EA012082B1 - Белки слияния на основе rage и способы их использования - Google Patents
Белки слияния на основе rage и способы их использования Download PDFInfo
- Publication number
- EA012082B1 EA012082B1 EA200700404A EA200700404A EA012082B1 EA 012082 B1 EA012082 B1 EA 012082B1 EA 200700404 A EA200700404 A EA 200700404A EA 200700404 A EA200700404 A EA 200700404A EA 012082 B1 EA012082 B1 EA 012082B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cace
- domain
- fusion protein
- immunoglobulin
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 299
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 299
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 314
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 274
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 261
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 225
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 225
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 152
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 107
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 176
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 57
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 37
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 25
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 22
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 17
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 claims description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 9
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 8
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 3
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 claims description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 claims 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 6
- 101000894895 Homo sapiens Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 238
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 description 221
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 189
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 129
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 50
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 40
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 38
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 30
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 20
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 17
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 17
- -1 aldose sugars Chemical class 0.000 description 17
- 102000044297 human BACE1 Human genes 0.000 description 17
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 16
- 101000916264 Homo sapiens Catenin delta-1 Proteins 0.000 description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 15
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 10
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 9
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 9
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 9
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 9
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 9
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 8
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 8
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 7
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 6
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101001090813 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-6 Proteins 0.000 description 5
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 5
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000051411 human PSMA6 Human genes 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 5
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 4
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 4
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 229940123208 Biguanide Drugs 0.000 description 3
- 206010012655 Diabetic complications Diseases 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 3
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 3
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 3
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 3
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 3
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 3
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 3
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 3
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 3
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 3
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 3
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 3
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 3
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 3
- 150000004283 biguanides Chemical class 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 108091006058 immobilized fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- RRUYWEMUWIRRNB-LURJTMIESA-N (2s)-6-amino-2-[carboxy(methyl)amino]hexanoic acid Chemical compound OC(=O)N(C)[C@H](C(O)=O)CCCCN RRUYWEMUWIRRNB-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000030767 Autoimmune encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101150070878 Ereg gene Proteins 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 101000931668 Homo sapiens Follistatin Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 2
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101100240886 Rattus norvegicus Nptx2 gene Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 2
- 210000004004 carotid artery internal Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N donepezil Chemical compound O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 2
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 2
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 2
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 2
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 2
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHOUBRCZNHFOSL-YOEHRIQHSA-N (+)-Casbol Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1[C@H]1[C@H](COC=2C=C3OCOC3=CC=2)CNCC1 AHOUBRCZNHFOSL-YOEHRIQHSA-N 0.000 description 1
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 1
- HRGCAZUYBJZUHM-GDVGLLTNSA-N (6S)-2-amino-6-(methylamino)heptanedioic acid Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CCCC(N)C(O)=O HRGCAZUYBJZUHM-GDVGLLTNSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTHCYVBBDHJXIQ-MRXNPFEDSA-N (R)-fluoxetine Chemical compound O([C@H](CCNC)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 RTHCYVBBDHJXIQ-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 1
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- KKTUQAYCCLMNOA-UHFFFAOYSA-N 2,3-diaminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1N KKTUQAYCCLMNOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 101800001718 Amyloid-beta protein Proteins 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101100446260 Arabidopsis thaliana At2g33705 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100119987 Arabidopsis thaliana FES1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240096 Arabidopsis thaliana NAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100144258 Arabidopsis thaliana RALFL19 gene Proteins 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N Desimpramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCNC)C2=CC=CC=C21 HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003790 Foot Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 101000889890 Homo sapiens Testis-expressed protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- AHOUBRCZNHFOSL-UHFFFAOYSA-N Paroxetine hydrochloride Natural products C1=CC(F)=CC=C1C1C(COC=2C=C3OCOC3=CC=2)CNCC1 AHOUBRCZNHFOSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 244000019194 Sorbus aucuparia Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100040172 Testis-expressed protein 11 Human genes 0.000 description 1
- KLBQZWRITKRQQV-UHFFFAOYSA-N Thioridazine Chemical compound C12=CC(SC)=CC=C2SC2=CC=CC=C2N1CCC1CCCCN1C KLBQZWRITKRQQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLRGJRBPOGGCBT-UHFFFAOYSA-N Tolbutamide Chemical compound CCCCNC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 JLRGJRBPOGGCBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- WERKSKAQRVDLDW-ANOHMWSOSA-N [(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO WERKSKAQRVDLDW-ANOHMWSOSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 1
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000007792 alzheimer disease pathology Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000002551 anterior cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229940005529 antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000008228 bacteriostatic water for injection Substances 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- YAYRGNWWLMLWJE-UHFFFAOYSA-L carboplatin Chemical compound O=C1O[Pt](N)(N)OC(=O)C11CCC1 YAYRGNWWLMLWJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960003914 desipramine Drugs 0.000 description 1
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 description 1
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003530 donepezil Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 1
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 229960002464 fluoxetine Drugs 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960004580 glibenclamide Drugs 0.000 description 1
- 229960001381 glipizide Drugs 0.000 description 1
- ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N glipizide Chemical compound C1=NC(C)=CN=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N glyburide Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003878 haloperidol Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- CBCIHIVRDWLAME-UHFFFAOYSA-N hexanitrodiphenylamine Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1NC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O CBCIHIVRDWLAME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 1
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000008069 intimal proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920001206 natural gum Polymers 0.000 description 1
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- OSTGTTZJOCZWJG-UHFFFAOYSA-N nitrosourea Chemical compound NC(=O)N=NO OSTGTTZJOCZWJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 229960001494 octreotide acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229960002296 paroxetine Drugs 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004796 pathophysiological change Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007391 self-medication Methods 0.000 description 1
- 235000006414 serbal de cazadores Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 101150106357 slc32a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001685 tacrine Drugs 0.000 description 1
- YLJREFDVOIBQDA-UHFFFAOYSA-N tacrine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=C(CCCC3)C3=NC2=C1 YLJREFDVOIBQDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229960002784 thioridazine Drugs 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002277 tolazamide Drugs 0.000 description 1
- OUDSBRTVNLOZBN-UHFFFAOYSA-N tolazamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)NN1CCCCCC1 OUDSBRTVNLOZBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005371 tolbutamide Drugs 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- PHLBKPHSAVXXEF-UHFFFAOYSA-N trazodone Chemical compound ClC1=CC=CC(N2CCN(CCCN3C(N4C=CC=CC4=N3)=O)CC2)=C1 PHLBKPHSAVXXEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003991 trazodone Drugs 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- PYHOFAHZHOBVGV-UHFFFAOYSA-N triazane Chemical compound NNN PYHOFAHZHOBVGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
Описываются белки слияния на основе RAGE, включающие полипептидные последовательности RAGE, присоединенные ко второму полипептиду, отличному от RAGE. В белке слияния на основе RAGE может использоваться полипептидный домен RAGE, включающий сайт связывания лиганда RAGE, и междоменный линкер, непосредственно присоединенный к С2 домену иммуноглобулина. Такие белки слияния могут обеспечивать специфичное, высокоаффинное связывание с лигандами RAGE. Описывается также использование белков слияния на основе RAGE в качестве терапевтических средств при RAGE-опосредованной патологии.
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка устанавливает приоритет в соответствии с положением 35 И8С 119 (е) относительно предварительной заявки на патент США № 60/598555, зарегистрированной 3 августа 2004 года. Описание предварительной заявки на патент США 60/598555 включено полностью в настоящую заявку в виде ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к регуляции рецептора высокогликозилированных конечных продуктов (КАСЕ). Более конкретно, настоящее изобретение относится к белкам слияния, включающим полипептид КАСЕ, к способам получения таких белков слияния и к использованию таких белков для лечения расстройств, связанных с КАСЕ.
Предпосылки создания изобретения
Инкубация белков или липидов с альдозными сахарами приводит к неэнзиматическому гликозилированию и окислению аминогрупп на белках с образованием аддуктов Амадори. С течением времени указанные аддукты подвергаются дополнительной перегруппировке, дегидратации и сшиванию с другими белками с образованием комплексов, известных как высокогликозилированные конечные продукты (АСЕ). Факторы, которые способствуют образованию АСЕ, включают задержку белкового метаболизма (как, например, в случае амилоидозов), накопление макромолекул, характеризующихся высоким содержанием лизина, и высокие уровни глюкозы в крови (как, например, при диабете) (Ной е! а1., 1. ΒίοΙ. СНет. 270: 25752-761 (1995)). АСЕ вовлекаются в большое число расстройств, которые включают осложнения, ассоциированные диабетом, а также нормальный процесс старения организма.
АСЕ демонстрируют специфическое и насыщаемое связывание с рецепторами клеточной поверхности на моноцитах, макрофагах, эндотелиальных клетках микрососудистой сетки, гладкомышечных клетках, мезангиальных клетках и нейронах. Рецептор для высоко гликозилированных конечных продуктов (КАСЕ) относится к семейству молекул иммуноглобулинового супергена. Внеклеточный (Ν-концевой) домен КАСЕ включает три участка иммуноглобулинового типа: один домен У-типа (вариабельный), за которым следует два домена С-типа (константные) (№ерег, е! а1., 1. Βίο1. СНет., 267: 14998-15004 (1992); 8с1ишб1 е! а1., Спс. (8ирр1). 96#194 (1997)). За внеклеточным доменом следуют один трансмембранный домен и короткий высокозаряженный цитозольный фрагмент. Ν-Концевой внеклеточный домен может быть выделен путем протеолиза КАСЕ или с использованием стратегий молекулярной биологии с получением растворимого КАСЕ (эКАСЕ), включающего V и С домены.
КАСЕ экспрессируется на клетках различных типов, включающих лейкоциты, нейроны, клетки микроглии и сосудистого эндотелия (Ноп е! а1., 1. Βίο1. СНет. 270: 25752-761 (1995)). Повышенные уровни КАСЕ также обнаружены в стареющих тканях (ЪсЫеюНег е! а1., 1. С1т. 1пуеэ!., 99 (3): 457-468 (1997)) и в сетчатке, сосудистой сетке и почке у больных диабетом (8с1ишб1 е! а1., №Шге Меб., 1: 1002-1004 (1995)).
Кроме АСЕ, другие соединения также могут связываться и модулировать активность КАСЕ. КАСЕ связывается с лигандами, которые характеризуются полифункциональностью и наличием структурных различий и включают амилоид-бета (Ав), сывороточный амилоид А (8АА), конечные продукты с повышенным уровнем гликозилирования (АСЕ), 8100 (провоспалительный представитель семейства калгранулина), карбоксиметиллизин (СМЬ), афотерин и СО11Ь/СЭ18 (ВисаагеШ е! а1., Се11 Мо1. ЬгГе 8сг, 59: 1117128 (2002); СНауаКэ е! а1., М1сгоЬеэ 1пГес!., 6: 1219-1225 (2004); Кокко1а е! а1., 8сапб. 1. 1ттипо1., 61, 1-9 (2005); 8с11пиб1 е! а1., 1. С1ш. 1пуеэ!., 108: 949-955 (2001); Коскеп е! а1., Ат. 1. РаЛо1., 162: 1213-1220 (2003)).
Было показано, что связывание лигандов, таких как АСЕ, 8100/калгранулин, β-амилоид, СМЬ (Νεкарбоксиметиллизин) и амфотерин, с КАСЕ модифицирует экспрессию большого числа генов. Указанные виды взаимодействия могут затем инициировать механизмы сигнальной трансдукции, включая активацию р38, р21гаэ, МАР-киназ, фосфорилирование Егк1-2 и активацию медиатора транскрипции воспалительных сигнальных молекул, ΝΡ-κΒ (УеН е! а1., П1аЬе!е5, 50: 1495-1504 (2001)). Например, в клетках большого числа типов взаимодействие между КАСЕ и его лигандами может вызывать окислительный стресс, который приводит к активации фактора транскрипции ΝΡ-кВ, чувствительного к свободным радикалом, и к активации генов, регулируемых ΝΡ-кВ, таких как цитокины !И-1 β и ΤΝΡ-α. Кроме того, экспрессия КАСЕ подвергается позитивной регуляции через ΝΡ-кВ, так что выявляется повышенный уровень экспрессии в сайтах воспаления или при окислительном стрессе (Тапака е! а1., 1. ΒΟΗ СНет. 275: 25781-25790 (2000)). Таким образом, связывание лиганда инициирует петлю регуляции по типу положительной обратной связи, которая может быть поддерживать нарастающую и часто неблагоприятную спираль.
Активация КАСЕ в разных тканях и органах может приводить к большому числу патофизиологических последствий. КАСЕ вовлекается во множество состояний, включающих острое хроническое воспаление (НоГтапп е! а1., Се11. 97: 889-901 (1999)), развитие поздних осложнений диабета, таких как повышенная проницаемость сосудов (^аийег е! а1., 1. С1т. 1пуеэ!., 97: 238-243 (1995)), нефропатия (ТеШе! е! а1., 1. Ат. 8ос. №рйго1., 11: 1488-1497 (2000)), атеросклероз (У1аээага е! а1., ТНе РйпэН Меб1са1 8ос1е1у ОиОПЕС1М, Апп. Меб., 28: 419-426 (1996)) и ретинопатия (Наттеэ е! а1., 01аЬе(о1оц1а, 42: 603-607 (1999)). КАСЕ также вовлекается в патогенез болезни Альцгеймера (Уап е! а1., №!иге, 382: 685-691 (1996)) и в инвазию и метастазирование опухоли (ТадисЫ е! а1., №!иге, 405: 354-357 (2000)).
- 1 012082
Несмотря на масштабную экспрессию ВАСЕ и его явную плейотропную роль, продемонстрированную на многих различных моделях заболеваний, по всей видимости, ВАСЕ не является обязательным фактором в случае нормального развития. Например, мыши с выключенным функционированием ВАСЕ не демонстрируют аномального фенотипа, указывая на то, что, хотя ВАСЕ может играть определенную роль в патологии заболевания при хронической стимуляции, ингибирование ВАСЕ, скорее всего, не сказывается на каком-либо нежелательном остром фенотипе (Ыйспмск с1 а1., 1. С1ш. 1пус5к. 113: 1641-50 (2004)).
Антагонистическое связывание физиологических лигандов с ВАСЕ может оказывать отрицательную регуляцию патофизиологических изменений, создаваемых избыточными концентрациями АСЕ и других лигандов ВАСЕ. За счет снижения уровня связывания эндогенных лигандов с ВАСЕ могут быть снижены симптомы, ассоциированные с расстройствами, опосредованными ВАСЕ. Растворимый ВАСЕ (кВАСЕ) способен оказывать эффективное антагонистическое воздействие на связывание лигандов ВАСЕ с ВАСЕ. Однако &ВАСЕ может, в случае его введения ίη νίνο, обладать таким периодом полувыведения, который будет слишком мал для терапевтического применения в случае одного или нескольких расстройств. Таким образом, имеется потребность в разработке соединений, которые бы оказывали антагонистический эффект на связывание АСЕ и других физиологических лигандов с рецептором ВАСЕ, так чтобы такие соединения имели желательный фармакокинетический профиль.
Краткое описание сущности изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения включают белки слияния на основе ВАСЕ и способы использования таких белков. Настоящее изобретение может быть осуществлено в рамках множества способов. Варианты осуществления настоящего изобретения могут включать белок слияния, содержащий полипептид ВАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте белок слияния включает сайт связывания лиганда ВАСЕ. Белок слияния может также включать полипептид ВАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему домен СН2 иммуноглобулина или часть домена СН2.
Настоящее изобретение также относится к способу получения белка слияния на основе ВАСЕ. В одном варианте данный способ включает присоединение полипептида ВАСЕ ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда ВАСЕ. Данный способ может также включать присоединение полипептида ВАСЕ непосредственно к полипептиду, включающему домен Сц2 иммуноглобулина или часть домена Сн2.
В другом варианте настоящее изобретение может включать способы и композиции для лечения у субъекта расстройства, опосредованного ВАСЕ. Данный способ может включать введение белка слияния по настоящему изобретению субъекту. Композиция может включать белок слияния на основе ВАСЕ по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе.
Можно отметить различные преимущества, ассоциированные с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения. В одном варианте белки слияния по настоящему изобретению могут быть метаболически стабильными при их введении субъекту. Кроме того, белки слияния по настоящему изобретению могут демонстрировать высокую аффинность по связыванию с лигандами ВАСЕ. В некоторых вариантах белки слияния по настоящему изобретению связываются с лигандами ВАСЕ со значениями аффинности, укладывающимися в диапазон от высоких наномолярных до низких микромолярных количеств. В ситуации связывания с высокой аффинностью с физиологическими лигандами ВАСЕ белки слияния по настоящему изобретению могут использоваться для ингибирования связывания эндогенных лигандов с ВАСЕ, что может рассматриваться как способ облегчения заболеваний, опосредованных ВАСЕ.
Кроме того, белки слияния по настоящему изобретению могут быть представлены в виде белка или нуклеиновой кислоты. В одном репрезентативном варианте белок слияния может вводиться системно и оставаться в сосудистой сетке для эффективного лечения сосудистых заболеваний, которые частично опосредованы ВАСЕ. В другом репрезентативном варианте белок слияния может вводиться местно для лечения заболеваний, патология которых включает лиганды ВАСЕ. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующей белок слияния, может быть доставлена в нужный сайт путем использования соответствующего носителя, такого как вирус или «оголенная» ДНК, где временная местная экспрессия может локально ингибировать взаимодействие между лигандами ВАСЕ и рецепторами. Таким образом, введение может быть временным (как, например, в случае введения белка слияния) или более постоянным по своей природе (например, в том случае, когда белок слияния вводят в виде рекомбинантной ДНК).
Ниже описываются дополнительные особенности осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается деталями, приведенными в заявке, формуле изобретения и чертежах. Настоящее изобретение может быть осуществлено в виде других вариантов и может быть реализовано или выполнено различными способами.
Краткое описание чертежей
Различные особенности, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут более понятными при рассмотрении их в сочетании с приведенными чертежами.
На фиг. 1 показаны разные ВАСЕ последовательности, относящиеся к различным вариантам настоящего изобретения: панель А: 8ЕО ГО N0: 1, аминокислотная последовательность человеческого ВАСЕ; и 8Е0 ГО N0: 2, аминокислотная последовательность человеческого ВАСЕ без сигнальной по
- 2 012082 следовательности на участке аминокислот 1-22; панель В: 8ЕС ΙΌ N0: 3, аминокислотная последовательность человеческого КАСЕ без сигнальной последовательности на участке аминокислот 1-23; панель С: 8ЕС ΙΌ N0: 4, аминокислотная последовательность человеческого кКАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 5, аминокислотная последовательность человеческого кКАСЕ без сигнальной последовательности на участке аминокислот 1-22; и 8ЕС ΙΌ N0: 6, аминокислотная последовательность человеческого кКАСЕ без сигнальной последовательности на участках аминокислот 1-23; панель Ό: 8ЕС ΙΌ N0: 7, аминокислотная последовательность, включающая У-домен человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 8, альтернативная аминокислотная последовательность, включающая У-домен человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 9, ^концевой фрагмент У-домена человеческого КАСЕ; 8 ЕС ΙΌ N0: 10, альтернативный ^концевой фрагмент У-домена человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 11, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 124-221 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 12, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 227317 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 13, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-123 человеческого КАСЕ; панель Е: 8ЕС ΙΌ N0: 14, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-123 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 15, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-136 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 16, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-136 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 17, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-226 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 18, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-226 человеческого КАСЕ; панель Е: 8ЕС ΙΌ N0: 19, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 23-251 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 20, аминокислотная последовательность на участке аминокислот 24-251 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 21, междоменный линкер КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 22, второй междоменный линкер КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 23, третий междоменный линкер КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 24, четвертый междоменный линкер КАСЕ; панель С: 8ЕС ΙΌ N0: 25, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-118 человеческого КАСЕ; 8ЕС ΙΌ N0: 26, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-123 человеческого КАСЕ; и 8ЕС ΙΌ N0: 27, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-136 человеческого КАСЕ; панель Н: 8ЕС ΙΌ N0: 28, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-230 человеческого КАСЕ; и 8ЕС ΙΌ N0: 29, ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность на участке аминокислот 1-251 человеческого КАСЕ; панель Ι: 8ЕС ΙΌ N0: 38, частичная аминокислотная последовательность Сц2 и Сц3 доменов человеческого ΙβΟ; 8ЕС ΙΌ N0: 39, ДНК, кодирующая часть человеческих доменов СН2 и Сц3 человеческого ΙβΟ; 8ЕС ΙΌ N0: 40, аминокислотная последовательность СН2 и Сц3 доменов человеческого ΙβΟ; панель 1: 8ЕС ΙΌ N0: 41, ДНК, кодирующая человеческие домены СН2 и СН3 человеческого фС; 8ЕС ΙΌ N0: 42, аминокислотная последовательность Сн2 домена человеческого ΙβΟ; 8ЕС ΙΌ N0: 43, аминокислотная последовательность СН3 домена человеческого ΙβΟ; и 8ЕС ΙΌ N0: 44, пятый междоменный линкер КАСЕ.
На фиг. 2 показана последовательность ДНК (8ЕС ΙΌ N0: 39) кодирующего участка белка слияния на основе КАСЕ (ТТР-4000) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Кодирующая последовательность 1-753, выделенная жирным шрифтом, кодирует №концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность на участке 754-1386 кодирует белковую последовательность человеческого ΙβΟ Ес (γ1).
На фиг. 3 показана последовательность ДНК (8ЕС ΙΌ N0: 31) кодирующего участка альтернативного белка слияния на основе КАСЕ (ТТР-3000) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Кодирующая последовательность 1-408, выделенная жирным шрифтом, кодирует №концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность 409-1041 кодирует белковую последовательность человеческого ΙβΟ Ес (γ1).
На фиг. 4 показаны аминокислотные последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 32 (ТТР-4000), 8ЕС ΙΌ N0: 33 и 8ЕС ΙΌ N0: 34, каждая из которых кодирует четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. Последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом.
На фиг. 5 показаны аминокислотные последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 35 (ТТР-3000), 8ЕС ΙΌ N0: 36 и 8ЕС ΙΌ N0: 37, каждая из которых кодирует трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ, в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения. Последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом.
На фиг. 6, панель А, приведены сравнение белковых доменов человеческого КАСЕ и человеческого фС гамма-1 Ес белка и точки расщепления, используемые для получения ТТР-3000 (в положении 136) и ТТР-4000 (в положении 251), в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения; и на панели В показана доменная структура ТТР-3000 и ТТР-4000 в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 7 показаны результаты теста на связывание ίη νίΐτο для кКАСЕ и белков слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ТТ3) с лигандами КАСЕ амилоид-бета (А-бета), 8100Ь (8100) и амфотерином (Ашрйо) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения.
- 3 012082
На фиг. 8 показаны результаты теста на связывание ίη νίίτο для белка слияния на основе КАСЕ ТТР4000 (ТТ4) («белок») с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим только реагенты для иммунологического выявления («только комплекс»), и продемонстрирован антагонизм такого присоединения под действием антагониста КАСЕ («лиганд КАСЕ») в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 9 показаны результаты теста на связывание ίη νίίτο для белка слияния на основе КАСЕ ТТР3000 (ТТ3) («белок») с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим только реагенты для иммунологического выявления («только комплекс»), и продемонстрирован антагонизм такого присоединения под действием антагониста КАСЕ («лиганд КАСЕ») в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 10 показаны результаты клеточного теста, выполняемого для определения уровня ингибирования индуцированной 8100Ь-КАСЕ продукции ТИЕ-α под действием белков слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 (ТТ3), и ТТР-4000 (ТТ4), и 8КАСЕ, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 11 показан фармакокинетический профиль для белка слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, где каждая из кривых относится к разным животным в одних и тех же экспериментальных условиях.
На фиг. 12 показаны относительные уровни высвобождения ТИЕ-а из клеток ТНР-1 в результате стимуляции белком слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 и стимуляции человеческим 1дС как меры воспалительного ответа в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 13 иллюстрирует использование белка слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 для снижении рестеноза у животных с диабетом в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения, где на панели А показано, что белок слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 снижает соотношение внутренней оболочки/среды в сравнении с отрицательным контролем (1дС), и на панели В показано, что белок слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 снижает пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов зависимым от дозы способом.
Фиг. 14 иллюстрирует использование белка слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 для снижения образования амилоида и дисфункции познавательного процесса у животных с болезнью Альцгеймера (БА) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления настоящего изобретения, где на панели А показано, что белок слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 снижает амилоидную нагрузку мозга, а на панели В показано, что белок слияния на основе КАСЕ ТТР-4000 улучшает познавательную функцию.
На фиг. 15 приведены кривые, описывающие насыщение связывания для ТТР-4000 с различными иммобилизованными известными лигандами КАСЕ, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего описания, если особо не указано иное, все цифры, относящиеся к количествам ингредиентов, условиям реакции и т. п. в тексте описания, следует понимать как указываемые в сочетании с термином «примерно». Соответственно, если из контекста не следует противоположное, численные параметры, приведенные далее в описании, являются приблизительными значениями, которые могут варьировать в зависимости от желательных свойств, нужных при осуществлении настоящего изобретения. В крайнем случае, но не с целью ограничения применения принципа эквивалентов применительно к настоящему изобретению, каждый численный параметр можно рассматривать как число, соответствующее значимым цифрам с применением обычной методики округления.
Несмотря на то что числовые диапазоны и параметры, приведенные в общем описании изобретения, даны в некотором приближении, числовые значения, приведенные в конкретных примерах, даны настолько точно, насколько это возможно. Однако каждое числовое значение может содержать в себе некоторую ошибку, возникающую как результат стандартного отклонения, присущего соответствующим методикам измерения. Более того, все указанные диапазоны следует понимать как охватывающие любые и все входящие в них поддиапазоны. Например, диапазон, указанный как «от 1 до 10», следует рассматривать как включающий любые и все поддиапазоны между приведенными значениями (и включая их) от минимального значения, равного 1, до максимального значения, равного 10, что означает, что все поддиапазоны, начинающиеся от минимального значения 1 или более, например от 1 до 6,1, и заканчивающиеся максимальным значением 10 или менее, например 5,5-10, входят в него. Дополнительно, любые ссылки, обозначаемые как «включенные в настоящий контекст», следует понимать как включенные полностью.
Следует также отметить, что в контексте настоящего описания единственные формы определений включают их множественное значение, если явно не следует иного. Термин «или» используется взаимозаменяемо с термином «и/или», если из контекста явно не следует иное.
Кроме того, термины «часть» и «фрагмент», используемые взаимозаменяемо, относятся к частям полипептида, нуклеиновой кислоты и других молекулярных конструкций.
В контексте настоящего описания термин «против направления считывания» относится к остатку, который является Ν-концевым относительно второго остатка, в том случае, если молекула является бел
- 4 012082 ком, или находится в 5' положении относительно второго остатка, если молекула представляет собой нуклеиновую кислоту. Кроме того, в контексте настоящего описания термин «в направлении считывания» относится к остатку, который является С-концевым относительно второго остатка, если молекула является белком, или находится в 3' положении относительно второго остатка, если молекула представляет собой нуклеиновую кислоту.
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют значения, общепринятые в данной области. Практикующим специалистам может быть рекомендовано известное руководство (Ситгеп1 Рто1осо1§ ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν (Ап8иЬе1)), в котором описаны определения и термины, используемые в данной области. Аббревиатуры аминокислотных остатков представлены стандартными трехбуквенными и/или однобуквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычных Ь-аминокислот.
Термин «нуклеиновая кислота» представляет собой полинуклеотид, такой как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Термин используется для обозначения одноцепочечных нуклеиновых кислот, двухцепочечных нуклеиновых кислот и РНК и ДНК, полученных из нуклеотидных или нуклеозидных аналогов.
Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может использоваться для транспортировки второй молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой вектор позволяет осуществлять репликацию последовательностей ДНК, введенных в вектор. Вектор может включать промотор для повышения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, в некоторых хозяйских клетках. Векторы могут реплицироваться автономно (внехромосомно) или могут быть интегрированы в хромосому хозяйской клетки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор может включать вектор экспрессии, способный продуцировать белок, полученный по меньшей мере из части последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор.
Как известно в данной области, условия гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом могут быть описаны в терминах, варьирующих от низкой до высокой строгости. В основном, высокострогие условии гибридизации относятся к промывке гибридов в низкосолевом буфере при высоких температурах. Гибридизация может включать фильтрование связанной ДНК с использованием растворов для гибридизации, стандартных для данной области, таких как растворы, включающие 0,5М ΝαΗΡΟ.·|. 7% додецилсульфат натрия (ДСН), при температуре 65°С, промывку в 0,25М ЫаНРСд, содержащем 3,5% ДСН, с последующей промывкой в 0,1х88С/0,1 ДСН при температуре, варьирующей от комнатной температуры до 68°С, в зависимости от длины зондов (см., например, Ли8иЬе1, Г.М. е1 а1., 811ог1 РтоФсоН ίη Мо1еси1аг ВФ1оду, 4‘ь Ей., Сйар1ет 2, ίοΐιη ^11еу&8оп§, Ν.Υ.). Например, условия высокой строгости промывки включают промывку в 6х88С/0,05% пирофосфата натрия при температуре 37°С в случае олигонуклеотидного зонда с 14 основаниями, или при температуре 48°С в случае олигонуклеотидного зонда с 17 основаниями, или при температуре 55°С в случае олигонуклеотидного зонда с 20 основаниями, или при температуре 60°С в случае олигонуклеотидного зонда с 25 основаниями, или при температуре 65°С в случае олигонуклеотидного зонда, включающего примерно 250 нуклеотидов в длину. Зонды нуклеиновой кислоты могут быть мечены радионуклидами, составляющими концевую метку, например [у-32Р]АТР, или за счет включения радиоактивно меченных нуклеотидов, таких как [а-32Р]йСТР, введенных путем случайного мечения с использованием праймеров. Альтернативно, зонды могут быть мечены путем включения биотинилированных или меченных флуоресцеином нуклеотидов, где выявление зондов проводят с использованием стрептавидина или антител против флуоресцеина.
В контексте настоящего описания термин «малые органические молекулы» относится к молекулам с молекулярным весом менее чем 2000 Да, которые содержат по меньшей мере 1 атом углерода.
Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо в тексте настоящего описания для обозначения молекул белка, которые могут включать либо частичные белки, либо белки полной длины.
Термин «белок слияния» относится к белку или полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, полученную из двух или более белков. Белок слияния может также включать связующие участки аминокислот между аминокислотными частями, полученными из отдельных белков.
В контексте настоящего описания термин «полипептид, отличный от КАСЕ» представляет собой любой полипептид, который был получен не из КАСЕ или его фрагмента. Такие полипептиды, отличные от КАСЕ, включают иммуноглобулиновые пептиды, димеризуемые полипептиды, стабилизируемые пептиды, амфифильные пептиды или полипептиды, включающие аминокислотные последовательности, которые обеспечивают наличие соответствующих «меток» для целевой доставки белка или его очистки.
В контексте настоящего описания термин «иммуноглобулиновые пептиды» может включать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть. В одном варианте осуществления настоящего изобретения часть тяжелой цепи может представлять собой Бс фрагмент или его часть. В контексте настоящего описания Бс фрагмент включает шарнирную область тяжелой цепи полипептида, а также СН2 и СН3 домены тяжелой цепи иммуноглобулина в мономерной или димерной форме. В ином случае, СН1 и Бс фрагмент могут использоваться в виде иммуноглобулинового полипептида. Тяжелая цепь (или ее часть) может
- 5 012082 быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: 1дС (γ), 1дМ (μ), ΙμΩ (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (α). Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: Ι§61 (γ1), 1§С2 (γ2), Ι§63 (γ3), Ι§64 (γ4), 1дА1 (α1), Ι§Α2 (α2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, меняющие их биологическую активность. Примером такой биологической активности, которая может быть изменена, является снижение способности изотипа связываться с некоторыми рецепторами Ре, например, за счет модификации шарнирной области.
Термины «идентичность» или «процент идентичности» относятся к идентичности на уровне последовательности, имеющейся между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты. Процент идентичности может быть определен путем выравнивания последовательностей и относится к числу идентичных остатков (например, аминокислот или нуклеотидов) в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Выравнивание последовательностей и их сравнение могут быть проведены с помощью известных для этого алгоритмов (см., например, 8тйй апй \Уа1сгшап. 1981, Αάν. Αρρί. МаЕй. 2:482: №ей1етап апй ХУноксй, 1970, 1. Мо1. ΒίοΙ. 48: 443; Реагкоп апй Ыртап, 1988, Ргос. Ν;·ι11. Асай. 8сЕ, И8А, 85: 2444) или при использовании компьютерных версий указанных алгоритмов (пакет прикладных программ \У|ксопбп Сепебск 8об\гаге Раскаде Ке1еаке 7.0, Сепебск СотриЕег Сгоир, 575 8аепсе ЭгСе, Майкоп, ^Ι), которые широко доступны в виде программ ВЬА8Т и РА8ТА. Кроме того, для сравнения последовательностей может использоваться программа ΕΝΤΚΕΖ, доступная от Ыабопа1 ЫкбЕиЕек оЕ Неайй, Вейекйа ΜΌ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения процент идентичности двух последовательностей может быть определен при использовании ССС с весовым значением гэпа (пропуска), равным 1, так что каждому аминокислотному гэпу присваивается весовое значение, соответствующее ошибке в одной аминокислоте между двумя последовательностями.
В контексте настоящего описания термин «консервативные остатки» относится к аминокислотам, которые являются одинаковыми среди множества белков, имеющих одну и ту же структуру и/или функцию. Область консервативных остатков, может быть, имеет значение для описания структуры или функции белка. Так, соприкасающиеся консервативные остатки, идентифицируемые в трехмерном белке, могут быть важны для описания структуры или функции белка. Для выявления консервативных остатков или консервативных участков трехмерной структуры можно провести сравнение последовательностей одинаковых или сходных белков из разных видов или у индивидуумов одного и того же вида.
В контексте настоящего описания термин «гомолог» обозначает полипептид, имеющий определенную степень гомологии с аминокислотной последовательностью дикого типа. Сравнение гомологии может быть проведено на глаз или, чаще всего, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Такие коммерчески доступные компьютерные программы позволяют вычислить процент гомологии между двумя или более последовательностями (см., например, ^ййиг, \Уб. апй Ыртап, Ό6., 1983, Ргос. №б. Асай. 8сЕ, И8А, 80: 726-730). Например, могут быть взяты гомологичные последовательности, включающие такие аминокислотные последовательности, которые в альтернативных вариантах по меньшей мере на 75, на 85, на 90, на 95 или на 98% идентичны друг другу.
В контексте настоящего описания полипептидный или белковый «домен» включает область полипептида или белка, которая включает независимую единицу. Домен может быть определен с точки зрения структуры последовательности и/или биологической активности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептидный домен может включать участок белка, который складывается в пространственную структуру таким образом, что, по существу, не зависит от остальной части белка. Домены могут быть идентифицированы с использованием баз данных доменов, таких как, без ограничения, РРАМ, РКОООМ, РКО8IΤΈ, ВЬОСК8, РКЮТ8, 8ВА8Е, ЫКЕС РКОРГОЕЗ, 8АМКТ и РКОСЬА88.
В контексте настоящего описания термин «иммуноглобулиновый домен» обозначает аминокислотную последовательность, которая характеризуется структурной гомологией или идентичностью к домену иммуноглобулина. Длина последовательности аминокислот в иммуноглобулиновом домене может быть любого размера. В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновый домен может включать менее чем 250 аминокислот в длину. В одном репрезентативном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновый домен может составлять примерно 80-150 аминокислот в длину. Например, вариабельный домен и участки СН1, СН2 и СН3 в ΙμΟ, каждый представляет собой иммуноглобулиновый домен. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариабельные участи СН1, СН2, СН3 и СН4 в ΙβΜ, каждый представляет собой иммуноглобулиновый домен.
В контексте настоящего описания «иммуноглобулиновый домен КАСЕ» представляет собой последовательность аминокислот белка в КАСЕ, которая характеризуется структурной гомологией или идентичностью к домену иммуноглобулина. Например, домен иммуноглобулина КАСЕ может включать Vдомен КАСЕ, домен КАСЕ ^-подобного С2 типа 1 («С1 домен») или домен КАСЕ ^-подобного С2 типа 2 («С2 домен»).
В контексте настоящего описания термин «междоменный линкер» обозначает полипептид, который соединяет вместе два домена. Рс шарнирная область представляет собой пример междоменного линкера в ΙμΟ
В контексте настоящего описания термин «непосредственно соединенный» идентифицирует кова
- 6 012082 лентную связь между двумя разными группами (например, между последовательностями нуклеиновых кислот, полипептидов, полипептидными доменами), которые не содержат каких-либо встроенных атомов между двумя соединяемыми группами.
В контексте настоящего описания термин «лигандсвязывающий домен» относится к домену белка, ответственному за связывание лиганда. Указанный термин «лигандсвязывающий домен» включает гомологи связывающего домена лиганда или его части. В этом контексте могут быть произведены осторожные замещения аминокислот в связывающем сайте лиганда с учетом сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков с тем, чтобы сохранить специфичность по связыванию домена, ответственного за связывание лиганда.
В контексте настоящего описания термин «сайт связывания лиганда» включает остатки в белке, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом, или остатки, вовлекаемые в осуществление такой локализации лиганда, чтобы он оставался в тесной близости к тем остаткам, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом. Взаимодействие остатков в сайте связывания лиганда может быть определено по пространственной близости остатков к лиганду на примере модели или в самой структуре. Термин «сайт связывания лиганда» включает гомологи сайта связывания лиганда или его части. В этой связи, могут быть произведены осторожные замещения аминокислот в сайте связывания лиганда с учетом сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков с тем, чтобы сохранить специфичность сайта по связыванию с лигандом. Сайт связывания лиганда может находиться в одном или нескольких связывающих доменах белка или полипептида.
В контексте настоящего описания термин «взаимодействует» относится к состояниям, предполагающим непосредственную близость между лигандом или соединением, или их частями или фрагментами, и частью второй интересующей молекулы. Взаимодействие может быть нековалентным, например осуществляющимся в результате действия водородных связей, взаимодействий под действием сил Ван дер Вальса или представляющим собой электростатическое или гидрофобное взаимодействие, или оно может быть ковалентным.
В контексте настоящего описания термин «лиганд» относится к молекуле или соединению, или другой структуре, которая взаимодействует с сайтом связывания лиганда, включая субстраты, или аналоги, или их части. В контексте настоящего описания термин «лиганд» может относиться к соединениям, которые связываются с интересующим белком. Лиганд может представлять собой агонист, антагонист или модулятор. Или указанный лиганд может оказывать биологический эффект. Или указанный лиганд может блокировать связывание других лигандов и, тем самым, ингибировать биологический эффект. Лиганды могут включать, без ограничения, малые молекулы ингибиторов. Указанные малые молекулы могут включать пептиды, пептидомиметики, органические соединения и т. п. Лиганды могут также включать полипептиды и/или белки.
В контексте настоящего описания термин «соединение-модулятор» относится к молекуле, которая изменяет или модифицирует биологическую активность интересующей молекулы. Соединение-модулятор может повышать или понижать активность или изменять физические или химические характеристики, а также функциональные или иммунологические свойства интересующей молекулы. В случае ВАСЕ соединение-модулятор может повышать или понижать активность или изменять характеристики или функциональные или иммунологические свойства ВАСЕ или его части. Соединение-модулятор может включать природные и/или химически синтезированные или искусственные пептиды, модифицированные пептиды (например, фосфопептиды), антитела, углеводы, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, гликолипиды, гетероциклические соединения, нуклеозиды, или нуклеотиды, или их части, а также малые органические или неорганические молекулы. Соединение-модулятор может представлять собой эндогенное физиологическое соединение или может быть природным синтетическим соединением. Или соединение-модулятор может представлять собой малую органическую молекулу. Термин «соединениемодулятор» также включает химически модифицированный лиганд или химически модифицированное соединение и включает их изомерные и рацемические формы.
Термин «агонист» включает соединение, которое связывается с рецептором с образованием комплекса, который демонстрирует фармакологический ответ, специфичный для вовлекаемого рецептора.
Термин «антагонист» включает соединение, которое связывается с агонистом или с рецептором с образованием комплекса, который не демонстрирует существенного фармакологического ответа и может ингибировать биологический ответ, индуцированный агонистом.
Соответственно, агонисты ВАСЕ могут связываться с ВАСЕ и стимулировать ВАСЕ-опосредованные клеточные процессы, а антагонисты ВАСЕ могут ингибировать опосредованные ВАСЕ процессы, стимулируемые агонистом ВАСЕ. Например, в одном варианте осуществления изобретения клеточный процесс, стимулируемый агонистами ВАСЕ, включает активацию транскрипции гена ΤΝΕ-α.
Термин «пептидные миметики» относится к структурам, которые служат в качестве заместителей пептидов в процессах взаимодействия между молекулами (Могдап с1 а1., 1989, Апп. Веротй Меб. Сйеш., 24: 243-252). Пептидные миметики могут включать синтетические структуры, которые могут содержать аминокислотные и/или пептидные связи и могут и не содержать, но сохраняют структурные и функциональные особенности пептида, агониста или антагониста. Пептидные миметики также включат пептои
- 7 012082 ды, олигопептоиды (81топ с! а1., 1972, Ргос. №111. Асаб. 8сЕ, И8А, 89: 9367) и пептидные библиотеки, содержащие пептиды заданной длины, отражающие все возможные последовательности аминокислот, соответствующие пептиду, агонисту или антагонисту согласно настоящему изобретению.
Термин «лечение» относится к ослаблению симптома заболевания или расстройства и может включать излечивание расстройства, по существу, предотвращение наступления развития расстройства или улучшение состояния субъекта. Термин «терапия» в контексте настоящего описания относится к полному спектру терапевтических методов, применяемых в случае того расстройства, от которого страдает пациент, включая облегчение одного симптома или большей части симптомов, определяемых данным расстройством, излечивание конкретного расстройства или предотвращение развития расстройства.
В контексте настоящего описания термин «ЕС50» определяется как концентрация агента, которая соответствует 50% от уровня измеряемого биологического эффекта. Например, ЕС50 терапевтического агента, оказывающего заметный биологический эффект, может включать величину, при которой данный агент демонстрирует 50% уровень указанного биологического эффекта.
В контексте настоящего описания термин «1С50» определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% ингибированию измеряемого эффекта. Например, 1С50 антагониста связывания КАСЕ может включать значение, при котором антагонист снижает связывание лиганда с сайтом связывания лиганда КАСЕ на 50%.
В контексте настоящего описания термин «эффективное количество» обозначает количество агента, которое является эффективным для проявления желательного эффекта у субъекта. Термин «терапевтически эффективное количество» обозначает количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое демонстрирует терапевтический ответ у животного или человека, для которого желателен такой ответ. Фактическая доза, которая включает эффективное количество, может зависеть от способа введения, размера субъекта и состояния его здоровья, от природы расстройства, подлежащего лечению, и т. п.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» в контексте настоящего изобретения может относиться к соединениям и композициям, которые приемлемы для использования у человека или животного, например может относиться к терапевтическим композициям, вводимым с целью лечения расстройства или заболевания, опосредованного КАСЕ.
Термин «фармацевтическая композиция» в контексте настоящего описания обозначает композицию, которая может вводиться в организм хозяина-млекопитающего, например, перорально, парентерально, местно, путем ингаляции, интраназально, ректально, в стандартных дозированных формах, включая обычные нетоксичные носители, разбавители, адъюванты, наполнители и т. п.
Термин «парентеральный» в контексте настоящего описания включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, внутригрудинную инъекцию или методику инфузии.
Белки слияния на основе КАСЕ
Варианты осуществления настоящего изобретения включают белки слияния на основе КАСЕ, способы получения таких белков слияния и способы использования таких белков слияния. Настоящее изобретение может осуществляться множеством способов.
Так, например, варианты настоящего изобретения относятся к белкам слияния, включающим полипептид КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от КАСЕ. В одном варианте белки слияния могут включать сайт связывания лиганда КАСЕ. В этом варианте осуществления изобретения сайт связывания лиганда включает большую часть Ν-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда КАСЕ может включать V домен КАСЕ или его часть. В этом варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8ЕО ΙΌ N0: 9 или последовательность, на 90% ей идентичную, или 8Е0 ΙΌ N0: 10 или последовательность, на 90% ей идентичную.
В одном варианте полипептид КАСЕ может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (например, фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть одного из Сн2 или Сн3 доменов человеческого 1дС.
Белок или полипептид КАСЕ может включать человеческий белок КАСЕ полной длины (например, 8Е0 ΙΌ N0: 1) или фрагмент человеческого КАСЕ. В контексте настоящего описания фрагмент полипептида КАСЕ составляет по меньшей мере 5 аминокислот в длину, может включать более 30 аминокислот в длину, но имеет длину меньше, чем полная аминокислотная последовательность. В альтернативных вариантах полипептид КАСЕ может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 85, или на 90% идентична человеческому КАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ или его фрагмент, при этом, скорее, первым остатком будет глицин, а не метионин (см., например, №ерет с! а1., (1992)). Или в другом варианте человеческий КАСЕ может включать КАСЕ полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 3, фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности.
Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать &КАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0: 4), полипептид, который на 90% идентичен &КАСЕ, или фрагмент &КАСЕ. В контексте настоящего описания &КАСЕ или белок КАСЕ не включает трансмембранный участок или цитоплазматический
- 8 012082 «хвостовой» фрагмент (Рагк е! а1., Ыа1ите Мей., 4: 1025-1031 (1998)). Так, например, полипептид КАСЕ может включать человеческий кКАСЕ или его фрагмент, при этом в первом положении будет находиться, скорее, глицин, а не метионин (см., например, Ыеерет е! а1., (1992)). Или полипептид КАСЕ может включать человеческий &КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС ΙΌ N0: 5 или 8ЕС ΙΌ N0: 6, фиг. 1С) или часть указанной аминокислотной последовательности.
В других вариантах белок КАСЕ может включать V домен КАСЕ (например, 8ЕС ΙΌ N0: 7 или 8ЕС ΙΌ N0: 8, фиг. 1Ό) (№ерет е! а1., (1992); 8с1ишй1 е! а1., (1997)). Или может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену КАСЕ или его фрагменту.
Или, в другом варианте, белок КАСЕ может включать V домен КАСЕ (например, 8ЕС ΙΌ N0: 9 или 8ЕС ΙΌ N0: 10, фиг. 1Ό). В одном варианте белок КАСЕ может включать сайт связывания лиганда. В этом варианте сайт связывания лиганда может включать 8ЕС ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8ЕС ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент КАСЕ представляет собой синтетический пептид.
Таким образом, полипептид КАСЕ, используемый в белках слияния согласно настоящему изобретению, может включать фрагмент КАСЕ полной длины. Как известно в данной области, КАСЕ включает трехдоменный полипептид иммуноглобулинового типа, в который входят V домен и С1 и С2 домены, каждый из которых соединен друг с другом через посредство междоменного линкера. КАСЕ полной длины также включает трансмембранный полипептид и цитоплазматический хвостовой фрагмент в направлении считывания информации (С-концевой) С2 домена и присоединен к С2 домену.
В одном варианте полипептид КАСЕ не включает какие-либо остатки сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может включать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 из КАСЕ полной длины.
Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-116 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 7) или последовательность, которая на 90% идентична им, аминокислоты 24-116 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 8) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену КАСЕ. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 124-221 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 11) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую С1 домену КАСЕ. В другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 227317 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 12) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую С2 домену КАСЕ. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-123 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 13) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-123 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 14) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-226 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 17) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-226 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 18) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С1 домену и междоменному линкеру, соединяющему указанные два домена. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-339 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 5) или последовательность, которая на 90% им идентична, или остатки 24-339 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 6) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую &КАСЕ (то есть кодирующую V, С1 и С2 домены и междоменные линкеры). Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей.
Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. В одном варианте иммуноглобулиновый полипептид может включать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть (то есть фрагмент). Например, фрагмент тяжелой цепи может включать полипептид, полученный из Ес фрагмента иммуноглобулина, где фрагмент Ес включает шарнирную область тяжелой цепи полипептида и Сн2 и Сн3 домены тяжелой цепи иммуноглобулина в качестве мономера. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотопа: ^С (γ), ΙβΜ (μ), Ι§Ό (δ), Ι§Ξ (ε) или ΙμΛ (α). Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелой цепи: ^С1 (γ1), ^С2 (γ2), ^С3 (γ3), ^С4 (γ4), ^А1 (α1), IдА2 (α2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены Сн2 и Сн3 человеческого Ι^Ο1. или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве репрезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого Ι^Ο1 или их часть, который может включать 8ЕС ΙΌ N0: 38 или 8ЕС ΙΌ N0: 40.
Ес часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием ίη νίνο. Так, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, но не из шарнирной области междоменного полипептида, полученного из иммуноглобулина.
- 9 012082
Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ может также включать полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина, или фрагмент, или часть Сн2 домена иммуноглобулина. В одном варианте Сн2 домен или его фрагмент может включать 8ЕС ΙΌ N0: 42. В одном варианте полипептид КАСЕ может включать сайт связывания лиганда. Сайт связывания лиганда КАСЕ может включать V домен КАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8ЕС ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8ЕС ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
Полипептид КАСЕ, используемый в белках слияния согласно настоящему изобретению, может включать иммуноглобулиновый домен КАСЕ. Дополнительно или альтернативно, фрагмент КАСЕ может включать междоменный линкер. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный против направления считывания информации (то есть ближе к Юконцу) или в направлении считывания информации (то есть ближе к С-концу) междоменного линкера. Еще в одном варианте полипептид КАСЕ может включать два (или более) иммуноглобулиновых домена КАСЕ, которые соединяются друг с другом через посредство междоменного линкера. Полипептид КАСЕ может также включать КАСЕ с множеством иммуноглобулиновых доменов, соединенных друг с другом с помощью одного или нескольких междоменных линкеров и содержащих концевой междоменный линкер, присоединенный к Ν-концевому иммуноглобулиновому домену КАСЕ и/или к С-концевому домену иммуноглобулина. Дополнительные сочетания иммуноглобулиновых доменов КАСЕ и междоменных линкеров также входят в область настоящего изобретения.
В одном варианте полипептид КАСЕ включает междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к Ν-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к Ν-концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий Сн2 домен иммуноглобулина, может включать Сн2 и Сн3 домены человеческого 1дС 1, или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве примерного варианта можно указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены или их часть из человеческого 1дС1, который может включать 8ЕС ΙΌ N0: 38 или 8ЕС ΙΌ N0: 40.
Как было указано выше, белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из КАСЕ. Кроме того, полипептид КАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к полипептидному домену КАСЕ, может включать фрагмент белка КАСЕ полной длины. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-136 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-136 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты 23-251 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 19) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты 24-251 из человеческого КАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 20) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, соединяющему два домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания С1.
Например, в одном варианте белок слияния может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес полипептида человека. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что Юконцевая аминокислота первого междоменного линкера присеодинена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулиновового домена КАСЕ, Юконцевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, Юаминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте Сн2 домена иммуноглобулина. В одном варианте четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать 8ЕС ΙΌ N0: 32. В альтернативных вариантах четыре домена белка слияния на основе КАСЕ включают 8ЕС ΙΌ N0: 33 или 8ЕС ΙΌ N0: 34.
Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес полипептида человека. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к Юконцевой аминокислоте Сн2 домена иммуноглобулина или части Сн2 домена иммуноглобулина. В одном варианте трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать 8ЕС ΙΌ N0: 35. В альтернативных вариантах трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ может включать 8ЕС ΙΌ N0: 36 или 8ЕС ΙΌ N0: 37.
Фрагмент междоменного линкера КАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует считыванию в направлении транскрипции в естественном состоянии и, таким образом, присоединяется к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. Например, в случае V домена КАСЕ междомен
- 10 012082 ный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые считываются в естественном состоянии в направлении транскрипции V домена. В одном варианте линкер может включать 8ЕС ГО N0: 21, соответствующую участку аминокислот 117-123 ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части природной последовательности ВАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из 8ЕС ГО N0: 32. Таким образом, в одном варианте междоменный линкер включает 8ЕС ГО N0: 23, включающую аминокислоты на участке 117-136 из ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты 8 ЕС ГО N0: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична 8ЕС ГО N0: 21 или 8ЕС ГО N0: 23.
В случае С1 домена ВАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которая считывается в естественном варианте по направлению транскрипции С1 домена. В этом варианте линкер может включать 8ЕС ГО N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части природной последовательности ВАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления считывания или в направления считывания информации из 8ЕС ГО N0: 22. Или в другом варианте могут использоваться фрагменты 8ЕС ГО N0: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер ВАСЕ может включать 8ЕС ГО N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или, в другом варианте, междоменный линкер может включать 8ЕС ГО N0: 44, соответствующий аминокислотам на участке 318-342 из ВАСЕ.
Способы получения белков слияния на основе ВАСЕ
Настоящее изобретение также относится к способу получения белка слияния на основе ВАСЕ. Так, в одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения белка слияния на основе ВАСЕ, включающему стадию ковалентного присоединение полипептида ВАСЕ, присоединенного ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ, где полипептид ВАСЕ включает сайт связывания лиганда ВАСЕ. Например, присоединенный полипептид ВАСЕ и второй полипептид, отличный от ВАСЕ, могут кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Данный способ также относится к стадии включения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Кроме того, указанный способ может включать стадию введения вектора экспрессии в хозяйскую клетку.
Например, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к белкам слияния, включающим полипептид ВАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте белок ВАСЕ может включать сайт связывания лиганда ВАСЕ. В одном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть Юконцевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда ВАСЕ может включать V домен ВАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда ВАСЕ включает 8ЕС ГО N0: 9 или последовательность, которая на 90% ей идентична, или 8ЕС ГО N0: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
В одном варианте полипептид ВАСЕ может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (то есть его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из доменов Сн2 или Сн3 доменов человеческого 1дС.
Белок слияния может быть также получен генноинженерными способами с использованием методик рекомбинантной ДНК. Например, в одном варианте настоящее изобретение может включать выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид ВАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. В одном варианте полипептид ВАСЕ может включать сайт связывания лиганда ВАСЕ.
Белок или полипептид ВАСЕ может включать человеческий ВАСЕ полной длины (например, 8ЕС ГО N0: 1) или фрагмент человеческого ВАСЕ. В одном варианте полипептид ВАСЕ не включает какиелибо остатки из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность ВАСЕ может включать остатки 1-22 или остатки 1-23 из ВАСЕ полной длины (8ЕС ГО N0: 1). В альтернативных вариантах полипептид ВАСЕ может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична человеческому ВАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид ВАСЕ может включать человеческий ВАСЕ или его фрагмент, в котором содержится в качестве первого остатка, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерет с1 а1. (1992)). Или, в другом варианте, человеческий ВАСЕ может включать ВАСЕ полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС ГО N0: 2 или 8ЕС ГО N0: 3, фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать &ВАСЕ (например, 8ЕС ГО N0: 4) или полипептид, который на 90% идентичен &ВАСЕ или фрагменту &ВАСЕ. Например, полипептид ВАСЕ может включать человеческий §ВАСЕ или его фрагмент, при этом в качестве первого остатка содержится, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерет с1 а1. (1992)). Или, в другом варианте, человеческий ВАСЕ может включать §ВАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС ГО
- 11 012082
N0: 5 или БЕС ΙΌ N0: 6, фиг. 1С) или часть такой аминокислотной последовательности. В других вариантах белок КАСЕ может включать V домен (например, БЕС ΙΌ N0: 7 или БЕС ΙΌ N0: 8; фиг. 1Ό). Или, в другом варианте, может использоваться последовательность, которая на 90% идентична V домену КАСЕ или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок КАСЕ может включать фрагмент КАСЕ, включающий часть V домена (например, БЕС ΙΌ N0: 9 или БЕС ΙΌ N0: 10, фиг. 1Ό). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать БЕС ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или БЕС ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент КАСЕ представляет собой синтетический пептид.
В одном варианте последовательность нуклеиновой кислоты включает БЕС ΙΌ N0: 25, который кодирует аминокислоты на участке 1-118 из человеческого КАСЕ или его фрагмента. Например, может использоваться последовательность, включающая нуклеотиды 1-348 из БЕС ΙΌ N0: 25, которая кодирует аминокислоты на участке 1-116 из человеческого КАСЕ. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательность БЕС ΙΌ N0: 6, которая кодирует аминокислоты на участке 1-123 из человеческого КАСЕ. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательность БЕС ΙΌ N0: 27, которая кодирует аминокислоты 1-136 из человеческого КАСЕ. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательность БЕС ΙΌ N0: 28, которая кодирует аминокислоты 1-120 из человеческого КАСЕ. Или, в другом варианте, нуклеиновая кислота может включать последовательность БЕС ΙΌ N0: 29, которая кодирует аминокислоты на участке 1-251 из человеческого КАСЕ. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты указанных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют фрагменты полипептида КАСЕ.
Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина (или ее часть) может быть получена из любого известного изотипа тяжелой цепи: 1дС (γ), 1дМ (μ), Ι§Ό (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелых цепей: 1дС1 (γ1), 1дС2 (γ2), 1дС3 (γ3), 1дС4 (γ4), 1дА1 (α1), 1дА2 (α2) или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, содержащих мутации, которые меняют биологическую активность. Второй полипептид может включать Сн2 и Сц3 домены человеческого 1дС1, или часть любого из них, или оба указанных домена. В качестве примерных вариантов можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 человеческого 1дС или их часть, который может включать БЕС ΙΌ N0: 38 или БЕС ΙΌ N0: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты БЕС ΙΌ N0: 39 или БЕС ΙΌ N0: 41.
Ес часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием ίη νίνο. Так, белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать междоменный линкер, полученный из КАСЕ, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения белок слияния может кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Кроме того, данный способ может включать стадию введения конструкции ДНК в вектор экспрессии. А также данный способ может включать трансфекцию вектора экспрессии в хозяйскую клетку.
Таким образом, в одном варианте настоящее изобретение включает способ получения белка слияния на основе КАСЕ, включающий стадию ковалентного присоединения полипептида КАСЕ к полипептиду, включающему домен Сн2 иммуноглобулина или часть домена Сн2 иммуноглобулина. В данном варианте белок слияния может включать сайт связывания лиганда КАСЕ. Сайт связывания лиганда КАСЕ может также включать V домен КАСЕ или его часть. В одном варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает БЕС ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или БЕС ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
Например, в одном варианте настоящее изобретение включает нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления изобретения Сн2 домен или его фрагмент включает БЕС ΙΌ N0: 42. Второй полипептид может включать Сн2 и Сн3 домены из человеческого ЦСЕ В качестве примерного варианта осуществления изобретения можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 человеческого Т§С1, который может включать БЕС ΙΌ N0: 38 или БЕС ΙΌ N0: 40. Иммуноглобулиновый полипептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты БЕС ΙΌ N0: 39 или БЕС ΙΌ N0: 41.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид КАСЕ может включать междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к Юконцевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий Сн2 домен иммуноглобулина, может включать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены из человеческого ЦС1 или часть одного или обоих указанных доменов. В качестве примерного варианта осуществления изобретения следует указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 до
- 12 012082 мены из человеческого 1дС1 и их часть, который может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40.
Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов КАСЕ. Кроме того, полипептид КАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, может включать фрагмент белка КАСЕ полной длины. Например, в одном варианте белок слияния по настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Бе. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что Ν-концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, Ν-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, Ν-концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к Сконцевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к Ν-концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-251 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации С1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 30 или его фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ.
Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Бс. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к №концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-136 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 31 или ее фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния на основе КАСЕ.
Фрагмент междоменного линкера КАСЕ может включать пептидную последовательность, соответствующую направлению считывания информации в природном состоянии и которая, таким образом, присоединена к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. Например, в случае V домена КАСЕ междоменный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые соответствуют направлению считывания информации из V домена. В данном варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 КАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из 8ЕС ΙΌ N0: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает 8Е0 ΙΌ N0: 23, включающую аминокислоты на участке 117-136 из КАСЕ полной длины. Или могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 21, содержащие делецию из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 21 или 8Е0 ΙΌ N0: 23.
В случае С1 домена КАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которые соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из С1 домена. В данном варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 КАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления и в направлении считывания информации (соответственно, в положениях «апстрим» и «даунстрим») из 8Е0 ΙΌ N0: 22. Или могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 15, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер КАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или междоменный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из КАСЕ.
Описываемый способ может также включать стадию введения конструкции ДНК в вектор экспрессии. Так, в данном варианте настоящее изобретение включает вектор экспрессии, который кодирует белок слияния, включающий полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, вклю
- 13 012082 чающему домен Сц2 иммуноглобулина или часть домена Сц2 иммуноглобулина. В данном варианте полипептид ВАСЕ включает конструкции, такие как приведенные в настоящем описании, содержащие междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к Ν-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к Ν-концевой аминокислоте полипептида, включающего Сц2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, вектор экспрессии, используемый для трансфекции клеток, может включать последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕС Ш N0: 30 или ее фрагмент или 8ЕС Ш N0: 31 или ее фрагмент.
Данный способ может также включать стадию трансфекции клетки вектором экспрессии согласно настоящему изобретению. Так, в одном варианте, настоящее изобретение включает клетку, трансфицированную вектором экспрессии, который экспрессирует белок слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению, так что клетка экспрессирует белок слияния, включающий полипептид ВАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему СН2 домен иммуноглобулина или часть СН2 домена иммуноглобулина. В данном варианте полипептид ВАСЕ включает конструкции, такие как приведенные в настоящем описании конструкции, содержащие междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к Ν-концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к Ν-концевой аминокислоте полипептида, включающего Сц2 домен иммуноглобулина или его часть. Например, вектор экспрессии может включать последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕС Ш N0: 30 или ее фрагмент или 8ЕС Ш N0: 31 или ее фрагмент.
Например, плазмиды могут быть сконструированы таким образом, что они будут экспрессировать белки слияния ВАСЕ-1дС Ес, получаемые путем объединения 5' последовательностей кДНК различной длины для человеческого ВАСЕ с 3' кДНК последовательностью человеческого 1дС1 Ес (γ1).
Последовательности кассет экспрессии могут быть вставлены в вектор экспрессии, такой как вектор экспрессии рсЭНА3.1 (Гиуйгодеи, СА), с использованием стандартных рекомбинантных методик.
Кроме того, описываемый способ может включать трансфекцию вектора экспрессии в хозяйскую клетку. В одном варианте рекомбинант может быть трансфицирован в клетки яичника китайского хомяка, после чего проводится оптимизация экспрессии. В альтернативных вариантах клетки могут продуцировать от 0,1 до 20 г/л, или от 0,5 до 10 г/л, или примерно 1-2 г/л.
Как известно в данной области техники, такие конструкции нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы за счет мутаций, например, путем амплификации в рамках ПЦР матрицы нуклеиновой кислоты с использованием праймеров, включающих интересующую мутацию. При использовании данного способа могут быть созданы полипептиды, включающие лиганды ВАСЕ с варьирующей аффинностью. В одном варианте мутированные последовательности могут быть на 90% или более идентичны исходной ДНК. В качестве таковых варианты могут включать нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях (то есть в условиях, эквивалентных примерно температуре 2027°С ниже температуры плавления (Тпл) дуплекса ДНК в 1 мол. растворе соли).
Кодирующая последовательность может быть экспрессирована при трансфекции вектора экспрессии в соответствующую хозяйскую клетку. Например, рекомбинантные векторы могут быть стабильно трансфицированы в клетки яичника китайского хомяка (СНО), после чего могут быть отобраны и клонированы клетки, экспрессирующие белок слияния. В одном варианте клетки, экспрессирующие рекомбинантную конструкцию, выбирают по резистентности к неомицину, кодируемой плазмидой, при внесении антибиотика С418. Индивидуальные клоны могут быть отобраны, и клоны, экспрессирующие высокие уровни рекомбинантного белка, выявленные по методу вестерн-блоттинга клеточного супернатанта, могут быть размножены, и генный продукт далее очищен аффинной хроматографией с использованием колонок с белком А.
Примерные рекомбинантные аминокислоты, которые кодируют белки слияния согласно настоящему изобретению, показаны на фиг. 2-5. Например, в соответствии с указанным выше белок слияния, продуцируемый конструкцией рекомбинантной ДНК, может включать полипептид ВАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от ВАСЕ. Белок слияния может включать два домена, полученных из белка ВАСЕ, и два домена, полученных из иммуноглобулина. Примерная конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая белок слияния, ТТР-4000 (ТТ4), имеющий указанный тип конструкции, показана на фиг. 2 (8ЕС Ш N0: 30). Как видно из фиг. 2, кодирующая последовательность на участке 1-753 (выделенная жирным шрифтом) кодирует №концевую белковую последовательность ВАСЕ, тогда как последовательность на участке 754-1386 кодирует белковую последовательность 1дС Ес.
В случае получения из 8ЕС Ш N0: 30 или последовательности, которая на 90% идентична ей, белок слияния может включать четырехдоменную аминокислотную последовательностью 8ЕС Ш N0: 32 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС Ш N0: 33 или 8ЕС Ш N0: 34, фиг. 4). На фиг. 4 аминокислотная последовательность ВАСЕ выделена жирным шрифтом. Иммуноглобулиновая последовательность представляет собой иммуноглобулиновые домены Сн2 и Сн3 из 1дС. Как видно из фиг. 6В, первые 251 аминокислот белка слияния ТТР-4000 ВАСЕ полной длины содержат в
- 14 012082 качестве полипептидной последовательности КАСЕ сигнальную последовательность, включающую аминокислоты на участке 1-22/23, V домен иммуноглобулина (включая сайт связывания лиганда), включающий аминокислоты на участке 23/24-116, междоменный линкер, включающий аминокислоты 117-123, второй иммуноглобулиновый домен (С1), включающий аминокислоты на участке 124-221, и междоменный линкер в направлении считывания информации, включающий аминокислоты на участке 222-251.
В одном варианте белок слияния может необязательно включать второй иммуноглобулиновый домен КАСЕ. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Пример конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей данный тип белка слияния, показан на фиг. 3 (8Е0 ГО N0: 31). Как видно из фиг. 3, кодирующая последовательность на участке нуклеотидов 1-408 (выделенная жирным шрифтом) кодирует Ν-концевую белковую последовательность КАСЕ, а последовательность на участке 409-1041 кодирует белковую последовательность 1дС1 Ес (γ1).
В случае получения из ЗЕЦ ГО N0: 31 или последовательности, которая на 90% ей идентична, белок слияния может включать трехдоменную аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 35 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (ЗЕЦ ГО N0: 36 или 8ЕЦ ГО N0: 37, фиг. 5). На фиг. 5 аминокислотная последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом. Как видно из фиг. 6В, первые 136 аминокислот из белок слияния ТТР-3000 КАСЕ полной длины содержат в качестве полипептида КАСЕ сигнальную последовательность, включающую аминокислоты на участке 1-22/23, V домен иммуноглобулина (включая сайт связывания лиганда), включающий аминокислоты на участке 23/24-116, и междоменный линкер, включающий аминокислоты на участке 117-136. Последовательность на участке 137-346 включает иммуноглобулиновые домены Сц2 и Сн3 из ЦС.
Белки слияния согласно настоящему изобретению могут демонстрировать повышенную стабильность ίη νίνο относительно полипептидов КАСЕ, которые не содержат второй полипептид. Белок слияния может быть далее модифицирован для повышения стабильности, эффективности, активности и биологической доступности. Так, белки слияния по настоящему изобретению могут быть модифицированы за счет посттрансляционного процессинга или путем химической модификации. Например, белок слияния может быть приготовлен методом синтеза, так чтобы он включал Ь-, Ό- или неприродные аминокислоты, альфа-двузамещенные аминокислоты или N-алкиламинокислоты. Дополнительно, белки могут быть модифицированы путем ацетилирования, ацилирования, АДФ-рибозилирования, амидирования, присоединения липидов, таких как фосфатидилинозит, за счет образования дисульфидных связей и т.п. Кроме того, может быть добавлен полиэтиленгликоль для повышения биологической стабильности белка слияния.
Связывание антагонистов КАСЕ с белками слияния на основе КАСЕ
Белки слияния согласно настоящему изобретению могут иметь множество различных применений. Например, белок слияния согласно настоящему изобретению может использоваться в тесте на связывание для идентификации лигандов КАСЕ, таких как агонисты, антагонисты или модуляторы КАСЕ.
Например, в одном варианте настоящее изобретение относится к способу выявления модуляторов КАСЕ, включающему: (а) получение белка слияния, включающего полипептид КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от КАСЕ, где полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда; (Ь) смешивание интересующего соединения и лиганда, имеющего известную связывающую аффинность для КАСЕ, с белком слияния и (с) измерение уровня связывания известного лиганда КАСЕ с белком слияния на основе в присутствии интересующего соединения. В данном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть ^концевого домена белка слияния.
Белки слияния на основе КАСЕ могут также включать наборы для выявления модуляторов КАСЕ. Например, в одном варианте набор согласно настоящему изобретению может включать: (а) соединение, обладающее известной связывающей аффинностью с КАСЕ, в качестве позитивного контроля; (Ь) белок слияния на основе КАСЕ, включающий полипептид КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от КАСЕ, где полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда КАСЕ; и (с) инструкции по использованию. В одном варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает большую часть №концевого домена белка слияния.
Белок или полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ полной длины (например, ЗЕЦ ГО N0: 1) или фрагмент человеческого КАСЕ. В одном варианте полипептид КАСЕ не включает какихлибо остатков из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из КАСЕ полной длины (8ЕЦ ГО N0: 1). В альтернативных вариантах полипептид КАСЕ может включать последовательность, которая на 70, на 80 или на 90% идентична человеческому КАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерег с1 а1. (1992)). Или, в другом варианте, человеческий КАСЕ может включать КАСЕ полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕЦ ГО N0: 2 или 8ЕЦ ГО N0: 3, фиг. 1А и 1В) или часть такой аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать 8КАСЕ (например, 8ЕЦ ГО N0: 4), полипептид, который на 90% идентичен 8КАСЕ, или фрагмент 8КАСЕ. Например, полипептид КАСЕ
- 15 012082 может включать человеческий кВАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерег с1 а1. (1992)). Или, в другом варианте, человеческий ВАСЕ может включать кВАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 8Е0 ΙΌ N0: 6, фиг. 1С) или часть такой аминокислотной последовательности. В других вариантах белок ВАСЕ может включать V домен (например, 8Е0 ΙΌ N0: 7 или 8Е0 ΙΌ N0: 8, фиг. 1Ό). Или может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок ВАСЕ может включать фрагмент ВАСЕ, включающий часть V домена (например, 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 8Е0 ΙΌ N0: 10, фиг. 1Ό). В данном варианте сайт связывания лиганда может включать 8Е0 ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8Е0 ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент ВАСЕ представляет собой синтетический пептид.
Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из ВАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: ΙβΟ (γ), ΙβΜ (μ), Ι§Ό (δ), !дЕ (ε) или ΙμΛ (α). Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: ΙβΟ1 (γ1), ΙβΟ2 (γ2), ΙβΟ3 (γ3), ΙβΟ4 (γ4), (α1), Ι^2 (α2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены Сц2 и Сн3 из человеческого Ι^ΟΕ или часть каждого из них, или оба указанных домена. В качестве реперезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ или их часть, который может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 39 или 8Е0 ΙΌ N0: 41.
Ес часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительным действием ίη νίνο. Так, в одном варианте белок слияния на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению включает последовательность Ес, полученную из ВАСЕ, а не из иммуноглобулиновой цепи. В данном варианте белок слияния может включать иммуноглобулиновый домен ВАСЕ, присоединенный к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. В одном варианте полипептид ВАСЕ может включать междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к ^концевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий Сн2 домен иммуноглобулина, может включать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ1 или часть обоих или любого из этих доменов. В качестве репрезентативного варианта можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 человеческого ΙβΟ1 или их часть, который может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40.
Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из ВАСЕ. Кроме того, полипептид ВАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, может включать фрагмент белка ВАСЕ полной длины. Например, в одном варианте белок слияния по настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен ВАСЕ, и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, и второй междоменный линкер ВАСЕ, так что ^концевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена ВАСЕ, ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, ^концевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к Сконцевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид ВАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого ВАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого ВАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второй междоменный линкер в направлении считывания информации из С1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 30 или его фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе ВАСЕ.
Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен ВАСЕ, присоединенный через междоменный линкер ВАСЕ к ^концевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид ВАСЕ может включать аминокис
- 16 012082 лоты на участке 23-136 из человеческого ВАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 человеческого ВАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену ВАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния на основе ВАСЕ.
Как указывалось выше, фрагмент междоменного линкера ВАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует в природном состоянии направлению считыванию информации и, таким образом, присоединена к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ. Например, в случае V домена ВАСЕ междоменный линкер может включать аминокислотные последовательности, которые в природном состоянии соответствуют направлению считывания информации из V домена. В данном варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности ВАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации 8Е0 ΙΌ N0: 21. Так, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает 8Е0 ΙΌ N0: 23, включающий аминокислоты на участке 117-136 из ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 21 или 8Е0 ΙΌ N0: 23.
В случае С1 домена ВАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует в природном состоянии направлению считывания информации из С1 домена. В данном варианте линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности ВАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) аминокислот против направления или в направлении считывания информации из 8Е0 ΙΌ N0: 22. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер ВАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или, в другом варианте, междоменный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318342 из ВАСЕ.
Например, белок слияния на основе ВАСЕ может использоваться в тесте на связывание для идентификации потенциальных лигандов ВАСЕ. В одном примерном варианте такого теста на связывание известный лиганд ВАСЕ может быть нанесен на твердый субстрат (например, на планшеты Максисорб (МахщогЬ)) в концентрации примерно 5 мкг на ячейку, где каждая ячейка содержит общий объем примерно 100 мкл. Планшеты инкубируют при температуре 4°С в течение ночи для абсорбции лиганда. Альтернативно, могут использоваться более короткие периоды инкубации при более высоких температурах (например, при комнатной температуре). После истечения периода времени, необходимого для того, чтобы лиганд связался с субстратом, содержимое ячеек отсасывают и добавляют блокирующий буфер (например, 1% БСА в 50 мМ имидазольном буфере, рН 7,2) для блокирования неспецифического связывания. Например, блокирующий буфер может быть добавлен к планшетам на 1 ч при комнатной температуре. Далее содержимое ячеек в планшетах отсасывают и/или промывают промывочным буфером. В таком варианте может быть использован буфер, включающий 20 мМ имидазола, 150 мМ №С1, 0,05% Твин20, 5 мМ СаС12 и 5 мМ МдС12, рН 7,2, в качестве промывочного буфера. Далее к экспериментальным ячейкам может быть добавлен белок слияния в возрастающих разведениях. Далее белок слияния на основе ВАСЕ инкубируют с иммобилизованным лигандом в экспериментальных ячейках, так чтобы было достигнуто равновесие по связыванию. В одном варианте белок слияния ВАСЕ инкубируют с иммобилизованным лигандом примерно в течение 1 ч при температуре 37°С. В альтернативных вариантах используют более длительные периоды инкубации при более низких температурах. По окончании инкубации белка слияния и иммобилизованного лиганда планшет промывают для удаления несвязанного белка слияния. Белок слияния, связанный с иммобилизованным лигандом, может быть выявлен различными способами. В одном варианте для выявления используют методику ЕЫ8А. Так, в одном варианте комплекс для иммунологического выявления, содержащий моноклональный мышиный Ιβ61 против человеческого компонента, биотинилированный козий антимышиный и авидин с присоединенной щелочной фосфатазой, может быть добавлен к белку слияния, иммобилизованному в экспериментальной ячейке. Комплекс для иммунологического выявления может быть подвергнут связыванию с иммобилизованным белком слияния, так чтобы связывание между белком слияния и комплексом для иммунологического выявления достигло равновесия. Например, комплекс может быть подвергнут связыванию с белком слияния в течение 1 ч при комнатной температуре. В этой точке несвязанный комплекс может быть удален промывкой экспериментальных ячеек промывочным буфером. Связанный комплекс может быть вы
- 17 012082 явлен при добавлении субстрата щелочной фосфатазы, паранитрофенилфосфата (ПНФФ (ΡΝΡΡ)), с последующим измерением уровня превращения ПНФФ в паранитрофенол (ПНФ (ΡΝΡ)), определяемого как повышение поглощения при длине волны 405 нм.
В одном варианте лиганд КАСЕ связывается с белком слияния на основе КАСЕ с наномолярной (нМ) или микромолярной (мкМ) аффинностью. На фиг. 7 проиллюстрирован эксперимент, демонстрирующий связывание лигандов КАСЕ с белками слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению. Готовят растворы ТТР-3000 (ТТ3) и ТТР-4000 (ТТ4) с исходными концентрациями 1,082 мг/мл и 370 мкг/мл, соответственно. Как видно из фиг. 7, при разных разведениях белки слияния ТТР-3000 и ТТР-4000 способны связываться с иммобилизованными лигандами КАСЕ амилоид-бета (Абета) (Ату1οίά Ве1а (1-40) от Вюкоигсе), 8100Ь (8100) и амфотерином (Атрйо), что приводит к повышению уровня поглощения. В отсутствие лиганда (например, при нанесении покрытия только из БСА) не отмечается повышения поглощения.
Тест на связывание согласно настоящему изобретению может использоваться для количественного определения уровня связывания лиганда с КАСЕ. В альтернативных вариантах лиганды КАСЕ могут связываться с белком слияния согласно настоящему изобретению с аффинностями по связыванию, варьирующими от 0,1 до 1000 нМ, или от 1 до 500 нМ, или от 10 до 80 нМ.
Белок слияния по настоящему изобретению может также использоваться для идентификации соединений, обладающих способностью связываться с КАСЕ. Как показано на фиг. 8 и 9, соответственно, лиганд КАСЕ может быть исследован на его способность конкурировать с иммобилизованным амилоидбета за связывание с белками слияния ТТР-4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ТТ3).
Так, можно видеть, что лиганд КАСЕ в конечной концентрации в тесте (БАС), равной 10 мкМ, может вытеснять в реакции связывания белка слияния КАСЕ с амилоид-бета в концентрациях 1:3, 1:10, 1:30 и 1:100 исходного раствора ТТР-4000 (фиг. 8) и ТТР-3000 (фиг. 9).
Модуляция клеточных эффекторов
Варианты белков слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для модуляции биологического ответа, опосредованного КАСЕ. Например, могут быть созданы белки слияния с целью модуляции КАСЕ-индуцированного повышения их генной экспрессии. Так, в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для модуляции функций биологических ферментов. Например, взаимодействие между КАСЕ и лигандами может вызывать окислительный стресс и активацию ΝΕ-кВ и генов, регулируемых ΝΕ-кВ, таких как цитокины 1Ь-1 β, ΤΝΡ-α и т.п. Дополнительно было показано, что некоторые другие регуляторные пути, такие как пути, вовлекающие р21гак, МАР-киназы, ЕКК1 и ЕКК2, активируются при связывании АСЕ и других лигандов с КАСЕ.
Использование белков слияния согласно настоящему изобретению для модуляции экспрессии клеточного эффектора Τ№-α показано на фиг. 10. Миелоидные клетки ТНР-1 культивируют в среде ΗΡΜΙ 1640 с добавкой 10% ФСТ и индуцируют секрецию Τ№-α путем стимуляции КАСЕ с использованием 8100Ь. В случае такой стимуляции в присутствии белка слияния КАСЕ индукция ΤΝΡ-α за счет связывания 8100Ь с КАСЕ может быть ингибирована. Так, на фиг. 10 показано, что добавление 10 мкг белка слияния на основе КАСЕ ТТР-3000 (ТТ3) или ТТР-4000 (ТТ4) снижает индукцию ΤΝΕ-α под действием 8100Ь примерно на 50-75%. Белок слияния ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, столь же эффективен по блокированию индукции ΤΝΡ-α под действием 8100Ь, как и кКАСЕ (фиг. 10). Специфичность ингибирования последовательностей КАСЕ для ТТР-4000 и ТТР-3000 показана в эксперименте, в рамках которого добавляют один 1дС к 8100Ь-стимулированным клеткам. Добавление 1дС и 8100Ь к тесту приводит к тем же уровням Τ№-α, что и добавление одного 8100Ь.
Физиологические характеристики белков слияния на основе КАСЕ
Хотя кКАСЕ может оказывать терапевтический эффект при модуляции КАСЕ-опосредованных заболеваний, человеческий кКАСЕ может иметь ограничения при использовании его в рамках единственного терапевтического подхода, определяемые относительно коротким периодом полувыведения кКАСЕ из плазмы. Например, тогда как кКАСЕ грызунов имеет период полувыведения у нормальных и диабетических крыс, равный примерно 20 ч, человеческий кКАСЕ имеет период полувыведения менее чем 2 ч при оценке по сохранению иммунореактивности кКАСЕ (Кепагй е1 а1., I. Ρйа^тасο1. Ехр. ΤΙκγ., 290: 14581466 (1999)).
Для достижения терапевтического эффекта КАСЕ, который имеет близкие к кКАСЕ характеристики по связыванию, но более стабильный фармакокинетический профиль, может быть использован белок слияния на основе КАСЕ, включающий сайт связывания лиганда КАСЕ, присоединенный к одному или нескольким иммуноглобулиновым доменам человека. Как известно в данной области, иммуноглобулиновые домены могут включать Бс часть тяжелой цепи иммуноглобулина.
Бс часть иммуноглобулина может придавать некоторые свойства белкам слияния. Например, белок слияния Бс может повышать период полувыведения таких белков слияния из сыворотки и зачастую от нескольких часов до нескольких дней. Повышение фармакокинетической стабильности, в основном, представляет собой результат взаимодействия линкера, находящегося между участками СН2 и СН3 фрагмента Бс, с рецептором БсКп (\Утек е1 а1., I. 1ттипо1., 164: 5313-5318 (2000)).
- 18 012082
Хотя белки слияния, включающие полипептид Ес иммуноглобулина, могут давать преимущество, определяемое повышенной стабильностью, иммуноглобулиновые белки слияния могут вызывать воспалительный ответ при введении в организм хозяина. Воспалительный ответ может определяться, в основном, Ес частью иммуноглобулина в белке слияния. Провоспалительный ответ может быть желательным, если целевое соединение экспрессируется в таких клетках, пораженных таким заболеванием, которые следует устранить (например, в раковой клетке или в популяции лимфоцитов, вызывающих аутоиммунное заболевание).
Провоспалительный ответ может быть нейтральной особенностью, если целевое соединение представляет собой растворимый белок, поскольку большая часть растворимых белков не активирует иммуноглобулины. Однако провоспалительный ответ может быть отрицательной характеристикой, если целевое соединение экспрессируется на клетках такого типа, разрушение которых может привести к нежелательным побочным эффектам. Кроме того, провоспалительный ответ также может быть отрицательной характеристикой, если воспалительный каскад устанавливается в сайте связывания белка слияния с тканью-мишенью, поскольку многие медиаторы воспаления могут быть вредны для окружающей ткани и/или могут вызвать системные эффекты.
Первичный провоспалительный сайт на иммуноглобулиновых Ес фрагментах находится на шарнирном участке между Сн2 и Сн3. Данный шарнирный участок взаимодействует с ЕсК1-3, находящимися на разных лейкоцитах, и заставляет эти клетки воздействовать на мишень (\Уте5 е! а1., 1. Iттиηо1., 164: 5313-5318 (2000)).
Белки слияния на основе КАСЕ при их использовании в качестве терапевтических препаратов для лечения КАСЕ-опосредованных заболеваний могут не вызывать воспалительный ответ. Так, некоторые варианты белков слияния КАСЕ по настоящему изобретению могут включать белок слияния, включающий полипептид КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому(ым) домену(ам), где Ес шарнирный участок в иммуноглобулине удален и замещен полипептидом КАСЕ. В этом случае взаимодействие между белком слияния на основе КАСЕ и Ес рецепторами на воспалительных клетках может быть минимизировано. Однако может быть важно поддерживать соответствующие липкие свойства и другие формы взаимодействия, определяемые трехмерной структурой, между различными иммуноглобулиновыми доменами белка слияния. Так, варианты белков слияния согласно настоящему изобретению могут замещать биологически инертный, но структурно близкий междоменный линкер КАСЕ, который разделяет V и С1 домены КАСЕ, или линкер, который разделяет С1 и С2 домены КАСЕ в нормальном шарнирном участке тяжелой цепи иммуноглобулина. Так, полипептид КАСЕ в белке слияния может включать последовательность междоменного линкера, которая в природном состоянии соответствует направлению считывания информации из иммуноглобулинового домена КАСЕ, с образованием иммуноглобулинового домена КАСЕ/линкерного фрагмента. При осуществлении данного способа удается сохранять трехмерные взаимодействия между иммуноглобулиновыми доменами, определяемыми КАСЕ или иммуноглобулином.
В одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может вызывать существенное повышение фармакокинетической стабильности в сравнении с &КАСЕ. Например, как видно из фиг. 11, при насыщении ТТР-4000, белка слияния на основе КАСЕ, его лигандами может сохраняться период полувыведения более 300 ч. Это резко отличается от значения периода полувыведения кКАСЕ, который насчитывает лишь несколько часов в плазме человека.
Таким образом, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для антагонизации в процессе связывания физиологических лигандов с КАСЕ и представлять собой средство лечения КАСЕ-опосредованных заболеваний, не вызывая неприемлемого уровня воспаления. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут демонстрировать существенное снижение воспалительного ответа в сравнении с Ιβθ. Например, как видно из фиг. 12, ТТР-4000, белок слияния на основе КАСЕ, не стимулирует высвобождение Т№-а из клеток в условиях, при которых выявляется высвобождение Т№-а, стимулированное человеческим ΙβΟ.
Лечение заболевания белками слияния на основе КАСЕ
Настоящее изобретение может также включать способы лечения КАСЕ-опосредованного расстройства у человека. В одном варианте данный способ может включать введение субъекту белка слияния, включающего полипептид КАСЕ, который включает сайт связывания лиганда КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от КАСЕ. В одном варианте белок слияния может включать сайт связывания лиганда КАСЕ. В одном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть Юконцевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда КАСЕ может включать V домен КАСЕ или его часть. В данном варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8Е0 ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8Е0 ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей.
В одном варианте полипептид КАСЕ может быть присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (то есть фрагмент) иммуноглобулинового домена. В данном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из Сн2 или Сн3 доменов человеческого ΙβΟ.
- 19 012082
Белок или полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ полной длины (например, 8ЕС ГО N0: 1) или фрагмент человеческого КАСЕ. В данном варианте полипептид КАСЕ не включает какиелибо остатки из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из КАСЕ полной длины (8ЕС ГО N0: 1). В альтернативных вариантах полипептид КАСЕ может включать последовательность, которая на 70, на 80 или на 90% идентична человеческому КАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерег с1 а1., (1992)). Или, в другом варианте, человеческий КАСЕ может включать КАСЕ полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС ГО N0: 2 или 8ЕС ГО N0: 3, фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать кКАСЕ (например, 8ЕС ГО N0: 4), полипептид, который на 90% идентичен кКАСЕ, или фрагмент кКАСЕ. Например, полипептид КАСЕ может включать человеческий кКАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или, в другом варианте, человеческий КАСЕ может включать кКАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕС ГО N0: 5 или 8ЕС ГО N0: 6, фиг. 1С) или часть указанной аминокислотной последовательности. В других вариантах белок КАСЕ может включать У домен (например, 8ЕС ГО N0: 7 или 8ЕС ГО N0: 8, фиг. 1Ό). Или, в другом варианте, может быть использована последовательность, которая на 90% идентична У домену или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок КАСЕ может включать фрагмент КАСЕ, включающий часть У домена (например, 8ЕС ГО N0: 9 или 8ЕС ГО N0: 10, фиг. 1Ό). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать 8ЕС ГО N0: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8ЕС ГО N0: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент КАСЕ представляет собой синтетический пептид. Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид в белке слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотипа: ΙβΟ (γ), Ι§Μ (μ), ΙμΌ (δ), фЕ (ε) или ΙμΛ (α). Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного подтипа: фС1 (γ1), ΙμΟ2 (γ2), ΙμΟ3 (γ3), ΙμΟ4 (γ4), фА1 (α1), IдА2 (α2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать Сн2 и Сн3 домены из человеческого фС 1, или любую их часть, или оба указанных домена. В качестве репрезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены человеческого фС 1 или их часть, который может включать 8ЕС ГО N0: 38 или 8ЕС ГО N0: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8ЕС ГО N0: 38 или 8ЕС ГО N0: 41.
Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-116 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 7) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-116 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 8) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую У домену КАСЕ. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 124-221 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 11) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую С1 домену КАСЕ. В другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 227-317 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 12) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую С2 домену КАСЕ. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-123 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 13) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-123 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 14) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую У домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-226 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 17) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-226 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 18) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую У домену, С1 домену и междоменному линкеру, соединяющему оба указанных домена. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23339 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 5) или последовательность, которая на 90% им идентична, или остатки на участке 24-339 из человеческого КАСЕ (8ЕС ГО N0: 6) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую кКАСЕ (то есть кодирующую У, С1 и С2 домены и междоменные линкеры). Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей.
Ес часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительной активностью ίη νίνο. Так, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ может также включать полипеп
- 20 012082 тид ВАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сц2 домен иммуноглобулина или фрагмент. В одном варианте Сн2 домен или его фрагмент может включать 8ЕС ΙΌ N0: 42.
В одном варианте полипептид ВАСЕ может включать междоменный линкер ВАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к Юконцевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий Сн2 домен иммуноглобулина, может включать СН2 и Сн3 домены из человеческого 1дС1. В качестве репрезентативного варианта можно указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены человеческого 1дС1, который может включать 8ЕС ΙΌ N0: 38 или 8ЕС ΙΌ N0: 40.
Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из ВАСЕ. Кроме того, полипептид ВАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ, может включать фрагмент белка ВАСЕ полной длины. Например, в одном варианте белок слияния согласно настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен ВАСЕ и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену ВАСЕ и второму междоменному линкеру ВАСЕ, так что Юконцевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена ВАСЕ, Юконцевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, Юконцевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера ВАСЕ непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид ВАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, соединяющему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации из С1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8ЕС ΙΌ N0: 30 или ее фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе ВАСЕ.
Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен ВАСЕ, присоединенный через междоменный линкер ВАСЕ к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Например, полипептид ВАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-136 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 из человеческого ВАСЕ (8ЕС ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену ВАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая 8ЕС ΙΌ N0: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния ВАСЕ.
Фрагмент междоменного линкера ВАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии и, таким образом, присоединенную к иммуноглобулиновому домену ВАСЕ. Например, в случае V домена ВАСЕ междоменный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации из V домена, в природном состоянии. В данном варианте линкер может включать 8ЕС ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности ВАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из 8ЕС ΙΌ N0: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает 8ЕС ΙΌ N0: 23, включающую аминокислоты на участке 117136 из ВАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты 8ЕС ΙΌ N0: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 21 или 8ЕО ΙΌ N0: 23.
В случае С1 домена ВАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации из С1 домена, в природном состоянии. В одном варианте линкер может включать 8ЕС ΙΌ N0: 22, соответствующий аминокислотам на участке 222-251 ВАСЕ полной длины. Линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности ВАСЕ. Например, может использоваться линкер, включающий несколько (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) аминокислот против направления или в направлении считыва
- 21 012082 ния информации из 8Е0 ΙΌ N0: 22. Или могут использоваться фрагменты 8Е0 ΙΌ N0: 22, содержащие делецию, например, из 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер КАСЕ может включать 8Е0 ΙΌ N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или междоменный линкер может включать 8Е0 ΙΌ N0: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из КАСЕ.
В одном варианте белок слияния согласно настоящему изобретению может вводиться различными способами. Введение белка КАСЕ согласно настоящему изобретению может включать внутрибрюшинную инъекцию (в/б). Альтернативно, белок слияния на основе КАСЕ может вводиться перорально, интраназально или в аэрозольной форме. В другом варианте введение представляет собой внутривенное введение (в/в). Белок слияния на основе КАСЕ может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществляют внутриартериальное введение белка слияния. В другом варианте введение осуществляется сублингвально. Кроме того, для введения могут использоваться капсулы с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозиториев и т. п. Например, может использоваться подкожное введение, которое полезно для лечения хронических заболеваний в тех случаях, когда желательно самолечение.
Для подтверждения полезности использования соединений, модулирующих КАСЕ, в качестве лекарственных средств оценивались результаты их применения у разных животных, взятых в качестве соответствующих моделей. Примеры таких моделей включают:
a) ингибирование под действием кКАСЕ образования неоинтимы на модели крыс с рестенозом после повреждения артерий как у диабетических, так и нормальных крыс путем ингибирования активации эндотелия, гладких мышц и макрофагов посредством КАСЕ (Ζΐιοιι е! а1., С1гси1айоп 107: 2238-2243 (2003));
b) ингибирование взаимодействия КАСЕ/лиганда с использованием кКАСЕ или антител против КАСЕ, снижение образования амилоидных бляшек на модели мышей с системный амилоидозом (Уап е! а1., №11. Мей., 6: 643-651 (2000)). Снижение амилоидных бляшек сопровождается снижением уровня воспалительных цитокинов, интерлейкина-6 ЦЬ-6) и макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ), а также сниженной активацией №-кВ у обработанных животных;
c) КАСЕ-трансгенные мыши (осуществляющие суперэкспрессию КАСЕ и негативную экспрессию доминантного КАСЕ) демонстрируют образование бляшек и расстройство распознавательной способности, в рамках модели мышей с БА (Агансю е! а1., ЕМВ0 I. , 23: 4096-4105 (2004));
й) использование кКАСЕ при лечении мышей с диабетом снижает проницаемость сосудов (Воннагйе1-РЬи е! а1., П1аЬе!ек, 48: 2052-2058 (1998));
е) лечение с использованием кКАСЕ снижает уровень атеросклеротических повреждений у диабетических мышей с аполипопротеином Е-пи11 и предотвращает появление функциональных и морфологических признаков диабетической нефропатии у йЬ/йЬ мышей (нийкоп е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук., 419: 80-88 (2003) и
Г) кКАСЕ ослабляет тяжесть воспаления на модели мышей с артритом, индуцированным коллагеном (ИоГтаии е! а1., Сепек ЮтипоР, 3: 123-135 (2002)), на модели мышей с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (Уап е! а1., №1 Мей., 9: 28-293 (2003)) и на модели мышей с воспалительным заболеванием кишечника (ноРтапп е! а1., Се11., 97: 889-901 (1999)).
Таким образом, в одном варианте осуществления белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения симптомов диабета и/или осложнений диабета, опосредованных КАСЕ. В альтернативных вариантах симптомы диабета или поздние осложнения диабета могут включать диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую язву стопы, сердечно-сосудистые осложнения диабета или диабетическую невропатию.
Первоначально идентифицированный как рецептор молекул, экспрессия которых ассоциирована с патологией диабета, сам по себе КАСЕ является обязательным компонентом в патофизиологии диабетических осложнений. Было показано, что ингибирование взаимодействия КАСЕ с его лигандом(ами) ш У1уо оказывает терапевтический эффект на многих моделях диабетических осложнений и воспаления (нийкоп е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬук., 419: 80-88 (2003)). Например, лечение в течение 2 месяцев с использованием антител против КАСЕ нормализовало почечную функцию и снизило аномальную гистопатологию почки у мышей с диабетом (Е1ууЬ_)егд е! а1., О1аЬе1ек., 53: 166-172 (2004)). Кроме того, лечение с использованием растворимой формы КАСЕ (кКАСЕ), который связывается с лигандами КАСЕ и ингибирует взаимодействия КАСЕ/лиганда, снижает выраженность атеросклеротических повреждений у диабетических мышей с аполипопротеином Е-пи11 и снижает функциональную и морфологическую патологию диабетической нефропатии у мышей йЬ/йЬ (ВисшагеШ е! а1., Спси1а1юп., 106: 2827-2835 (2002)).
Кроме того, было показано, что неэнзиматическое гликоксилирование макромолекул, приводящее в итоге к образованию конечных продуктов с повышенным гликозилированием (АСЕ), усиливается в сайтах воспаления при почечной недостаточности, в случае гипергликемии и других состояний, ассоциированных с системным или локальным окислительным стрессом (Эуег е! а1., I. С1ш. ШуекР, 91: 2463-2469 (1993); Кеййу е! а1., ВюсЬет., 34: 10872-10878 (1995); 1)\ег е! а1., I. Вю1. СЬет., 266: 11654-11660 (1991); ЭеёепЬагй! е! а1., Се11. Мо1. Вю1., 44: 1139-1145 (1998)). Накопление АСЕ в сосудистой сетке может осу
- 22 012082 ществляться в очагах, например в суставном амилоиде, состоящем из АСЕ-в2-микроглобулина, обнаруженного у пациентов с амилоидозом, связанным с диабетом (М1уа!а е! а1., 1. С1т. ИщекЬ, 92: 1243-1252 (1993); М1уа!а е! а1., I. С1т. ИщекЕ, 99: 1088-1094 (1996)), или, в основном, встречается в сосудистой сетке и ткани пациентов с диабетом (8сйт1й! е! а1., №11иге. Мей., 1: 1002-1004 (1995)). Прогрессирующее накопление АСЕ с течением времени у пациентов с диабетом говорит о том, что механизм эндогенного клиренса не способен эффективно функционировать в сайтах осаждения АСЕ. Такие аккумулированные АСЕ обладают способностью менять клеточные свойства посредством множества механизмов. Хотя АСЕ экспрессируется на низком уровне в нормальных тканях и в сосудистой клетке, было показано, что в среде, где накапливаются лиганды рецептора, КАСЕ подвергается позитивной регуляции (Ь1 е! а1., 1. Бю1. СЕет., 272: 16498-16506 (1997); Ы е! а1., Ε Бю1. СЕет., 273: 30870-30878 (1998); Тапака е! а1., I Бю1. СЕет., 275: 25781-25790 (2000)). Экспрессия КАСЕ повышается в эндотелии, гладкомышечных клетках и инфильтрующих моноядерных фагоцитах сосудистой сетки при диабете. Кроме того, исследования с использованием клеточной культуры показали, что взаимодействие АСЕ-КАСЕ вызывает изменения клеточных свойств, важных для сосудистого гомеостаза.
Использование белков слияния на основе КАСЕ при лечении патологий, связанных с диабетом, проиллюстрировано на фиг. 13. Белок слияния на основе КАСЕ, ТТР-4000, оценивают на модели рестеноза у крыс с диабетом при проведении измерения пролиферации гладких мышц и размножения клеток интимы после поражения сосудистой сетки. Как показано на фиг. 13, лечение с использованием ТТР4000 существенно снижает соотношение интима/среда (И/С) (фиг. 13А, табл. 1) на модели ассоциированного с диабетом рестеноза зависимым от дозы способом. Кроме того, лечение с использованием ТТР4000 существенно снижает ассоциированную с рестенозом пролиферацию гладкомышечных клеток сосудистой сетки зависимым от дозы способом.
Таблица 1
Эффект ТТР-4000 на модели крыс с рестенозом
| 1дС (п=9) | ТТР-4000 (п=9) низкая доза** (0,3 мг/животное через день х 4) | ТТР-4000 (п=9) высокая доза** (1,0 мг/животное через день х 4) | |
| Площадь просвета (мм2) | 0,2±0,03 | 0,18+0,04 | 0,16+0,02 |
| Медиальная площадь (мм21 | 0,12±0,01 | 0,11±0,02 | 0,11+0,01 |
| Соотношение И/С | 1,71+0,27 | 1,61±0,26 | 1,44*±0,15 |
* Р<0,05.
** В качестве высокой и низкой дозы используется нагрузочная доза, равная 3 мг/животное.
В других вариантах белки слияния согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения или реверсирования амилоидоза или болезни Альцгеймера. КАСЕ представляет собой рецептор для бета-амилоида (Ав), а также других амилоидогенных белков, включая 8АА и амилин (Уап е! а1., №!иге, 382: 685-691 (1996); Уап е! а1., Ргос. N311. Асай. 8οΐ. И8А., 94: 5296-5301 (1997); Уап е! а1., Ыа!. Мей., 6: 643-651 (2000); 8оика е! а1., ЬаЬ. ^ек!., 80: 1101-1110 (2000)). Кроме того, лиганды КАСЕ, включая АСЕ, 8100Ь и Ав белки, найдены в ткани, окружающей старческие бляшки у человека (Ъи1й е! а1., СегеЬ. Сойех., 15: 211-220 (2005); Ре(хо1й е! а1., №иго8с1. Ье!!., 336: 167-170 (2003); 8акак1 е! а1., Бгат Кек., 12: 256-262 (2001); Уап е! а1., Кек!ог. №иго1. №иго5с1., 12: 167-173 (1998)). Было показано, что КАСЕ связывается с фибриллярным β-складчатым, независимо от состава субъединиц (пептид амилоид в, амилин, сывороточный амилоид А, прионовый пептид) (Уап е! а1., Хакие., 382: 685-691 (1996); Уап е! а1., №11. Мей., 6: 643-651 (2000)). Кроме того, было показано, что отложение амилоида приводит к усилению экспрессии КАСЕ. Например, в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (БА) экспрессия КАСЕ повышается в нейронах и глии (Уап е! а1., КаШге., 382: 685-691 (1996)). Одновременно с экспрессией лигандов КАСЕ, КАСЕ подвергается позитивной регуляции в астроцитах и микроглиальных клетках в гиппокампе индивидуумов с болезнью Альцгеймера, но не у индивидуумов с выраженной позитивной регуляцией, но которые не имеют БА (Ьие е! а1., Ехр. №ιιιό1., 171: 29-45 (2001)). Приведенные данные позволяют полагать, что клетки, экспрессирующие КАСЕ, активируются за счет взаимодействия КАСЕ/лиганда КАСЕ вблизи старческих бляшек. Кроме того, Ав-опосредованная активация клеток микроглии ш νίΙΐΌ может блокироваться антителами, направленными против домена связывания лиганда в КАСЕ (Υап е! а1., Ргос. Май. Асай. 8сь И8А., 94: 5296-5301 (1997)). Было также показано, что КАСЕ может служить в качестве очаговой точки для сборки фибрилл (Эеапе е! а1., №!. Мей., 9: 907-913 (2003)).
Кроме того, ингибирование ш νί\Ό взаимодействия КАСЕ/лиганда с использованием кКАСЕ или антител против КАСЕ может снижать образование амилоидных бляшек на модели мышей с системным амилоидозом (Уап е! а1., №11. Мей., 6: 643-651 (2000)). У двойных трансгенных мышей, осуществляющих суперэкспрессию человеческого КАСЕ и белка-предшественника человеческого амилоида (АРР) с мута
- 23 012082 циями 8\уеб1эН и Ьопбоп (мутант НАРР), в нейронах развиваются дефекты обучения и нейропатологические аномалии раньше, чем в случае их НАРР трансгенных вариантов с одной мутацией. И наоборот, двойные трансгенные мыши со сниженной Ав сигнальной способностью за счет нейронов, экспрессирующих доминантную негативную форму КАСЕ на фоне того же мутанта НАРР, демонстрируют задержанное развитие аномалий в обучении в сравнении с их трансгенным вариантом, содержащим один АРР (Агапсю е! а1., ЕМΒО I., 23: 4096-4105 (2004)).
Кроме того, было показано, что ингибирование взаимодействия КАСЕ-амилоид снижает экспрессию клеточного КАСЕ и маркера клеточного стресса (а также активацию ΝΡ-кВ) и снижает отложение амилоида (Уап е! а1., №11. Меб., 6: 643-651 (2000)), что указывает на возможную роль взаимодействия КАСЕ-амилоида в перестройке клеточных свойств в окружении, обогащенном амилоидом (даже на ранних стадиях), а также при накоплении амилоида.
Таким образом, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения с целью снижения амилоидоза, числа амилоидных бляшек, а также познавательной дисфункции, ассоциированной с болезнью Альцгеймера (БА). Как указывалось выше, на модели животных с БА было показано, что эКАСЕ снижает как образование амилоидных бляшек в мозге, так и последующее повышение уровня воспалительных маркеров. На фиг. 14А и 14В показано, что мыши с БА, которых лечили в течение 3 месяцев с использованием ТТР-4000 или мышиного эКАСЕ, имеют сниженный уровень амилоид-бета (Ав) бляшек и менее выраженную познавательную дисфункцию, чем животные, которые получали носитель или человеческий 1дС в качестве отрицательного контроля (1дС1). Как и эКАСЕ, ТТР-4000 может также снижать уровень воспалительных цитокинов 1Ь-1 и ΤΝΡ-α (данные не показаны), ассоциированных с БА.
Кроме того, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых расстройств. Так, было показано, что ишемическая болезнь сердца особенно часто встречается у пациентов с диабетом (КоЬейэоп е! а1., ЬаЬ. 1пуеэ!., 18: 538-551 (1968); Каппе1 е! а1., I. Ат. Меб. Аээос., 241: 2035-2038 (1979); Каппе1 е! а1., 1№ώ. Саге, 2: 120-126 (1979)). Кроме того, в других исследованиях было показано, что атеросклероз у пациентов с диабетом развивается быстрее и более масштабно, чем у пациентов без диабета (см., например, \\'а11ег е! а1., Ат. I. Меб., 69: 498-506 (1980); Сга11 е! а1., Ат. I. Меб., 64: 221-230 (1978); НатЬу е! а1., СНеэ!, 2: 251-257 (1976); и Руога1а е! а1., 1№ώ. Ме!аЬ. Кеу., 3: 463-524 (1978)).
Хотя имеется множество разных причин ускоренного развития атеросклероза при диабете, было показано, что снижение уровня АСЕ может приводить к сниженному образованию бляшек.
Например, белки слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению могут также использоваться при лечении инсульта. При сравнении ТТР-4000 с эКАСЕ на релевантной модели животных для инсульта было показано, что ТТР-4000 обеспечивает значительно большее снижение объема некроза. В рамках данной модели среднюю сонную артерию мышей лигируют и затем проводят реперфузию с образованием зоны некроза. Для оценки эффективности белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению, в плане лечения или предотвращения инсульта, мышам перед реперфузией вводят эКАСЕ, или ТТР-4000, или контрольный иммуноглобулин. Как показано в табл. 2, ТТР-4000 был более эффективен, чем эКАСЕ, по ограничению площади некроза у данных животных, что указывает на то, что ТТР-4000, в связи с его лучшими показателями полувыведения из плазмы, способен оказывать большую защиту, чем эКАСЕ.
Таблица 2
Снижение зоны некроза при инсульте
| % снижения зоны некроза** | |
| зКАСЕ | 15%* |
| ТТР-4000 (300 мкг) | 38%* |
| ТТР-4000 (300 мкг) | 21%* |
| ТТР-4000 (300 мкг) | 10%* |
| контрольный изотип 1дС (300 мкг) | 4% |
* Значимые данные при р<0,001.
** Сравнение с солевым раствором.
В других вариантах белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения рака. В одном варианте лечение рака с использованием белков слияния согласно настоящему изобретению включает раковые клетки, которые экспрессируют КАСЕ. Например, рак, который можно лечить с использованием белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению, включает некоторые виды рака легкого, некоторые глиомы, некоторые папилломы и т. п. Амфотерин представляет собой высокомобильный негистоновый белок группы I, связывающийся с хромосомальной ДНК (Каиуа1а е! а1., I. ΒΜ. СНет., 262: 16625-16635 (1987); РагИктеп е! а1., I. Βώ1. СНет., 268: 19726-19738 (1994)), который, как было показано, взаимодействует с КАСЕ. Было показано, что амфотерин способствует об
- 24 012082 разованию нейритных отростков, а также служит в качестве поверхности для сборки протеазных комплексов в системе фибринолиза (который, как известно, также вносит вклад в клеточную мобильность). Дополнительно, местный ингибирующий эффект на рост опухоли за счет блокирования ВАСЕ наблюдается на модели первичной опухоли (С6 глиома), на модели Льюиса (ЪеЮк) метастазирования в легких (ТадисЫ е! а1., №11иге 405: 354-360 (2000)) и в случае спонтанно возникающих папиллом у мышей, экспрессирующих трансген ν-На-гак (Ьебег е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1., 87: 9178-9182 (1990)).
Еще в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения воспаления. Например, в альтернативных вариантах белок слияния согласно настоящему изобретению используют для лечения воспаления, ассоциированного с аутоиммунным процессом, воспаления, ассоциированного с воспалительным заболеванием кишечника, воспаления, ассоциированного с ревматоидным артритом, воспаления, ассоциированного с псориазом, воспаления, ассоциированного с рассеянным склерозом, воспаления, ассоциированного с гипоксией, воспаления, ассоциированного с инсультом, воспаления, ассоциированного с сердечным приступом, воспаления, ассоциированного с геморрагическим шоком, воспаления, ассоциированного с сепсисом, воспаления, ассоциированного с трансплантацией органа, или воспаления, ассоциированного с плохим заживлением ран.
Например, после тромболитического лечения воспалительные клетки, такие как гранулоциты, инфильтруют ишемизированную ткань и создают кислородные радикалы, которые могут разрушать больше клеток, чем их было уничтожено гипоксией. Ингибирование рецептора на нейтрофиле, ответственном за способность нейтрофилов инфильтрировать ткань антителами или другими белковыми антагонистами, как было показано, снижает указанную реакцию. Поскольку ВАСЕ представляет собой лиганд такого нейтрофильного рецептора, белок слияния, содержащий фрагмент ВАСЕ, может действовать в качестве приманки, и предотвращать поступление нейтрофилов в реперфузированный сайт, и таким образом предотвращать дальнейшую деструкцию ткани. Роль ВАСЕ в предотвращении воспаления может быть продемонстрирована на примере результатов исследований, в которых показано, что кВАСЕ ингибирует размножение неоинтимы на модели крыс с рестенозом после повреждения артерии, как у крыс с диабетом, так и у нормальных крыс, прежде всего, за счет ингибирования пролиферации эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и за счет активации макрофагов через ВАСЕ (Ζΐιοιι е! а1., С1гси1а!юп, 107: 2238-2243 (2003)). Дополнительно было показано, что кВАСЕ оказывает ингибирующее действие на моделях воспаления, включающих гиперчувствительность задержанного типа, на модели с экспериментальным аутоиммунным энцефалитом и на модели воспалительного заболевания кишечника (НоГтап е! а1., Се11, 97: 889-901 (1999)).
Кроме того, в одном варианте белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения аутоиммунных расстройств. Например, белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения почечной недостаточности. Так, белки слияния согласно настоящему изобретению могут использоваться для лечения системного волчаночного нефрита или воспалительного волчаночного нефрита. Например, было показано, что 8100/калгранулины включают семейство близкородственных кальцийсвязывающих полипептидов, для которых характерно наличие участков с двумя ЕЕ-полосами, соединенными связующим пептидом (8сНаГег е! а1., Т1В8., 21: 134-140 (1996); ΖίιηιικΓ е! а1., Вгат Век. Ви11., 37: 417-429 (1995); Ваттек е! а1., Е Вю1. СЕет., 272: 9496-9502 (1997); Ьидеппд е! а1., Еиг. Е С1т. Гпуек!., 25: 659-664 (1995)). Хотя у них отсутствуют сигнальные пептиды, уже давно известно, что 8100/калгранулины имеют преимущество, связанное с возможностью их доступа во внеклеточное пространство, особенно в сайты хронических иммунных/воспалительных ответов, как в случае цистного фиброза и ревматоидного артрита. ВАСЕ представляет собой рецептор для многих представителей семейства 8100/калгранулина, опосредующих провоспалительное действие на клетки, такие как лимфоциты и моноядерные фагоциты. Кроме того, результаты исследований ответов на моделях гиперчувствительности задержанного типа, колита у мышей 1Ь-10 пи11, коллагениндуцированного артрита и экспериментального аутоиммунного энцефалитом дают основания полагать, что взаимодействие ВАСЕ-лиганд (преимущественно в рамках 8100/калгранулины) играют определенную роль в воспалительном каскаде, находясь в его начале.
Так, в различных выбранных экспериментах настоящее изобретение может относиться к способу ингибирования взаимодействия АСЕ с ВАСЕ у субъекта, осуществляемого путем введения субъекту терапевтически эффективного количества белка слияния согласно настоящему изобретению. Субъект, подлежащий лечению с использованием белков на основе ВАСЕ согласно настоящему изобретению, может представлять собой животное. В одном из таких вариантов указанный субъект представляет собой человека. Субъект может страдать от АСЕ-родственного заболевания, такого как диабет, диабетические осложнения, такие как нефропатия, нейропатия, ретинопатия, язва стопы, амилоидоз или почечная недостаточность, а также воспаление. Или указанный субъект может представлять собой индивидуум с болезнью Альцгеймера. В альтернативном варианте указанный субъект может быть раковым больным. Еще в других вариантах указанный субъект может представлять собой больного с системой красной волчанкой или с воспалительным волчаночным нефритом. Другие заболевания также могут быть опосредованы участием ВАСЕ и, в этой связи, могут лечиться с использованием белков слияния согласно настоящему изобретению. Так, в дополнительных альтернативных вариантах белки слияния согласно настоящему
- 25 012082 изобретению могут использоваться для лечения болезни Крона, артрита, васкулита, нефропатий, ретинопатии и нейропатий у человека или животного.
Терапевтически эффективное количество может включать собой такое количество, которое способно предупреждать взаимодействие КАСЕ с АСЕ или другими типами эндогенных лигандов КАСЕ у субъекта. Указанное количество может варьировать, в зависимости от субъекта, подлежащего лечению. Введение соединения может осуществляться ежечасно, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно или представлять собой разовое явление. В различных альтернативных вариантах эффективное количество белка слияния может находиться в диапазоне от примерно 1 нг/кг веса тела до примерно 100 мг/кг веса тела, или от примерно 10 мкг/кг веса тела до примерно 50 мг/кг веса тела, или от примерно 100 мкг/кг веса тела до примерно 100 мг/кг веса тела. Фактическое эффективное количество может быть установлено в экспериментах при определении зависимости дозы/ответ с использованием стандартных методик (бойпкоп е1 а1., ИгаЬеЕек, 42: 1179 (1993)). Так, в соответствии с общими известными положениями, эффективное количество может зависеть от биологической доступности соединения, его биологической активности и способности к биологической деградации.
Композиции
Настоящее изобретение может включать композицию, в состав которой входит белок слияния согласно настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Белок слияния может включать полипептид КАСЕ, присоединенный ко второму полипептиду, отличному от КАСЕ. В одном варианте белок слияния может включать сайт связывания лиганда КАСЕ. В данном варианте сайт связывания лиганда включает большую часть Ν-концевого домена белка слияния. Сайт связывания лиганда КАСЕ может включать V домен КАСЕ или его часть. В данном варианте сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8ЕО ΙΌ NО: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8ЕО ΙΌ NО: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей.
В одном варианте полипептид КАСЕ присоединен к полипептиду, включающему иммуноглобулиновый домен или часть (то есть фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте полипептид, включающий иммуноглобулиновый домен, включает по меньшей мере часть по меньшей мере одного из СН2 или СН3 доменов человеческого ΙβΟ.
Белок или полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ полной длины (например, 8ЕО ГО NО: 1) или фрагмент человеческого КАСЕ. В одном варианте полипептид КАСЕ не включает какихлибо остатков из сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может включать остатки на участке 1-22 или на участке 1-23 из КАСЕ полной длины (8ЕО ГО NО: 1). В альтернативных вариантах полипептид КАСЕ может включать последовательность, которая на 70, на 80 или на 90% идентична человеческому КАСЕ или его фрагменту. Например, в одном варианте полипептид КАСЕ может включать человеческий КАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или, в другом варианте, человеческий КАСЕ может включать КАСЕ полной длины с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕО ГО NО: 2 или 8ЕО ГО NО: 3, фиг. 1А и 1В) или часть указанной аминокислотной последовательности. Белки слияния согласно настоящему изобретению могут также включать кКАСЕ (например, 8ЕО ГО NО: 4), полипептид, который на 90% идентичен кКАСЕ, или фрагмент кКАСЕ. Например, полипептид КАСЕ может включать человеческий кКАСЕ или его фрагмент, где в качестве первого остатка присутствует, скорее, глицин, а не метионин (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или, в другом варианте, человеческий КАСЕ может включать кКАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕО ГО NО: 5 или 8ЕО ГО NО: 6, фиг. 1С) или часть указанной аминокислотной последовательности. В других вариантах белок КАСЕ может включать V домен (например, 8ЕО ГО NО: 7 или 8ЕО ГО NО: 8, фиг. 1Ό). Или, в другом варианте, может быть использована последовательность, которая на 90% идентична V домену или его фрагменту. Или, в другом варианте, белок КАСЕ может включать фрагмент КАСЕ, включающий часть V домена (например, 8ЕО ГО NО: 9 или 8ЕО ГО NО: 10, фиг. 1Ό). В одном варианте сайт связывания лиганда может включать 8ЕО ГО NО: 9 или последовательность, которая на 90% идентична ей, или 8ЕО ГО NО: 10 или последовательность, которая на 90% идентична ей. Еще в одном варианте фрагмент КАСЕ представляет собой синтетический пептид.
Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-116 из человеческого КАСЕ (8ЕО ГО NО: 7) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-116 из человеческого КАСЕ (8ЕО ГО NО: 8) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену КАСЕ. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 124-221 из человеческого КАСЕ (8ЕО ГО NО: 11) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую С1 домену КАСЕ. В другом варианте полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 227-317 из человеческого КАСЕ (8ЕО ГО NО: 12) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую С2 домену КАСЕ. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-123 из человеческого КАСЕ (8ЕО ГО NО: 13) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-123 из человеческого КАСЕ (8ЕО ГО NО: 14) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру в направлении считывания информации. Или, в
- 26 012082 другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-226 из человеческого КАСЕ (8ЕО ΙΌ N0: 17) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-226 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 18) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую V домену, С1 домену и междоменному линкеру, соединяющему оба указанных домена. Или, в другом варианте, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-339 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 5) или последовательность, которая на 90% им идентична, или аминокислоты на участке 24-339 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 6) или последовательность, которая на 90% им идентична, соответствующую кКАСЕ (то есть кодирующую V, С1 и С2 домены и междоменные линкеры). Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты каждой из указанных последовательностей.
Белок слияния может включать несколько типов пептидов, которые не были получены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид из белка слияния может включать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из тяжелой цепи любого известного изотопа: ΙβΟ (γ), ΙβΜ (μ), ΙβΌ (δ), кЕ (ε) или ΙβΛ (α). Дополнительно, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого известного подтипа тяжелой цепи: ΙβΟ1 (γ1), ΙβΟ2 (γ2), ΙβΟ3 (γ3), ΙβΟ4 (γ4), кА1 (α1), кА2 (α2), или на основе мутантов данных изотипов или подтипов, которые содержат мутации, изменяющие их биологическую активность. Второй полипептид может включать домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ1, или любую часть, или оба указанных домена. В качестве репрезентативных вариантов можно указать полипептид, включающий домены Сн2 и Сн3 из человеческого ΙβΟ1 или их часть, который может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40. Иммуноглобулиновый пептид может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 39 или 8Е0 ΙΌ N0: 41.
Ес часть цепи иммуноглобулина может обладать провоспалительной активностью ίη νίνο. Так, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению включает междоменный линкер, полученный из КАСЕ, но не из шарнира междоменной области полипептида, полученного из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте белок слияния на основе КАСЕ может также включать полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте Сн2 домен или его фрагмент может включать 8Е0 ΙΌ N0: 42.
В одном варианте полипептид КАСЕ включает междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к Юконцевой аминокислоте междоменного линкера и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, включающий Сн2 домен иммуноглобулина, может включать Сн2 и Сн3 домены из человеческого ΙβΟ1. В качестве репрезентативного варианта можно указать полипептид, включающий Сн2 и Сн3 домены из человеческого ΙβΟ1, который может включать 8Е0 ΙΌ N0: 38 или 8Е0 ΙΌ N0: 40.
Белок слияния согласно настоящему изобретению может включать один или множество доменов из КАСЕ. Кроме того, полипептид КАСЕ, включающий междоменный линкер, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, может включать фрагмент белка КАСЕ полной длины. Например, в одном варианте белок слияния согласно настоящему изобретению может включать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Белок слияния может включать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что Юконцевая аминокислота первого междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, Юконцевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера, Юконцевая аминокислота второго междоменного линкера присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего иммуноглобулиновый домена Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-251 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 19) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-251 из человеческого КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0: 20) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену, С1 домену, междоменному линкеру, связывающему два указанных домена, и второму междоменному линкеру в направлении считывания информации из С1. В одном варианте осуществления изобретения конструкция нуклеиновой кислоты, включающая 8Е0 ΙΌ N0: 30 или ее фрагмент, может кодировать четырехдоменный белок слияния на основе КАСЕ.
Альтернативно, трехдоменный белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из человеческого полипептида Ес. Например, белок слияния может включать один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего имму
- 27 012082 ноглобулиновый домен СН2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может включать аминокислоты на участке 23-136 из человеческого КАСЕ (БЕС ΙΌ N0: 15) или последовательность, которая на 90% идентична им, или аминокислоты на участке 24-136 из человеческого КАСЕ (БЕС ΙΌ N0: 16) или последовательность, которая на 90% идентична им, соответствующую V домену КАСЕ и междоменному линкеру, в направлении считывания информации. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты, включающая БЕС ΙΌ N0: 31 или его фрагмент, может кодировать трехдоменный белок слияния КАСЕ.
Фрагмент междоменного линкера КАСЕ может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии и, таким образом, присоединения к иммуноглобулиновому домену КАСЕ. Например, в случае V домена КАСЕ междоменный линкер может включать аминокислотную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из V домена. В одном варианте линкер может включать БЕС ΙΌ N0: 21, соответствующую аминокислотам на участке 117-123 КАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из БЕС ΙΌ N0: 21. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения междоменный линкер включает БЕС ΙΌ N0: 23, включающий аминокислоты на участке 117136 из КАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты БЕС ΙΌ N0: 21, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. В альтернативных вариантах линкер может включать последовательность, которая на 70, или на 80, или на 90% идентична БЕС ΙΌ N0: 21 или БЕС ΙΌ N0: 23.
В случае С1 домена КАСЕ линкер может включать пептидную последовательность, которая соответствует направлению считывания информации в природном состоянии из С1 домена. В одном варианте линкер может включать БЕС ΙΌ N0: 22, соответствующую аминокислотам на участке 222-251 из КАСЕ полной длины. Или, в другом варианте, линкер может включать пептид, содержащий дополнительные части из природной последовательности КАСЕ. Например, может использоваться междоменный линкер, включающий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) против направления или в направлении считывания информации из БЕС ΙΌ N0: 22. Или, в другом варианте, могут использоваться фрагменты БЕС ΙΌ N0: 23, содержащие делецию, например, из 1, 2 или 3 аминокислот с любого конца линкера. Например, в одном варианте междоменный линкер КАСЕ может включать БЕС ΙΌ N0: 24, соответствующую аминокислотам на участке 222-226. Или междоменный линкер может включать БЕС ΙΌ N0: 44, соответствующую аминокислотам на участке 318-342 из КАСЕ.
Фармацевтически приемлемые носители могут включать любые стандартные фармацевтически приемлемые носители, известные в данной области. Носитель может включать разбавитель. В одном варианте фармацевтический носитель может представлять собой жидкость и белок слияния или конструкция нуклеиновой кислоты могут быть представлены в виде раствора. В другом варианте фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество, имеющее вид порошка, лиофилизированного порошка или таблетки. Или, в другом варианте, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой гель, суппозиторий или крем. В альтернативных вариантах носитель может включать липосомы, микрокапсулы, клетку, инкапсулированную в полимер, или вирус. Так, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает, без ограничения, любые стандартные фармацевтически приемлемые носители, такие как вода, спирты, фосфатно-буферные солевые растворы, сахара (например, сахарозу или маннит), масла или эмульсии, такие как эмульсии типа вода-в-масле или триглицеридная эмульсия, различные типы увлажнителей, покрытые оболочкой таблетки и капсулы.
Введение белков слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может осуществляться разными способами. Так, введение белка слияния на основе КАСЕ согласно настоящему изобретению может осуществляться внутрибрюшинной (в/б) инъекцией. Альтернативно, белок слияния на основе КАСЕ может вводиться перорально, интраназально или в форме аэрозоля. В другом варианте введение представляет собой внутривенное введение (в/в). Белок слияния на основе КАСЕ может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществляют внутриартериальное введение белка слияния. В другом варианте введение осуществляется сублингвально. Кроме того, для введения могут использоваться капсулы с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозиториев и т. п. Например, может использоваться подкожное введение, которое полезно для лечения хронических заболеваний в тех случаях, когда желательно самостоятельное введение.
Фармацевтические композиции могут иметь вид стерильного инъецируемого раствора в нетоксичном парентерально приемлемом растворителе или носителе. В числе приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, следует указать воду, раствор Рингера, 3-бутандиол, изотонический раствор хлорида натрия или водные буферы, такие как, например, физиологически приемлемые цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буферы. Инъецируемый раствор может содержать стабилизаторы для предупреждения химического разложения и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать антиоксиданты, такие как бутилированный гидро
- 28 012082 ксианизол (БГА) и бутилированный гидрокситолуол (БГТ), буферы (цитраты, глицин, гистидин) или поверхностно-активные вещества (полисорбат-80, полоксамеры). Растворы могут также содержать противомикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Раствор может также содержать поверхностно-активные вещества (полисорбат-80, полоксамеры). Растворы могут также содержать поверхностно-активные вещества для снижения тенденции к агрегации, такие как полисорбат-80, полоксамер или другие поверхностно-активные вещества, известные в данной области. Раствор может также содержать другие добавки, такие как сахар(а) или солевой раствор, для коррекции осмотического давления композиции с целью достижения показателей, соответствующих крови человека.
Фармацевтические композиции могут иметь вид стерильного лиофилизированного порошка для инъекции, который восстанавливают разбавителем. Разбавитель может представлять собой воду для инъекций, бактериостатическую воду для инъекций или стерильный раствор соли. Лиофилизированный порошок может быть получен при лиофильной сушке раствора белка слияния с образованием сухого белка. Как известно в данной области, лиофилизированный белок, в основном, обладает повышенной стабильностью и более длительным сроком годности, чем жидкий раствор белка. Лиофилизированный порошок (высушенный осадок) может содержать буфер, применяемый для коррекции рН, такой как, например, физиологически приемлемый цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буфер. Лиофилизированный порошок может также содержать лиопротекторные вещества для поддержания его физической и химической стабильности. Обычно используемые лиопротекторы представляют собой нередуцирующие сахара и дисахариды, такие как сахароза, манит или трегалоза. Лиофилизированный порошок может содержать стабилизаторы для предупреждения химического разложения и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать, без ограничения, антиоксиданты (БГА, БГТ), буферы (цитраты, глицин, гистидин) или поверхностно-активные вещества (полисорбат-80, полоксамеры). Лиофилизированный порошок может также содержать противомикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Лиофилизированный порошок может также содержать поверхностно-активные вещества для снижения агрегации, такие как, без ограничения, полисорбат-80 и полоксамер. Лиофилизированный порошок может также содержать добавки (такие, как сахар(а) или насыщенный солевой раствор) для коррекции осмотического давления с целью достижения показателей, соответствующих крови человека, при восстановлении порошка. Лиофилизированный порошок может содержать агенты-наполнители, такие как сахара и дисахариды.
Фармацевтические композиции для инъекций могут также иметь вид маслянистой суспензии. Такая суспензия может быть получена по известным методикам с использованием подходящих диспергирующих агентов или увлажнителей и соответствующих агентов, применяемых для суспендирования. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные масла. Этой цели можно достичь за счет любого легкого жирного масла при использовании синтетических моно- или диглицеридов. Кроме того, масляные суспензии могут быть изготовлены при суспендировании активного ингредиента в растительном масле, например в арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или минеральном масле, таком как жидкий парафин. Например, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, нашли применение при изготовлении инъецируемых композиций. Масляные композиции могут содержать загуститель, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Такие композиции могут содержать в качестве консерванта добавку антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут также иметь вид эмульсии типа масло-в-воде или водных суспензий. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смесь. Приемлемые эмульгаторы могут включать природные камеди, например аравийскую камедь или трагакант, природные фосфатиды, например соевый лецитин, и сложные эфиры или частичные сложные эфиры, получаемые из жирных кислот и ангидридов гексита, например сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных частичных сложных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитан.
Водные суспензии могут также содержать активные соединения в смеси с эксципиентами. Такие эксципиенты могут включать суспендирующие агенты, например натрийкарбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксиприпилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийскую камедь; средства, способствующие диспергированию, или увлажнители, такие как природные фосфатиды, такие как лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида и длинноцепочечных алифатических спиртов, например гептадекаэтиленоксицитанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как, например, полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиэтиленсорбитанмоноолеат.
Диспергированные порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, могут давать активное соединение в смеси с диспергирующим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие консерванты, диспергирующие агенты и
- 29 012082 суспендирующие агенты описаны выше.
Композиции могут также иметь вид суппозиториев для реактального введения соединений согласно настоящему изобретению. Указанные композиции могут быть получены при смешивании лекарственного агента с подходящим нераздражающим эксципиентом, который представляет собой твердое вещество при обычных температурах, но который разжижается при ректальной температуре, расплавляясь, таким образом, в прямой кишке с высвобождением лекарственного вещества. Такие материалы включают, например, какао-масло и полиэтиленгликоли.
Для местного применения могут использоваться кремы, мази, гели, растворы или суспензии, содержащие соединения согласно настоящему изобретению. Средства для местного применения могут включать промывные жидкости для ротовой полости и горла. Могут использоваться подходящие консерванты, антиоксиданты, такие как БГА и БГТ, диспергирующие средства, поверхностно-активные вещества.
Соединения согласно настоящему изобретению могут также вводиться в виде липосомных систем доставки, таких как маленькие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы на основе множества фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемые соединения могут быть модифицированы для дальнейшего задержания клиренса из кровотока метаболическими ферментами. В одном варианте соединения могут быть модифицированы путем ковалентного присоединения водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры ПЭГ и пропиленгликоля, поливинилпирролидон или полипролин, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт и т.п. Такие модификации могут также повышать растворимость соединения в водном растворе. Полимеры, такие как ПЭГ, могут быть ковалентно присоединены к одному или нескольким реактивным аминокислотным остаткам, сульфгидрильным остаткам или карбоксильным остаткам. Могут быть использованы различные активированные формы ПЭГ, включая активные сложные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в частности такие, в которых удаляемые группы представляют собой N гидроксисукцинид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-3-сульфон, для реакции с аминогруппами, мультимодальные или галогенацетильные производные для реакции с сульфгидрильными группами и аминогидразиновые или гидразиновые производные для реакции с углеводными группами.
Дополнительные методики получения белковых композиций, которые могут использоваться в случае белков слияния согласно настоящему изобретению, описаны в патентах США № 6267958 и № 5567677.
В другом аспекте осуществления настоящего изобретения модуляторы КАСЕ согласно настоящему изобретению используют в адъювантной терапии (с другими средствами) или в комбинированной терапии вместе с другими известными терапевтическими агентами. Ниже приведен некоторый неисчерпывающий перечень вспомогательных средств и дополнительных терапевтических агентов, которые могут использоваться в сочетании с белками слияния на основе КАСЕ в качестве модулятора согласно настоящему изобретению.
Фармакологическая классификация противораковых агентов
1. Алкилирующие агенты: циклофосфамид, нитрозомочевина, карбоплатина, цисплатина, прокарбазин.
2. Антибиотики: блеомицин, даунорубицин, доксорубицин.
3. Антиметаболиты: метотрексат, цитарабин, фторурацил.
4. Растительные алкалоиды: винбластин, винкристин, этопозид, паклитаксел.
5. Гормоны: тамоксифен, октреотида ацетат, финастерид, флутамид.
6. Модификаторы биологического ответа: интерфероны, интерлейкины.
Фармакологическая классификация средств, применяемых при лечении ревматоидного артрита
1. Анальгетики: аспирин.
2. НСПВС (нестероидные противовоспалительные средства): ибупрофен, напроксен, диклофенак.
3. ЭМАКЭ (антиревматические средства, модифицирующие заболевание): метотрексат, препараты на основе золота, гидроксихлорохин, сульфасалазин.
4. Модификаторы биологического ответа, ЭМАКЭ: этанерцепт, инфликсимаб, глюкокортикоиды.
Фармакологическая классификация средств, применяемых для лечения сахарного диабета
1. Сульфонилмочевины: толбутамид, толазамид, глибурид, глипизид.
2. Бигуаниды: метформин.
3. Другие пероральные агенты: акарбоза, троглитазон.
4. Инсулин.
Фармакологическая классификация средств, применяемых при лечении болезни Альцгеймера
1. Ингибитор холиностеразы: такрин, донепезил.
2. Антипсихотические препараты: галоперидол, тиоридазин.
3. Антидепрессанты: Дезипрамин, Флуоксетин, Тразодон, Пароксетин;
4. Противосудорожные препараты: карбамазепин, вальпроевая кислота.
- 30 012082
В одном варианте настоящее изобретение также относится к способу лечения заболеваний, опосредованных КАСЕ, где указанный способ включает введение субъекту, при наличии такой необходимости, терапевтически эффективного количества белка слияния на основе КАСЕ в сочетании с терапевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, растительных алкалоидов, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологического ответа, анальгетиков, НСПВС, ЭМАКО, глюкокортикоидов, сульфонилмочевин, бигуанидов, инсулина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических препаратов, антидепрессантов и противосудорожных препаратов. В другом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, которая также включает один или несколько терапевтических агентов, выбранных из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, растительных алкалоидов, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологического ответа, анальгетиков, НСПВС, ЭМАИО, глюкокортикоидов, сульфонилмочевин, бигуанидов, инсулина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических препаратов, антидепрессантов и противосудорожных препаратов.
Примеры
Особенности и преимущества настоящего изобретения, определяемые изобретательской стадией, ниже поясняются приведенными примерами.
Пример 1. Получение белков слияния КАСЕ-1дС Бс.
Конструируют две плазмиды, экспрессирующие белки слияния КАСЕ-1дС Бс. Обе плазмиды конструируют путем лигирования последовательности 5'-кДНК разной длины из человеческого КАСЕ с такой же 3'-кДНК последовательностью из человеческого 1дС Бс (γ1). Указанные последовательности экспрессии (то есть продукты лигирования) затем встраивают в вектор экспрессии рс^NА3.1 (1пу11годеп, СА). Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют кодирующий участок белка слияния, показаны на фиг. 2 и 3. В случае белка слияния ТТР-4000 последовательность нуклеиновой кислоты от 1 до 753 (выделено жирным шрифтом) кодирует Ν-концевую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты от 754 до 1386 кодирует белковую последовательность 1дС Бс (фиг. 2). В случае ТТР-3000 последовательность нуклеиновой кислоты от 1 до 408 (выделена жирным шрифтом) кодирует Ν-концевую белковую последовательность КАСЕ, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты от 409 до 1041 кодирует белковую последовательность 1дС Бс (фиг. 3).
Для получения белков слияния на основе КАСЕ вектор экспрессии, включающий последовательности нуклеиновой кислоты 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 31, подвергают стабильной трансфекции в клетки СНО. Положительные трансформанты отбирают по устойчивости к неомицину, придаваемой плазмидой, и далее клонируют. Высокопродуцирующие клоны, по данным вестерн-блоттинг анализа супернатанта, размножают и генный продукт очищают аффинной хроматографией на колонках с белком
А. Экспрессию оптимизируют так, чтобы клетки продуцировали рекомбинантный ТТР-4000 на уровне примерно 1,3 г/л.
Экспрессированные полипептиды, кодирующие два белка слияния, показаны на фиг. 4-6. В четырехдоменной структуре ТТР-4000 первые 251 аминокислот (выделенные жирным шрифтом на фиг. 4) содержат сигнальную последовательность (1-22/23), V иммуноглобулиновый (и связываемый лиганд) домен (23/24-116), второй междоменный линкер (117-123), второй иммуноглобулиновый домен (СН1) (124-221) и второй линкер (222-251) из человеческого белка КАСЕ (фиг. 4, 6В). Последовательность на участке от 252 до 461 включает иммуноглобулиновые домены СН2 и СН3 из 1дС.
В трехдоменной структуре ТТР-3000 первые 136 аминокислот (выделенные жирным шрифтом) содержат сигнальную последовательность (1-22/23), V иммуноглобулиновый домен (и связываемый лиганд) (23/24-116) и последовательность междоменного линкера (117-136) из человеческого белка КАСЕ (фиг. 5, 6В). Дополнительно, ТТ3 последовательность на участке от 137 до 346 включает иммуноглобулиновые домены СН2 и СН3 из 1дС.
Пример 2. Способ тестирования активности белка слияния КАСЕ-1дС1.
А. Связывание лиганда ш νίΐΓΟ.
Известные лиганды для КАСЕ наслаивают на поверхность планшетов (МахкогЬ) в концентрации 5 мкг/ячейку. Планшеты инкубируют в течение ночи при температуре 4°С. После инкубации лиганда содержимое планшетов отсасывают, и добавляют блокирующий буфер, содержащий 1% БСА в 50 мМ имидазольном буфере (рН 7,2), и оставляют планшеты на 1 ч при комнатной температуре. Затем содержимое планшетов отсасывают и/или промывают промывочным буфером (20 мМ имидазола, 150 мМ №С1, 0,05% Твин-20, 5 мМ СаС12 и 5 мМ МдС12, рН 7,2). Готовят раствор ТТР-3000 (ТТ3) с исходной концентрацией 1,082 мг/мл и раствор ТТР-4000 (ТТ4) с исходной концентрацией 370 мкг/мл. Добавляют белок слияния с возрастающими разбавлениями исходного образца. Белок слияния на основе КАСЕ оставляют для инкубации с иммобилизованным лигандом при температуре 37°С в течение 1 ч, после чего планшет промывают и анализируют связывание белка слияния. Связывание выявляют при добавлении комплекса для иммунологического выявления, содержащего моноклональный мышиный 1дС1 против человеческого фактора, в разбавлении 1:11000, до конечной концентрации в тесте (БАС) 21 нг/100 мкл, биотинилированный козий противомышиный 1дС, в разбавлении 1:500, до значения БАС 500 нг/мкл и щелочную фосфатазу, связанную с авидином. Комплекс инкубируют с иммобилизованным белком слияния в тече
- 31 012082 ние 1 ч при комнатной температуре, после чего планшет промывают и добавляют субстрат для щелочной фосфатазы паранитрофенилфосфат (ПНФФ). Связывание комплекса с иммобилизованным белком слияния оценивают количественно путем измерения превращения ПНФФ в паранитрофенол (ПНФ), проводя измерения на спектрофотометре при длине волны 405 нм.
Как показано на фиг. 7, белки слияния ТТР-4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ТТ3) специфически взаимодействуют с известными лигандами ВАСЕ-амилоид-бета (АЬе!а), 8100Ь (8100) и амфотерином (АтрЬо). В отсутствие лиганда, то есть при нанесении покрытия только лишь из БСА (БСА или БСА+промывная жидкость), не отмечается повышения поглощения над уровнем неспецифического связывания комплекса для иммунологического выявления. В случае использования амилоида-бета в виде меченого лиганда может возникнуть необходимость провести предварительную инкубацию амилоида-бета перед тестированием. Предварительная инкубация может сделать возможной самоагрегацию амилоида-бета с образованием формы складчатой пластинки, поскольку амилоид-бета может предпочтительно связываться с ВАСЕ со структурой складчатой пластинки.
Дополнительные доказательства наличия специфического взаимодействия между белками слияния на основе ВАСЕ, ΤΤΡ-4000 и ТТР-3000 с лигандами ВАСЕ приведены в примерах исследования, результаты которых показали, что лиганд ВАСЕ способен эффективно конкурировать с известным лигандом ВАСЕ за связывание с белками слияния. В этих исследованиях амилоид-бета (Ав) иммобилизуют на планшете Максисорб (МахщогЬ) и добавляют белок слияния, как было указано выше. Кроме того, лиганд ВАСЕ добавляют к некоторым ячейкам в то же время, что и белок слияния.
Было показано, что лиганд ВАСЕ может блокировать связывание ΤΤΡ-4000 (ΤΤ4) примерно на 2530%, где ТТР-4000 присутствует на уровне 123 мкг/мл (разбавление 1:3, фиг. 8). В том случае, когда исходный раствор ТТР-4000 разбавляет в 10 или 30 раз (1:10 или 1:30), связывание белка слияния с иммобилизованным лигандом полностью ингибируется лигандом ВАСЕ. Аналогично, лиганд ВАСЕ блокирует связывание ТТР-3000 (ТТ3) примерно на 50%, если ТТР-3000 присутствует на уровне 360 мкг/мл (разбавление 1:3, фиг. 9). В том случае, когда исходная концентрация ТТР-3000 разбавляется в 10 раз (1:10), связывание белка слияния с иммобилизованным лигандом полностью ингибируется лигандом ВАСЕ. Таким образом, специфичное связывание белка слияния на основе ВАСЕ с лигандом ВАСЕ является зависимым от дозы. Кроме того, как показано на фиг. 8 и 9, по существу, не выявляется связывания в отсутствие белка слияния, то есть с использованием только комплекса для иммунологического выявления (параметр «один комплекс»).
В. Оценка эффекта белков слияния на основе ВАСЕ в клеточном тесте.
В предшествующей работе было показано, что миелоидные клетки ТНР-1 могут секретировать Т№-а в ответ на введение лигандов ВАСЕ. В данном тесте клетки ТНР-1 культивируют в среде КРМЕ 1640 с добавкой 10% ФСТ, по протоколу АТСС. Клетки индуцируют для секреции Т№-а путем стимуляции ВАСЕ с использованием 0,1 мг/мл 8100Ь как в отсутствие, так и при наличии белков слияния ТТР3000 (ТТ3) или ТТР-4000 (ТТ4) (10 мкг), кВАСЕ (10 мкг) и человеческого ΙβΟ (10 мкг) (в качестве негативного контроля). Количество Τ№-α, секретированного клетками ТНР-1, измеряют через 2 ч после добавления белков к клеточной культуре с использованием коммерчески доступного набора для ЕЫ8А для оценки Т>-« (В&П кук!етк, М1ппеаро11к, М№). Результаты, показанные на фиг. 10, демонстрируют, что белки слияния ингибируют в этих клетках продукцию Τ№-α, индуцированную 8100Ь/ВАСЕ. Как видно из фиг. 10, при добавлении 10 мкг белка слияния на основе ВАСЕ, ТТР-3000 или ТТР-4000 индукция Т№-а под действием 8100Ь (0,1 мг/мл РАС) снижается примерно на 45-70%, соответственно. Белок слияния ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, столь же эффективен по блокированию индукции Т№α под действием 8100Ь, как и кВАСЕ (фиг. 10). Специфичность ингибирования последовательностей под действием ТТР-4000 и ТТР-3000 показана в рамках экспериментов, в которых добавляют один Ι§Ο к 8100Ь-стимулированным клеткам. Добавление ΙβΟ и 8100Ь к системе для тестирования показывает, что Т№-а находится на том же уровне, что и при добавлении одного 8100Ь. Специфичность ингибирования индукции ΤNР-α под действием ТТР-4000 и ТТР-3000 для последовательностей ВАСЕ в белке слияния показана в эксперименте, в рамках которого добавляют один Ι§Ο к 8100Ь-стимулированным клеткам. Можно видеть, что добавление ΙβΟ. то есть человеческого ΙβΟ. без ВАСЕ последовательности (человеческий Ι§Ο 81дта, вносимый в количестве 10 мкг/ячейка) и 8100Ь к системе для тестирования дают те же самые уровни Т№-а, что и добавление одного 8100Ь.
Пример 3. Фармакокинетический профиль ТТР-4000.
Для определения того, демонстрирует ли ТТР-4000 лучший фармакокинетический профиль в сравнении с человеческим кВАСЕ, крысам и приматам, отличным от человека, вводят внутривенной (в/в) инъекцией ТТР-4000 (5 мг/кг), после чего оценивают в плазме наличие ТТР-4000. В этих экспериментах двум самцам обезьян, ранее не принимавшим препарат, вводят однократную дозу в/в болюса ТТР-4000 (5 мг/мл/кг) в периферическую вену, после чего вливают примерно 1,0 мл солевого раствора. Отбирают образцы крови (примерно по 1,0 мл) до введения дозы (то есть до инъекции ТТР-4000) или через 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 и 336 ч после введения дозы в две пробирки, содержащие литий-гепарин. После отбора пробирки помещают на влажный лед (максимум, на 30 мин) и затем
- 32 012082 центрифугируют с охлаждением (при температуре от 2 до 8°С) при 1500/д в течение 15 мин. Затем каждый отобранный образец плазмы замораживают для хранения (при температуре -70±10°С) до тестирования полипептида ВАСЕ по методу ЕШЗА в разные временные точки после инъекции, как показано в примере 6.
Кинетический профиль, приведенный на фиг. 1, показывает, что, как только ТТР-4000 насыщает свои лиганды, что отмечается по очень крутому углу наклона в альфа-фазе у 2 животных, сохраняется его конечный период полувыведения выше чем 300 ч. Указанный период полувыведения существенно выше, чем период полувыведения человеческого кВАСЕ в плазме (в основном, равный примерно 2 ч), что дает возможность проводить однократные инъекции по острым и субхроническим показаниям. Каждая из прямых, приведенных на фиг. 11, относится к разным животным в одних и тех же экспериментальных условиях.
Пример 4. ТТР-4000-активация Ес.
Проводят эксперименты для определения уровня активации Ес рецептора белком слияния на основе ТНР-1 ТТР-4000 в сравнении с человеческим ΙβΟ. Активацию Ес рецептора определяют при измерении секреции ЮТ-а из клеток ТНР-1, которые экспрессируют Ес рецептор. В указанных экспериментах на ячейки 96-ячеечных планшетов наслаивают по 10 мкг/ячейку ТТР-4000 или человеческий ΙβΟ. Стимуляция Ес приводит к секреции Т\Е-а. Количество ЮТ-а определяют в рамках иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЫ8А).
В рамках данного теста миелоидную клеточную линию, ТНР-1 (АТТС#ТГВ-202) поддерживают в среде ΒΡΜΙ-1640 с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка по инструкции АТСС. В типичном случае 40000-80000 клеток на ячейку индуцируют секрецию Т№-альфа через стимуляцию Ес рецептора при внесении предварительного покрытия на ячейку в количестве 10 мкг/ячейку агрегированного под действием тепла (63°С в течение 30 мин) ТТР-4000 или человеческого Ι§61. Количество ЮТ-альфа, секретированного ТНР-1 клетками, определяют в супернатантах, отобранных из 24-часовых культур клеток в обработанных ячейках с использованием коммерчески доступного набора для определения ТСТ-альфа методом ЕЫЗА (В&Ц 8ук1етк, М1ппеаро11к, ΜN # ОТА00С) в соответствии с приведенными инструкциями.
Полученные результаты приведены на фиг. 12, из которых видно, что ТТР-4000 генерирует меньше чем 2 нг/ячейку ТНЕ, а ΙβΟ генерирует более чем 40 нг/ячейку.
Пример 5. Активность ТТР-4000 ίη νίνο.
Активность ТТР-4000 сравнивают с кВАСЕ на нескольких моделях ίη νίνο заболевания человека.
A. ТТР-4000 на модели рестеноза у животного.
Белок слияния на основе ВАСЕ, ТТР-4000, оценивают на модели рестеноза у диабетических крыс, при этом производят измерения уровня пролиферации гладких мышц и размножение интимы через 21 день после повреждения сосудов. В рамках данных экспериментов проводят балонное повреждение левой общей сонной артерии у крыс 2искег с диабетом и без диабета по стандартной процедуре. Вводят нагрузочную дозу (3 мг/крысу) ΙβΟ, ТТР-4000 или фосфатно-буферного раствора (ФБР) внутрибрюшинно (в/б) за день до повреждения. Поддерживающую дозу вводят через день до момента 7 дня после повреждения (то есть в дни 1, 3, 5 и 5 после повреждения). Поддерживающую дозу устанавливают высокой, =1 мг/животное, для одной группы, или низкой, =0,3 мг/животное, для второй группы. Для измерения уровня пролиферации гладкомышечных клеток сосудов (У8МС) животных умерщвляют в период от 4 до 21 дня после повреждения.
Для измерения уровня пролиферации клеток животным на 4 день вводят внутрибрюшинной инъекцией бромдезоксиуридин (ВЮби) в дозе 50 мг/кг за 18, 12 и 2 ч до эвтаназии. После умерщвления у животных отбирают целиком левую и правую сонные артерии. Образцы хранят в н1кЮс1ю1се в течение 24 ч до последующей обработки. Оценку пролиферации V8ΜС проводят с использованием мышиного антиВгбИ моноклонального антитела. Вносят флуоресцентно меченое козье противомышиное вторичное антитело. Подсчитывают количество В гби-положительных ядер на срез в рамках слепого теста относительно режима лечения двумя наблюдателями.
Оставшихся крыс умерщвляют в 21 день для проведения морфометрического анализа. Морфометрический анализ проводят в рамках слепого теста относительно исследуемых групп с использованием компьютерного программного обеспечения для цифровой микроскопической планиметрии ^аде-Рго Р1ик с использованием серийных срезов (взятых на расстоянии 5 мм) сонных артерий, окрашенных красителем Vаη ^е^п. Все данные выражают в виде среднего значения±стандартное отклонение (СО). Статистический анализ проводят с использованием программного обеспечения 8Р88. Непрерывные варьирующие параметры сравнивают с использованием непарного ΐ-теста. Величины Р<0,05 рассматривают как статистически значимые.
Как показано на фиг. 13А и 13В, обработка с использованием ТТР-4000 существенно снижает соотношение интима/среда и пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов зависимым от дозы образом. На фиг. 13В ось у обозначает количество ВгбИ-пролиферирующих клеток.
B. ТТР-4000 на модели животных с БА.
Проводят эксперименты для оценки того, может ли ТТР-4000 влиять на образование амилоида и по
- 33 012082 знавательную дисфункцию, на модели мышей с БА. В экспериментах используют трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий мутантный 8\\ό6ι81ι амилоидный белок-предшественник (АРР) под контролем промотора РЭСЕ-В цепи. С течением времени указанные мыши образуют высокие уровни лиганда ВАСЕ, амилоид-бета (Ав). Ранее было показано, что обработка кВАСЕ в течение 3 месяцев снижает и образование амилоидных бляшек в мозге и связанное с ним повышение уровня воспалительных маркеров, в рамках данной модели.
Используемые в данном эксперименте мыши (АРР) (самцы) были получены в результате микроинъекций человеческого гена АРР (при наличии мутации 8\\ό6ι81ι апб Ьопбои) в яйца мышей под контролем генного промотора цепи В фактора роста тромбоцитов (РЭСЕ-В). Мышей получают на основе С57ВЬ/6 и растят в условиях Мо1еси1аг ТИегареиеИск Шс. Животных кормят аб ИЬИшп и содержат при спаривании по принципу брат-сестра. У полученных с использованием такой конструкции мышей наблюдается отложение амилоида, начиная с 6 месяца жизни. Животных растят до 6-месячного возраста и затем выдерживают в течение 90 дней, после чего умерщвляют для подсчета уровня амилоида.
Трансгенным мышам АРР вводят носитель ТТР-4000 через день |с.|об (в/б)] в течение 90 дней, начиная с 6-месячного возраста. В конце эксперимента животных умерщвляют и выявляют наличие Ав бляшек в мозге (то есть определяют количество бляшек). Используют также 6-масячный контроль для группы АРР для определения базового уровня отложения амилоида. Кроме того, в конце исследования животных подвергают бихевиоральному анализу (тест Морриса с лабиринтом в воде (Мотк \\'а1ег тахе)). Исследователи проводят эксперимент вслепую относительно соединений, используемых в исследовании. Образцы вводят мышам в количестве 0,25 мл/мышь через день. Дополнительно одной группе мышей вводят 200 мкг/день человеческого кВАСЕ.
1. Отложение бета-амилоида.
Для гистологического исследования животных подвергают анестезии путем внутрибрюшинной инъекции (в/б) пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Животных подвергают транскардиальной перфузии при температуре 3°С фосфатно-буферным раствором (ФБР) и затем 4% параформальдегидом. У животных отбирают мозг и помещают на ночь в 4% параформальдегид. Затем мозг животных обрабатывают парафином и готовят для гистологического анализа. Получают из мозга 10 серийных срезов толщиной 30 мкм. Срезы подвергают инкубации с первичным антителом в течение ночи при 4°С (антитело против Ав пептида) для выявления отложения амилоида в мозге трансгенных животных (Сио е1 а1., №иго8ск, 22: 5900-5909 (2002)). Срезы промывают в трис-буферном солевом растворе (ТВ8) и добавляют вторичное антитело, после чего инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки срезы инкубируют согласно инструкции, прилагаемой к набору УесЮг АВС Е1бе (УесЮг ЬаЬогаШпек), и окрашивают диаминобензойной кислотой (ΌΛΕ). Реакцию останавливают в воде и наслаивают после обработки ксилол. Область амилоида в каждой среде определяют с помощью компьютерного системного визуального анализа, состоящего из компьютера Ро\\ег МастЮкй снабженного картой Ошск СарШте Егате дгаЬЬег сагб, камерой нбасЫ ССЭ, вмонтированный в микроскоп 01утрик, и инсталлированной камерой. Используют программное обеспечение Мн Ийаде Аиа1у818 8ой^аге, ν. 1.55. Получают снимки и определяют общую площадь амилоида в десяти срезах. Все измерения проводит один оператор в слепом эксперименте относительно статуса лечения. Суммирование объемов амилоида в срезах с последующим делением полученного значения на общее число срезов позволяет рассчитать объем амилоида.
Для количественного анализа используют иммуноферментный твердофазный анализ (ЕЫ8А), который позволяет измерить уровень общего человеческого Ав, Ав±о±а1 и Ав1-42 в мозге трансгенных мышей АРР (Вюкоигсе [гИегпабопаИ СатагШо, СА). АвМа1 и Ав1-42 экстрагируют из мозга мышей с использованием гуанидингидрохлорида и подсчитывают по методике производителя. Данный анализ позволяет экстрагировать общий Ав пептид из мозга (и растворимый, и агрегированный).
2. Распознавательная функция.
Тест Морриса с лабиринтом в воде проводят следующим образом. Всех мышей исследуют 1 раз в тесте Морриса с лабиринтом в воде в конце эксперимента. Мышей тренируют в открытом водном лабиринте длиной 1,2 м. Бассейн наполняют до глубины 30 см водой и поддерживают при температуре 25°С. Спасательную платформу (10 см2) помещают на 1 см ниже поверхности воды. Во время испытаний платформу убирают из бассейна. Сигнальный тест проводят в бассейне, окруженном белыми шторами, для того, чтобы скрыть какие-либо другие знаки за пределами лабиринта. Всех животных подвергают предварительно тренировке Щ8Р) в течение 3 последовательных дней. Указанные испытания подготавливают животных к финальному бихевиоральному тесту для определения сохранения информации в памяти с целью отыскания платформы. Данные испытания не записываются, но проводятся только для целей тренировки. Для тренировочных и обучающих исследований шторы удаляют за пределы лабиринта (что позволяет идентифицировать животных с недостатками в плавании). На день 1 животных помещают на скрытую платформу на 20 с (испытание 1), для испытаний оставляют 2-3 животных в воде на расстоянии 10 см от знака платформы или скрытой платформы (испытание 4) и позволяют им плыть к платформе. На второй день испытаний скрытую платформу передвигают случайным образом на участке между центром бассейна или центром каждого квадрата. Животных оставляют в бассейне перед стеной и позво
- 34 012082 ляют им в течение 60 с достичь платформы (3 испытания). В рамках третьего испытания животным дают три попытки: две со скрытой платформой и одну с видимой платформой. Через 2 дня после Н8Р животных подвергают финальным бихевиоральным испытаниям (тест Морриса с водным лабиринтом). В ходе указанных испытаний (по три на каждое животное) платформу помещают в центре квадрата бассейна и животных оставляют перед стеной в произвольном порядке. Животным дают возможность отыскать платформу или плыть в течение 60 с (латентный период, время, которое нужно для того, чтобы отыскать платформу). Всех животных тестируют в течение 4-6 ч введения дозы и отбирают случайным образом для тестирования операторам в рамках слепого эксперимента относительно группы тестирования.
Результаты выражают в виде среднего значения±стандартное отклонение (СО). Значимость различий в уровне амилоида и бихевиоральном поведении анализируют с использованием ΐ-теста. Сравнение проводят между контрольной группой 6-месячных мышей АРР и животных, обработанных с использованием ТТР-4000, а также между группой 9-месячных мышей АРР, получавших носитель, и животными, получавшими ТТР-4000. Различия ниже 0,05 рассматриваются как значимые. Для сравнения определяют процентные показатели изменений в уровне амилоида и в поведении и суммируют данные по каждой группе с последующим делением (например, 1 в/б/6-месячный контроль=% изменений).
На фиг. 14А и 14В показано, что мыши, которым в течение 3 месяцев вводили ТТР-4000 или мышиный кКАСЕ, имеют сниженное количество Ав бляшек и характеризуются меньшей распознавательной дисфункцией, чем животные, обработанные носителем и негативным контрольным человеческим ΙβΟ1 (ΙβΟ1). Эти данные указывают на то, что ТТР-4000 эффективен на трансгенной модели мышей в плане снижения БА патологии. Было также показано, что, как и кКАСЕ, ТТР-4000 модет снижать уровень воспалительных цитокинов ГС-1 и ТИЕ-а (данные не приведены).
С. Эффективность ТТР-4000 на модели животных с инсультом.
ТТР-4000 также сравнивают с кКАСЕ на релевантной модели животных с инсультом. В рамках данной модели среднюю сонную артерию мышей лигируют в течение 1 ч и затем проводят реперфузию в течение 23 ч, после чего мышей умерщвляют и определяют зону некроза в мозге. Мышам дают кКАСЕ, или ТТР-4000, или контрольный иммуноглобулин непосредственно перед реперфузией.
В рамках данных экспериментов самцам мышей С57ВЬ/6 инъецируют носитель в дозе 250 мкл/мышь или исследуемый ТТР препарат (ТТР-3000, ТТР-4000, в дозе 250 мкл/мышь). Мышам проводят внутрибрюшинную инъекцию через 1 ч после начала ишемии. Далее мышей подвергают одночасовой церебральной ишемии, после чего в течение 24 ч проводят реперфузию. Для индукции ишемии каждую мышь подвергают анестезии и поддерживают температуру на уровне 36-37°С за счет внешнего нагрева. Левую общую сонную артерию (ОСА) обнажают путем разреза на шее. Помещают микрохирургический зажим вокруг начала внутренней сонной артерии ДСА). Дистальный конец ЕСА лигируют шелковой нитью и делают поперечный разрез. Шелковую нить размером 6-0 завязывают некрепко вокруг культи ЕСА. Отполированный в огне кончик нейлоновой нити осторожно вставляют в культю ЕСА. Петлю из шелка 6-0 затягивают вокруг культи и нейлоновую нить проталкивают внутрь и через внутреннюю сонную артерию ДСА), пока она не останется в передней мозговой артерии, что приводит к окклюзии передней соединительной и средней мозговой артерий. После того как нейлоновая нить продержится таким образом в течение 1 ч, животных подвергают анестезии, отмечают ректальную температуру, удаляют нить и зашивают разрез.
Зону некроза определяют при анестезии животных внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг) и затем отбирают мозг. Мозг разрезают на четыре среза по 2 мм вдоль зоны некроза и помещают на 30 мин в 2% хлорида трифенилтетразолия (ТТС). После этого срезы помещают на ночь в 4% параформальдегид. Определяют зону некроза в каждом срезе с помощью компьютерной системы, включающей компьютер Ро\уег МаспИокН. снабженного картой Ошск СарФге Егаше дгаЬЬег сагб и установленной камерой НйасЫ ССЭ. Используют программное обеспечение NIΗ Ийаде Апа1укк 8ойтаге, ν. 1.55. Получают снимки и в срезах определяют общую площадь некроза. Все измерения проводит один оператор, работающий в рамках слепого эксперимента относительно вариантов тестирования. Суммирование объемов инфаркта в срезах дает общий объем некроза. Результаты выражают в виде среднего значения±стандартное отклонение (СО). Значимость различий в данных по объему некроза анализируют с использованием ΐ-теста.
Как показывают данные табл. 2, ТТР-4000 был более эффективным, чем кКАСЕ, по ограничению зоны некроза у исследованных животных, что позволяет полагать, что ТТР-4000, в связи с его лучшими показателями полупериода выведения из плазмы, способен оказывать лучшую защиту у данных мышей.
Пример 6. Выявление методом ЕЫ8А белка слияния на основе КАСЕ.
Вначале наслаивают на ячейки планшета 50 мкл специфичного к КАСЕ моноклонального антитела 1НВ1011 в концентрации 10 мкг/мл в 1х ФБР, рН 7,3, и проводят инкубацию в течение ночи. Как только планшеты становятся готовыми для использования, их промывают 3 раза 30 мкл промывочного буфера 1 х имидазол-Твин и проводят блокирование, добавляя 1% БСА. Образцы (разбавленные) и стандартные разведения известных разбавлений ТТР-4000 добавляют до конечного объема 100 мкл. Образцы оставляют для инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубации планшеты промывают
- 35 012082 раза. Добавляют козий ЦС1 для человека (Б1дта А3312) АР конъюгат в 1х ФБР с добавкой 1% БСА и оставляют для инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывают 3 раза. Окраску проявляют с использованием паранитрофенилфосфата.
Пример 7. Количественное определение связывания лиганда КАСЕ с белком слияния на основе КАСЕ.
На фиг. 15 приведены кривые по насыщению связывания ТТР-4000 с разными иммобилизованными известными лигандами КАСЕ. Лиганды иммобилизуют на микротитрационном планшете и инкубируют в присутствии возрастающих концентраций белка слияния, от 0 до 360 нМ. Взаимодействие белка слияния-лиганда выявляют с использованием поликлонального антитела, конъюгированного с щелочной фосфатазой, которое специфично для ЦС части химерного белка. Соответствующее значение Кб вычисляют с использованием программного обеспечения Сгарйраб Рпхш и сравнивают с известными литературными данными для КАСЕ и лиганда КАСЕ. нМС1В = Амфотерин, СМЬ = карбоксиметиллизин, А бета = Амилоид-бета 1-40.
Приведенное выше описание рассматривается лишь как иллюстративное для пояснения принципа изобретения. Для специалистов в данной области будет понятна возможность множества модификаций и изменений, и приведенное описание не ограничивает изобретение конкретными вариантами его реализации, но все подходящие модификации и эквиваленты охватываются областью прилагаемой формулы изобретения и соответствуют изобретательской стадии настоящего изобретения.
Claims (35)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Белок слияния, включающий полипептид КАСЕ, непосредственно присоединенный к полипептиду, включающему СН2 домен иммуноглобулина или часть СН2 домена иммуноглобулина, где полипептид КАСЕ включает сайт связывания лиганда и где белок слияния не содержит шарнирной области Ес иммуноглобулина.
- 2. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что:(a) белок слияния включает междоменный линкер, происходящий из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, происходящий из иммуноглобулина; или (b) белок слияния включает (ί) междоменный линкер КАСЕ, который разделяет домены V и С1 КАСЕ, или (ίί) линкер, который разделяет домены С1 и С2 КАСЕ, расположенные в шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина; или (c) белок слияния получен удалением шарнирной области Ес иммуноглобулина и заменой ее на полипептид КАСЕ.
- 3. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что полипептид КАСЕ включает междоменный линкер КАСЕ, присоединенный к иммуноглобулиновому домену КАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к Юконцевой аминокислоте междоменного линкера КАСЕ и С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к N концевой аминокислоте полипептида, включающего Сн2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домена иммуноглобулина.
- 4. Белок слияния по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что белок слияния включает первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, присоединенный ко второму иммуноглобулиновому домену КАСЕ и второму междоменному линкеру КАСЕ, так что Юконцевая аминокислота первого междоменного линкера КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, Юконцевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте первого междоменного линкера КАСЕ, Юконцевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ присоединена к С-концевой аминокислоте второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно присоединена к Юконцевой аминокислоте иммуноглобулинового домена СН2 или части СН2 домена иммуноглобулина.
- 5. Белок слияния по п.4, отличающийся тем, что второй междоменный линкер КАСЕ, непосредственно присоединенный к иммуноглобулиновому домену СН2 или к части иммуноглобулинового домена Сд2, включает аминокислотную последовательность, представленную в БЕС ΙΌ N0: 22, или последовательность, которая на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в БЕС ΙΌ N0: 24, или последовательность, которая на 90% ей идентична.
- 6. Белок слияния по пп.1-3, отличающийся тем, что полипептид КАСЕ представляет собой один иммуноглобулиновый домен КАСЕ, присоединенный через междоменный линкер КАСЕ к Юконцевой аминокислоте полипептида, включающего СН2 иммуноглобулиновый домен или часть Сн2 домена иммуноглобулина.
- 7. Белок слияния по п.6, отличающийся тем, что междоменный линкер КАСЕ, непосредственно присоединенный к СН2 иммуноглобулиновому домену или части СН2 домена иммуноглобулина, включает аминокислотную последовательность, представленную в БЕС ΙΌ N0: 21, или последовательность, которая на 90% ей идентична, или аминокислотную последовательность, представленную в БЕС ΙΌ N0: 23, или последовательность, которая на 90% ей идентична.- 36 012082
- 8. Белок слияния по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что сайт связывания лиганда КАСЕ включает 8ЕС ΙΌ N0: 9 или последовательность, которая на 90% ей идентична, или 8ЕС ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая на 90% ей идентична.
- 9. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что полипептид КАСЕ включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 5, 8ЕС ΙΌ N0: 6, 8ЕС ΙΌ N0: 7, 8ЕС ΙΌ N0: 8, 8ЕС ΙΌ N0: 13, 8ЕС ΙΌ N0: 14, 8ЕС ΙΌ N0: 15, 8ЕС ΙΌ N0: 16, 8ЕС ΙΌ N0: 17, 8ЕС ΙΌ N0: 18, 8ЕС ΙΌ N0: 19 или 8ЕС ΙΌ N0: 20.
- 10. Белок слияния по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность полипептида КАСЕ представлена в 8ЕС ΙΌ N0: 15, 8ЕС ΙΌ N0: 16, 8ЕС ΙΌ N0: 19 или 8ЕС ΙΌ N0: 20.
- 11. Белок слияния по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что полипептид дополнительно включает СН3 домен иммуноглобулина или его часть.
- 12. Белок слияния по п.11, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность полипептида, включающая Сн2 домен иммуноглобулина или часть Сн2 домена иммуноглобулина, представляет собой или включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 38.
- 13. Белок слияния по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из ΙβΛ. ΙβΩ. !дЕ, [дС и Ι§Μ.
- 14. Белок слияния по п.13, отличающийся тем, что иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из Ι§Ά1, Ι^ΔΣ, ^СЕ IдС2, IдС3 и IдС4.
- 15. Белок слияния по п.14, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой ^СЕ
- 16. Белок слияния, включающий аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 32, 8ЕС ΙΌ N0: 33, 8ЕС ΙΌ N0: 34, 8ЕС ΙΌ N0: 35, 8ЕС ΙΌ N0: 36 или 8ЕС ΙΌ N0: 37.
- 17. Белок слияния по п.16, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 37 или 8ЕС ΙΌ N0: 34.
- 18. Белок слияния, кодируемый нуклеиново-кислотной последовательностью, представленной в 8ЕС ΙΌ N0: 30 или 8ЕС ΙΌ N0: 31.
- 19. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок слияния по любому из предшествующих пунктов.
- 20. Нуклеиновая кислота по п.19, отличающаяся тем, что нуклеиново-кислотная последовательность, кодирующая полипептид КАСЕ, представляет собой или включает нуклеиново-кислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 25, 8ЕС ΙΌ N0: 26, 8ЕС ΙΌ N0: 27, 8ЕС ΙΌ N0: 28 или 8ЕС ΙΌ N0: 29.
- 21. Нуклеиновая кислота по п.20, включающая нуклеиново-кислотную последовательность, представленную в 8ЕС ΙΌ N0: 30 или 8ЕС ΙΌ N0: 31.
- 22. Вектор экспрессии, кодирующий белок слияния по любому из пп.1-18 и/или включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.19-21.
- 23. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество белка по любому из пп.1-18 в фармацевтическом носителе.
- 24. Фармацевтическая композиция по п.23, изготовленная в виде инъецируемого раствора или в виде стерильного лиофилизированного порошка.
- 25. Способ получения белка слияния по любому из пп.1-18, включающий стадию ковалентного присоединения полипептида КАСЕ к полипептиду, включающему Сн2 домен иммуноглобулина или часть СН2 домена иммуноглобулина.
- 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что белок слияния кодируется рекомбинантной конструкцией ДНК.
- 27. Способ по п.25 или 26, дополнительно включающий стадию встраивания конструкции ДНК в вектор экспрессии.
- 28. Способ по п.27, дополнительно включающий трансфекцию вектора экспрессии в клеткухозяина.
- 29. Применение белка слияния по любому из пп.1-18 для получения лекарственного средства для лечения КАСЕ-опосредованного заболевания у субъекта.
- 30. Применение по п.29, где лекарственное средство предназначено для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения субъекту белка слияния на основе КАСЕ.
- 31. Применение по п.29 или 30, где лекарственное средство предназначено для лечения симптома диабета или симптома поздних осложнений диабета.
- 32. Применение по п.31, где симптом диабета или поздних осложнений диабета включает диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическое изъязвление стопы, сердечнососудистое осложнение или диабетическую нейропатию.
- 33. Применение по п.29 или 30, где лекарственное средство предназначено для лечения амилоидоза, болезни Альцгеймера, рака, почечной недостаточности, воспаления, ассоциированного с аутоиммунным процессом, воспалительным заболеванием кишечника, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, гипоксией, инсультом, сердечным приступом, геморрагическим шоком, сепсисом, трансплантацией органа или плохим заживлением раны.
- 34. Клетка-хозяин для продуцирования белка слияния по п.1, где клетка трансформирована векто- 37 012082 ром экспрессии по п.22.
- 35. Клетка-хозяин по п.34, отличающаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59855504P | 2004-08-03 | 2004-08-03 | |
| PCT/US2005/027705 WO2006017647A1 (en) | 2004-08-03 | 2005-08-03 | Rage fusion proteins and methods of use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700404A1 EA200700404A1 (ru) | 2007-06-29 |
| EA012082B1 true EA012082B1 (ru) | 2009-08-28 |
Family
ID=35149359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700404A EA012082B1 (ru) | 2004-08-03 | 2005-08-03 | Белки слияния на основе rage и способы их использования |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US7981423B2 (ru) |
| EP (1) | EP1781700B1 (ru) |
| JP (1) | JP5188804B2 (ru) |
| KR (1) | KR101323411B1 (ru) |
| CN (1) | CN1993378A (ru) |
| AP (1) | AP2007003869A0 (ru) |
| AU (1) | AU2005271452B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0514052A (ru) |
| CA (1) | CA2570324C (ru) |
| CR (1) | CR20110556A (ru) |
| EA (1) | EA012082B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP077221A (ru) |
| ES (1) | ES2473587T3 (ru) |
| GE (1) | GEP20105110B (ru) |
| IL (1) | IL180554A (ru) |
| MA (1) | MA29067B1 (ru) |
| MX (1) | MX2007001559A (ru) |
| NO (1) | NO20065949L (ru) |
| NZ (1) | NZ552128A (ru) |
| TN (1) | TNSN07037A1 (ru) |
| UA (1) | UA93356C2 (ru) |
| WO (1) | WO2006017647A1 (ru) |
| ZA (2) | ZA200700643B (ru) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6465422B1 (en) * | 1998-04-17 | 2002-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject |
| US6303321B1 (en) | 1999-02-11 | 2001-10-16 | North Shore-Long Island Jewish Research Institute | Methods for diagnosing sepsis |
| US7304034B2 (en) | 2001-05-15 | 2007-12-04 | The Feinstein Institute For Medical Research | Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents |
| US7696169B2 (en) * | 2003-06-06 | 2010-04-13 | The Feinstein Institute For Medical Research | Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents |
| JP4792392B2 (ja) * | 2003-09-11 | 2011-10-12 | コーナーストーン セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｈｍｇｂ１に対するモノクローナル抗体 |
| JP5188804B2 (ja) | 2004-08-03 | 2013-04-24 | トランステック ファーマ，インコーポレイティド | Ｒａｇｅ融合タンパク質及びその使用方法 |
| CA2575830A1 (en) * | 2004-08-03 | 2006-02-16 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion proteins and methods of use |
| WO2006119510A2 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-09 | Receptor Biologix, Inc. | Isoforms of receptor for advanced glycation end products (rage) and methods of identifying and using same |
| EP1959997A4 (en) * | 2005-11-28 | 2009-12-23 | Medimmune Llc | ANTAGONISTS OF HMGB1 AND / OR RAGE AND METHOD OF USE THEREOF |
| RU2431804C2 (ru) * | 2005-12-23 | 2011-10-20 | ДжиКоудер Системз АБ | Шаблон позиционирования |
| CA2638907A1 (en) * | 2006-02-09 | 2007-08-23 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion proteins and methods of use |
| CA2651348A1 (en) | 2006-05-05 | 2007-11-15 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof |
| EP2450366A1 (en) | 2007-01-30 | 2012-05-09 | Epivax, Inc. | Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof |
| WO2008100470A2 (en) * | 2007-02-15 | 2008-08-21 | Transtech Pharma, Inc. | Rage - immunoglobulin fusion proteins |
| US20100254983A1 (en) * | 2007-06-07 | 2010-10-07 | Ann Marie Schmidt | Uses of rage antagonists for treating obesity and related diseases |
| KR101595634B1 (ko) * | 2007-06-14 | 2016-02-18 | 갈락티카 파마슈티칼스, 인크. | Ｒａｇｅ 융합 단백질 |
| JP5620106B2 (ja) * | 2007-10-24 | 2014-11-05 | 株式会社糖鎖工学研究所 | 増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド |
| NL2001556C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001554C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001552C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001558C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001551C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001553C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001555C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| NL2001557C2 (nl) * | 2008-05-06 | 2009-05-07 | Transtech Pharma | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
| WO2009143411A2 (en) | 2008-05-23 | 2009-11-26 | Siwa Corporation | Methods, compositions and apparatus for facilitating regeneration |
| US9034341B2 (en) | 2009-04-20 | 2015-05-19 | Transtech Pharma, Llc | Control of RAGE fusion protein glycosylation and RAGE fusion protein compositions |
| US10080799B2 (en) | 2010-02-12 | 2018-09-25 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Methods and compositions related to glycoprotein-immunoglobulin fusions |
| WO2011102845A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion protein compositions and methods of use |
| US9649376B2 (en) | 2010-09-27 | 2017-05-16 | Siwa Corporation | Selective removal of age-modified cells for treatment of atherosclerosis |
| US8721571B2 (en) | 2010-11-22 | 2014-05-13 | Siwa Corporation | Selective removal of cells having accumulated agents |
| US10400029B2 (en) | 2011-06-28 | 2019-09-03 | Inhibrx, Lp | Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof |
| ES2746052T3 (es) | 2011-06-28 | 2020-03-04 | Inhibrx Lp | Polipéptidos de fusión de serpina y métodos de uso de los mismos |
| AU2012275295B2 (en) | 2011-06-28 | 2016-11-10 | Inhibrx, Lp | WAP domain fusion polypeptides and methods of use thereof |
| KR20150043505A (ko) * | 2012-09-07 | 2015-04-22 | 사노피 | 대사 증후군의 치료용 융합 단백질 |
| WO2015023165A1 (ko) * | 2013-08-16 | 2015-02-19 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 염증조절복합체 및 ｓｔａｔ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포 |
| CA2961603C (en) * | 2014-09-19 | 2021-07-13 | Siwa Corporation | Anti-age antibodies for treating inflammation and auto-immune disorders |
| US10358502B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-07-23 | Siwa Corporation | Product and method for treating sarcopenia |
| US9993535B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-12 | Siwa Corporation | Method and composition for treating sarcopenia |
| CN109071675A (zh) | 2016-02-19 | 2018-12-21 | Siwa有限公司 | 使用高级糖化终产物(age)的抗体治疗癌症、杀死转移性癌细胞和预防癌症转移的方法和组合物 |
| KR20180133452A (ko) | 2016-04-15 | 2018-12-14 | 시와 코퍼레이션 | 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 항-노화 항체 |
| CN107474136B (zh) * | 2016-06-08 | 2023-03-07 | 上海交通大学医学院 | 增强激动型抗体活性的抗体重链恒定区序列 |
| WO2017222535A1 (en) | 2016-06-23 | 2017-12-28 | Siwa Corporation | Vaccines for use in treating various diseases and disorders |
| US10925937B1 (en) | 2017-01-06 | 2021-02-23 | Siwa Corporation | Vaccines for use in treating juvenile disorders associated with inflammation |
| US10858449B1 (en) | 2017-01-06 | 2020-12-08 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating osteoarthritis |
| US10995151B1 (en) | 2017-01-06 | 2021-05-04 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating disease-related cachexia |
| US10961321B1 (en) | 2017-01-06 | 2021-03-30 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating pain associated with inflammation |
| US10143187B2 (en) | 2017-02-17 | 2018-12-04 | Denali Therapeutics Inc. | Transferrin receptor transgenic models |
| CA3053381A1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Denali Therapeutics Inc. | Engineered polypeptides |
| US10457717B2 (en) | 2017-02-17 | 2019-10-29 | Denali Therapeutics Inc. | Engineered polypeptides |
| JP2020516648A (ja) | 2017-04-13 | 2020-06-11 | シワ コーポレーション | ヒト化モノクローナル終末糖化産物抗体 |
| US11518801B1 (en) | 2017-12-22 | 2022-12-06 | Siwa Corporation | Methods and compositions for treating diabetes and diabetic complications |
| JP7307178B2 (ja) | 2018-09-14 | 2023-07-11 | バイオエイジ ラブス， インコーポレイテッド | 改善された安定性およびリガンド結合親和性を有するｒａｇｅ融合タンパク質ならびにその使用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004016229A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Wyeth | Compositions and methods for treating rage-associated disorders |
Family Cites Families (92)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4867973A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-19 | Cytogen Corporation | Antibody-therapeutic agent conjugates |
| US6018026A (en) * | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
| US5567584A (en) * | 1988-01-22 | 1996-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF |
| NZ235148A (en) * | 1989-09-05 | 1991-12-23 | Immunex Corp | Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences |
| MX9204374A (es) * | 1991-07-25 | 1993-03-01 | Idec Pharma Corp | Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion. |
| US5714350A (en) | 1992-03-09 | 1998-02-03 | Protein Design Labs, Inc. | Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region |
| SE9201073D0 (sv) | 1992-04-03 | 1992-04-03 | Kabi Pharmacia Ab | Protein formulation |
| WO1994010308A1 (en) | 1992-10-23 | 1994-05-11 | Immunex Corporation | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins |
| FI119756B (fi) * | 1995-01-18 | 2009-03-13 | Alteon Inc | Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa |
| US5656261A (en) * | 1995-01-18 | 1997-08-12 | The Picower Institute For Medical Research | Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts |
| DK0808163T3 (da) * | 1995-01-18 | 2003-11-10 | Alteon Inc | Anvendelse af thiazoliumforbindelser til at forhindre og ændre dannelse af fremskredne glycosyleringsslutprodukter |
| CA2217572A1 (en) * | 1995-04-05 | 1996-10-10 | The Picower Institute For Medical Research | Agents for binding to advanced glycosylation endproducts, and methods of their use |
| US5747035A (en) * | 1995-04-14 | 1998-05-05 | Genentech, Inc. | Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor |
| US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
| WO1997026913A1 (en) | 1996-01-26 | 1997-07-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | A POLYPEPTIDE FROM LUNG EXTRACT WHICH BINDS AMYLOID-β PEPTIDE |
| WO1997039121A1 (en) | 1996-04-16 | 1997-10-23 | Schering Aktiengesellschaft | Advanced glycosylation end-product receptor peptides and uses therefor |
| US5864018A (en) * | 1996-04-16 | 1999-01-26 | Schering Aktiengesellschaft | Antibodies to advanced glycosylation end-product receptor polypeptides and uses therefor |
| US7258857B2 (en) * | 1996-11-22 | 2007-08-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rage-related methods for treating inflammation |
| US6555651B2 (en) | 1997-10-09 | 2003-04-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Ligand binding site of rage and uses thereof |
| US6790443B2 (en) | 1996-11-22 | 2004-09-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for treating symptoms of diabetes |
| US7081241B1 (en) * | 1998-10-06 | 2006-07-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Extracellular rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof |
| WO1998040071A1 (en) | 1997-03-11 | 1998-09-17 | The General Hospital Corporation | Identification of agents for use in the treatment of alzheimer's disease |
| US6165476A (en) | 1997-07-10 | 2000-12-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker |
| US7101838B2 (en) * | 1997-08-05 | 2006-09-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method to prevent accelerated atherosclerosis using (sRAGE) soluble receptor for advanced glycation endproducts |
| ZA988461B (en) | 1997-09-18 | 1999-03-30 | Idec Pharma Corp | Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis |
| US6380165B1 (en) * | 1997-09-19 | 2002-04-30 | The Picower Institute For Medical Research | Immunological advanced glycation endproduct crosslink |
| US6761888B1 (en) * | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
| US6323218B1 (en) | 1998-03-11 | 2001-11-27 | The General Hospital Corporation | Agents for use in the treatment of Alzheimer's disease |
| US6465422B1 (en) | 1998-04-17 | 2002-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject |
| US6706683B1 (en) | 1998-09-29 | 2004-03-16 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for controlling the release of granules |
| US6753150B2 (en) * | 1998-10-05 | 2004-06-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for determining whether a compound is capable of inhibiting the interaction of a peptide with rage |
| JP2002526117A (ja) | 1998-10-06 | 2002-08-20 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 細胞外新規ｒａｇｅ結合タンパク質（ｅｎ−ｒａｇｅ）及びその使用 |
| US6197294B1 (en) * | 1998-10-26 | 2001-03-06 | Neurotech S.A. | Cell surface molecule-induced macrophage activation |
| US6589944B1 (en) | 1999-04-05 | 2003-07-08 | City Of Hope | Breakers of advanced glycation endproducts |
| US6605642B2 (en) * | 1999-04-05 | 2003-08-12 | City Of Hope | Inhibitors of formation of advanced glycation endproducts (AGES) |
| US6787566B2 (en) * | 1999-04-05 | 2004-09-07 | City Of Hope | Breakers of advanced glycation endproducts |
| US6939545B2 (en) * | 1999-04-28 | 2005-09-06 | Genetics Institute, Llc | Composition and method for treating inflammatory disorders |
| US6835200B2 (en) | 1999-06-22 | 2004-12-28 | Ndo Surgical. Inc. | Method and devices for tissue reconfiguration |
| FR2797402B1 (fr) | 1999-07-15 | 2004-03-12 | Biomerieux Stelhys | Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune |
| AU6766800A (en) * | 1999-08-13 | 2001-03-13 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Methods of inhibiting binding of beta-sheet fibril to rage and consequences thereof |
| WO2001018060A1 (fr) | 1999-09-08 | 2001-03-15 | Toray Industries, Inc. | Materiaux de circulation extracorporelle, adsorbants de facteurs de complication diabetique, reservoirs servant a eliminer des facteurs de complication diabetique et procede d'elimination de facteurs de complication diabetique |
| US20050170382A1 (en) * | 1999-10-06 | 2005-08-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York. | RAGE-related compositions |
| EP1287162A2 (en) | 1999-10-21 | 2003-03-05 | Case Western Reserve University | Gene expression profiling of inflammatory bowel disease |
| JP2003516150A (ja) | 1999-12-08 | 2003-05-13 | ジェンセット | 潜在性分泌タンパク質をコードする全長ヒトｃＤＮＡ |
| US6727353B2 (en) * | 2000-04-14 | 2004-04-27 | Icagen, Inc. | Nucleic acid encoding Kv10.1, a voltage-gated potassium channel from human brain |
| MXPA02010194A (es) * | 2000-04-14 | 2004-08-19 | Niadyne Corp | Metodo para identificar reguladores de formacion de proteina-producto final de glicacion avanzada (proteina-age). |
| EP1354037A2 (en) | 2000-04-17 | 2003-10-22 | TransTech Pharma, Inc. | Protein expression system arrays and use in biological screening |
| WO2001086002A2 (en) | 2000-05-09 | 2001-11-15 | Genetics Institute, Llc | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of psoriasis |
| US6613801B2 (en) | 2000-05-30 | 2003-09-02 | Transtech Pharma, Inc. | Method for the synthesis of compounds of formula I and their uses thereof |
| US6908741B1 (en) | 2000-05-30 | 2005-06-21 | Transtech Pharma, Inc. | Methods to identify compounds that modulate RAGE |
| EP1307917A2 (en) * | 2000-08-07 | 2003-05-07 | Amberwave Systems Corporation | Gate technology for strained surface channel and strained buried channel mosfet devices |
| US6563015B1 (en) * | 2000-08-14 | 2003-05-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof |
| US6825164B1 (en) | 2000-08-14 | 2004-11-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method to increase cerebral blood flow in amyloid angiopathy |
| EA200300442A1 (ru) * | 2000-10-02 | 2003-10-30 | Редди Ю Эс Терапьютикс, Инк. | Способы и композиции для лечения воспалительных заболеваний |
| AU2002213192A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury |
| US20050244849A1 (en) * | 2000-12-15 | 2005-11-03 | Genetics Institute, Llc | Screening assays for rheumatoid arthritis |
| IL156651A0 (en) * | 2000-12-29 | 2004-01-04 | Reddy Us Therapeutics Inc | Detection of compounds that modulate inflammatory responses |
| US6946277B2 (en) | 2001-01-31 | 2005-09-20 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method for enhancing cellobiase activity of termitomyces clypeatus using a glycosylation inhibitor |
| HUP0303171A2 (hu) * | 2001-02-19 | 2003-12-29 | Merck Patent Gmbh | Csökkentett immunogenitású mesterséges fehérjék |
| DE10164805B4 (de) | 2001-02-28 | 2011-02-10 | Koch-Pelster, Brigitte, Dr. | Verfahren und Mittel zur Modifikation humaner Angiogenese |
| JP3837494B2 (ja) * | 2001-03-19 | 2006-10-25 | 国立大学法人金沢大学 | 可溶型ｒａｇｅタンパク質 |
| DE60204669T2 (de) * | 2001-03-22 | 2006-05-04 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. | Verfahren und vorrichtung zur gel-freien qualitativen proteomanalyse und deren verwendungen |
| US7304034B2 (en) * | 2001-05-15 | 2007-12-04 | The Feinstein Institute For Medical Research | Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents |
| US8188231B2 (en) | 2002-09-27 | 2012-05-29 | Xencor, Inc. | Optimized FC variants |
| EP1578434A2 (en) | 2002-07-09 | 2005-09-28 | Point Therapeutics, Inc. | Methods and compositions relating to isoleucine boroproline compounds |
| US7261893B2 (en) | 2002-10-22 | 2007-08-28 | Wyeth | Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor |
| US20060241284A1 (en) | 2002-12-13 | 2006-10-26 | Juha Kuja-Panula | Transmembrane protein amigo and uses thereof |
| EP2338333B1 (en) | 2003-04-09 | 2017-09-06 | ratiopharm GmbH | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| WO2004100890A2 (en) * | 2003-05-09 | 2004-11-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rage g82s-related methods and compositions for treating inflammatory disorders |
| EP1635823A1 (en) * | 2003-05-20 | 2006-03-22 | TransTech Pharma Inc. | Rage antagonists as agents to reverse amyloidosis and diseases associated therewith |
| WO2005021710A2 (en) * | 2003-06-02 | 2005-03-10 | University Of Miami | Chimeric molecules and methods of use |
| US8198020B2 (en) | 2003-08-22 | 2012-06-12 | Potentia Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity |
| WO2005023191A2 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rage-related methods and compositions for treating glomerular injury |
| US20070167360A1 (en) * | 2003-10-31 | 2007-07-19 | Yan Shi D | Methods for treating multiple sclerosis |
| WO2005049852A2 (en) | 2003-11-17 | 2005-06-02 | University Of Florida | Methods and compositions for inducing apoptosis |
| WO2005051995A2 (en) | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Curagen Corporation | Novel advanced glycosylation end product-specific receptor-like protein and nucleic acids encoding same |
| GB0330079D0 (en) | 2003-12-20 | 2004-02-04 | Bioinvent Int Ab | Vaccine |
| CN100342017C (zh) | 2004-05-10 | 2007-10-10 | 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 | 基因重组趋化抗原疫苗 |
| EP1768677B1 (en) | 2004-07-02 | 2008-06-25 | Creabilis Therapeutics S.P.A. | Nucleic acids for the treatment of hmgb1-related pathologies |
| US20060012414A1 (en) * | 2004-07-15 | 2006-01-19 | Texas Instruments Incorporated | Circuit and method for generating a polyphase clock signal and system incorporating the same |
| WO2006012415A2 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Critical Therapeutics, Inc. | Rage protein derivatives |
| WO2006012373A2 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Critical Therapeutics, Inc. | Combination therapies of hmgb and complement inhibitors against inflammation |
| CA2575830A1 (en) * | 2004-08-03 | 2006-02-16 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion proteins and methods of use |
| JP5188804B2 (ja) | 2004-08-03 | 2013-04-24 | トランステック ファーマ，インコーポレイティド | Ｒａｇｅ融合タンパク質及びその使用方法 |
| EP1799700A4 (en) | 2004-09-27 | 2009-02-11 | Centocor Inc | SRAGE MIMETIC BODIES, COMPOSITIONS, PROCESSES AND USES |
| WO2006119510A2 (en) | 2005-05-04 | 2006-11-09 | Receptor Biologix, Inc. | Isoforms of receptor for advanced glycation end products (rage) and methods of identifying and using same |
| US20080207499A1 (en) * | 2005-06-29 | 2008-08-28 | Gaetano Barile | Rage-related methods for treating and preventing diabetic retinopathy |
| CA2638907A1 (en) * | 2006-02-09 | 2007-08-23 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion proteins and methods of use |
| CA2651348A1 (en) | 2006-05-05 | 2007-11-15 | Transtech Pharma, Inc. | Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof |
| EP2395077A1 (en) | 2006-11-03 | 2011-12-14 | Wyeth LLC | Glycolysis-inhibiting substances in cell culture |
| WO2008100470A2 (en) | 2007-02-15 | 2008-08-21 | Transtech Pharma, Inc. | Rage - immunoglobulin fusion proteins |
| KR101595634B1 (ko) | 2007-06-14 | 2016-02-18 | 갈락티카 파마슈티칼스, 인크. | Ｒａｇｅ 융합 단백질 |
-
2005
- 2005-08-03 JP JP2007524978A patent/JP5188804B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-03 US US11/629,437 patent/US7981423B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-03 EA EA200700404A patent/EA012082B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-08-03 MX MX2007001559A patent/MX2007001559A/es active IP Right Grant
- 2005-08-03 CN CNA2005800259477A patent/CN1993378A/zh active Pending
- 2005-08-03 UA UAA200702273A patent/UA93356C2/ru unknown
- 2005-08-03 ES ES05778764.0T patent/ES2473587T3/es active Active
- 2005-08-03 BR BRPI0514052-8A patent/BRPI0514052A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-08-03 KR KR1020077005152A patent/KR101323411B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-08-03 EP EP05778764.0A patent/EP1781700B1/en active Active
- 2005-08-03 NZ NZ552128A patent/NZ552128A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-08-03 AP AP2007003869A patent/AP2007003869A0/xx unknown
- 2005-08-03 WO PCT/US2005/027705 patent/WO2006017647A1/en active Application Filing
- 2005-08-03 US US11/197,038 patent/US7901688B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-03 CA CA2570324A patent/CA2570324C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-03 AU AU2005271452A patent/AU2005271452B2/en not_active Ceased
- 2005-08-03 GE GEAP20059904A patent/GEP20105110B/en unknown
-
2006
- 2006-12-21 NO NO20065949A patent/NO20065949L/no not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-01-04 IL IL180554A patent/IL180554A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-01-23 ZA ZA200700643A patent/ZA200700643B/xx unknown
- 2007-02-02 EC EC2007007221A patent/ECSP077221A/es unknown
- 2007-02-02 TN TNP2007000037A patent/TNSN07037A1/fr unknown
- 2007-02-02 MA MA29650A patent/MA29067B1/fr unknown
-
2009
- 2009-09-16 ZA ZA200906459A patent/ZA200906459B/xx unknown
-
2011
- 2011-01-03 US US12/983,604 patent/US8877192B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-01-07 US US12/986,602 patent/US20110124102A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-17 US US13/029,622 patent/US20110244516A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-20 CR CR20110556A patent/CR20110556A/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004016229A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Wyeth | Compositions and methods for treating rage-associated disorders |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA012082B1 (ru) | Белки слияния на основе rage и способы их использования | |
| EA012586B1 (ru) | Rage-слитые белки и способы их применения | |
| JP5558810B2 (ja) | Ｒａｇｅ融合タンパク質、製剤及びその使用方法 | |
| JP6041843B2 (ja) | ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させる方法 | |
| US20090004190A1 (en) | Rage Fusion Proteins And Methods Of Use | |
| JP2002526117A (ja) | 細胞外新規ｒａｇｅ結合タンパク質（ｅｎ−ｒａｇｅ）及びその使用 | |
| NL2001558C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. | |
| NL2001552C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. | |
| NL2001557C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. | |
| NL2001556C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. | |
| NL2001554C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. | |
| NL2001553C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. | |
| NL2001555C2 (nl) | Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| TC4A | Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |