EA017291B1 - Белки слияния на основе rage, их композиции и способы их применения - Google Patents

Белки слияния на основе rage, их композиции и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA017291B1
EA017291B1 EA200870502A EA200870502A EA017291B1 EA 017291 B1 EA017291 B1 EA 017291B1 EA 200870502 A EA200870502 A EA 200870502A EA 200870502 A EA200870502 A EA 200870502A EA 017291 B1 EA017291 B1 EA 017291B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cace
fusion protein
bace
domain
sequence
Prior art date
Application number
EA200870502A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870502A1 (ru
Inventor
Аднан М.М. Мджалли
Роберт Ротлейн
Йе Эдвард Тянь
Джеффри К. Вебстер
Эрик Дж. Бенджамин
Original Assignee
Транстек Фарма, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Транстек Фарма, Инк. filed Critical Транстек Фарма, Инк.
Publication of EA200870502A1 publication Critical patent/EA200870502A1/ru
Publication of EA017291B1 publication Critical patent/EA017291B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Описываются белки слияния на основе RAGE, включающие полипептидные последовательности RAGE, присоединенные к второму полипептиду, отличному от RAGE. В белке слияния на основе RAGE может использоваться полипептидный домен RAGE, включающий сайт связывания лиганда RAGE, и междоменный линкер, непосредственно присоединенный к N-концу C2 домена иммуноглобулина. Описываются также композиции белка слияния на основе RAGE и использование белков слияния на основе RAGE и композиций белков слияния на основе RAGE в качестве терапевтических средств при RAGE-опосредованной патологии.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с положением 35 И8С 119(е) относительно предварительной заявки на патент США, серийный № 60/798455, поданной 4 мая 2006 г. Описание предварительной заявки на патент США 60/798455 включено полностью в настоящую заявку в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к регуляции рецептора высокогликозилированных конечных продуктов (КесерЮг ίοτ Абуапсеб С1уса!еб Епбргобис!к; КАСЕ). Более конкретно, настоящее изобретение относится к белкам слияния, включающим полипептид КАСЕ, к способам получения таких белков слияния и к использованию таких белков для лечения нарушений, связанных с КАСЕ.
Предпосылки создания изобретения
Инкубация белков или липидов с альдозными сахарами приводит к неферментативному гликозилированию и окислению аминогрупп на белках с образованием аддуктов Амадори. С течением времени указанные аддукты подвергаются дополнительной перегруппировке, дегидратации и сшиванию с другими белками с образованием комплексов, известных как высоко гликозилированные конечные продукты (АСЕ). Факторы, которые способствуют образованию АСЕ, включают задержку белкового метаболизма (как, например, в случае амилоидозов), накопление макромолекул, характеризующихся высоким содержанием лизина, и высокие уровни глюкозы в крови (как, например, при диабете) (Ной е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 270: 25752-761 (1995)). АСЕ вовлечены в большое число нарушений, которые включают осложнения, ассоциированные диабетом, а также естественный процесс старения организма.
АСЕ демонстрируют специфическое и насыщаемое связывание с рецепторами клеточной поверхности на моноцитах, макрофагах, эндотелиальных клетках микрососудистой сетки, гладкомышечных клетках, мезангиальных клетках и нейронах. Рецептор для высокогликозилированных конечных продуктов (КАСЕ) относится к семейству молекул иммуноглобулинового супергена. Внеклеточный (Ν-концевой) домен КАСЕ включает три участка иммуноглобулинового типа: один домен V типа (вариабельный), за которым следует два домена С-типа (константные) (№ерет, е! а1., 1. Βίο1. Сйеш., 267: 14998-15004 (1992); 8сйт1б! е! а1., Сйс. (8ирр1). 96#194 (1997)). За внеклеточным доменом следует один трансмембранный домен и короткий высокозаряженный цитозольный фрагмент. Ν-концевой внеклеточный домен может быть выделен путем протеолиза КАСЕ или с использованием стратегий молекулярной биологии с получением растворимого КАСЕ (кКАСЕ), включающего V- и С-домены.
КАСЕ экспрессируется на клетках различных типов, включающих лейкоциты, нейроны, клетки микроглии и сосудистого эндотелия (Ной е! а1., 1. Βίο1. Сйеш. 270: 25752-761 (1995). Повышенные уровни КАСЕ также обнаружены в стареющих тканях (8сЫеюйег е! а1., 1. С1ш. 1пуек!., 99 (3): 457-468 (1997)) и в сетчатке, сосудистой сетке и почке у больных диабетом (8сйт1б! е! а1., №Шге Меб., 1: 1002-1004 (1995)).
Кроме АСЕ, другие соединения также могут связываться и модулировать КАСЕ. КАСЕ связывается со множеством функционально и структурно различных лигандов, включая амилоид-бета (АЗ), сывороточный амилоид А (8АА), конечные продукты с повышенным уровнем гликозилирования (АСЕ), 8100 (провоспалительный представитель семейства калгранулина), карбоксиметиллизин (СМЬ), амфотерин и С011Ь/СЭ18 (ВисОагеШ е! а1., Се11 Μο1. Ь1£е 8ск, 59: 1117-128 (2002); СйауаКк е! а1., МюгоЬек 1п£ес!., 6: 1219-1225 (2004); Κο1<1<ο1;·ι е! а1., 8сапб. 1. Ιιηιηιιπο1.. 61, 1-9 (2005); 8сйт1б! е! а1., 1. С1ш. 1пуек!., 108: 949955 (2001); ^скеп е! а1., Ат. 1. Ρаΐйο1., 162: 1213-1220 (2003)).
Было показано, что связывание лигандов, таких как АСЕ, 8100/калгранулин, β-амилоид, СМЬ (№карбоксиметиллизин) и амфотерин, с КАСЕ модифицирует экспрессию большого числа генов. Указанные виды взаимодействия могут затем инициировать механизмы сигнальной трансдукции, включая активацию р38, фосфорилирование р21гак, МАР-киназ, Егк1-2 и активацию медиатора транскрипции воспалительных сигнальных молекул, ΝΕ-κΒ (Уей е! а1., О1аЬе!ек, 50: 1495-1504 (2001)). Например, в клетках большого числа типов взаимодействие между КАСЕ и его лигандами может вызвать окислительный стресс, который приводит к активации фактора транскрипции ΝΕ-κΒ, чувствительного к свободным радикалом, и к активации генов, регулируемых ΝΕ-κΒ, таких как цитокины ΙΠ-1β и ΤΝΕ-α. Кроме того, экспрессия КАСЕ активируется посредством ΝΕ-κΒ, так что выявляется повышенный уровень экспрессии в участках воспаления или при окислительном стрессе (Тапака е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 275: 25781-25790 (2000)). Таким образом, связывание лиганда инициирует петлю регуляции по типу положительной обратной связи, которая может поддерживать нарастающую и часто неблагоприятную спираль.
Активация КАСЕ в разных тканях и органах может приводить к большому числу патофизиологических последствий. КАСЕ вовлечен во множество состояний, включающих острое и хроническое воспаление (^Гтапп е! а1., Се11. 97: 889-901 (1999)), развитие поздних осложнений диабета, таких как повышенная проницаемость сосудов (^аийет е! а1., 1. С1ш. 1пуек!., 97: 238-243 (1995)), нефропатия (ТеШе! е! а1., 1. Ат. 8ο^ №рйго1., 11: 1488-1497 (2000)), артериосклероз (АЗакката е! а1., Тйе Ешшкй Мебюа1 8οс^еΐу ОиОПЕС1М, Апп. Меб., 28: 419-426 (1996)) и ретинопатия (Наттек е! а1., ПзаЬеФ^дза, 42: 603-607 (1999)). КАСЕ также вовлечен в патогенез болезни Альцгеймера (Уап е! а1., №!ите, 382: 685-691 (1996)) и
- 1 017291 в инвазию и метастазирование опухоли (ТадисЫ с1 а1.. №11игс. 405: 354-357 (2000)).
Несмотря на масштабную экспрессию КАСЕ и его явную плейотропную роль. продемонстрированную на множестве моделей различных заболеваний. по всей видимости. КАСЕ не является обязательным фактором в случае нормального развития. Например. мыши с нокаутом по КАСЕ не демонстрируют аномального фенотипа. указывая на то. что. хотя КАСЕ может играть определенную роль в патологии заболевания при хронической стимуляции. ингибирование КАСЕ. скорее всего. не вносит вклад в какойлибо нежелательный острый фенотип (ЬШепщек с1 а1.. 1. С1ш. ΙηνοδΙ.. 113: 1641-50 (2004)).
Антагонистическое связывание физиологических лигандов с КАСЕ может подавлять патофизиологические изменения. создаваемые избыточными концентрациями АСЕ и других лигандов КАСЕ. За счет снижения уровня связывания эндогенных лигандов с КАСЕ могут быть снижены симптомы. ассоциированные с нарушениями. опосредованными КАСЕ. Растворимый КАСЕ (кКАСЕ) способен оказывать эффективное антагонистическое воздействие на связывание лигандов КАСЕ с КАСЕ. Однако &КАСЕ может. в случае его введения ίη νίνο. обладать таким периодом полувыведения. который будет слишком мал для его терапевтического применения в случае одного или нескольких нарушений. Таким образом. существует потребность в разработке соединений. которые бы оказывали антагонистический эффект на связывание АСЕ и других физиологических лигандов с рецептором КАСЕ. и так. чтобы такие соединения имели желательный фармакокинетический профиль.
Краткое описание сущности изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения включают белки слияния на основе КАСЕ и способы использования таких белков. Настоящее изобретение может быть осуществлено в рамках множества способов. Варианты осуществления настоящего изобретения могут включать белок слияния на основе КАСЕ. содержащий полипептид КАСЕ. присоединенный к второму полипептиду. отличному от КАСЕ. В одном варианте белок слияния на основе КАСЕ включает сайт связывания лиганда КАСЕ. Белок слияния на основе КАСЕ может дополнительно включать полипептид КАСЕ. непосредственно присоединенный к полипептиду. включающему домен Сн2 иммуноглобулина или часть домена Сн2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белок слияния на основе КАСЕ включает аминокислотную последовательность. представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 56 или 8ЕО ΙΌ N0: 57. или последовательность. которая по меньшей мере на 70. 75. 80. 85. 90. 95. 96. 97. 98 или 99% идентична указанным последовательностям. Например. в некоторых вариантах последовательность. которая характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью с 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57. включает последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57 без С-концевого лизина.
Настоящее изобретение также относится к способу получения белка слияния на основе КАСЕ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает присоединение полипептида КАСЕ ко второму полипептиду. отличному от КАСЕ. В одном варианте полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда КАСЕ. Способ может включать присоединение полипептида КАСЕ непосредственно к полипептиду. включающему домен Сн2 иммуноглобулина или часть домена Сн2. В некоторых вариантах белок слияния на основе КАСЕ включает аминокислотную последовательность. представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57. или последовательность. которая по меньшей мере на 70. 75. 80. 85. 90. 95. 96. 97. 98 или 99% идентична указанным последовательностям. Например. в некоторых вариантах последовательность. по меньшей мере на 90% идентичная 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57. включает последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57 без С-концевого лизина.
В других вариантах настоящее изобретение включает способы и композиции. подходящие для лечения КАСЕ-опосредованного нарушения у субъекта. Данный способ может включать введение белка слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению субъекту. Композиция может включать белок слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе.
В других вариантах настоящее изобретение относится к композициям. содержащим лиофилизированную смесь лиопротектора. белка слияния на основе КАСЕ и буфера. Так. например. в некоторых вариантах настоящее изобретение может включать стабильную восстановленную композицию. содержащую белок слияния на основе КАСЕ. в количестве по меньшей мере 50 мг/мл. и разбавитель. где восстановленную композицию получают из лиофилизированной смеси белка слияния на основе КАСЕ и лиопротектора.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения могут также включать изделия. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения изделия могут включать контейнер. в котором содержится композиция. содержащая лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ. Изделие может также включать инструкции по восстановлению лиофилизированной композиции разбавителем.
В других вариантах настоящее изобретение также включает способы получения стабильной восстановленной композиции белка слияния на основе КАСЕ. В некоторых вариантах способ может включать восстановление лиофилизированной смеси белка слияния на основе КАСЕ и лиопротектора в разбавителе так. чтобы белок слияния на основе КАСЕ имел концентрацию в восстановленной композиции. равную по меньшей мере 50 мг/мл. Например. в одном варианте осуществления настоящего изобретения описываемый в нем способ может включать стадии лиофилизации смеси. содержащей белок слияния на основе КАСЕ и лиопротекторное количество лиопротектора. и затем восстановления лиофилизирован
- 2 017291 ной смеси в разбавителе.
Можно отметить различные преимущества, ассоциированные с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения. В одном варианте белки слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению могут быть метаболически стабильными при их введении субъекту. Кроме того, белки слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению могут демонстрировать высокую аффинность связывания с лигандами КАСЕ. В некоторых вариантах белки слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению связываются с лигандами КАСЕ со значениями аффинности, укладывающимися в диапазон от высоких наномолярных до низких микромолярных количеств. В ситуации связывания с высокой аффинностью с физиологическими лигандами КАСЕ белки слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению могут использоваться для ингибирования связывания эндогенных лигандов с КАСЕ, что может рассматриваться как способ облегчения заболеваний, опосредованных КАСЕ.
Кроме того, белки слияния на основе КАСЕ по настоящему изобретению могут быть представлены в виде белка или нуклеиновой кислоты. В одном иллюстративном варианте белок слияния на основе КАСЕ может вводиться системно и оставаться в сосудистой сети для эффективного лечения сосудистых заболеваний, которые частично опосредованы КАСЕ. В другом иллюстративном варианте белок слияния на основе КАСЕ может вводиться местно для лечения заболеваний, патология которых включает лиганды КАСЕ. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая белок слияния на основе КАСЕ, может быть доставлена в нужный сайт путем использования соответствующего носителя, такого как вирус или оголенная ДНК, где временная местная экспрессия может локально ингибировать взаимодействие между лигандами КАСЕ и рецепторами. Таким образом, введение может быть временным (как, например, в случае введения белка слияния на основе КАСЕ) или более постоянным по своей природе (например, в том случае, когда белок слияния на основе КАСЕ вводят в виде рекомбинантной ДНК).
Ниже описываются дополнительные особенности осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается деталями, приведенными в заявке, формуле изобретения и чертежах. Настоящее изобретение может быть осуществлено в виде других вариантов и может быть реализовано или выполнено различными способами.
Краткое описание чертежей
Различные особенности, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут более понятными при рассмотрении их в сочетании с приведенными чертежами.
На фиг. 1 показаны разные последовательности КАСЕ, а также последовательности иммуноглобулина, относящиеся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения. Панель А: 8ЕС ГО N0: 1, аминокислотная последовательность КАСЕ человека; и 8ЕС ГО N0: 2, аминокислотная последовательность КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-22; панель В: 8ЕС ГО N0: 3, аминокислотная последовательность КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23; панель С: 8ЕС ГО N0: 4, аминокислотная последовательность 5КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 5, аминокислотная последовательность 5КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-22 и 8ЕС ГО N0: 6, аминокислотная последовательность 5КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23; панель Ό: 8ЕС ГО N0: 7, аминокислотная последовательность, включающая У-домен КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 8, альтернативная аминокислотная последовательность, включающая У-домен КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 9, ^концевой фрагмент У-домена КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 10, альтернативный ^концевой фрагмент У-домена КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 11, аминокислотная последовательность аминокислот 124-221 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 12, аминокислотная последовательность аминокислот 227-317 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 13, аминокислотная последовательность аминокислот 23-123 КАСЕ человека; панель Е, 8ЕС ГО N0: 14, аминокислотная последовательность аминокислот 24-123 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 15, аминокислотная последовательность аминокислот 23-136 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 16, аминокислотная последовательность аминокислот 24-136 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 17, аминокислотная последовательность аминокислот 23-226 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 18, аминокислотная последовательность аминокислот 24-22 6 КАСЕ человека; панель Е, 8ЕС ГО N0: 19, аминокислотная последовательность аминокислот 23-251 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 20, аминокислотная последовательность аминокислот 24-251 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 21, междоменный линкер КАСЕ; 8ЕС ГО N0: 22, второй междоменный линкер КАСЕ; 8ЕС ГО N0: 23, третий междоменный линкер КАСЕ; 8ЕС ГО N0: 24, четвертый междоменный линкер КАСЕ; панель С, 8ЕС ГО N0: 25, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность аминокислот 1-118 КАСЕ человека; 8ЕС ГО N0: 26, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность аминокислот 1-12 3 КАСЕ человека; и 8ЕС ГО N0: 27, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность аминокислот 1-136 КАСЕ человека; панель Н, 8ЕС ГО N0: 28, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность аминокислот 1-230 КАСЕ человека; и 8ЕС ГО N0: 29, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность аминокислот 1-251 КАСЕ человека; Панель I, 8ЕС ГО N0: 38, частичная аминокислотная последовательность Сн2- и Сн3-доменов 1дС человека; 8ЕС ГО N0: 39, ДНК, кодирующая часть доменов Сн2 и Сн3 человека 1дС человека; 8ЕС ГО N0: 40, аминокислотная последовательность Сн2- и Сн3доменов 1дС человека; панель 1, 8ЕС ГО N0: 41, ДНК, кодирующая домены Сн2 и Сн3 человека 1дС че
- 3 017291 ловека; 8ЕЦ ΙΌ N0: 42, аминокислотная последовательность Сн2-домена 1дС человека; 8ЕЦ ΙΌ N0: 43, аминокислотная последовательность Сн3-домена 1дС человека; и 8ЕЦ ΙΌ N0: 44, пятый междоменный линкер КАСЕ; панель К, 8ЕЦ ΙΌ N0: 45, аминокислотная последовательность кКАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23, где остаток глютамина на Оконце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; 8ЕЦ ΙΌ N0: 46, альтернативная аминокислотная последовательность, включающая V-домен кКАСЕ человека, где остаток глютамина на №конце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; 8ЕЦ ΙΌ N0: 47, альтернативный ^концевой фрагмент ν-домена, где остаток глютамина на №конце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; 8ЕЦ ΙΌ N0: 48, аминокислотная последовательность аминокислот 24-123 КАСЕ человека, где остаток глютамина на Оконце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; панель Ь, 8ЕЦ ΙΌ N0: 49, аминокислотная последовательность аминокислот 24-136 КАСЕ человека, где остаток глютамина на №конце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; 8ЕЦ ΙΌ N0: 50, аминокислотная последовательность аминокислот 24-226 КАСЕ человека, где остаток глютамина на Оконце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; 8ЕЦ ΙΌ N0: 51, аминокислотная последовательность аминокислот 24251 КАСЕ человека, где остаток глютамина на Оконце циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты; панель М, 8ЕЦ ΙΌ N0: 52, альтернативная последовательность ДНК, кодирующая часть доменов Сн2 и Сн3 человека ΙβΟ человека в 8ЕЦ ΙΌ N0: 38, и 8ЕЦ ΙΌ N0: 53, альтернативная последовательность ДНК, кодирующая домены Сн2 и Сн3 человека ΙβΟ человека в 8ЕЦ ΙΌ N0: 40.
На фиг. 2 показаны альтернативные последовательности ДНК 8ЕЦ ΙΌ N0: 30 (панель А) и 8ЕЦ ΙΌ N0: 54 (панель В), которые кодируют кодирующий участок первого белка слияния на основе КАСЕ (ТТР-4000), в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Кодирующая последовательность 1-753, выделенная жирным шрифтом, кодирует ^концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность на участке 754-1386 кодирует белковую последовательность ЦС Ес (γ1) человека без шарнирной области.
На фиг. 3 показаны альтернативные последовательности ДНК 8ЕЦ ΙΌ N0: 31 (панель А) и 8ЕЦ ΙΌ N0: 55 (панель В), которые кодируют кодирующий участок второго белка слияния на основе КАСЕ (ТТР-3000), в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Кодирующая последовательность 1-408, выделенная жирным шрифтом, кодирует ^концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность 409-1041 кодирует белковую последовательность Ι§0 Ес (γ1) человека без шарнирной области.
На фиг. 4 показаны аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 32, 8ЕЦ ΙΌ N0: 33, 8ЕЦ ΙΌ N0: 34 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 56, каждая из которых кодирует четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. Последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом.
На фиг. 5 показаны аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 35, 8ЕЦ ΙΌ N0: 36, 8ЕЦ ΙΌ N0: 37 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 57, каждая из которых кодирует трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. Последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом.
На фиг. 6, панель А, приведено сравнение белковых доменов КАСЕ человека и Ι§0 γ1 Ес белка человека, и точки расщепления, используемые для получения ТТР-3000 (в положении 136) и ТТР-4000 (в положении 251), в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения; и на панели В показана доменная структура ТТР-3000 и ТТР-4000 в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 7 показаны результаты теста на связывание ίη νίίτο для кКАСЕ и первого белка слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000 (ТТ4) и второго белка слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 (ТТ3) с лигандами КАСЕ амилоид-бета (АЗ), 8100Ь (8100) и амфотерином (Λιηρίιο). в соответствии с альтернативным вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 8 показаны результаты теста на связывание ίη νίίτο для первого белка слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 (ТТ4) (белок) с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим только реагенты для иммунологического выявления (только комплекс) и продемонстрирован антагонизм такого присоединения под действием антагониста КАСЕ (лиганд КАСЕ), в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 9 показаны результаты теста на связывание ίη νίίτο для второго белка слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 (ТТ3) (белок) с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим только реагенты для иммунологического выявления (только комплекс) и продемонстрирован антагонизм такого присоединения под действием антагониста КАСЕ (лиганд КАСЕ) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 10 показаны результаты клеточного теста, выполняемого для определения уровня ингибирования индуцированной 8100Ь-КАСЕ продукции ТНЕ-α под действием белков слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 (ТТ3) и ТТР-4000 (ТТ4), и кКАСЕ, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
- 4 017291
На фиг. 11 показаны результаты клеточного теста, выполняемого для определения уровня ингибирования индуцированной НМСВ1-ВАСЕ продукции ΤΝΕ-α под действием белка слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 и антитела к ВАСЕ, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 12 показан фармакокинетический профиль для белка слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, где каждая из кривых относится к разным животным в одних и тех же экспериментальных условиях.
На фиг. 13 показаны относительные уровни высвобождения ΤΝΕ-α из клеток ТНР-1 в результате стимуляции белком слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 и стимуляции 1дС человека, как меры воспалительного ответа, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 14 иллюстрирует использование белка слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 для снижении рестеноза у животных с диабетом, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения, где на панели А показано, что белок слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 снижает соотношение интимы/среды в сравнении с отрицательным контролем (1дС), и на панели В показано, что белок слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 снижает пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов зависимым от дозы способом.
Фиг. 15 иллюстрирует использование белка слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 для снижения образования амилоида и дисфункции познавательного процесса у животных с болезнью Альцгеймера (БА) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения, где на панели А показано, что белок слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 снижает амилоидную нагрузку мозга, а на панели В показано, что белок слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 улучшает познавательную функцию.
На фиг. 16 приведены кривые, описывающие насыщение связывания для ТТР-4000 с различными иммобилизованными известными лигандами ВАСЕ в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 17 иллюстрирует использование белка слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 для снижения отторжения трансплантатов аллогенных островковых клеток поджелудочной железы в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, где открытые (незачерненные) кружки обозначают животных, представляющих группу необработанного контроля; кружки с диагональной штриховкой обозначают животных, которым вводили ТТР-4000 в первой указанной дозе; кружки с волнистой штриховкой обозначают животных, которым вводили ТТР-4000 во второй указанной дозе; и кружки с ромбовидными заполняющими элементами обозначают животных, которым вводили ΡΒ8 в качестве контрольного агента; и зачерненные кружки обозначают животных, которым вводили контрольный 1дС.
Фиг. 18 иллюстрирует использование белка слияния на основе ВАСЕ ΤΤΡ-4000 для снижения отторжения трансплантатов сингенных островковых клеток поджелудочной железы в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, где открытые (назачерненные) кружки обозначают животных, представляющих группу необработанного контроля; и зачерненные кружки обозначают животных, которым вводили ТТР-4000.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего описания, если из контекста не следует противоположное, численные параметры, приведенные далее в описании, являются приблизительными значениями, которые могут варьировать в зависимости от желательных свойств, нужных при осуществлении настоящего изобретения. В крайнем случае, но не с целью ограничения применения принципа эквивалентов применительно к настоящему изобретению, каждый численный параметр можно рассматривать как число, соответствующее значимым цифрам с применением обычной методики округления.
Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, приведенные в общем описании изобретения, даны в некотором приближении, числовые значения, приведенные в конкретных примерах, даны настолько точно, насколько это возможно. Однако каждое числовое значение может содержать в себе некоторую ошибку, возникающую в результате стандартного отклонения, присущего соответствующим методикам измерения. Более того, все указанные диапазоны следует понимать, как охватывающие любые и все входящие в них поддиапазоны. Например, диапазон, указанный как от 1 до 10, следует рассматривать как включающий любые и все поддиапазоны между приведенными значениями (и включая их) от минимального значения, равного 1, до максимального значения, равного 10, что означает, что все поддиапазоны, начинающиеся от минимального значения 1 или более, например от 1 до 6,1, и заканчивающиеся максимальным значением 10 или менее, например 5,5-10, входят в него. Дополнительно любые ссылки, обозначаемые как включенные в настоящий контекст, следует понимать как включенные полностью.
Следует также отметить, что в контексте настоящего описания формы единственного числа включают формы множественного числа, если явно не следует иное. Термин или используется взаимозаменяемо с термином и/или, если из контекста явно не следует иное.
Кроме того, термины часть и фрагмент, используемые взаимозаменяемо, относятся к частям по
- 5 017291 липептида, нуклеиновой кислоты или других молекулярных конструкций.
Термины полипептид и белок используются взаимозаменяемо в тексте настоящего описания для обозначения молекул белка, которые могут включать либо частичные белки, либо белки полной длины.
Как известно в данной области, белки, пептиды, полипептиды и олигопептиды представляют собой цепи на основе аминокислот (в типичном случае, Ь-аминокислот), в которых α-углероды соединены пептидной связью, образованной в результате реакции конденсации между карбоксильной группой ауглерода одной аминокислоты и аминогруппой а-углерода другой аминокислоты. В типичном случае аминокислоты, образующие белок, нумеруют в определенном порядке, начиная от аминоконцевого остатка в направлении остатка на карбоксильном конце белка.
В контексте настоящего описания термин против направления считывания (ирейсат) относится к остатку, который является Ν-концевым относительно второго остатка, в том случае, если молекула является белком, или находится в 5'-положении относительно второго остатка, если молекула представляет собой нуклеиновую кислоту. Кроме того, в контексте настоящего описания термин в направлении считывания относится к остатку, который является С-концевым относительно второго остатка, если молекула является белком, или находится в З'-положении относительно второго остатка, если молекула представляет собой нуклеиновую кислоту.
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют значения, общепринятые в данной области. Практикующим специалистам может быть рекомендовано известное руководство (Сипси! Рто1осо1е ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν (см. также АиеиЬе1 Е.М. е! а1., 81юП Ρτοΐοсо1е ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 411' Еб., СНар1ег 2, 1о1и \УПеу & 8оие, Ν.Υ.)), где описаны определения и термины, используемые в данной области. Аббревиатуры аминокислотных остатков представлены стандартными трехбуквенными и/или однобуквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычных Ь-аминокислот.
Термин нуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотид, такой как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Термин используется для обозначения одноцепочечных нуклеиновых кислот, двуцепочечных нуклеиновых кислот и РНК и ДНК, полученных из нуклеотидных или нуклеозидных аналогов.
Термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может использоваться для транспортировки второй молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой вектор позволяет осуществлять репликацию последовательностей ДНК, введенных в вектор. Вектор может включать промотор для повышения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, в некоторых клетках-хозяевах. Векторы могут реплицироваться автономно (внехромосомно) или могут быть интегрированы в хромосому клетки-хозяина. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемый в нем вектор может включать вектор экспрессии, способный продуцировать белок, полученный по меньшей мере из части последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор.
Как известно в данной области, условия гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом могут быть описаны в терминах, варьирующих от низкой до высокой жесткости. В основном, высокожесткие условия гибридизации относятся к промывке гибридов в низкосолевом буфере при высоких температурах. Гибридизация может включать фильтрование связанной ДНК с использованием растворов для гибридизации, стандартных для данной области, таких как растворы, включающие 0,5М №1НР04. 7% додецилсульфат натрия (ДСН), при температуре 65°С и промывку в 0,25М №1НР04. содержащем 3,5% ДСН, с последующей промывкой в 0,1х88С/0,1% ДСН при температуре, варьирующей от комнатной температуры до 68°С в зависимости от длины зонда. Например, условия высокой жесткости промывки включают промывку в 6х88С/0,05% пирофосфата натрия при температуре 37°С в случае олигонуклеотидного зонда с 14 основаниями, или при температуре 48°С в случае олигонуклеотидного зонда с 17 основаниями, или при температуре 55°С в случае олигонуклеотидного зонда с 20 основаниями, или при температуре 60°С в случае олигонуклеотидного зонда с 25 основаниями, или при температуре 65°С в случае олигонуклеотидного зонда, включающего примерно 250 нуклеотидов в длину. Зонды нуклеиновой кислоты могут быть мечены радионуклидами, введенными в качестве концевой метки, например [у-32Р]АТР, или за счет включения радиоактивно меченых нуклеотидов, таких как [а-32Р]бСТР, введенных путем случайного мечения с использованием праймеров. Альтернативно, зонды могут быть мечены путем включения биотинилированных или меченых флуоресцеином нуклеотидов, где выявление зондов проводят с использованием стрептавидина или антител против флуоресцеина.
В контексте настоящего описания термин малые органические молекулы относится к молекулам с молекулярным весом менее чем 2000 Да, которые содержат по меньшей мере один атом углерода.
Термин белок слияния относится к белку или полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, полученную из двух или более белков. Белок слияния может также включать связующие участки аминокислот между аминокислотными частями, полученными из отдельных белков.
В контексте настоящего описания термин полипептид, отличный от ВАСЕ представляет собой
- 6 017291 любой полипептид, который был получен не из КАСЕ или его фрагмента. Такие полипептиды, отличные от КАСЕ, включают иммуноглобулиновые пептиды, димеризованные полипептиды, стабилизированные полипептиды, амфифильные пептиды или полипептиды, включающие аминокислотные последовательности, которые обеспечивают наличие соответствующих меток для целевой доставки белка или его очистки.
В контексте настоящего описания термин иммуноглобулиновые пептиды может включать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть. В одном варианте осуществления настоящего изобретения часть тяжелой цепи может представлять собой Ес-фрагмент или его часть. В контексте настоящего описания Ес-фрагмент включает шарнирную область тяжелой цепи полипептида, а также Сц2 и Сн3 домены тяжелой цепи иммуноглобулина в мономерной или димерной форме. В ином случае, Сн1 и Ес-фрагмент могут использоваться в виде иммуноглобулинового полипептида. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: 1дС (γ), 1дМ (μ), ΙμΌ (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (а). Дополнительно тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: 1дС1 (γ1), 1дС2 (γ2), 1дС3 (γ3), 1дС4 (γ4), 1дА1 (а1), 1дА2 (а2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, меняющие их биологическую активность. Примером такой биологической активности, которая может быть изменена, является снижение способности изотипа связываться с некоторыми рецепторами Ес, например, за счет модификации шарнирной области.
Термины идентичность или процент идентичности относятся к идентичности на уровне последовательности, имеющейся между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты. Процент идентичности может быть определен путем сопоставления последовательностей и относится к числу идентичных остатков (например, аминокислот или нуклеотидов) в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Сопоставление последовательностей и их сравнение может быть проведено с помощью известных для этого алгоритмов (см., например, 8тб11 апб Аа1егшап, 1981, Абу. Арр1. Ма111. 2:482: №еб1ешап апб АипБсй, 1970, 1. Мо1. ΒίοΙ. 48: 443; Реагзоп апб Ыршап, 1988, Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск, И8А, 85: 2444) или при использовании компьютерных версий указанных алгоритмов (пакет прикладных программ А1бсопбш Сепебсз 8оП\таге Раскаде Ке1еазе 7.0, Сепебсз Сошри1ет Сгоир, 575 8аепсе Элуе. Маб18оп, ΜΙ), которые широко доступны в виде программ ВБА8Т и ЕА8ТА. Кроме того, для сравнения последовательностей может использоваться программа ΕΝΤΚΕΖ, доступная от Национального института здоровья, Бетезда, США (Ыа1юпа1 1п8Йи1е8 о! НеаШт ВеЛезба МО). В одном варианте осуществления настоящего изобретения процент идентичности двух последовательностей может быть определен при использовании ССС с весовым значением гэпа, равным 1, так что каждому аминокислотному гэпу присваивается весовое значение, соответствующее ошибке в одной аминокислоте между двумя последовательностями.
В контексте настоящего описания термин консервативные остатки относится к аминокислотам, которые являются одинаковыми среди множества белков, имеющих одну и ту же структуру и/или функцию. Область консервативных остатков может иметь значение для описания структуры или функции белка. Так, соприкасающиеся консервативные остатки, идентифицируемые в трехмерном белке, могут быть важны для описания структуры или функции белка. Для выявления консервативных остатков или консервативных участков трехмерной структуры можно провести сравнение последовательностей одинаковых или сходных белков из разных видов или у индивидуумов одного и того же вида.
В контексте настоящего описания термин гомолог обозначает полипептид, имеющий определенную степень гомологии с аминокислотной последовательностью дикого типа. Сравнение по гомологии может быть проведено на глаз или чаще всего с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. Такие коммерчески доступные компьютерные программы позволяют вычислить процент гомологии между двумя или более последовательностями (см., например, АйЬиг, А.1. апб Ь1ршап, Ό.Ι., 1983, Ргос. №11. Асаб. 8ск, И8А, 80: 726-730). Например, могут быть взяты гомологичные последовательности, включающие такие аминокислотные последовательности, которые в альтернативных вариантах по меньшей мере на 70, на 75, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны друг другу.
В контексте настоящего описания термин идентичный по меньшей мере на 90% обозначает последовательности, которые характеризуются показателем идентичности в диапазоне от 90 до 99,99% идентичности указанным последовательностям и которые включают все диапазоны между указанными значениями. Таким образом, термин идентичный по меньшей мере на 90% обозначает последовательности, которые характеризуются показателем идентичности, равным 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 и 99,5%, применительно к указанной последовательности. Аналогично, термин идентичный по меньшей мере на 70% обозначает последовательности, которые характеризуются показателем идентичности в диапазоне от 70 до 99,99% идентичности, включая все диапазоны между ними. Определение процента идентичности проводят с использованием алгоритмов, приведенных в настоящем описании.
В контексте настоящего описания полипептидный или белковый домен обозначает область полипептида или белка, которая включает независимую единицу. Домены могут быть определены с точки
- 7 017291 зрения структуры, последовательности и/или биологической активности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептидный домен может включать участок белка, который укладывается в пространственную структуру таким образом, что, по существу, не зависит от остальной части белка. Домены могут быть идентифицированы с использованием баз данных доменов, таких как, без ограничения, РЕАМ, РИОСОМ. РВО81ТЕ, ВЬОСК8, РВЮТ8, 8ВА8Е, 18ВЕС РВОЕШЕ8, 8АМВТ и РВОСЬА88.
В контексте настоящего описания термин иммуноглобулиновый домен обозначает аминокислотную последовательность, которая характеризуется структурной гомологией или идентичностью с доменом иммуноглобулина. Длина последовательности аминокислот в иммуноглобулиновом домене может быть любого размера. В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновый домен может включать менее чем 250 аминокислот в длину. В одном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновый домен может составлять примерно 80-150 аминокислот в длину. Например, вариабельный домен и участки Сн1, Сн2 и Сн3 в 1дС, каждый, представляет собой иммуноглобулиновый домен. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариабельные участи Сн1, Сн2, Сн3 и Сн4 в 1дМ, каждый, представляют иммуноглобулиновый домен.
В контексте настоящего описания иммуноглобулиновый домен ВАСЕ представляет собой последовательность аминокислот белка в ВАСЕ, которая характеризуется структурной гомологией или идентичностью с доменом иммуноглобулина. Например, домен иммуноглобулина ВАСЕ может включать Vдомен ВАСЕ, домен ВАСЕ 1д-подобного С1 типа 1 (С1 домен) или домен ВАСЕ 1д-подобного С2 типа 2 (С2 домен).
В контексте настоящего описания термин междоменный линкер обозначает полипептид, который соединяет вместе два домена. Ес-шарнирная область представляет собой пример междоменного линкера в 1дС.
В контексте настоящего описания термин непосредственно соединенный идентифицирует ковалентную связь между двумя разными группами (например, между последовательностями нуклеиновых кислот, полипептидов, полипептидными доменами), которые не содержат каких-либо встроенных атомов между двумя соединяемыми группами.
В контексте настоящего описания термин лигандсвязывающий домен относится к домену белка, ответственному за связывание лиганда. Указанный термин лигандсвязывающий домен включает гомологи связывающего домена лиганда или его части. В этом контексте могут быть произведены осторожные замещения аминокислот в связывающем сайте лиганда с учетом сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков с тем, чтобы сохранить специфичность по связыванию домена, ответственного за связывание лиганда.
В контексте настоящего описания термин сайт связывания лиганда включает остатки в белке, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом, или остатки, вовлекаемые в осуществление такой локализации лиганда, чтобы он оставался в тесной близости к тем остаткам, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом. Взаимодействие остатков в сайте связывания лиганда может быть определено по пространственной близости остатков к лиганду на примере модели или в самой структуре. Термин сайт связывания лиганда включает гомологи сайта связывания лиганда или его части. В этой связи, могут быть произведены осторожные замещения аминокислот в сайте связывания лиганда с учетом сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков с тем, чтобы сохранить специфичность сайта по связыванию с лигандом. Сайт связывания лиганда может находиться в одном или нескольких связывающих доменах белка или полипептида.
В контексте настоящего описания термин взаимодействует относится к условиям, включающим близость между лигандом или соединением, или их частями, или фрагментами, и частью второй молекулы, представляющей определенный интерес. Взаимодействие может быть нековалентным, например, осуществляемым как результат действия водородных связей, может представлять собой взаимодействие под действием сил Ван дер Вальса или электростатическое или гидрофобное взаимодействие, или оно может быть ковалентным.
В контексте настоящего описания термин лиганд относится к молекуле или соединению или другой структуре, которая взаимодействует с сайтом связывания лиганда, включая субстраты, или аналоги, или их части. В контексте настоящего описания, термин лиганд может относиться к соединениям, которые связываются с белком, представляющим интерес. Лиганд может представлять собой агонист, антагонист или модулятор. Или указанный лиганд может оказывать биологический эффект. Или указанный лиганд может блокировать связывание других лигандов и тем самым ингибировать биологический эффект. Лиганды могут включать, без ограничения, малые молекулы ингибиторов. Указанные малые молекулы могут включать пептиды, пептидомиметики, органические соединения и т.п. Лиганды могут также включать полипептиды и/или белки.
В контексте настоящего описания термин соединение-модулятор относится с молекуле, которая изменяет или модифицирует биологическую активность молекулы, представляющей интерес. Соединение-модулятор может повышать или понижать активность или изменять физические или химические
- 8 017291 характеристики, а также функциональные или иммунологические свойства молекулы, представляющей интерес. В случае КАСЕ соединение-модулятор может повышать или снижать активность или изменять характеристики, или функциональные или иммунологические свойства КАСЕ или его части. Соединение-модулятор может включать природные и/или химически синтезированные или искусственные пептиды, модифицированные пептиды (например, фосфопептиды), антитела, углеводы, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, гликолипиды, гетероциклические соединения, нуклеозиды или нуклеотиды или их части, а также малые органические или неорганические молекулы. Соединение-модулятор может представлять собой эндогенное физиологическое соединение или может быть природным или синтетическим соединением. Или соединение-модулятор может представлять собой малую органическую молекулу. Термин соединение-модулятор также включает химически модифицированный лиганд или химически модифицированное соединение, и включает их изомерные и рацемические формы.
Термин агонист включает соединение, которое связывается с рецептором с образованием комплекса, который демонстрирует фармакологический ответ, специфичный для вовлекаемого рецептора.
Термин антагонист включает соединение, которое связывается с агонистом или с рецептором с образованием комплекса, который не демонстрирует существенного фармакологического ответа и может ингибировать биологический ответ, индуцированный агонистом.
Соответственно, агонисты КАСЕ могут связываться с КАСЕ и стимулировать КАСЕопосредованные клеточные процессы, а антагонисты КАСЕ могут ингибировать опосредованные КАСЕ процессы, стимулируемые агонистом КАСЕ. Например, в одном варианте осуществления изобретения клеточный процесс, стимулируемый агонистами КАСЕ, включает активацию транскрипции гена ΤΝΕ-α.
Термин пептидные миметики относится к структурам, которые служат в качестве заместителей пептидов в процессах взаимодействия между молекулами (Могдап е! а1., 1989, Апп. Керотй Мей. Сйеш., 24: 243-252). Пептидные миметики могут включать синтетические структуры, которые могут содержать аминокислотные и/или пептидные связи или могут не содержать их, но которые сохраняют структурные и функциональные особенности пептида, агониста или антагониста. Пептидные миметики также включат пептоиды, олигопептоиды (81шоп е! а1., 1972, Ргос. №111. Асай. δα., И8А, 89: 9367) и пептидные библиотеки, содержащие пептиды заданной длины, отражающие все возможные последовательности аминокислот, соответствующие пептиду, агонисту или антагонисту согласно настоящему изобретению.
Термин лечение относится к ослаблению симптома заболевания или нарушения и может включать излечивание нарушения, по существу, предотвращение начала развития нарушения или улучшение состояния субъекта. Термин терапия в контексте настоящего описания относится к полному спектру терапевтических методов, применяемых в случае того нарушения, которым страдает пациент, включая облегчение одного симптома или большей части симптомов, определяемых данным нарушением, излечивание конкретного нарушения или предотвращение развития нарушения.
В контексте настоящего описания термин ЕС5о определяется как концентрация агента, которая соответствует 50% от уровня измеряемого биологического эффекта. Например, ЕС50 терапевтического агента, оказывающего заметный биологический эффект, может включать величину, при которой данный агент демонстрирует 50% уровень указанного биологического эффекта.
В контексте настоящего описания термин 1С50 определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% ингибированию измеряемого эффекта. Например, 1С50 антагониста связывания КАСЕ может включать значение, при котором антагонист снижает связывание лиганда с сайтом связывания лиганда КАСЕ на 50%.
В контексте настоящего описания термин эффективное количество обозначает количество агента, которое является эффективным для проявления желательного эффекта у субъекта. Термин терапевтически эффективное количество обозначает количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое демонстрирует терапевтический ответ у животного или человека, для которого желателен такой ответ. Фактическая доза, которая включает эффективное количество, может зависеть от способа введения, размера субъекта и состояния его здоровья, от природы нарушения, подлежащего лечению, и т. п.
Термин фармацевтически приемлемый носитель в контексте настоящего изобретения может относиться к соединениям и композициям, которые приемлемы для использования у человека или животного, например, может относиться к терапевтическим композициям, вводимым с целью лечения нарушения или заболевания, опосредованного КАСЕ.
Термин фармацевтическая композиция в контексте настоящего описания обозначает композицию, которая может вводиться в организм хозяина-млекопитающего, например, перорально, парентерально, местно, путем ингаляции, интраназально или ректально, в стандартных дозированных формах, включая обычные нетоксичные носители, разбавители, адъюванты, наполнители и т. п.
Термин парентеральный в контексте настоящего описания включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, внутригрудинную инъекцию или методику инфузии.
В контексте настоящего описания термин отторжение относится к иммунному или воспалительному ответу на ткань, который ведет к деструкции клеток, тканей или органов или который ведет к по
- 9 017291 вреждению клеток, тканей или органов. Отторгаемые клетки, ткань или орган могут быть получены от того же субъекта, который проявил реакцию отторжения, или они могут быть трансплантированы от другого субъекта в организм того субъекта, который демонстрирует указанную реакцию отторжения.
В контексте настоящего описания термин клетка относится к структурным и функциональным единицам живой системы млекопитающего, где каждая из них включает независимую живую систему. Как известно в данной области, клетки включают ядро, цитоплазму, внутриклеточные органеллы и клеточную стенку, которая окружает клетку и позволяет клетке быть независимой от других клеток.
В контексте настоящего описания термин ткань относится к агрегату клеток, которые обладают аналогичной структурой и функцией или которые действует сообща, выполняя определенную функцию. Ткань может включать объединение близких клеток и внутриклеточные вещества, которые окружают клетки. Ткани включают, без ограничения, мышечную ткань, нервную ткань и костную ткань.
В контексте настоящего описания термин орган относится к полностью дифференцированной структурной и функциональной единице в организме животного, которая специализируется на выполнении конкретной функции. Орган может включать группу тканей, которые выполняют определенную функцию или группу функций. Органы включают, без ограничения, сердце, легкие, головной мозг, глаз, желудок, селезенку, поджелудочную железу, почки, печень, кишечник, кожу, матку, мочевой пузырь и кости.
Термин стабильная применительно к композиции обозначает такую композицию, в составе которой белок слияния на основе КАСЕ, по существу, сохраняет свою физическую и химическую стабильность, а также биологическую активность при хранении. В данной области имеются различные доступные методики для определения стабильности белка, которые описаны в приведенных ниже обзорах (РерИйе аий Рго1еш Бгид Бейуегу, 247-301, Ушсеи! Ьее Ей., Магсе1 Беккег, 1пс., Уогк, Ν.Υ., РиЬ§. (1991) и 1оие§, А. Айу. Б гид Бейуегу Кеу. 10: 29-90 (1993)). Стабильность может быть измерена при заданном значении температуры в течение выбранного периода времени. Для целей быстрого скрининга композиция может выдерживаться при температуре 40°С в течение периода времени от 1 недели до 1 месяца, и в течение этого периода времени проводят измерение стабильности. Так, например, может использоваться показатель уровня агрегации после лиофилизации и хранения как индикатор стабильности белка слияния на основе КАСЕ (см. приведенные в тексте примеры). Например, стабильная композиция может представлять собой такую композицию, в которой меньше чем примерно 10% и предпочтительно меньше чем примерно 5%, белка слияния на основе КАСЕ присутствует в композиции в виде агрегата. В других вариантах осуществления настоящего изобретения может быть определено повышение уровня образования агрегатов после лиофилизации и хранения лиофилизированной композиции. Например, стабильная лиофилизированная композиция может представлять собой такую композицию, в случае которой повышение уровня агрегатов в такой лиофилизированной композиции составляет менее чем примерно 5% или менее чем примерно 3% в случае, если лиофилизированную композицию инкубируют при температуре 40°С в течение по меньшей мере одной недели. В других вариантах осуществления настоящего изобретения стабильность композиции белка слияния на основе КАСЕ может быть измерена с использованием теста на биологическую активность, такого как тест на связывание согласно настоящему описанию.
Восстановленная композиция представляет собой такую композицию, которую получают при растворении лиофилизированной композиции белка слияния на основе КАСЕ в разбавителе, так что белок слияния на основе КАСЕ диспергируется и/или растворяется в восстановленной композиции. Восстановленная композиция может быть пригодна для введения (например, парентерального введения) пациенту, подлежащему лечению с использованием белка слияния, и в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может представлять собой композицию, подходящую для целей подкожного введения.
Термин изотоническая применительно к композиции обозначает такую представляющую интерес композицию, которая имеет осмотическое давление в диапазоне значений от примерно 240 до примерно 340 мосм./кг. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемая в нем изотоническая композиция представляет собой такую композицию, которая характеризуется осмотическим давлением, которое, по существу, соответствует таковому для человеческой крови (285-310 мосм./кг). Изотоничность можно измерить в рамках процедуры оценки давления пара или с помощью осмометра, позволяющего определить снижение точки замерзания.
Лиопротектор представляет собой такую молекулу, которая при ее объединении с белком слияния на основе КАСЕ, по существу, устраняет или снижает химическую и/или физическую нестабильность белка при его лиофилизации и последующем хранении. Иллюстративные лиопротекторы включают сахара, такие как сахароза или трегалоза; полиол, такой как сахарные спирты, например эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит или их сочетания. В одном варианте осуществления настоящего изобретения лиопротектор может включать сахар. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лиопротектор может включать невосстанавливающий сахар. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лиопротектор может включать невосстанавливающий сахар, такой как сахароза. Указанный лиопротектор может добавляться к предварительно лиофилизированной композиции в лиопротектор
- 10 017291 ном количестве, что означает, что после лиофилизации белка в присутствии лиопротекторного количества лиопротектора, белок слияния на основе КАСЕ, по существу, сохраняет свою физическую и химическую стабильность, а также биологическую активность при лиофилизации и хранении.
Термин разбавитель для лиофилизированной композиции согласно настоящему изобретению представляет собой такой разбавитель, который является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным при введении человеку) и который используется для изготовления восстановленной композиции. Иллюстративные разбавители включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекций (ВАН), забуференный по рН раствор (например, фосфатно-буферный раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный разбавитель обеспечивает получение восстановленной композиции, пригодной для инъекций. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, где указанный разбавитель обеспечивает получение восстановленной композиции, пригодной для инъекций, указанный разбавитель может включать воду для инъекций (АН).
Термин консервант для восстановленной композиции согласно настоящему изобретению представляет собой соединение, которое может быть добавлено к разбавителю или к восстановленной композиции для снижения, по существу, бактериального воздействия в восстановленной композиции. В одном варианте осуществления настоящего изобретения количество добавляемого консерванта может быть таким количеством, которое используется с целью облегчения производства восстановленной композиции для множественного применения. Примеры возможных консервантов включают хлорид октадецилметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилметиламмония, в которых алкильные группы представлены длинноцепочечными соединениями) и хлорид бензетония. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, аллилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол.
Термин наполнитель для лиофилизированной композиции согласно настоящему изобретению представляет собой соединение, которое вносит дополнительную массу в лиофилизированную смесь и поддерживает физическую структуру лиофилизированной лепешки (например, облегчает получение, по существу, однородной лиофилизированной лепешки, которая сохраняет структуру с открытыми порами). Иллюстративные наполнители включают, без ограничения, маннит, глицин и ксорбитол.
Белки слияния на основе КАСЕ.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают белки слияния на основе КАСЕ, способы получения таких белков слияния и способы использования таких белков слияния. Настоящее изобретение может осуществляться множеством способов.
Так, например, варианты настоящего изобретения относятся к белкам слияния на основе КАСЕ, включающим полипептид КАСЕ, присоединенный к второму полипептиду, отличному от КАСЕ. В одном варианте белки слияния на основе КАСЕ могут включать сайт связывания лиганда КАСЕ. В одном варианте осуществления изобретения сайт связывания лиганда включает самый Ν-концевой домен белка слияния КАСЕ. Сайт связывания лиганда КАСЕ может включать V домен КАСЕ или его часть. В этом варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8 ЕС ΙΌ N0: 9 или последовательность, на 90% ей идентичную, или 8ЕС Ш N0: 10 или последовательность, на 90% ей идентичную, или 8ЕС ΙΌ N0: 47 или последовательность, на 90% ей идентичную (фиг. 1).
В одном варианте полипептид КАСЕ может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или его часть (например, фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть одного из СН2 или СН3 доменов человеческого 1дС.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белок слияния на основе КАСЕ включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 56 или 8ЕС ΙΌ N0: 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей. Так, например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична 8ЕС ΙΌ N0: 56 или 8ЕС ΙΌ N0: 57, включает последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 56 или 8ЕС ΙΌ N0: 57 без С-концевого лизина.
Белок или полипептид КАСЕ может включать человеческий белок КАСЕ полной длины (например, 8ЕС ΙΌ N0: 1) или фрагмент человеческого КАСЕ. В контексте настоящего описания фрагмент полипептида КАСЕ составляет по меньшей мере 5 аминокислот в длину, может включать более 30 аминокислот в длину, но имеет длину меньше, чем полная аминокислотная последовательность. В альтернативных вариантах, относящихся к белкам слияния, композициям и способам согласно настоящему изобретению, полипептид КАСЕ может включать последовательность, которая на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична человеческому КАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ или его фрагмент, при этом, скорее, первым остатком будет глицин, а не метионин (см., например, №ерет с1 а1., (1992)). Или в другом варианте человеческий КАСЕ может включать КАСЕ полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС ΙΌ
- 11 017291
N0: 2 или 8ЕС ГО N0: 3) (фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности.
Белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут также включать &КАСЕ (например, 8 ЕС ГО N0: 4), полипептид, который на 90% идентичен кКАСЕ, или фрагмент кКАСЕ. В контексте настоящего описания &КАСЕ или белок КАСЕ не включает трансмембранный участок или цитоплазматический хвостовой фрагмент (Рагк с1 а1., №11игс Мей., 4: 1025-1031 (1998)). Так, например, полипептид КАСЕ может включать человеческий &КАСЕ или его фрагмент, при этом в первом положении будет находиться, скорее, глицин, а не метионин (см, например, №ерет е1 а1., (1992)). Или полипептид КАСЕ может включать человеческий &КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (см., например, 8ЕС ГО N0: 5, или 8ЕС ГО N0: 6, или 8ЕС ГО N0: 45 (фиг. 1)) или может включать часть указанной аминокислотной последовательности.
В других вариантах белок КАСЕ может включать V домен КАСЕ (см., например, 8ЕС ГО N0: 7, 8ЕС ГО N0: 8 или 8ЕС ГО N0: 46, фиг. 1) (№ерет е1 а1., (1992); 8с1ишй1 е1 а1., (1997)). Или может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену КАСЕ или его фрагменту.
Или, в другом варианте, белок КАСЕ может включать V домен КАСЕ (например, 8ЕС ГО N0: 9, 8ЕС ГО N0: 10 или 8ЕС ГО N0: 47, фиг. 1). В одном варианте белок КАСЕ может включать сайт связывания лиганда. В этом варианте сайт связывания лиганда может включать 8ЕС ГО N0: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕС ГО N0: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕС ГО N0: 47 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей. В еще одном варианте фрагмент КАСЕ представляет собой синтетический пептид.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 23-53 из 8ЕС ГО N0: 1 (фиг. 1). В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 24-52 из 8ЕС ГО N0: 1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 31-52 из 8ЕС ГО N0: 1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 31-116 из 8ЕС ГО N0: 1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 19-52 из 8ЕС ГО N0: 1. Например, сайт связывания лиганда может включать V домен КАСЕ или его часть, такую как домен связывания лиганда КАСЕ (например, аминокислоты на участках 1-118, 23-118, 24-118, 31-118, 1-116, 23116, 24-116, 31-116, 1-54, 23-54, 24-54, 31-54, 1-53, 23-53, 24-53 или 31-53 из 8ЕС ГО N0: 1 или фрагменты указанных участков). Или могут использоваться фрагменты полипептидов, которые способны функционально связываться с лигандом КАСЕ. Или, в другом варианте, может использоваться последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична V домену КАСЕ или его фрагменту (как было описано выше). Кроме того, как известно в данной области, в тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где №конец белка слияния представлен глютамином, например, как в случае удаления сигнальной последовательности, включающей остатки 1-23 из 8ЕС ГО N0: 1 (например, С24 в случае полипептида, включающего аминокислоты 24-118 или 8ЕС ГО N0: 1), такой глютамин может быть циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты (рЕ).
Таким образом, полипептид КАСЕ, используемый в белках слияния согласно настоящему изобретению, может включать фрагмент КАСЕ полной длины. Как известно в данной области, КАСЕ включает трехдоменный полипептид иммуноглобулинового типа, в который входят V домен и С1 и С2 домены, каждый из которых соединен друг с другом с помощью междоменного линкера. КАСЕ полной длины также включает трансмембранный полипептид и цитоплазматический хвостовой фрагмент в направлении считывания информации (С-концевой) С2 домена и присоединен к С2 домену.
В одном варианте полипептид КАСЕ не включает какие-либо остатки сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может включать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 из КАСЕ полной длины. Кроме того, как известно в данной области, в тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где вконец белка слияния представлен глютамином (например, в случае удаления сигнальной последовательности, включающей остатки 1-23), ^концевой глютамин (С24) может быть циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты (рЕ). Примеры соответствующих конструкций таких молекул включают полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в виде 8ЕС ГО N0: 45, 46, 47, 48, 49, 50 и 51 (фиг. 1), а также белки слияния на основе КАСЕ, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в виде 8ЕС ГО N0: 56 и 57 (фиг. 4).
Как известно в данной области, Сн3 участок белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать С-концевую аминокислоту, выщепляемую в ходе посттрансляционной модификации, при экспрессии в некоторых рекомбинантных системах (см., например, Ь1, е1 а1., ВюРтосе881ид 1., 4:23-30 (2005)). В одном варианте осуществления настоящего изобретения выщепляемая Сконцевая аминокислота представляет собой лизин (К). Таким образом, в альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ГО N0: 32-37, 56 и 57 без С-концевого лизина (К).
Таким образом, в разных вариантах осуществления настоящего изобретения полипептид КАСЕ
- 12 017291 может включать аминокислоты 23-116 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 7) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты 24-116 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 8) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты 24-116 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ГО N0: 46), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую V домену КАСЕ. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 124-221 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 11) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую С1 домену КАСЕ. В другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 227317 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 12) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую С2 домену КАСЕ. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-123 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 13) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-123 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 14) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 24-123 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ГО N0: 48), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-226 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 17) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-226 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 18) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую V домену, С1 домену и междоменному линкеру, соединяющему указанные два домена. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 24-226 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ГО N0: 50), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-339 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 5) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-339 из человеческого КАСЕ (8Е0 ГО N0: 6) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую вКАСЕ (т.е. кодирующую V, С1 и С2 домены и междоменные линкеры). Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 24-339 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ГО N0: 45), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей.
Аминокислотные последовательности этих полипептидов приведены на фиг. 1.
Белок слияния на основе КАСЕ может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния на основе КАСЕ может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. В одном варианте иммуноглобулиновый полипептид может включать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть (т.е. фрагмент). Например, фрагмент тяжелой цепи может включать полипептид, полученный из Бе-фрагмента иммуноглобулина, где фрагмент Бе включает шарнирную область тяжелой цепи полипептида и Сн2 и Сн3 домены тяжелой цепи иммуноглобулина в качестве мономера. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотопа: 1дС(у), Ι^Μ(μ), Ι§Ό(δ), 1дЕ(е) или 1дА(а). Дополнительно тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелой цепи: 1дС1(у1), 1дС2(у2), 1дС3(у3), 1дС4(',4). 1дА1(а1), 1дА2(а2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены Сн2 и Сн3 человеческого 1дС1, или любую часть, или оба указанных домена. В качестве примера варианта осуществления полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 человеческого 1дС1 или их фрагмент, может включать 8Е0 ГО N0: 40 (фиг. 1) или ее часть. В качестве иллюстративного варианта можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого 1дС1 или их часть, которая может включать 8Е0 ГО N0: 38 или его фрагмент. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0: 39 или 8Е0 ГО N0: 41 (фиг. 1). Иммуноглобулиновая последовательность, соответствующая 8Е0 ГО N0: 38 или 8Е0 ГО N0: 40, может также кодироваться 8Е0 ГО N0: 52 или 8Е0 ГО N0: 53 (фиг. 1), где молчащие изменения оснований в кодонах, которые кодируют пролин (ССС на ССС) и глицин (ССТ на ССС) на С-конце последовательности удаляют сайт сплайсинга криптической РНК возле концевого кодона (например, нуклеотиды 622-627 из 8Е0 ГО N0: 39 модифицируют с получением 8Е0 ГО N0: 52 или нуклеотиды 652-657 из 8Е0 ГО N0: 41 модифицируют с получением 8Е0 ГО N0: 53).
Шарнирный участок Бс части цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием ίη νίνο. Так, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не из шарнирной области междоменного полипептида, полученного из иммуноглобулина.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белок слияния на основе КАСЕ может также включать полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипеп
- 13 017291 тиду, включающему Сц2 домен иммуноглобулина или фрагмент или часть Сц2 домена иммуноглобулина. В одном варианте Сн2 домен или его фрагмент может включать 8ЕС ГО N0: 42 (фиг. 1). В одном варианте фрагмент 8ЕС ΙΌ N0: 42 включает последовательность 8ЕС ГО N0: 42, в которой удалены первые десять аминокислот, включающих по меньшей мере часть шарнирного участка Ес. В одном варианте полипептид ВАСЕ может включать сайт связывания лиганда. Сайт связывания лиганда ВАСЕ может включать V домен ВАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда ВАСЕ включает 8ЕС ГО N0: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕС ГО N0: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична, или 8ЕС ГО N0: 47 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
Полипептид ВАСЕ, используемый в белках слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению, может включать иммуноглобулиновый домен ВАСЕ. Дополнительно или альтернативно, фрагмент ВАСЕ может включать междоменный линкер. Или в другом варианте полипептид ВАСЕ может включать иммуноглобулиновый домен ВАСЕ, присоединенный против направления считывания информации (т.е. ближе к №концу) или в направлении считывания информации (т.е. ближе к С-концу) междоменного линкера. В еще одном варианте полипептид ВАСЕ может включать два (или более) иммуноглобулиновых домена ВАСЕ, которые соединяются друг с другом с помощью междоменного линкера. Полипептид ВАСЕ может также включать ВАСЕ с множеством иммуноглобулиновых доменов, соединенных друг с другом с помощью одного или нескольких междоменных линкеров и содержащих концевой междоменный линкер, присоединенный к ^концевому иммуноглобулиновому домену ВАСЕ и/или к Сконцевому домену иммуноглобулина. Дополнительные сочетания иммуноглобулиновых доменов ВАСЕ и междоменных линкеров также входят в область настоящего изобретения.
В одном варианте полипептид ВАСЕ включает междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к ^концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий Сн2 домен иммуноглобулина, может включать Сн2 и Сн3 домены человеческого 1дС 1, или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве иллюстративного варианта можно указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены или их часть из человеческого 1дС 1, который может включать 8ЕС ГО N0: 40 или его часть. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены из человеческого 1дС1 или их часть, может включать 8ЕС ГО N0: 38 или ее фрагмент. Или в другом варианте человеческий 1дС1 может включать 8ЕС ГО N0: 38 или 8ЕС ГО N0: 40 с удаленным концевым лизином (К).
Как было указано выше, белок слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из ВАСЕ. Кроме того, полипептид ВАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к полипептидному домену ВАСЕ, может включать фрагмент белка ВАСЕ полной длины. Например, полипептид ВАСЕ может включать аминокислоты 23-136 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ГО N0: 15) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-136 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ГО N0: 16) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-136 из человеческого ВАСЕ, где С24 циклизуется с образованием рЕ (8ЕС ГО N0: 49), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую V домену ВАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или в другом варианте полипептид ВАСЕ может включать аминокислоты 23-251 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ГО N0: 19) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-251 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ГО N0: 20) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты 24-251 из человеческого ВАСЕ, где С24 циклизуется с образованием рЕ (8ЕС ГО N0: 51), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, соединяющему два домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации для С1.
Например, в одном варианте белок слияния на основе ВАСЕ может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес полипептида человека. Белок слияния на основе ВАСЕ может включать первый иммуноглобулиновый домен ВАСЕ и первый междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к второму иммуноглобулиновому домену ВАСЕ и второму междоменному линкеру ВАСЕ, так что ^концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулиновового домена ВАСЕ, ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к Сконцевой аминокислоте первого междоменного линкера, ^концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к Иконцевой аминокислоте Сн2 домена иммуноглобулина. В альтернативных вариантах, четырехдоменный белок слияния на основе ВАСЕ кодируется 8ЕС ГО N0:30 или 8ЕС ГО N0:54 (фиг. 2). В одном варианте четыре домена белка слияния на основе ВАСЕ могут включать 8ЕС ГО N0:32 (фиг. 4). В альтернативных
- 14 017291 вариантах четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ включает 8ЕО ΙΌ N0:33, 8Е0 ΙΌ N0:34 или 8Е0 ΙΌ N0:56 (фиг. 4).
Альтернативно, трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес полипептида человека. Например, белок слияния на основе КАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к Ν-концевой аминокислоте Сц2 домена иммуноглобулина или части Сц2 домена иммуноглобулина. В альтернативных вариантах трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ кодируется 8Е0 ΙΌ N0:31 или 8Е0 ΙΌ N0:55 (фиг. 3). В одном варианте трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0:35 (фиг. 5). В альтернативных вариантах трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0:36, или 8ЕО ΙΌ N0:37, или 8ЕО ΙΌ N0:57 (фиг. 5).
Фрагмент междоменного линкера КАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует считыванию в направлении транскрипции в естественном состоянии, и, таким образом, присоединяется к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. Например, в случае V домена КАСЕ междоменный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые считываются в естественном состоянии в направлении транскрипции V домена. В одном варианте линкер может включать последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 КАСЕ полной длины. Или в другом варианте линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации для 8Е0 ΙΌ N0: 21. Таким образом, в одном варианте междоменный линкер включает 8Е0 ΙΌ N0: 23 включает аминокислоты на участке 117-136 из КАСЕ полной длины. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 21 или 8Е0 ΙΌ N0: 23.
В случае С1-домена КАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которая считывается в естественном варианте по направлению транскрипции С1-домена. В этом варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 из КАСЕ полной длины. Или в другом варианте линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления считывания или в направления считывания информации для 8Е0 ΙΌ N0: 22. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер КАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. В альтернативных вариантах указанный линкер может включать пептид, который по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен 8ЕО ΙΌ N0: 22 или 8ЕО ΙΌ N0: 24.
Или междоменный линкер может включать последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 44, которая соответствует аминокислотам на участке 318-342. В альтернативных вариантах, указанный линкер может включать пептид, который по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен 8Е0 ΙΌ N0: 44.
Кроме того, для специалистов в данной области очевидно, что отдельные замещения, делеции или добавки, которые изменяют, добавляют или делетируют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот (в типичном случае, менее чем примерно 5%, чаще менее чем примерно 1%) в кодируемой последовательности, представляют собой консервативные вариации, где указанные изменения приводят к замещению одной аминокислоты другой, химически близкой аминокислотой. Таблицы, описывающие консервативные варианты замещений с получением функционально близких аминокислот, известны в данной области. Приведеннные ниже группы описывают те аминокислоты, которые могут рассматриваться в контексте консервативных замещений друг для друга:
1) алании (А), серин (8), треонин (Т);
2) аспарагиновая кислота (Ό), глютаминовая кислота (Е);
3) аспарагин (Ц), глютамин (О);
4) аргинин (К), лизин (К);
5) изолейцин (Ι), лейцин (Ь), метионин (М), валин (V) и
6) фенилаланин (Е), тирозин (Υ), триптофан (^).
Консервативное замещение представляет собой замещение, в рамках которого замещающая аминокислота (природная или модифицированная) структурно близка замещаемой аминокислоте, т.е. она имеет примерно тот же размер и характеризуется такими же электронными свойствами, что и замещаемая аминокислота. Так, замещающая аминокислота будет иметь такую же или близкую функциональную группу в боковой цепи, что и исходная аминокислота. Термин консервативное замещение таже относится к использованию замещающей аминокислоты, которая идентична замещаемой, с тем исключением,
- 15 017291 что функциональная группа в боковой цепи защищена подходящей защитной группой.
Как известно в данной области, аминокислоты могут быть химически модифицированы относительно их природной структуры с использованием для этого механизмов, основанных либо на энзиматических, либо на неэнзиматических реакциях.
Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения Ν-концевая аминокислота или Ν-концевой глютамин могут быть циклизованы при потере воды с образованием пироглютаминовой кислоты (ругоЕ или рЕ) (Сйе1ш8 с1 а1., Апа1. Спег, 78: 2370-2376 (2006); и Вигйет с1 а1., Ργοο. Νηΐίοηηΐ Асаб. 8си, 73:2604-2608 (1976)). Альтернативно, в случае белка слияния, содержащего на Ν-конце пироглютаминовую кислоту, потенциальный вариант доступа может быть связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей глутаминовую кислоту, в том положении на белке, которое в результате посттрансляционного процессинга становится Ν-концом (например, где остаток 24 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 представлен, скорее, глютаматом, а не глютамином).
Способы получения белков слияния на основе ВАСЕ.
Настоящее изобретение также относится к способу получения белка слияния на основе ВАСЕ. Так, в одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения белка слияния на основе ВАСЕ, включающему стадию ковалентного присоединения полипептида ВАСЕ, присоединенного к второму полипептиду, отличному от ВАСЕ, где полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда ВАСЕ. Например, присоединенный полипептид ВАСЕ и второй полипептид, отличный от ВАСЕ, могут кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Данный способ также относится к стадии включения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Кроме того, указанный способ может включать стадию введения вектора экспрессии в клетку-хозяина.
Например, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к белкам слияния на основе ВАСЕ, включающим полипептид ВАСЕ, присоединенный к второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте белок слияния на основе ВАСЕ может включать сайт связывания лиганда ВАСЕ. В одном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть Ν-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда ВАСЕ может включать V домен ВАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда ВАСЕ включает 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или 8ЕО Ш ΝΟ: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 47 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична.
В одном варианте полипептид ВАСЕ может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (т.е. его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из доменов СН2 или СН3 доменов человеческого 1дС.
Таким образом, разные варианты осуществления настоящего изобретения могут включать выделенные молекулы ДНК, которые кодируют белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах молекулы ДНК кодируют белок слияния на основе ВАСЕ, который включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 56 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% ей идентична. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 56 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 57, включает последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 56 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 57 без С-концевого лизина. Так, в некоторых вариантах своего осуществления настоящее изобретения может включать молекулу ДНК, с последовательностью, которая показана в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 54 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 55, или включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична.
Белок слияния на основе ВАСЕ может быть получен в рамках генноинженерной стратегии с использованием методик рекомбинантной ДНК. Например, в одном варианте настоящее изобретение может включать выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид ВАСЕ, присоединенный к второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте полипептид ВАСЕ может включать сайт связывания лиганда ВАСЕ.
Белок или полипептид ВАСЕ может включать человеческий ВАСЕ полной длины (например, 8ЕО Ш ΝΟ: 1) или фрагмент человеческого ВАСЕ. В одном варианте полипептид ВАСЕ не включает какиелибо остатки из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность ВАСЕ может включать остатки 1-22 или остатки 1-23 из полноразмерного ВАСЕ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1). В альтернативных вариантах полипептид ВАСЕ может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична человеческому ВАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид ВАСЕ может включать человеческий ВАСЕ или его фрагмент, в котором содержится в качестве первого остатка скорее глицин, а не метионин (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или в другом варианте человеческий ВАСЕ может включать полноразмерный ВАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3) (фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут также включать кВАСЕ (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4) или полипептид, который на 90% идентичен кВАСЕ или фрагменту кВАСЕ. Например, полипептид ВАСЕ может включать человеческий кВАСЕ или
- 16 017291 его фрагмент, при этом в качестве первого остатка содержится скорее глицин, а не метионин (см., например, №ерег е! а1., (1992)). Или в другом варианте человеческий КАСЕ может включать кКАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (см., например, 8Е0 ΙΌ N0: 5, 8Е0 ГО N0: 6 или 8Е0 ГО N0: 45, фиг. 1) или часть такой аминокислотной последовательности. В других вариантах белок КАСЕ может включать V домен (например, 8Е0 ГО N0: 7, 8Е0 ГО N0: 8 или 8Е0 ГО N0: 46, фиг. 1). Или в другом варианте может использоваться последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или в другом варианте белок КАСЕ может включать фрагмент КАСЕ, включающий часть V домена (например, 8Е0 ГО N0: 9, 8Е0 ГО N0: 10 или 8Е0 ГО N0: 47, фиг. 1). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать 8Е0 ГО N0: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8Е0 ГО N0: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8Е0 ГО N0: 47 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей. В еще одном варианте фрагмент КАСЕ представляет собой синтетический пептид.
В одном варианте последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность 8Е0 ГО N0: 25, которая кодирует аминокислоты на участке 1-118 из человеческого КАСЕ или его фрагмента. Например, может использоваться последовательность, включающая нуклеотиды 1-348 из 8Е0 ГО N0: 25, которая кодирует аминокислоты на участке 1-116 из человеческого КАСЕ. Или в другом варианте нуклеиновая кислота может включать последовательность 8Е0 ГО N0: 26, которая кодирует аминокислоты на участке 1-123 из человеческого КАСЕ. Или в другом варианте нуклеиновая кислота может включать последовательность 8Е0 ГО N0: 27, которая кодирует аминокислоты 1-136 из человеческого КАСЕ. Или в другом варианте нуклеиновая кислота может включать последовательность 8Е0 ГО N0: 28, которая кодирует аминокислоты 1-120 из человеческого КАСЕ. Или в другом варианте нуклеиновая кислота может включать последовательность 8Е0 ГО N0: 29, которая кодирует аминокислоты на участке 1-251 из человеческого КАСЕ. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты указанных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют фрагменты полипептида КАСЕ.
Белок слияния на основе КАСЕ может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния на основе КАСЕ может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина (или ее часть) может быть получена из любого известного изотипа тяжелой цепи 1дС(у), 1дМ(ц), 1дО(5), 1дЕ(е) или 1дА(а). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелых цепей: 1дС1(у1), 1дС2(у2), 1дС3(у3), 1дС4(у4), 1дА1(а1), 1дА2(а2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, содержащих мутации, которые меняют биологическую активность. Второй полипептид может включать Сн2 и Сн3 домены человеческого 1дС1, или часть любого из них, или оба указанных домена. В качестве иллюстративных вариантов можно указать полипептид, включающий домены Сц2 и Сн3 из человеческого 1дС1 или их часть, который может включать 8Е0 ГО N0: 38 или 8Е0 ГО N0: 40. В одном варианте полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого 1дС1 или их часть, может включать 8Е0 ГО N0: 38 или ее фрагмент. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0: 39 или 8Е0 ГО N0: 41. В альтернативных вариантах иммуноглобулиновая последовательность 8Е0 ГО N0: 38 или 8Е0 ГО N0: 40 может также кодироваться 8Е0 ГО N0: 52 или 8Е0 ГО N0: 53 соответственно.
Бс-часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием ш у1уо. Так, белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать междоменный линкер, полученный из КАСЕ, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения белка слияния на основе КАСЕ, который включает стадию ковалентного присоединения полипептида КАСЕ к полипептиду, включающему домен Сн2 иммуноглобулина или часть домена Сн2 иммуноглобулина. В одном варианте белок слияния на основе КАСЕ может включать сайт связывания лиганда КАСЕ. Сайт связывания лиганда КАСЕ может также включать V домен КАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8Е0 ГО N0: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8Е0 ГО N0: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична, или 8Е0 ГО N0: 47 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения белок слияния может кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Данный способ может включать стадию введения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Кроме того, рассматриваемый способ может включать трансфекцию вектора экспрессии в клетку-хозяина. Таким образом, разные варианты осуществления настоящего изобретения также включают векторы экспрессии с кодирующими молекулами ДНК, которые кодируют белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах молекулы ДНК кодируют белок слияния на основе КАСЕ, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 56 или 8Е0 ГО N0: 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей. Например, в некоторых вариантах последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Е0 ГО N0: 56 или 8Е0 ГО N0: 57, включает после
- 17 017291 довательность 8ЕО ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57 без С-концевого лизина.
Еще другие варианты осуществления настоящего изобретения включают клетки. трансфицированные вектором экспрессии с кодирующими молекулами ДНК. которые кодируют белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах молекулы ДНК кодируют белок слияния на основе КАСЕ. включающий аминокислотную последовательность. представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57. или последовательность. которая по меньшей мере на 70. 75. 80. 85. 90. 95. 96. 97. 98 или 99% идентична ей. Например. в некоторых вариантах последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57. включает последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 56 или 8Е0 ΙΌ N0: 57 без С-концевого лизина.
Например. в одном варианте настоящее изобретение включает нуклеиновую кислоту. кодирующую пептид КАСЕ. непосредственно присоединенный к полипептиду. включающему Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления изобретения Сн2 домен или его фрагмент включает 8Е0 ΙΌ N0: 42. В одном варианте фрагмент 8Е0 ΙΌ N0: 42 включает последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 42. в которой удалены первые десять аминокислот. Второй полипептид может включать Сн2 и Сн3 домены из человеческого Ι§01. В рамках иллюстративных вариантов осуществления изобретения полипептид. содержащий домены Сн2 и Сн3 из человеческого Ι§01. может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40. В одном варианте полипептид. включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ1 или их часть. может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или ее фрагмент. Пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 39 или 8Е0 ΙΌ N0: 41. Иммуноглобулиновая последовательность. соответствующая 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40. может также кодироваться последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 52 или 8Е0 ΙΌ N0: 53. где молчащие изменения оснований в кодонах. которые кодируют пролин (ССС на ССС) и глицин (ССТ на ССС) на С-конце последовательности. удаляют сайт сплайсинга криптической РНК возле концевого кодона (например. нуклеотиды 622627 из 8Е0 ΙΌ N0: 39 модифицируют с получением 8Е0 ЕО N0: 52 или нуклеотиды 652-657 из 8Е0 ΙΌ N0: 41 модифицируют с получением 8Е0 ΙΌ N0: 53).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид КАСЕ может включать междоменный линкер КАСЕ. присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. так что Сконцевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к №концевой аминокислоте междоменного линкера. и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида. включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид. включающий Сн2 домен иммуноглобулина или его часть. может включать полипептид. включающий Сн2 и Сн3 домены из человеческого ΙβΟ1 или часть одного или обоих из указанных доменов. В рамках иллюстративных вариантов осуществления изобретения полипептид. включающий Сн2 и Сн3 домены из человеческого ΙβΟ1 и их часть. может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40. В одном варианте полипептид. включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ1 или их часть. может включать последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 38 или ее часть. В некоторых вариантах полипептид. включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ1 или их часть. может включать последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40 с удаленным С-концевым лизином (К).
Белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов КАСЕ. Кроме того. полипептид КАСЕ. включающий междоменный линкер. присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. может включать фрагмент белка КАСЕ полной длины. Например. в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена. полученных из белка КАСЕ. и два иммуноглобулиновых домена. полученных из Ес человеческого полипептида. Белок слияния на основе КАСЕ может включать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер. присоединенный к второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ. так что ^концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ. ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера. ^концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида. включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Например. полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-251 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 19) или последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична ей. или аминокислоты на участке 24-251 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 20) или последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична ей. или аминокислоты на участке 24-251 человеческого КАСЕ. где 024 циклизуют с образованием рЕ (8Е0 ΙΌ N0: 51). или последовательность. которая по меньшей мере на 90% идентична ей. соответствующую V домену. С1 домену. междоменному линкеру. связывающему два указанных домена. и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации С1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты. включающая 8Е0 ΙΌ N0: 30 или его фрагмент. может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ (фиг. 2А). В другом варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой ки
- 18 017291 слоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 54 (фиг. 2В), может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, где введены молчащие изменения оснований в кодонах, которые кодируют пролин (ССС на ССС) и глицин (ССТ на ССС) на С-конце последовательности, для удаления сайта сплайсинга криптической РНК возле концевого кодона (например, нуклеотиды 1375-1380 из 8Е0 ΙΌ N0: 30 модифицируют с получением 8Е0 ΙΌ N0: 54).
Альтернативно, трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес человеческого полипептида. Например, белок слияния на основе КАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домен СН2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-136 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24136 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-136 человеческого КАСЕ, где 024 циклизуют с образованием рЕ (8Е0 ΙΌ N0: 49), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 Ш N0: 31 или ее фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ (фиг. 3А). В другом варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 55, может кодировать трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, где введены молчащие изменения оснований в кодонах, которые кодируют пролин (ССС на ССС) и глицин (ССТ на ССС) на С-конце последовательности, для удаления сайта сплайсинга криптической РНК возле концевого кодона (например, нуклеотиды 1030-1035 из 8Е0 ΙΌ N0: 31 модифицируют с получением 8Е0 ΙΌ N0: 55) (фиг. 3В).
Фрагмент междоменного линкера КАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии и которая, таким образом, присоединена к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. Например, в случае V домена КАСЕ, междоменный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые соответствуют направлению считывания информации из V домена. В одном варианте указанный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 полноразмерного КАСЕ. Или в другом варианте линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления и в направлении считывания информации из 8Е0 ΙΌ N0: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает 8Е0 Ш N0: 23, включающую аминокислоты на участке 117-136 из полноразмерного КАСЕ. Или могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 21, содержащие делецию из 1, 2, или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 21 или 8Е0 ΙΌ N0: 23.
В случае С1 домена КАСЕ указанный линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует естественному направлению считывания информации из С1 домена. В одном варианте указанный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 полноразмерного КАСЕ. Или в другом варианте указанный линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления и в направлении считывания информации из 8Е0 ΙΌ N0: 22. Или могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте, междоменный линкер КАСЕ может включать 8Е0 Ш N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. В альтернативных вариантах, указанный линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 22 или 8Е0 ΙΌ N0: 24.
Или в другом варианте междоменный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из КАСЕ. В альтернативных вариантах указанный линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 44.
Описываемый способ может также включать стадию введения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Так, в одном варианте своего осуществления настоящее изобретение включает вектор экспрессии, который кодирует белок слияния на основе КАСЕ, включающий полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему домен СН2 иммуноглобулина или часть домена СН2 иммуноглобулина. В одном варианте полипептид КАСЕ включает конструкции, такие как приведенные в настоящем описании, содержащие междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоеди
- 19 017291 нена к Ν-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к Ν-концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, вектор экспрессии, используемый для трансфекции клеток, может включать последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕО ΙΌ N0: 30 или ее фрагмент, 8Е0 ΙΌ N0: 54 или ее фрагмент, 8Е0 ΙΌ N0: 31 или ее фрагмент или 8Е0 ΙΌ N0: 55 или ее фрагмент.
Рассматриваемый способ может также включать стадию трансфекции клетки вектором экспрессии согласно настоящему изобретению. Так, в одном варианте своего осуществления настоящее изобретение включает клетку, трансфицированную вектором экспрессии, который экспрессирует белок слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению, так что клетка экспрессирует белок слияния на основе ВАСЕ, включающий полипептид ВАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домена иммуноглобулина. В одном варианте полипептид ВАСЕ включает конструкции, такие как приведенные в настоящем описании конструкции, содержащие междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, так что Сконцевая аминокислота иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к ^концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, вектор экспрессии может включать последовательность нуклеиновой кислоты 8Е0 Ш N0: 30 или ее фрагмент, 8Е0 ΙΌ N0: 54 или ее фрагмент, 8Е0 ΙΌ N0: 31 или ее фрагмент или 8Е0 ΙΌ N0: 55 или ее фрагмент.
Например, плазмиды могут быть сконструированы таким образом, что они будут экспрессировать белки слияния ВАСЕЛдС, получаемые путем объединения 5'-последовательностей кДНК различной длины для человеческого ВАСЕ с 3'-последовательностью кДНК человеческого Ιβ61 Ес(у1). Последовательности кассет экспрессии могут быть вставлены в вектор экспрессии, такой как вектор экспрессии рс^NА3.1 (ΙηνίΙΐΌβοη. СА) с использованием стандартных рекомбинантных методик.
Кроме того, описываемый способ может включать трансфекцию вектора экспрессии в клеткухозяин. Белки слияния на основе ВАСЕ могут быть экспрессированы в системах экспрессии млекопитающих, включая системы, в рамках которых векторы экспрессии вводят в клетки млекопитающего с использованием вируса, такого как ретровирус или аденовирус. Клеточные линии млекопитающих, где указанные клетки доступны в качестве клеток-хозяев для проведения экспрессии, хорошо известны в данной области и включают большое число иммортализованных клеточных линий, доступных от Американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре СиЙиге Со11есНоп (АТСС)), Указанные линии включают, в числе других, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки N80, 8Р2, клетки НеЬа, клетки детенышей хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (С08), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер С2), клетки А549 и множество других клеточных линий. Клеточные линии могут быть отобраны по результатам определения, какие клеточные линии характеризуются высокими уровнями экспрессии белка слияния на основе ВАСЕ. Другие клеточные линии, которые также могут использоваться, включают клеточные линии насекомых, такие как 8Г9 клетки. Клетки-хозяева растений включают, например, клетки МсоБаиа, АгаЬ1Фор515, ряски, кукурузы, пшеницы, картофеля и т.п. Бактериальные клетки-хозяева включают клетки Е. сой и различные виды 81гер1отусе5. Клетки-хозяева дрожжей включают клетки 8с1и/о5асс11аготусе5 ротЬе, 8ассйаготусе5 сегеу151ае и РюЫа раЛогО. В том случае, когда в клетки-хозяева млекопитающего вводят рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие гены, кодирующие белки слияния на основе ВАСЕ, белки слияния на основе ВАСЕ получают при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии белка слияния на основе ВАСЕ в клетках-хозяевах, или при секреции белка слияния на основе ВАСЕ в культуральную среду, в которой растят клетки-хозяева. Белки слияния на основе ВАСЕ могут быть восстановлены из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белка.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки слияния на основе ВАСЕ, и векторы экспрессии, включающие указанные молекулы, могут использоваться для трансфекции подходящей клеткихозяина млекопитающего, растения, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Трансформация может быть осуществлена в рамках известных способов введения полинуклеотидов в клетку-хозяин. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающего известны в данной области и включают методы трансфекции с использованием декстрана, трансфекции, включающей осаждение фосфатом кальция, трансфекции, опосредованной использованием полибрена, путем слияния протопластов, с использованием метода электропорации, инкапсулирования одного или нескольких полинуклеотидов в липосомы и непосредственную микроинъекцию ДНК в ядра. Дополнительно молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки млекопитающего с помощью вирусных векторов. Способы трансформации растительных клеток известны в данной области и включают, например, трансформацию с использованием АдгоЬас1егшт, ЬюНкБс-трансформацию, непосредственную инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Способы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток также известны в данной области.
Вектор экспрессии также может быть доставлен в систему экспрессии с использованием технологии биолистики ДНК, в рамках которой плазмиду осаждают на микроскопические частицы, предпочти
- 20 017291 тельно частицы золота, и затем такие частицы направляют на целевую клетку или систему экспрессии. Стратегии на основе биолистики ДНК известны в данной области и коммерчески доступны устройства, например устройство для бомбардировки генов генное ружье, для доставки микрочастиц в клетку (например, доступные от компании Не1ю§ Сеие Сии, Βίο-Кай ЬаЬ§., Негси1е§, СА) и на кожу (РМЕБ Беуке, РотейегМей Ий., Ох&гй, ИК).
Экспрессия белков слияния на основе КАСЕ в клеточных линиях, способных к их продукции, может быть усилена с помощью большого числа известных методов. Например, в качестве таких принятых стратегий усиления экспрессии в определенных условиях может использоваться система экспрессии гена глютаминсинтетазы (С8 система) и система резистентности к неомицину, кодируемая на уровне плазмы.
Белки слияния на основе КАСЕ, экспрессируемые различными клеточными линиями, могут иметь свой отличный от других характер гликозилирования. Однако все белки слияния на основе КАСЕ, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или включающие аминокислотные последовательности согласно настоящему изобретению, являются составной частью изобретения независимо от характера гликозилирования белков слияния на основе КАСЕ.
В одном варианте рекомбинантный вектор экспрессии может быть трансфицирован в клетки яичника китайского хомяка (СНО), после чего проводится оптимизация экспрессии. В альтернативных вариантах клетки могут продуцировать от 0,1 до 20 г/л, или от 0,5 до 10 г/л, или примерно 1-2 г/л.
Как известно в данной области техники, такие конструкции нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы за счет мутаций, например путем ПЦР-амплификации матрицы нуклеиновой кислоты с использованием праймеров, включающих соответствующую мутацию. В рамках данного способа могут быть созданы полипептиды, включающие лиганды КАСЕ с варьирующей аффинностью. В одном варианте мутированные последовательности могут быть на 90% или более идентичны исходной ДНК. В качестве таковых варианты могут включать нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в жестких условиях (т.е. в условиях, эквивалентных примерно температуре 20-27°С ниже температуры плавления (Тпл) дуплекса ДНК в 1 молярном растворе соли).
Кодирующая последовательность может быть экспрессирована при трансфекции вектора экспрессии в соответствующую клетку-хозяина. Например, рекомбинантные векторы могут быть стабильно трансфицированы в клетки яичника китайского хомяка (СНО), после чего могут быть отобраны и клонированы клетки, экспрессирующие белок слияния на основе КАСЕ. В одном варианте клетки, экспрессирующие рекомбинантную конструкцию, отбирают по резистентности к неомицину, кодируемой плазмидой, при внесении антибиотика С418. При этом могут быть отобраны отдельные клоны и клоны, экспрессирующие высокие уровни рекомбинантного белка, выявленные по результатам вестерн-блот анализа клеточного супернатанта, могут быть размножены, а генный продукт далее очищен аффинной хроматографией с использованием колонок с белком А.
Некоторые варианты рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые кодируют белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению, показаны на фиг. 2 и 3. Например, в соответствии с приведенным выше описанием, белок слияния на основе КАСЕ, продуцируемый рекомбинантной конструкцией ДНК, может включать полипептид КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от полипептида КАСЕ. Белок слияния на основе КАСЕ может включать два домена, полученных из белка КАСЕ, и два домена, полученных из иммуноглобулина. Один из примеров конструкций нуклеиновой кислоты, кодирующих белок слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000 (ТТ4), имеющий указанный тип конструкции, показан на фиг. 2 (8ЕО 1Б ΝΟ: 30 и 8Е0 1Б ΝΟ: 54). Как следует из 8Е0 1Б N0: 30 и 8Е0 ГО N0: 54, кодирующая последовательность на участке 1-753 (выделенная жирным шрифтом) кодирует Ν-концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность на участке 754-1386 кодирует белковую последовательность 1дС Ес без шарнирной области.
В случае получения из 8Е0 ГО N0: 30 или 8Е0 ГО N0: 54 последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, белок слияния на основе КАСЕ может включать четырехдоменную аминокислотную последовательностью 8Е0 ГО N0: 32 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ГО N0: 33, 8Е0 ГО N0: 34 или 8Е0 ГО N0: 56, фиг. 4). В 8Е0 ГО N0: 33, 8Е0 ГО N0: 34 или 8Е0 ГО N0: 56 аминокислотная последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом. Иммуноглобулиновая последовательность представлена иммуноглобулиновыми доменами СН2 и СН3 из 1дС, без шарнирной области.
Как фиг. 6 проиллюстрированы результаты сравнения полипептидных доменов, имеющихся в КАСЕ и 1дС (фиг. 6А), а также показана доменная структура белков слияния на основе КАСЕ, ТТР-3000 и ТТР-4000. Как видно из фиг. 6В, первые 251 аминокислота в полноразмерном белке слияния ТТР-4000 КАСЕ содержит в качестве полипептидной последовательности КАСЕ сигнальную последовательность, включающую аминокислоты на участке 1-22/23, V домен иммуноглобулина (включая сайт связывания лиганда), включающий аминокислоты на участке 23/24-116, междоменный линкер, включающий аминокислоты 117-123, второй иммуноглобулиновый домен (С1), включающий аминокислоты на участке 124221 и междоменный линкер в направлении считывания информации, включающий аминокислоты на участке 222-251.
- 21 017291
В одном варианте белок слияния на основе ВАСЕ может необязательно включать второй иммуноглобулиновый домен ВАСЕ. Например, белок слияния на основе ВАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Рс. Пример конструкций нуклеиновой кислоты, кодирующих белки слияния на основе ВАСЕ данного типа, показан на фиг. 3 (ЪЕЦ ΙΌ N0: 31 и 8ЕЦ ΙΌ ν0: 55). Как следует из 8ЕЦ ГО N0: 31 и 8Е0 ГО N0: 55, кодирующая последовательность на участке нуклеотидов 1-408 (выделенная жирным шрифтом) кодирует Ν-концевую белковую последовательность ВАСЕ, а последовательность на участке 409-1041 кодирует белковую последовательность 1дС1 Рс(у1).
В случае получения из ЗЕЦ ГО N0: 31, или 8ЕЦ ГО N0: 55, или последовательности, которая по меньшей мере на 90% им идентична, белок слияния на основе ВАСЕ может включать трехдоменную аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 35 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (см., например, ЗЕЦ ГО N0: 36, 8ЕЦ ГО N0: 37 или 8ЕЦ ГО N0: 57, фиг. 5). Как показано на фиг. 5, в 8Е0 ГО N0: 35, 8ЕЦ ГО N0: 36, 8ЕЦ ГО N0: 37 или 8ЕЦ ГО N0: 57 аминокислотная последовательность ВАСЕ выделена жирным шрифтом. Как видно из фиг. 6В, первые 136 аминокислот в полноразмерном белке слияния на основе ВАСЕ, ТТР-3000, содержат в качестве полипептида ВАСЕ, сигнальную последовательность, включающую аминокислоты на участке 1-22/23, V домен иммуноглобулина (включая сайт связывания лиганда), включающий аминокислоты на участке 23/24-116, и междоменный линкер, включающий аминокислоты на участке 117-136. Последовательность на участке 137-346 включает иммуноглобулиновые домены Сн2 и Сн3 из 1дС, без шарнирной области.
Белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут демонстрировать повышенную стабильность ίη νί\Ό относительно полипептидов ВАСЕ, которые не содержат второй полипептид. Белок слияния на основе ВАСЕ может быть далее модифицирован для повышения стабильности, эффективности, активности и биологической доступности. Так, белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы за счет посттрансляционного процессинга или путем химической модификации. Например, белок слияния на основе ВАСЕ может быть получен в рамках процедур синтеза, так чтобы он включал Ь-, Ό- или неприродные аминокислоты, а-двузамещенные аминокислоты или №алкиламинокислоты. Дополнительно белки могут быть модифицированы путем ацетилирования, ацилирования, АДФ-рибозилирования, амидирования, присоединения липидов, таких как фосфатидилинозит, за счет образования дисульфидных связей и т.п. Кроме того, может быть добавлен полиэтиленгликоль для повышения биологической стабильности белка слияния на основе ВАСЕ.
Связывание антагонистов ВАСЕ с белками слияния на основе ВАСЕ.
Белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут найти применение в рамках различных стратегий. Например, белок слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться в тесте на связывание, для идентификации лигандов ВАСЕ, таких как агонисты, антагонисты или модуляторы ВАСЕ.
Например, в одном варианте настоящее изобретение относится к способу выявления модуляторов ВАСЕ, включающему (а) получение белка слияния на основе ВАСЕ, включающего полипептид ВАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ, где полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда; (Ь) смешивание исследуемого соединения и лиганда, обладающего связывающей аффинностью для ВАСЕ, с белком слияния на основе ВАСЕ; и (с) оценка уровня связывания известного лиганда ВАСЕ с белком слияния на основе ВАСЕ в присутствии исследуемого соединения. В данном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть ^концевого домена белка слияния на основе ВАСЕ. Белки слияния на основе ВАСЕ могут быть также представлены в виде наборов для выявления модуляторов ВАСЕ. Например, в одном варианте набор согласно настоящему изобретению может включать (а) соединение, обладающее уже выявленной связывающей аффинностью с ВАСЕ, в качестве позитивного контроля; (Ь) белок слияния на основе ВАСЕ, включающий полипептид ВАСЕ, присоединенный к второму полипептиду, отличному от ВАСЕ, где полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда ВАСЕ; и (с) инструкции по применению. В одном варианте сайт связывания лиганда ВАСЕ включает большую часть ^концевого домена белка слияния на основе ВАСЕ.
Например, белок слияния на основе ВАСЕ может использоваться в тесте на связывание для идентификации потенциальных лигандов ВАСЕ. В одном иллюстративном варианте такого теста на связывание известный лиганд ВАСЕ может быть нанесен на твердый субстрат (например, на планшеты Максисорб (Мах1еогЬ)) в концентрации примерно 5 мкг на ячейку, где каждая ячейка содержит общий объем примерно 100 мкл. Планшеты инкубируют при температуре 4°С в течение ночи для абсорбции лиганда. Альтернативно, могут использоваться более короткие сроки инкубации при более высоких температурах (например, при комнатной температуре). После истечения периода времени, необходимого для того, чтобы лиганд связался с субстратом, содержимое ячеек отсасывают и добавляют блокирующий буфер (например, 1% БСА в 50 мМ имидазольном буфере, рН 7,2) для блокирования неспецифического связывания. Например, блокирующий буфер может быть добавлен к планшетам на 1 ч при комнатной температуре. Далее содержимое ячеек в планшетах отсасывают и/или промывают промывочным буфером. В таком варианте может быть использован буфер, включающий 20 мМ имидазола, 150 мМ №С1, 0,05% Твин
- 22 017291
20, 5 мМ СаС12 и 5 мМ МдС12, рН 7,2, в качестве промывочного буфера. Далее к экспериментальным ячейкам может быть добавлен белок слияния на основе КАСЕ в возрастающих разведениях. После этого белок слияния на основе КАСЕ инкубируют в экспериментальных ячейках с иммобилизованным лигандом, так чтобы было достигнуто равновесие по связыванию. В одном варианте белок слияния на основе КАСЕ инкубируют с иммобилизованным лигандом примерно в течение 1 ч при температуре 37°С. В альтернативных вариантах используют более длительные периоды инкубации и при более низких температурах. По окончании инкубации белка слияния на основе КАСЕ и иммобилизованного лиганда планшет промывают для удаления несвязанного белка слияния. Связанный с иммобилизованным лигандом белок слияния на основе КАСЕ может быть выявлен различными способами. В одном варианте для такой детекции используют методику анализа по процедуре ЕЫ8А. Так, в одном варианте к белку слияния на основе КАСЕ, иммобилизованному в экспериментальной ячейке, может быть добавлен комплекс для иммунологической детекции, содержащий моноклональный мышиный 1дС1 против человеческого компонента, биотинилированный козий антимышиный 1дС и связанную с авидином щелочную фосфатазу. Комплекс для иммунологической детекции может быть подвергнут связыванию с иммобилизованным белком слияния на основе КАСЕ, так чтобы достигалось состояние равновесия в процессе связывания между белком слияния на основе КАСЕ и комплексом для иммунологической детекции. Например, указанный комплекс может быть подвергнут связывания с белком слияния на основе КАСЕ в течение 1 ч при комнатной температуре. В этой точке несвязанный комплекс может быть удален при промывке экспериментальных ячеек промывочным буфером. Связанный комплекс может быть выявлен при добавлении субстрата щелочной фосфатазы, паранитрофенилфосфата (ПНФФ (Р\РР)) с последующим измерением уровня превращения ПНФФ в паранитрофенол (ПНФ (РИР)), определяемого как повышение поглощения при длине волны 405 нм.
В одном варианте лиганд КАСЕ связывается с белком слияния на основе КАСЕ с наномолярной (нМ) или микромолярной (мкМ) аффинностью. На фиг. 7 проиллюстрирован эксперимент, демонстрирующий связывание лигандов КАСЕ с белками слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. Готовят растворы ТТР-3000 (ТТ3) и ТТР-4000 (ТТ4) с исходными концентрациями 1,082 мг/мл и 370 мкг/мл соответственно. Как показано на фиг. 7, белки слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 и ТТР-4000 в разных разведениях способны связываться с иммобилизованными лигандами КАСЕ амилоидом-β (АЬс1а) (Ашу1о1й Вс1а (1-40) от Вюкоигсе), 8100Ь (8100) и амфотерином (Ашрйо), что приводит к повышению уровня поглощения. В отсутствие лиганда (например, при нанесении покрытия только из БСА), не отмечается повышения поглощения.
Тест на связывание согласно настоящему изобретению может использоваться для количественного определения уровня связывания лиганда с КАСЕ. В альтернативных вариантах лиганды КАСЕ могут связываться с белком слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению с показателями связывающей аффинности, варьирующими от 0,1 до 1000 нМ, или от 1 до 500 нМ, или от 10 до 80 нМ.
Белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может также использоваться для идентификации соединений, обладающих способностью связываться с КАСЕ. Как показано на фиг. 8 и 9, соответственно, лиганд КАСЕ может быть исследован на его способность конкурировать с иммобилизованным амилоид-β за связывание с белками слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ТТ3). Так, можно видеть, что лиганд КАСЕ в конечной, используемой в тесте концентрации (ЕАС), равной 10 мкМ, может вытеснять белок слияния на основе КАСЕ в реакции его связывания с амилоидом-β в концентрациях 1:3, 1:10, 1:30 и 1:100 относительно исходного раствора ТТР-4000 (фиг. 8) или ТТР-3000 (фиг. 9).
Модуляция клеточных эффекторов.
Варианты белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для модуляции биологического ответа, опосредованного КАСЕ. Например, могут быть созданы белки слияния с целью модуляции КАСЕ-индуцированного повышения их генной экспрессии. Так, в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для модуляции функций биологических ферментов. Например, взаимодействие между КАСЕ и лигандами может вызывать окислительный стресс и активацию ИЕ-кВ и генов, регулируемых NЕ-кВ, таких как цитокины !И-1 β. ТИЕ-а и т.п. Дополнительно было показано, что некоторые другие регуляторные пути, такие как пути, вовлекающие р21га§, МАР-киназы, ЕКК1 и ЕКК2, активируются при связывании АСЕ и других лигандов с КАСЕ.
Использование белков слияния согласно настоящему изобретению для модуляции экспрессии клеточного эффектора ТИЕ-α показано на фиг. 10. Миелоидные клетки ТНР-1 культивируют в среде КРМ1 1640 с добавкой 10% ФСТ и индуцируют секрецию ТИЕ-α путем стимуляции КАСЕ с использованием 8100Ь. В случае такой стимуляции в присутствии белка слияния КАСЕ индукция ТИЕ-α за счет связывания 8100Ь с КАСЕ может быть ингибирована. Так, на фиг. 10 показано, что добавление 10 мкг белка слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 (ТТ3) или ТТР-4000 (ТТ4) снижает индукцию ЮТ-а под действием 8100Ь примерно на 50-75%. Белок слияния ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, столь же эффективен по блокированию индукции ТИЕ-а под действием 8100Ь, как и 5КАСЕ (фиг. 10). Специфичность
- 23 017291 ингибирования последовательностей КАСЕ для ТТР-4000 и ТТР-3000 показана в эксперименте, в рамках которого добавляют один ЦС к 8100Ь-стимулированным клеткам. Добавление ΙβΟ и 8100Ь к тесту приводит к тем же уровням ТИЕ-а, что и добавление одного 8100Ь.
В рамках другого клеточного теста оценивают способность ТТР-4000 препятствовать взаимодействию лиганда КАСЕ НМСВ1 с КАСЕ и другими рецепторами НМСВ1. В отличие от анти-КАСЕ антител, которые связываются с КАСЕ и препятствуют взаимодействию лиганда КАСЕ с КАСЕ, ТТР-4000 может блокировать взаимодействие лиганда КАСЕ с КАСЕ за счет связывания с лигандом КАСЕ. Сообщалось, что НМСВ1 является лигандом для КАСЕ и Тο11-подобных рецепторов 2 и 4 (Рагк с1 а1., 1 ΒίοΙ Сбет., 2004; 279 (9): 7370-7). Все три указанных рецептора (КАСЕ, ^П-подобный рецептор 2 и ^б-подобный рецептор 4) экспрессируются на клетках ТНР-1 се11к (Рагкег, е1 а1., 1 Iттиηο1, 2004, 172 (8): 4977-86).
В данном эксперименте ТНР-1 клетки стимулируют к продукции ТНР-а путем добавления НМСВ1 (50 мг/мл) в присутствии или в отсутствие ТТР4000 или анти-КАСЕ антител. В условиях данного теста НМСВ1 должен быть единственным индуктором ТНЕ-а. Результаты, приведенные на фиг. 11, показывают, что анти-КАСЕ антитело и белок слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000, блокируют взаимодействие нМСВ1 с КАСЕ, экспрессированным на ТНР-1 клетках и что ТТР-4000 ингибирует индуцированную НМСВ1 продукцию ТОТ-а в большей мере, чем это делает анти-КАСЕ антитело. Таким образом, полученные результаты показывают, что ТТР-4000 может ингибировать активность нМСВ1 в большей степени, чем анти-КАСЕ антитело, за счет ингибирования взаимодействия НМСВ1 с ^И-подобными рецепторами 2 и 4, а также с КАСЕ, присутствующим на ТНР-1 клетках.
Физиологические характеристики белков слияния на основе КАСЕ.
Хотя кКАСЕ может оказывать терапевтический эффект при модуляции КАСЕ-опосредованных заболеваний, человеческий кКАСЕ может иметь ограничения при использовании его в качестве обособленного терапевтического средства, определяемые относительно коротким периодом полувыведения кКАСЕ из плазмы. Например, тогда как кКАСЕ грызунов имеет период полувыведения у нормальных и диабетических крыс, равный примерно 20 ч, человеческий кКАСЕ имеет период полувыведения менее чем 2 ч при оценке по сохранению иммунореактивности кКАСЕ (Кепагб е1 а1., 1. РЕата^. Ехр. Тбег., 290: 1458-1466 (1999)).
Для достижения терапевтического эффекта КАСЕ, который имеет близкие к кКАСЕ характеристики по связыванию, но более стабильный фармакокинетический профиль, может быть использован белок слияния на основе КАСЕ, включающий сайт связывания лиганда КАСЕ, присоединенный к одному или нескольким иммуноглобулиновым доменам человека. Как известно в данной области, иммуноглобулиновые домены могут включать Ес часть тяжелой цепи иммуноглобулина.
Ес часть иммуноглобулина может придавать некоторые свойства белкам слияния на основе КАСЕ. Например, белок слияния с Ес может повышать период полувыведения таких белков слияния из сыворотки, часто от нескольких часов до нескольких дней. Повышение фармакокинетической стабильности в основном представляет собой результат взаимодействия линкера, находящегося между участками Сн2 и Сн3 фрагмента Ес, с рецептором ЕсКп (\Утек е! а1., 1. Iттиηο1., 164: 5313-5318 (2000)).
Хотя белки слияния, включающие полипептид Ес иммуноглобулина, могут обеспечивать преимущество, определяемое повышенной стабильностью, иммуноглобулиновые белки слияния могут вызывать воспалительный ответ при введении в организм хозяина. Воспалительный ответ может определяться в основном Ес частью иммуноглобулина в белке слияния. Провоспалительный ответ может быть желательным, если целевое соединение экспрессируется в пораженных заболеванием клетках, которые следует удалить (например, в раковой клетке или в популяции лимфоцитов, вызывающих аутоиммунное заболевание). Провоспалительный ответ может быть нейтральной особенностью, если целевое соединение представляет собой растворимый белок, поскольку большая часть растворимых белков не активирует иммуноглобулины. Однако провоспалительный ответ может быть отрицательным свойством, если целевое соединение экспрессируется в клетках такого типа, разрушение которых может привести к нежелательным побочным эффектам. Кроме того, провоспалительный ответ также может быть отрицательной характеристикой, если воспалительный каскад устанавливается в сайте связывания белка слияния с тканью-мишенью, поскольку многие медиаторы воспаления могут быть вредны для окружающей ткани и/или могут вызвать системные эффекты.
Первичный провоспалительный сайт на иммуноглобулиновых Ес-фрагментах находится на шарнирном участке между Сн1 и Сн2. Данный шарнирный участок взаимодействует с ЕсК1-3, находящихся на разных лейкоцитах, и направляет эти клетки для атаки на мишень (\Уи'1ек е! а1., 1. ΙΜΜπηο1., 164: 53135318 (2000)).
Белки слияния на основе КАСЕ при их использовании в качестве терапевтических препаратов для лечения КАСЕ-опосредованных заболеваний необязательно вызывают воспалительный ответ. Так, некоторые варианты белков слияния КАСЕ по настоящему изобретению могут включать белок слияния, включающий полипептид КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену (доменам), где Ес шарнирный участок в иммуноглобулине удален и замещен полипептидом КАСЕ. В этом случае взаимодействие между белком слияния на основе КАСЕ и Ес рецепторами на воспалительных клетках может
- 24 017291 быть минимизировано. Однако может быть важно поддерживать соответствующие сцепляющие свойства и другие формы взаимодействия, определяемые трехмерной структурой, между различными иммуноглобулиновыми доменами белка слияния на основе КАСЕ. Так, варианты белков слияния согласно настоящему изобретению могут замещать биологически инертный, но структурно близкий междоменный линкер КАСЕ, который разделяет V и С1 домены КАСЕ, или линкер, который разделяет С1 и С2 домены КАСЕ в нормальном шарнирном участке тяжелой цепи иммуноглобулина. Так, полипептид КАСЕ в белке слияния на основе КАСЕ может включать последовательность междоменного линкера, которая в природном состоянии соответствует направлению считывания информации из иммуноглобулинового домена КАСЕ, с образованием иммуноглобулинового домена/инкерного фрагмента КАСЕ. В рамках данного способа, удается сохранять пространственные взаимодействия между иммуноглобулиновыми доменами, определяемыми КАСЕ или иммуноглобулином.
В одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящего изобретению может вызывать существенное повышение фармакокинетической стабильности в сравнении с вКАСЕ. Например, как видно из фиг. 12, при насыщении ТТР-4000 белка слияния на основе КАСЕ, его лигандами, может сохраниться период полувыведения более 300 ч. Это резко отличается от величины периода полувыведения для вКАСЕ, который насчитывает лишь несколько часов в плазме человека.
Таким образом, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для антагонизации в процессе связывания физиологических лигандов с КАСЕ и представлять собой средство лечения КАСЕ-опосредованных заболеваний, не вызывая неприемлемого уровня воспаления. Белки слиянии на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут приводить к существенному снижению воспалительного ответа в сравнении с 1дС. Например, как видно из фиг. 13, ТТР-4000, белок слияния на основе КАСЕ, не стимулирует высвобождение ТИБ-α из клеток в условиях, при которых выявляется высвобождение Т№-а, стимулированное человеческим 1дС.
Лечение заболевания белками слияния на основе КАСЕ.
Настоящее изобретение может также включать способы лечения КАСЕ-опосредованного нарушения у человека. В одном варианте данный способ может включать введение субъекту белка слияния на основе КАСЕ, включающего полипептид КАСЕ, который включает сайт связывания лиганда КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от КАСЕ.
В некоторых вариантах композиция на основе КАСЕ включает лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ. В некоторых вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения КАСЕ-опосредованного нарушения, включающим введение субъекту терапевтически эффективного количества восстановленной композиции, включающей белок слияния на основе КАСЕ, лиопротектор и буфер.
В любом варианте осуществления настоящего изобретения белок слияния на основе КАСЕ может использоваться для лечения заболевания в составе терапевтических композиций и препаратов согласно настоящему изобретению. Таким образом, белок слияния на основе КАСЕ может включать последовательность, полученную из сайта связывания лиганда КАСЕ, которая присоединена к иммуноглобулиновому полипептиду. Различные варианты белков слияния на основе КАСЕ могут включать полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домена иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептид КАСЕ может включать междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота из иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединяется к ^концевой аминокислоте междоменного линкера, и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединяется к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, в некоторых вариантах белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, присоединенные ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что ^концевая аминокислота из первого мождоменного линкера присоединяется к Сконцевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединяется к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, ^концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединяется к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ, и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединяется к ^концевой аминокислоте иммуноглобулинового домена Сн2 или части Сн2 домена иммуноглобулина.
В альтернативных вариантах настоящего изобретения, относящихся к полидоменному белку слияния, полипептид КАСЕ может включать аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 10, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 47, или последовательноость, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% ей идентична. В других альтернативных вариантах настоящего изобретения белок слияния на основе КАСЕ может включать аминокислотную последовательность, показанную, по меньшей мере, в виде одной из приведенных ниже последовательностей 8Е0
- 25 017291
ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% ей идентична. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57, включает полипептид 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57 без С-концевого лизина. Или в других вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность составляет белок слияния на основе КАСЕ, используемый в композициях согласно настоящему изобретению.
В композиции белка слияния на основе лиофилизированного КАСЕ может использоваться множество лиопротекторов. В некоторых вариантах указанный лиопротектор может включать невосстанавливающий сахар. Например, невосстанавливающий сахар может включать сахарозу, маннит или трегалозу. Кроме того, в композиции белка слияния на основе лиофилизированного КАСЕ может использоваться множество буферов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанный буфер может включать гистидин.
Лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ может включать дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция белка слияния на основе КАСЕ может также включать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент или наполнитель. В одном варианте восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ включает примерно 40-100 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ, который включает последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57; от примерно 2 до примерно 50 мМ гистидина; от примерно 60 до примерно 65 мМ сахарозы; от примерно 0,001 до примерно 0,05% Твина 80; и характеризуются значением рН примерно от 6,0 до 6,5. Так, например, восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может в некоторых вариантах включать примерно 40-50 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ, который включает последовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57; примерно 10 мМ гистидина, примерно 65 мМ сахарозы, примерно 0,01% Твина 80 и характеризуются значением рН примерно 6,0. Или могут использоваться другие концентрации белка слияния на основе КАСЕ в композициях, применяемых для лечения КАСЕ-опосредованных нарушений, при наличии такой необходимости.
Композиция белка слияния на основе КАСЕ может включать стабильный терапевтический агент, который вводится в композицию для целей его использования в клинической практике или в качестве лекарственного средства, предписанного врачом. Например, в некоторых вариантах композиция белка слияния на основе КАСЕ может демонстрировать уровень разложения после недели хранения при температуре 40°С менее чем 10%, или менее чем 5%, или менее чем 3%.
Кроме того, композиция белка слияния на основе КАСЕ может быть стабильной при ее восстановлении разбавителем. В некоторых вариантах в композиции белка слияния на основе КАСЕ в форме агрегата присутствует менее чем примерно 10, 5, 4, 3, 2 или 1% от белка слияния на основе КАСЕ.
Восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может быть пригодна для введения разными способами и может осуществляться в соответствии с потребностью, определяемой лечением КАСЕ-опосредованного рассматриваемого нарушения. Так, введение белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может осуществляться внутрибрюшинной (в/б) инъекцией. Альтернативно, белок слияния на основе КАСЕ может вводиться перорально, интраназально или в форме аэрозоля. В другом варианте введение представляет собой внутривенное введение (в/в). Белок слияния на основе КАСЕ может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществляют внутриартериальное введение белка слияния. В еще одном варианте введение осуществляется сублингвально. Кроме того, для введения могут использоваться капсулы с пролонгированным высвобождением. В еще одном варианте введение может быть трансректальным, например с использованием суппозиториев и т.п. Например, может использоваться подкожное введение, которое полезно для лечения хронических заболеваний в тех случаях, когда желательно самостоятельное введение.
Как описано здесь более подробно, КАСЕ вовлекается в патогенез множества болезненных состояний, и было показано, что белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению являются эффективными в направлении ослабления таких болезненных состояний. Таким образом, композиции белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться при лечении большого числа КАСЕ-опосредованных нарушений.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения симптома диабета или симптома осложнений диабета, опосредованных КАСЕ. Например, симптомы диабета или поздние осложнения диабета могут включать по меньшей мере одно из приведенных состояний: диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую язву стопы, сердечнососудистые осложнения диабета или диабетическую невропатию.
В других вариантах восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения по меньшей мере одного из приведенных состояний: амилоидоза, болезни Альцгеймера, рака, почечной недостаточности или воспаления, ассоциированного с аутоиммунным процессом, воспалительной болезни кишечника, ревматоидного артрита, псориаза, рассеянного склероза, гипоксии, инсульта, сердечного приступа, геморрагического шока, сепсиса, транс
- 26 017291 плантации органа или нарушения заживления ран.
Или в другом варианте восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения остеопороза. Например, в некоторых вариантах введение композиции белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению повышает плотность кости у субъекта или уменьшает уровень снижения плотности кости у субъекта.
В некоторых вариантах аутоиммунное нарушение, подлежащее лечению с использованием композиций белка слияния на основе КАСЕ, согасно настоящему изобретению может включать отторжение по меньшей мере одного из приведенных видов клеток: клетки кожи, клетки поджелудочной железы, нервные клетки, мышечные клетки, эндотелиальные клетки, клетки сердца, клетки печени, клетки почки, клетки костного мозга, костные клетки, клетки крови, клетки артерий, клетки вен, клетки хряща, клетки щитовидной железы или стволовые клетки. Или в другом варианте восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения почечной недостаточности.
В некоторых вариантах восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения воспаления и/или отторжения, ассоциированного с трансплантацией по меньшей мере одного органа, ткани или множества клеток из первого сайта во второй сайт. Указанные первый и второй сайт могут находиться в разных организмах или могут присутствовать у одного и того же субъекта. Трансплантация множества клеток разного типа может быть облегчена с использованием композиций белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. Например, трансплантированные клетки, ткань или орган могут включать клетку, ткань или орган из поджелудочной железы, кожи, печени, почки, сердца, костного мозга, крови, кости, мышцы, артерии, вены, хряща, щитовидной железы, нервной системы или стволовые клетки.
Примеры использования белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению при лечении таких заболеваний и состояний описаны в настоящем тексте.
Для подтверждения полезности использования соединений, модулирующих КАСЕ, в качестве лекарственных средств оценивались результаты их применения у разных животных, взятых в качестве соответствующих моделей. Примеры таких моделей включают:
a) ингибирование под действием кКАСЕ образования неоинтимы на модели крыс с рестенозом после повреждения артерий как у диабетических, так и нормальных крыс, путем ингибирования активации эндотелия, гладких мышц и макрофагов посредством КАСЕ (Ζΐιοιι е! а1., С’йси1а!юп 107: 2238-2243 (2003));
b) ингибирование взаимодействий КАСЕ/лиганд с использованием кКАСЕ или антител против КАСЕ, снижение образования амилоидных бляшек на модели мышей с системным амилоидозом (Уап е! а1., №11. Мей., 6: 643-651 (2000)). Снижение амилоидных бляшек сопровождается снижением уровня воспалительных цитокинов, интерлейкина-6 (1Ь-6) и макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ), а также сниженной активацией ИЕ-кВ у опытных животных;
c) КАСЕ-трансгенные мыши (при наличии суперэкспрессии КАСЕ и доминантных отрицательных экспрессоров КАСЕ) демонстрируют образование бляшек и нарушения распознавательной способности, в рамках модели мышей с БА (Агаисю е! а1., ЕМВ0 1., 23: 4096-4105 (2004));
й) использование кКАСЕ при лечении мышей с диабетом снижает проницаемость сосудов (Воппагйе1-РНи е! а1., Б1аЬе1ек, 48: 2052-2058 (1998));
е) лечение с использованием кКАСЕ снижает уровень атеросклеротических повреждений у диабетических мышей с аполипопротеином Е-пи11 и предотвращает появление функциональных и морфологических признаков диабетической нефропатии у ЙЬ/ЙЬ мышей (Нийкоп е! а1., АгсН. ВюсНет. В1орНук., 419: 80-88 (2003); и
ί) кКАСЕ ослабляет тяжесть воспаления на модели мышей с артритом, индуцированным коллагеном (НоЕтапп е! а1., Сепек 1ттипо1., 3: 123-135 (2002)), на модели мышей с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (Уап е! а1., N1. Мей., 9: 28-293 (2003)) и на модели мышей с воспалительным заболеванием кишечника (НоЕтапп е! а1., Се11., 97: 889-901 (1999)).
Таким образом, в одном варианте белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения симптома диабета и/или осложнений диабета, развивающихся как следствие диабета, опосредованного участием КАСЕ. Например, симптомы диабета или поздние осложнения диабета могут включать диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую язву стопы, сердечно-сосудистые осложнения диабета или диабетическую невропатию.
Первоначально идентифицированный как рецептор молекул, экспрессия которых ассоциирована с патологией диабета, сам по себе КАСЕ является обязательным компонентом в патофизиологии диабетических осложнений. Было показано, что ингибирование взаимодействия КАСЕ с его лигандом(ами) ш У1уо оказывает терапевтический эффект на многих моделях диабетических осложнений и воспаления (Нийкоп е! а1., АгсН. ВюсНеш. ВюрНук., 419: 80-88 (2003)). Например, лечение в течение двух месяцев с использованием антител против КАСЕ нормализовало почечную функцию и снизило аномальную гистопатологию почки у мышей с диабетом (Е1ууЬ)егд е! а1., Б1аЬе1ек., 53: 166-172 (2004)). Кроме того, лечение с использованием растворимой формы КАСЕ (кКАСЕ), которая связывается с лигандами КАСЕ и инги
- 27 017291 бирует взаимодействия ВАСЕ/лиганд, снижает выраженность атеросклеротических повреждений у диабетических мышей с аполипопротеином Е-пи11 и снижает функциональную и морфологическую патологию диабетической нефропатии у мышей бЬ/бЬ (Висс1агеШ е! а1., Спси1а1юп., 106: 2827-2835 (2002)).
Кроме того, было показано, что неэнзиматическая гликоксидация макромолекул, приводящая в итоге к образованию конечных продуктов с повышенным гликозилированием (АСЕ), усиливается в сайтах воспаления, при почечной недостаточности, в случае гипергликемии и других состояний, ассоциированных с системным или локальным окислительным стрессом (Буег е! а1., I. С11п. 1пуе51.. 91: 2463-2469 (1993); Веббу е! а1., Вюсйет., 34: 10872-10878 (1995); Буег е! а1., I. Вю1. С1ет., 266: 11654-11660 (1991); Бедеийагб! е! а1., Се11. Мо1. Вю1., 44: 1139-1145 (1998)). Накопление АСЕ в сосудистой сети может быть очаговым и осуществляться, например, в суставном амилоиде, состоящем из АСЕ-32-микроглобулина, обнаруженного у пациентов с амилоидозом, вызванным диабетом (М1уа!а е! а1., I. С1ш. 1пуек!., 92: 12431252 (1993); М1уа!а е! а1., I. С1т. 1пуек!., 99: 1088-1094 (1996)), или в основном встречается в сосудистой сети и ткани пациентов с диабетом (8с11пйб1 е! а1., №11цгс. Меб., 1: 1002-1004 (1995)). Прогрессирующее накопление АСЕ с течением времени у пациентов с диабетом говорит о том, что механизмы эндогенного клиренса не способны эффективно функционировать в сайтах осаждения АСЕ. Такие аккумулированные АСЕ обладают способностью менять клеточные свойства за счет множества механизмов. Хотя ВАСЕ экспрессируется на низких уровнях в нормальных тканях и в сосудистой сети, было показано, что в среде, где накапливаются лиганды рецептора, ВАСЕ подвергается позитивной регуляции (Ь1 е! а1., I. Вю1. С1ет., 272: 16498-16506 (1997); Ь1 е! а1., I. Вю1. С1ет., 273: 30870-30878 (1998); Тапака е! а1., I. Вю1. С1ет., 275: 25781-25790 (2000)). Экспрессия ВАСЕ повышается в эндотелии, гладкомышечных клетках и инфильтрующих моноядерных фагоцитах сосудистой сети при диабете. Кроме того, исследования с использованием клеточной культуры показали, что взаимодействие АСЕ-ВАСЕ вызывает изменения клеточных свойств, важных для сосудистого гомеостаза.
Использование белков слияния на основе ВАСЕ при лечении патологий, связанных с диабетом, проиллюстрировано на фиг. 14. Белок слияния на основе ВАСЕ, ТТР-4000, оценивают на модели рестеноза у крыс с диабетом при проведении измерения пролиферации гладких мышц и размножения клеток интимы после поражения сосудистой сети. Как показано на фиг. 14, лечение с использованием ТТР-4000 существенно снижает соотношение интима/среда (И/С) (фиг. 14А, табл. 1) на модели ассоциированного с диабетом рестеноза, зависимым от дозы способом. Кроме того, лечение с использованием ТТР-4000 существенно снижает ассоциированную с рестенозом пролиферацию гладкомышечных клеток сосудистой сети зависимым от дозы способом (фиг. 14В).
Таблица 1
Эффект ТТР-4000 на модели крыс с рестенозом
1дС (п=9) ТТР-4000 (п=9) низкая доза** (0,3 мг/животное через день х 4} ТТР-4000 (п=9) высокая доза** (1,0 мг/животное через день х 4)
Площадь просвета (мм2) 0,2+0,03 0, 18+0,04 0,16 + 0,02
Медиальная площадь (мм21 0,12±0,01 0, 11+0,02 0,11+0,01
Соотношение И/С 1,71±0,27 1,61+0,26 1,44*+О,15
* Р<0,05 ** В качестве высокой и низкой дозы используется нагрузочная доза, равная 3 мг/животное.
В других вариантах белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения или реверсирования амилоидоза или болезни Альцгеймера. ВАСЕ представляет собой рецептор для β-амилоида ^β), а также других амилоидогенных белков, включая 8АА и амилин (Уап е! а1., Ыа1шв, 382: 685-691 (1996); Уап е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А., 94: 5296-5301 (1997); Уап е! а1., №11. Меб., 6: 643-651 (2000); 8оика е! а1., ЬаЬ. 1пуек!., 80: 1101-1110 (2000)). Кроме того, лиганды ВАСЕ, включая АСЕ, 8100Ь и Аβ белки, найдены в ткани, окружающей старческие бляшки у человека (Ьи1й е! а1., СегеЬ. Сойех., 15: 211-220 (2005); Ре1хо1б е! а1., №иго8С1. Ьей., 336: 167-170 (2003); 8акак1 е! а1., Вгат Век., 12: 256-262 (2001); Уап е! а1., Век!ог. №иго1. №игокск, 12: 167-173 (1998). Было показано, что ВАСЕ связывается с фибриллярным β-складчатым, независимо от состава субъединиц (пептид амилоид β, амилин, сывороточный амилоид А, прионовый пептид) (Уап е! а1., ^Ште., 382: 685-691 (1996); Уап е! а1., №11. Меб., 6: 643-651 (2000)). Кроме того, было показано, что отложение амилоида приводит к усилению экспрессии ВАСЕ. Например, в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (БА) экспрессия ВАСЕ повышается в нейронах и глии (Уап е! а1., ^Ште., 382: 685-691 (1996)). Одновременно с экспрес
- 28 017291 сией лигандов КАСЕ, КАСЕ подвергается позитивной регуляции в астроцитах и микроглиальных клетках в гиппокампе индивидуумов с болезнью Альцгеймера, но не у индивидуумов с выраженной позитивной регуляцией, которые не имеют БА (Ъие е! а1., Ехр. ХеигоГ 171: 29-45 (2001)). Приведенные данные позволяют полагать, что клетки, экспрессирующие КАСЕ, активируются за счет взаимодействий КАСЕ/лиганд КАСЕ вблизи старческих бляшек. Кроме того, Λβ-опосредованная активация клеток микроглии 1п νίΐτο может блокироваться антителами, направленными против домена связывания лиганда в КАСЕ (Уап е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А., 94: 5296-5301 (1997)). Было также показано, что КАСЕ может служить в качестве очаговой точки для сборки фибрилл (Пеане е! а1., Ν!. Меб., 9: 907-913 (2003)).
Кроме того, ингибирование ш νίνο взаимодействия КАСЕ/лиганда с использованием кКАСЕ или антител против КАСЕ может снижать образование амилоидных бляшек на модели мышей с системным амилоидозом (Уап е! а1., №11. Меб., 6: 643-651 (2000)). У двойных трансгенных мышей, осуществляющих суперэкспрессию человеческого КАСЕ и белка-предшественника человеческого амилоида (АРР) с мутациями 8\\'еб1к11 и ΡοιΉοΐ'ΐ (мутант йАРР), в нейронах развиваются дефекты обучения и нейропатологические аномалии раньше, чем в случае их йАРР трансгенных вариантов с одной мутацией. И наоборот, двойные трансгенные мыши со сниженной АЗ сигнальной способностью за счет нейронов, экспрессирующих доминантную негативную форму КАСЕ на фоне того же мутанта йАРР, демонстрируют задержанное развитие аномалий процесса обучения в сравнении с их трансгенным вариантом, содержащим один АРР (Атапсю е! а1., ЕΜΒО^., 23: 4096-4105 (2004).
Кроме того, было показано, что ингибирование взаимодействия КАСЕ-амилоид снижает экспрессию клеточного КАСЕ и маркеров клеточного стресса (а также активацию ΝΕ-κΒ) и снижает отложение амилоида (Уап е! а1., №11. Меб., 6: 643-651 (2000)), что указывает на возможную роль взаимодействия КАСЕ-амилоида в перестройке клеточных свойств в окружении, обогащенном амилоидом (даже на ранних стадиях), а также при накоплении амилоида.
Таким образом, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения с целью снижения амилоидоза, числа амилоидных бляшек, а также познавательной дисфункции, ассоциированной с болезнью Альцгеймера (БА). Как указывалось выше, на модели животных с БА было показано, что кКАСЕ снижает как образование амилоидных бляшек в мозге, так и последующее повышение уровня воспалительных маркеров. На фиг. 15А и 15В показано, что мыши с БА, которых лечили в течение 3 месяцев с использованием ТТР-4000 или мышиного кКАСЕ, имеют сниженный уровень амилоид-бета (АЗ) бляшек и менее выраженную познавательную дисфункцию, чем животные, которые получали носитель или человеческий 1дС, в качестве отрицательного контроля (1дС1). Как и кКАСЕ, ТТР-4000 может также снижать уровень воспалительных цитокинов ΙΗ-1 и ΤΝΕ-α (данные не показаны), ассоциированный с БА.
Кроме того, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых нарушений. Так, было показано, что ишемическая болезнь сердца особенно часто встречается у пациентов с диабетом (КοЬе^ΐкοπ е! а1., ЬаЬ. 1^ек!., 18: 538-551 (1986); Каппе1 е! а1., I. Ат. Меб. Актос, 241: 2035-2038 (1979); Каппе1 е! а1., ОпЬ. Саге, 2: 120-126 (1979). Кроме того, в других исследованиях было показано, что атеросклероз у пациентов с диабетом развивается быстрее и более масштабно, чем у пациентов без диабета (см., например, ^а11ет е! а1., Ат. I. Меб., 69: 498-506 (1980); Сга11 е! а1., Ат. I. Меб., 64: 221-230 (1978); НатЬу е! а1., Сйек!, 2: 251257 (1976) и Руο^а1а е! а1., И1аЬ. Ме!аЬ. Кеу., 3 463-524 (1978)). Хотя имется множество разных причин ускоренного развития атеросклероза при диабете, было показано, что снижение уровня АСЕ может приводить к сниженному образованию бляшек.
Например, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут также использоваться при лечении инсульта. При сравнении результатов применения ТТР-4000 с кКАСЕ на релевантной модели животных для инсульта было показано, что ТТР-4000 обеспечивает значительно большее снижение объема некроза. В рамках данной модели среднюю сонную артерию мыши лигируют и затем проводят реперфузию с образованием зоны некроза. Для оценки эффективности белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению в плане лечения или предупреждения инсульта мышам перед реперфузией вводят кКАСЕ, или ТТР-4000, или контрольный иммуноглобулин. Как показано в табл. 2, ТТР-4000 был более эффективным, чем кКАСЕ по ограничению площади некроза у данных животных, что указывает на то, что ТТР-4000 в связи с его лучшими показателями полувыведения из плазмы способен оказывать большую защиту, чем кКАСЕ.
- 29 017291
Таблица 2
Снижение зоны некроза при инсульте
% снижения зоны некроза**
ЗНАСЕ 15%*
** сравнение с солевым раствором.
В других вариантах белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения рака. В одном варианте лечение рака с использованием белков слияния согласно настоящему изобретению включает раковые клетки, которые экспрессируют КАСЕ. Например, рак, который можно лечить с использованием белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению, включает некоторые виды рака легкого, некоторые глиомы, некоторые папилломы и т. п. Амфотерин представляет собой высокомобильный негистоновый белок группы Ι, связывающийся с хромосомальной ДНК (Каиуа1а е! а1., 1. Βίο1. СЬет., 262: 16625-16635 (1987); РагИкшеп е! а1., 1. Βίο1. СЬет., 268: 19726-19738 (1993), который, как было показано, взаимодействует с КАСЕ. Было показано, что амфотерин способствует образованию нейритных отростков, а также служит в качестве поверхности для сборки протеазных комплексов в системе фибринолиза (что, как известно, также вносит вклад в клеточную мобильность). Дополнительно местный ингибирующий эффект на рост опухоли за счет блокирования КАСЕ наблюдается на модели первичной опухоли (С6 глиома), на модели Льюиса (Ье^1к) метастаз легкого (ТадисЫ е! а1., №1!иге 405: 354-360 (2000)) и в случае спонтанно возникающих папиллом у мышей, экспрессирующих трансген ν-На-гак (ЬеФег е! а1., Ргос. N311. АсаФ. 8с1. И8А., 87: 9178-9182 (1990)).
В еще других вариантах белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения воспаления. В альтернативных вариантах белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения воспаления, ассоциированного с воспалительной болезнью кишечника, воспаления, ассоциированного с ревматоидным артритом, воспаления, ассоциированного с псориазом, воспаления, ассоциированного с рассеянным склерозом, воспаления, ассоциированного с гипоксией, воспаления, ассоциированного с инсультом, воспаления, ассоциированного с сердечным приступом, воспаления, ассоциированного с геморрагическим шоком, воспаления, ассоциированного с сепсисом, воспаления, ассоциированного с трансплантацией органа, воспаления, ассоциированного с нарушением заживления ран, или воспаления, ассоциированного с оттторжением собственных (например, при аутоиммунном процессе) или чужеродных (например, при трансплантации) клеток, тканей или органов.
Например, после тромболитического лечения воспалительные клетки, такие как гранулоциты, инфильтруют ишемизированную ткань и создают кислородные радикалы, которые могут разрушать больше клеток, чем их было уничтожено гипоксией. Было показано, что ингибирование рецептора на нейтрофиле, ответственном за способность нейтрофилов инфильтрировать ткань антителами или другими белковыми антагонистами, снижает указанную реакцию. Поскольку КАСЕ представляет собой лиганд такого нейтрофильного рецептора, белок слияния на основе КАСЕ, содержащий фрагмент КАСЕ, может действовать в качестве приманки и предотвращать поступление нейтрофилов в реперфузированный сайт и таким образом предупреждать дальнейшую деструкцию ткани. Роль КАСЕ в предупреждении воспаления может быть продемонстрирована на примере результатов исследований, в которых показано, что кКАСЕ ингибирует размножение неоинтимы на модели крыс с рестенозом после повреждения артерии как у крыс с диабетом, так и у нормальных крыс, прежде всего, за счет ингибирования пролиферации эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и за счет активации макрофагов через КАСЕ (Ζΐιοιι е! а1., С1гси1а!юп, 107: 2238-2243 (2003)). Дополнительно было показано, что кКАСЕ оказывает ингибирующее действие на моделях воспаления, включающих гиперчувствительность задержанного типа, на модели с экспериментальным аутоиммунным энцефалитом и на модели воспалительного заболевания кишечника (НоГтап е! а1., Се11 97: 889-901 (1999)).
В одном варианте белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения нарушений, связанных с аутоиммунным заболеванием.
В одном варианте белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения почечной недостаточности.
Так, в одном варианте белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут ис
- 30 017291 пользоваться для лечения системного волчаночного нефрита или воспалительного волчаночного нефрита. Например, было показано, что 8100/калгранулины включают семейство близкородственных кальцийсвязывающих полипептидов, для которых характерно наличие участков с двумя ЕЕ-полосами, соединенными связующим пептидом (8с11аГег е! а1., ΤΙΒ8., 21: 134-140 (1996); ΖίιηιικΓ е! а1., ВгОп Кек. Ви11., 37: 417-429 (1995); Каттек е! а1., I. Вю1. Сйет., 272: 9496-9502 (1997); Ьидеппд е! а1., Еиг. I. С1т. Шуей., 25: 659-664 (1995)). Хотя у них отсутствуют сигнальные пептиды, уже давно известно, что 8100/калгранулины имеют преимущество, определяемое возможностью их доступа во внеклеточное пространство, особенно в сайты хронических иммунных/воспалительных ответов, как в случае муковисцидоза и ревматоидного артрита. КАСЕ представляет собой рецептор для многих представителей семейства 8100/калгранулина, опосредующих провоспалительное действие на клетки, такие как лимфоциты и мононуклеарные фагоциты. Кроме того, результаты изучения ответов на моделях гиперчувствительности задержанного типа, колита у мышей ЕЬ-10 пи11, коллаген-индуцированного артрита и экспериментального аутоиммунного энцефалита дают основания полагать, что взаимодействие КАСЕ-лиганд (преимущественно в рамках 8100/калгранулины) играет определенную роль в воспалительном каскаде, находясь в его начале.
Диабет типа Ι представляет собой заболевание, развитие которого можно предупредить или ослабить при использовании для лечения белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. Например, было показано, что кКАСЕ может способствовать переносу спленоцитов от диабетических мышей без ожирения (N00) к N0^-мышам с тяжелой формой комбинированного иммунодефицита (N00-806 мыши). N00-806 мыши не демонстрируют признаков спонтанного диабета, но требуют наличия иммуноцитов, которые способны разрушать островковые клетки, что приводит далее к индукции диабета. Было показано, что N00-806 реципиентные мыши, которым вводили кКАСЕ, проявляют ослабленные начальные признаки диабета, индуцированного спленоцитами, перенесенными от диабетической (N00) мыши, в сравнении с N00-806 реципиентными мышами, которым не вводили кКАСЕ (публикация по патенту США 2002/0122799). Как указывалось в И8 2002/0122799, результаты экспериментов, проведенных с использованием 8КАСЕ в рамках данной модели, релевантны для заболевания человека в том случае, когда лечение проводят в условиях клиники, где могут быть проведены дальнейшая иммунотерапия и трансплантация островковых клеток.
Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения воспаления, ассоциированного с трансплантацией по меньшей мере одного из указанных ниже органа, ткани или множества клеток из первого сайта во второй сайт. Указанные первый и второй сайт могут находиться в разных организмах или могут присутствовать у одного и того же субъекта. В альтернативных вариантах трансплантированные клетки, ткань или орган могут включать клетки поджелудочной железы, кожи, печени, почки, сердца, легкого, костного мозга, крови, кости, мышцы, эндотелиальные клетки, артерии, вены, хряща, щитовидной железы, нервной системы или стволовые клетки. Например, введение белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться для облегчения трансплантации островковых клеток от первого субъекта без диабета к второму субъекту с диабетом.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу лечения остеопороза за счет введения субъекту терапевтически эффективного количества белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению (Ζΐιοιι е! а1., I. Ехр. Ме6., 203: 1067-1080 (2006)). В одном варианте указанный способ лечения остеопороза может также включать стадию повышения плотности кости у субъекта или уменьшения уровня снижения плотности кости у субъекта.
Так, в различных выбранных вариантах настоящее изобретение может относиться к способу ингибирования взаимодействия АСЕ с КАСЕ у субъекта, осуществляемого путем введения субъекту терапевтически эффективного количества белка слияния согласно настоящему изобретению. Субъект, подлежащий лечению с использованием белков на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению, может представлять собой животное. В одном из таких вариантов субъектом является человек. Субъект может страдать от АСЕ-родственного заболевания, такого как диабет, осложнения диабета, такие как нефропатия, нейропатия, ретинопатия, язва стопы, амилоидоз или почечная недостаточность, а также воспаление. Или указанный субъект может представлять собой индивидуум с болезнью Альцгеймера. В альтернативном варианте указанный субъект может быть раковым больным. В еще других вариантах указанный субъект может представлять собой больного с системной красной волчанкой или с воспалительным волчаночным нефритом. Другие заболевания также могут быть опосредованы участием КАСЕ и в этой связи могут лечиться с использованием белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. Так, в дополнительных альтернативных вариантах белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения болезни Крона, артрита, васкулита, нефропатий, ретинопатии и нейропатий у человека или животного. В других вариантах воспаление вовлекает как аутоиммунные (например, реакцию отторжения собственных материалов), так и не аутоиммунные (например, реакцию отторжения чужеродных материалов) ответы согласно настоящему изобретению.
Терапевтически эффективное количество может включать такое количество, которое способно предупреждать взаимодействие КАСЕ с АСЕ или другими типами эндогенных лигандов КАСЕ у субъекта.
- 31 017291
Указанное количество может варьировать в зависимости от субъекта, подлежащего лечению. Введение соединения может осуществляться ежечасно, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно или представлять собой разовое явление. В различных альтернативных вариантах эффективное количество белка слияния на основе ВАСЕ может находиться в диапазоне от примерно 1 нг/кг веса тела до примерно 100 мг/кг веса тела, или от примерно от 10 мкг/кг веса тела до примерно 50 мг/кг веса тела, или от примерно 100 мкг/кг веса тела до примерно 20 мг/кг веса тела. Фактическое эффективное количество может быть установлено экспериментально, при определении зависимости доза/ответ с использованием стандартных методик (ЗоНпкоп е1 а1., 0|аЬе1е5. 42: 1179 (1993)). Так, в соответствии с общими известными положениями, эффективное количество может зависеть от биологической доступности соединения, его биологической активности и способности к биологической деградации.
Композиции.
Настоящее изобретение может включать композицию, в состав которой входит белок слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Белок слияния на основе ВАСЕ может включать полипептид ВАСЕ, присоединенный к второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте белок слияния на основе ВАСЕ может включать сайт связывания лиганда ВАСЕ. В данном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть Νконцевого домена белка слияния на основе ВАСЕ. Сайт связывания лиганда ВАСЕ может включать V домен ВАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда ВАСЕ включает 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕО Ш ΝΟ: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 47 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей.
В одном варианте полипептид ВАСЕ присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (т.е. фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из доменов СН2 или СН3 из человеческого ΙβΟ.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белок слияния на основе ВАСЕ включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 56 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична указанным последовательностям. Например, в некоторых вариантах последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью к 8ЕО Ш ΝΟ: 56 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 57, включает последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 56 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 57 без С-концевого лизина.
Белок или полипептид ВАСЕ может включать полноразмерный человеческий ВАСЕ (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1) или фрагмент человеческого ВАСЕ. В одном варианте полипептид ВАСЕ не включает каких-либо остатков из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность ВАСЕ может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из ВАСЕ полной длины (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1). В альтернативных вариантах полипептид ВАСЕ может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична человеческому ВАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид ВАСЕ может включать человеческий ВАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует глицин, а не метионин (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или в другом варианте человеческий ВАСЕ может включать полноразмерный ВАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3) (фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности.
Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать кВАСЕ (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4), полипептид, который на 90% идентичен кВАСЕ, или фрагмент кВАСЕ. Например, полипептид ВАСЕ может включать человеческий кВАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует скорее глицин, а не метионин (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или в другом варианте человеческий ВАСЕ может включать кВАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 45, фиг. 1) или часть указанной аминокислотной последовательности. В других вариантах белок ВАСЕ может включать V домен (см., например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 46, фиг. 1). Или в другом варианте может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или в другом варианте белок ВАСЕ может включать фрагмент ВАСЕ, включающий часть V домена (см., например, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 47, фиг. 1). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕО Ш ΝΟ: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 47 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей. В еще одном варианте фрагмент ВАСЕ представляет собой синтетический пептид.
Например, полипептид ВАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-116 из человеческого ВАСЕ (8ЕО Ш ΝΟ: 7) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-116 из человеческого ВАСЕ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-116, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 46), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична
- 32 017291 ей, соответствующую V домену КАСЕ. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 124-221 из человеческого КАСЕ (8ЕО Ш N0: 11) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую С1 домену КАСЕ. В другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 227-317 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 12) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую С2 домену КАСЕ. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-123 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 13) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислоты на участке 24-123 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 14) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 24-123 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ΙΌ N0: 48), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-226 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0:17) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-226 из человеческого КАСЕ (8Е0 Ш N0: 18) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую V домену, С1 домену и междоменному линкеру, соединяющему оба указанных домена. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 24-226 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ΙΌ N0: 50), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична. Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-339 из человеческого КАСЕ (8Е0 Ш N0: 5) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или на участке 24-339 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 6) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, соответствующую бКАСЕ (т.е. кодирующую V, С1 и С2 домены и междоменные линкеры). Или в другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 24-339 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ (8Е0 ΙΌ N0: 45), или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 23-51 из 8Е0 Ш N0: 1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 23-51 из 8Е0 ΙΌ N0: 1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 31-51 из 8Е0 ΙΌ N0: 1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайт связывания лиганда может включать аминокислоты 31-116 из 8Е0 Ш N0: 1. Например, сайт связывания лиганда может включать V домен КАСЕ или его часть, такую как домен связывания лиганда КАСЕ (например, аминокислоты на участках 1-118, 23-118, 24-118, 31-118, 1-116, 23-116, 24-116, 31-116, 1-54, 23-54, 24-54, 31-54, 1-53, 23-53, 24-53 или 31-53 из 8Е0 ΙΌ N0: 1 или фрагменты указанных участков) (фиг. 1). Или могут использоваться фрагменты полипептидов, которые способны функционально связываться с лигандом КАСЕ. Или в другом варианте может использоваться последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична V домену КАСЕ или его фрагменту (как было описано выше). Кроме того, как известно в данной области, в тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где вконец белка слияния представлен глютамином, например, как в случае удаления сигнальной последовательности, включающей остатки 1-23 из 8Е0 ΙΌ N0: 1 (например, 024 в случае полипептида, включающего аминокислоты 24-118 или 8Е0 ΙΌ N0: 1), такой глютамин может быть циклизован с образованием пироглютаминовой кислоты (рЕ).
Белок слияния на основе КАСЕ может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид в белке слияния на основе КАСЕ может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: Ι^^γ), Ι^Μ(μ), Ι§Ό(δ), ^ЕО:) или ΙμΛ(α). Дополнительно тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: Ι£θ1 (γ 1), IдС2(γ2), IдС3(γ3), ^С4^4), ^АЦа^, ^А2(а2) или на основе мутантных вариантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, меняющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать Сн2 и Сн3 домены из человеческого ^С1, или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве иллюстративных вариантов можно указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены человеческого ΙβΟ1 или их часть, которая может включать 8Е0 ΙΌ N0: 40 или ее часть. В одном варианте полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены человеческого ΙβΟ1 или их часть, может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или ее часть. Например, полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены человеческого ΙβΟ1 или их часть, может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40 с удаленным концевым лизином (К). Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 39 или 8Е0 ΙΌ N0: 41. Иммуноглобулиновая последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40 может также кодироваться последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 52 или 8Е0 Ш N0: 53.
Ес часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительной активностью ш у1уо. Так, в од
- 33 017291 ном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ может также включать полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему СН2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте СН2 домен или его фрагмент может включать 8Е0 ΙΌ N0: 42. В одном варианте фрагмент 8Е0 ΙΌ N0: 42 может включать последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 42 с удаленными десятью аминокислотами.
В одном варианте полипептид КАСЕ включает междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к ^концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего СН2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий СН2 домен иммуноглобулина или его часть, может включать СН2 и СН3 домены из человеческого 1дС1, или часть обоих или одного из указанных доменов. В рамках иллюстративных вариантов можно отметить, что полипептид, включающий СН2 и СН3 домены из человеческого 1дС1 или их часть, может включать 8Е0 ΙΌ N0: 40 или ее часть. В одном варианте полипептид, включающий СН2 и СН3 домены из человеческого 1дС1 или их часть, может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или ее часть. Например, полипептид, включающий СН2 и СН3 домены из человеческого ^С1 или их часть, может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40, с удаленным концевым лизином (К).
Белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из КАСЕ. Кроме того, полипептид КАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, может включать фрагмент полноразмерного белка КАСЕ. Например, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Белок слияния на основе КАСЕ может включать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что N концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, ^концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена СН2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 19) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 20) или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей (8Е0 ΙΌ N0: 51), соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации из С1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 30 или ее фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 54 или ее фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, где молчащие изменения оснований в кодонах, которые кодируют пролин (ССС на ССС) и глицин (ССТ на ССС) на С-конце последовательности удаляют сайт сплайсинга криптической РНК возле концевого кодона (например, нуклеотиды 1375-1380 из 8Е0 ΙΌ N0: 30 модифицируют с получением 8Е0 ΙΌ N0: 54).
Альтернативно, трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Например, белок слияния на основе КАСЕ может включать один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домен СН2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-136 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-136 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая на 90% идентична ей, или аминокислоты на участке 24-136 из человеческого КАСЕ, где 024 циклизуется с образованием рЕ, или последовательность, которая на 90% идентична ей (8Е0 ΙΌ N0: 49), соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру, в направлении считывания информации. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния КАСЕ. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 55 или его
- 34 017291 фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния КАСЕ, где молчащие изменения оснований в кодонах, которые кодируют пролин (ССС на ССС) и глицин (ССТ на ССС) на С-конце последовательности удаляют сайт сплайсинга криптической РНК возле концевого кодона (например, нуклеотиды 10301035 из 8ЕО ΙΌ N0: 31 модифицируют с получением 8Е0 ΙΌ N0: 55).
Фрагмент междоменного линкера КАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации, в природном состоянии, и, таким образом, присоединения к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. Например, в случае V домена КАСЕ, междоменный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из V домена. В одном варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 полноразмерного КАСЕ. Или в другом варианте линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, 1-10 или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из 8Е0 ΙΌ N0: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения междоменный линкер включает 8Е0 ΙΌ N0: 23, включающий аминокислоты на участке 117-136 из полноразмерного КАСЕ. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 21 или 8Е0 ΙΌ N0: 23.
В случае С1 домена КАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из С1 домена. В одном варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 из КАСЕ полной длины. Или в другом варианте линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, 1-10 или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из 8Е0 ΙΌ N0: 22. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 23, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5 или 1-10 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер КАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 22 или 8Е0 ΙΌ N0: 24.
Или междоменный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из КАСЕ. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая по меньшей мере на на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 44.
Фармацевтически приемлемые носители могут включать любые стандартные фармацевтически приемлемые носители, известные в данной области. В одном варианте фармацевтический носитель может представлять собой жидкость и белок слияния на основе КАСЕ или конструкция нуклеиновой кислоты могут иметь вид раствора. В другом варианте фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество, имеющее вид порошка, лиофилизированного порошка или таблетки. Или в другом варианте фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой гель, суппозиторий или крем. В альтернативных вариантах носитель может включать липосому, микрокапсулу, клетку, инкапсулированную в полимер, или вирус. Так, термин фармацевтически приемлемый носитель включает, без ограничения, любые стандартные фармацевтически приемлемые носители, такие как вода, спирты, фосфатно-буферный солевый раствор, сахара (например, сахарозу или маннит), масла или эмульсии, такие как масляно-водные эмульсии, или триглицеридную эмульсию, различные типы увлажнителей, покрытые оболочкой таблетки и капсулы.
В некоторых вариантах белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут присутствовать в нейтральной форме (включая цвиттер-ионные формы) или в виде положительно или отрицательно заряженных молекул. В некоторых вариантах белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут образовывать комплексное соединение с противоионом с образованием фармацевтически приемлемой соли.
Термин фармацевтически приемлемая соль относится к комплексу, включающему один или несколько белков слияния на основе КАСЕ и один или несколько противоионов, где указанные противоионы получены из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований.
Фармацевтически приемлемые неорганические основания включают ионы металла. Более предпочтительные ионы металла включают, без ограничения, соли щелочного металла, соли щелочноземельного металла и соли других физиологически приемлемых ионов металлов. Соли, полученые из неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, кобальта, никеля, молибдена, ванадия, марганца, хрома, селена, олова, меди, трехвалентного и двухвалентного железа, лития, магния, трехвалентного и двухвалентного марганца, калия, рубидия, натрия и цинка, в форме их обычной ва
- 35 017291 лентности.
Фармацевтически приемлемые аддитивные соли кислоты белков слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут быть получены из следующих кислот, включающих, без ограничения, муравьиную, уксусную, ацетамидобензойную, адипиновую, аскорбиновую, борную, пропионовую, бензойную, камфорную, угольную, цикламовую, дегидрохолевую, малоновую, эдетовую, этилсерную, фендизойную, метафосфорную, янтарную, гликолевую, глюкуроновую, молочную, яблочную, винную, танниновую, лимонную, азотную, аскорбиновую, глюкуроновую, малеиновую, фолиевую, фумаровую, пропионовую, пировиноградную, аспарагиновую, глютаминовую, бензойную, хлористо-водородную, бромисто-водородную, иодисто-водородную, лизин, изолимонную, трифторуксусную, памоевую, пропионовую, антраниловую, мезиловую, оротовую, щавелевую, щавелевоуксусную, олеиновую, стеариновую, салициловую, аминосалициловую, силикатную, п-гидроксибензойную, никотиновую, фенилуксусную, миндальную, эмбоновую, сульфоновую, метансульфоновую, фосфорную, фосфоновую, этансульфоновую, этандисульфоновую, аммоний, бензолсульфоновую, пантотеновую, нафталинсульфоновую, толуолсульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, сульфаниловую, серную, азотную, азотистую, монометиловый эфир серной кислоты, циклогексиламиносульфоновую, β-гидроксимасляную, глицин, глицилглицин, глютаминовую, какодилат, диаминогексаноевую, камфорсульфоновую, глюконовую, тиоциановую, оксоглутаровую, пиридоксаль-5-фосфат, хлорфеноксиуксусную, ундекановую, №ацетил-Ь-аспарагиновую, галактаровую и галактуроновые кислоты.
Фармацевтически приемлемые органические основания включают триметиламин, диэтиламин, ^№-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, дибензиламин, диэтаноламин, этилендиамин, меглумин ^-метилглюкамин), прокаин, циклические амины, катионы четвертичного аммония, аргинин, бетаин, кофеин, клемизол, 2-этиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этандиамин, бутиламин, этаноламин, этилендиамин, №этилморфолин, №этилпиперидин, этилглюкамин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидробамин, имидазол, изопропиламин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиридин, пиридоксин, неодимий, пиперидин, полиаминные смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, трипропиламин, триэтаноламин, трометамин, метиламин, таурин, холат, 6-амино-2-метил-2гептанол, 2-амино-2-метил-1,3-пропандиол, 2-амино-2-метил-1-пропанол, алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты, стронций, трицин, гидразин, фенилциклогексиламин, 2-(№морфолино)этансульфоновую кислоту, бис(2-гидроксиэтил)амино-трис(гидроксиметил)метан, №-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту, 1,4-пиперазиндиэтансульфоновую кислоту, 3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновую кислоту, 1,3-бис[трис(гидроксиметил)метиламино]пропан, 4-морфолинопропансульфоновую кислоту, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1этансульфоновую кислоту, 2-[(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)амино]этансульфоновую кислоту, ^№бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту, 4-(№морфолино)бутансульфоновую кислоту, 3-^,№бис[2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновую кислоту, 2-гидрокси-3[трис(гидроксиметил)метиламино]-1-пропансульфоновую кислоту, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-(2гидроксипропансульфоновую кислоту), дигидрат пиперазин-1,4-бис(2-гидроксипропансульфоновой кислоты), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновую кислоту, ^№бис(2-гидроксиэтил)глицин, №(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(4-бутансульфоновую кислоту), №[трис(гидроксиметил)метил]-3аминопропансульфоновую кислоту, №трис(гидроксиметил)метил-4-аминобутансульфоновую кислоту, №(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-3-амино-2-гидроксипропансульфоновую кислоту, 2-(циклогексиламино) этансульфоновую кислоту, 3-(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновую кислоту, 3(циклогексиламино)-1-пропансульфоновую кислоту, №(2-ацетамидо)иминодиуксусную кислоту, 4(циклогексиламино)-1-бутансульфоновую кислоту, №[трис(гидроксиметил)метил]глицин, 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол и трометамол.
Введение белков слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению может осуществляться разными способами. Так, введение белка слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению может осуществляться внутрибрюшинной (в/б) инъекцией. Альтернативно, белок слияния на основе ВАСЕ может вводиться перорально, интраназально или в форме аэрозоля. В другом варианте введение представляет собой внутривенное введение (в/в). Белок слияния на основе ВАСЕ может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществляют внутриартериальное введение белка слияния на основе ВАСЕ. В еще одном варианте введение осуществляется сублингвально. Кроме того, для введения могут использоваться капсулы с пролонгированным высвобождением. Например, может использоваться подкожное введение, которое полезно для лечения хронических заболеваний, в тех случаях, когда желательно самостоятельное введение.
В другом аспекте осуществления настоящего изобретения белки слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут быть использованы в адъювантной терапии или в комбинированной терапии вместе с другими известными терапевтическими агентами. Ниже приведен не исчерпывающий перечень адъювантов и дополнительных терапевтических агентов, которые могут использоваться в сочетании с белками слияния на основе ВАСЕ, в качестве модуляторов согласно настоящему изобретению.
Фармакологическая классификация противораковых агентов.
- 36 017291
1. Алкилирующие агенты: циклофосфамид, нитрозомочевина, карбоплатин, цисплатин, прокарбазин.
2. Антибиотики: блеомицин, даунорубицин, доксорубицин.
3. Антиметаболиты: метотрексат, цитарабин, фторурацил, азатиоприн.
4. Меркаптопурин и цитотоксические химиотерапевтические средства.
5. Растительные алкалоиды: винбластин, винкристин, этопозид, паклитаксел.
6. Гормоны: тамоксифен, октреотида ацетат, финастерид, флутамид.
7. Модификаторы биологического ответа: интерфероны, интерлейкины.
Фармакологическая классификация средств, применяемых при лечении ревматоидного артрита.
1. Анальгетики: аспирин.
2. НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства): ибупрофен, напроксен, диклофенак.
3. ОМАВО (антиревматические средства, модифицирующие заболевание): метотрексат, препараты на основе золота, гидроксихлорокин, сульфасалазин.
4. Модификаторы биологического ответа, ОМАВЭ: этанерцепт, инфликсимаб, глюкокортикоиды, такие как беклометазон, метилпреднизолон, бетаметазон, преднизон, дексаметазон и гидрокортизон.
Фармакологическая классификация средств, применяемых для лечения сахарного диабета.
1. Сульфонилмочевины: толбутамид, толазамид, глибурид, глипизид.
2. Бигуаниды: метформин.
3. Другие пероральные агенты: акарбоза, троглитазон.
4. Инсулин.
Фармакологическая классификация средств, применяемых при лечении болезни Альцгеймера.
1. Ингибитор холинэстеразы: такрин, донепезил.
2. Антипсихотические препараты: галоперидол, тиоридазин.
3. Антидепрессанты: дезипрамин, флуоксетин, тразодон, пароксетин.
4. Противосудорожные препараты: карбамазепин, валпроевая кислота.
В одном варианте композиции согласно настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество белка слияния на основе ВАСЕ в сочетании с одним или несколькими терапевтическим агентами. Кроме указанных выше средств, в сочетании с белками слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться следующие терапевтические агенты: иммуносупрессоры, такие как циклоспорин, такролимус, рапамицин и другие иммуносупрессоры, относящиеся к ЕК-506 типу иммуносупрессоров.
В одном варианте настоящее изобретение также относится к способу лечения заболеваний, опосредованных ВАСЕ, где указанный способ включает введение субъекту, при наличии такой необходимости, терапевтически эффективного количества белка слияния на основе ВАСЕ в сочетании с терапевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, растительных алкалоидов, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологического ответа, анальгетиков, НСПВС, ОМАВЭ, модификаторов биологического ответа (например, глюкокортикоидов), сульфонилмочевин, бигуанидов, инсулина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических препаратов, антидепрессантов, противосудорожных препаратов и иммуносупрессоров, таких как циклоспорин, такролимус, рапамицин и другие иммуносупрессоры, относящиеся к ЕК-506 типу иммуносупрессоров. В другом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, которая также включает один или несколько терапевтических агентов, выбранных из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, растительных алкалоидов, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологического ответа, анальгетиков, НСПВС, ОМАВЭ, модификаторов биологического ответа (например, глюкокортикоидов), сульфонилмочевин, бигуанидов, инсулина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических препаратов, антидепрессантов, противосудорожных препаратов и иммуносупрессоров, таких как циклоспорин, такролимус, рапамицин и другие иммуносупрессоры, относящиеся к ЕК-506 типу иммуносупрессоров.
Лиофилизированные композиции.
В других вариантах настоящее изобретение относится к композициям, включающим белок слияния на основе ВАСЕ. Различные варианты таких композиций могут включать лиофилизированную смесь лиопротектора, белка слияния на основе ВАСЕ и буфера.
В лиофилизированных композициях белка слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться различные лиопротекторы. В некоторых вариантах лиопротектор может включать невосстанавливающий сахар. Например, указанный невосстанавливающий сахар может включать сахарозу, маннит или трегалозу. Кроме того, в лиофилизированных композициях белка слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться множество буферов. В некоторых вариантах указанный буфер может включать гистидин.
Лиофилизированный белок слияния на основе ВАСЕ может включать дополнительные компоненты. В некоторых вариантах композиция белка слияния на основе ВАСЕ может также включать по меньшей мере один из следующих агентов: поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент или наполнитель. В одном варианте восстановленная композиция белка слияния на основе ВАСЕ содержит примерно 40-100 мг/мл белка слияния на основе ВАСЕ, включающего последовательность, представлен
- 37 017291 ную в 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57; от примерно 2 до примерно 50 мМ гистидина; от примерно 60 до примерно 65 мМ сахарозы; от примерно 0,001 до примерно 0,05% Твина 80; и характеризуется значением рН, равным примерно 6,0-6,5. Так, например, восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может в некоторых вариантах содержать примерно 40-50 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ, включающего последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57; примерно 10 мМ гистидина; примерно 65 мМ сахарозы; примерно 0,01% Твина 80; и характеризуется значением рН, равным примерно 6,0. Или, как это описано в настоящем тексте, могут использоваться также другие концентрации белка слияния на основе КАСЕ.
В одном варианте настоящее изобретение относится к восстановленной композиции, включающей лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ, восстановленный разбавителем, где концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции варьируется в диапазоне от примерно 1 до примерно 400 мг/мл. Или, как это описано в настоящем тексте, могут использоваться также другие концентрации белка слияния на основе КАСЕ.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способам получения стабильной восстановленной композиции белка слияния на основе КАСЕ. Восстановленная композиция может ключать концентрацию, которая приемлема для непосредственного применения (например, для целей прямого введения субъекту) или которая может быть далее разбавлена и/или смешана с агентом доставки.
В некоторых вариантах указанный способ может включать восстановление лиофилизированной смеси белка слияния на основе КАСЕ и лиопротектора с использованием разбавителя так, чтобы концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции укладывалась в диапазон от примерно 1 л до примерно 400 мг/мл. Или, как это описано в настоящем тексте, могут использоваться также другие концентрации белка слияния на основе КАСЕ.
В восстановленных композициях белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться множество лиопротекторов. В некоторых вариантах указанный лиопротектор может включать невосстанавливающий сахар. Например, указанный невосстанавливающий сахар может включать сахарозу, маннит или трегалозу. Кроме того, в лиофилизированных композициях белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться множество буферов. В некоторых вариантах указанный буфер может включать гистидин.
Восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может включать дополнительные компоненты. В некоторых вариантах композиция белка слияния на основе КАСЕ может также включать по меньшей мере один из следующих агентов: поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент или наполнитель. В одном варианте восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ содержит примерно 40-100 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ, включающего последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57; от примерно 2 до примерно 50 мМ гистидина; от примерно 60 до примерно 65 мМ сахарозы; от примерно 0,001 до примерно 0,05% Твина 80; и характеризуется значением рН, равным примерно 6,0-6,5. Так, например, восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может в некоторых вариантах содержать примерно 40-50 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ, включающего последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 или 57; примерно 10 мМ гистидина; примерно 65 мМ сахарозы; примерно 0,01% Твина 80; и характеризуется значением рН, равным примерно 6,0.
Для восстановления лиофилизированного белка слияния на основе КАСЕ может использоваться множество фармацевтически приемлемых разбавителей. В одном варианте лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ является стерильным. Дополнительно в одном варианте разбавитель также является стерильным. В одном варианте указанный разбавитель может включать воду для инъекций (\УБ[). Дополнительно в некоторых вариантах количество добавляемого разбавителя определяется терапевтической дозировкой и фармакокинетическим профилем белка слияния на основе КАСЕ, а также биосовместимостью подлежащих введению композиции и носителя. В одном варианте восстановленная композиция является изотонической.
Композиция белка слияния на основе КАСЕ может включать терапевтический агент, который изготовлен для целей использования в клинических условиях или в качестве предписываемого для приема лекарственного средства. Например, в некоторых вариантах восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может демонстрировать уровень разложения менее чем 10%, или менее чем 5%, или менее чем 3% после хранения в течение одной недели при температуре 40°С.
Кроме того, композиция белка слияния на основе КАСЕ может быть стабильной при ее восстановлении разбавителем. В некоторых вариантах белок слияния на основе КАСЕ присутствует в виде агрегата на уровне менее чем примерно 10%, или примерно 5%, или примерно 4%, или примерно 3%, или примерно 2%, или примерно 1% в композиции белка слияния на основе КАСЕ.
Восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может быть пригодна для введения в рамках различных способов в соответствии с потребностями, диктуемыми методом лечения рассматриваемого КАСЕ-опосредованного нарушения. В некоторых вариантах восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ пригодна для введения в рамках по меньшей мере одного из указанных способов введения композиции субъекту: внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.
- 38 017291
Например. в некоторых вариантах настоящее изобретение может относиться к стабильной восстановленной композиции. включающей белок слияния на основе КАСЕ в концентрации. составляющей по меньшей мере 10 мг/мл. или по меньшей мере 20 мг/мл. или по меньшей мере 50 мг/мл. и разбавитель. где указанную восстановленную композицию получают из лиофилизированной смеси белка слияния на основе КАСЕ и лиопротектора. В альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может составлять по меньшей мере 100 мг/мл. или по меньшей мере 200 мг/мл. или по меньшей мере 400 мг/мл. В других альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может быть представлена количеством. по меньшей мере. в диапазоне от примерно 0.5 до примерно 400 мг/мл. от примерно 1 до примерно 200 мг/мл. от примерно 40 до примерно 400 мг/мл. примерно от 40 до 100 мг/мл или примерно в диапазоне 40-50 мг/мл. Композиция может также включать буфер.
В еще других вариантах настоящее изобретение может относиться к промышленному изделию. которое включает белки слияния на основе КАСЕ. Например. в некоторых вариантах промышленное изделие может включать контейнер. который содержит лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ и инструкцию по восстановлению указанной лиофилизированной композиции разбавителем. В некоторых вариантах указанные производственные изделия могут включать контейнер. который содержит композицию. включающую лиофилизированную смесь лиопротектора. белка слияния на основе КАСЕ и буфера. Указанное промышленное изделие может также включать инструкцию по восстановлению указанной лиофилизированной композиции разбавителем.
Может использоваться множество лиопротекторов в промышленных изделиях согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах указанный лиопротектор может включать невосстанавливающий сахар. Например. указанный невосстанавливающий сахар может включать сахарозу. маннит или трегалозу. Кроме того. в лиофилизированной композиции белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может использоваться множество буферов. В некоторых вариантах указанный буфер может включать гистидин.
Композиция белка слияния на основе КАСЕ в промышленных изделиях может включать дополнительные компоненты. В некоторых вариантах композиция белка слияния на основе КАСЕ может также включать по меньшей мере один из следующих агентов: поверхностно-активное вещество. хелатирующий агент или наполнитель. В одном варианте производственные изделия согласно настоящему изобретению включают композицию белка слияния на основе КАСЕ. которая при восстановлении содержит примерно 40-100 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ. включающего последовательность. представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 32. 33. 34. 56. 35. 36. 37 или 57; от примерно 2 до примерно 50 мМ гистидина; от примерно 60 до примерно 65 мМ сахарозы; от примерно 0.001 до примерно 0.05% Твина 80; и характеризуется значением рН. равным примерно 6.0-6.5. Так. например. восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может в некоторых вариантах содержать примерно 40-50 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ. включающего последовательность. представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 32. 33. 34. 56. 35. 36. 37 или 57; примерно 10 мМ гистидина; примерно 65 мМ сахарозы; примерно 0.01% Твина 80; и характеризуется значением рН. равным примерно 6.0. Или. как это описано в настоящем тексте. могут использоваться также другие концентрации белка слияния на основе КАСЕ.
Для восстановления лиофилизированного белка слияния на основе КАСЕ может использоваться множество фармацевтически приемлемых разбавителей. В одном варианте лиофилизированная форма является стерильной. Альтернативно или дополнительно. разбавитель также является стерильным. В одном варианте указанный разбавитель может включать воду для инъекций (№ΕΙ). Таким образом. промышленное изделие может также включать второй контейнер. который содержит разбавитель для восстановления лиофилизированной композиции. где указанный разбавитель представляет собой воду для инъекций (№ΕΙ). В одном варианте восстановленная композиция является изотонической.
Кроме того. в некоторых вариантах количество добавляемого разбавителя определяется терапевтической дозировкой и фармакокинетическим профилем белка слияния на основе КАСЕ. а также биосовместимостью подлежащих введению композиции и носителя. В альтернативном варианте прилагаются инструкции по восстановлению лиофилизированной композиции так. чтобы достичь при восстановлении концентраций. соответствующих приведенным в данном описании. Например. в некоторых вариантах прилагаются инструкции по восстановлению лиофилизированной композиции. которые позволяют достичь концентраций белка слияния на основе КАСЕ в диапазоне от примерно 40 до примерно 100 мг/мл.
Композиция белка слияния на основе КАСЕ. предлагаемая в виде промышленного изделия. может содержать стабильный терапевтический агент. который изготовлен для целей использования в клинических условиях или в качестве предписываемого для приема лекарственного средства. Например. в некоторых вариантах восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может демонстрировать уровень разложения менее чем 10%. или менее чем 5%. или менее чем 3% после хранения в течение одной недели при температуре 40°С. Кроме того. композиция белка слияния на основе КАСЕ может быть стабильной при ее восстановлении разбавителем. В некоторых вариантах белок слияния на основе КАСЕ присутствует в виде агрегата на уровне менее чем примерно 10%. или примерно 5%. или примерно 4%. или примерно 3%. или примерно 2%. или примерно 1% в композиции белка слияния на основе КАСЕ.
- 39 017291
Кроме того, в некоторых вариантах при восстановлении согласно прилагаемой инструкции восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ может быть пригодна для введения в рамках различных способов в соответствии с потребностями, диктуемыми методом лечения рассматриваемого КАСЕ-опосредованного нарушения. В некоторых вариантах восстановленная композиция белка слияния на основе КАСЕ пригодна для введения в рамках по меньшей мере одного из указанных способов введения композиции субъекту: внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.
Так, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, относящихся к композициям, производственным изделиям и способам изготовления композиций, включающих белок слияния на основе КАСЕ, концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может составлять по меньшей мере 10 мг/мл, или по меньшей мере 20 мг/мл, или по меньшей мере 50 мг/мл. В альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может составлять по меньшей мере 100 мг/мл, или 200 мг/мл, или 400 мг/мл. Например, в альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может составлять по меньшей мере примерно от 0,5 до 400 мг/мл, или примерно от 1 до 200 мг/мл, или примерно от 40 до 400 мг/мл, или примерно от 50 до 400 мг/мл, или примерно от 40 до 100 мг/мл, или примерно от 50 до 100 мг/мл, или примерно в диапазоне 40-50 мг/мл. Например, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ вводят в композицию в виде стерильного водного раствора, имеющего рН в диапазоне от примерно 5,0 до примерно 6,5 и включающего от примерно 1 до примерно 200 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ, от примерно 1 до примерно 100 ммоль гистидинового буфера, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл полисорбата 80, от примерно 100 до примерно 400 ммоль трегалозы и от примерно 0,01 до примерно 1,0 ммоль дигидрата динатриевой соли ЭДТА.
В составе композиций согласно настоящему изобретению может быть использован любой из описанных вариантов в качестве белка слияния на основе КАСЕ. Так, в случае каждой из лиофилизированных композиций, восстановленных лиофилизированных композиций или в случае каждого из способов получения лиофилизированных композиций или восстановленных лиофилизированных композиций, промышленных изделий, включающих лиофилизированные композиции или восстановленные лиофилизированные композиции согласно настоящему изобретению, белок слияния на основе КАСЕ может включать последовательность, полученную из сайта связывания лиганда КАСЕ, присоединенного к иммуноглобулиновому полипептиду.
Таким образом, в разных вариантах белок слияния на основе КАСЕ может включать полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домен иммуноглобулина согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах полипептид КАСЕ может включать междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к №концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Например, в некоторых вариантах белок слияния может включать первый иммуноглобулиновй домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что N концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, N-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, N-концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте иммуноглобулинового домена Сн2 или к части Сн2 домена иммуноглобулина.
В альтернативных вариантах, относящихся к белку слияния на основе КАСЕ, полипептид КАСЕ может включать аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, или последовательность, которая показана в виде 8ЕЦ ΙΌ N0: 47, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей. В других альтернативных вариантах белок слиния на основе КАСЕ может включать аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей. Например, в некоторых вариантах, последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична 8ЕЦ ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57, включает полипептид с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57 без С-концевого лизина.
Получение лиофилизированных композиций.
В другом варианте настоящее изобретение относится к предварительно лиофилизированной композиции, лиофилизированной композиции, к восстановленной композиции и к способам их получения.
После получения описанного выше белка слияния на основе КАСЕ, представляющего интерес, может быть создана предварительно лиофилизированная композиция. Количество белка слияния на основе КАСЕ в такой предварительно лиофилизированной композиции может быть определено с учетом же
- 40 017291 лательных объемов вводимой дозы, способов введения и т. п. В одном варианте количество белка слияния в такой предварительно лиофилизированной композиции может быть выше чем 1 мг/мл. Кроме того, в некоторых вариантах количество белка слияния в предварительно лиофилизированной композиции может быть выше чем 5, 10, 50, 100 или 200 мг/мл.
В другом варианте рассматриваемая предварительно лиофилизированная композиция может представлять собой рН-забуференный раствор со значением рН в диапазоне 4-8. В другом варианте рассматриваемая предварительно лиофилизированная композиция может представлять собой рН-забуференный раствор со значением рН в диапазоне 5-7. В другом варианте рассматриваемая предварительно лиофилизированная композиция может представлять собой рН-забуференный раствор со значением рН менее чем 6,7. В другом варианте рассматриваемая предварительно лиофилизированная композиция может представлять собой рН-забуференный раствор со значением рН, равным примерно 6,0. Примеры соответствующих буферов включают гистидиновый, фосфатный, Трис, цитратный, сукцинатный буферы и буферы, полученные на основе других органических кислот, описанных в настоящем тексте. Концентрация буфера может варьировать от примерно 1 до примерно 100 мМ или может составлять менее чем примерно 50 мМ, или может укладываться в диапазон значений от примерно 2 до примерно 50 мМ, или может составлять менее чем примерно 15 мМ, или может быть в диапазоне значений от примерно 3 до примерно 15 мМ в зависимости, например, от используемого буфера и желательных изотонических показателей данной композиции (например, восстановленной композиции). В одном варианте указанный буфер представляет собой гистидиновый буфер.
К предварительно лиофилизированной композиции может быть добавлен лиопротектор. В одном варианте лиопротектор включает сахар. В другом варианте указанный лиопротектор включает невосстанавливающий сахар. В другом варианте указанный лиопротектор включает невосстанавливающий сахар в виде сахарозы. Или указанный невосстанавливающий сахар может включать маннит. Или указанный невосстанавливающий сахар может включать трегалозу. В основном в предварительно лиофилизированную композицию вводят такое количество лиопротектора, чтобы при восстановлении получить изотоническую композицию. Однако может быть также приемлема гипертоническая восстановленная композиция, например в случае композиций для периферического патентерального введения. Кроме того, количество добавляемого лиопротектора не должно быть слишком низким с тем, чтобы при лиофилизации не происходила неприемлемо высокая деградация и/или агрегация белка. В альтернативных вариантах неприемлемый уровень агрегации означает наличие в композиции в виде агрегата 20%, или 10%, или 5%, или большего количества белка слияния на основе КАСЕ. Одним из примеров диапазона концентраций лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции может быть концентрация, меньшая чем примерно 400 мМ. В другом варианте диапазон концентраций лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции составляет менее чем примерно 100 мМ. В другом варианте диапазон концентраций лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции составляет примерно от 0,5 до 400 мМ, или примерно от 2 до 200 мМ, или от примерно 30 до примерно 150 мМ, или примерно 60-65 мМ. Кроме того, в некоторых вариантах лиопротектор добавляют в таком количестве, чтобы сделать восстановленную композицию изотонической.
Соотношение белка слияния на основе КАСЕ к лиопротектору в предварительно лиофилизированной композиции подбирают для каждого сочетания белка слияния на основе КАСЕ и лиопротектора. В одном варианте, относящемся к изотонической восстановленной композиции с высоким содержанием белка слияния на основе КАСЕ (например, больше или равным примерно 50 мг/мл), молярное соотношение лиопротектора к белку слияния на основе КАСЕ может составлять от примерно 50 до примерно 1500 моль лиопротектора к 1 моль белка слияния на основе КАСЕ. В другом варианте молярное соотношение лиопротектора к белку слияния на основе КАСЕ может составлять от примерно 150 до примерно 1000 моль лиопротектора к 1 моль белка слияния на основе КАСЕ. В другом варианте молярное соотношение лиопротектора к белку слияния на основе КАСЕ может составлять от примерно 150 до примерно 300 моль лиопротектора к 1 моль белка слияния на основе КАСЕ. Эти диапазоны могут быть приемлемы, например, в тех случаях, когда лиопротектор представляет собой невосстанавливающий сахар, такой как сахароза, трегалоза или маннит.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения к предварительно лиофилизированной композиции может быть добавлено поверхностно-активное вещество. Альтернативно или дополнительно, указанное поверхностно-активное вещество добавляют к лиофилизированной композиции и/или к восстановленной композиции. Иллюстративные примеры поверхностно-активных веществ включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80) (Твин 20™ или Твин 80™); полоксамеры (например, полоксамер 188). Поверхностно-активное вещество добавляют в таком количестве, чтобы снизить агрегацию восстановленного белка и минимизировать образование частиц после восстановления. Например, указанное поверхностно-активное вещество может присутствовать в предварительно лиофилизированной композиции в количестве, составляющем примерно от 0,001 до 0,5%. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, где поверхностноактивное вещество включает полисорбат 80, указанное поверхностно-активное вещество может присутствовать в предварительно лиофилизированной композиции в количестве, составляющем примерно от
- 41 017291
0,005 до 0,05% или примерно от 0,008 до 0,012%, или в количестве, равном примерно 0,01%. Альтернативно, указанное поверхностно-активное вещество может присутствовать в композиции в таком количестве, чтобы его конечная концентрация составляла от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл или от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при изготовлении предварительно лиофилизированной композиции может использоваться смесь лиопротектора (такого как сахароза или гистидин) и наполнителя (например, маннита или глицина). Использование наполнителя позволяет получить однородную лиофилизированную лепешку, в отсутствие в ней избытка полостей и т. п.
Другие фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, описанные, например, в руководстве Ремингтона (Кетшд!оп'к РЬаттасеи!1са1 8с1епсек 16!Ь еФШоп, 0ко1, А. ЕФ. (1980)), могут быть включены в предварительно лиофилизированную композицию (и/или лиофилизированную композицию, и/или восстановленную композицию), при условии, что они не оказывают неблагоприятного эффекта на желательные характеристики такой композиции. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают дополнительные забуферивающие агенты; консерванты; сорастворители; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие вещества, такие как ЭДТА; комплексы металлов (например, Ζη-белковые комплексы); биодеградируемые полимеры, такие как полиэфиры; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.
Композиции белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные белки, которые необходимы для конкретного показания, подлежащего лечению. Указанные дополнительные белки могут быть выбраны таким образом, чтобы все такие белки обладали комплементарными активностями, которые не оказывают неблагоприятного эффекта друг на друга или на белок слияния на основе КАСЕ. Соответственно, такие белки могут присутствовать в сочетании в количествах, которые являются эффективными для цели их использования.
Композиции белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут быть стерильными для целей их введения ш у1уо. Этого можно достичь путем фильтрования через стерильные мембранные фильтры до или после лиофилизации и восстановления.
После смешивания белка слияния на основе КАСЕ, лиопротектора и других необязательных компонентов композиция может быть подвергнута лиофилизации. Для этой цели известно и доступно множество аппаратов, осуществляющих сушку при замораживании, такие как аппараты для лиофильной сушки Ни1150™ (Ни11, И8А) или СТ20™ (ЬеуЬо1Ф-Негаеик, Сегтапу). Лиофильная сушка достигается путем замораживания композиции с последующей сублимацией льда из замороженного содержимого, при температуре, подходящей для перичной сушки. В этих условиях температура продукта имеет значение ниже эвтектической точки или температуры коллапса композиции. В типичном случае температура (кЬе1Г !етрега!иге) в процессе первичной сушки варьируется в дапазоне примерно от -50 до 25°С (при условии, что продукт остается замороженным в ходе первичной сушки), при соответствующем давлении, в диапазоне значений примерно от 50 до 250 мТорр. В одном варианте указанное давление составляет примерно 100 мТорр, и образец может быть лиофилизирован в диапазоне температур примерно от -30 до 25°С. Композиция, а также размер и тип контейнера, в котором содержится образец (например, стеклянный флакон), а также объем жидкости, все это может определяться требуемой длительностью сушки, которая может варьировать от нескольких часов до нескольких дней (например, 40-60 ч). Условия лиофильной сушки могут варьировать в зависимости от композиции и размера флакона.
В некоторых случаях может быть желательно лиофилизировать белковую композицию в контейнере, в который вводят восстановленную композицию белка с тем, чтобы избежать стадии переноса. В этом случае контейнер может представлять собой, например, флакон объемом 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 или 250 см3. В одном варианте указанный контейнер может быть представлен любым контейнером, подходящим для восстановления композиции, имеющей объем, менее или равный 100 мл.
Как правило, лиофилизация приводит к получению лиофилизированной композиции, в которой уровень влажности составляет менее чем примерно 5%. В одном варианте уровень влажности лиофилизированной композиции составляет менее чем примерно 3%. В другом варианте уровень влажности лиофилизированной композиции составляет менее чем примерно 1%.
Восстановление лиофилизированной композиции.
На желательной стадии в типичном случае к моменту введения пациенту или субъекту белка слияния на основе КАСЕ лиофилизированная композиция может быть восстановлена разбавителем, так чтобы концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляла примерно более 10 мг/мл, или более 20 мг/мл, или более 50 мг/мл, или более 30-50 мг/мл, или составляла примерно 50 мг/мл. В альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может составлять по меньшей мере 100, или 200, или 400 мг/мл. Например, в альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может иметь значения в диапазоне от примерно 1 до примерно 600 мг/мл, или от примерно 1 до примерно 500 мг/мл, или от примерно 1 до примерно 400 мг/мл, или от примерно 1 до примерно 200 мг/мл, или от при
- 42 017291 мерно 10 до примерно 4 00 мг/мл, или от примерно 10 до примерно 200 мг/мл, или от примерно 40 до примерно 400 мг/мл, или от примерно 40 до примерно 200 мг/мл, или от примерно 50 до примерно 400 мг/мл, или от примерно 50 до примерно 200 мг/мл. В других вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет от примерно 40 до примерно 100 мг/мл, или от примерно 50 до примерно 100 мг/мл, или от примерно 40 до примерно 50 мг/мл. Такие концентрации белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции рассматриваются как особенно полезные для подкожной доставки восстановленной композиции. Однако в случае других режимов введения, таких как внутривенное введение, могут быть желательны сниженные концентрации белка в восстановленной композиции (например, в диапазоне 5-50 мг/мл или примерно 10-40 мг/мл белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции). Таким образом, в некоторых вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может соответствовать или может быть сниженной в 2 раза относительно концентрации белка слияния в предварительно лиофилизированной композиции.
В некоторых вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции значительно выше, чем в предварительно лиофилизированной композиции. Так, например, концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может в некоторых вариантах превышать примерно в 2-40, или в 2-10, или в 3-8 раз его концентрацию в предварительно лиофилизированной композиции. В одном варианте концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может превышать примерно в 3-6 раз его концентрацию в предварительно лиофилизированной композиции. В другом варианте, где концентрация белка слияния на основе КАСЕ в предварительно лиофилизированной композиции составляет примерно 15 мг/мл, концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции выше или равна примерно 50 мг/мл (т.е. по меньшей мере в три раза выше или по меньшей мере в четыре раза выше).
Часто бывает полезной или даже необходимой доставка высокой концентрации белка при подкожном введении из-за ограничений вводимого объема (менее или равного 1,5 мл) и в связи с потребностью в увеличенной дозе (более или равной 100 мг). Однако таких концентраций белка (более или равных 50 мг/мл) не всегда удобно достичь в рамках производственного процесса, поскольку при высоких концентрациях белок может агрегировать и дальнейшие манипуляции с ним (например, закачивание насосом) и стерильное фильтрование затрудняются. Альтернативно, процесс лиофилизации может обеспечивать способ достижения нужной концентрации белка. Например, белок слияния на основе КАСЕ может быть введен во флаконы для заполнения с определенным объемом (νί) и затем может быть подвергнут лиофилизации. Затем лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ может быть восстановлен водой или консервантом (например, ΒνΕΙ) в объеме (ντ), меньшем, чем исходный объем (например, ντ=0,25 νί), что приводит к повышению концентрации белка слияния на основе КАСЕ в растворе восстановленного белка. Этот процесс также позволяет достичь нужной концентрации буферов и эксципиентов. В случае подкожного введения желательно, чтобы раствор был изотоническим.
Восстановление обычно проводят при температуре, равной примерно 25°С, с тем, чтобы гарантировать полную гидратацию, хотя, если это потребуется, могут использоваться другие температуры. Период времени, необходимый для восстановления, может зависеть, например, от типа разбавителя, количества одного или нескольких используемых эксципиентов и белка. Иллюстративные примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекций (ΒνΕΙ), рН-забуференный раствор (например, фосфатно-буферный раствор), стерильный солевой раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В одном варианте разбавитель обеспечивает получение восстановленной композиции, пригодной для инъекции. В другом варианте, где разбавитель обеспечивает получение восстановленной композиции, пригодной для инъекции, указанный разбавитель включает воду для инъекций (νΕΙ). Разбавитель необязательно содержит консервант. Количество добавляемого консерванта может быть определено при оценке разных концентраций консерванта на его совместимость с белком и при тестировании эффективности консерванта.
В альтернативных вариантах восстановленная композиция может содержать менее чем 8000, или менее чем 6000, или менее чем 4000, или менее чем 2000, или менее чем 1000, или менее чем 600, или менее чем 400, или менее чем 200, или менее чем 100, или менее чем 50 частиц, размер которых равен или превышает 10 мкм, в расчете на контейнер объемом 50 мл. В других вариантах восстановленная композиция может содержать менее чем 8000, или менее чем 6000, или менее чем 4000, или менее чем 2000, или менее чем 1000, или менее чем 600, или менее чем 400, или менее чем 200, или менее чем 100, или менее чем 50 частиц, размер которых равен или превышает 25 мкм, в расчете на контейнер объемом 50 мл.
Введение восстановленной композиции.
Восстановленная композиция при наличии потребности в лечении с использованием белка слияния на основе КАСЕ может вводиться млекопитающему, такому как человек, в соответствии с известными методами введения, такими как внутривенное введение в виде болюса или непрерывная инфузия в течение определенного периода времени, а также внутримышечное, внутрибрюшинное, интрацереброспинальное, подкожное, внутрисуставное, интрасиновиальное, интратекальное, пероральное, местное введе
- 43 017291 ние, или доставка путем ингаляции.
В разных вариантах восстановленная композиция может вводиться млекопитающему путем подкожного введения (т. е. под кожу). В таких случаях восстановленная композиция может быть инъецирована с использованием шприца. Однако доступны также другие устройства для введения восстановленной композиции, такие как инжекторы (например, инжекторы 1п)ес!-еаке™ и Сеп)ес!™); шприцы-тюбики (такие как !Не СепРеп™); безыгольные впрыскиватели (например, МейНес1ог™ и Вю1ес!ог™); а также системы для подкожной доставки через пластырь.
Подходящая доза или терапевтически эффективное количество белка слияния на основе КАСЕ соответствующим образом определяется и зависит, например, от состояния, которое подлежит лечению, тяжести и особенностей развития такого состояния, от того, с какой целью: профилактической или терапевтической, вводят белок слияния на основе КАСЕ, проводилось ли ранее лечение этого состояния, от истории болезни пациента и его реакции на белок слияния на основе КАСЕ, с учетом решения лечащего врача. Белок слияния на основе КАСЕ может вводиться субъекту (например, пациенту) однократно или в виде курса лечения, включающего серию введений, или может вводиться пациенту в любое время в зависимости от поставленного диагноза. Белок слияния на основе КАСЕ может вводиться в рамках самостоятельного лечения единственным препаратом или в сочетании с другими лекарственными средствами или видами терапии, применяемыми при лечении рассматриваемого состояния. В одном варианте исходная вводимая субъекту доза может составлять примерно 0,1-20 мг/кг, и она может быть введена один раз или может быть разделена на несколько отдельных введений. Как было указано выше, могут использоваться другие режимы введения.
Промышленные изделия.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к промышленному изделию, которое содержит лиофилизированную композицию согласно настоящему изобретению с прилагаемой инструкцией по ее восстановлению и/или использованию. Указанное промышленное изделие может включать контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы (например, двухкамерные флаконы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и опытные пробирки. Контейнер может быть изготовлен из разных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может содержать лиофилизированную композицию. В некоторых вариантах к контейнеру может быть прикреплена или иным образом прилагаться сопровождающая этикетка. На этикетке может быть приведена инструкция по восстановлению и/или использованию. Например, в некоторых вариантах на этикетке может быть указано, что лиофилизированная композиция восстанавливается до определенных концентраций белка, указанных выше. На этикетке также может быть указано, что данная композиция используется или предназначена для подкожного введения.
Контейнер, содержащий композицию, может представлять собой флакон для многоразового использования, который может использоваться при повторных введениях (например, для проведения 2-6, или 2-10, или 2-50 введений) восстановленной композиции. Промышленное изделие может также включать второй контейнер, содержащий разбавитель (например, \УЕ1). При смешивании разбавителя и лиофилизированной композиции, в основном достигается конечная концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции, равная по меньшей мере 10 мг/мл. В одном варианте конечная концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет по меньшей мере примерно 20 мг/мл. В другом варианте конечная концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет по меньшей мере примерно 50 мг/мл. В альтернативных вариантах концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции может составлять по меньшей мере 100, или 200, или 400 мг/мл. В других вариантах конечная концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет по меньшей мере примерно 1-400, или 1-200, или 1-100, или 10-400, или 10-200, или 10-100, или 40-400, или 40-200, или 40-100, или 50-400, или 50200, или 50-100, или от 40 до 50 мг/мл. Промышленное изделие может также включать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения или с позиции пользователя, которые включают другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листы-вкладыши с иснструкцией по применению.
Примеры
Особенности и преимущества настоящего изобретения, определяемые его концепцией, поясняются приведенными ниже примерами.
Пример 1А. Получение белков слияния КАСЕ-1дС.
Конструируют две плазмиды, экспрессирующие белки слияния КАСЕ-1дС. Обе плазмиды конструируют путем лигирования 5'-последовательности кДНК разной длины из человеческого КАСЕ с 3'последовательностью такой же кДНК из человеческого 1дС Ес (γ1). Указанные последовательности экспрессии (т.е. продукты лигирования) затем встраивают в вектор экспрессии рсБНА3.1 (1пуйгодеп, СА). Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют кодирующий участок белка слияния на основе КАСЕ, показаны на фиг. 2 и 3. В случае белка слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000, последовательность нуклеиновой кислоты на участке от 1 до 753 нуклеотида (выделена жирным шрифтом) кодирует №концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность нуклеиновой ки
- 44 017291 слоты на участке от 754 до 1386 нуклеотида кодирует белковую последовательность ^С Ес, без шарнирной области (фиг. 2). В случае ТТР-3000, последовательность нуклеиновой кислоты на участке от 1 до 408 (выделена жирным шрифтом) кодирует ^концевую белковую последовательность ВАСЕ, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты на участке от 409 до 1041 кодирует белковую последовательность ΙβΟ Ес, без шарнирной области (фиг. 3).
Для получения белков слияния на основе ВАСЕ векторы экспрессии, включающие последовательности нуклеиновой кислоты 8ЕЭ ΙΌ N0: 30 или 8ЕЭ ΙΌ N0: 31, подвергают стабильной трансфекции в клетки СНО. Положительные трансформанты отбирают по устойчивости к неомицину, придаваемой плазмидой, и далее клонируют. Размножают высокопродуцирующие клоны, по данным вестерн-блоттинг анализа супернатанта, и генный продукт очищают афинной хроматографией на колонках с белком А. Экспрессию оптимизируют таким образом, чтобы клетки продуцировали рекомбинантный ТТР-4000 на уровне примерно 1,3 г/л.
Пример 1В. Альтернативный способ получения четырехдоменных белков слияния на основе ВАСЕ.
Конструируют плазмиду для экспрессии белков слияния ВАСЕЛдС. Плазмиду конструируют путем лигирования 5'-последовательности кДНК из человеческого ВАСЕ с 3'-последовательностью кДНК из человеческого ΙβΟ Ес(у1), без шарнирной области. Используют ПЦР для амплификации кДНК. Далее на 5'-конце ПЦР-праймера добавляют сайт рестрикции фермента Есо ВI из консенсусной последовательности Козака инициации трансляции. На 3'-конце ПЦР-праймера добавляют сайт рестрикции Х1о Ι, сразу за кодоном терминации. На 3'-конце ПЦР-праймер также включает два молчащих изменения основания, которые удаляют сайт сплайсинга криптической РНК в иммуноглобулиновой части возле концевого кодона. Кодон, кодирующий пролин (остаток 459, согласно нумерации в белковой последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 32), меняют с ССС с ССС, а кодон, кодирующий глицин (остаток 460, согласно нумерации в белковой последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 32), меняют с ССТ на ССС. ПЦР-фрагмент расщепляют с использованием Есо Ш и Х1о Ι и затем встраивают в ретровекторную плазмиду (рСА8-пе\\МС8-\УРРЕ (новый ориджин), доступную от Са1а, Ιηο.), которая была обработана МГе Ι (для получения совместимого с Есо Ш конца), и расщепляют Х1о Ι. Встроенную часть клонированной плазмиды и клонированные соединения секвенируют, для подтверждения того, что при клонировании не произошло мутаций.
Для получения белка слияния ВАСЕЛдС, вектор экспрессии, включающий последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕЭ ΙΌ N0: 54, подвергают стабильной трансфекции в СНО клетки.
Последовательность выделенного белка слияния на основе ВАСЕ, ТТР-4000, экспрессированного трансфицированными клетками, подтверждают в рамках различных методик оценки, как 8ЕЭ ΙΌ N0: 34 или 8ЕЭ ΙΌ N0: 56, или как и 8ЕЭ ΙΌ N0: 34, и 8ЕЭ ΙΌ N0: 56. Таким образом, расщепляется сигнальная последовательность, кодируемая первыми 23 аминокислотами из 8ЕЭ ΙΌ N0: 32, и ^концевой остаток представляет глютамин (О) или пироглютаминовую кислоту (рЕ) или их смесь. Исследования, проведенные с целью характеристики последовательностей, показали наличие сайтов гликозилирования при N2 и N288 (согласно нумерации в 8ЕЭ ΙΌ N0: 34 или 8ЕЭ ΙΌ N0: 56), а также выявили, что на СН3 участке белка слияния на основе ВАСЕ его С-концевой остаток может быть выщеплен в процессе посттрансляционной модификации, при экспрессии в данной рекомбинантной системе.
Пример 1С. Альтернативный способ получения трехдоменных белков слияния на основе ВАСЕ.
Плазмида может быть сконструирована для экспрессии трехдоменных белков слиния ВАСЕЛдС (например, включающих один домен ВАСЕ и два ΙβΟ домена), таких как ТТР-3000, по процедуре, аналогичной описанной выше применительно к ТТР-4000. Указанную плазмиду конструируют при лигировании 5'-последовательности кДНК из человеческого ВАСЕ, кодирующей аминокислоты на участке 1-136 из человеческого ВАСЕ, с 3'-последовательностью кДНК из человеческого ΙβΟ Ес(у1), без шарнирного участка Ес. Используют ПЦР для амплификации кДНК. Далее на 5'-конце ПЦР-праймера добавляют сайт рестрикции (например, сайт рестрикции фермента Есо ВТ, который использовали при получении ТТР4000) для клонирования и консенсусную последовательность Козака инициации трансляции. К 3'-концу ПЦР-праймера также может быть добавлен сайт рестрикции (например, сайт рестрикции Х1о Ι), сразу за кодоном терминации. ПЦР-праймеры также включают молчащие изменения оснований, что может быть необходимо для удаления сайтов сплайсинга криптической РНК, таких как сайты сплайсинга криптической РНК, расположенные на 3'-конце иммуноглобулинового домена СН2, как описано в примере ΙΒ. Для удаления этих криптических сайтов сплайсинга, кодон, кодирующий пролин 344 в 8ЕЭ ΙΌ N0: 35 (т.е. остатки 1030-1032, согласно нумерации в последовательности ДНК в 8ЕЭ Ш N0: 31), может быть изменен с ССС на ССС, а кодон, кодирующий глицин 345 в 8ЕЭ ΙΌ N0: 35 (остатки 1033-1035 согласно нумерации в последовательности ДНК в 8ЕЭ ΙΌ N0: 31), может быть изменен с ССТ на ССС. Далее ПЦРфрагмент может быть расщеплен с использованием соответствующих ферментов рестрикции (например, Есо Ш и Х1о Ι) и встроен в ретровекторную плазмиду рСА8-пе\\МС8-\УРРЕ (новый ориджин; доступна от Са1а, Ιηο.). Указанный вектор может быть далее расщеплен с использованием МГе Ι с получением совместимого с Есо ВI конца и затем также расщеплен с использованием Х1о Ι. Встроенная часть клонированной плазмиды и клонируемые соединения могут быть подвергнуты секвенированию для подтверждения того, что в процессе клонирования не произошли мутации.
- 45 017291
Для получения белка слияния КАСЕЧдС вектор экспрессии, включающий последовательность нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 55 (например, включающий изменение в последовательности ДНК для удаления криптических сайтов сплайсинга), может быть подвергнут стабильной трансфекции в СНО клетки, как было описано в примерах 1А и 1В.
Последовательность выделенного белка слияния на основе КАСЕ, ΤΤΡ-3000, экспрессированная трансфицированными клетками, может представлять собой 8Е0 ΙΌ N0: 36, 8Е0 ΙΌ N0: 37, или 8Е0 ΙΌ N0: 57, или сочетание 8Е0 ΙΌ N0: 36, 8Е0 ΙΌ N0: 37 и/или 8Е0 ΙΌ N0: 57. Таким образом, сигнальная последовательность, кодируемая первыми 22 и/или 23 аминокислотами из 8Е0 ΙΌ N0: 35, может быть расщеплена и полученный №концевой остаток может представлять глютамин (О) или пироглютаминовую кислоту (рЕ) или их смесь. Гликозилирование может происходить в сайтах N2 и N174 (согласно нумерации в 8Е0 ΙΌ N0: 37 или 8Е0 ΙΌ N0: 57) и/или могут присутствовать другие сайты гликозилирования. На Сн3 участке белка слияния на основе КАСЕ его С-концевой остаток может быть выщеплен в процессе пост-трансляционной модификации, при экспрессии в данной рекомбинантной системе.
Пример 2. Способ тестирования активности белка слияния КАСЕЧдСЕ
А. Связывание лиганда ш νίΙΐΌ.
Известные лиганды КАСЕ наслаивают на поверхность планшетов Максисорб (МахЕогЬ) в концентрации 5 мкг на ячейку. Планшеты инкубируют в течение ночи при температуре 4°С. После инкубации лиганда содержимое планшетов отсасывают и добавляют блокирующий буфер, содержащий 1% БСА в 50 мМ имидазольном буфере (рН 7,2), и оставляют планшеты на 1 ч при комнатной температуре. Затем содержимое планшетов отсасывают и/или промывают промывочным буфером (20 мМ имидазола, 150 мМ №С1, 0,05% Твин-20, 5 мМ СаС12 и 5 мМ МдС12, рН 7,2). Готовят раствор ΤΤΡ-3000 (ΤΤ3) с исходной концентрацией 1,082 мг/мл и раствор ТТР-4000 (ТТ4) с исходной концентрацией 370 мкг/мл. Добавляют белок слияния на основе КАСЕ с возрастающими разбавлениями исходного образца. Белок слияния на основе КАСЕ оставляют для инкубации с иммобилизованным лигандом при температуре 37°С в течение 1 ч, после чего планшет промывают и анализируют связывание белка слияния на основе КАСЕ. Связывание выявляют при добавлении комплекса для иммунологического тестирования, содержащего моноклональный мышиный противочеловеческий ΙβΟ1 в разбавлении 1:11000 до конечной концентрации в тесте (БАС) 21 нг/100 мкл, биотинилированный козий противомышиный ΙμΟ в разбавлении 1:500 до конечной концентрации БАС 500 нг/мкл и щелочную фосфатазу, связанную с авидином. Комплекс инкубируют с иммобилизованным белком слияния на основе КАСЕ в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего планшет промывают и добавляют субстрат для щелочной фосфатазы паранитрофенилфосфат (ПНФФ). Связывание комплекса с иммобилизованным белком слияния оценивают количественно путем измерения превращения ПНФФ в паранитрофенол (ПНФ), проводя измерения на спектрофотометре при длине волны 405 нм.
Как показано на фиг. 7, белки слияния ТТР-4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ΤΤ3) специфически взаимодействуют с известными лигандами КАСЕ: амилоидом-β (АЗ), 8100Е (8100) и амфотерином (Атрйо). В отсутствие лиганда, т.е. при нанесении покрытия только лишь из БСА (БСА или БСА + промывная жидкость), не отмечается повышения поглощения относительно уровней неспецифического связывания комплекса для иммунодетекции. В случае использования амилоида-β в виде меченого лиганда может возникнуть потребность в предварительной инкубации амилоида-β перед тестированием. Предварительная инкубация может способствовать самоагрегации амилоида-β с образованием плетеной пластинчатой формы, поскольку амилоид-β предпочтительно может связываться с КАСЕ, имеющим плетеную пластинчатую форму.
Дополнительные доказательства наличия специфического взаимодействия между белками слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000 и ТТР-3000 с лигандами КАСЕ продемонстрированы в исследованиях, результаты которых показали, что лиганд КАСЕ способен эффективно конкурировать за связывание с белками слияния с известным лигандом КАСЕ. В этих исследованиях амилоид-β (АЗ) иммобилизуют на планшете Максисорб (МахЕогЬ) и добавляют белок слияния на основе КАСЕ, как было указано выше. Кроме того, к тем же ячейкам и в то же время, что и белок слияния на основе КАСЕ, добавляют лиганд КАСЕ.
Было показано, что лиганд КАСЕ может блокировать связывание ТТР-4000 (ТТ4) примерно на 2530%, где ТТР-4000 присутствует на уровне 123 мкг/мл (разбавление 1:3, фиг. 8). В том случае, когда исходный раствор ТТР-4000 разбавляет в 10 или 30 раз (1:10 или 1:30), связывание белка слияния на основе КАСЕ с иммобилизованным лигандом полностью ингибируется лигандом КАСЕ. Аналогично, лиганд КАСЕ блокирует связывание ТТР-3000 (ΤΤ3) примерно на 50%, если ТТР-3000 присутствует на уровне 360 мкг/мл (разбавление 1:3, фиг. 9). В том случае, когда исходная концентрация ТТР-3000 разбавляется в 10 раз (1:10), связывание белка слиянии на основе КАСЕ с иммобилизованным лигандом полностью ингибируется лигандом КАСЕ. Таким образом, специфичность связывания белка слияния на основе КАСЕ с лигандом КАСЕ зависит от дозы. Кроме того, как показано на фиг. 8 и 9, по существу, не выявляется связывания в отсутствие белка слияния на основе КАСЕ, т.е. с использованием только комплекса для иммунодетекции (параметр один комплекс).
- 46 017291
В. Оценка эффекта белков слияния на основе КАСЕ в клеточных тестах.
В предшествующей работе было показано, что миелоидные клетки ТНР-1 могут секретировать Т№-а в ответ на введение лигандов КАСЕ. В этом тесте клетки ТНР-1 культивируют в среде КРМЫ640 с добавкой 10% ФСТ, по протоколу АТСС. Клетки индуцируют для секреции Т№-а путем стимуляции КАСЕ с использованием 0,1 мг/мл 8100Ь как в отсутствие, так и при наличии белков слияния на основе КАСЕ, ТТР-3000 (ТТ3) или ТТР-4000 (ТТ4) (10 мкг), кКАСЕ (10 мкг) и человеческого ΙβΟ (10 мкг) (в качестве негативного контроля). Количество Т№-а, секретированного клетками ТНР-1, измеряют через 24 ч после добавления белков к клеточной культуре с использованием коммерчески доступного набора для ЕЫ8А для оценки Т№-а (К&О кук!етк, М1пиеаро11к, М№). Из результатов, показанных на фиг. 10, видно, что белки слияния на основе КАСЕ ингибируют в этих клетках продукцию Т№-а, индуцированную 8100Ь/КАСЕ. Как видно из фиг. 10, при добавлении 10 мкг белка слияния на основе КАСЕ, ТТР3000 или ТТР-4000, индукция Т№-а под действием 8100Ь (0,1 мг/мл ЕАС) снижается примерно на 4570% соответственно.
Белок слияния ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, столь же эффективен по блокированию индукции Т№-а под действием 8100Ь, как и кКАСЕ (фиг. 10). Специфичность ингибирования последовательностями ТТР-4000 и ТТР-3000 показана в рамках экспериментов, в которых добавляют один Ι§6 к 8100Ь-стимулированным клеткам. Добавление ΙβΟ и 8100Ь к системе для тестирования показывает, что Т№-а находится на том же уровне, что и при добавлении одного 8100Ь. Специфичность ингибирования индукции Т№-а под действием ТТР-4000 и ТТР-3000 для последовательностей КАСЕ из белка слияния на основе КАСЕ показана в эксперименте, в рамках которого добавляют один Ι§6 к 8100Ьстимулированным клеткам. Можно видеть, что добавление ΙβΟ. например, человеческого ΙβΟ без КАСЕ последовательности (человеческий Ι§6 81дта, вносимый в количестве 10 мкг/ячейку) и 8100Ь к системе для тестирования дает такие же уровни Т№-а, что и добавление одного 8100Ь.
В рамках другого клеточного теста оценивают способность ТТР-4000 препятствовать взаимодействию лиганда КАСЕ, НМСВ1 с КАСЕ и другими рецепторами НМСВ1. В отличие от анти-КАСЕ антител, которые связываются с КАСЕ и препятствуют взаимодействию лиганда КАСЕ с КАСЕ, ТТР-4000 может блокировать взаимодействие лиганда КАСЕ с КАСЕ путем связывания с лигандом КАСЕ. Сообщалось, что НМСВ1 является лигандом КАСЕ и То11-подобных рецепторов 2 и 4 (Рагк е! а1., I Вю1 Скет., 2004; 279 (9):7370-7). Все эти три указанных рецептора (КАСЕ, То11-подобный рецептор 2 и То11-подобный рецептор 4) экспрессируются в ТНР-1 клетках (Рагкег, е! а1., I Iттиηο1., 2004,172 (8): 4977-86).
В данном эксперименте клетки ТНР-1 стимулируют к продукции ТА-а под действием НМСВ1 (50 мг/мл), в присутствии или в отсутствие ТТР-4000 или анти-КАСЕ антител. В условиях данного теста НМСВ1 должен быть единственным индуктором Т№-а. Количество Т№-а, секретированного клетками ТНР-1, измеряют через 24 ч после добавления белков к культуре клеток с использованием коммерчески доступного набора для определения ТА-а по процедуре ЕЫ8А (К&О 8ук!етк, Мшиеарокк, М№).
Полученные результаты, которые приведены на фиг. 11, показывают, что анти-КАСЕ антитело и белок слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000 блокируют взаимодействие НМСВ1 с КАСЕ, экспрессированным на ТНР-1 клетках, но при этом ТТР-4000 ингибирует НМСВ1-индуцированную продукцию Т№-а в большей степени, чем анти-КАСЕ антитело. Таким образом, полученные данные указывают на то, что ТТР-4000 может ингибировать активность НМСВ1 в большей мере, чем анти-КАСЕ антитело путем ингибирования взаимодействия НМСВ1 с То11-подобными рецепторами 2 и 4, а также с КАСЕ, присутствующим на ТНР-1 клетках.
Пример 3. Фармакокинетический профиль ТТР-4000.
Для определения того, демонстрирует ли ТТР-4000 лучший фармакокинетический профиль в сравнении с человеческим кКАСЕ, крысам и приматам, отличным от человека, вводят внутривенной (в/в) инъекцией ТТР-4000 (5 мг/кг), после чего оценивают в плазме наличие ТТР-4000. В этих экспериментах двум самцам обезьян, которым ранее не вводили препарат, вводят однократную дозу в/в болюса ТТР4000 (5 мг/мл/кг) в периферическую вену, после чего вливают примерно 1,0 мл солевого раствора. Отбирают образцы крови (примерно по 1,0 мл) до введения дозы (т.е. до инъекции ТТР-4000) или через 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 и 336 ч после введения дозы в пробирки, содержащие литий-гепарин. После отбора пробирки помещают на влажный лед (максимум на 30 мин) и затем центрифугируют с охлаждением (при температуре от 2 до 8°С) при 1500хд в течение 15 мин. Затем каждый отобранный образец плазмы замораживают для хранения (при температуре -70±10°С) до тестирования полипептида КАСЕ по методу ЕЫ8А, в разные временные точки после инъекции, как описано в примере 6.
Кинетический профиль, приведенный на фиг. 12, показывает, что как только ТТР-4000 насыщает свои лиганды, что отмечается по очень крутому углу наклона в а-фазе у 2 животных, достигается и поддерживается конечный период его полувыведения более, чем 300 ч. Указанный период полувыведения существенно выше, чем период полувыведения человеческого кКАСЕ из плазмы (в основном равный примерно 2 ч), что дает возможность проводить однократные инъекции по острым и субхроническим показаниям. Каждая из кривых, приведенных на фиг. 12, относится к разным животным в одних и тех же экспериментальных условиях.
- 47 017291
Пример 4. ТТР-4000-активация Ес.
Проводят эксперименты для определения уровня активации Ес рецептора белком слияния на основе КАСЕ. ТТР-4000 в сравнении с человеческим Ι§6. Активацию Ес рецептора определяют при измерении секреции ТИЕ-α из клеток ТНР-1. которые экспрессируют Ес рецептор. В указанных экспериментах в ячейки 96-ячеечных планшетов наслаивают по 10 мкг/ячейку ТТР-4000 или человеческого ΙβΟ. Стимуляция Ес приводит к секреции ТИЕ-α. Количество ТИЕ-а определяют в рамках иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЫ8А).
В рамках данного теста миелоидную клеточную линию ТНР-1 (АТТС#ТГВ-202) поддерживают в среде ΡΡΜΙ-1640 с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка по инструкции АТСС. В типичном случае 40000-80000 клеток на ячейку индуцируют секрецию ТЫЕ-а через стимуляцию Ес рецептора. при внесении предварительного покрытия на ячейку в количестве 10 мкг/ячейку агрегированного под действием тепла (63°С в течение 30 мин) ТТР-4000 или человеческого Ι§Ο1. Количество ТНЕ-а. секретированного ТНР-1 клетками. определяют в супернатантах. отобранных из 24-часовых культур клеток в обработанных ячейках. с использованием коммерчески доступного набора для определения ТНЕ по процедуре ЕЫЗА (К&О 8ук1етк. МшпеароНк. ΜN # ОТА00С). в соответствии с приведенными инструкциями. Полученные результаты приведены на фиг. 13. из которых видно. что ТТР-4000 генерирует меньше чем 2 нг/ячейку ТНЕ. а ΙβΟ генерирует более чем 40 нг/ячейку.
Пример 5. Активность ТТР-4000 ίη νίνο.
Активность ТТР-4000 сравнивают с активностью кКАСЕ на нескольких моделях ίη νίνο болезней человека.
A. ТТР-4000 на модели рестеноза у животного.
Белок слияния на основе КАСЕ. ТТР-4000. оценивают на модели рестеноза у диабетических крыс. при измерении уровня пролиферации гладких мышц и размножения интимы через 21 день после повреждения сосудов. В рамках данных экспериментов проводят балонное повреждение левой общей сонной артерии у крыс 2искег с диабетом и без диабета по стандартной процедуре. Вводят нагрузочную дозу (3 мг/крысу) ΙβΟ. ТТР-4000 или фосфатно-буферного раствора (РВ8) внутрибрюшинно (в/б) за день до повреждения. Поддерживающую дозу вводят через день до 7 дня после повреждения (т.е. в дни 1. 3. 5 и 7 после повреждения). Поддерживающую дозу устанавливают высокой. равной 1 мг/животное. для одной группы или низкой. равной 0.3 мг/животное. для второй группы. Для измерения уровня пролиферации гладкомышечных клеток сосудов №8МС). животных умерщвляют в 4 день и 21 день после повреждения.
Для измерения уровня пролиферации клеток животным на 4 день вводят внутрибрюшинной инъекцией бромдезоксиуридин (ВгОйИ) в дозе 50 мг/кг за 18. 12 и 2 ч до эвтаназии. После умерщвления у животных отбирают целиком левую и правую сонную артерию. Образцы хранят в нШосйоюе по меньшей мере в течение 24 ч до последующей обработки. Оценку пролиферации V8ΜС проводят с использованием мышиного анти-Вгйи моноклонального антитела. Вносят флуоресцентно меченое козье противомышиное вторичное антитело. Подсчитывают количество Вгйи-положительных ядер на срез в рамках слепого теста относительно режима лечения двумя наблюдателями.
Оставшихся крыс умерщвляют в 21 день для проведения морфометрического анализа. Морфометрический анализ проводят в рамках слепого теста относительно исследуемых групп с использованием компьютерного программного обеспечения для цифровой микроскопической планиметрии Епаде-Рго Р1ик с использованием серийных срезов (взятых на расстоянии 5 мм) сонных артерий. окрашенных красителем Vаη С1екоп. Все данные выражают в виде среднего значения ±СК0. Статистический анализ проводят с использованием программного обеспечения 8Р88. Непрерывные варьирующие параметры сравнивают с использованием непарного ΐ-теста. Величины Р<0.05 рассматривают как статистически значимые.
Как показано на фиг. 14А и 14В. обработка с использованием ТТР-4000 существенно снижает соотношение интима/среда и пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов зависимым от дозы образом. На фиг. 14В ось у обозначает количество ВгйИ-пролиферирующих клеток.
B. ТТР-4000 на модели животных с БА.
Проводят эксперименты на модели мышей с БА для оценки того. может ли ТТР-4000 влиять на образование амилоида и познавательную дисфункцию. В экспериментах используют трансгенных мышей. экспрессирующих человеческий мутантный 8^ей1кй амилоидный белок-предшественник (АРР) под контролем промотора РЭСЕ-В цепи. С течением времени указанные мыши образуют высокие уровни лиганда КАСЕ. амилоид-β (Λβ). Ранее было показано. что обработка кКАСЕ в течение 3 месяцев снижает и образование амилоидных бляшек в головном мозге. и связанное с ним повышение уровня воспалительных маркеров в рамках данной модели.
Используемые в данном эксперименте мыши (АРР) (самцы) были получены в результате микроинъекций человеческого гена АРР (при наличии мутации 8\\'еЙ1кЕ апй Ьопйоп) в яйца мышей. под контролем генного промотора цепи В фактора роста тромбоцитов (РЭСЕ-В). Мышей получают на основе С57ВБ/6 и растят в условиях Мо1еси1аг ТЕегареийск Ιπο. Животных кормят ай ЕЫШт и поддерживают при спаривании по принципу брат-сестра. У полученных с использованием такой конструкции мышей
- 48 017291 наблюдается отложение амилоида, начиная с 6 месяца жизни. Животных растят до 6-месячного возраста и затем выдерживают в течение 90 дней, после чего умерщвляют для подсчета уровня амилоида.
Трансгенным мышам АРР вводят носитель ТТР-4000 через день |доб (в/б)] в течение 90 дней, начиная с 6-месячного возраста. В конце эксперимента животных умерщвляют и выявляют наличие Аβ бляшек в мозге (т.е. определяют количество бляшек). Используют также контрольную группу 6-месячную группу по АРР для определения базового уровня отложения амилоида. Кроме того, в конце исследования животных подвергают бихевиоральному анализу (тест Морриса с лабиринтом в воде). Исследователи проводят эксперимент вслепую относительно соединений, используемых в испытании. Образцы вводят мышам в количестве 0,25 мл/мышь/через день. Дополнительно одной группе мышей вводят 200 мкг/день человеческого кВАСЕ.
1. Отложение β-амилоида.
Для проведения гистологического анализа животных подвергают анестезии путем внутрибрюшинной инъекции (в/б) пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Животных подвергают транскардиальной перфузии при температуре 4°С фосфатно-буферным раствором (РВ8) и затем 4% параформальдегидом. У животных отбирают головной мозг и помещают на ночь в 4% параформальдегид. Затем головной мозг животных обрабатывают парафином и готовят образцы для гистологического анализа. Получают из головного мозга 10 серийных срезов толщиной 30 мкм. Срезы инкубируют с первичным антителом в течение ночи при 4°С (антитело против Аβ пептида) для выявления отложения амилоида в головном мозге трансгенных животных (Сио е! а1., Nеи^окс^., 22: 5900-5909 (2002)). Срезы промывают в трис-буферном солевом растворе (ТВ8) и добавляют вторичное антитело, после чего инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки срезы инкубируют согласно инструкции, прилагаемой к набору Vес!о^ АВС Е11!е кй ^ес!ог ЬаЬога!опек), и затем окрашивают диаминобензойной кислотой (Б АВ). Реакцию останавливают в воде и наслаивают после обработки ксилол. Область амилоида в каждом срезе определяют с помощью набора для компьютерного системного визуального анализа, состоящего из компьютера Ро\гег Маст!окй, снабженного картой Ошск Сар!иге £гате дгаЬЬег сагб, камерой нйасЫ ССБ, вмонтированный в микроскоп 01утрик, и инсталлированной камерой. Используют программное обеспечение N14 1таде Апа1ук1к 8ой^аге, ν. 1.55. Получают снимки и определяют общую площадь амилоида в десяти срезах. Все измерения проводит один оператор в слепом режиме относительно статуса лечения. Суммирование объемов амилоида в срезах с последующим делением полученного значения на общее число срезов позволяет рассчитать объем амилоида.
Для количественного анализа используют иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), который позволяет измерить уровни человеческого Аβ, Аβ!о!а1 и Аβ1-42 в головном мозге трансгенных мышей АРР (Вюкоигсе 1п!егпа!юпа1, СатагШо, СА). Аβ!оίа1 и Аβ1-42 экстрагируют из головного мозга мышей с использованием гуанидингидрохлорида и подсчитывают по методике производителя. Данный анализ позволяет экстрагировать суммарный Аβ пептид из головного мозга (и растворимый, и агрегированный).
2. Распознавательная функция.
Тест Морриса с лабиринтом в воде проводят следующим образом. Всех мышей исследуют один раз в тесте Морриса с лабиринтом в воде в конце эксперимента. Мышей тренируют в открытом водном лабиринте длиной 1,2 м. Бассейн наполняют до глубины 30 см водой и поддерживают при температуре 25°С. Спасательную платформу (10 см2) помещают на 1 см ниже поверхности воды. Во время испытаний платформу убирают из бассейна. Сигнальный тест проводят в бассейне, окруженном белыми шторами, для того, чтобы скрыть какие-либо другие знаки за пределами лабиринта. Всех животных подвергают предварительно тренировке (Н8Р) в течение трех последовательных дней. Указанные испытания подготавливают животных к финальному бихевиоральному тесту для определения сохранения информации в памяти с целью отыскания платформы. Данные испытания не записываются, но проводятся только для целей тренировки. Для тренировочных и обучающих исследований шторы удаляют за пределы лабиринта (что позволяет идентифицировать животных с ухудшенными способностями к плаванию). В день 1 животных помещают на скрытую платформу на 20 с (испытание 1), для испытаний оставляют 2-3 животных в воде на расстоянии 10 см от знака на платформе или скрытой платформы (испытание 4) и позволяют им плыть к платформе. На второй день испытаний скрытую платформу передвигают случайным образом на участке между центром бассейна или центром каждого квадрата. Животных оставляют в бассейне перед стеной и позволяют им в течение 60 с достичь платформы (3 испытания). В рамках третьего испытания животным дают три попытки: две со скрытой платформой и одну с видимой платформой. Через два дня после Н8Р животных подвергают финальным бихевиоральным испытаниям (тест Морриса с водным лабиринтом). В ходе указанных испытаний (по 3 на каждое животное), платформу помещают в центре квадрата бассейна и животных оставляют перед стеной в произвольном порядке. Животным дают возможность отыскать платформу или плыть в течение 60 с (латентный период, т.е. время, которое нужно для того, чтобы отыскать платформу). Всех животных тестируют в течение 4-6 ч введения дозы и отбирают случайным образом для тестирования операторам в рамках слепого эксперимента относительно группы тестирования.
Результаты выражают в виде среднего значения ± стандартное отклонение (СК0). Значимость раз
- 49 017291 личий в уровне амилоида и бихевиоральном поведении анализируют с использованием ΐ-теста. Сравнения проводят между контрольной группой 6-месячных мышей АРР и животных, которым вводили ТТР4000, а также между группой 9-месячных мышей, получавших АРР-носитель, и животными, которым вводили ТТР-4000. Различия ниже 0,05 рассматриваются как значимые. Для сравнения определяют процентные показатели изменений в уровне амилоида и в поведении и суммируют данные по каждой группе с последующим разделением (например, 1 в/б/6-месячный контроль = % изменений).
На фиг. 15 А и 15В показано, что мыши, которым в течение 3 месяцев вводили ТТР-4000 или мышиный кКАСЕ, имеют сниженное количество Аβ бляшек и характеризуются меньшей распознавательной дисфункцией, чем животные, обработанные носителем и негативным контрольным человеческим 1дС1 (1дС1). Эти данные указывают на то, что ТТР-4000 эффективен на трансгенной модели мышей в плане снижения БА патологии. Было также показано, что, как и кКАСЕ, ТТР-4000 может снижать уровень воспалительных цитокинов 1Ь-1 и 'ТЫЕ-а (данные не приведены).
С. Эффективность ТТР-4000 на модели животных с инсультом.
ТТР-4000 также сравнивают с кКАСЕ на релевантной модели животных с инсультом. В рамках данной модели среднюю сонную артерию мышей лигируют в течение 1 ч и затем проводят реперфузию в течение 23 ч, после чего мышей умерщвляют и определяют зону некроза в головном мозге. Мышам вводят кКАСЕ, или ТТР-4000, или контрольный иммуноглобулин непосредственно перед реперфузией.
В рамках данных экспериментов самцам мышей С57ВБ/6 инъецируют носитель в дозе 250 мкл/мышь или исследуемый ТТР препарат (ТТР-3000, ТТР-4000, в дозе 250 мкл/мышь). Мышам проводят внутрибрюшинную инъекцию через 1 ч после начала ишемии. Далее мышей подвергают одночасовой церебральной ишемии, после чего в течение 24 ч проводят реперфузию. Для индукции ишемии каждую мышь подвергают анестезии и поддерживают температуру на уровне 36-37°С за счет внешнего нагрева. Левую общую сонную артерию (ССА) обнажают путем разреза на шее. Помещают микрохирургический зажим вокруг начала внутренней сонной артерии (1СА). Дистальный конец ЕСА лигируют шелковой нитью и делают поперечный разрез. Шелковую нить размером 6-0 некрепко затягивают вокруг культи ЕСА. Отполированный в огне кончик нейлоновой нити осторожно вставляют в культю ЕСА. Петлю из шелка 6-0 затягивают вокруг культи и нейлоновую нить проталкивают внутрь и через внутреннюю сонную артерию (1СА), пока она не установится в передней мозговой артерии, что приводит к окклюзии передней соединительной и средней мозговой артерий. После того как нейлоновая нить продержится таким образом в течение 1 ч, животных подвергают повторной анестезии, отмечают ректальную температуру, удаляют нить и зашивают разрез.
Объем зоны некроза определяют при анестезии животных внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг) и затем отбирают головной мозг. Головной мозг разрезают с получением четырех срезов по 2 мм вдоль зоны некроза и помещают на 30 мин в 2% раствор хлорида трифенилтетразолия (ТТС). После этого срезы помещают на ночь в 4% параформальдегид. Определяют площадь зоны некроза в каждом срезе с использованием компьютерной системы, включающей компьютер Ро\\гег Маст1окй, снабженный картой Ошск Сар1иге Ггате дгаЬЬег сагй и установленной камерой нйасЫ ССЭ. Используют программное обеспечение N14 1таде Аиа1ук1к 8оП\уаге. ν. 1.55. Получают снимки и в срезах определяют общую площадь зоны некроза. Все измерения проводит один оператор, работающий в режиме слепого эксперимента относительно вариантов тестирования. Суммирование объемов инфаркта в срезах дает общий объем некроза. Результаты выражают в виде среднего значения ± стандартное отклонение (СКО). Значимость различий в данных по объему некроза анализируют с использованием 1-теста.
Как видно из данных табл. 2, ТТР-4000 был более эффективным, чем кКАСЕ, по ограничению зоны некроза у исследованных животных, что позволяет полагать, что ТТР-4000 в связи с его лучшими показателями по полупериоду выведения из плазмы способен оказывать более надежную защиту у данных мышей.
Пример 6. Выявление методом ЕЛ18А белка слияния на основе КАСЕ.
Вначале наслаивают на ячейки планшета 50 мкл специфичного к КАСЕ моноклонального антитела 1НВ1011 в концентрации 10 мкг/мл в 1хРВ8, рН 7,3 и проводят инкубацию в течение ночи. Готовые к использованию планшеты промывают три раза по 30 мкл промывочного буфера 1х имидазол-Твин и проводят блокирование, добавляя 1% БСА. Образцы (разбавленные) и стандартные разведения известных разбавленных вариантов ТТР-4000 добавляют до конечного объема 100 мкл. Образцы оставляют для инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубации планшеты промывают три раза. Добавляют козий противочеловеческий 1дС1 (81дта А3312) АР конъюгат в 1хРВ8 с добавкой 1% БСА и оставляют для инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывают три раза. Окраску проявляют с использованием паранитрофенилфосфата.
Пример 7. Количественное определение уровня связывания лиганда КАСЕ с белком слияния на основе КАСЕ.
На фиг. 16 приведены кривые, описывающие насыщение-связывание ТТР-4000 с разными иммобилизованными известными лигандами КАСЕ. Лиганды иммобилизуют на микротитрационном планшете и инкубируют в присутствии возрастающих концентраций белка слияния на основе КАСЕ, от 0 до 360 нМ.
- 50 017291
Взаимодействие белка слияния на основе КАСЕ-лиганда выявляют с использованием поликлонального антитела, конъюгированного с щелочной фосфатазой, которое специфично для ЦС части химерного белка. Соответствующие значения Кб вычисляют с использованием программного обеспечения Сгарбраб Рпхш и сравнивают с известными литературными данными для КАСЕ-лиганда КАСЕ. НМС1В = амфотерин, СМЬ = карбоксиметиллизин, АЗ = амилоид-З 1-40.
Пример 8. Использование белка слияния на основе КАСЕ для предупреждения реакции отторжения аллогенного трансплантата.
Для целей блокирования реакции отторжения аллогенного трансплантата можно предположить блокирование КАСЕ. В этой связи были проведены эксперименты для выяснения, будет ли блокада взаимодействия лиганда-КАСЕ под действием белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению ослаблять отторжение островковых клеток, которые были трансплантированы от здорового донора в организм животного с диабетом, по данным оценки периода времени, в течение которого у трансплантированных животных поддерживается уровень глюкозы в крови ниже заданной концентрации. Как отмечается в настоящем описании, было показано, что введение белка слияния на основе КАСЕ (например, ТТР-4000) животным с диабетом, которым были трансплантированы островковые клетки, значительно задерживает рецидив гипергликемии и в этой связи отторжение трансплантированных островковых клеток на двух моделях (аллогенной и сингенной) животных с трансплантатом.
А. Трансплантация мышам аллогенных островковых клеток.
Первую группу экспериментов проводят для определения, будет ли введение белка слияния на основе КАСЕ (ТТР-4000) модулировать отторжение трансплантата аллогенных островковых клеток и возобновление диабета у мышей С57ВБ/61 (В6) в рамках модели диабета.
Модель диабета на животных.
У мышей С57ВБ/61 (6-8-недельного возраста) (В6) вызывают диабет путем однократной внутривенной инъекции стрептозотоцина (8Т2) (81дта Сбетюа1 Οο., 8ΐ. Рюшк, МО) в дозе 200 мг/кг. Мыши ВАЬВ/с! (6-8-недельного возраста) (ВАЬВ) служат в качестве доноров для трансплантации островковых клеток, что обеспечивает аллогенный механизм трансплантации островковых клеток.
Выделение островковых клеток.
Мышей (ВАЬВ/с) подвергают анестезии раствором кетамина-НС1/ксилазина-НС1 (81дта, 8ΐ Рюшк МО). После интрадуктальной инъекции 3 мл холодного сбалансированного солевого раствора Хэнкса (НВ88, СЛто, Сгип6 И^б НУ), содержащего 1,5 мг/мл коллагеназы Р (^сбе Бха^^^ск, Β^аηсбЬи^д, N1), прокалывают поджелудочную железу, с последующим расщеплением при температуре 37°С в течение 20 мин. Островковые клетки промывают в НВ88 и очищают по процедуре прерывистого градиентного центрифугирования с использованием Рο1укис^οке 400 (Се11дго, ^Γη6οη VА), характеризующееся четырьмя разными показателями плотности (26, 23, 20 и 11%). Собирают тканевые фрагменты на интерфейсе слоев с плотностью 20 и 23%, промывают и ресуспендируют в НВ88. Отдельные островковые клетки, не содержащие ацинарных, сосудистых тканей и тканей протоков, собирают вручную под инвертационным микроскопом, получая в итоге высокоочищенные островковые клетки для трансплантации.
Трансплантация островковых клеток.
Мышам С57ВБ/6 (В6) с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, вводят трансплантаты островковых клеток в течение 2 дней после постановки диагноза диабет. Мыши ВАЬВ/с! (6-8-недельного возраста) (ВАЬВ) служат в качестве доноров аллогенных трансплантатов островковых клеток. Для трансплантации отбирают 500-600 свежевыделенных островков (т.е. примерно 550 островковых эквивалентов) от мышей-доноров с помощью инфузионной установки и пересаживают в подлопаточную область правой почки эксципиента.
Лечение с использованием исследуемых соединений.
Исследуемое соединение вводят сразу после трансплантации островковых клеток; введение продолжают в течение 60 дней в зависимости от состояния контрольных животных. Мышам инъецируют 0,25 мл фосфатно-буфферного (РВ8), ТТР-4000 в РВ8 или ЦС в РВ8 в соответствии с описанным ниже режимом лечения (табл. 3).
- 51 017291
Таблица 3
Введение исследуемых соединений и/или носителя
Исследуемая группа Число мышей Нагрузочная доза П одле ржи ваюшая доза Режим введения
Контроля без введения 8
Контроль (РВ5) 8 0, 25мл/дозу/мь1ть, 1 день 0,25мл/дозу/мышь , 2 день Через день (ООО) х 60 дней, в/б
1дС 8 (ЗООмкг) 0,25мл/доэу/мышь, 1 день (100мкг) 0,25мл/дозу/мышь, 2 день (100 мкг) Через день (ςοο) х 60 дней, в/б
ТТР-4000 В (ЗООмкг) 0,25мл/дозу/мышь, 1 день (ЮОмкг) 0,25мл/дозу/мышь, 2 день (100 мкг) Через день (ООО) х $0 дней, в/б
ТТР-4000 8 (ЗООмкг) 0,25мл/доэу/мышь, 1 день (ЗОмкг) 0,25мл/доэу/мышь, 2 день (30 мкг) Через день (2ОО) х 50 дней, в/б
Мониторинг функции островкового трансплантата.
Функцию островкового трансплантата отслеживают при ежедневном определении уровня глюкозы в серийных образцах крови в течение первых 2 недель после трансплантации островковых клеток и затем анализ проводят через день. Реверсирование диабета определяют как показатель уровня глюкозы в крови менее чем 200 мг/дл в течение двух последовательных измерений. Потеря трансплантата определяется в том случае, когда уровень глюкозы в крови превышает 250 мг/дл в течение двух последовательных измерений. Соответствующие результаты показаны в табл. 4.
Таблица 4 Эффекты ТТР-4000 на аллогенный трансплантат островковых клеток*
ТТР-4000 300 мкг ЬО + 100 мкг ςοά в/б (группа 1) РВЗ (группа 2) ТТР-4000 300 мкг + 30 мкг в/б (группа 3) 1дС 300 мкг Ш + 100 мкг дой в/б (группа 4) Контроли, без введения
14 9 13 8 9
16 8 14 9 8
13 10 12 10 9
13 8 12 8 10
12 11 11 8 9
16 8 11 8 6
15 8 8 9 11
14 8 8 11 9
7
9
8
9
Среднее значение 14,125 8,75 11,125 8,675 8,833333
ско 1,45773В 1,164965 2,167124 1,125992 1, 029857
N 8 е 8 8 12
*3начения в табл. 4 отражают день отторжения трансплантата для каждого животного, который определяется как рецидив повышенных уровней глюкозы в крови.
Эффекты введения ТТР-4000 на отторжение аллотрансплантата островковых клеток ВЛЬВ/с у мышей В/6 показаны на фиг. 17 в виде графика Каплана-Мейер, описывающего кумулятивное выживание. Можно видеть, что отмечается увеличение периода времени до выявления недостаточности транспланта
- 52 017291 та у животных, которым вводили ТТР-4000 (группы 1 и 3), в отличие от животных, которым не вводили вообще ничего (контроль), или животных, которым вводили носитель (РВ8) или (человеческий ΙβΟ1). С использованием различных методов статистического анализа (Мап!е1-Сох Ьодгапк, Вгек1о^-СеЬапХУПсохоп; Тагопе-Уаге, Ре!о-Ре!о-У11сох1п и Натпд!оп-Е1ет1пд) было показано, что различие между контрольными животными и животными в группах введения ТТР-4000 (группы 1 и 3) являются статистически значимыми (табл. 5).
Таблица 5
Метод статистического анализа Контроль-группа 1 (ТТР 4000) Контроль-группа 3 (ТТР 4000)
Чи-квадрат РЕ’* Р-значение Чи- квадрат цр ₽-значение
Ьодгапк (МапЕ.е1-Сох) 18,777 1 <0, 0001 7,662 1 0,0056
Вгез1ом-СеЬап-И11сохоп 15, 092 1 о)ООО Ϊ 4,904 1 0,0268
Тагопе-Наге 16, 830 1 <0,0001 6,212 1 0,0127
Ρβίο-Ρβϋο-νίιΙοοχοη 14,359 1 0,0002 4,315 1 0,0378
Нагг1пдсоп-Р1ет1пд (г1ю = 0, 5) 15, 930 1 <0,0001 6, 212 1 0,0127
* Степени свободы.
В. Трансплантация островковых клеток 46^34^00, используемым в качестве моделей аутоиммунного заболевания.
Вторую группу экспериментов проводят для выяснения, будет ли введение белка слияния на основе КАСЕ (например, ТТР-4000 или ТТР-3000) модулировать течение рекуррентного диабета у мышей-N0^, с использованием сингенной модели трансплантации N00.
Модель диабета на животных.
Мыши со спонтанным аутоиммунным диабетом без ожирения (N00/^1) (12-25-недельного возраста) используют в качестве реципиентов островковых клеток, тогда как молодые мыши в состоянии преддиабета N00^!.! (6-7-недельного возраста) используют в качестве доноров при сингенной трансплантации островковых клеток. Островковые клетки для трансплантации были выделены по процедуре, описанной выше, в разделе А (трансплантация аллогенных островковых клеток).
Трансплантация островковых клеток.
Мышам с диабетом N00/^1 трансплантируют островковые клетки в течение 2 дней после постановки диагноза диабета. Отбирают 500-600 свежевыделенных островков (что соответствуют примерно 550 островковым эквивалентам) от мышей-доноров с использованием инфузионной установки и пересаживают в подлопаточную область правой почки.
Лечение с использованием исследуемых соединений.
Исследуемое соединение вводят сразу же после трансплантации островковых клеток и продолжают введение примерно в течение 8 недель. Мышам инъецируют 0,25 мл РВ8, ТТР-4000 в РВ8 или ТТР-3000 в РВ8 в соответствии с описанным ниже режимом лечения (табл. 6).
Таблица 6
Группа Число мышей Объем нагрузочной дозы Объем поддерживающей дозы Режим
ТТР-4000 8 (300 мкг) 0,25мл/дозу/мышь, (100 мкг) 0,25 мл/дозу/мышь, с (ЮОмкг) Через день
день 1 дня 2 (ООО) х 8 недель; в/б
ТТР-3000 8 (300 мкг) 0,25мл/дозу/мышь, день 1 (100 мкг) 0,25 мл/дозу/мышь, с дня 2 (100 мкг) Через день (ООО) х 9 недель; в/б
ΡΒΞ 6 0,2 5мл/дозу/мышь, день 1 0,25 мл/дозу/мышь, с дня 2 Через день (ООО) х 8 недель; в/б
Мониторинг функции островкового трансплантата.
Функцию островкового трансплантата отслеживают при проведении ежедневных измерений уровня глюкозы в серийных образцах крови в течение первых 2 недель после трансплантации островковых клеток, после чего анализ проводят через день. Реверсирование диабета определяется как показатель уровня
- 53 017291 глюкозы в крови менее чем 200 мг/дл в течение двух последовательных измерений. Процент отторжения трансплантата определяют в той точке, когда уровень глюкозы в крови превышает 250 мг/дл в течение двух последовательных измерений. Соответствующие результаты показаны в табл. 7.
Таблица 7
Эффекты ТТР-4000 и ТТР-3000 на рецидив диабета при сингенной трансплантации островковых клеток мышам ΝΟΌ*
ТТР-4000 300 мкгЬР 4- 100 мкг дос! в/б (группа 1) ТТР-3000 300 мкг + 100 мкг дос1 в/б (группа 21 КОНТРОЛЬ
35 44 23
38 46 25
40 42 26
43 41 22
36 34 22
45 32 24
44 30 21
38 20
22
21
24
Среднее Значение 39, 875 38,42857 22,727273
С КО 3,758324 6, 32079 1,8488326
η 8 7 11
* Приведенные значения отражают день отторжения трансплантата для каждого животного, определяемый как рецидив повышенных уровней глюкозы в крови.
Эффекты введения ТТР-4000 на отторжение сингенных трансплантированных островковых клеток у мышей ΝΟΌ с диабетом продемонстрированы на фиг. 18 в виде графика Каплана-Мейер, описывающего кумулятивное выживание. Как показано в табл. 7, отмечается повышение длительности периода времени до выявления недостаточности трансплантата у животных, которым вводили ТТР-4000 (группа 1) и ТТР-3000 (группа 2), в сравнении с животными, которых вообще ничем не лечили (контроль). На фиг. 18 показано увеличение периода времени перед выявлением недостаточности трансплантата у животных, которых лечили путем введения ТТР-4000 (группа 1), в сравнении с животными, которых вообще не лечили. С использованием множества различных методов статистического анализа (Маи1е1-Сох Ьодгапк, Вгек1о\\-Се11ап-\УПсохоп; Τа^οηе-\Vа^е. Ρеΐο-Ρеΐο-^^1сοx^η; Нагппд1оп-Е1еш1пд) было показано, что различия между контрольными животными и животными в группе введения ТТР-4000 (группа 1), а также контрольными животными и животными в группе введения ТТР-3000 (группа 2) являются статистически значимыми (табл. 8).
Таблица 8
Метод статистического анализа Контроль - группа 1 (ТТР-4000) Контроль - группа 2 (ТТР-3000)
Чм-квадрат ϋΓ* Р~значение Чи-кеадрат 6Р Р-значение
Ьодгапк (МапПе1-Сох) 18,410 1 <0,0001 16, 480 1 <0,0001
вгез1ои-(зе11аг1-И11сохоп 14, 690 1 0,0001 12,927 1 0,0001
Тагопе-Иаге 16,529 1 <0,0001 14,636 1 0,0001
РеЪо-Ре1:о-И1 Ιοοχοη 14,812 1 0,0001 13,027 1 0,0003
Нагг1пдЬоп-Г1етхпд (гЬо - 0,5) 16,529 1 <0,0001 14,636 1 0, 0001
* Степени свободы.
Пример 9. Лиофилизированная композиция белка слияния на основе ВАСЕ.
При разработке лиофилизированной композиции, в которой используют белок слияния на основе ВАСЕ, ТТР-4000, проводят первоначальный скрининг лиопротекторов и буферов при определении стабильности белка после лиофилизации и восстановления. Лиофилизированный белок в каждой композиции исследовали по процедуре ускоренной оценки стабильности для определения потенциальной ста
- 54 017291 бильности белка в течение всего срока годности.
Для проведения исследований в рамках исходного скрининга были разработаны эксперименты, направленные на оценку тех условий изготовления композиций, которые могут обеспечивать соответствующие показатели растворимости и стабильности ТТР-4000, изготовленного в виде замороженной массы, и обеспечивать восстановление композиции, содержащей концентрации белка слияния на основе КАСЕ, равные примерно 50 мг/мл или выше. Композиции, содержащие ацетат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия, сукцинат натрия, гистидин и хлорид натрия, анализируют вместе с сахарозой и маннитом. Оценивают также эффект различных значений рН в диапазоне от 5,5 до 7,0.
Биофизическую и химическую стабильность ТТР-4000 оценивают в рамках процедур вытеснительной хроматографии (8ЕС), электрофореза в ДСН-ПААГ, инфракрасной спектроскопии с Фурьепреобразованием (РТ1К), кругового дихроизма (СИ), картирования пептидов и поглощения в ультрафиолетовой-видимой области (УФ-^к).
На основании данных по растворимости белка слияния на основе КАСЕ в композициях, содержащих один или несколько указанных компонентов: цитрат натрия, гистидин, сахароза, маннит и Твин 80, при значении рН 7,0 или менее, были отобраны композиции, содержащие один или несколько указанных буферов, лиопротекторов или поверхностно-активного вещества, для дальнейшего исследования.
Пример 10. Лиофилизированная композиция белка слияния на основе КАСЕ.
На основании информации, полученной в примере 9, исследуют другие композиции ТТР-4000. Исследования были направлены на идентификацию буферов и/или лиопротекторов, которые будут полезны для целей поддержания стабильности продукта в течение всего процесса лиофильной сушки с возможностью достижения высокой концентрации ТТР-4000 при восстановлении (т.е. концентрации примерно 50 мг/мл или выше). Были проанализированы шесть композиций в течение 2-недельного испытания по процедуре ускоренной оценки стабильности. Исследуемые композиции описаны в табл. 9. Как указывается ниже в тексте, оценивался также цикл лиофильной сушки, разработанный для варианта повышенных доз ТТР-4000 (250 мг).
По завершению цикла лиофильной сушки флаконы с образцами композиции, находящейся в стадии разработки, закручивают и помещают в камеру с температурой 40°С на 2 недели. Образцы композиции, которую оценивают применительно к масштабированию, хранят при температуре 2-8°С до проведения тестирования.
Методы анализа образцов.
Концентрацию ТТР-4000 в образцах измеряют по процедуре УФ-спектрометрии в УФ/видимой области. Используют спектрофотометр Адйеп! υν-ν^ для получения спектров белков, а также спектров буферных образцов, взятых в качестве слепых проб. При вычислении показателя абсорбции, проводят коррекцию на наличие светового рассеяния, которое может быть результатом агрегации белков.
Остаточную влажность анализируют по методу титрования Карла Фишера. Образцы лиофильно высушенной композиции, находящиеся на стадии разработки, восстанавливают соответствующим количеством νΕΙ. Длительность восстановления рассматривают как период времени от момента добавления воды до того момента времени, когда не отмечается видимых твердых компонентов. Значение рН в каждом образце измеряют после восстановления с использованием соответствующим образом откалиброванного полумикрозонда.
Проводят вытеснительную хроматографию (8ЕС) с использованием колонки Т8Кде1 8ирег 8ν2000 для анализа или мониторинга физической стабильности (деградации и образования растворимого агрегата) ТТР-4000 в ходе лиофильной сушки и хранения, в условиях ускоренного тестирования. Образцы инъецируют в Адйеп! 1100, серия ЬС, с двумя встроенными колонками Т8Кде1 8ирег 8ν2000, 4,6x300 мм, 4 мкм (^той Β^οкс^еπсе, 18674).
Для определения количества частиц 1 мл образца разбавляют в 20 раз до получения объема в 20 мл. Образец дегазируют путем озвучивания в течение примерно 30 с и осторожно переворачивают вручную для перемешивания так, чтобы не образовались пузырьки. Отбирают 3 аликвоты, каждую объемом по 5 мл, и переносят в непрозрачный сенсорный счетчик. При установке прибора на кумулятивный режим работы частицы собираются в группы, равные или более чем 10 мкм, и в группы, равные или более чем 25 мкм.
Результаты.
На основании предварительных исследований композиции, проведенных по процедуре примера 9, вначале исследовали два буфера: цитрат натрия и Ь-гистидин. Концентрированные композиции 1-6 (табл. 9) были получены с использованием центрифужных концентраторов. Конечные концентрации белка в композициях 1-6, показанных в табл. 9, варьируют в диапазоне значений примерно от 4 до 15 мг/мл.
- 55 017291
Таблица 9
Композиции на основе ТТР-4000
В случае композиций 1-6, показанных в табл. 9, были использованы флаконы (2 мл) с объемами наполнения, равными 0,7 мл. Свободное пространство флаконов было заполнено воздухом. Перед сушкой образцы замораживают так, чтобы температура на полке составляла от -50 до -20°С в течение примерно 12 ч. Далее образцы сушат при пониженном давлении 100 мТорр и при поддержании температуры на полке в диапазоне от примерно -20 до -10°С в течение 36 ч и затем в условиях, когда температура на полке составляет 20°С в течение примерно 12 ч. По завершению сушки при замораживании флаконы закрывают пробками и закручивают крышки. Для каждой из композиций 1-6 получают спрессованные аггломераты.
Лиофильно высушенные продукты исследуют в условиях ускоренного тестирования для оценки химической стабильности полученной композиции. Лиофильно высушенные продукты помещают для хранения при температуре 40°С и относительной влажности 75% в течение 2 недель.
Лиофильно высушенные продукты восстанавливают с использованием 0,206 мл ^ΡΙ. Все лиофильно высушенные продукты восстанавливают в течение 20 с или менее. Значение рН поддерживается на нужном уровне во всех восстановленных композициях в течение всего 2-недельного периода хранения. Показатели остаточной влажности, определяемые в лиофильно высушенных продуктах во временных точках 0 и 2 недели, составляют от 3,0 до 0,8%, и было показано, что цикл лиофильной сушки позволяет получить достаточно сухие предварительно лиофилизированные композиции. Осмоляльность всех восстановленных композиций находится в диапазоне от 250 до 400 мОсм/кг (см. табл. 10). Вязкость каждой восстановленной композиции была менее чем 3,7 сП.
Таблица 10 Восстановленные композиции на основе ТТР-4000 и их осмоляльность
Цитрат натрич (мН) (тМ) Гистидин (мю Сахароза (ММ) Маннит (мМ) Твин 80 (%) Осмоляльность (мОсм/кг)
1 10 60 322
2 10 30 50 385
3 10 60 0,01 324
4 10 60 264
5 10 30 50 336
6 10 60 0,01 2 62
Анализ с использованием вытеснительной хроматографии проводят применительно к образцам композиции 5, описанной в табл. 10, отобранным на разных стадиях процесса лиофильной сушки, и было показано, что ТТР-4000 в составе этих композиций не характеризуется особой чувствительностью к условиям, создаваемым на стадиях лиофильной сушки, на что указывали данные по постоянно низким уровням агрегата и продуктов распада.
Анализ в рамках вытеснительной хроматографии также проводили с использованием предварительно лиофилизированных композиций, перед процессом лиофильной сушки, а также с использованием восстановленных композиций в нулевой момент времени и после проведения 2-недельного исследования на стабильность в ускоренном режиме. Количество примесей (агрегата или продуктов распада) было постоянно низким (т.е. ниже 4%) (табл. 11).
- 56 017291
Таблица 11
Восстановленные композиции на основе ТТР-4000 и % интактного белка
Цитрат натрия (мМ) Гистидин (мМ) Сахароза (мМ) Маннит (мМ) Твин 80 (%) % интактн. белка (Т=0) % интактн. белка (Т=2 нед.)
1 10 60 96, 2 97,3
2 10 30 50 96,8 97,3
3 10 60 0,01 96,3 97,2
4 10 60 97,4 97,0
5 10 30 50 97,9 96, 9
6 10 60 0,01 97,7 96, 9
Исследование по процедуре картирования пептидов показало отсутствие окисления или дезамидирования ТТР-4000, после проведения лиофильной сушки и хранения в режиме ускоренного тестирования.
Анализ с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ, проведенный применительно к композициям 1, 3, 4 и 6, показал, что ТТР-4000 сохраняет физическую стабильность в данных композициях в ходе всего процесса лиофильной сушки и хранения.
Для масштабирования процесса лиофилизации с целью использования флаконов для лиофилизации объемом 50 мл и дозы ТТР-4000 в 250 мг, получают образцы путем концентрирования раствора до достижения концентрации ТТР-4000 в 15 мг/мл, с использованием ультрафильтрации и затем диафильтрации раствора против 10 мМ гистидина и 65 мМ сахарозы при рН 6,0. Затем добавляют Твин 80 до конечной концентрации 0,01 об.%.
К каждому флакону по 50 мл добавляют предварительно лиофилизированную композицию (16,67 мл). Образцы подвергают обработке в цикле лиофильной сушки, где образцы охлаждают при температуре полки от 5 до -5°С в течение 30 мин и затем охлаждают на полке при температуре -50°С в течение 3 ч. Образцы сушат при пониженном давлении в 100 мТорр и при температуре на полке от -20 до -10°С в течение примерно 34 ч, после чего выдерживают в течение примерно 11 ч на полке с температурой от 5 до 20°С. После лиофилизации флаконы закрывают пробкой и закручивают крышки. Получают фармацевтически элегантный белый аггломерат. Указанный аггломерат выглядит как жесткий и не теряет своей структуры при обработке и хранении.
Концентрация восстановленного образца, определенная по значению поглощения при длине волны 280 нм составляет 40,5 мг/мл ТТР-4000. В дополнительных исследованиях в аналогичных условиях было показано, что концентрация ТТР-4000 в восстановленном образце неизменно составляет около 50 мг/мл.
В восстановленном образце определяют содержание частиц в точках 0, 2 и 6 ч в условиях хранения при комнатной температуре. Приведенные в табл. 12 результаты показывают, что восстановленный образец характеризуется низким содержанием частиц.
Таблица 12
Количество частиц, выявленных в восстановленном образце при хранении
Размер частиц Время=0 Время=2 часа Время=6 часов
Число частиц на мл >10 мкм 562 368 948
>25 мкм 8 16 20
Число частиц на контейнер >10 мкм 2753 1803 4645
>25 мкм 39 78 98
Далее исследовали ТТР-4000, изготовленный в цитратном и гистидиновом буферах, содержащих один или несколько следующих ингредиентов: сахарозу, маннит и Твин 80. Анализ показал, что композиции, содержащие цитрат натрия или гистидин, имеют близкие характеристики и что ТТР-4000 лучше растворим в композиции, содержащей гистидин.
Композиции, содержащие гистидин, были далее исследованы в рамках разработок по масштабированию. По завершению цикла лиофильной сушки, оценивают химическую и физическую стабильность ТТР-4000, и при этом не было выявлено значимых различий между гистидиновыми композициями. Кроме того, маннит был удален из композиции. Окончательная композиция, выбранная в результате исследований по разработке композиции, содержала 10 мМ гистидина, 60 мМ сахарозы и 0,01% Твина 80 при значении рН примерно 6,0. Эта композиция демонстрировала наилучшую способность поддерживать
- 57 017291 стабильность ТТР-4000 в ходе лиофильной сушки и хранения, а также обеспечивала наивысшую концентрацию ТТР-4000 в ходе исследования. В исследовании по масштабированию уровень сахарозы поднимали до 65 мМ для достижения осмоляльности композиции, близкой к изотоничности. В ходе указанного исследования по масштабированию было показано, что при поддержании значения рН в предварительно лиофилизированной композиции и в восстановленной композиции ТТР-4000 на уровне примерно рН 6,0 и менее чем 6,7 удается снизить осаждение или агрегацию белка, что рассматривается как благоприятный фактор.
Приведенное выше описание рассматривается лишь как иллюстративное для пояснения принципа изобретения. Для специалистов в данной области будет понятна возможность множества модификаций и изменений, и приведенное описание не ограничивает изобретение конкретными вариантами его реализации, но все подходящие модификации и эквиваленты охватываются областью прилагаемой формулы изобретения и соответствуют изобретательской стадии настоящего изобретения.

Claims (36)

1. Композиция, включающая лиофилизированную смесь лиопротектора, белка слияния на основе КАСЕ и буфера, где белок слияния на основе КАСЕ включает полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему домен Сн2 иммуноглобулина или функциональную часть домена Сн2 иммуноглобулина, где полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда КАСЕ, где лиопротектор включает невосстанавливающий сахар и где количество буфера является достаточным для обеспечения восстановленной композиции, имеющей рН в диапазоне от 6,0 до 6,7, когда концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет от 1 до 400 мг/мл.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что белок слияния на основе КАСЕ включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что белок слияния на основе КАСЕ включает (ί) междоменный линкер КАСЕ, который разделяет V- и С1-домены КАСЕ; или (ίί) линкер, который разделяет С1и С2-домены КАСЕ, вместо шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что белок слияния на основе КАСЕ кодируется молекулой ДНК, включающей последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 30, 8Е0 ΙΌ N0: 31, 8Е0 ΙΌ N0: 54 или 8ЕО ΙΌ N0: 55.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что композиция дополнительно включает по меньшей мере один из следующих компонентов: поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент или наполнитель.
6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что невосстанавливающий сахар включает по меньшей мере один из следующих компонентов: сахарозу, маннит или трегалозу.
7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что буфер включает гистидин.
8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда КАСЕ, который включает аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 10, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 47, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична.
9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что белок слияния на основе КАСЕ включает по меньшей мере одну из указанных аминокислотных последовательностей: 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% им идентична.
10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична каждой из 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57, представляет собой аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57 соответственно, без С-концевого лизина.
11. Восстановленная композиция, включающая лиофилизированный белок слияния на основе КАСЕ, восстановленный в разбавителе, где концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет от 1 до 400 мг/мл, где восстановленная композиция включает лиопротектор, белок слияния на основе КАСЕ и буфер, и где белок слияния на основе КАСЕ включает полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему домен Сн2 иммуноглобулина или функциональную часть домена Сн2 иммуноглобулина, где полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда КАСЕ, и где лиопротектор включает невосстанавливающий сахар, и где рН находится в диапазоне от 6,0 до 6,7.
12. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что концентрация белка слияния на основе КАСЕ в восстановленной композиции составляет от 40 до 100 мг/мл.
13. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что белок слияния на основе КАСЕ включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина.
- 58 017291
14. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что белок слияния на основе ВАСЕ включает (ί) междоменный линкер ВАСЕ, который разделяет V- и С1-домены ВАСЕ; или (ίί) линкер, который разделяет С1- и С2-домены ВАСЕ, вместо шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
15. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что белок слияния на основе ВАСЕ кодируется молекулой ДНК, включающей последовательность, представленную в ЗЕЦ ГО N0: 30, 8ЕЦ ГО N0: 31, 8ЕО ГО N0: 54 или 8ЕО ГО N0: 55.
16. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда ВАСЕ, который включает аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 10, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕЦ ГО N0: 47, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична.
17. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что белок слияния на основе ВАСЕ включает по меньшей мере одну из указанных аминокислотных последовательностей: ЗЕЦ ГО N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% им идентична.
18. Восстановленная композиция по п.17, отличающаяся тем, что последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична каждой из ЗЕЦ ГО N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57, представляет собой аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕЦ ГО N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57 соответственно, без С-концевого лизина.
19. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что композиция включает 1-400 мг/мл белка слияния на основе ВАСЕ, включающего последовательность, представленную в ЗЕЦ ГО N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57, или последовательность, которая по меньшей мере на 90% ей идентична; от 1 до 100 мМ гистидинового буфера; от 60 до 65 мМ сахарозы; от 0,001 до 0,05% Твина 80; и характеризуется значением рН от 6,0 до 6,5.
20. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что композиция демонстрирует уровень разложения менее чем 5% после хранения в течение 1 недели при температуре 40°С.
21. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что менее чем 10% белка слияния на основе ВАСЕ присутствует в виде агрегата в композиции при ее восстановлении.
22. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что невосстанавливающий сахар включает по меньшей мере один из следующих компонентов: сахарозу, маннит или трегалозу.
23. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что лиофилизированная композиция белка слияния на основе ВАСЕ дополнительно включает по меньшей мере один из следующих компонентов: поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент или наполнитель.
24. Восстановленная композиция по п.11, отличающаяся тем, что восстановленная композиция пригодна для подкожного или внутримышечного введения.
25. Набор, включающий контейнер, который содержит композицию по любому из пп.1-10, и инструкции по восстановлению композиции разбавителем, так чтобы концентрация белка слияния на основе ВАСЕ в восстановленной композиции составляла от 1 до 400 мг/мл и рН составляло от 6,0 до 6,7.
26. Набор по п.25, отличающийся тем, что концентрация белка слияния на основе ВАСЕ в восстановленной композиции составляет от 40 до 100 мг/мл.
27. Набор по п.25, дополнительно включающий второй контейнер, который содержит разбавитель для восстановления лиофилизированной композиции.
28. Способ получения стабильной восстановленной композиции белка слияния на основе ВАСЕ, включающий восстановление лиофилизированной смеси белка слияния на основе ВАСЕ, лиопротектора и буфера в разбавителе, так чтобы концентрация белка слияния на основе ВАСЕ в восстановленной композиции составляла от 1 до 400 мг/мл и рН составляло от 6,0 до 6,7, где белок слияния на основе ВАСЕ включает полипептид ВАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему домен Сн2 иммуноглобулина или функциональную часть домена Сн2 иммуноглобулина, где полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда ВАСЕ и где лиопротектор включает невосстанавливающий сахар.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что белок слияния на основе ВАСЕ включает междоменный линкер, полученный из ВАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина.
30. Способ по п.28, отличающийся тем, что белок слияния на основе ВАСЕ включает (ί) междоменный линкер ВАСЕ, который разделяет V- и С1-домены ВАСЕ; или (ίί) линкер, который разделяет С1- и С2-домены ВАСЕ, вместо шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
31. Способ по п.28, отличающийся тем, что лиопротектор включает по меньшей мере один из следующих компонентов: сахароза, маннит или трегалоза.
32. Способ по п.28, отличающийся тем, что лиофилизированная смесь дополнительно включает по меньшей мере один из следующих компонентов: поверхностно-активное вещество, хелатирующий агент или наполнитель.
33. Способ по п.28, отличающийся тем, что белок слияния на основе ВАСЕ включает по меньшей мере одну из указанных аминокислотных последовательностей: ЗЕЦ ГО N0: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 или 57 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% им идентична.
- 59 017291
34. Применение композиции по любому из пп.1-10 для получения восстановленной композиции по любому из пп.11-24.
35. Применение восстановленной композиции по любому из пп.11-24 в качестве лекарственного средства.
36. Применение восстановленной композиции по любому из пп.11-24 для лечения диабета или симптома поздних осложнений диабета, амилоидоза, болезни Альцгеймера, рака, почечной недостаточности или воспаления, ассоциированного с аутоиммунным процессом, воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, псориаза, рассеянного склероза, гипоксии, инсульта, сердечного приступа, геморрагического шока, сепсиса, трансплантации органа, остеопороза, плохого заживления ран или воспаления и/или отторжения, ассоциированного с трансплантацией по меньшей мере одного из следующего: органа, ткани или совокупности клеток из первого участка во второй участок.
EA200870502A 2006-05-05 2007-04-25 Белки слияния на основе rage, их композиции и способы их применения EA017291B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79845506P 2006-05-05 2006-05-05
PCT/US2007/010125 WO2007130302A2 (en) 2006-05-05 2007-04-25 Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870502A1 EA200870502A1 (ru) 2009-06-30
EA017291B1 true EA017291B1 (ru) 2012-11-30

Family

ID=38521887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870502A EA017291B1 (ru) 2006-05-05 2007-04-25 Белки слияния на основе rage, их композиции и способы их применения

Country Status (21)

Country Link
US (2) US7981424B2 (ru)
EP (2) EP2021474A2 (ru)
JP (1) JP5558810B2 (ru)
KR (1) KR20090008459A (ru)
CN (1) CN101548012A (ru)
AR (1) AR060862A1 (ru)
AU (1) AU2007248784B2 (ru)
BR (1) BRPI0711193A2 (ru)
CA (1) CA2651348A1 (ru)
DO (1) DOP2007000089A (ru)
EA (1) EA017291B1 (ru)
IL (1) IL194482A0 (ru)
MX (1) MX2008013863A (ru)
NL (1) NL2000626A1 (ru)
NZ (1) NZ571692A (ru)
PE (1) PE20080397A1 (ru)
SG (1) SG171670A1 (ru)
TW (1) TW200801036A (ru)
UY (1) UY30324A1 (ru)
WO (1) WO2007130302A2 (ru)
ZA (1) ZA200809394B (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2570324C (en) * 2004-08-03 2014-07-22 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
US20090060925A1 (en) * 2004-08-03 2009-03-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of Rage Fusion Proteins and Methods of Use
EP1963786B1 (en) * 2005-12-23 2013-07-24 GCoder Systems AB Positioning pattern
WO2007094926A2 (en) * 2006-02-09 2007-08-23 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
SG171670A1 (en) 2006-05-05 2011-06-29 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof
TW200902063A (en) * 2007-02-15 2009-01-16 Univ Kumamoto Therapeutic agent comprising antibody capable of specifically binding to human hmgb-1 as active ingredient
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
EP2123299A4 (en) * 2007-02-15 2011-10-05 Univ Kyushu Nat Univ Corp THERAPEUTIC AGENT FOR INTERSTITIAL PULMONARY DISEASE COMPRISING ANTI-HMGB-1 ANTIBODY
JP5285437B2 (ja) * 2007-02-15 2013-09-11 学校法人福岡大学 抗ｈｍｇｂ−１抗体を含む臓器移植拒絶抑制剤
CN101842382A (zh) 2007-06-14 2010-09-22 卡拉狄加制药公司 Rage融合蛋白
EP2421892A1 (en) * 2009-04-20 2012-02-29 Pfizer Inc. Control of protein glycosylation and compositions and methods relating thereto
WO2011102845A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion protein compositions and methods of use
WO2013074820A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Immunogenic tumor associated stromal cell antigen peptides and methods of their use
KR102166374B1 (ko) * 2012-11-28 2020-10-15 노노 인코포레이티드 Tat-nr2b9c의 동결건조된 제형
US10251935B2 (en) * 2012-11-28 2019-04-09 Nono Inc. Lyophilized formulation comprising tat-NR2B9C, histidine and trehalose
WO2015085097A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for identifying and treating cachexia or pre-cachexia
US11311002B2 (en) 2014-10-01 2022-04-26 National Agriculture And Food Research Organization Biotinylated and oxidized LDL receptor and advanced glycation end product receptor produced using genetically engineered silkworm
EP3822291A1 (en) 2015-06-10 2021-05-19 The Broad Institute Inc. Antibodies, compounds and screens for identifying and treating cachexia or pre-cachexia
WO2017106196A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating cardiac dysfunction
CN112699601B (zh) * 2020-12-28 2022-05-31 电子科技大学 一种传感器网络数据的空时重构方法
US20230246158A1 (en) * 2022-02-02 2023-08-03 Enevate Corporation Cycle life in si/li batteries using high temperature deep discharge cycling

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA003634B1 (ru) * 1998-10-05 2003-08-28 Фармэкса А/С Новые способы терапевтической вакцинации
RU2219947C2 (ru) * 1997-09-18 2003-12-27 Айдек Фармасьютикалз Корпорейшн Синергическая композиция и способы лечения состояний неопластического или злокачественного роста и восстановления или усиления гемопоэза
WO2004016229A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Wyeth Compositions and methods for treating rage-associated disorders
WO2006017643A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US5567584A (en) * 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
MX9204374A (es) * 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
SE9201073D0 (sv) * 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
MX9705449A (es) * 1995-01-18 1998-02-28 Alteon Inc Uso de compuestos de tiazolio para evitar y revertir la formacion de productos finales de glicosilacion avanzada.
US5656261A (en) * 1995-01-18 1997-08-12 The Picower Institute For Medical Research Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
NO315930B1 (no) 1995-01-18 2003-11-17 Picower Inst For Medical Res T Anvendelse av tiazoliumforbindelser ved fremstilling av farmasöytiske preparater, preparater som inneholder forbindelsene, samt nyetiazoliumforbindelser
JPH11504316A (ja) * 1995-04-05 1999-04-20 ザ ピコワー インスティテュート フォア メディカル リサーチ 進行性グリコシル化終末産物に結合する薬剤及びその使用方法
US5747035A (en) * 1995-04-14 1998-05-05 Genentech, Inc. Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997026913A1 (en) 1996-01-26 1997-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A POLYPEPTIDE FROM LUNG EXTRACT WHICH BINDS AMYLOID-β PEPTIDE
AU2696097A (en) 1996-04-16 1997-11-07 Schering Aktiengesellschaft Advanced glycosylation end-product receptor peptides and uses therefor
US5864018A (en) * 1996-04-16 1999-01-26 Schering Aktiengesellschaft Antibodies to advanced glycosylation end-product receptor polypeptides and uses therefor
US6790443B2 (en) * 1996-11-22 2004-09-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for treating symptoms of diabetes
US7258857B2 (en) * 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
US7081241B1 (en) * 1998-10-06 2006-07-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Extracellular rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
US6555651B2 (en) * 1997-10-09 2003-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ligand binding site of rage and uses thereof
WO1998040071A1 (en) 1997-03-11 1998-09-17 The General Hospital Corporation Identification of agents for use in the treatment of alzheimer's disease
US7101838B2 (en) * 1997-08-05 2006-09-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to prevent accelerated atherosclerosis using (sRAGE) soluble receptor for advanced glycation endproducts
US6380165B1 (en) * 1997-09-19 2002-04-30 The Picower Institute For Medical Research Immunological advanced glycation endproduct crosslink
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6323218B1 (en) 1998-03-11 2001-11-27 The General Hospital Corporation Agents for use in the treatment of Alzheimer's disease
US6465422B1 (en) 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
WO2000018970A1 (fr) 1998-09-29 2000-04-06 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Procede de commande de liberation de granules
US6753150B2 (en) * 1998-10-05 2004-06-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for determining whether a compound is capable of inhibiting the interaction of a peptide with rage
AU765719B2 (en) 1998-10-06 2003-09-25 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Extracellular novel rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
US6197294B1 (en) * 1998-10-26 2001-03-06 Neurotech S.A. Cell surface molecule-induced macrophage activation
US6589944B1 (en) 1999-04-05 2003-07-08 City Of Hope Breakers of advanced glycation endproducts
US6787566B2 (en) * 1999-04-05 2004-09-07 City Of Hope Breakers of advanced glycation endproducts
US6605642B2 (en) * 1999-04-05 2003-08-12 City Of Hope Inhibitors of formation of advanced glycation endproducts (AGES)
US6939545B2 (en) * 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
US6835200B2 (en) 1999-06-22 2004-12-28 Ndo Surgical. Inc. Method and devices for tissue reconfiguration
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
WO2001012598A2 (en) 1999-08-13 2001-02-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York METHODS OF INHIBITING BINDING OF β-SHEET FIBRIL TO RAGE AND CONSEQUENCES THEREOF
EP1219639A4 (en) 1999-09-08 2009-03-25 Toray Industries CIPO - Patent
US20050170382A1 (en) * 1999-10-06 2005-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York. RAGE-related compositions
WO2001029269A2 (en) 1999-10-21 2001-04-26 Case Western Reserve University Gene expression profiling of inflammatory bowel disease
CA2382165A1 (en) * 1999-12-08 2001-06-14 Genset S.A. Full-length human cdnas encoding potentially secreted proteins
DE60129008T2 (de) * 2000-04-14 2007-10-11 Niadyne Corp., Tucson Methode zur identifizierung von regulatoren der bildung von protein-age-derivaten
AU2001255436A1 (en) 2000-04-17 2001-10-30 Transtech Pharma Protein expression system arrays and use in biological screening
US6563015B1 (en) * 2000-08-14 2003-05-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof
US6825164B1 (en) * 2000-08-14 2004-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to increase cerebral blood flow in amyloid angiopathy
PL366009A1 (en) * 2000-10-02 2005-01-24 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of inflammatory diseases
WO2002030889A2 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury
US20050244849A1 (en) * 2000-12-15 2005-11-03 Genetics Institute, Llc Screening assays for rheumatoid arthritis
HUP0600450A2 (en) * 2000-12-29 2006-09-28 Reddy Us Therapeutics Detection of compounds that modulate inflammatory responses
WO2002066514A2 (en) * 2001-02-19 2002-08-29 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
JP3837494B2 (ja) * 2001-03-19 2006-10-25 国立大学法人金沢大学 可溶型ｒａｇｅタンパク質
US7304034B2 (en) * 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
US8067371B2 (en) * 2003-05-09 2011-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York RAGE G82S-related methods and compositions for treating inflammatory disorders
WO2005021710A2 (en) * 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
US20070014791A1 (en) * 2003-09-05 2007-01-18 Schmidt Ann M Rage-related methods and copositions for treating glomerular injury
US20070167360A1 (en) * 2003-10-31 2007-07-19 Yan Shi D Methods for treating multiple sclerosis
US20060012414A1 (en) * 2004-07-15 2006-01-19 Texas Instruments Incorporated Circuit and method for generating a polyphase clock signal and system incorporating the same
WO2006012415A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
WO2006012414A2 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Novel polyadenylation signal for use in expression vectors
CA2570324C (en) * 2004-08-03 2014-07-22 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
AU2005289594B2 (en) * 2004-09-27 2012-02-02 Centocor, Inc. Srage mimetibody, compositions, methods and uses
US20080207499A1 (en) * 2005-06-29 2008-08-28 Gaetano Barile Rage-related methods for treating and preventing diabetic retinopathy
WO2007094926A2 (en) * 2006-02-09 2007-08-23 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
SG171670A1 (en) 2006-05-05 2011-06-29 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2219947C2 (ru) * 1997-09-18 2003-12-27 Айдек Фармасьютикалз Корпорейшн Синергическая композиция и способы лечения состояний неопластического или злокачественного роста и восстановления или усиления гемопоэза
EA003634B1 (ru) * 1998-10-05 2003-08-28 Фармэкса А/С Новые способы терапевтической вакцинации
WO2004016229A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Wyeth Compositions and methods for treating rage-associated disorders
WO2006017643A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007248784A1 (en) 2007-11-15
DOP2007000089A (es) 2007-11-15
UY30324A1 (es) 2008-01-02
NZ571692A (en) 2012-01-12
US20110282035A1 (en) 2011-11-17
US7981424B2 (en) 2011-07-19
WO2007130302A3 (en) 2008-04-03
SG171670A1 (en) 2011-06-29
JP2009536201A (ja) 2009-10-08
EP2380983A3 (en) 2012-12-05
WO2007130302A2 (en) 2007-11-15
EP2380983A2 (en) 2011-10-26
CA2651348A1 (en) 2007-11-15
ZA200809394B (en) 2009-07-29
US8344120B2 (en) 2013-01-01
BRPI0711193A2 (pt) 2013-06-18
AU2007248784B2 (en) 2013-11-21
PE20080397A1 (es) 2008-04-28
AR060862A1 (es) 2008-07-16
EA200870502A1 (ru) 2009-06-30
MX2008013863A (es) 2008-11-14
JP5558810B2 (ja) 2014-07-23
IL194482A0 (en) 2011-08-01
NL2000626A1 (nl) 2007-11-06
EP2021474A2 (en) 2009-02-11
CN101548012A (zh) 2009-09-30
KR20090008459A (ko) 2009-01-21
TW200801036A (en) 2008-01-01
US20080045455A1 (en) 2008-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017291B1 (ru) Белки слияния на основе rage, их композиции и способы их применения
AU2019215110B2 (en) Modified monocytes/macrophages/dendritic cells expressing chimeric antigen receptors and uses in diseases and disorders associated with protein aggregates
US20200030377A1 (en) Antigen-specific immune modulation
EA012082B1 (ru) Белки слияния на основе rage и способы их использования
EA015657B1 (ru) Слитые белки rage и способы применения
EA012586B1 (ru) Rage-слитые белки и способы их применения
US20110110945A1 (en) Immunoglobulin Fusion Proteins and Methods of Making
US20130142792A1 (en) RAGE Fusion Protein Compositions And Methods Of Use
US20230174619A1 (en) PD-L1 variants with improved affinity towards PD-1
NL2001558C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001556C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001553C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001555C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001554C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001552C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001557C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001551C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU