inyección (WFI). El diluyente opcionalmente contiene un preservativo. La cantidad de preservativo empleado puede determinarse por la valoración de las concentraciones de preservativo diferentes para compatibilidad con la proteína y la prueba de eficacia del preservativo.

En modalidades alternas, la formulación reconstituida puede tener menos de 8,000 o menos de 6,000 o menos de 4,000 o menos de 2,000 o menos de 1 ,000 o menos de 600 o menos de 400 o menos de 200 o menos de 100 o menos de 50 partículas que son iguales o mayores que 10 µ[ ? en tamaño por 50 ml_ del contenedor. En otras modalidades, la formulación reconstituida puede tener menos de 8,000 o menos de 6,000 o menos de 4,000 o menos de 2,000 o menos de 1 ,000 o menos de 600 o menos de 400 o menos de 200 o menos de 100 o menos de 50 partículas que son iguales a o mayores que 25 µ?t? en tamaño por 50 ml_ del contenedor.

Administración de la Formulación Reconstituida La formulación reconstituida puede administrarse a un mamífero en necesidad del tratamiento con la proteína de fusión de RAGE, tal como un humano de conformidad con métodos conocidos tales como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua en un periodo de tiempo, mediante rutas intramusculares, intraperitoneales, intracerobrospinales, subcutáneas, ¡ntra-articular, intrasionovial, intratecal, oral, tópica o inhalación.

En modalidades, la formulación reconstituida puede administrarse al mamífero mediante administración subcutánea (por ejemplo, debajo de la piel). Para dichos propósitos, la formulación reconstituida puede inyectarse usando una jeringa. Sin embargo, otros dispositivos para la administración de la formulación reconstituida están disponibles tal como los dispositivos de inyección (por ejemplo, los dispositivos Inject-ease™ y Genject™); plumas inyectoras (tales como la GenPen™); dispositivos sin agujas (por ejemplo, MediJector™ y BioJector™) y los sistemas de liberación de parches subcutáneos.

La dosis apropiada o la cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión de RAGE dependerá, por ejemplo de la condición a tratarse, la severidad y el curso de la condición, si la proteína de fusión de RAGE se administra para prevenir o para propósitos terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a la proteína de fusión de RAGE y la discreción del médico que atiende. La proteína de fusión de RAGE puede administrarse al sujeto (por ejemplo, paciente) en un tiempo o en una serie de tratamientos o puede administrarse al paciente en cualquier tiempo del diagnóstico avanzado. La proteína de fusión de RAGE puede administrarse como el único tratamiento o junto con otros fármacos o terapias útiles en el tratamiento de la condición en cuestión. En una modalidad, una dosis de aproximadamente 0.1 -20 mg/kg es una dosis candidata inicial para la administración al sujeto, si por ejemplo por una o más administraciones separadas. Como se describió anteriormente, otros regímenes de dosis pueden ser útiles.

Artículos de Fabricación. En otra modalidad de la invención, un articulo de fabricación se proporciona, el cual contiene la formulación liofilizada de la presente invención y proporciona instrucciones para su reconstitución y/o uso. El artículo de fabricación puede comprende un contenedor. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, ampolletas (es decir, las ampolletas de cámara dual), jeringas (tales como las jeringas de cámara dual) y los tubos de prueba. El contenedor puede formarse de una variedad de materiales tales como cristal o plástico. El contendor puede mantener la formulación liofilizada. En ciertas modalidades, puede existir una etiqueta fijada a o asociada con el contenedor. La etiqueta puede indicar instrucciones para la reconstitución y/o uso. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada se reconstituya a las concentraciones de proteína como se describió anteriormente. La etiqueta puede además indicar que la formulación es útil o se intenta para la administración subcutánea.

El contenedor que mantiene la formulación puede ser una ampolleta de uso múltiple, que permite las administraciones repetidas (por ejemplo de 2-6 ó 2-10 ó 2-50 administraciones) de la formulación reconstituida. El artículo de fabricación además puede comprender un segundo contendor que comprende un diluyente apropiado (por ejemplo WFI). En el mezclado del diluyente y la formulación liofilizada, la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida generalmente será al menos 10 mg/mL. En una modalidad, la concentración de la proteína de fusión de RAGE final en la formulación reconstituida es al menos 20 mg/mL. En otra modalidad, la concentración de proteína de fusión de RAGE final en la formulación reconstituida es al menos aproximadamente 50 mg/mL. En modalidades alternas, la concentración de la proteina de fusión de RAGE en la formulación reconstituida puede ser al menos 100 mg/mL o 200 mg/mL o 400 mg/mL. En otras modalidades, la concentración de la proteína de fusión de RAGE final en la formulación reconstituida es entre aproximadamente 1 -400 mg/mL o 1 -200 mg/mL o 10-400 mg/mL o 10-200 mg/mL o 10-100 mg/mL o de 40-400 mg/mL o de 40-200 mg/mL o de 40-100 mg/mL o de 50-400 mg/mL o de 50-200 mg/mL o de 50-100 mg/mL o de 40 mg/mL a 50 mg/mL. El artículo de fabricación además puede incluir otros materiales deseables de un punto de inicio del usuario y comercial, incluyendo otros estabilizadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e inserciones en paquetes con instrucciones para usarlos.

EJEMPLOS Las características y ventajas del concepto inventivo cubierto por la presente invención se ilustran adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1A: Producción de las proteínas de fusión de RAGE Se construyeron dos plásmidos para expresar las proteínas de fusión de RAGE-lgG. Ambos plásmidos se construyeron por la unión de secuencias de ADNc 5' de diferentes longitudes de RAGE humano con la misma secuencia de ADNc 3' de la IgG humana (?1 ). Estas secuencias de expresión (es decir., productos de ligamiento) luego se insertaron en el vector de expresión pcADN3, 1 (Invitrogen, CA). Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la región codificadora de la proteína de fusión de RAGE se muestran en las FIGS. 2 y 3. Para la proteína de fusión de RAGE TTP-4000, la secuencia de ácidos nucleicos de 1 a 753 (destacada en negritas) codifica la secuencia de N-terminal de la proteína de RAGE, mientras que la secuencia de ácidos nucleicos de 754 a 1386 codifica la secuencia de la proteína de la IgG (FIG. 2). Para la TTP-3000, la secuencia de ácidos nucleicos de 1 a 408 (destacada en negritas) codifica la secuencia de la proteína N-terminal de la proteína de RAGE, mientras que la secuencia de ácidos nucleicos de 409 a 1041 codifica la secuencia de la proteína de IgG (FIG. 3).

Para producir las proteínas de fusión de RAGE, los vectores de expresión que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 se transfectan en forma estable a las células CHO. Los transformantes positivos se seleccionaran por la resistencia a neomicina conferida por la clonación plásmida. La alta producción de clones detectada por el análisis de transferencia Western del sobrenadante se expandió y el producto génico se purificó por cromatografía de afinidad por medio de columnas de proteína A. la expresión se optimizó para que las células produjeran TTP-4000 recombinante en niveles de aproximadamente 1 .3 gramos por litro.

Ejemplo 1 B: Producción Alterna de Cuatro Proteínas de Fusión de RAGE de Dominio Se construyó un plásmido para expresar las proteínas de fusión de RAGE-lgG. El plásmido se construyó por la unión de una secuencia de ADNc 5' de RAGE humano con una secuencia de ADNc 3' de la IgG humana Fc(y1 ) sin la región Fe de bisagra . Se usó una PCR para amplificar el ADNc. Además, en el extremo 5', el iniciador de PCR agregó un sitio de restricción Eco Rl de clonación y una secuencia de consenso de iniciación de traducción Kozak. En el extremo 3', el iniciador de PCR se agregó un sitio de restricción Xho I exactamente después del codón terminal. En el extremo 3', el cebador de PCR también incluyó dos cambios de bases silentes que eliminan un sitio de empalme del ARN críptico de la porción inmunoglobulina cercana al codón terminal. El codón que codifica para prolina (residuo 459 basado en la numeración de la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 32) se cambió de CCG al CCC, y el codón que codifica para glicina (residuo 460 basado en la numeración de la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 32) se cambió de GGT a GGG. El fragmento PCR se digirió con Eco Rl y Xho I y luego se insertó en el plásmido retrovector (pCNS-newMCS-WPRE (nuevo ori), disponible en Gala, Inc.) que había sido digerido con Mfe I (para formar un extremo compatible con Eco Rl) y se digirió con Xho I. La porción insertada del plásmido clonado y las uniones de clonación se secuenciaron para asegurar que no se produjeran mutaciones durante la clonación.

Para producir la proteína de fusión de RAGE-lgG, el vector de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 54 se transfectó en forma estable en las células CHO.

La secuencia de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 aislada expresada por las células transfectadas se confirmó por varios estudios de caracterización de la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 56, o ambas SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 56. De este modo, la secuencia de señal codificada por los primeros 23 aminoácidos de la SEQ ID NO: 32 se penetró y el residuo N-terminal fue glutamina (Q) o ácido piroglutámico (pE) o una mezcla de los mismos. Los estudios de caracterización también mostraron sitios de glicosilación en N2 y N288 (basado en la numeración de la SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 56) y se mostró la región CH3 de la proteína de fusión de RAGE puede tener su residuo C-terminal penetrado mediante una modificación pos-tranduccional cuando se expresó en este sistema recombinante.

Ejemplo 1C: Producción Alterna de Tres Proteínas de Fusión de RAGE de dominio Un plásmido puede construirse para expresar tres proteínas de fusión de RAGE-lgG de dominio (es decir, un dominio RAGE y dos dominios IgG) tal como TTP-3000 descrita anteriormente para TTP-4000. El plásmido se construyó mediante unir una secuencia cADN 5' de RAGE humana que codifican 1 -136 aminoácidos de RAGE humana con una secuencia cADN 3' de IgG Fc(y) de humano sin la región de bisagra De. Puede usarse PCR para amplificar el cADN. En el extremo 5', un iniciador PCR puede agregar un sitio de restricción (es decir, un sitio de enzima de restricción Eco Rl como se usa para TTP-4000) para clonación y una secuencia de inicio de traducción de consenso Kozak. En el extremo 3', el iniciador PCR también puede agregar un sitio de restricción (por ejemplo, un sitio de restricción Xho I) justo pasando el codón terminal. Los iniciadores PCR también pueden incluir cambos de base silente como puedan necesitarse para remover cualquier sitio de empalme de ARN críptico, tales como los sitios de empalme de ARN críptico localizados en el extremo 3' del dominio CH2 de inmunoglobulina como se describe en el Ejemplo 1 B. Para remover estos sitios de empalme críptico, el codón que codifica para la prolina 344 de la SEQ ID NO:35 (es decir los residuos 1030-1032 basados en la numeración en la secuencia de ADN en la SEQ ID NO:31 ) puede cambiar de CCG a CCC y el codón que codifica para glicina 345 de la SEQ ID NO:35 (residuos 1033-1035 basados en la numeración en la secuencia de ADN en la SEQ ID NO:31 ) pueden cambiarse de GCT a GGG. El fragmento de PCR entonces puede digerirse con las enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo Eco Rl y Xho I) e insertarse en el plásmido retrovector pCND-newMCS-WPRE (nuevo orí, disponible en Gala, Inc.). El vector puede digerirse con Mfe I para formar un extremo compatible con Eco Rl y también digerirse con Xho I. La porción insertada del plásmido clonado y las uniones de clonación pueden secuenciarse para asegurar que no ocurran mutaciones durante la clonación.

Para producir la proteína de fusión de RAGE-lgG, el vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:55 (es decir, comprendiendo el cambio en la secuencia de ADN para remover los sitios de empalme crípticos) puede transfectarse establemente en las células CHO como se describe en el Ejemplo 1A y 1 B.

La secuencia de la proteína de fusión de RAGE aislada TTP-3000 expresada por las células transfectadas pueden ser SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 ó SEQ ID NO:57 o una combinación de la SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 y/o SEQ ID NO:57. Además, la secuencia de señal codificada por los primeros 22 y/o 23 aminoácidos de la SEQ ID NO:35 pueden penetrarse y el residuo N-terminal puede ser glutamina (Q) o ácido piroglutámico (pE) o una mezcla de los mismos. La glicosilación puede ocurrir en los sitios en N2 y N 174 (basados en la numeración de la SEQ ID NO:37 ó SEQ ID NO:57) y/u otros sitios de glicosilación que pueden estar presentes. La región CH3 de la proteína de fusión de RAGE puede tener su residuo C-terminal penetrado a través de la modificación post-translacional cuando se expresa en este sistema recombinante.

Ejemplo 2: Método para probar la actividad de una proteína de fusión de RAGE-lgG1 A. Prueba de unión in vitro: Los ligandos de RAGE conocidos se recubrieron en la superficie de las placas Maxisorb a una concentración de 5 microgramos por pozo. Las placas se incubaron a 4°C durante toda la noche. Después de la incubación con ligandos, las placas se aspiraron y se agregó un estabilizador bloqueante de BSA 1 % en buffer imidizol 50 mM (pH 7.2) a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas posteriormente se aspiraron y/o lavaron con estabilizador de lavado (imidizol 20 mM, NaCI 150 mM, Tween-20 0.05%, CaCI2 5 mM y MgCI2 5mM, pH 7.2). Se prepararon una solución del TTP-3000 (TT3) a una concentración inicial de 1 .082 mg/ml y una solución de TTP-4000 (TT4) en una concentración inicial de 370 µg/ml. La proteína de fusión de RAGE se agregó diluciones crecientes de la muestra inicial. La proteína de fusión de RAGE se dejó incubar con el ligando inmovilizado y a 37°C durante una hora después de que la placa fuera lavada y se probó para determinar la unión de la proteína de fusión de RAGE. La unión se detectó por la adición de un complejo de inmunodetección que contiene una lgG1 anti-humana de ratón monoclonal diluida a 1 :1 1.000 a una concentración final (FAC) de 21 ng/100 µ?, una IgG anti-ratón de cabra biotinilada diluida a 1 :500, a un FAC de 500 ng/µ? y una fosfatasa alcalina unida a avidina. El complejo se incubó con la proteína de fusión de RAGE inmovilizada durante una hora a temperatura ambiente a la cual se lavó la placa y se agregó el sustrato de la fosfatasa de la alcalina para-nitrofenilfosfato (PNPP). La unión del complejo a la proteína de fusión de RAGE inmovilizada se cuantificó por la medición de la conversión del PNPP para-nitrofenol (PNP) que se midió espectrofotométricamente a 405 nm.

Como se ilustra en la FIG. 7, las proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) y TTP-3000 (TT3) interactúan específicamente con los ligandos de RAGE beta amiloides conocidos (Abeta), S100b (S100) y anfoterina (Ampho). En ausencia del ligando, es decir, un solo recubierto con BSA (BSA o BSA + lavado) no hubo aumento de los niveles de absorbancia atribuibles a la unión no específica del complejo de inmunodetección. Cuando el beta amiloide se usa como ligando marcado puede ser necesario preincubar el beta amiloide antes de la prueba. La preincubación puede permitir que el beta amiloide se autoagregue en forma de hoja plegada, ya que el beta amiloide puede unirse en forma preferencial al RAGE en forma de hoja plegada.

La evidencia adicional de una interacción específica entre las proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 y TTP-3000 con los ligandos de RAGE se ejemplifica en estudios que muestran que un ligando de RAGE puede competir efectivamente con un ligando de RAGE conocido para unirse a las proteínas de fusión de RAGE. En estos estudios, el beta-amiloide (A-beta) se inmovilizó en una placa Maxisorb y se agregó una proteina de fusión de RAGE como se describió anteriormente. Además, se agregó un ligando de RAGE a algunos de los pozos al mismos tiempo que la proteína de fusión de RAGE.

Se encontró que el ligando de RAGE podía bloquear la unión de TTP-4000 (TT4) en aproximadamente 25% a 30% cuando estaba presente la TTP-4000 en 123 pg/ml (dilución 1 :3, FIG. 8). Cuando la solución inicial del TTP-4000 se diluyó con un factor de 10 o 30 (1 : 10 o 1 :30), la unión de la proteína de fusión de RAGE al ligando inmovilizado fue inhibida completamente por el ligando de RAGE. De modo similar, el ligando de RAGE bloqueó la unión del TTP-3000 (TT3) en aproximadamente 50% cuando estaba presente la TP-3000 en 360 g/ml (dilución 1 :3, FIG. 9). Cuando la solución inicial del TTP-3000 se diluyó con un factor de 10 (1 :10), la unión de la proteína de fusión de RAGE al ligando inmovilizado fue inhibida completamente por el ligando de RAGE. De este modo, se determinó que la especificidad de unión de la proteína de fusión de RAGE al ligando de RAGE era dependiente de la dosis. También, como se muestra en las FIGS. 8 y 9, no se detectó esencialmente unión en ausencia de la proteína de fusión de RAGE, es decir, usando solo el complejo de inmunodetección ("Complejo solo").

B. Efecto de las proteínas de fusión de RAGE en pruebas basadas en células Un trabajo previo demostró que las células THP-1 mieloides pueden secretar TNF-a en respuesta a los ligandos de RAGE. En esta prueba, las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FBS 10% empleando un protocolo proporcionado por ATCC. Las células se indujeron para secretar el TNF-a por medio de la estimulación de RAGE con S100b 0, 1 mg/ml en ausencia y presencia de las proteínas de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) (10 pg), RAGEs (10 g) una IgG humana (10 (es decir, como control negativo). La cantidad de TNF-a secretada por las células THP-1 se midió 24 horas después de la adición de las proteínas al cultivo celular usando un equipo de ELISA disponible en el mercado para TNF-a (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados de la FIG. 10 demuestran que las proteínas de fusión de RAGE inhiben la producción de TNF-a inducida por S100b/RAGE en estas células. Como se muestra en la FIG. 10, después de la adición de 10 µg de proteína de fusión de RAGE TTP-3000 o TTP-4000, la inducción del TNF-a por S100b (0,1 mg/ml FAC) se redujo en aproximadamente 45% a 70%, respectivamente. La proteína de fusión TP-4000 puede ser al menos tan efectiva para bloquear la inducción del TNF-a por S 00b como el RAGEs (FIG. 10). La especificidad de inhibición para las secuencias de RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se demuestra por el experimento en que la IgG sola se agregó a las células estimuladas S100b. La adición de IgG y S100b a la prueba muestra los mismos niveles de TNF-a que la S100b sola. La especificidad de inhibición de la inducción de TNF-a por TTP-4000 y TTP-3000 para las secuencias de RAGE de la proteína de fusión de RAGE se muestra en un experimento en que la IgG sola se agregó a las células estimuladas S100b. Se observó que la adición de IgG, es decir, IgG humana sin la secuencia de RAGE (IgG humana Sigma agregada a 10 µg/pozo), y S100b a la prueba muestra los mismos niveles de TNF-a que S 00b sola.

En otra prueba basada en células, la habilidad de TTP-4000 para prevenir al ligando HMGB1 de RAGE de interactuar con RAGE y otros receptores HMGB1 se evaluó. A pesar de que los anticuerpos antí-RAGE que unen a RAGE y previenen la interacción de un ligando de RAGE con RAGE, TTP-4000 puede bloquear la interacción de un ligando de RAGE con RAGE mediante la unión al ligando de RAGE. HMGB1 ha reportado ser un ligando para RAGE y los Receptores como enlace 2 y 4 (Park et al., J Biol Chem., 2004; 279(9)7370-7). Todos los tres de estos receptores (RAGE, receptor 2 como enlace y el receptor 4 como enlace) se expresan en las células ???-1 (Parker, et al., J Immunol., 2004, 172(8):4977-86).

En este experimento, las células THP-1 se estimularon para producir TNF-a por HMGB1 (50 mg/mL) en la presencia o ausencia de TTP4000 o anticuerpos anti-RAGE. Bajo las condiciones usadas en la prueba, el HMGB1 deberá solamente ser solamente el inductor de TNF-a. La cantidad de TNF-a secretada por las células THP-1 se miden 24 horas después de la adición de las proteínas al cultivo celular usando un equipo ELISA comercialmente disponible para TNF-a (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados en la Figura 1 1 demuestran que el anticuerpo anti-RAGE y la proteína de fusión RAGE TTP-4000 bloquean el HMGB1 de interactuar con el RAGE expresado en las células RHP-1 , pero que el TTP-4000 inhibe la producción TNF-a HMGB1 -inducida a una mayor extensión que lo hace el anticuerpo anti-RAGE. Además, los datos indican que el TTP-4000 pueden inhibir la actividad HMGB1 a una mayor extensión que el anticuerpo anti-RAGE mediante inhibir el HMGB1 de interactuar con los receptores 2 y 4 como enlace así como el RAGE presente en las células THP-1 .

Ejemplo 3: Perfil farmacocinético de TTP-4000 Para determinar si la TTP-4000 presentaría un perfil farmacocinético superior en comparación con el RAGEs, a ratas y primates no humanos se les aplicó una inyección intravenosa (IV) de TTP-4000 (5mg/kg) y luego se evaluó el plasma para determinar la presencia de TTP-4000. En estos experimentos, dos mono machos sin exposición previa recibieron una dosis única en bolo IV de TTP-4000 (5mg/ml/kg) en una vena periférica seguida por un flujo salino aproximado de 1 .0 mililitro (mi). Las muestras de sangre (aproximadamente 1 .0 mi) se recogieron en una pre-dosis (es decir, antes de la inyección de la TTP-4000), o a 0.083, 0.25, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 y 336 horas después de la dosis en tubos que contienen heparina de litio. Después de la recolección, los tubos se colocaron en hielo húmedo (máximo 30 minutos) hasta la centrifugación con refrigeración (a 2 a 8°C) a 1500 x g durante 15 minutos. Cada muestra de plasma recogida luego se conservó congelada (-70 °C +10 °C) hasta que se probó para determinar el polipéptido de RAGE usando un ELISA con diferentes puntos de tiempo después de la inyección, como se describe en el Ejemplo 6.

El perfil cinético que se muestra en la FIG. 12 revela que una vez que el TTP-4000 saturó sus ligandos como es evidente por la pendiente relativamente pronunciada de la fase alfa en 2 animales, esta proteína conserva una vida media terminal mayor de 300 horas. Esta vida media es significativamente superior que la vida media de RAGEs humano en plasma (generalmente aproximadamente 2 horas) y proporciona una oportunidad para inyecciones únicas para las indicaciones agudas y semi-crónicas. En la FIG. 12 cada curva representa un animal diferente en las mismas condiciones experimentales.

Ejemplo 4: Activación del Fe de la TTP-4000 Se realizaron experimentos para medir la activación del receptor de Fe por la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 en comparación con la IgG humana. La privación del receptor de Fe se evaluó por la medición de la secreción del TNF-a de las células THP-1 que expresan el receptor de Fe receptor. En estos experimentos, se incubó una placa de 96 pozos con 10 pg/pozo de TTP-4000 o IgG humana. La estimulación del Fe produce la secreción de TNF-a. La cantidad de TNF-a se midió por una prueba de inmunoabsorbancia ligado a enzima (ELISA).

De este modo, en esta prueba, la línea celular mieloide, THP-1 (ATTC # TIB-202) se mantuvo en un medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino 10% de acuerdo con las instrucciones del ATCC. Típicamente, se indujeron 40,000-80,000 células para secretar el TNF-alfa por medio de la estimulación del receptor de Fe por preincubación del pozo con 10 ug/pozo de TTP-4000 o lgG1 humana agregada por calor (63°C durante 30 min). La cantidad de TNF-alfa secretada por las células THP-1 se evaluó en el sobrenadante recogido de los cultivos de 24 horas de las células de los pozos tratados mediante un equipo de ELISA del TNF disponible en el mercado (R&D Systems, Minneapolis, MN # DTAOOC) de acuerdo con las instrucciones. Los resultados se muestran en la FIG. 13 donde se puede observar que la TTP-4000 genera menos 2 ng/pozo de TNF y la IgG generó mas de 40 ng/pozo.

Ejemplo 5: Actividad in vivo de la TTP-4000 La actividad de la TTP-4000 se comparó con el RAGEs en varios modelos in vivo de la enfermedad humana.

A. TTP-4000 en un modelo animal de restenosis La proteína de fusión de RAGE TTP-4000 se evaluó en un modelo de rata diabética de restenosis que incluyó la medición de la proliferación del músculo liso y una íntima expansión de 21 días después de la lesión vascular. En estos experimentos, la lesión por balón de arteria de la carótida común izquierda se realizó en ratas diabéticas y no diabéticas Zucker mediante procedimientos estándares. Se administró una dosis de carga (3mg/rata) de IgG, TTP-4000 o solución salina de fosfato estabilizada (PBS) por vía intraperitoneal (IP) un día antes de la lesión. Se administró una dosis de mantenimiento cada dos días hasta el día después de la lesión (es decir, en el día , 3, 5 y 7 después de la lesión). La dosis de mantenimiento fue alta = 1 mg/animal por grupo, o baja = 0.3 mg/animal para el segundo grupo. Para medir la proliferación de células del músculo liso vascular (VSMC), se sacrificaron los animales en los día 4 y 21 después de la lesión.

Para la medición de la proliferación celular, el día 4 los animales recibieron una inyección intraperitoneal de bromodeoxiuridina (BrDdU) 50 mg/kg a las 18, 12 y 2 horas antes de la eutanasia. Después del sacrificio, se recogieron las arterias de la carótida izquierda y derecha. Las muestras se conservaron en Histochoice durante por lo menos 24 horas antes de la inclusión. La evaluación de la proliferación de VSMC se llevó a cabo mediante anticuerpos anti-BrdU monoclonal de ratón. Se aplicó un segundo anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con fluorescencia. El número de núcleos BrdU positivos por sección fue contado por dos observadores sin conocimiento previo a los esquemas de tratamiento.

Las ratas restantes se sacrificaron a los 21 días para el análisis morfométrico. Los análisis morfométricos fueron realizados por un observador sin conocimiento previo para los grupos de estudio, usando el programa de planimetría digital computarizada microscópica Image-Pro Plus en secciones seriadas, arterias carotídeas (5 mm alejados) teñidas por colorante de Van Gieson. Todos los datos se expresaron como media ± SD. El análisis estadístico se llevó a cabo con el uso del programa de computación SPSS. Las variables continuas se compararon mediante pruebas t no apareadas. Un valor de P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Como se observa en las FIGS. 14 y 14A, el tratamiento TTP-4000 redujo en forma significativa la relación íntima/media y la proliferación celular del muscular liso vascular en forma que responde a la dosis. En la FIG. 14A, los ejes Y representan el número de BrdU que prolifera en las células.

B. TTP4000 en un modelo de animal de AD Los experimentos se realizaron para evaluar si la TTP-4000 podía afectar la formación del amiloide y la disfunción cognitiva en un modelo de ratón de AD. Los experimentos utilizaron ratones transgénicos que expresan la proteína del precursor amiloide mutante Swedish (APP) bajo control del promotor de la cadena PDGF-B. Con el transcurso del tiempo, estos ratones generan altos niveles del ligando de RAGE, beta amiloide (?ß). Previamente, se ha demostrado que el tratamiento con RAGEs durante 3 meses reduce la formación de la placa amiloide en el cerebro y el aumento asociado de los marcadores de inflamación en este modelo.

Los ratones APP (machos) usados en este experimento se diseñaron por la microinyección del gen APP humano (con la mutaciones Swedish y London) en los huevos de ratón bajo el control del promotor del gen de la cadena del factor B de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-B). Los ratones se generaron en un fondo de C57BL/6 y se desarrollaron por Molecular Therapeutics Inc. Los animales se alimentaron ad libitum y se mantuvieron por apareamiento de hermano-hermana. Los ratones generados a partir de esta construcción desarrollan depósitos de amiloide a partir de los 6 meses de edad. Los animales envejecieron durante 6 meses y luego se mantuvieron durante 90 días y se sacrificaron para cuantificar el amiloide.

A los ratones transgénicos APP se les administró un vehículo o TTP4000 cada dos días [qod (i.p.)] durante 90 días a partir de los 6 meses de edad. Al fin del experimento, los animales se sacrificaron y se examinaron para determinar la carga de placa ?ß en el cerebro (es decir, número de placas). Se usó un grupo control de APP de 6 meses para determinar la linea base de los depósitos de amiloide. Además, al final del estudio, los animales se sometieron al análisis de comportamiento (laberinto de agua de Morris). Los investigadores estaban no conocían a los compuestos del estudio. Las muestras se dieron a los ratones a razón de 0.25 ml/ratón/cada dos días. Además, a un grupo de ratones se le dieron 200 ug/día de AGEs de humano. 1. Depósito de beta amiloide Para el examen histológico, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal (IP) de pentobarbital de sodio (50 mg/kg). Los animales se prefunden en forma transcardíaca con solución salina de fosfato estabilizada, (PBS) a 4°C seguida por 4% de paraformaldehído. Se extrajeron los cerebros y se colocaron en 4% de paraformaldehído durante la noche. Los cerebros se procesaron en parafina y se incluyeron. Se obtuvieron diez secciones seriadas de 30-µ?t? de espesor del cerebro. Las secciones se sometieron al anticuerpo primario durante toda la noche a 4°C (anticuerpo del péptido ?ß) con el fin de detectar los depósitos de amiloide del cerebro de los animales transgénicos (Guo et al., J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)). Las secciones se lavaron en solución salina estabilizada Tris (TBS) y se agregó el anticuerpo secundario e incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las secciones se incubaron como se indica en el equipo de Vector ABC Elite kit (Vector Laboratories) y se tiñeron con ácido diaminobenzoico (DAB). Las reacciones se detuvieron en agua y se cubrieron después del tratamiento con xileno. El área amiloide de cada sección se determinó con un sistema de análisis de imágenes asistido por computadora, que consiste en una computadora Power Macintosh equipada con una tarjeta digitalizadora Quick Capture, cámara Hitachi CCD provista de un microscopio Olympus y una base para la cámara. Se usó el programa de computación de análisis de imagen NIH, v. 1.55. Las imágenes se capturaron y se determinó el área total de amiloide para las diez secciones. Un único operador sin conocimientos para las condiciones del tratamiento realizó todas las mediciones. Se realizó la suma de los volúmenes del amiloide de la secciones y se dividió por el número total de secciones para calcular el volumen de amiloide.

Para el análisis cuantitativo, se usó una prueba de inmunoabsorbancia ligada a enzimas (ELISA) para medir los niveles totales de ?ß, ?ß,0(3? y ?ß1 -42 humanos de los cerebros de los ratones transgénicos APP (Biosource International, Camarillo, CA). Los A totai y ?ß^ se extrajeron de los cerebros de ratón con clorhidrato de guanidina y se cuantificaron como esta descrito por el fabricante. Esta prueba extrae el péptido ?ß total del cerebro (tanto soluble como agregado). 2. Función cognitiva La prueba del laberinto del agua de Morris se realizó de la siguiente manera: Todos los ratones se probaron una vez en la prueba del laberinto del agua al final del experimento. Los ratones se entrenaron en un laberinto de agua de campo abierto de 1.2 m. La pileta se llenó con una profundidad de 30 cm de agua y se mantuvo a 25°C. La plataforma de escape (10 cm cuadrados) se colocó 1 cm por debajo de la superficie del agua. Durante las pruebas, la plataforma se retiró de la pileta. La prueba de entrada se realizó en la pileta rodeada con cortinas blancas para ocultar cualquiera de las entradas extra-laberinto. Todos los animales experimentaron el pre-entrenamiento no espacial (NSP) durante tres días consecutivos. Estas pruebas son para preparar a los animales para la prueba de comportamiento final para determinar la retención de la memoria para encontrar la plataforma. Estas pruebas no se registraron sino que fueron solo con el propósito de entrenamiento. Para los estudios de aprendizaje y entrenamiento, se retiraron las cortinas a las entradas extra laberinto (esto permitió la identificación de lo animales con discapacidades para nadar). En el día 1 , los ratones se colocaron en una plataforma oculta durante 20 segundos (prueba 1 ), para las pruebas se liberaron 2-3 animales en el agua a una distancia de 10 cm de la plataforma de entrada o plataforma oculta (4 pruebas) y se les dejó nadar en la plataforma. En el segundo día de las pruebas, la plataforma oculta se movió al azar entre el centro de la pileta o el centro de cada cuadrante. Los animales se liberaron en la pileta, orientados aleatoriamente a la pared y se dejaron 60 segundos para alcanzar la plataforma (3 pruebas). En la tercera prueba, a los animales se les aplicaron tres pruebas, dos con la plataforma oculta y una con una plataforma de entrada. Dos días después del NSP, los animales se sometieron a pruebas finales de comportamiento (prueba del laberinto de agua de Morris). Para estas pruebas (3 por animal), la plataforma se colocó en el centro de un cuadrante de la pileta y los animales se liberaron orientados a la pared en forma aleatoria. Se dejó que los animales encontraran la plataforma o nadaran durante 60 segundos (periodo de latencia, el tiempo que se lleva encontrar la plataforma).Todos los animales se probaron dentro de las 4-6 horas de la dosificación y se seleccionaron al azar para ser examinados por un operador sin conocimientos para los grupos de prueba.

Los resultados se expresan como la media ± desviaciones estándares (SD). La significación de las diferencias de los estudios de amiloide y de comportamiento se analizó mediante una prueba t. Las comparaciones se realizaron entre el grupo control APP de 6 meses y los animales tratados con TTP-4000, además de, el grupo tratado con vehículo APP de 9 meses y los animales tratados con TTP-4000. Las diferencias por debajo de 0,05 se consideraron significativas. Los por cientos de cambio de amiloide y comportamiento se determinaron por la suma de los datos de cada grupo divididos por la comparación (es decir, 1 , i. p. /control 6 meses = % de cambio).

Las FIGS. 15 y 15A muestran que los ratones tratados durante 3 meses con TTP-4000 o RAGEs de ratón presentaron pocas placas ?ß y menor disfunción cognitiva que los animales tratados con lgG1 (lgG1 ) humana control negativo y vehículo. Estos datos indican que TTP-4000 es efectiva para reducir la patología del AD en un modelo de ratón transgénico. También se encontró que al igual que RAGEs, la TTP-4000 puede reducir las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF-a (datos no mostrados).

C. Eficacia de la TTP-4000 en un modelo animal de accidente cerebrovascular La TTP-4000 también se comparó con RAGEs en un modelo animal de enfermedad relevante del accidente cerebrovascular. En este modelo, la arteria media de la carótida de un ratón se ligó durante 1 hora seguida por 23 horas de repercusión hasta el punto que los ratones se sacrificaron y se evaluó el área del infarto en el cerebro. Los ratones se trataron con RAGEs o TTP-4000 o inmunoglobulina control exactamente antes de la reperfusión.

En estos experimentos, los machos C57BL/6 se inyectaron con vehículo a razón de 250 µ?/ratón o artículos de la prueba TTP (TTP-3000, TTP-4000 a razón de 250 µ l/ratón). Los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal, 1 hora después de iniciación de la isquemia. Los ratones se sometieron a una hora de isquemia cerebral seguida por 24 horas de reperfusión. Para inducir la isquemia, cada ratón se anestesió y la temperatura corporal se mantuvo a 36-37°C por calentamiento externo. La arteria de la carótida común izquierda (CCA) se expuso mediante una incisión de la línea media del cuello. Se colocó una pinza micro quirúrgica alrededor del origen de la arteria de la carótida interna (ICA). El extremo distal de la ECA se ligó con hilo de seda y se transectó. Un hilo de seda 6-0 se ató sin apretar alrededor del cierre de la ECA. La punta pulida a fuego de una sutura de nylon se insertó suavemente en el cierre de la ECA. El lazo de hilo de seda 6-0 se ajustó alrededor del cierre y la sutura de nylon se introdujo a través de la arteria de la carótida interna (ICA), hasta se apoyó en la arteria cerebral anterior, de este modo se ocluye la comunicación de las arterias antenor y media cerebrales. Después de que la sutura de nylon se colocó en el lugar durante 1 hora, el animal se re-anestesió, se registró la temperatura rectal y se retiró la sutura y se cerró la incisión.

El volumen del infarto se determinó anestesiando al animal con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) y luego se extrajeron lo cerebros. Luego los cerebros se seccionaron en cuatro Secciones de 2 mm a través de la región infartada y se colocaron en cloruro de trifeniltetrazolio 2% (TTC) durante 30 minutos. Después, las secciones se colocaron en paraformaldehido 4% durante la noche. El área de infarto de cada sección se determinó con un sistema de análisis de imágenes asistido por computadora, que consiste en una computadora Power Macintosh equipada con una tarjeta digitalizadora Quick Capture, cámara Hitachi CCD provista de una base para la cámara. Se usó el programa de computación de análisis de imagen NIH, v. 1 .55. Las imágenes se capturaron y se determinó el área total del infarto para las diez secciones. Un único operador sin conocimientos para las condiciones del tratamiento realizó todas las mediciones. Se realizó la suma de los volúmenes del infarto de las secciones y se calculó el volumen total del infarto. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (SD). La significación de la diferencia de los datos del volumen del infarto se analizó mediante una prueba t.

Tal como ilustran los datos de la Tabla 2, la TTP-4000 fue más eficaz que el RAGEs para limitar el área de infarto en estos animales, lo que sugiere que la TTP-4000, debido a su vida media mejor en plasma, pudo mantener una protección superior en estos ratones.

Ejemplo 6: Detección de la proteína de fusión de RAGE por ELISA Inicialmente, 50 ul del anticuerpo 1 HB101 1 monoclonal específico de RAGE a una concentración de 10 ug/ml en 1 X PBS pH 7.3 se coloca en placas por medio de la incubación durante toda la noche. Cuando estén listas para usarse, las placas se lavan tres veces con 300 ul de estabilizador de lavado imidazol 1X-Tween y se bloquearon con BSA 1 %. Las muestras (diluidas) y las diluciones estándares de diluciones de TTP-4000 conocidas se agregan a razón de 100 ul de volumen final. Las muestras se dejan incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, las placas se lavan tres veces. Se agrega un conjugado AP lgG1 1 antihumana de cabra (Sigma A3312) en 1 XPBS con 1 % de BSA y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan tres veces. El color se aclaró con paranitrofenilfosfato.

Ejemplo 7: Cuantificación de la unión de ligando de RAGE a una proteína de fusión de RAGE La Figura 16 muestra las curvas de unión-saturación con TTP-4000 a varios ligandos de RAGE conocidos inmovilizados. Los ligandos se inmovilizan en una placa de microtitulación y se incuban en presencia de concentraciones crecientes de la proteína de fusión de RAGE de 0 a 360 nM. Las interacciones de la proteína de fusión de RAGE-ligando se detectan usando un anticuerpo policlonal conjugado con fosfatasa alcalina que es específico para la porción IgG de la quimera de fusión. Se calcularon las Kd relativas mediante un programa de computación Graphpad Prizm y se aparean con los valores de la bibliografía establecidos de los valores de RAGE-ligando de RAGE. HMG1 B = Anfoterina, CML= Carboximetil lisina, A beta = Amiloide beta 1 -40.

Ejemplo 8: Uso de la proteína de fusión de RAGE para prevenir el rechazo del trasplante alogeneico Se puede esperar que el bloqueo de RAGE bloquee el rechazo del trasplante alogeneico. Estos experimentos exploran si el bloqueo de las interacciones del ligando-RAGE usando una proteína de fusión de RAGE de la invención atenuaría el rechazo de las células del islote que han sido trasplantadas de un donante sano en un animal diabético medido por la duración de tiempo que los animales trasplantados mantienen un nivel de glucosa por debajo de la concentración a lograr. Como se describe en este documento, se encontró que la administración de una proteína de fusión de RAGE (por ej., TTP-4000) a los animales diabéticos que recibieron trasplantes de las células del islote retrasaron significativamente la recurrencia de la hiperglucemia y de este modo el rechazo de las células del islote trasplantadas en dos modelos animales de trasplante (alogeneico y singeneico).

A. Trasplante del islote alogeneico en ratones El primer juego de experimentos probados si se administra una proteína de fusión de RAGE (TTP-4000) modularía el rechazo de las células del islote trasplantadas alogeneicas y la recurrencia de diabetes en modelo de ratón C57BL/6J (B6) de diabetes.

Modelo animal de diabetes Los ratones C57BL/6J (6-8 semanas) (B6) se convirtieron en diabéticos por una inyección intravenosa única de estreptozotocina (STZ) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a razón de 200 mg/kg. Los ratones BALB/cJ (6-8 semanas) (BALB) actuaron como donantes para el trasplante de islote, de esta manera se proporciona un alo-apareamiento erróneo para los trasplantes de islotes.

Aislamiento de islote Los ratones (BALB/c) se anestesiaron con una solución de ketamina HCI/xilazina HCI (Sigma, St. Louis MO). Después de la inyección intraductal de 3 mi de solución de sal equilibrada de Hank fría (HBSS, Gibco, Grand Island NY) que contiene 1 .5 mg/ml de colagenasa P (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ), se obtuvieron en forma quirúrgica los páncreas y se digirieron a 37°C durante 20 minutos. Los islotes se lavaron con HBSS y se purificaron por una centrifugación con gradiente discontinuo mediante Polisacarosa 400 (Cellgro, Herndon VA) que tiene cuatro densidades diferentes (26%, 23%, 20% y 1 1 %). Se recogieron los fragmentos de tejido de la interfase de las capas de 20% y 23%, se lavaron y resuspendieron en HBSS. Los islotes individuales, libres de tejidos acinar, vascular y ductal unidos se colocan cuidadosamente en un microscopio invertido, que produce islotes altamente purificados para trasplante.

Trasplante de islote Los ratones diabéticos C57BL/6 (B6) inducidos por estreptozotocina recibieron injertos de islotes dentro de los 2 días del diagnóstico de diabetes. Los ratones BALB/cJ (6-8 semanas) (BALB) actuaron como donantes para trasplantes de islotes alogeneicos. Para el trasplante, se seleccionaron 500-600 islotes recién aislados (es decir, aproximadamente 550 islotes equivalentes) del ratón donante con una infusión y se trasplantaron en el espacio subcapular del riñón derecho de un recipiente.

Tratamiento con compuestos de prueba Los compuestos de ensayo se administraron tan pronto como se trasplantaron los islotes; la administración continuó durante aproximadamente 60 días, dependiendo de cómo el animal controlado se estaba alimentando. Los ratones se inyectaron con 0.25 mi de solución salina estabilizada con fosfato (PBS), TTP-4000 en PBS, o IgG en PBS de acuerdo con el siguiente esquema (Tabla 3).

Tabla 3 Administración de los compuestos de prueba y/o vehículo Control de la función del injerto del islote La función del injerto de islote se controló por mediciones de glucemia sanguínea seriales diariamente durante las primeras 2 semanas después del trasplante del islote, seguido por cada dos días desde aquí en adelante. La reversión de la diabetes se definió como un nivel de glucosa sanguíneo menor de 200 mg/dl en dos mediciones consecutivas. La pérdida del injerto se determinó cuando la glucemia excedió los 250 mg/dl en dos mediciones consecutivas. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Efectos de la TTP-4000 en trasplante de aloinjerto de islote* * Los valores en la Tabla 4 reflejan el día de la pérdida del injerto para cada animal, definida por la recurrencia de los niveles de glucemia aumentados.

Los efectos de la administración de la TTP-4000 en el rechazo del aloinjerto para los islotes BALB/c de los ratones B6 se muestran en el gráfico de supervivencia acumulativa de Kaplan-Meier de la FIG. 17. Se puede observar que hay un aumento del tiempo antes de la detección de la falla del injerto en animales tratados con TTP-4000 (Grupos 1 y 3) en contraste con los animales que no tienen ningún tratamiento (Control) o animales tratados con el vehículo (PBS) o (lgG1 humana). Usando una variedad de análisis estadísticos (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; y Harrlngton-Fleming) las diferencias entre el Control y TTP-4000 (Grupos 1 y 3) fueron significativos (Tabla 5).

Tabla 5 *Grados de libertad B. Trasplante de islote en ratones NOD como un modelo de enfermedad autoinmune El segundo conjunto de experimentos para determinar si la administración de la proteína de fusión de RAGE (es decir, TTP-4000 o TTP-3000) podría modular el curso de la diabetes recurrente en ratones NOD, mediante un modelo de trasplante singeneico NOD.

Modelo animal de diabetes Los ratones diabéticos no obesos autoinmune espontáneos (NOD/LtJ) (12-25 semanas) actuaron como recipientes para las células del islote, mientras que los ratones NOD/LtJ jóvenes pre-diabéticos (6-7 semanas) actuaron como donantes en trasplante de islote singeneico. Los islotes para el trasplante se aislaron como se describió anteriormente en la Sección A (trasplante de islote alogeneico).

Trasplante de islote: Los ratones diabéticos NOD/LtJ recibieron injertos de islote dentro de los 2 días del diagnóstico de diabetes. Se seleccionaron 500-600 islotes recién aislados (aproximadamente 550 equivalentes de islote) del ratón donante con una infusión y se trasplantaron en el espacio subcapular del riñon derecho.

Tratamiento con compuestos de prueba Los compuestos de prueba se administraron tan pronto como se trasplantaron los islotes; la administración continuó durante aproximadamente 8 semanas. Los ratones se inyectaron con 0.25 mi de PBS, TTP-4000 en PBS, o TTP-3000 en PBS de acuerdo con el siguiente esquema (Tabla 6).

Tabla 6 Control de la función del injerto de islote La función del injerto se controló por mediciones de glucemia sanguínea seriadas diarias durante las primeras 2 semanas después del trasplante del islote, seguido por cada dos días desde allí en adelante. La reversión de la diabetes se definió como un nivel de glucosa sanguíneo menor de 200 mg/dl en dos mediciones consecutivas. El porcentaje de la pérdida del injerto se determinó cuando la glucemia excedió los 250 mg/dl en dos mediciones consecutivas. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 Efectos de TTP-4000 y TTP-3000 sobre la diabetes recurrente en trasplantes de islotes singeneicos en ratones NOD* * Los valores reflejan el día de la pérdida del injerto para cada animal, definida por la recurrencia de los niveles de glucemia aumentados.

Lo efectos de la administración de TTP-4000 sobre el rechazo de islotes trasplantados singeneicos en ratones diabéticos NOD se muestran en el gráfico de supervivencia acumulativa de Kaplan-Meier de la FIG. 18. Como se muestra en los datos de la Tabla 7, hubo un aumento del tiempo antes de la detección de la falla del injerto para los animales tratados con TTP-4000 (Grupo 1 ) y TTP-3000 (Grupo 2) en contraste con los animales que no tienen ningún tratamiento (Control). La FIG 22 muestra el aumento del tiempo antes de la detección de la falla del injerto para animales tratados con TTP-4000 (Grupo 1 ) y los animales que no tienen ningún tratamiento. Usando una variedad de análisis estadísticos (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; y Harrington-Fleming) las diferencias entre el Control y TTP-4000 (Grupo 1 ) y el Control y TTP-3000 (Grupo 2) fueron significativas (Tabla 8).

Tabla 8 *Grados de libertad Ejemplo 9 - Formulación liofilizada de proteína de fusión de RAGE En el desarrollo de una formulación liofilizada usando la proteina de fusión de RAGE TTP- 4000, los lioprotectantes y los estabilizantes se analizaron inicialmente mediante medir la estabilidad de la proteína después de la liofilización y reconstitución. La proteína liofilizada en cada formulación también se sometió a estudios de estabilidad acelerada para determina la estabilidad potencial de la proteína en su vida autónoma.

En los estudios de análisis inicial, los experimentos se designaron para evaluar las condiciones de formulación que podrían proporcionar la solubilidad apropiada y estabilidad de TTP-4000 formulada como un volumen congelado y proporcionar las formulaciones reconstituidas que tienen concentraciones de proteína de fusión de RAGE en aproximadamente 50 mg/mL o mayores. Las formulaciones que contienen acetato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio, succinato de sodio, histidina y cloruro de sodio se probaron junto con sacarosa y manitol. Varios pHs entre 5.5 y 7.0 también se evaluaron.

La estabilidad química y biofísica de TTP-4000 se evaluó usando la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), SDS-Page, Espectroscopia Infrarroja de Transformación Fourier (FTIR), dicroismo circular (CD), mapeo de péptido y absorbencia ultravioleta visible (UV-Vis).

Con base en la solubilidad de la proteína de fusión de RAGE en las formulaciones que contienen uno o más de citrato de sodio, histidina, sacarosa, manitol y Tween 80 en un pH de 7.0 o menor, las formulaciones que contienen uno o más de estos estabilizadores, lioprotectante o surfactante se seleccionaron para estudio adicional.

Ejemplo 10 - Formulación liofilizada de proteína de fusión de RAGE ' Con base en la información en el Ejemplo 9, las formulaciones adicionales de TTP-4000 se estudiaron. Los estudios se enfocaron en identificar los estabilizadores y/o lioprotectantes útiles para mantener un producto estable a través del proceso de secado por congelamiento y potencialmente lograr una concentración alta de TTP-4000 en la reconstitución (es decir, en aproximadamente o arriba de 50 mg/mL).. Seis formulaciones se estudiaron durante un estudio de estabilidad acelerada de 2 semanas. Las formulaciones se resumen en la Tabla 9. Los estudios también se enfocaron en el desarrollo de un ciclo de secado por congelamiento para dosis más grandes de TTP-4000 (250 mg) como se describe posteriormente.

Siguiendo el secado por congelación, las ampolletas de muestra del desarrollo de la formulación se cortaron y colocaron en una cámara de 40°C por 2 semanas. Las muestras de desarrollo aumentado se almacenaron en 2-8°C hasta que se realizó la prueba.

Métodos de Análisis de Muestra: La concentración de TTP-4000 en muestras se midió por espectrometría UV-Vis. Un agüente UV-Vis se usó para obtener el espectro de proteína así como el espectro blanco del estabilizador. Una vez adquiridos, los valores de absorbencia e corrigieron para cualquier difusión ligera que ocurre como un resultado de cualquier agregación de proteína.

La humedad residual se analizó usando un método de titulación Karl Fischer. Las muestras de desarrollo de formulación secada en congelamiento se reconstituyeron con la cantidad apropiada de WFI. El tiempo para la reconstitución se consideró ser el tiempo de cuando el agua se agregó al tiempo cuando no hubo sólidos visibles. El pH de cada muestra se midió después de la reconstitución usando una sonda semi-micro apropiadamente calibrada.

La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) se realizó usando una columna Super SW2000 TSKgel para analizar o monitorear la estabilidad física (degradación y formulación de agregado soluble) de TTP-4000 durante el secado por congelamiento y almacenaje en condiciones de aceleración. Las muestras se inyectaron en un agüente 1 100 series LC adecuadas con dos columnas Super SW2000 TSKgel, 4.6 x 300 mm, 4 µ?? (Tosoh Bioscience, 8674).

Para medir el conteo de partículas, una muestra de 1 mL se diluyó 20 veces en 20 mL. La muestra se desgasificó por sonicación por aproximadamente 30 segundos y suavemente se agitó mediante agitación a mano sin introducir burbujas. Tres alícuotas, cada una de 5 mL de volumen, se observaron en el sensor de conteo de oscurecimiento de luz. Con el equipo del instrumento para el modo cumulativo, las partículas se colectaron en los establecimientos de más de o igual a 10 µ?? y mayor o igual a 25 µ??.

Resultados: Con base en los estudios de preformulación en el Ejemplo 9, dos estabilizadores se investigaron inicialmente: citrato de sodio y L-histidina. Las formulaciones concentradas 1 -6 (Tabla 9) se prepararon usando concentradores centrífugas. La concentración de proteína final en las formulaciones 1 -6 en la Tabla 9 estuvo en un rango entre aproximadamente 4-15 mg/ml.

Tabla 9. Formulaciones de TTP-4000 Usando las formulaciones 1 -6 en la Tabla 9, las ampolletas (2 ml_) se usaron con 0.7 mide volúmenes de relleno. El espacio en la cabeza de la ampolleta se llenó con aire. Antes del secado, las muestras se congelaron en una temperatura autónoma de entre -50°C a -20°C por aproximadamente 12 horas. Las muestras se secaron en una presión reducida de 100 mTorr y una temperatura autónoma de entre -20°C y -10°C por aproximadamente 36 horas, seguido por una temperatura autónoma de 20°C por aproximadamente 12 horas. Siguiendo el secado por congelamiento, las ampolletas se detuvieron y las partes superiores se cortaron. Los pasteles acumulados se produjeron de cada formulación 1 -6.

Los productos secos por congelamiento se sometieron a estudio de estabilidad acelerada para accesar a la estabilidad química de las formulaciones. Los productos secos por congelamiento se colocaron en almacenaje a 40°C y 75% de humedad relativa por 2 semanas.

Los productos secos por congelamiento se reconstituyeron con 0.206 mL de WFI. Todos los productos secos por congelamiento se reconstituyeron dentro de 20 segundos o menos. El pH consistente restante en todas las formulaciones reconstituidas a través del todo el periodo de almacenaje de 2 semanas. Los valores de humedad residuales determinados en los tiempos 0 y 2 semanas para los productos secos por congelamiento fueron entre 3.0% y 0.8% y mostraron que el ciclo de secado por congelamiento fue capaz de secar suficientemente las formulaciones pre-liofilizadas. La osmolaridad de todas las formulaciones reconstituidas estuvo dentro de un rango isotónico deseable entre 250 mOsm/kg y 400 mOsm/kg (Ver la Tabla 10). La viscosidad de cada formulación reconstituida fue debajo de 3.7 cP (centipoise).

Tabla 10. Formulaciones Reconstituidas de TTP-4000 y osmolaridad El análisis SEC se realizó en muestras de la formulación 5 en la Tabla 10 tomados en varias etapas del proceso de secado por congelamiento e indicó que en estas formulaciones, TTP-400 no fue particularmente sensible a ninguna de las etapas del proceso de secado por congelamiento basado en los niveles bajos consistentes de las especies de rompimiento y agregado.

El análisis SEC también se realizó en las formulaciones pre-liofilizadas antes del secado por congelamiento así como las formulaciones reconstituidas en el tiempo cero y después de un estudio de estabilidad acelerada de 2 semanas. La cantidad de impurezas (producto de rompimiento o agregado) fue consistentemente bajo (es decir, debajo de 4%) (Tabla 1 1 ).

Tabla 1 1 . Formulaciones Reconstituidas de TTP-4000 y % de proteína intacta El mapeo de péptidos no reveló oxidación o deaminación de TTP-4000 debido al secado por congelamiento y almacenaje bajo condiciones aceleradas.

La SDS-PAGE se corrió en formulaciones 1 , 3, 4 y 6 y mostró que el TTP-4000 mantuvo estabilidad física a través del proceso de almacenaje y secado en frío en estas formulaciones.

Para aumentar el proceso de secado en frío para usarse con ampolletas de 50 mL lyo y una dosis de 250 mg de TTP-4000, las muestras se prepararon mediante concentrar la solución a 15 mg/mL de TTP-4000 usando ultrafiltración y posteriormente diafiltrar la solución en contra de 10 mM de histidina y 65 mM de sacarosa en pH 6.0. Tween 80 se agregó a una cantidad final de 0.01 % (vol/vol).

La formulación pre-liofilizada (16.67 mL) se agregó a cada ampolleta de 50 mL Las muestras se expusieron a un ciclo de secado en seco en donde las muestras se enfriaron en una temperatura autónoma de entre 5° C y -5°C por 30 minutos, seguido por el enfriamiento en una temperatura autónoma de -50°C por aproximadamente 3 horas. Las muestras se secaron en una presión reducida de 100 mTorr y una temperatura autónoma de entre -20 °C y -10°C por aproximadamente 34 horas, seguido por una temperatura autónoma de entre 5°C y 20°C por aproximadamente 1 1 horas. Siguiendo el secado en frío, las ampolletas se detuvieron y las partes superiores se cortaron. Un pastel blanco farmacéuticamente elegante se produjo. El pastel parecía rugoso y no perdió su estructura durante el manejo y almacenaje.

La concentración de la muestra reconstituida como se determinó por la absorbencia en 280 nm fue 40.5 mg/mL de TTP-4000. En los estudios adicionales bajo condiciones similares, la concentración de TTP-4000 en la muestra reconstituida fue consistentemente aproximadamente 50 mg/mL.

La muestra reconstituida se midió para el contenido particulado en 0, 2 y 6 horas de almacenaje a temperatura ambiente. Los resultados en la Tabla 12 mostraron que la muestra reconstituida tuvo una cantidad baja de contenido particulado.

Tabla 12 Número de partículas detectadas en la muestra reconstituida durante el almacenaje En resumen, TTP-4000 se formuló en estabilizadores de citrato e histidina conteniendo uno o más de sacarosa, manitol y Tween 80. La prueba mostró que las formulaciones conteniendo citrato de sodio o histidina tuvieron características similares y que TTP-4000 puede ser más soluble en formulaciones que contienen histidina.

Las formulaciones que contienen histidina se enfocan en los estudios de aumento adicional. Siguiendo un ciclo de secado en frío, la estabilidad química y física de TTP-4000 se evaluó y no se detectaron diferencias significantes entre las formulaciones de histidina. También, el manitol fue eliminado de la formulación. La formulación final probada del estudio de desarrollo de la formulación contuvo 10 mM de histidina, 60 mM de sacarosa y 0.01 % de Tween 80 en aproximadamente un pH de 6.0. Esta formulación demostró una habilidad superior para conservar TTP-4000 estable durante el secado por congelamiento y almacenaje y también proporcionó la concentración más alta de TTP-4000 durante el estudio. En el estudio de aumento, el nivel de sacarosa se elevó a 65 mM para ajustar la osmolaridad de la formulación más cercada a la isotonicidad. Durante el estudio de escalamiento, también se encontró que mantener el pH de la formulación pre-liofilizada TTP-4000 y la formulación reconstituida en o cerca de un pH 6.0 y menos de 6.7 fue un pH útil para reducir la precipitación o agregación de proteína.

Lo precedente es considerado como ilustrativo solamente de lo principal de la invención. Dichas modificaciones y cambios numerosos ocurrirán rápidamente para aquellos expertos en la técnica, no se intenta que limiten la invención a las modalidades exactas mostradas y descritas y todas las modificaciones apropiadas y equivalentes que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas se consideran dentro del concepto de la presente inventiva.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Una formulación que comprende una mezcla liofilizada de un lioprotectante de azúcar de no reducción, una proteína de fusión de RAGE y un estabilizador, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende un polipéptido de RAGE unido directamente a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina y en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de enlace de ligando de RAGE.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde: (a) la proteína de fusión de RAGE comprende un conector interdominio derivado de RAGE más que de un polipéptido de bisagra de interdominio derivado de una inmunoglobulina o (b) la proteína de fusión de RAGE comprende (i) un conector de interdominio de RAGE que separa los dominios V y C1 de RAGE, o (ii) un conector que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en lugar de la región de bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina o (c) la proteína de fusión de RAGE es obtenible mediante la remoción de la región de bisagra Fe de la inmunoglobulina y reemplazándola con el polipéptido de RAGE.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la proteína de fusión de RAGE se codifica por una molécula de ADN que comprende la secuencia como se establece en SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:54 ó SEQ ID NO:55.

4. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la formulación además comprende al menos un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el azúcar de no reducción comprende al menos uno de sacarosa, manitol o trehalosa.

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el estabilizante comprende histidina.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de enlace de ligando de RAGE que comprende la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma o una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:47 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácido como se establece en al menos uno de SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

9. La formulación de conformidad con la reivindicación 8, en donde la secuencia al menos 90% idéntica a cada una de las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57, es la secuencia de aminoácido como se establece en las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 respectivamente sin la lisina C-terminal.

10. Una formulación reconstituida que comprende una proteína de fusión de RAGE liofilizada reconstituida en un diluyente en donde la concentración de proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está dentro del rango de 1 mg/mL a 400 mg/mL, en donde la proteína de fusión de RAGE liofilizada comprende un lioprotectante de azúcar de no reducción, la proteína de fusión de RAGE y un estabilizador y en donde la proteína de fusión de RAGE comprende un polipéptido de RAGE directamente unido a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina y en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de enlace de ligando de RAGE.

11 . La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida es de 40 mg/mL a 100 mg/mL.

12. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde: (a) la proteína de fusión de RAGE comprende un conector interdominio derivado de RAGE más que de un polipéptido de bisagra de interdominio derivado de una inmunoglobulina; o (b) la proteína de fusión de RAGE comprende (i) un conector interdominio de RAGE que separa los dominios V y C1 o (i¡) un conector que separa los dominios C1 y C2 de RAGE en lugar de la región de bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina o (c) la proteína de fusión de RAGE es obtenible mediante remover la región de bisagra de RAGE de la inmunoglobulina y reemplazándola con el polipéptido de RAGE.

13. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la proteína de fusión de RAGE es codificable por una molécula de ADN que comprende la secuencia como se establece en la SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:54 ó la SEQ ID NO:55.

14. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de enlace de ligando de RAGE que comprende una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:10 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma, o la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:47 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

15. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácido como se establece en al menos una de las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 ó una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

16. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 15, en donde la secuencia al menos 90% idéntica a cada una de las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 es la secuencia de aminoácido como se establece en las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36,37, 56 ó 57 respectivamente sin la lisina C-terminal.

17. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la formulación comprende 1/400 mg/mL de proteína de fusión de RAGE comprendiendo la secuencia como se establece en las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma; 1 m a 100 mM de estabilizador de histidina; 60 mM a 65 mM de sacarosa, 0.001 % a 0.05% de Tween 80 y un pH de 6.0 a 6.5.

18. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la formulación exhibe menos de 5% de descomposición después de 1 semana a 40 grados centígrados.

19. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde menos del 10% de proteína de fusión de RAGE está presente como un agregado en la formulación en la reconstitución.

20. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde el azúcar de no reducción comprende al menos una de sacarosa, manitol o trehalosa.

21 . La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la formulación liofilizada de la proteína de fusión de RAGE además comprende al menos uno de un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen.

22. La formulación reconstituida de conformidad con la reivindicación 10, en donde la formulación reconstituida es apropiada para la administración subcutánea o intramuscular.

23. Un artículo de fabricación que comprende un contenedor que sujeta la formulación liofilizada de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 9 e instrucciones para reconstituir la formulación liofilizada con un diluyente de manera que la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está dentro del rango de 1 mg/mL a 400 mg/mL. 5 24. El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 23, en donde la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida es de 40 mg/mL a 100 mg/mL.

10.

25. El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 23, que además comprende un segundo contenedor que sostiene un diluyente para la reconstitución de la formulación liofilizada.

26. Un método para preparar una formulación reconstituida estable de una proteína de 15 fusión de RAGE que comprende reconstituir una mezcla liofilizada de la proteína de fusión de RAGE y un lioprotectante de azúcar de no reducción en un diluyente de manera que la concentración de la proteína de fusión de RAGE en la formulación reconstituida está en un rango de 1 mg/mL a 400 mg/mL, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende un polipéptido de RAGE directamente unido a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una 20 inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina y en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión de ligando de RAGE.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde: (a) la proteína de fusión de RAGE comprende un conector interdominio derivado de RAGE 25 más que de un polipéptido de bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina o (b) la proteína de fusión de RAGE comprende (i) un conector interdominio de RAGE que separa los dominios V y C1 de RAGE o (¡i) un conector que separa los dominio C1 y C2 de RAGE, en lugar de la región de bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina o (c) la proteína de fusión de RAGE es obtenible mediante remover la región de bisagra Fe de la inmunoglobulina y reemplazarla con el polipéptido de RAGE.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el lioprotectante comprende al menos uno de sacarosa, manitol o trehalosa.

29. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde la mezcla liofilizada además comprende al menos un estabilizante, un surfactante, un agente de quelación o un agente de volumen.

30. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácido como se establece en al menos una de SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 ó 57 o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

31 . El uso de una formulación de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 22, en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de un desorden mediado por RAGE en un sujeto.

32. El uso de conformidad con la reivindicación 31 , en donde el medicamento se intenta para tratar al menos uno de diabetes o un síntoma de complicaciones tardías diabéticas, amiloidosis, enfermedad de Alzheimer, cáncer, falla de los ríñones o inflamación asociada con autoinmunidad, enfermedad del colón irritable, artritis reumatoide, soriasis, esclerosis múltiple, hipoxia, apoplejía, ataque cardiaco, choque hemorrágico, sepsis, transplante de órganos, osteoporosis, curación deteriorada de heridas o inflamación y/o rechazo asociado con el transplante de al menos un órgano, un tejido o una pluralidad de células desde un primer sitio a un segundo sitio.