FI119756B - Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa - Google Patents

Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa Download PDF

Info

Publication number
FI119756B
FI119756B FI973031A FI973031A FI119756B FI 119756 B FI119756 B FI 119756B FI 973031 A FI973031 A FI 973031A FI 973031 A FI973031 A FI 973031A FI 119756 B FI119756 B FI 119756B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
oxoethyl
salt
amino
methyl
thiazolium
Prior art date
Application number
FI973031A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI973031A0 (fi
FI973031A (fi
Inventor
Anthony Cerami
Peter C Ulrich
Dilip R Wagle
San-Bao Hwang
Sara Vasan
John J Egan
Original Assignee
Alteon Inc
Picower Inst Med Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/375,155 external-priority patent/US5656261A/en
Priority claimed from US08/588,249 external-priority patent/US5853703A/en
Application filed by Alteon Inc, Picower Inst Med Res filed Critical Alteon Inc
Publication of FI973031A0 publication Critical patent/FI973031A0/fi
Publication of FI973031A publication Critical patent/FI973031A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119756B publication Critical patent/FI119756B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/426—1,3-Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/38—Nitrogen atoms
    • C07D277/40—Unsubstituted amino or imino radicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)

Description

t
Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa-TiazoliumfÖreningarnas användning för att förhindra ooh om-kasta bildandet av den längthunna glykosylationens slutproduk-5 ter
Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee yleisesti proteiinien vanhenemista, joka 10 on tuloksena niiden reaktiosta glukoosin ja muiden pelkistävi en sokereiden kanssa, ja tarkemmin sanottuna ei-entsymaatti-sesti glykosyloitujen proteiinien reaktion estämisestä ja sellaisen siloittumisen katkaisemisesta, joka on muodostunut sen jälkeen, kun pitkälle kehittyneet glykosylaation lopputuotteet 15 ovat syntyneet.
Glukoosin ja proteiinien välinen reaktio on ollut tunnettu jonkin aikaa. Sen varhaisin ilmenemismuoto oli sellaisten ruskeiden pigmenttien ilmestyminen ruoan keittämisen aikana, 20 jotka identifioi vuonna 1912 Maillard, joka havaitsi, että . glukoosi ja muut pelkistävät sokerit reagoivat aminohappojen .. . kanssa, jotta muodostuu addukteja, joille tapahtuu dehydrataa- : ·' tioiden ja uudelleenmuodostumisten sarja, niin että syntyy kestäviä ruskeita pigmenttejä. Lisätutkimukset viittavat : '.· 25 siihen, että säilytetyissä ja lämmöllä käsitellyissä ruoissa | ’·· tapahtuu ei-entsymaattista ruskettumista, joka on tulos glu- koosin ja polypeptidiketjun välisestä reaktiosta, ja että proteiinit ovat lopulta silloitettuja ja vastaavsti niiden biologinen hyötyosuus on vähentynyt.
30 Tällaiselle pelkistävien sokereiden väliselle reaktiolle • · · ’... yhdenmukainen reaktio havaittiin pelkistävien sokereiden ja ruoan proteiinien välillä in vivo♦ Täten ei-entsymaattinen reaktio, joka toteutuu glukoosin ja proteiinin vapaiden amino-:***: 35 ryhmien välillä, niin että muodostuu stabiili 1-desoksike-. V tosyyliaddukti, joka tunnetaan Amadori-tuotteena, on osoitettu **’ I hemoglobiinilla, jolloin hemoglobiinin beeta-ketjun aminopään 2 uudelleenjärjestyminen glukoosin kanssa tapahtuvan reaktion avulla tuottaa adduktin, joka tunnetaan hemoblobiini Alc:nä. Reaktion on havaittu tapahtuvan myös monilla muilla kehon proteiineilla, kuten silmän linssissä, kollageenillä ja hermo-5 proteiineilla. Katso Bucala et ai., "Advanced Glycosylation; Chemistry, Biology, and Implications for Diabetes and Aging" julkaisussa Advances in Pharmacology, osa 23, sivuilla 1-34, Academic Press (1992).
10 Ennen kaikkea havaittiin in vivo ruskeita pigmenttejä, joiden spektraali- ja fluoroivat ominaisuudet olivat samanlaiset kuin myöhäisen vaiheen Maillard-tuotteilla ja jotka liittyivät moniin pitkäikäisiin proteiineihin, kuten silmän mykiön proteiineihin ja kollageeniin, jotka olivat peräisin ikääntyneitä 15 henkilöiltä. Pigmentin lineaarinen, ikään liittyvä lisääntyminen havaittiin 20 - 90 vuotiaan ihmisen kovakalvon kollageenissä. On mielenkiintoista, että kollageenin vanhenemista voidaan jäljitellä in vitro, siten että silloittuminen saadaan aikaan glukoosilla; ja muiden proteiinien vangitsemiselle ja 20 adduktien muodostumiselle kollageenillä, mikä myös havaittiin, . esitetään teoria, jonka mukaan ne toteutuvat silloittumis- reaktion avulla, ja uskotaan, että ne ovat vastuussa albumii- • · : ♦' nin ja vasta-aineiden havaitusta kerääntymisestä, joka tapah- • · *...· tuu munuaisen tyvikalvossa.
M · : ’.· 25 • · j ’·· US-patentissa, numerossa 4 758 583, esitetään menetelmä ja siihen liittyviä aineita, jotka toimivat pitkälle edistyneen glykosyloinnin lopputuotteiden muodostumisen inhiboinnissa, siten että ne reagoivat aikaisen glykosyloinnin sellaisen 30 tuotteen kanssa, joka on peräisin alkuperäisestä reaktiosta, ..^ joka tapahtuu kohdeproteiinin ja glukoosin välillä. Oletettiin • ·« *... näin ollen, että inhibitio tapahtuu inhibiittorin ja varhaisen • · . glykosylaation tuotteen välisenä reaktiona, jotta glykosyloi- dun tuotteen myöhempi reaktio lisäproteiinimateriaalin kanssa 35 silloitetuksi myöhäisen vaiheen tuotteeksi keskeytyy. Eräs ·· · . inhibiittoriksi tunnistetuista aineista oli aminoguanidiini, • · · • · · · 1 · 3 ja lisätestauksen tulokset ovat vahvistaneet sen tehon tässä suhteessa.
Vaikka aminoguanidiinillä ja sen kaltaisilla yhdisteillä on saavutettu menestystä, on jatkuvaa tarvetta identifioida ja 5 kehittää lisää inhibiittoreita, jotka laajentavat tämän mahdollisen aktiivisuuden piiriä ja sen diagnostista ja terapeuttista käyttökelpoisuutta. On lisätarvetta löytää aineita, jotka eivät vain inhiboi tätä reaktiota ja sen seurauksia, vaan sellaisia vaikuttavia aineita, jotka pystyvät katkaise-10 maan sillat, jotka ovat muodostuneet ptkälle edistyneen gly-kosyloinnin ennalta olemassa olevien lopputuotteiden tuloksena, ja jotka palauttavat tällä tavalla vaikutukset, jotka niistä seuraavat.
15 Keksinnön yhteenveto Tässä hakemuksessa esitetään menetelmä ja koostumukset proteiinien pitkälle edistyneen glykosyloinnin muodostumisen (proteiinien vanhenemisen) inhiboimiseksi ja sellaisten silto-20 jen katkaisemiseksi, jotka muodostuvat pitkälle edistyneen glykosyloinnin (glykoinnin) lopputuotteiden (AGE:t) väliin tai . AGE:iden ja muiden proteiinien väliin. Näillä koostumuksilla ,, , ja menetelmillä voitaisiin estää pitkälle edistyneen • · · • ·1 glykosyloinnin (glykoinnin) sellaiset lopputuotteet ja sil- • · · • · *··.1 25 loittuminen tai kääntää niiden kulku, joita muut in vivo tai • · · : 1.· ruoka-aineissa läsnäolevat reaktiokykyiset sokerit aiheutti- • · • 1·· vat, riboosi, galaktoosi ja fruktoosi mukaan luettuina.
• · · • · · • · ·
Koostumukset sisältävät erityisesti vaikuttavia aineita ennal-30 ta muodostuneiden, pitkälle edistyneen glykosyloinnin (gly- • · .···. koinnin) lopputuotteiden muodostumisen inhiboimiseksi ja täi- • · **’ laisen glykosyloinnin (glykoinnin) suunnan muuttamiseksi sekä • · *.·.1 myöhempien siltojen rikkomiseksi. Vaikka ei haluta sitoutua • · · ·...· mihinkään teoriaan, uskotaan, että pitkälle edistyneen gly- ;·. 35 kosyloinnin (glykoinnin) ennalta muodostuneiden lopputuot- • · · )···. teiden ja siltojen rikkominen on tuloksena, siitä että pilko- • · taan dikarboksyylihappoon perustuvat proteiinisillat, joita on 4 läsnä pitkälle edistyneen glykosyloinnin lopputuotteissa. Tämän keksinnön käytöt ja koostumukset kohdistuvat vaikuttaviin aineisiin, joita niiden kyvyn perusteella saada aikaan tällainen pilkkoutuminen, voidaan käyttää hyväksi katkaistaes-5 sa pitkälle edistyneen glykosyloinnin ennalta muodostunut lopputuote ja silta sekä vaimennettaessa niiden seurauksena olevia haitallisia vaikutuksia sekä in vitro että in vivo.
Tietyt sellaiset vaikuttavat aineet, jotka ovat käyttökelpoi-10 siä tässä keksinnössä, ovat tiatsoliumyhdisteinä tunnettujen luokan jäseniä.
Keksinnön kohteena olevan käytön vaikuttaviin aineisiin kuuluu tiatsoliumyhdisteitä, joilla on seuraava rakennekaava: 15 y χΘ k2' s (i) jossa R1 ja R2 valitaan itsenäisesti ryhmästä, johon kuuluvat • · ... hydroksi(alempi)alkyyli, asetoksi(alempi)alkyyli, alempi *..* 20 alkyyli, alempi alkenyyli, tai R ja R , yhdessä renkaaseen • · ]·“* sisältyvien hiiliatomiensa kanssa, voivat olla aromaattinen, • · · ’ ·' yhdistetty rengas, joka on substituoitu valinnaisesti yhdellä ·· : ’·· tai useammalla amino-, halogeeni- tai alkyleenidioksiryhmällä; • · · • · · • · « 25 Z on vety tai aminoryhmä; :Y: Y on amino, ryhmä, jolla on seuraava kaava
' * O
:...·- Il -ch2c-r • · · • · · I.I jossa R on alempi alkyyli-, alkoksi-, hydroksi-, amino- • · **;·* tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on valinnaisesti • · • *.. 30 substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, :***: alemalla alkoksi-, halogeeni-, dialkyyl i amino -, hydrok- • · · si-, nitro- tai alkyleenidioksiryhmällä; 5 ryhmä, jolla on seuraava kaava -C^R- jossa R' on vety tai alempi alkyyli-, alempi alkynyyli-tai aryyliryhmä; 5 tai ryhmä, jolla on seuraava kaava 0 R' '
Il I
-CH2C-N-R' ' ' jossa R' ' on vety ja R" ' on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu aryyliryhmällä, tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on valinnaisesti 10 substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, halogeeni- tai alkoksikarbonyyliryhmällä; tai R' ' ja R''’ ovat molemmat alempia a1kyy1iryhmiä; X on halogenidi-, tosylaatti-, metaanisulfonaatti- tai mesityleenisulfonaatti-ioni; 15 ja niiden seoksia ja kantaja-aine niitä varten.
Yhdisteet ja niiden koostumukset, joita käytetään tässä keksinnössä, näyttävät reagoivan aikaisen glykosyloinnin tuotteen kanssa ja täten estävät sitä myöhemmin muodostamasta pitkälle 20 edistyneen glykosyloinnin lopputuotteita, jotka johtavat sil-·;··| tojen muodostumiseen ja täten molekyylin tai proteiinin vanhe- nemiseen sekä muihin haitallisiin molekyylimuutoksiin. Sitä • · .···. paitsi ne reagoivat pitkälle edistyneen glykosyloinnin jo * · muodostuneiden tuotteiden kanssa, jotta tällaisten tuotteiden • · · *’ 25 määrä vähenee.
• * • · · • · · • · · *·* * Tässä hakemuksessa kuvataan myös menetelmää proteiinin vanhe nemisen ja muiden haitallisten molekyyliseurausten inhiboimi- • · seksi, siten että aluksi glykosyloituneet molekyylit saatetaan 30 aikaisen glykosylointituotteen vaiheessa kosketuksiin yhden • · · tai useamman tämän keksinnön mukaisen vaikuttavan aineen mää- • · · • · · *.* rän tai samaa vaikuttavaa ainetta sisältävän koostumuksen • · *···’ kanssa, sekä menetelmää pitkälle edenneen glykosylaation jo muodostuneiden tuotteiden hajottamiseksi, jotta tällaisten • .***. 35 tuotteiden määrä vähenee, siten että pilkotaan a-dikarbonyy- ··· liin perustuvat sillat, joita on läsnä pitkälle edenneen gly- 6 kosyloinnin lopputuotteissa. Silloin kun tällä menetelmällä on teollinen sovellus, kyseisille proteiineille voidaan käyttää yhtä tai useampaa vaikuttavaa ainetta, esimerkiksi siten, että ne viedään proteiiniuute-esimerkissä proteiinien seokseen, tai 5 niitä käytetään sellaisille ruoka-aineille, jotka ovat alttiina pitkään edenneelle glykoinnille ja silloittumiselle, tai ne sisällytetään mainittuihin ruoka-aineisiin, jotta estetään tiettyjen ruoka-aineiden liian varhainen vanheneminen ja pilaantuminen sekä muutetaan pitkälle edenneen glykosyloinnin jo 10 muodostuneiden lopputuotteiden vaikutusten suuntaa.
Kyky inhiboida pitkälle edenneen glykoinnin lopputuotteiden muodostumista ja kääntää pitkälle edenneen glykosyloinnin jo muodostuneiden tuotteiden suunta pitää mukanaan merkittäviä 15 seuraamuksia kaikissa sovelluksissa, joissa pitkälle edenneestä glykoitumisesta ja siihen liittyvästä molekyylin silloittu-misesta on vakavaa haittaa. Ruoan pilaantumisen hidastaminen antaisi elintarviketekniikan alalla täten selvää taloudellista ja sosiaalista hyötyä tekemällä tietyt ruoat, joiden säilyvyys 20 on juuri ja juuri vähimmäisvaatimukset täyttävä, vähemmän pilaantuviksi ja sen tähden kuluttajalle käyttökelpoisemmiksi.
. Pilaantuminen vähenisi samoin kuin tutkimisen, poiston ja korvaamisen aiheuttama kulunki, ja ruokien pidennetty käyttö- • · · • ·’ kelpoisuus auttaisi vakauttamaan niiden hintaa markkinoilla.
• · · ·...* 25 Muilla teollisuuden aloilla, joilla proteiinien pilaantuminen • · · •*.· on ongelma, tässä esitetyn mukaisten vaikuttavien aineiden ·· • ’·. sekoittaminen koostumuksiin, joissa on tällaisia proteiineja, helpottaisi mainittujen koostumusten käyttöiän pidentämistä. Tällä hetkellä käytetyt ruoan säilöntäaineet ja värin häviämi-30 sen estäjät, kuten rikkidioksidi, jonka tiedetään aiheuttavan • · · • · .···. eläimissä myrkyllisyyttä, allergia ja astma mukaan luettuina, • ♦ *Γ voidaan korvata yhdisteillä, joita kuvataan tässä yhteydessä.
• ♦ • · · • · · • · ··· Tällä menetelmällä on erityistä terapeuttista käyttöä, koska ;·. 35 Maillardin prosessi vaikuttaa useihin merkittäviin kehon pro- • ♦♦ ,···. teiinimassoihin, niiden joukossa kollageeniin, elastiiniin, • · mykiön proteiineihin ja munuaisen glomeruluksen tyvikalvoihin.
7 Nämä proteiinit turmeltuvat iän myötä (sen tähden käytetään termiä "proteiinin vanheneminen") sekä sokeritaudin seurauksena. Niinpä kyky joko hidastaa tai olennaisesti inhiboida pitkälle kehittyneen glykosyloinnin lopputuotteiden muodostumista 5 tai vähentää sellaisten siltojen määrää, jotka ovat muodostuneet pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteiden ja kehon muiden proteiinien välille, antaa lupauksen esimerkiksi sokeritaudin ja ikääntymisen komplikaatioiden hoidosta ja parantaa täten eläinten ja ihmisen elämän laatua ja mahdollisesti 10 kestoa.
Tässä kuvatuilla vaikuttavilla aineilla on käyttöä myös henkilökohtaisen ulkonäön ja hygienian alueella, koska ne estävät ja kumoavat hampaiden värjäytymisen kationisi11a, mikro-15 bienvastaisilla vaikuttavilla aineilla, joilla on plakin muodostumista estäviä ominaisuuksia, kuten klooriheksidiinillä.
Jäljempänä kuvataan tämän lisäksi uutta analyysimenetelmää ei- entsymaattisten lopputuotteiden muodostumisen "keskeyttämisen" 20 tai palauttamisen määrittämiseksi. Tässä yhteydessä keksintö laajenee vielä sellaisten uusien siltarakenteiden identifioin- . tiin ja käyttöön, joiden uskotaan edustavan merkittävää luku- ...* määrää molekyylisiltoja, jotka muodostuvat pitkälle edenneen • · · • ·* glykoinnin seurauksena in vitro ja in vivo. Siltarakenne *...· 25 sisältää aivan erityisesti sokerista johdetun a-dikarbonyy- ♦ · · : V lisegmentin tai osan, kuten diketonin, joka on pilkottavissa ·· • *·. dinukleofiilisellä, tiatsoliumin kaltaisella yhdisteellä.
Siltarakenne voi olla erityisesti seuraavan kaavan mukainen,
: : Ot> O
... 3 • · • · · ***** 30 jossa A ja B itsenäisesti ovat kiinnittyrniskohtia biomolekyy- ··· • ·
Iin nukleofiiliseen atomiin.
·· • · • ·· .*··. Jäljempänä kuvataan menetelmä pitkälle edistyneen • · • · · glykosyloinnin lopputuotteiden ja molekyylien laajan 8 silloittumisen inhiboimiseksi sekä menetelmä sellaisten siltojen pilkkomiseksi, jotka ovat muodostuneet pitkälle kehittyneen glykosyloinnin ennalta olemassa olevista lopputuotteista seurauksena siitä, että herkät molekyylit, kuten 5 esimerkiksi proteiinit, reagoivat glukoosin ja muiden reak-tiokykyisten sokereiden kanssa, ja vastaavasti menetelmä pitkälle kehittyneen glykosyloinnin lopputuotteiden muodostumisen inhiboimiseksi ja pitkälle kehittyneen glykosyloinnin sellaisen välittömän silloittumisen inhiboimiseksi, joka on 10 tapahtunut aiemmin.
Tutkimuksen tavoitteena on saada aikaan, kuten edellä mainittiin, menetelmä, jolle on luonteenomaista reaktio alussa glykosyloituneen proteiinin kanssa, joka on tunnistettu 15 varhaiseksi glykosylointituotteeksi.
Tutkimuksen lisätarkoituksena on saada aikaan, kuten edellä sanottiin, menetelmä, joka estää mainitun varhaisen glykosyloinnin tuotteiden uudelleenjärjestymisen ja silloittumisen 20 pitkälle edenneen glykosyloinnin mainittujen lopputuotteiden muodostumiseksi.
Edelleen lisätarkoituksena on vielä saada aikaan vaikuttavia ·· · • · · • ·’ aineita, jotka pystyvät edellä mainituissa menetelmissä osal- • · · ·...* 25 listumaan reaktioon varhaisen glykosyloinnin mainittujen tuot- ·· · • V teiden kanssa.
·» • · ♦ ··
Tutkimuksen vielä eräänä lisäkohteena on saada aikaan vaikut-tavia aineita, jotka tuhoavat pitkälle edenneen glykosyloinnin 30 sellaiset lopputuotteet tai palauttavat niiden suunnan, jotka • · · ,···. ovat muodostuneet seurauksena edellä mainitusta pitkälle eden- • · ‘V neen glykosyloinnin reaktiosekvenssistä, siten että mainitut ♦ · *.·.· vaikuttavat aineet pilkkovat α-dikarboksyyliin perustuvia ··· Σ...Σ proteiinisiltoja, joita on pitkälle edenneen glykosyloinnin j·. 35 lopputuotteissa.
• ·· «*· • · • ♦ 9
Vielä eräänä lisätarkoituksena on saada aikaan menetelmiä molekyylin ja proteiinin vanhenemisen haitallisten seurauksien hoitamiseksi turvautumalla lopulta edellä mainittuun menetelmään ja vaikuttaviin aineisiin.
5
Lisätarkoituksena on vielä saada aikaan hampaiden tummumisen estämiseksi ja poistamiseksi menetelmä, jossa turvaudutaan edellä esitettyyn menetelmään ja vaikuttaviin aineisiin.
10 Eräänä keksinnön tarkoituksena on saada aikaan koostumuksia, farmaseuttiset koostumukset mukaan lukien, joissa kaikissa on tämän keksinnön mukaisia vaikuttavia aineita.
Tämän keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan uusia 15 yhdisteitä sekä niiden valmistamiseksi menettelytapoja tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä ja koostumuksissa toteutettavaa käyttöä varten.
Jäljempänä kuvataan vielä uusia analyysimenetelmiä, joita voi- 20 daan käyttää hyväksi ilmaisemaan yhdisteitä, jotka pystyvät "katkaisemaan" tai palauttamaan ei-entsymaattisen glykosyloin- >###. nin lopputuotteiden muodostumisen suunnan sekä mainittujen • · ... lopputuotteiden myöhemmät sillat.
• · · • · • · «·· • · *···* 25 Lisäksi kuvataan siltarakenne, jonka pystyvät pilkkomaan vai- ·· · • · · Σ .* kuttavat aineet, jotka rikkovat pitkälle edenneen glykosyloin- ·· •*·· nin lopputuotteiden muodostumisen tai palauttavat sen, kuten ··· Σ.ϊ : on esitetty tässä yhteydessä, sekä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä mainitulle siltarakenteelle, ja niiden diagnostisia ·*·*. 30 ja terapeuttisia käyttöjä.
• · ··· • · • · • · · Täsmällisemmin sanoen keksinnön kohteena oleva käyttö farma- • · · ’·’·* seuttisen koostumuksen valmistamiseen on kuvattu patenttivaa- • · · ·...* timuksissa 1 ja 12, koostumus patenttivaatimuksessa 13, !*·># 35 yhdiste patenttivaatimuksessa 17 ja farmaseuttinen koostumus φ .···, patenttivaatimuksessa 20.
• · ··· 10
Keksinnön muut tarkoitukset ja edut käyvät ilmi alan ammattimiehelle, siten että hän ottaa huomioon seuraavan kuvauksen, joka etenee, siten että viitataan seuraaviin, keksintöä valaiseviin piirroksiin.
5
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on SDS-PAGE-geeli, joka esittää sellaisen hännän jänteen kollageenin (Tail Tendon Collagen) CNBrr-peptidikart-10 toja, joka ovat peräisin normaaleista ja sokeritautia potevien rottien luokista, joka kuvio esittää vaihetta, jossa geeliä on inkuboitu keksinnön mukaisella 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli) tiat-soliumbromidilla (nimitetty ALT-766:ksi).
15 Kuvio 2 on SDS-PAGE-geeli, joka esittää fysikaalista todistetta AGE-BSA-sillan katkaisemisesta 3-(2-fenyyli-2-oksoetyy-li)tiatsoliumbromidilla, tämän keksinnön yhdisteellä.
Edullisten sovellusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus 20 Tämän keksinnön mukaan on kehitetty vaikuttavia aineita, • / koostumuksia, mainittuja aineita sisältävät farmaseuttiset • · ί ·' koostumukset mukaan lukien, joiden uskotaan inhiboivan pitkäl- ’...· le edistyneen glykosyloinnin lopputuotteiden muodostumisen • V 25 lukuisissa kohdemolekyyleissä, erityisesti sellaiset prote- : ·.. iinit mukaan luettuina, joita on sekä eläimissä että kasvima- teriaalissa, ja palauttavan pitkälle kehittyneen glykosyloinnin jo muodostuneet lopputuotteet. Keksintö koskee erityisesti koostumusta, joka voi sisältää yhden tai useampia vaikuttavia 30 aineita, jotka pystyvät pilkkomaan α-dikarbonyyliin perustuvat molekyylisillat, joita on pitkälle edenneen glykosyloinnin • · · *... lopputuotteissa. Käyttökelpoiset vaikuttavat aineet ovat esimerkiksi yhdisteitä, joilla on seuraava rakennekaava: • · · • · • · 35 y x° : X κ’-Νι-Ν?5 (1) ,Τ Ή
* * R^S
11 jossa R-1- ja R2 valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, hydroksi(alempi)alkyylistä, asetoksi(alempi)alkyylis-tä, alemmasta alkyylistä, alemmasta alkenyylistä, tai R1 ja R2 voivat olla yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä kanssa 5 aromaattinen, yhdistetty rengas, joka on valinnaisesti substi-tuoitu yhdellä tai useammalla amino-, halogeeni- tai alky-leenidioksiryhmällä; Z on vety tai aminoryhmä;
Y on amino, ryhmä, jolla on seuraava kaava 10 O
I! -ch2c-r jossa R on alempi alkyyli-, alkoksi-, hydroksi-, amino- tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on substi-15 tuoitu valinnaisesti yhdellä tai useammalla alkyyli-, alemmalla alkoksi-, halogeeni-, dialkyyliamino-, hydroksi-, nitro- tai alkyleenidioksiryhmällä; ryhmä, jolla on seuraava kaava -CH2R' 20 jossa R' on vety tai alempi alkyyli-, alempi alkynyy- . li- tai aryyliryhmä; .. . tai ryhmä, jolla on seuraava kaava • · • · • · • · · • · !:*: o r·'
:V 25 II I
;·... -CH2C-N-R·’’ • · » Φ · • · * jossa R' 1 on vety ja R' ' 1 on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu aryyliryhmällä, 30 tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on valinnaises- ;·. ti substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla • · · alkyyli-, halogeeni- tai alkoksikarbonyyliryhmällä, • · *.. tai R'' ja R" ' ovat molemmat alempia alkyyliryhmiä; ··· V X on halogenidi-, tosylaatti-, metaanisulfonaatti- • · · 35 tai mesityleenisulfonaatti-ioni; ; X ja niiden seoksia sekä kantaja niitä varten.
• · · ♦ ♦ · · 12
Alemmat alkyyliryhmät, joihin edellä viitattiin, sisältävät yhdestä kuuteen hiiliatomia, ja niihin kuuluvat metyyli, etyyli, propyyli, butyyli, pentyyli, heksyyli ja niiden vastaavat haaraketjuiset isomeerit. Alemmat alkynyyliryhmät 5 sisältävät kahdesta kuuteen hiiliatomia. Alemmat alkoksiryhmät sisältävät samoin yhdestä kuuteen hiiliatomia, ja niihin kuuluvat metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, pentoksi ja heksoksi sekä niiden vastaavat haaraketjuiset isomeerit. Nämä ryhmät ovat valinnaisesti substituoidut yhdellä tai usemmalla 10 halogeeni-, hydroksi-, amino- tai alempialkyyliaminoryhmällä.
Alempiin asyylioksi(alempi)alkyyliryhmiin, jotka edellä esitetty kaava sisältää, kuuluu ryhmiä, joissa asyylioksiosassa on kahdesta kuuteen hiiliatomia ja alemmassa alkyyliosassa on 15 yhdestä kuuteen hiiliatomia. Tyypillisiä asyylioksiosia ovat esimerkiksi asetoksi tai etanoyylioksi, propanoyylioksi, bu-tanoyylioksi, pentanoyylioksi, heksanoyylioksi ja niiden vastaavat haaraketjuiset isomeerit. Tyypillisiä alempia alkyyli-osia ovat tässä yhteydessä edellä kuvatut ryhmät.
20 . Aryyliryhmiä, jotka sisältyvät edellä esitettyyn kaavaan, ovat .. . ryhmiä, joissa on kuudesta kymmeneen hiiliatomia, kuten naf- • · · tyyli, fenyyli ja alemmalla alkyylillä substituoitu fenyyli, • · '··· esimerkiksi tolyyli ja ksylyyli, ja ne ovat substituoidut • · · : 25 valinnaisesti yhdestä kahteen halogeeni-, hydroksi-, alemmalla *· • ’·· alkoksi- tai di(alempi)alkyyliaminoryhmällä. Edullisia aryyli- • · : : . ryhmiä ovat fenyyli-, metoksifenyyli- ja 4-bromifenyyliryhmät.
Edellä esitetyssä kaavassa esitetyt halogeeniatomit voivat 30 olla fluori, kloori, bromi tai jodi.
« ♦ • · • · Tämän keksinnön tarkoituksia varten muodostetaan kaavan (I) • * *. . mukaiset yhdisteet biologisesti tai farmaseuttisesti hyväksyt- ··· V tävinä suoloina. Käyttökelpoisia suolamuotoja ovat haloge- :*\· 35 nidit, erityisesti bromidi-, kloridi-, tosylaatti, metaanisul- ; *·* fonaatti- ja mesityleenisulfonaattisuolat sekä niiden farma- • · seuttisesti hyväksyttävät anionit.
13
Kaavan I esittämien yhdisteiden tietyt substituentit ovat edullisia. Edullisia ovat esimerkiksi yhdisteet, joissa Rx ja R2 ovat alempia alkyyliryhmiä. Erittäin edullisia ovat myös yhdisteet, joissa Y on aminoryhmä, 2-amino-2-oksoetyyliryhmä, 5 2-fenyyli-2-oksoetyyli- tai 2-[substituoitu fenyyli]-2-ok-soetyy1iryhmä.
Tämän keksinnön tyypillisiä yhdisteitä ovat: 3-aminotiatsoliummesityleenisulfonaatti; 10 3-amino-4,5-dimetyyliaminotiatsoliummesityleenisulfonaatti; 2,3-diaminotiatsoliummesityleenisulfonaatti; 3-(2-metoks i-2-oksoetyy1i)-tiatsoliumbromidi; 3-(2-metoks i-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyylitiatsoliumbromidi; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumbromidi; 15 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumbromidi; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyylitiatsoliumbromidi; 3-amino-4-metyylitiatsoliummesityleenisulfonaatti; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-5-metyylitiatsoliumbromidi; 3-(3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-5-metyylitiatsoliumbromidi; 20 3-[2-(41-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]tiatsoliumbromidi; . 3- (2- (4 ' -bromifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyylitiatsoliumbromi- • · · · . di; : · 3-[2- (4 ' -bromifenyyli) -2-oksoetyyli] -5-metyylitiatsoliumbromi- «»· • · *... di; • · · • V 25 3 - [ 2 - (4 ' -bromifenyyli) -2-oksoetyyli ] -4,5-dimetyy lit iatsol ium-»· • *· bromidi; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-hydroksietyyli) tiatsoliumbromidi ; 3- (2-fenyyli-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli)tiat-30 soliumbromidi; ... 3-[2-(4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2-hydrok- • ® sietyy li) tiatsoliumbromidi; • · . 3,4-dimetyyli-5-(2-hydroksietyyli)tiatsoliumjodidi; 3-etyyli-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyylitiatsoliumbromiidi; :1· 35 3-bentsyyli-5-(2-hydroksietyyli) -4-metyylitiatsoliumkloridi; • · ♦ . V 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumbromidi; • ♦ *“ 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumbromidi; «··· t 14 3 — [ 2 — (4 1 -bromifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatsoliumbromidi; 3-(karboksimetyyli)bentsotiatsoliumbromidi; 2,3-(diamino)bentsotiatsoliummesityleenisulfonaatti; 3-(2-amino-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi; 5 3-(2-amino-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumbromidi; 3-(2-amino-2-oksoetyyli)-5-metyylitiatsoliumbromidi; 3-(2-amino-2-oksoetyy1i)-4,5-dimetyy1itiatsoliumbromidi, 3-(2-amino-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumbromidi; 3- (2-amino-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-hydroksietyyli) tiatso-10 liumbromidi; 3-amino-5- (2-hydroksietyyli) -4-metyylitiatsoliummesity-leenisulfonaatti; 3-(2-metyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumkloridi; 3-amino-4-metyyli-5- (2-asetoksietyyli)tiatsoliummesity-15 leenisulfonaatti; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi; 3- (2-metoksi-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5-( 2-asetoksietyyli) tiatsoliumbromidi ; 3- (2-amino-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5-(2-asetoksietyyli)tiatso-2 0 liumbromidi; 2- amino-3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi, . 2-amino-3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumbromidi; 4 # • · 2-amino-3-(2-amino-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi; *·♦· 2-amino-3 - (2-amino-2-oksoetyyli) bentsotiatsoliumbromidi; • · 4 ; Y 25 3-[2-(4'-metoksifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi; • · • *· 3—[2- (21,41-dimetyylifenyyli)-2-oksoetyyli] -tiatsoliumbromidi; :Y 3—[2—(4 *-fluorifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi; 3— [2-(2',4'-difluorifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi; 3-[2-(41-dietyyliaminofenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromi- 30 di; ... 3-propargyyli-tiatsoliumbromidi; • · *... 3-propargyyli-4-metyylitiatsoliumbromidi; » · *. . 3-propargyyli-5-metyylitiatsoliumbromidi; • · · ί.ί 3-propargyyli-4,5-dimetyylitiatsoliumbromidi; 35 3-propargyyli-4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli) -tiatsoliumbromidi; • · r • · 1 3- (2-[3 '-metoksifenyyli] -2-oksoetyyli) -tiatsoliumbromidi, M·» 15 3- (2-[3'-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5-(2 '-hydrok-sietyyli)-tiatsoliubromidi; 3-(2-[3'-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli)-bentsotiatsoliumbromi-di; 5 2,3-diamino-4-klooribentsotiatsoliummesityleenisulfonaatti: 2.3- diamino-4-metyyli-tiatsoliummesityleenisulfonaatti; 3-amino-4-metyyli-5-vinyyli-tiatsoliummesityleenisulfonaatti; 2.3- diamino-6-klooribentsotiatsoliummesityleenisulfonaatti; 2.6- diamino-bentsotiatsolin dihydrokloridi; 10 2,6-diamino-3 [ 2- (41 -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatso- liumbromidi; 2.6- diamino-3 [2- (3 ' -metoksifenyyli) -2-oksoetyyliJbentsotiatso-liumbromidi; 2.6- amino-3 [2- (4 '-dietyyliaminofenyyli) -2-oksoetyyli]bentso- 15 tiatsoliumbromidi; 2.6- diamino-3 (2-(4 '-bromifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatso-liumbromidi; 2.6- diamino-3 (2- (2-fenyyli-2-oksoetyyli) bentsotiatsoliumbromi-di; 20 2,6-diamino-3 [2- (4 ' -fluorifenyyli-2-oksoetyyli]bentsotiatso- liumbromidi; * * 3-asetamido-4-metyyli-5-tiatsolyyli-etyyliasetaattimesity- : ’.· leenisulfonaatti; • · · 2.3- diamino-5-metyylitiatsoliummesity leenisulf onaatti; 25 3- [ 2- (2 ' -naftyyli) -2-oksoetyyli ] - 4-metyyli-5- (2 ' -hydrok- ·*.. sietyyli) -tiatsoliumbromidi; 3-[2- (3,5-di-tert-butyyli-41 -hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5-(2'-hydroksietyylitiatsoliumbromidi; 3 — [2 — (21,6'-dikloorifenetyyliamino) -2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-30 (2'-hydroksietyyli)tiatsoliumbromidi; 3- [ 2-dibutyyliamino-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydrok- • · • “ sietyyli)-tiatsoliumbromidi; • · · *.* 3-[2-4'-karbetoksianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hyd- • · roksietyyli) -tiatsoliumbromidi; .···. 35 3- [2- (2 ' , 6 ' -di-isopropyylianilino) -2-oksetyyli) -4-metyyli-5- *·]· (2 ' -hydroksietyyli) -tiatsoliumbromidi; • · · I · » • · · · 16 3-amino-4-metyyli-5-[2-(2 ', 6' -diklooribentsyylioksi)etyyli]-tiatsoliummesityleenisulfonaatti; 3 - [ 2-(41-karbmetoksi-3'-hydroksianilino)-2-oksoetyyli]-4-xnetyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi; 5 2,3-diamino-4,5-dimetyylitiatsoliumesityleenisulfonaatti; 2.3- diamino-4-metyyli-5-hydroksietyyli-tiatsoliummesity-leenisulfonaatti; 2.3- diamino-5-(3',4'-trimetyleenidioksifenyyli)-tiatsolium-mesityleenisulfonaatti; 10 3 [ 2-(1' , 4'-bentsodioksan-6-yyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5- (2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi; 3-[2-(3',4'-trimetyleenidioksifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyy-li-5-(2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi; 3 - (2 -[ 11,4-bentsodioksanyyli]-2-oksoetyyli) -tiatsoliumbromidi; 15 3— [2— (3 ', 4'-trimetyleenidioksifenyyli) -2-oksoetyyli]-tiatso liumbromidi; 3 -[2 -(3 ', 51 -di-tert-butyyli-4' -hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi; 3-[2-(3 ' ,5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]-20 4-metyyli-tiatsoliumbromidi; 3-[2- (3 ', 5' -di-tert-butyyli-4' -hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli] - * ‘ 5-metyyli-tiatsoliumbromidi; : *.· 3-[2-(3 ',5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- 4,5-dimetyyli-tiatsoliumbromidi; 25 3 -[2 - (3 ', 5'-di-tert-butyyli-41 -hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- ·*·.. bentsotiatsoliumbromidi; l-metyyli-3-[2-(3 1,51-di-tert-butyyli-4 '-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]-imidatsoliumbromidi; 3-[2-(4'-n-pentyylifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi; 30 3 — [2 — (4 ' -n-pentyylifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2 ' - .. hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi; • · “ 3 — [2— (4 '-dietyyliaminofenyyli) -2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2 '- • · *·* ^ hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi; ;*·* 3- (2-fenyyli-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5-vinyyli-tiatsoliumbro- .*·*. 35 midi; • · « . 3-[2-(3 ' ,5'-tert-butyyli-4 '-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli) -4- • · · : metyyli-5-vinyyli-tiatsoliumbromidi; ····* 17 3-(2-tert-butyyli-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi 3-(2-tert-butyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyy- li)-tiatsoliumbromidi; 3-(3'-metoksibentsyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-tiat-5 soliumkloridi; 3- (2 ', 6 ' -diklooribentsyyli) -4-metyyli-5- (2 ' -hydroksietyyli) -tiatsoliumkloridi; 3-(2 '-nitrobentsyyli)-4-metyyli-5-(2 '-hydroksietyyli) -tiatsoliumbromidi ; 10 3[2-(41-kloorifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi; 3 [2- (4 1 -kloorifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2 ' -hydroksietyyli) tiatsoliumbromidi, ja 3[2-(41-metoksifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli) -tiatsoliumbromidi.
15
Tietyt kaavalla I esitetyt yhdisteet ovat uusia yhdisteitä, jotka edustavat tämän keksinnön lisäsovellusmuotoa. Näitä yhdisteitä esittää seuraava kaava 20 Y X° R^N0 (Ia) r X y*
: Y R^S
• ♦ · • » • ·♦ • · · • V 25 jossa R1 ja R2 valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu • · • *. vedystä, hydroksi(alempi)alkyylistä, asetoksi(alempi)alkyylis- tä, alemmasta alkyylistä, alemmasta alkenyylistä, tai R1 ja R2 yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä kanssa voivat olla aromaattinen, yh- distetty rengas, joka on substituoitu valin-30 naisesti yhdellä tai useammalla amino-, halogeeni- tai alky-leenidioksiryhmällä; * *» Z on vety tai aminoryhmä; . Y on amino, ryhmä, jolla on seuraava kaava ··« • · • ·
35 O
*:·. Il
; :* -CH2C-R
• · · · 18 jossa R on alempi alkyyli-, alkoksi-, hydroksi-, amino- tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on subs-tituoitu valinnaisesti yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, alemmalla alkoksi-, halogeeni-, dial-5 kyyliamino-, hydroksi-, nitro- tai alkyleenidioksi- ryhmällä; ryhmä, jolla on seuraava kaava -CH2R' jossa R1 on vety tai alempi alkyyli-, alempi alkynyy-10 li- tai aryyliryhmä; tai ryhmä, jolla on seuraava kaava O R"
Il I
-CH2C-N-R” 15 jossa R' ' on vety ja R' 1 ' on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti subtituoitu aryyliryhmällä, tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyy-20 li-, halogeeni- tai alkoksyylikarbonyyliryhmällä; tai R'' ja R'11 ovat molemmat alempia alkyyliryhmiä; • · · · *« · : · edellyttäen, että ainakin yksi Y:stä ja Z:sta on aminoryhmä, *...· ja lisäksi edellyttäen, että kun Y on amino ja R2 ja Z molemmat * · · • 25 ovat vety, silloin R2 on muu kuin alempi alkyyliryhmä; ja X on : *- halogenidi-, tosylaatti-, metaanisulfonaatti- tai mesityleeni- ioni.
*
Muita uusia yhdisteitä ovat yhdisteet, joilla on seuraava 30 rakennekaava
* 1· O
Y x°
* ♦ I
T Vz
:*** 35 R1^S
««· • · * · • · • · » 19 jossa R1 ja R2 valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, hydroksi(alempi)alkyylistä, asetoksi(alempi)alkyylis-tä, alemmasta asyylioksi(alempi)alkyylistä, alemmasta alkyylistä tai R1 ja R2 yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä 5 kanssa voivat olla aromaattinen yhdistetty rengas; Z on vety tai aminoryhmä; Y on alkynyylimetyyliryhmä tai ryhmä, jolla on seu-raava kaava O R"
10 II I
-CH2C-N-R·" jossa R' ' on vety ja R' ' 1 on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla 15 alkyyli-, halogeeni- tai alkyylioksikarbonyyliryhmällä; tai R'' ja R''' molemmat ovat alempia alkyyliryhmiä; ja X on halogenidi-, tosylaatti-, metaanisulfonaatti-tai mesityleenisulfonaatti-ioni.
20 Edellä esitetyt yhdisteet pystyvät inhiboimaan pitkälle eden-neen glykosykoinnin lopputuotteiden muodostumisen kohdemole-... kyyleillä, esimerkiksi proteiinit mukaan luettuina, ja ne pystyvät pilkkomaan tällaisilla proteiineilla jo muodostuneet • * [y· pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteet tai muuttamaan • · · : · 25 niiden suuntaa. Proteiinin silloittuminen, siten että muodos-• · : ’·' tuu jo pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteita, edis- • · tää sitä, että saadaan satimeen muita proteiineja ja päädytään in vivo sellaisten tilanteiden kehittymiseen, jossa ihon elastisuus on vähentynyt, iho rypistyy, tiettyihin munuaissairauk-30 siin, valtimonkovetustautiin, nivelrikkoon ynnä muihin sellai- j·.^ seen tauteihin. Kasvimateriaali, joka ruskettuu ei-entsymaat- * .·;· tisesti, turmeltuu, ja ruoka-aineiden tapauksessa se pilaantuu • · [· · tai sitkistyy, ja sen seurauksena se tulee syötäväksi kelpaa- « · *.* mattomaksi, pahanmakuiseksi ja ei-ravitsevaksi. Tämän keksin- • · · 35 non mukaan käytetyt yhdisteet inhiboivat täten pitkälle ehti- • · : .* neessä vaiheessa olevan Maillardin efektin ja estävät edellä • · · .... kuvatut pilaavat muutokset sekä vähentävät pitkälle edenneen 20 glykosyloinnin jo läsnä olevien lopputuotteiden tasoa prote-iinimateriaalissa.
Tämän keksinnön järjellinen periaate on käyttää vaikuttavia 5 aineita estämään glykosyloinnin jälkeinen vaihe sekä muuttamaan sen suuntaa, esimerkiksi estämään sellaisten fluoroivien kromoforien ja siltojen muodostuminen, jotka liittyvät ja johtavat sokeritaudin ja vanhenemisen haitallisiin jälkitauteihin. Ihanteellinen vaikuttava aine estäisi tällaisten 10 kromoforien sekä proteiinisäikeiden välisten siltojen muodostumisen ja proteiinien tarttumisen muihin proteiineihin, mitä tapahtuu valtimoissa ja munuaisissa, sekä muuttaisi tällaisen, jo läsnäolevan sillanmuodostumistason suuntaa.
15 Varhaisen glykosyloinnin sellaisten tuotteiden kemiallinen luonne voi vaihdella, joiden kanssa esillä olevan keksinnön yhdisteiden uskotaan reagoivan, ja niinpä termi "varhaisen glykosyloinnin tuote tai tuotteet" tässä yhteydessä käytettynä on tarkoitettu sisältämään piiriinsä mitkä tahansa ja kaikki 20 tällaiset variaatiot. Esimerkiksi on pidetty selviönä varhai-....· sen glykosyloinnin sellaisia tuotteita, joissa on karbonyy- .. . liosia, jotka sisältyvät pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteiden muodostumiseen ja jotka voidaan saartaa reak- • · !*·· tiolla, joka tapahtuu tämän keksinnön yhdisteiden kanssa.
• · i . 25 Eräässä sovellusmuodossa muodostetaan sellainen kuva, että • · : *· varhainen glykosulointituote voi sisältää Amadori-tuotteiden • · reaktiokykyisiä karbonyyliosia tai niiden lisäkondensointi-, - dehydratointi- ja (tai) -uudelleenjärjestäytymistuotteita, jotka voivat kondensoitua, jotta muodostuu pitkälle edenneen 30 glykosyloinnin lopputuotteita. Toisessa skenaariossa reak- :·. tiokykyiset karbonyyliyhdisteet, jotka sisältävät yhden tai • · φ... useampia karbonyyliosia, voivat muodostua Amadori- tai varhai- • · \ . sen glykosyloinnin muiden lopputuotteiden pilkkoutumisesta, ja ··· V myöhemmillä reaktioilla amiini- tai Amadori-tuotteiden kanssa • · · 35 ne voivat muodostaa karbonyylin, joka sisältää pitkälle eden- : V neen glykosyloinnin tuotteita, kuten esimerkiksi alkyylifor- • · myyli-glykosyylipyrroleita.
21
Useat tutkijat crvat tutkineet pitkälle edenneen glykosyloinnin tuotteen muodostumisen mekanismia. Eble et ai.:n (1983) tutkimukset in vitro. jotka on esitetty julkaisussa J. Biol. Chem., 258:9406 - 9412, koskivat glykosyloituneen proteiinin silloit-5 tumista ei-glykosyloituneen proteiinin kanssa glukoosin puuttuessa. Eble et ai. yrittivät selventää Maillardin reaktion mekanismia, ja näin ollen he panivat mallijärjestelmänä toimeen RNAasin säädellyn alkuglykosyloinnin, jota tutkittiin sitten vaihtelevissa olosuhteissa. Tutkimuksen eräässä näkö-10 kohdassa eristettiin glykosyloitu proteiinimateriaali ja asetettiin glukoosittomaan ympäristöön ja sillä tavalla sitä tarkkailtiin silloittumisen lajuuden määrittämiseksi.
Eble et ai. havaitsivat tällöin, että silloittuminen ei jatku-15 nut ainoastaan glykosyloituneen proteiinin vaan se jatkui myös glykosyloitumattoman proteiinin kanssa. Eräs Eble et ai.:n tekemistä havainnoista oli reaktio glykosyloituneen proteiinin ja sellaisen proteiinimateriaalin välillä, joka näytti esiintyvän proteiinin aminohapposivuketjun asemassa. Varmistava 20 koe, jonka Eble et ai. toteuttivat tässä yhteydessä, havainnollisti, että vapaa lysiini kilpailisi RNAasilla sijaitsevan t .. . lysiinin kanssa glykosyloidun proteiinin sitomisesta. Näistä • · tuloksista voidaan tehdä täten johtopäätös, että lysiini voi '··· toimia pitkälle edenneen glykosyloinnin inhibiittorina; tämä ·* i ( I | : . 25 johtopäätös ja siihen johtaneet pohjimmaiset havainnot tulisi • · • ’· tehdä sellaisen mallijärjestelmän suhteellisen rajoitetussa • · yhteydessä, jonka Eble et ai. ovat valmistaneet ja jota he ovat tutkineet. Eble et ai. eivät ymmärrä täysin sellaisia havaintoja, eikä heidän julkaisussaan ole mitään ehdotusta 30 niistä havainnoista, jotka ovat tämän keksinnön perustana, ;·. mitä tulee proteiinien pitkälle edenneen glykosyloinnin inhi- » · bitioon joko in vitro tai in vivo.
• · • · ···
Eble et ai:n kokeet eivät viittaa reaktiokykyiseen pilkkoutu- • ·· •tmm 35 mistuotemekanismiin tai mihinkään muuhun mekanismiin pitkälle : [·* edenneen glykosyloinnin sellaisten lopputuotteiden muodostu- • · misessa in vivo, joissa glukoosi on aina läsnä. Itse asiassa ···· 22 muut tutkijat tukevat tätä mekanismia pitkälle edenneiden gly-kosyloitujen lopputuotteiden muodostumisen selittämiseksi (katso esimerkiksi Hayase et ai., J. Biol. Chem., 263:3758 -3764 (1989); Sell ja Monnier, J. Biol. Chem., 264:21597 - 5 21602 (1989), Oimoni et ai., Agric. Biol. Chem., 53(6):1727 - 1728 (1989); sekä Diabetes Research and Clinical Practice, 6:311 - 313 (1989). Lysiinin käytöllä inhibiittorina Eble et al.:n mallijärjestelmässä ei ole näin ollen mitään yhteyttä tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden käyttökelpoisuuteen 10 pikälle edenneiden glykosyloitujen lopputuotteiden muodostumisen inhibitiossa glukoosin läsnäollessa in vivo sekä sokeritaudin komplikaatioiden ja vanhenemisen paranemisessa.
Vaikka ei haluta sitoutua mihinkään erityiseen teoriaan, 15 esimerkiksi mekanismiin, jolla tämän keksinnön mukaiset yhdisteet palauttavat pitkälle edenneen glykosyloinnin jo muodostuneiden lopputuotteiden suunnan, on kehitelty tutkimuksia mahdollisen mekanismin ratkaisemiseksi. Aiemmat tutkimukset, jotka kohdistuivat Amadori-tuotteen (AP) kohtaloon in vivo. 20 ovat tunnistaneet yhden todennäköisen tien, joka voisi johtaa kovalenttisten, glukoosiperäisten proteiinisidosten muodostu- » .. . miseen. Tämä tie etenee AP:n dehydratoinnin avulla peräkkäis- • · •#<* ten B-eliminaatioiden kautta, kuten myöhemmin esitetään kaa- ’··· viossa A. AP:n 4-hydroksyylin (1) poistuma antaa 1,4-dideoksi- • ♦ · : . 25 l-alkyyliamino-2,3-heksodiuloosin (AP-dionin) (2). AP-dioni, • · • *· jonka rakenne on 1,4-didesoksiosoni, on eristetty siten, että • · ί,ί malli AP:t on otettu kiinni AGE: n inhibiittorin aminogu- anidiinin kanssa. 5-hydroksyylin myöhempi eliminointi antaa 1,4,5-trideoksi-l-alkyyliamino-2,3-heksulos-4-eenin (AP-eeni-30 dionin) (3), joka on eritetty 1,2-enolimuotonsa triasetyyli- ;·. johdannaisena. Amadori-dionien, erityisesti AP-eeni-dionien • · ’... otaksuttaisiin olevan erittäin reaktiokykyisiä proteiinin • · . silloittumisreaktioita kohtaan, siten että ne toimivat kohtei- • · · V na amiinin (Lys, His) tai sulfhydryyli(Cys)-pohjaisten nukle- • · · 35 ofiilien, joita on proteiineissa, lisäämiselle, ja tuottavat ; V täten stabiileja muodon (4) sidoksia.
• · • · · *««« 2 2 ,__mLy*l ιΌ9**1 7" £ cvj Γ r^^Pr^l 5 *vXo„ — j-C ^ °" I 25=1 1 I ''°H i 'OH o—v. H 9—y-x-lPfo«ein] 0H OH [Ly»Ä^>0
«O / n° O
I n in iv 10
On huomattava, että (3):n lineaarinen AP-eenidioni ja (4) :n stabiili silta voi syklisoitua, jotta muodostuu joko 5- tai 6-jäsenisiä laktolirenkaita, vaikka vain 6-jäseninen, syklinen muunnos esitetään edellä kaaviossa A.
15
Tutkittiin sellainen mahdollisuus, että glukoosiperäisen sillan muodostumisen päätie etenee AP-eeni-dionivälivaiheen kautta, kokein, jotka oli suunniteltu tämän tien esiintymisen tutkimiseksi in vivo sekä saamaan aikaan tuloksena olevien a- 20 dikarbonyyli-pohjaisten proteiinin siltojen spesifinen pilk- • koutuminen. Tämän keksinnön mukaisten tiatsoliumyhdisteiden « * * * - * .. . uskotaan täten toimivan "kaksihampaisina" nukleofiileinä, jotka on suunniteltu erityisesti saamaan aikaan fysiologisissa *··’ olosuhteissa hiili-hiilisidoksen katkeamisreaktio sillan • · · • 9 ί . 25 kahden karbonyylin välillä, kuten esitetään seuraavassa kaa- • · : *· viossa B. Tämä kaavio esittää kaavan I mukaisen, prototyyppi- • i sen, α-dionia pilkkovan aineen N-fenasyylitiatsoliumbromidin reaktion AP-eeni-dionista johdetun sillan kanssa.
30 o :·. h h f h 9 ?
h-- -Ä) — mPO
35 oh OH OH
:;·· I
»·« J| « 9 » · 24 = Λ-Ph H 9 9 HQ it, ΜΗ*Ο^Λ-ΡΙι 5 f0 VÖ OH MhOLo, f^X-lProton)
OH
Lisätutkimus tämän reaktion selventämiseksi sisältää kaavan I 10 mukaisen yhdisteen N-fenasyylitiatsoliumbromidin reaktion 1-fenyyli-1,2-propaanidionin kanssa, niin että saadaan aikaan ennustettu fissiotuote bentsoehappo. N-fenasyylitiatsoliumbromidin reaktio 1-fenyyli-l,2-propaanidionin kanssa oli nopea, ja se eteni helposti, mikä varmisti tämän mahdollisen mekanis-15 min.
Kun proteiineilla muodostuu varhaisia, glukoosiperäisiä addi- tiotuotteita, jälkeenpäin voi seurata lisäreaktioita, jotta saadaan aikaan kovalenttisen proteiini-proteiininsillan muo- 20 dostava reaktio. Kaavan I mukaisen yhdisteen N-fenasyylitiat- soliumbromidin annettiin reagoida tällä tavalla AGE-siltojen ..t. kanssa, jotta natiivi kollageeni muodostuu, kun AGE:llä muun- ’,,1 netun BSA: n (AGE-BSA) annetaan reagoida muuntamattoman, natii- .;*· vin kollageenin kanssa. Tämä antoi tulokseksi pitoisuuden • « • · 25 mukaisen BSA:n vapautumisen ennalta muodstuneista AGE-välit- Ϊ * teisistä komplekseista. Tämä tutkimus varmisti jälleen, että • · ·,* merkittävä osa sellaisista AGE-silloista, jotka muodostuvat koeolosuhteissa, koostuvat α-diketonista tai läheisestä rakenteesta, joka herkästi pilkkoutuu kaava I mukaisten yhdisteiden 30 edullisilla, kaksihammastyyppisillä molekyyleillä fysiologi- ί*. sisssa olosuhteissa.
* · * »· • «
Sen varmistamiseksi, että sama tilanne esiintyy in vivo.
% · *·* käsiteltiin eristettyä kollageeniä, joka oli saatu sellaisten • · · 35 rottien hännän jänteistä, jotka olivat poteneet sokeritautia • · :.* 32 viikon ajan, kaavan I mukaisella yhdisteellä N-fenasyyli- • · · ,,,, tiatsoliumbromidilla ennen syanogeenibromidiuuttoa ja geeli- 25 elektroforeesianalyysiä. Myöhempi elektroforeesi paljasti, että käsiteltyä kollageeniä ei voitu erottaa käsittelemättömästä, ei-diabeetikon (kontrolli) kollageenistä, mikä oli selvä vastakohta AGE:llä muunnetulle, voimakkaasti silloite-5 tulle, uuttamista kestävälle kollageenille, joka tyypillisesti eristetään sokeritautia potevista eläimistä.
Tämä keksintö koskee samalla tavalla menetelmiä, pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteiden muodostumisen inhi-10 boimiseksi ja mainitun glykosyloinnin jo muodostuneiden lopputuotteiden tason suunnan muuttamiseksi, joissa menetelmissä kohdemolekyylit saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen koostumuksen kanssa. Esimerkissä, jossa kohdeproteiinit sisältyvät ruoka-aineisiin, jotka ovat joko kasvi- tai eläin-15 peräisiä, näihin ruoka-aineisiin voitaisiin erilaisin menetelmin käyttää koostumusta, joka sisältää näitä vaikuttavia aineita.
Elintarviketeollisuuden piirissä havaittiin vuosia sitten, 20 että sulfiitit inhiboivat Maillardin reaktiota ja niitä käyte-*:*·: tään yleisesti valmisruoissa ja varastoiduissa ruoissa. Ruoan sisältämät sulfiitit ovat tuottaneet kuitenkin viime aikoina • · .***. vakavia ja jopa kohtalokkaita reaktioita astmaatikoilla. Sen • · · seurauksena on kielletty tuoreiden hedelmien ja vihannesten ' 25 sulf iittikäsittely. Niinpä tämän keksinnön mukaiset koostumuk- • · · *. . set ja vaikuttavat aineet tarjoavat tämän tapaista elintar- • · · vikkeiden käsittelyä varten myrkyttömän vaihtoehdon.
Tämän keksinnön piiriä koskevasta tarkastelusta käy ilmi, että 30 nämä menetelmät ja koostumukset pitävät lupauksen estää avain- • *·· proteiinien vanheneminen ja jossain määrin muuttaa sen suuntaa :[:* sekä eläimissä että kasveissa ja sen myötä suoda sekä talou- y,·’ dellisia että lääketieteellisiä etuja.
• · ··« • · 35 Elintarvikkeita koskevassa esimerkissä tämän koostumuksen • · ·.· j käyttö pitää lupauksen hidastuttaa ruoan pilaantumista ja *:··: siten lisätä elintarvikkeiden säilytysaikaa ja tehdä ne kulut- 26 tajalle käyttökelpoisemmiksi. Tämän keksinnön lisäetuna on yleisesti käytettyjen säilöntäaineiden, kuten rikkidioksidin, joka aiheuttaa allergioita ja astmaa, korvaaminen myrkyttömillä, biologisesti yhteen sopivilla yhdisteillä.
5 Tämän keksinnön terapeuttiset seuraamukset koskevat van-henemistapahtuman pysäyttämistä tai jossakin määrin suunnan muuttamista, joka tapahtuma, kuten aiemmin esitettiin, on tunnistettu ja esimerkein esitetty, pitkälle edenneenä gly-10 kosyloitumisena ja silloittumisena avainproteiinien vanhenemisessa. Kehon proteiinit ja erityisesti rakenneproteiinit, kuten kollageeni, elastiini, linssin proteiinit, hermoprote-iinit, munuaisen glomeruluksen tyvikalvomembraanit ja muut suonen ulkopuolisen matriksin komponentit hyötyisivät kaikki 15 pitkäikäsyydessä ja toiminnassaan tämän keksinnön toteuttamisesta. Tämä keksintö vähentää täten sellaisten patologisten tilojen esiintymistiheyttä, joihin sisältyy proteiinien salpaus silloitetuilla kohdeproteiineilla, kuten retinopatiaa, kaihia, sokeritautiperäistä munuaissairautta, munuaiskeräsen 20 kovettumista, perifeerisiin verisuoniin liittyvää sairautta, *:··* halvausta, kohonnutta verenpainetta, valtimonrasvoittumis- ·’·*: tautia eli ateroskleroosia, nivelrikkoa eli osteoartriittia, • · .***. niveltä ympäröivää jäykkyyttä, ihon jostavuuden häviötä sekä • · · :*.·. rypistymistä, nivelien jäykistymistä, munuaiskerästulehdusta |·/ 25 eli glomerulonefriittiä jne.. Samalla tavalla kaikki nämä • · · *. . tilat ovat todistettavia ja niillä on taipumus esiintyä li- • · · * sääntyvällä nopeudella potilaissa, jotka kärsivät tämän hyper-glykemian seurauksena sokeritaudista. Tämä hoitomenetelmä on täten asiaankuuluva mainittujen ja läheisten tilojen hoidossa 30 potilailla, jotka ovat hyvin iäkkäitä tai jotka kärsivät jos- • · • '·· tain mainituista patologisista tiloista.
• · · • · • · y..' Molekyylin silloittuminen pitkälle edenneen glykosyloinnin • · tuotteen muodostumisen kautta voi vähentää rakenneproteiinien, *”·. 35 kuten verisuonen seinämän kollageenin, liukoisuutta, ja sil-• · j.j | loittuminen voi myös pidättää seerumin proteiineja, kuten ·;··: lipoproteiineja kollageeniin. Tämä voi johtaa endoteeliumin 27 lisääntyneeseen permeabilitettiin ja niin muodoin sitoa verisuonista ulospäässeet plasman proteiinit kovalenttisesti endoteelinalaiseen matriksiin ja vähentää sekä plasma- että matriksiproteiinien herkkyyttä entsyymien aikaansaamalle 5 fysiologiselle hajoamiselle. Näistä syistä diabeetikon verisuonien jatkuvasti etenevän tukkeutuminen, jonka krooninen hyperglykemia saa aikaan, on oletettu tulokseksi sokeriperäis-ten ja erityisesti glukoosiperäisten siltojen ylimääräisestä muodostumisesta. Tällaiset diabeetikon mikroverisuonien muu-10 tokset ja tukkeutuminen voidaan estää tehokkaasti ja kääntää niiden suuntaa pitkälle edenneen glykosyloinnin tuotteen muodostumisen kemiallisen inhibition ja suunnan muutoksen avulla, siten että käytetään tämän keksinnön koostumusta ja menetelmiä.
15
Tutkimukset ilmaisevat, että kroonisen sokeritaudin aiheuttaman vaurion kehittyminen kohde-elimissä kytkeytyy ensisijaisesti hyperglykemiaan, niin että tiukka metabolian säätely viivyttäisi ja vieläpä estäisi pääte-elimen vaurioitumista. 20 Katso Nicholls et ai., Lab. Invest.; 60, nro 4, sivu 486 ””· (1989), jossa tarkastellaan saarekeisograftien muodostumisen :*·[· ja aminoguanidiinin vaikutusta hiiren sokeritautiperäisessä :*** nefropatiassa. Nämä tutkimukset todistavat lisäksi, että ··· :·.*. aminoguanidiini vähentää aortan seinämäproteiinin silloittu- • · :·. 25 mistä sokeritautia potevilla rotilla, ja ne varmistavat aiem- • · ' \φ. mat tutkimukset, jotka Brownlee et ai., Science, 232:1629 - • ·
1632 (1986) ovat toteuttaneet tällä elimellä, joka on joutunut sokeritaudin komplikaation lisäkohteeksi. Lisätutkimus osoitti myös, että immunoglubuliinin salpautuminen väheni munuaisissa 30 aminoguanidiinilla (Brownlee et ai., Diabetes, 35 (1): 42A
:*’· (1986)).
··· • * • · .···* Brownlee et ai. 1988 todistivat edellä esitetyssä julkaisussa • · l·· lisäksi, että streptotsosiinidiabetesrottamallilla aminogua- *1*. 35 nidiinin anto tulee esteeksi sokeritautiperäisen nefropatian • · ;.· . kehittymisessä, mitä tulee munuaisten morfologisiin muutok- *:** siin, jotka ovat sokeritautiperäisen munuaissairauksen tunto- 28 merkki. Nämä tutkijat raportoivat, että aminoguanidiini esti glomeruluksen tyvikalvon paksuuden lisääntymisen, joka on sokeritautiperäiselle munuaissairaudelle ominainen, pääasiallinen rakenteellinen epänormaalisuus.
5 Nämä tulokset yhdessä viittaavat voimakkaasti siihen, että pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteiden (AGE:iden) muodostumisen inhibitio ja suunnan muutos tämän keksinnön opetusten mukaisesti voi estää myöhäisiä sekä aikaisia raken-10 teellisiä vaurioita, jotka johtuvat sokeritaudista samoin kuin ikääntymisen aikana tapahtuvista muutoksista, jotka johtuvat AGE:iden muodostumisesta, sekä jossain määrin muuttaa niiden suuntaa.
15 Sokeritaudin aikaansaamat sellaiset muutokset punaisten verisolujen muodonmuutoskyvyssä, jotka johtavat jäykempiin solu-kalvostoihin, on silloittumisen toinen ilmenemismuoto, jonka on osoitettu estyvän aminoguanidiinilla in vivo. Tällaisissa tutkimuksissa käytetään Uuden Seelannin valkoisia kaniineja, 20 joilla on aikaansaatu pitkäkestoinen sokeritauti, tutkittaessa *!*· koeyhdisteen vaikutusta veren punasolun (RBC) muodonmuutosky- kyyn (df) . Koeyhdistettä annetaan sokeritautia potevien rot- • » tien suuonteloon määränä, joka on 100 mg/kg.
♦ ·· • i i • * • t ··, 25 Sokeritaudin lisäseuraamus on hyperglykemian aikaansaama • · luumatriksin erilaistuminen, joka johtaa siihen, että luuta • · * muodostuu vähemmän, mikä liittyy tavallisesti krooniseen sokeritautiin. Sokeritauti vähentää eläinmalleissa matriksin indusoimaa luun erilaistumista 70 prosentilla.
30 • * * ’· Sellaisessa esimerkissä, jossa tämän keksinnön koostumuksia
Ml käytetään hyväksi in vivo tai terapeuttisiin tarkoituksiin, ,··** täytyy huomata, että tässä käytetyt yhdisteet ja vaikuttavat λ. aineet sopivat biologisesti yhteen. Farmaseuttiset koostumuk- Ί*. 35 set voidaan valmistaa tämän keksinnön yhdisteiden tai vaikut- • · ♦ ,· tavien aineiden terapeuttisesti tehokkaana määränä, ja ne *:*·- voivat sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainet- 29 ta, joka valitaan sellaisten tunnettujen materiaalien joukosta, joita käytetään tähän tarkoitukseen. Tällaiset koostumukset voidaan valmistaa erilaisissa muodoissa, jotka ovat anto-menetelmän mukaisia. Voidaan käyttää myös kaavan I mukaisia, 5 erilaisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja.
Nestemuotoa voitaisiin käyttää, silloin kun anto toteutetaan suonensisäisenä, lihaksensisäisenä tai vatsakalvonontelon sisäisenä ruiskeena. Silloin kun on sopivaa, kiinteät annos-10 muodot suun kautta toteutettavaa antoa varten voidaan valmistaa esimerkiksi tabletteina, kapseleina tai nestemäisinä annosmuotoina, kuten liuoksina ja suspensioina ja niin edel-lee. Paikallista tai dermaalista antoa varten iholle tai silmään liuos, pesuneste tai voide voidaan formuloida vaikut-15 tavan aineen kanssa sopivassa apuaineessa, kuten vedessä, propyleeniglykolissa, jossa on mahdollisesti kantaja, joka auttaa tunkeutumista ihoon tai silmään. Paikallinen valmiste voisi sisältää noin 10 prosenttia kaavan I mukaista yhdistettä. Tutkitaan myös muut sopivat muodot muihin kehon kudoksiin 20 toteutettavaa antoa varten.
• · .. . Sellaisessa esimerkissä, jossa tällä menetelmällä on terapeut- tista käyttöä, eläimelle, joka on tarkoitettu hoidettavaksi, • · ]···' on voitu antaa määrä yhtä tai useampaa vaikuttavaa ainetta : .‘ 25 sopivassa farmaseuttisessa muodossa. Anto voidaan toteuttaa • • *·· tunnetuin tekniikoin, kuten suun kautta, paikallisesti ja • · ·' parenteraalisin tekniikoin, kuten intradermaalisesti, ihon alaisesti, laskimonsisäisesti tai vatsaontelonsisäisenä ruiskeena, sekä muulla tavanomaisella tavalla. Vaikuttavien anei-30 den anto voi toteutua pidennetyn ajanjakson kuluessa annos-tasolla, joka on esimerkiksi aina noin 30 mg:aan saakka kiloa • · * *·.. kohti.
« · • · • · ♦ * ♦ ·.· Kuten edellä mainittiin, keksintö koskee myös menetelmää • · ♦ 35 hampaan sellaisen tummumisen inhiboimiseksi ja suunnan muutta- : V miseksi, joka on peräisin ei-entsymaattisesta ruskettumisesta, • « · ! joka tapahtuu suuontelossa, jossa menetelmässä henkilölle, 30 joka tarvitsee tällaista hoitoa, annetaan rakennekaavan I mukaista vaikuttavaa ainetta sisältävää koostumusta määrä, joka on tehokas inhiboimaan jo pitkälle edenneen glykosyloin-nin lopputuotteiden muodostumisen ja palauttamaan niiden 5 muodostumisen suunnan.
Ei-entsymaattinen ruskettumisreaktio, joka tapahtuu suuontelossa, saa aikaan hampaan tummumisen. Plakin muodostumista estävät, nykyisin käytetyt aineet kiihdyttävät tätä ei-entsy-10 maattista ruskettumisreaktiota ja edelleen hampaan värjäytymistä. Äskettäin on formuloitu suun huuhteluliuoksiksi säännöllistä käyttöä varten, suun bakteereiden tappamiseksi, sellaisten kationisten, mikrobienvastaisten, vaikuttavien aineiden luokka, joilla on ominaisuuksia, jotka huomattavasti 15 estävät plakin muodostumista. Näihin vaikuttaviin, kationisiin antiseptisiin aineisiin kuuluu sellaisia vaikuttavia aineita kuin aleksidiini, setyylipyridiniumkloridi, klooriheksidiini-glukonaatti, heksetidiini sekä bentsalkoniumkloridi.
20 Hampaiden värjäytyminen klooriheksidiinillä ja muilla plakin ____. muodostumista estävillä aineilla johtuu ilmeisesti Maillardin .. . reaktiosta. Nordbo raportoi julkaisussa J. Dent. Res., 58:1429 • · ·.,·* (1979) , että klooriheksidiini ja bentsalkoniumkooridi kataly- *···' soivat ruskettumisreaktioita in vitro. Klooriheksidiini, joka • · · : *.* 25 on lisätty sokerijohdannaista ja aminoryhmien lähdettä sisäl-• · • *·· täviin seoksiin, läpikävi lisääntyneen värinmuodostuksen, mikä • · .* luetaan Maillardin reaktion syyksi. Tiedetään myös, että klooriheksidiini tuottaa lisääntynyttä hammaspellikkeliä. Norbo ehdotti, että klooriheksidiini sai aikaan hampaan vär-30 jäytymisen kahdella tavalla: ensinnäkin se lisäsi sellaisen :·. pellikkelin muodostumista, joka sisältää enemmän aminoryhmiä, • · · *... ja toiseksi se katalysoi Maillardin reaktiota, joka johti • · *. . värjäytyneisiin tuotteisiin.
• · · • · • · m : 35 Tämän menetelmän mukaan formuloidaan kaavan I mukaiset yhdis- ; V teet koostumuksiksi, jotka sovelletaan suuontelossa toteutet- ♦ · · tavaa käyttöä varten. Erityisen sopivia formulaatioita ovat 31 suun huuteluaineet ja hammastahnat, jotka sisältävät aktiivista ainetta.
Tämän keksinnön toteutuksessa käytetään hyväksi tekniikoita 5 myrkyttömien, farmaseuttisesti hyväksyttävien kantaja-aineiden kanssa, joita käytetään tyypillisesti määrinä ja yhdistelminä, jotka tunnetaan tällaisten suun huuhteluaineiden ja hammastahnojen formuloinnissa.
10 Kaavan I mukainen vaikuttava aine formuloidaan koostumuksissa määränä, joka on tehokas inhiboimaan pitkälle edenneen gly-kosyloinnin lopputuotteiden muodostumisen ja kääntämään sen suunnan. Tämä määrä vaihtelee tietyn käytettävän aineen ja annosmuodon mukaan, mutta se on tyypillisesti alueella 0,01 -15 0,1 painoprosenttia tietystä formulaatiosta.
Yhdisteet, jotka kaava I käsittää, valmistetaan mukavasti kemiallisen synteesin avulla, joka on tekniikan tason mukaan hyvin tunnettu. Tietyt kaavan I sisältämät yhdisteet ovat 20 hyvin tunnettuja yhdisteitä, jotka ovat helposti saatavilla . kemikaalien toimittajilta ja (tai) valmistettavissa syn- .. . teesimenetelmillä, jotka erityisesti on julkaistu niitä var- • ♦ · • ·* ten. Esimerkiksi 3,4-dimetyyli-5-(2-hydroksietyyli)tiatso- *·.. liumjodidi; 3-etyyli-5- (2-hydroksietyyli) -4-metyylitiatsolium- M · • V 25 bromidi;3-bentsyyli-5-(2-hydroksietyyli) -4-metyylitiatsolium- • · • '·· kloridi sekä 3-(karboksimetyyli)bentsotiatsoliumbromidi ovat :V: saatavilla Aldrich Chem. Co.:lta.
Sellaisia yhdisteitä, joita kuvataan kemiallisessa ja patent-30 tikirjallisuudessa tai jotka ovat suoraan valmistettavissa niissä kuvatuin menetelmin ja jotka kuuluvat kaavan I piiriin, • · · ”... ovat esimerkiksi 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatso- \ . liumbromidi ja 3-bentsyyli-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyylitiat- soliumkloridi [Potts et ai, J. Org. Chem., 41:187 - 191 35 (1976)].
• · • · • · ··· · »««· 32
Tietyt kaavan (I) mukaiset yhdisteet ovat uusia yhdisteitä, jotka tekniikan tason mukaan eivät ole tähän mennessä tunnettuja. Nämä yhdisteet ovat yhdisteitä, joita esittää kaava Ia Y X° 5 R^N® T Vz <Ia)
R^S
jossa R1 ja R2 valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, hydroksi(alempi)alkyylistä, asetoksi(alempi)alkyylis-10 tä, alemmasta alkyylistä, alemmasta alkenyylistä, tai R1 ja R2 yhdessä renkaanseen sisältyvien hiiliatomiensa kanssa voivat olla aromaattinen, yhdistetty rengas, joka on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla amino-, halogeeni- tai alkyleenidioksiryhmällä; 15 Z on vety tai aminoryhmä;
Y on amino, ryhmä, jolla on seuraava kaava O
20 11 -ch2c-r • · · · · .. . jossa R on alempi alkyyli-, alkoksi-, hydroksi-, t · • ·’ amino- tai aryyliryhmä, mainittu aryyliryhmä on va- *··. linnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla alem- • · · : V 25 maila alkyyli-, alemmalla alkoksi-, halogeeni-, dial- • · • *· kyyliamino-, hydroksi-, nitro- tai alkyleenidioksi- • · ::. ryhmällä; ryhmä, jolla on seuraava kaava -CH2R' 30 jossa R' on vety tai alempi alkyyli-, alempi alkynyy- li- tai aryyliryhmä; • ♦ · j... tai ryhmä, jolla on seuraava kaava • · :T O R"
Il I
• 11 1 ···· -CHiC-N-R’" • · * • · * # · • · • · · · 33 jossa R' ' on vety ja R"1 on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu aryyliryhxnällä, tai aryyliryhmä, mainittu eryyliryhmä on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla alemman alkyy-5 Iin-, halogeenin- tai alkoksyylikarbonyylin ryhmällä; tai R'' ja R,M ovat molemmat alemman alkyylin ryhmiä; edellyttäen, että ainakin yksi Y:stä ja Z:sta on aminoryhmä, 10 ja edellyttäen vielä, että Y on amino ja R2 ja Z molemmat ovat vety, silloin Rx on muu kuin alempi alkyyliryhmä; ja X on halogenidi-, tosylaatti-, metaanisulfonaatti-tai mesityleeni-ioni.
15
Muut uudet yhdisteet ovat kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa Y on alempi alkynyylimetyyliryhmä tai ryhmä, jolla on seuraava kaava O R"
20 il I
-CHnC-N-R" ♦ «·· • · · • * : ·* jossa R' ' on vety ja R' ' ' on alempi alkyyliryhmä, valinnai- • · · *... sesti substituoitu aryyliryhmä tai aryyliryhmä, mainittu • · · ; V 25 aryyliryhmä on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useam-·· • *· maila alkyyli-, halogeeni- tai alkoksyylikarbonyyliryhmällä; :V: tai R'' ja R'·1 molemmat ovat alempia alkyyliryhmiä.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa Y on ryhmä, jolla on 30 seuraava kaava
O
l ··· Il
:*:* -CH2C-R
• · ··· jossa R on alempi alkyyli-, alkoksi-, hydroksi-, ami- 35 no- tai aryyliryhmä; . V tai ryhmä, jolla on seuraava kaava ’ -CHoR', ···· “ 34 jossa R1 on vety tai alempi alkvyli- tai aryyliryhmä; X on halogenidi-, tosylaatti-, metaanisulfonaatti-tai mesityleenisulfonaatti-ioni; voidaan valmistaa menetelmin, joita kuvataan julkaisussa Potts 5 at ai., J. Org. Chem., 41:187 (1976), sekä julkaisussa J. Org. Chem., 42:1648 (1977) tai myöhemmin esitetyn kaavion I mukaisesti .
Kaavio I
10 O
H 11 I o ch2c-r rVN\s » E,OH rL^n© x° R1 >z + XCH*CR —► Xyz
R S
15 (Π) (ΙΠ) a) jossa R1 R2, Z ja R ovat edellä esitetyn määritelmän mukaisia ryhmiä ja X on halogeeniatomi.
20 Reaktiokaaviossa I sellaisten sopivan, substituoidun tiat- soliyhdisteen, jolla on kaava II, jossa R1:llä, R2:lla ja Z:lla .. . on tässä yhteydessä aiemmin määritellyt merkitykset, annetaan • · •#>* reagoida sopivan halogeeniyhdisteen kanssa, jolla on kaava *··· III/ jossa R:llä ja X:llä on tässä yhteydessä aiemmin määri- • · · : . 25 tellyt merkitykset, jotta saadaan haluttu yhdiste, jolla on • · ♦ *· kaava I, jossa R1, R2, Z, R ja X ovat tässä yhteydessä edellä • · Σ,ί esitetyn määritelmän mukaisia ryhmiä.
Tämä reaktio toteutetaan tyypillisesti palautusjäähdytyslämpö-30 tiloissa noin 1-3 tunnin kuluessa. Reaktion toteuttamiseen käytetään normaalisti poolista liuotinta, kuten etanolia.
• ♦ ··· • · • φ
Kaavan I mukainen yhdiste, jossa Y on aminoryhmä, voidaan ··· ·.* valmistaa menetelmien mukaan, joita Tamura et ai. kuvaavat ··*
35 julkaisussa Synthesis, 1 (1977), tai myöhemmin kaaviossa II
• · : ,· esitetyllä tavalla.
• · • · · , »··· 35
Kaavio II
NIL
H vO
I O-mesityleenisulf onyyli- oOn© λ 5 RTVz ------------------------- X>z / hydroksyyliamiini R ^ R j jossa R1:llä, R2:lla ja Z:lla on tässä yhteydessä edellä määri-10 tellyt merkitykset.
Kaaviossa II esitetyssä reaktiossa, joka normaalisti toteutetaan vedettömässä, poolisessa liuottimessa, huoneenlämpötilassa, tyypilliset reaktiolämpötilat ovat alueella, joka on 15 huoneenlämpötilasta palautusjäähdytyslämpötilaan, ja tyypilli set reaktioajat ovat yhdestä noin neljään tuntiin. Tämä reaktio antaa mesityleenisulfonaattia, joka voidaan sitten normaalien vaihtoreaktioiden avulla valinnaisesti muuttaa muiksi tiatsoliumsuoloiksi.
20 Tämä uusi keksintö sisältää myös uuden entsyymi-immunologisen .. . määrityksen, jossa käytetään voileipätekniikkaa (sandwich), • · • ·" jotta varmistetaan koeyhdisteiden kyky "rikkoa" jo muodostu- *··· neet, pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteet tai • · · ! 1. 25 kääntää niiden suunta, siten että katkaistaan AGE-osat (pit- • · • 1· källe edenneen glykosyloinnin lopputuotteet AGE-silloitetusta • · proteiinista. Tämä määritys sisältää: a) AGEtllä muunnetun härän seerumin albumiinin (AGE-BSA) inkuboinnin mikrotiitteri-levyjen kammioissa, jotka on päällystetty kollageenillä, 2-6 30 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, b) kammioiden pesun PBS- ;·. Tweenillä; • 1 *... c) koeyhdisteiden sijoittamisen vaiheessa b pestyihin kammioi- • · *. . hin; • · · V d) pestyihin kammioihin pantujen koeyhdisteiden inkuboinnin • · · 35 vielä 12 - 24 tunnin ajan noin 37 °C:n lämpötilassa; ja • · • · • « • · • · « · · · 36 e) AGE-katkaisun ilmaisun, siten että käytetään vasta-ainetta, joka on muodostettu AGE-ribonukleaasia vastaan, tai kat-kaisemlla silta BSA:n vasta-aineella.
5 Keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein.
Esimerkki l 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi 10
Tiatsolia (850 mg, 10 mmoolia), metyylibromiasetaattia (1,52, 10 mmoolia) ja absoluuttista etanolia (50 ml) palautusjäähdytettiin kahden tunnin ajan. Suola erotettiin jäähdyttämällä ja se uudelleenkiteytettiin absoluuttisesta etanolista, jotta 15 saatiin otsikon mukaista yhdistettä (1,59 g) molekyylipaino 189 - 190 °C (hajoaa).
Esimerkki 2 20 3-eunino-4/5-dimetyylitiatsoliummesityleenisulfonaatti t · ·· ... 4,5-dimetyylitiatsolin (2,26 g, 20 millimoolia) jääkylmää • · • · liuosta, joka oli dikloorimetaanissa (15 ml) , käsiteltiin *·.. pisaroittain g-mesityleenisulfonyylihydroksyyliamiinin (4,3 g, ·· · i *. 25 20 mmoolia) liuoksella, joka oli kuivassa dikloorimetaanissa ·"*· (15 ml) .
• · • · • ·
Kahden tunnin mittaisen, huoneenlämpötilassa toteutetun sekoittamisen jälkeen lisättiin vedetöntä eetteriä (10 ml) . 30 Jäähdytettäessä erosi värittömiä neulasia 3-amino-4,5-dimetyy-..# litiatsoliumesityleenisulfonaattia (3,48 g), sulamispiste 165 *...' - 168 °C.
• » • · • · ί : Esimerkki 6 • · · : 35 • · · . V Käyttämällä edellä esimerkeissä 1 ja 2 esitettyjä menettelyta- • » *** poja valmistettiin yhdisteet, jotka ovat seuraavat: • · · · 37 3-amino-tiatsoliummesityleenisulfonaatti, sulamispiste 102 -104 °C.
2,3-diamino-tiatsoliummesityleenisulfonaatti, sulamispiste 173 - 175 °C (hajoaa).
5 3- (2-metoksi-2-oksoetyyli) -4,5-dimetyylitiatsoliumbromidi , sulamispiste 184 - 185 °C (hajoaa).
3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumbromidi, sulamispiste 149 - 151 °C (hajoaa).
3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumbromidi, sula-10 mispiste 218 - 220 °C.
3- (2-fenyyli-2-oksoetyyli) -4,5-dimetyylitiatsoliumbromidi, sulamispiste 212 - 213 °C (hajoaa).
3-amino-4-metyyli-tiatsoliummesityleenisulfonaatti, sulamisp-site 143 - 144 °C.
15 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-5-metyyli-tiatsoliumbromidi, sula mispiste 193 - 194 °C (hajoaa).
3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-5-metyyli-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 193 - 194 °C.
3-(2-[41-bromifenyyli]-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi, sula-20 mispiste 269 - 270 °C (hajoaa).
3 - (2 - [41-bromifenyyli] -2-oksoetyyli) -4-metyyli-tiatsoliumbromi-.. , di, sulamispiste 248 - 249 °C (hajoaa) .
9 · 3 - (2 - [41-bromif enyyli] -2-oksoetyyli) -5-metyyli-tiatsoliumbromi- *··· di, sulamispiste 216 - 217 °C.
·· · ί . 25 3-(2-[41-bromifenyyli]-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyylitiatsolium- • « • '· bromidi, sulamispiste 223 - 224 °C (hajoaa) .
• · ί,ί 3- (2-metoksi-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-hydroksietyyli) - tiatsoliumbromidi, sulamispiste 137 - 138 °C.
3- (2-fenyyli-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-hydroksietyyli) -30 tiatsoliumbromidi, sulamispiste 180 - 181 °C.
;·. 3-(2-[41-bromifenyyli]-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2-hydrok- • · [... sietyyli) tiatsoliumbromidi, sulamispiste 251 - 252 °C (hajo- • ♦ \ . aa).
*·· V 3/4-dimetyyli-5-(2-hydroksietyyli)-tiatsoliumjodidi, sulamis- 35 piste 85 - 87 °C.
• · · * ; [·* 3-etyyli-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyylitiatsoliumbromidi, • · sulamispiste 84 - 85 °C.
« · · · 38 3-bentsyyli-5-(2-hydroksietyyli) -4-metyyli-tiatsoliumkloridi, sulamispiste 144 - 146 °c.
3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-bentsotiatsoliumbromidi, sulamispiste 144 - 145 °C (hajoaa).
5 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-betsotiatsoliumbromidi, sulamiste piste 240 - 241 °C (hajoaa).
3- (2- [ 41-bromif enyyli) -2-oksoetyyli) -bentso-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 261 - 262 °C (hajoaa).
3-(karboksimetyyli)-bentsotiatsoliumbromidi, sulamispiste 250 10 °C (hajoaa).
2,3-diamino-bentsotiatsoliummesityleenisulfonaatti, sulamispiste 212 - 214 °C (hajoaa).
3-(2-amino-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 205 -206 °C.
15 3- (2-amino-2-oksoetyyli) -4-metyyli-tiatsoliumbromidi, sulamis piste 220 - 222 °C.
3-(2-amino-2-oksoetyyli)-5-metyyli-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 179 - 180 °C.
3-(2-amino-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyyli-tiatsoliumbromidi, 20 sulamispiste 147 - 148 °C.
3-(2-amino-2-oksetyyli)-bentsotiatsoliumbromidi, sulamispiste , 222 - 223 °C.
• « 3-(2-amino-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-hydroksietyyli) tiatso- 4 « '··· liumbromidi, sulamispiste 182 - 183 °C.
·· 1 : . 25 3-amino-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyyli-tiatsoliummesity- • » • ’· leenisulfonaatti, sulamispiste 94 - 95 °C (hajoaa).
:V 3-(2-metyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumkloridi, sulamispiste 178 - 179 °C.
3-amino-4-metyyli-5 - (2-asetoksietyyli)tiatsoliummesity-30 leenisulfonaatti, sulamispiste 118 - 120 °C.
··, 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi, sulamispiste 217
t I
\.. - 218 °C.
• t \ . 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-asetoksietyyli) tiat- 1·« V soliumbromidi, sulamispiste 217 - 218 °C.
35 3- (2-amino-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2-asetoksietyyli) tiatso- . V liumbromidi, sulamispiste 233 - 234 °C.
f « • 1 9 ·»· 39 2-amino-3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi, sulamispiste 191 - 192 °C.
2-amino-3- (2-metoksi-2-oksoetyyli) bentsotiatsoliumbromidi, sulamispiste 236 - 237 °C.
5 2-amino-3-(2-amino-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidi,sulamispis te 209 - 210 °C.
2- amino-3-(2-amino-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumbromidi, sulamispiste 234 - 235 °C.
3 - [ 2-(4'-metoksifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi, 10 sulamispiste 248 - 249 °C (hajoaa); 3 -[2 - (2', 4' -dimetoksifenyyli) -2-oksoetyyli] -tiatsoliumbromidi, sulamispiste 214 - 216 °C (hajoaa); 3- (2-(41-fluorifenyyli-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 209 - 210 °C (hajoaa); 15 3-(2-(2',4'-difluorifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 226 - 228 °C (hajoaa); 3-(2-(4'-dietyyliaminofenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumbromidi, sulamispsite 233 - 235 °C (hajoaa); 3-propargyyli-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 64 - 66 °C; 20 3-propargyyli-4-metyylitiatsoliumbromidi, sulamispiste 213 - ....: 215 °c'r • · .. . 3-propargyyli-5-metyylitiatsoliumbromidi, sulamispiste 127 - 129 °C; • « "···' 3-propargyyli-4,5-dimetyylitiatsoliumbromidi, sulamispiste 198 • · · : 25 - 200 °C; • · • *·· 3-propargyyli-4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromi- :Y: di, sulamispiste 132 - 134 °C; 3-(2-(31-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 224 - 225 °C; 30 3-(2-(3 '-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli) -4-metyyli-5-(2 '-hydrok- sietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 164 - 165 °C; • · · 3- (2-(3 '-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli) -bentsotiatsoliumbromi-. di, sulamispiste 215 - 217 °C; • · · V 2,3-diamino-4-klooribentsotiatsoliummesityleenisulfonaatti, 35 sulamispiste 228 - 230 °C; . V 2,3-diamino-4-metyyli-tiatsoliummesityleenisulfonaatti, sula- • · · ! mispiste 204 - 205 °C; 40 3-amino-4-metyy1i-5-vinyyli-tiätsoiiummesityleenisulfonaatti, sulamispiste 145 - 147 °C; 2,3-diamino-6-klooribentsotiatsoliummesityleenisulfonaatti, sulamispiste 244 - 246 °C; 5 2,6-diamino-bentsotiatsolin dihydrokloridi, sulamispiste 318 - 320 °C (hajoaa); 2.6- diamino-3 [2 - (4 1 -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatso-liumbromidi, sulamispiste 243 - 245 °C (hajoaa); 2.6- diamino-3 [2- (3 ' -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatso-10 liumbromidi, sulamispiste 217 - 218 °C (hajoaa); 2.6- diamino-3[2-(4'-dietyyliaminofenyyli)-2-oksoetyyli]betso-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 223 - 225 °C (hajoaa); 2.6- diamino-3(2-(4 *-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]betsotiatso-liumbromidi, sulamispiste 258 - 259 °C (hajoaa); 15 2,6-diamino-3(2-(2-fenyyl-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumbromi- di, sulamispiste 208 - 210 °C (hajoaa); 2.6- diamino-3[2-(41-fluorifenyyli-2-oksetyyli]bentsotiatso-liumbromidi, sulamispiste 251 - 252 °C (hajoaa); 3-asetamido-4-metyyli-5-tiatsolyyli-etyyliasetaattimesity- 20 leenisulfonaatti, sulamispiste, siirappimainen aine; # . 2,3-diamino-5-metyylitiatsoliummesityleenisulfonaatti, sula- .. . mispiste 149 - 152 °C; 3-[2- (2 ' -naftyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2 ' -hydroksietyy- • · ’··· li)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 219 - 220 °C; • · · ; V 25 3-(2-(3 ',5'-di-tert-butyyli-41-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- • · • *·· 4-metyyli-5-(2 ' -hydroksietyyli) -tiatsoliumbromidi, sulamispis- ;V; te 206 - 207 °C; 3-(2-(2 ',6'-dikloorifenetyyliamino) -2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 193 - 195 30 °C; ;·. 3-(2-dibutyyliamino-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydrok- *... sietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 78 - 80 °C; • · . 3-[2-4'-karbetoksianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'- • · · V hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 204 - 206 °C; 35 3-(2-(21,6'-di-isopropyylianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5- ; (2 '-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 166 - 168 • · · ;;;; °c; • » 41 3-amino-4-metyyli-5-[2(2·,6'-diklooribentsyylioksi)etyyli]-tiatsoliummesityleenisulfonaatti, sulamispiste 164 - 166 °C; 3 - [2-(4'-karbmetoksi-3'-hydroksianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5- (2' -hydroksietyyli) -tiatsoliumbromidi,sulamispiste, 5 222 - 223 °C; 2.3- diamino-4,5-dimetyylitiatsoliummesityleenisulf onaatti, sulamispiste 166 - 168 °C; 2.3- diamino-4-metyyli-5-hydroksietyyli-tiatsoliummesity-leenisulfonaatti, sulamispiste 132 - 134 °C; 10 2,3-diamino-5-(3',4'-trimetyleenidioksifenyyli)-tiatsolium- mesityleenisulfonaatti, sulamispiste 224 - 226 °C; 3[2-(11,4'-bentsodioksan-6-yyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 196 - 198 °C; 15 3-[2-(3',4'-trimetyleenidioksifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyy- li-5-(2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 164 -166 °C; 3-(2-[1 ·,4-bentsodioksan-6-yyli]-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 238 - 239 °C; 20 3-[2- (3 ', 4 1 -trimetyleenidioksifenyyli) -2-oksoetyyli]-tiatso- . liumbromidi, sulamispiste 246 - 248 °C (hajoaa); • · · · · 3-[2-(3',5'-di-tert-butyyli-41-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- • · » : ·" tiatsoliumbromidi, sulamispiste ··« 3-[3-(3 ', 51 -di-tert-butyyli-4' -hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- • · · : 25 4-metyylitiatsoliumbromidi, sulamispiste 226 - 228 °C (hajo- :1 2 3. aa) ; :V: 3-[2- (3 ', 5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- 5-metyyli-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 210 - 211 °C; 3-[2- (3 ', 5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]-
30 4,5-dimetyyli-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 243 - 244 °C
:·. (hajoaa) ; • · · *... 3-[2-(3 1,5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli) -2-oksoetyyli]- • · *\ . bentsotiatsoliumbromidi, sulamispiste 239 - 294 °C (hajoaa); l-metyyli-3-[2-(3',5'-di-tert-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyy-35 li]-imidatsoliumbromidi, sulamispiste 148 - 150 °C; ·· · V 3—[2—(4 1 -n-pentyylifenyyli) -2-oksoetyyli] -tiatsoliumbromidi, 2 • · 3 ‘ sulamispiste 218 - 220 °C (hajoaa) ; • · · · 42 3-[2- (4 '-n-pentyylifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2 ' -hydroksietyyli)-tiatsolimbromidi, sulamispiste 178 - 180 °C (hajoaa); 3-[2-4 '-dietyyliaminofenyyli) -2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2 '-5 hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 184 - 186 °C (hajoaa); 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-vinyyli-tiatsoliumbro-midi, sulamispiste 176 - 177 °C; 3-[2-(3^51-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli)-4-10 metyyli-5-vinyyli-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 208 - 209 °C; 3-(2-tert-butyyli-2-oksoetyyli) -tiatsoliumbromidi, sulamispiste 211 - 212 °C; 3-(2-tert-butyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyy-15 li)-tiatsoliumbromidi, sulamispiste 186 - 187 °C; 3-(3'-metoksibentsyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-tiat-soliumkloridi, sulamispiste 135 - 136 °C; 3- (2 ', 6' -diklooribentsyyli) -4-metyyli-5- (2 ' -hydroksietyyli) -tiatsoliumkloridi, sulamispiste 192 - 194 °C; 20 3 —(2'-nitrobentsyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-tiatso- i . liumbromidi, sulamispiste 215 - 216 °C; .. , 3[2-(4'-kloorifenyyli)-2-oksoetyyli)-tiatsoliumbromidi, sula- • · • mispiste 239 - 241 °C (hajoaa) ; • « ’··· 3 [2- (4 ' -kloorifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2 ' -hydrok- • · « : 25 sietyyli)-tiatsoliumbromidi, sulamispsite 240 - 251 °C (hajo- • · : *· aa, ja 3 [2- (4 1 -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli]-4-metyyli-5- (2 ' -hydroksietyyli)-tiatsolimbromidi, sulamispiste 229 - 231 °C (hajoaa) .
30 ;·. Esimerkki 4 • ·» ]... mg/tabletti • · *. . Kaavan I mukaista yhdistettä 50 V Tärkkelystä 50 35 Mannitolia 75 • · · ; V Magnesiumstearaattia 2 • ·
Steariinihappoa 5 • · · · 43
Yhdiste, osa tärkkelyksestä ja laktoosi yhdistetään ja rakeistetaan kosteana tärkkelystahnan kanssa. Kostea granulaatti asetetaan tarjottimelle ja sen annetaan kuivua yön ajan 45 °C:n lämpötilassa. Kuivattu granulaatti jauhetaan hienonnusko-5 neessa hienoksi noin 20 meshin partikkelikokoon. Magnesiums-tearaatti, steariinihappo ja tärkkelyksen loppuosa lisätään ja koko seosta sekoitetaan, ennen kuin se puristetaan sopivassa tablettipuristimessa. Tabletit puristetaan 232 mg:n painoon, siten että käytetään 279,4/812,8 mm:n meistiä ja neljän kilo-10 gramman kovuutta. Nämä tabletit hajoavat puolen tunnin sisällä USP XVI:ssä kuvatun menetelmän mukaan.
Esimerkki 5 15 Pesuneste mg/g
Kaavan I mukaista yhdistettä 1,0
Etyylialkoholia 400,0
Polyetyleeniglykoli 400:aa 300,0 20 Hydroksipropyyliselluloosaa 5,0
Propyleeniglykolia 1,0 g:aan saakka ·« · • · * * Esimerkki 6 • · · • * % • · ·
• · I
: 25 Suun huuhteluneste • · I i • *
Kaavan I mukaista yhdistettä 1,4 %
Klooriheksidiiniglukonaattia 0,12 %
Etanolia 11,6 % 30 Natriumsakkariini 0,15 % ;·, FD&C Blue nro 1 0,001 % t ·
Piparminttuöl jyä 0,5 % • · . Glyseriiniä 10,0 % ··· V Tween 60:ntä 0,3 % : 35 Vettä 100,0 %:iin saakka • · · ' • · • · • · $ · • ··
Mm 44
Esimerkki 7 Hammastahna 5 Kaavan I mukaista yhdistettä 5,5 %
Sorbitolia, 70-prosenttista vedessä 25 %
Natriumsakkariinia 0,15 %
Natriumlauryylisulfaattia 1,75 %
Carbopol 934, 6-prosenttisena dispersiona 15,0 % 10 Viherminttuöljyä 1,0 %
Natriumhydroksidi, 50-prosenttinen vedessä 0,76 % Kaksiemäksisen Kalsiumdifosfaatin dihydraattia 45 %
Vettä 100 %:iin 15 saakka
Esimerkki 8
Silloituksen inhibition määrittäminen 20 Käytettiin seuraavaa menetelmää tämän keksinnön yhdisteiden , kyvyn arvioimiseksi, kun inhiboidaan häränseerumin glykoidun » * • albumiinin (AGE-BSA) silloittumista rotan hännän jänteen **·. kollageenillä päällystetty lie, 96-kammioiselle levylle.
·· · : \ 25 • » • *. AGE-BSA valmistettiin, siten että inkuboitiin BSArta pitoisuu- :V tena, joka oli 200 mg litrassa, 200 mmolaarisen glukoosin kanssa, joka oli 0,4 molaarisessa natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,4, 37 °C:ssa, 12 viikon ajan. Glykoitu BSA dialysoitiin 30 sitten perusteellisesti fosfaattipuskuriliuosta vastaan (PBS), .« 48 tunnin ajan ja vaihtamalla puskuria vielä viisi kertaa.
» i
Rotan hännän jänteen kollageenillä päällystetty levy suljet- • · **’ , tiin ensin 300 ^litralla erikoissulkupuskuria (superblock) ί#Γ (Pierce #37515X) yhden tunnin ajaksi. Sulkuliuos poistettiin 35 kammioista, siten että niitä pestiin kaksi kertaa PBS-Tween 20 ··* . V -liuoksella (0,05 prosenttia Tween 20:ntä) käyttämällä NUNC- t · *** monikoe- tai Dynatech ELISA -levynpesijää. AGE-BSA:n silloit- t · · · 45 taminen (1-10 ^grammaa kammiota kohti AGE-BSA-erän mukaan) rotan hännän kollageenillä päällystettyyn levyyn toteutettiin ilman koeyhdistettä tai koeyhdisteen kanssa, joka oli liuotettu PBS-puskuriin pH 7,4:ssä, haluttuina pitoisuuksina, siten 5 että levylle lisättiin 50 julitraa kutakin PBSiään tai koeyhdisteen liuokseen laimennettua AGE-BSA:ta 37 °C:ssa neljän tunnin ajaksi. Ruskettumatonta BSArta, joka oli PBS-puskurissa koeyhdisteen kanssa tai ilman sitä, lisättiin erillisiin kammioihin sokeita kokeita varten. Silloittumaton AGE-BSA 10 poistettiin sitten, siten että kammiot pestiin kolme kertaa PBS-Tween-puskurilla. AGE-BSA:n määrä, joka oli silloittunut hännän jänteen kollageenillä päällystettyyn levyyn, määritettiin sitten käyttämällä polyklonaalista vasta-ainetta, joka oli muodostettu AGE-RNaasia kohtaan. Yhden tunnin mittaisen 15 inkuboinnin jälkeen poistettiin AGE-vasta-aine, siten että pestiin neljä kertaa PBS-Tweenin avulla.
Sidottu AGE-vasta-aine ilmaistiin sitten, siten että lisättiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-20 ainetta, vuohen anti-kaniini-immunoglobuliinia, ja inkuboitiin 30 minuutin ajan. Lisättiin 2,2-atsino-di(3-etyylibentstiatso-;·.· liinisulfonihappo)-substraattia (ABTS-kromogeeniä) (Zymed #00- 2011) . Reaktion annettiin tapahtua vielä 15 minuutin ajan ja absorbanssi luettiin 410 nm:ssä Dynatech levynlukijalla.
·1 25 Kunkin koeyhdisteen aikaansaaman inhibition prosentti lasket- ’1 tiin seuraavasti: • · · ( i i
Inhibitioprosentti ={[optinen tiheys (ilman yhdistettä) optinen tiheys (yhdisteen kanssa)/optinen tiheys (ilman yhdis-30 tettä)> x 100 prosenttia • IC50-arvot eli inhibitio koeyhdisteen eri pitoisuuksissa ovat .·:· seuraavat: • · · • · · · • · • · · • · * · · • · · 45
P Ρ φ rH P H
•rl (1) h m n)
rH Ή rH 0) M rH
oi Id oi -Ρ Ρ Ό Ä H 3 POP ω g tn B ·Η jj C O o Q) O +J o o\o A» o\o o\o o\o M H -H <n -h— Ot -h Γ" co t" vo g ij cg in n n
POP
-Ρ -H Φ jj •Ρ -Ρ Φ To •H -H -p > O Λ M oi rH -rl "H ^ HÄO w •H fi Ä o W -H >i x
P
-P
o
•H
"H o in co
O'— CO H CM ^ VO CM VO
ms il ^ ^ ^ ^ ·* ** *
OttrJcNJOOO ΙΓ) Π CN
β Λ H
H
I -H I II I
>i -P -H 0 0 O I
.p -p g i in ω ι ι ω a)
•H (0 o -H -P -P -H H 4J I S
. ΦΡΡΗΡΡΗΡΡ-Η I
···· Φ β Λ >1 -H -rl (fl -rl rH •έΙ* g Og >ίΡ-Ρ >i-H-P >1 I ... g MH P -P -H -H +J e -H >1 Γ-.
: · · 0 H *rl OlJHrH Q) φ H -P H
·· -Hj3rHg>i>,g<l)>ia)rH
• · · rHWO*rl>-l>>|THrH>lg>i . · O-HlOOP-POi^-P I >1 ··· ιηβ.ρΐφφΐ.ρφΐη.ρ -P opin g gin-ri g ι a) : · ΡΦ-Η^ΙΙ^ΦΙ^Ο ·· -P >ι I I I I I g I rH * :·· 0-p-r.^^.^-^g^^o
• · β ·Η ·Η ·Η -H -H ·Η ·Η -H I
!?* -rll/lrHi—IrHrHrHrHrH+JCs]
• g Φ >i >i >i Sp >i O >i a> I
P g >1 >1 >1 >1 >1 W >1 O r-*-H
η g-Ρ-Ρ-Ρ-Ρ-Ρ-Ρ-Ρ in-ri-ö r-π p<u o) a) a) o ρ φ h -h <1) >,-HOOOOO-rHOO>ig -P irirHininwwwgjwi so
W -P O ϋ X‘H X χ X -rl -rl X CM-rIPP
•H Φ -H W O O Ό O O OOH O I Ό Φ Λ Ό g -P -P I I -rl I I I -H >1 I H H (h g .. xi -rl -p p CM CM g CM CM CM g >1 CM H g -H 3 : >i Tl P -H I I O I I I O H-> I >1 O g-rl
• Q) I (0 -P ·Η ·Η P -rl -H -rl P Q) -rl P O H
... o ιηροω onxito-HHHH^g οι-ηρλρο :: m - o p x xe x ό >iO sg ι x ό φ g λ ω • "sf MH H o OP O -H >ι·Η >ιΡ-ΐ O-HMHp l-p • * IH g -P -PH p g Pg P-H l-H+Jg I -H - (0 . :* op ρ φ φ h φο φο φ h o-P φο cm h -tf-ri
·.· Pl0-Hg go BP MhP MhO P-P gP — O
... HH ό ι ι ω ι Λ ι ä ι ω -h p ι λ ι ω ι -h
: g P I CM CM P CM g CM g CM-P gP OJ g CO -p CM H
... p Φ co — ^'P'^p'-'P^'PPC'-^P^P1—‘>1 . . I Φ * I ·Η I -r| I -rl I -rl I -rl ΙΟ I ·Η I -rl I >1 n H cm co Ό ro -P n H co rH co -P ro Mh ci h ro -p ro -p • · · • ·· · 11 ιΐί.··· ιι »i>—— ι ι -...-1 ι - - » —^ ‘ i in o m o
H rH CN
_£7_ I ^ G o (Ο (1) rl rl G rH H G Q) H Q) Ό H 0) 3 O) -P G a) to to
P -H "rl ÄO O G 43 -P
M >1-rl a) a c o Q) Ai (0 o\o A° o\0 o\o
10 '—rH
•H H 00 VO m VO
g O <D m co n H
G -H M -P -P -H P-H p •H Λ t0 O ·Η (0 rH 43 rH
ΗΉ O
•h e i CO -rl g en σι >ϋ· co cm in r·' n cm cm in S σ> σι o in Γ' o σ o
Cj g 1» s ·1 1 2 2 "1 H w (N o cvj o o o o o σι o
«H rH
Λ Λ
•H | I
I I I TS g -H -P
I CM CM 0) -H G Ό -rl | | (0 I
in ^ ^ B g -h -h Ό O O -h g
. 1 i i i o rH g -rimw-PG
·;··- ^ in in Sh o O g -P -P -h -h i i i ι 43 oi p o G ίο ή η
·· · I—I -H -rl '—' g -P Λ I P -rl -rl O
-HrHrH-rl3(0 g >1 43 -P -P >1 01
• · rH >1 >, rH -H -H G -P g -H -H +J +J
.···. >1 >1 >1 >1 rH +j -H -H G rH rH (U (0
• >1-P-r|-p-Ht>lOOrH01-r|>l>lg-H
··· +j «doojo-pww o tu h >, >, -h -p <U g -rl g -rl Q) -P -P 01 g O-P -P Ό o O I g I g O (0 G -P g 010) 0) I 01
.. Ol-tfO^OOJ-HO) (0 G -P g gin-P
:· Ai ι p ι p Ai -P 43 -H -H (01 I » G
: 1· O -H r-,Λ ^43 O^- ^ 1P rH -rl «31 in ^ 0) . . I TS -H g -H g I -H -H OO -P I I I X! IJ· CM 1H r—I G 1—I G (N I—I I—I 0101 r-. rs ^
• I g >i-H >,-H I >1 >1 -P -P -H -H -H -H -H
r-1 o >irH >iH m >·! >f G (0 rH rH rH rH rH
•HP -PO -PO -H 4-) -P ai-H >1>1 >1 >1 >1 ΗΛ IMI dl M H ¢) 0) 43 -P >1 >1 >1 >1 >1
>i g O -P O -P ΪΡ-Η O ·-» O -P-P -P -P HJ
>i G 01(0 01(0 >1 01 01 -H 01 Q10) 0) 0) 0)
G-H Ai-H1-H G1,1 rH+J OO O O O
OIHO-PO-POIOO >i G -H 01 (O OI OI OI <W O I ^ I <H p I >i 0) .p Ai Ai Ai Ai Ai
.. -H 01 CM -H CM -H -H Ό CM -p 43 -P O O O O O
g+J|rH|Hg>il (U — (0 I I I l-HI
• 0) O (0 -H >i -H >Ί O 43 ·Η g O (0 CM CM CM CM Ό CM
.·;· -P P-H 01 >i rH >, p | oi -H G G I I -H I -H I -H I
• : 01 43 -P Ai -P >1-P 43 cm Ai 01 -HO O OO O TS Og O
. -H I -H O Q> >1 a> I 'r' O Ai G Ή G G-H G-H CO G
.1. TS - rH JJ-H G-H - I 4J O (0 H -H -H g -H g -H p -H
.. 43 ^<>Ha)0ia)0]^in<l)-H43-HGggOgOg43g-H
>1 -— >1 g Ai 1P Ai — I go P Olli (0 (OP (OP (0 g (OO
... O) I +J I O I O I -H I -H (0 s—H I l 43 l 43 I G I -p :: O CM 0) CM P CM P CM H CMg Ai IG CM CM g CM g CM-H (Mg ... £4 i-jg '—T3 w Ό <—· >-i — O — nd) — —- G — G —Ή — o • · I -H I >i I >i I >i I p I 1 0) I I -H I -H 10 lp I . · πΌοο4Ηθθ43Γθ+4(θ43(θ(ΜΗηηίΗηΓΗηθΐΜ43 • Φ » • · · · M milli n......i .1 —I·.-n... .m il i ι ι i in o in o
H rH (N
· · · 2 • · 43 β I «Γ G OH β H H •h a) H Cfl H (1) 3 a) <d 3 a) ρ oi — -p ω -h g Ä-H 0 i
β Ό P
01 Ä -H CM
>i a — c a)
0)0(0 o\o o\o o\° o\o CM
01 X i-H
•H---ι-H ·Μ*σΐΓΟΟ CO
BO) CO CM CO CM
β O 01 4-) ·Η ·Η +J-P ^ •H -H (Ö 0 Λ (0 rH -H i—I Ηί O •H c i 0)·Η g m o— o
m S H
U g co
H *— X
CM H
M* VO H H
^ ^ ».
H CO H
rH
I -H I I
4-> Ό I >i >i
(0 -H *H +-> -P I
I -H B P -H I -H X
CM P O I 01 >i I 01 O I I
....· w-H +h ~ 0) P B 0) I XX
• I H Λ -H E Ή β g CM O O
... in>iBHBoi-HBiii
:·’ I >1 β >1 β 0) H β -—- CM CM
• · -H P -H ·Η B O -H *H I I
... rH0)iHpiHBWrHrH -—. -H
: · >i-h s o ai o β p o >i-h -h .h -h ··· >ιΌ I 01 O 01 -H β 01 >1-0 rH Ό >ιΌ P *H ’i* p 01 p H -H P β-H >i-H >ι·Η
• 0) B I <ΰ X β O P β 0) S >ιβ β B
.. BO -*-H -HO -H oi i -h <++ o β o a) o ·. i p ·ρ P p i p p -h 4) -Hpaipcwp :· *3- Λ H 4J CM O β H O 01 Λ P ,Q -rl Λ .. IB >1 β -H I ω -H >1 01 X e -H & u β :: β >ί β rH i I p p >1 p o β g β o β . 01 ·Η -H p β >N ·Η β I β β +J ·Η O -H β ·Η
4+ I—Ιι—I β O £>i i—I 0) ·Η -H-HO) 0)rHpi—IrHi-H
01 >ιΟ ΗΉ p >1 Ä H > P Λ BO PO OH O
•H ><111 Ι0Η m >1 -H >, I4J-H I UI I 01 I 01
Ό p p ,¾ β O β U >ι ΙΠβΡ -4+-P-P
x; ω β o oi oi a) o >ι ΐβο ^β^β^β >ι Ο ·Η +Η ·Η Λί Ρ Ο Ρ Η β O '—rl ^-·Η '—Η 0) 01 Ρ β β Ο ·Η Η ·Η 0) ·Η Η Ο Η ·Η | +-> |+J Ip Ο X — >ι Q) I ΙΛ ·Η X Ρ BP >ι Ρ *Ρ CM Ο CM Ο CM Ο .. « 0·Η 430) CM IP IP >ιΗ lp — 01 ---01 ·— 01 • ·. Ir-H li—I I Ο ·Η ^1- β M- β Ρβ VO β CO+J COp CO+) • CM^CM^-ΗΡΒΐβΙβΦΟΙΙβΙβΙβΙβ ... I >, W4-) rH 0)0 Οβ Οβ Β-Η Οβ Ο 0) Ο 0) Ο 11 :: ορι-Η>,βρβθβοΐββθβΛβΛβΛ • β 0) ΙΠ 01 >1 I Λ -Η Ρ -rl Ρ ^ 0) ·Η Ρ -H I—. -Η —< -H ι—.
,·· ·Η·Η 10) β - g SH SH 10) SH g H g-H S H
. :* gOl Og 0) m β ββ ββ OH ββ βιΗ β rH β rH
·.· β χ β g Ρ -—-Η -Η 01 -Η 01 β >1 -Η 01 ·Η >ι ·Η >ι ·Η >ι ... I Ο ·Η β I I Ρ Ό Η Τ5 Η Η Ρ Ό ·Η Τ3 >ι Ό >ι Τ3 >ι
ί’ CM+ng-HCMCMOlfilfig-HlfilPIPIP
... βι-Η WW01 m Q) η 0) β 01 ma) VO 0) VO 0) VO Q)
.. I >1 I O I IP ^0) ^0)10) - Q) v O - O - O
; , · mxj moi m m β cm h n h mg cmp cmoi cmoi cmoi I t > • ·· 11 1 »* — 1 « ··· in o in o in
H H (N (N
49
•H
O M
H (O r-* —' 42 O r-* 1 m
•H E (β O M
^ g pH pH rH ' 02*
Ch I H w Vb>* ->H O CU o\» AP AP o\«
H Ό o\» o\° AP
C d Φ C ^ Ao co oo in ω a) tn -
H O) -H H O 00 σι VO (Tl CO O
E 4-1 O VO H (M n H
d co p O "H ·Η P Ό ft •H Λ O >1 (0
i—I 0) rH rH O i—I
•H 44 CU w co ors LO S vo a e > H '—
iH
Il II I
I H I 0 HI -r^ 44 •H H P I I d OO H I (0
H >1 ΙΛ ~ P (0 IH >1 H
>, >1 r-,Ε IH C H -s >1 +J p I
>ι·Η p H H d ÄH 0) d O >h H I H H
·;·. I +> Ό Φ Ό H H 0>i 420) CP CO H 10 p
>1 QJHEH>iH I >1 HO) Ηφ 0) H 44 P
... P E S I S >1 O OI P pH H-H E >1 O (0 I* H 10 ^ O -P (0 Id) 0 >1 H 10 E >1 H (0 • · to ρ ι p cu P -.h op c 44 d -P Ό c
.··· CU I 42 -—>42 0(0 OCfl H H (CO H CU HO
· i I—> E HE CO H C 44 44 (0 Hp H H C H
E HdHd4ii-P HO H CU CO Ό O CO CU H
.d H H >hH OI HP Ό i 44 >1 CO 44 <Ud
H >, H >1H I ^ H Ό IE O 42 P O H CO .. H >iO U O Ν·Η C >i - d Pl dl pH >rH
.. o -P CO CU (0 I H (042 VO H T3- H Ό P P G
• CO φ p Ο P «-* >1 H I - H >,oa +J ><P CU CU
·. -P O (0 CO (0 O >1 H- -o 42 w h 42 (0 E CU
:: (0 CO H 44 H CP >1 ro N I0 II h | (O h h • H 44 -P O P> H CU >1^ ^44 - in >1 in C P >1
44 OI II H -H ft I CN (0 Hl >i IO4444 H I . (V| H CO O in -—-H I H 44 H MH I H
H OO H I H (2 44 pl lp H H CU H H - CO
cu >h I h o h (ö o ftH mi co>i E >id-^cu
44 >1 ~ >1 C >1 H p OH |r-> 44 >1 H >1 CO -E
CO P ·Η >1 -H >, 10 O CO >iH -H ~ Ο P H Ό P H - E
•H CU H HP EP 44 >1 H >ιΌ H-H P CU Ό IH <UC Hd Ό SP >1 CU (0 CU 042 IP-H>iH CU E H CO P E 0) —Ή
.. 42 I P >1·Η H H P I H CU E >1 >1 S I g -P I CU I H
;·. >1 in(ö pco h co cu- ό S o P >1 om-o m-o m-h no
• CU I (0 MH 44 >i44 4201 IIP CUP PIP 1(0 I >1 ICO
.·;· O OC (OO >hO P w - M1 Δ E 0) (0 r-..Q O C OP OP
·: W COCPPPdl VO I E l —~ 44HECOGHG(Ö
• . H MH I Ό d Ό 44 in -.1—> d Ί· H I H d H H H CO H -H
EH - >1 42 >1 II - HH I CO H - >,H EH E <U SP
• * (0 d ro 42 H 42 - h OlHH044P-4,>iH(Öd(ÖglÖH
H CO — I Ό I ^ H — >iO (2 O P ^PO H 10 HS H H
... ΌΗ I - I - I >1 I >1 CO H H (0 I CU CO Ό H -o d n >1 : l G ro 00 ro ro no >ί·η 00ΡΡ S H (0 ro OP I G IH IS»,
•. H CU -—' 1—- ^ -P Ό <—- 0) <0 (0 >1 C — CO (0 H CU H H H G
·· ^ a) Il II I CU H I O H I >1 O I 44 h ^ CU - o ^ cu ; , · ooh n in n in n E S rocop n to Mh n o P oi h oicfl oimh • · »m Ιί- 1 — i I·— —*—l - I - I ———I —.1 ,1 in o in o in H H OI 01 • · · · 50
C
0) t I
C H -H
•h +i a 2 r-1 3 s 2 i—I 3 (0 β CD r—I I—I n 3 Ο Ή
+4 g <D OH
42 gw 3 I -rH <SJ csj w o +j H 3 o\o oV> o\° C 3 o\° 3 C iH »*
ω Q) O -. Q
h 3 g 3 n σι S
g +4 g H H ^ CM VO
3 ο ω I r-t +J -H -H o 0) 4-> 4-> Ό H T3 •Η -H 42 3 Ο Λ >1 3 C h -h a) h ω H £ O I—I "H •H C 44 a) O W -H '— 3 +4
q -—* CO VO
m2 t" h in U g v H '— O O ^
I I I
— g I o
I -H 3 g ω I
~ I H I H 3 4-1 I '—>
•H CM >i (N I Η I -H 13 ”1 "H
I rH I >ι I *H O “H H -H -H ^ O H
·»·· M >i r-.+4 ^ 3 3 3 0 014-1 101 >i 0>i H 3 -H 44 +> 44 3 44 I -H +4 >i • · « 14-1 rH-Η rH 03 04-1 0 -rt r—13 4-1 :* CM3>i3>i+-H +j3+4H >i3 3
• · I -H >i44 >1 Ό 4-1 TJ-H TJ >1 >ι·Η O
e’··. ~ 01 CO C >i I >i-P >i >i +> g 01 • -H 44 3+1 3 42 -H 42 -H +3+» 3-h 44
*· HO +4 Ό <H IH IH 13 42 I O
'V >i+l -H >i -H - >i - >i -g I·-· I
>ιΌ 3 42 03 -H >i ^ >i ^ -H 4-1 -H CM
.. I >1 44 I 44 Ό I +> l4-> ITI +1 H I
• · VO +3 O - o H -H 3 -H 3 -H I 3 >i r-*
·* Il -H CM -H g H g H g H in +> >i -H
·. C - 3^ 3 O >1 I >ι I >1* 14-1 H
il 3ΓΜ-ΗΙ -H +1 >t 'd* >iin >ί it -H 3 >, • 3 OI'-' cm C 42 4-> I 4-11 4->l Ό O >i
+> 44 I 31 3 g C r-, 3 >-1 C 101 C
Ui 0 in 3 H 3342 H 42 H 42 H -44 3 •H 31 HH H -rl I H IH IH li) O +4
Tl -H-H >i >i >i H 4-1 >i 4-> >ι 4->>ι -I -H
43 Ό H +>>i +JO +1 >1 +1 >1 +1 >1 -CM H
>i O >i*H 34-> H 303 34J 34-1 34-> Hl >i-H
3 Ui >i3 g 3 Ό g +> +l 3 +13 4-> 3 >iT3
O +) +> -H -H g -H -H 3 I O ΙΟ ΙΟ I H +J -H
:· « C3g+4lg+4-rtHUl H ID H 3 CM H cg :·. 3g0+i-tf04->+»O* Ό 44 Tl 44 >i 30 * 42 I +1 I I +1 II 10 10 10 1>ι Λ +i .·;· I "d* 42 - ·—.42 — r-i — | -I - I -H H C -H I 42 ·· -ig^-ng^-HincM in cm mcM'013'öCg ' <5j*r-iS-H3-Hv| - I -Ι·Η·Η4η·γ4Ι3 ... Ή ·Η - >ι·Η - >1 - — -—g H-H g - -rl
· -HH H>iH CO >1 H-H -rl CO -rl H H -rl O >l0)0 ·>3· H
H >1 O —' 4-> O — 4-1 H rs —' H n — H +i >144 +i ·— o ... —' >1 01 I 3 01 13 I >i-rl I >i-rl I >43 4-> O 42 I 03 : 1+4+4 CM0+-1 CMO CM >ί g CM>ig CM>ig 3+lg OM +4 ... cm33>—'331—·3>—«CO1—'CO*—'CCgTJC1—'3
·· *-*0·ΗΙ44ΗΙ44 13+ιΙ3+|Ι3··ΗΙ >ι-Η I -H
h 3 +4 coO+J n O m H 42 n + 43 n Vh H HÖH ro +4 • ·
»·· _ II..- ..I— I --- —I———J——L—— I __I —L—— ..I I
··«· * m o in o in
h h nj CM
_51
•H O M •H (O 4-> ttJ
"H r-1 Λ O — H S (O Ä H H e i ή
•H O <D
H Ό g C C g tl) C C tn a) tn n
•H Q) -H
g 4-> O <3J
C tn 4-> +J -H -H o\°
+j rs £A
•H g O >1 (0
r—I Q) i—I (N
rl O H LO
•H X Q) co '— tn 02 m g n O g tn co
H '— - Q Q
H (N g g
I i—i I
10 -Hl I I +J
I—I M H g H >1 (O
•H Λ >i 3 > >i-H
Ή g >ι·Η I C 4->
. >iH 4-1 H in O) I
·;··: >ih a) o i ή -h
4J O O tn -rl -H H
·· · a) tn tn 4-> h tn >i • : o +j x to >i Ai >i • · tn «s o -h >i o c
.···. Ai-rl I 4-> -P PH
• · O 4-> cm I Q) Ό > ..I il i -h g >1 i ... (M «—* λ H I £ in : d) I -H -H >i <4· Il
. · 4-1 1—I H >i | - -H
: tn -h >i >i-m ^ ^ h • -H i—I >i tl) ·Η | >«( • · Ό >l+> C H H H >i : : : .c >i q> tn tn >,h h 4-> * >1 CH <ΗΑί >ιΌ >i 0) <d a) tn oo +j-H>ig O Ή Ai CP Φ g -Ml a -HO H Ό OOPM·
Hp g>i tn ρ Λ i >,
>1-0 (0 Xl AI Λ I ~ 4J
>1 >1 -Hl O g 4-1 -H 4J
4-> ,C H- I C P H dj
Cl >1 CM CM H 0) >i 1J
·. tl) - >,'— I H 4-> >i-H -h £A CM 4-) I -HO I 4-> Ό Vt • i — <u m Htn-tu-H :(rt .·;· Ci -hi >i 4-> m o g :<o ·* im ό-h >i to - tn o g -1 IH C-H-Aip
... ^ H - >iH Q) 4-> M o Λ -H
: : '— h >ιΌ M-ι i T- i g q)
• I >1 | 4-) -H I -H I CM C
... CM >i-H CM tl) g CM H CM I -H II
'· <—14-) Ό 1—1 g O '— 1—1
*·· I <D -H I I p I >ι I -H O Q
_· ro g g n M· Λ roC o H tn ^
• · · I I I
• · · · in o in
rH rH
52
Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että tämäntyyppisestä lääkehoidosta voi olla hyötyä vähenettäessä patologisia tiloja, joihin liittyy proteiinien pitkälle edennyt glyko-sylointi ja proteiinien ja muiden makromolekyylien välisten 5 siltojen muodostuminen. Lääkehoitoa voidaan käyttää estämään proteiinien sitominen ja silloittuminen, jota tapahtuu sokeritaudissa ja ikääntymisessä, mikä johtaa jälkitauteihin, kuten verkkokalvon vaurioitumiseen ja ylimääräiseen verisuonekkuu-teen, jänteiden, nivelsiteiden ja muiden nivelten vaurioitumi-10 seen. Tämä hoito voi hidastaa ateroskleroosia ja sidekudosten muutoksia, joita tapahtuu sokeritaudissa ja ikääntymisessä. Tutkitaan myös paikalliset, oraaliset ja parenteraaliset antotiet, jotta hoito saadaan aikaan paikallisesti ja systee-misesti.
15
Esimerkki 9
Sillan katkaisun määrittäminen 20 Sen varmistamiseksi, että tämän keksinnön mukaiset yhdisteet >>>>; pystyvät "rikkomaan" pitkälle edenneen glykosyloinnin jo muo- .. . dostuneita lopputuotteita tai vaihtamaan niiden suuntaa, • · · kehitettiin uusi entsyymi-immunologinen voileipämääritys • · *···* (sandwichassay) ilmaisemaan AGE-osien (pitkälle edenneen gly- • · · : .· 25 kosyloinnin lopputuotteen osien) katkeamista AGE:n silloit- • '·· tamasta proteiinista. Määrityksessä käytetään hyväksi kolia- • · .* geenillä päällystettyjä, 96-kammioisia mikrotiitterilevyjä, jotka ovat kaupallisesti saatavissa. AGE:llä muunnettua proteiinia (AGE-BSA), joka on valmistettu kuten edellä esimerkissä 30 8, inkuboidaan kollageenillä päällystetyissä kammioissa neljän :·. tunnin ajan, kammiot pestään PBS-Tweenillä ja niihin lisätään • · · *... koeyhdisteiden liuoksia. 16 tunnin mittaisen (37 °C) inkuboin- • · '. . tijakson jälkeen sillan katkeaminen ilmaistaan, siten että ··· V käytetään vasta-ainetta, joka on muodostettu AGE-ribonukleaa- : : 35 siä kohtaan tai BSA:n vasta-aineella. Positiiviset tulokset • · · ; V tässä määrityksessä ilmaisevat yhdisteitä, jotka pystyvät ♦ · · vähentämään sellaisen AGE-BSA:n määrää, joka on muodostanut « · 53 aiemmin sillan kollageeniin, siten että mainitut yhdisteet katkaisevat siltoja ja tekevät mahdolliseksi, että vapautunut materiaali on huudottavissa pois myöhemmissä pesuvaiheissa. Määrityksen yksityiskohdat ovat seuraavat: 5
MATERIAALIT
Immunokemiaalit ja kemikaalit 10 Häränseerumin albumiini (tyyppi V), (BSA) Calbiochem Dekstroosi
Superbloc, Pierce, Inc.
Kaniinissa muodostettu häränseerumin albumiinin vasta-aine Piparjuuriperoksidaasi (HRP)-vuohi-anti-kaniini, Zymed 15 HRP-substraattipuskuri, Zymed ABTS-kromogeeni, Zymed Fosfaattipuskurikeittosuola Tween 20, Sigma 20 Laitteisto ELISA-levynpesijä, Dynatech ELISA-levynlukija, Dynatech • · ’··· Precision, vesihaude ·· · • · ' .* 25 Corning, digitaalinen pH-mittari • · • · • · · • ·
Lasi- ja muovitavara
Finneppette Multichannel Pipettor (monikanavainen pipetti), 30 Baxter :·. Eppendorfin pipettejä, Baxter • · ·
Eppendorfin toistopipettejä, Baxter • ·
Pipetin kärkiä Finneppetteriin, Baxter • ·· ·.· Pipetin kärkiä Eppendor f-pipettejä varten, Baxter • · · 35 Lasisia koeputkia, 13 x 100 mm; Baxter : .· Mylar-tiivisteteippiä 96-kammioisia levyjä varten, Corning • · ··· · • · ·· 54
Bicoat Cellware Rat Tail Collagen Type-1:llä päällystettyjä 96-kammioisia levyjä, Collaborative Biomedical Products
MENETELMÄT
5
Liuosten ja puskureiden valmistus 1. AGE-BSA-varastoliuokset valmistettiin seuraavasti. Valmistettiin natriumfosfaattipuskuri (0,4-molaarinen), siten että 10 liuotettiin 6 grammaa yksiemäksistä natriumfosfaattia 100 millitraan tislattua vettä, 7 grammaa kaksiemäksistä natrium-fosfaattia (0,4 molaarinen) 100 millitraan tislattua vettä ja kaksiemäksisen liuoksen pH säädettiin 7,4:ksi yksiemäksisellä lliuoksella. Lisättiin natriumatsidia (0,02 grammaa) 100 15 millitraa kohti bakteerikasvun estämiseksi. BSA-liuos valmistettiin seuraavalla tavalla: natriumfosfaattipuskurin (edellä) kutakin millitraa kohti lisättiin 400 milligrammaa tyypin V BSA:ta (häränseerumin albumiinia). Valmistettiin 400-mmolaa-rista glukoosiliuosta, siten että liuotettiin 7,2 grammaa 20 dekstroosia 100 millitraan natriumfosfaattipuskuria (edellä). BSA- ja glukoosiliuokset sekoitettiin suhteessa 1:1 ja niitä .. . inkuboitiin 37 °C:ssa 12 viikon ajan. Inkubointiseoksen pH:ta • · * ·* tarkkailtiin viikoittain ja se säädettiin tarvittaessa ··· ^ • · '··· 7,4:ksi. 12 viikon kuluttua AGE-BSA-liuosta dialysoitiin ·· · : 25 PBS:ää vastaan 48 tunnin ajan, siten että puskuri vaihdettiin • · • *· neljä kertaa ja liuoksen suhde dialysointipuskuriin oli kuiri*. loinkin 1:500. Proteiinipitoisuus määritettiin mikro-Lowry- menetelmällä. AGE-BSA-varastoliuos annosteltiin ja säilytettiin -20 °C:ssa. Laimeat AGE-BSA-liuokset olivat epästabii-30 leita, kun niitä säilytettiin -20 °C:ssa.
» · • · • · *... 2. Silloitus- ja katkaisututkimuksia varten työskentelyliuok- \ . set valmistettiin seuraavasti. Koeyhdiste liuotettiin PBS:ään ·*· ϊ.ϊ ja pH säädettiin pH 7,4:ään, jos se oli tarpeellista. AGE-BSA- :**’ 35 varastoliuos laimennettiin PBS:ään suurimman mahdollisen ·· · . *.* silloittumisen mittaamiseksi ja inhibiittoriliuokseen yhdis- • · *** teiden inhibiittoriaktiivisuuden testaamiseksi. AGE-BSA:n • · · « 55 pitoisuus, joka tarvittiin optimiherkkyyden saavuttamiseen, määritettiin AGE-BSA:n kunkin erän alkutitrauksen avulla.
3. Pesupuskuri ("PBS-Tween") valmistettiin seuraavalla taval-5 la. PBS valmistettiin liuottamalla seuraavat suolat yhteen litraan tislattua vettä: NaCl, 8 grammaa; KC1, 0,2 grammaa, KH2P04, 1,15 grammaa; NaN3, 0,2 grammaa. Tween-20 lisättiin 0. 05.prosentin (tilavuus/tilavuus) lopulliseksi pitoisuudeksi.
10 4. Sekundaarisen vasta-aineen ilmaisua varten valmistettiin substraatit, siten että HRP-substraattipuskuri laimennettiin tislattuun veteen suhteessa 1:10 ja se sekoitettiin ABTS-kromogeenin kanssa suhteessa 1:50 juuri ennen käyttöä.
15 Määritysmenettelyt 1. Biocor-levyt suljettiin 300 plitralla "Superbloc"ia. Levyt suljettiin yhden tunnin mittaiseksi ajaksi huoneenlämpötilassa ja niitä pestiin PBS-Tweenillä kolme kertaa, siten että käy- 20 tettiin Dynatech-levynpesijää, ennen kuin koereagenssit lisät tiin.
• ··· .
·· · • · 2. Kukin koe toteutettiin seuraavalla tavalla. Biocot-levyn » · ’··· kolmea ensimmäistä kammiota käytettiin sokeakokeina. Koekammi- • · · : *. 25 oihin lisättiin 50 mikrolitraa AGE-BSA-liuosta kolmea rinnak- • · • '· kaista näytettä varten ja vain PBS:ää lisättiin sokeisiin ::\ kammioihin. Levyä inkuboitiin 37 °C:ssa neljän tunnin ajan ja se pestiin PBS-Tweenillä kolme kertaa. Kontrollikammioihin sekä sokeakokeeseen lisättiin 50 mikrolitraa PBS:ää sekä 50 30 ^litraa "AGE-sillan katkaisevaa yhdistettä”. Levyä inkuboitiin ;·, yön ajan (suunnilleen 16 tuntia) "AGE-sillan katkaisevan" • · *... koeyhdisteen kanssa, minkä jälkeen pestiin PSB:llä, ennen kuin • · *.. lisättiin primaarista vasta-ainetta (katso myöhemmin).
• ·· • · • · :’** 35 3. Primaarisen vasta-aineen, joko anti-BSA:n tai anti-RNaasin, ·· · . V kukin erä tutkittiin suotuisimman sitoutumiskapasiteetin • · *** suhteen tässä määrityksessä, siten että valmistettiin sarja- *··· • · 56 laimennukset (1:500 - 1:2000) ja 50 /zlitraa kutakin laimennusta siirrettiin Biocot-levyjen kammioihin. Paras primaarinen vasta-aine määritettiin kyllästyskinetiikoista. Lisättiin 50 mikrolitraa primaarista vasta-ainetta, jonka sopiva laimennus 5 määritettiin alkutitrauksen avulla, ja sitä inkuboitiin yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten levy pestiin PBS-Tweenillä.
4. Levyjä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen, HRP-(vuohi-10 anti-kaniini):n kanssa, joka laimennettiin suhteessa 1:4000 PBS:ssä ja jota käytettiin lopullisena sekundaarisena vasta-aineena. Inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan.
5. Enimmäissilloittuminen havaittiin ja AGE-silloittumisen 15 katkaiseminen toteutettiin seuraavasti. Levyn kuhunkin kammioon lisättiin HRP-substraattia (100 jul) ja levyä inkuboitiin 37 °C:ssa viidentoista minuutin ajan. Lukemat otettiin Dyna-techin ELISA-levynlukijalla. Näytesuodatin asetettiin "1":ksi ja vertailusuodatin asetettiin "5":ksi.
20
Normaali toimintamenettelytapa 4« · • · • ’ Alustavat vaiheet • · · «•t ·· · : *.’ 25 1. Titrataan kukin uusi AGE-BSA-valmisteen erä, kuten kuvataan • · : *· taulukossa 4, ja kyllästyskinetiikkojen perusteella määrite- • « tään optimi-AGE-BSA-pitoisuus ELISA-määritystä varten. 1 • ··· Päivän alussa huuhdotaan levynpesijän pää kuumalla huuh- 30 teluvedellä, tislatulla vedellä ja 50-prosenttisella etano- :·, lilla. Levyn pesijän puskurisäiliö täytetään PBS-Tweenillä • · *... (0,05 prosenttinen) ja järjestelmä tyhjennetään kolme kertaa • · *. . ennen käyttöä.
··· • · • · 35 3. Valmistetaan määritysmatriisi kokeen pystyttämiseksi, kuten j V kuvataan myöhemmin kohdassa "Määritysjäjestys", #2.
• · • · · · 57 Määritysjärjestys 1. Superbloc-reagenssi lämmitetään 37 °C:seen. Kuhunkin Bio-cot-levyn kammioon lisätään 300 Mlitraa Superblocia ja jäte-5 tään seisomaan kuudenkymmenen minuutin ajaksi 37 °C:seen. Kammiot pestään kolme kertaa PBS-Tweenillä (0,05-prosenttisel-la) . Levyä käännetään 180 astetta ja tämä pesusykli toistetaan.
10 2. AGE-BSA laimennetaan PBS:ssä, niin että 50 laimen nettua näytettä sisältää AGE-BSA:ta määrän, joka on tarpeen vähimmäissilloittumiseen ja inhibitioon, jonka pimagediini (aminoguanidiini) saa aikaan, edellä kuvatulla alkutitrauksel-la määritettynä. Valmistetaan negatiiviset kontrollit, siten 15 että ruskettumaton BSA liuotetaan PBS:ään samana pitoisuutena kuin AGE-BSA. Kuhunkin kammioon lisätään AGE-BSA:ta tai BSA:-ta, joka matriisilla vastaa "AGE-BSA"- ja "BSA"-leimoja.
3. Koeyhdisteet liuotetaan PBS:ään 30-mmolaarisina pitoisuuk-20 sinä esiarviointia varten. PH täytyy tarkistaa ja säätää 7,4:ksi, jos on tarpeellista. Kollageenillä päällystetyt levyt .. . esikäsitellään AGE-BSA:11a, jotta saadaan maksimi silloittumi- • ^ nen. Valmistetaan negatiiviset kontrollit inhibitokokeita *··. varten, siten että liuotetaan BSA:ta inhibitioliuokseen samana • · · : 25 proteiinipitoisuutena, jota käytettiin AGE-BSA:lie. Lisätään • · • 1· 50 plitraa AGE-BSA:ta tai BSA:ta, jotka ovat inhibiittorili- uoksissa, sellaisiin kammioihin, jotka vastaavat matriisilla vastaavasti "ALT#+AGE-BSA:ta ja "ALT#-sokeakoetta". Levyä inkuboidaan 37 °C:ssa neljän tunnin ajan. Sen jälkeen kun AGE-30 BSA on sitoutunut levyihin kovalenttisesti, levyt pestään PBS-Tweenillä ilmaisureaktiota valmisteltaessa (katso myöhem- • · min) .
• ··· ··· V 4. Primaarinen vasta-aine sidotaan Biocot-levyihin seuraavas- 35 ti. Neljän tunnin mittaisen inkuboinnin päättyessä kammiot ; V pestään PBS-Tweenillä. Valmistetaan kaniinin anti-AGE-RNaasin • · tai kaniinin anti-BSA-vasta-aineiden sopivia laimennuksia 58 (alkutitrauksella määritettyinä) PBS:ssä, ja niitä lisätään kuhunkin kammioon 50 ^litraa ja annetaan seisoa huoneenlämpö-tilassa 60 minuutin ajan.
5 5. Sekundaarista vasta-ainetta sitovat kammiot pestään PBS-
Tweenillä ja 50 mikrolitraa HR (piparjuuriperoksidaasi)-vuohi-anti-kaniiniseerumia, joka on laimennettu PBSrssä suhteessa 1:4000, lisätään kuhunkin kammioon. Levyn annetaan seisoa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan.
10 6. Väri kehitettiin seuraavasti. Levyt pestään kuten edellä vaiheessa neljä. HRP-substraattipuskuri laimennetaan veteen suhteessa 1:10. Lisätään 200 ^litraa ABTS-liuosta, sekoitetaan hyvin ja kuhunkin kammioon lisätään 100 Mlitraa tätä reagens-15 siä. Levyä inkuboidaan 37 °C:ssa 15 minuutin ajan. Optinen tiheys luetaan 410 nm:ssä käyttämällä Dynatechin ELISA-levyn-lukijan näytesuodattimen asentoa "1" ja vertailusuodattimen asentoa "5". Lasketaan yhdisteen aikaansaama prosentuaalinen inhibitio, kuten kuvataan edellä. Sellaiset yhdisteet, joiden 20 havaitaan vähentävän immunologisen reaktiokyvyn määrää, katsotaan olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia, sikäli kuin ne t ··· palauttavat pitkälle edenneen glykosyloinnin lopputuotteiden • · : · tasoja tai vähentävät niitä.
··· ··· • · · : \ 25 ♦ · • · • ♦ • « • · • · ·· • · • ·♦ • · • · • · ·*· • · • · ··· m ··· • · • · • · • · • ·· ···· 59 0 — is ^
--r Q) ^ ^ O O O O
p ^ ^ ^ O O O (O ΓΟ (O M
<d G o o o o η n n ^ —' —- ^ co G CO «H H n "-· CQ 01 *— w — — 1 Ή -H O <λ° oV> c\° o\o o\° o\o o\o o\o o\«
P P
C -H C"· ’d* O H C" H VO Q Q t" in (0 vo ** σν ^ m vo a a cm cm d H e ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ CO O CL) o\o o\o o\o o\° o\o o\o o\o o\° o\o o\o o\o •H < 01 (ö l -h h ·μ< σι co co co vo in cm vo ^•HMt^vo Γ' n vo in vo in in t" r* Ρ P (0 (0 C (0
a (0 rH
<! co CQ Ä I S
1 +J O CO o •C. G * H co (0 en - ^ o o inH in — —.
U O o co co
H <3 O CM CM
I - · »
•H O O O
P
e (0
•H I I
P I >1 >1 ·:·· +j i e >1 i i >1 i
(0 g I d P -H -H p -H
·»· (OdiP’HQlrHrHO) rH
:♦ C-HdHg>i>,gl>,l ** OrHWO-H>i>i-H>,>,>i *··. «PO -H 01ΌΡΡΌΡ-Ρ >i • rHoiep i αία) i-hcu-p ··· dPa)(öingginoigo) :*,· 01(00) -H «· I I ^ 0) I o -H -H rH p ^ ^ gin m .. e -P >1 i i i i i g i ^ : oiop^r-^^^^d^o
• 0) G ·Η ·Η ·Η ·Η -Η Ή -H -H I
• · rH ·Η OlrHrHrHrHrHrHiH CM
:: >ιβο)>ι>ι>ι>ι>ιθ>ιΐ • Ρ (0 ·Η g >1 >1 >1 >1 >1 01 >ι ^ •Η -Η p g Ρ Ρ ρ ρ ρ ρ ρ -Η Μ dp d 0) 0) 0) 0) 0) (0 0) ι-Η ·Η 0) 0) >1 <β ·Η ο 0·Η ο Ο Ο ·Η ·Η Ο >ιΌ ρ έ >ι«ι h m οι ό οι οι οιόρ οι >ι-η 01 g Ρ G O X X -Η χ ·Η χ -Η X ·Η ·Η X -H C g •H daiOOl O O S Ο Ο Ο Ο Ο ε Η·Η Ο Ο 0)0 Ό ·Η g Ρ Ρ I I O I -H I -H I Ο >1Ρ I -Η Ρ Ρ Λ rl-HrH (0 CM CMpCMgCMgCMp >ιΡ (N g H Λ .· >1 OTJd-H I IPIOIOIPPiOIOgg
: ·. 0) 01 I 01 P -H -H g -H p -H p -H g 0) (0 -H P O G
• o pm-πο oi oidoiArHPrHdgeoipp-H
.·;· « (0 * G G X X-H x g >10 >ι·Η ΙΟ * g Λ rH
·· -H ί* <|) -rl O OPOd^dtHrH’M'POdlO
Ρ I 0) g ·Η P POP-PG-HGOIHP-H-OI
• O OH (OP Q)-H 0)01 0) H <D H 0)01 OG Q) rH -a-p
:· GC^-HpgTJgpgopOPPCoigO'-'iO
. -H -H p T3 (0 I -H I (0 I 01 I 01 I (0 -H -H I 01 I -H
·.. g g -H ItÖCMgCM-HCMpCMpCM-HgGCMpCMP
: (0 (ooi ne ^ o —· p ^(0 ·— (o p (oo) -- (o
··· I 10) - O I Ρ I -H I -H I -H I -H I 0) I -H I -H
·· cocogcMMHcoPcorHnPcopcorHcorHcopcorH
• · ♦ * ____________________ • · .................... ...... " ' 1 • · ·
»•M
LO O LO O LO
H H (N (N
60 0 I —
gw O
g 11 co -—Ό —·
d O O O o\o O O O
< oi co co co co co co co -h '— —- ^ σ> —' — —
CQ O
1 4-> o\o o\° o\o t" o\o o\° o\° o\o o\o o\o •H Ή H o\° 4-> ft co h > m· m· introon C Hvoco^in^vovoin^ov
(0 (0 H
d W W
01 O 0) o\° o\° o\° t" o\° o\° o\° o\o oY> o\° o\° •H 01 -
(Öl-H t" ID VO CO t" CT» rH t" lf) VO VO
,¾ ·Η M VO VO VO VO CO 00 VO Is» VO Γ- ID
4-> -P fO ~ (0 C (0 (0 « (G rH 01
(G
+J < •H W H « \ l o
<Ö 1Ή CM
.^j+JOinov vo hoit» e v in - cm ^ tn t" o cö cm - in co in o - - n^-HOCM co — o o e H H ^ ^ O CM ^ ^
20 ^ CM O O rH CO CO
e. (< CO CM C" M· O H CO
I ^ ^ < V S K
q’H O t-I ^ o o o o
ID 4-1 rH
υ e H (0
I II II I
in i .μ o 4J -h -H
.... I 0) (0 M CO Η I I rH I
* -H g -H Λ I -H >1 O in >1 g ... rH -H I -H g >1 4-> >1 W I -H >1 d
• · >,O^4Jd4-l-H4-l4J-HT34->-H
• . >ί·Η I 01 1H -H rH (D (0 Ή Ή dl ι—I
... 4-> g O rH 01 >i g -H >>igg-iHO
ι <DO-H01OQ)>i-H4->>iOl4JW
·1· gMrH4->Wg4->'Ö0 4->M''14->4-> ;a.· ιλ>·, e +j g α) i w n) Λ i co co
• ^g>ia)(edgin4->gg-—(0-H
• · i d +j λ -h -h ι - e ι d -h e -P
ι1, -^-H Q) — 4-> rH -3· <D H1 -H -HO ^
ι · -H H -H -H O O I I Λ I ι—I >i<W -H
, , r-1 0 W H 01 II) Λ rv r. r>0 H
! i >1 W X >1 4-» 4-> -H -H -H -H 01 4J d >i >i-P O-H >i C (0 rH rH H rH 4-1 0) 01 >i
4-> (0 Μ Ό 4-> Q) -H >i >i >i >,(0-H-H4J
Q) -H Ό -H Q) Λ +J >ι >ι >ι >ι·Η 01 C QJ
O 4-> >i M O ~ O 4J 4-> +J 4J4J Λ O O
W^ÄOW -H 01 0) 0) QJ <U ·— O <D 10
0) -H I H rH +4 O O-H o OH Jl H
4-> OHCM^O >1 C-H 01 II) Ό W W H Ό >1 O
W I >i I >i <U 4-> Λϋ 1·Η ,¾ ,Μ >ι >ι-Ρ I
•H CM Id CM 4-J Λ-P O OgO O >t ÄH CM
., Ό I 4-J in -H I 0) r-. (0 I -H I O I I4->IWI
£ -HOJIrH-H-Hg O 10 CM Ό CM J-l (M (M Q) CM (U -H
• >1 rH -H -H O 01 TO -H β fi I -H I Λ I ·Η I ·Η '-r g rH
·.· 0) >i01iH01^O01 -HOOgOgOTJOWIg^i :: ο >Ί<ν ><4-1 o g ,¾ g<Hcoc3g-Hc>:ind>i
’ « β O >i (0 4J O O (0 H -H u -H -H -H g -H O I -H +J
.2 0) M 01 ·Η 0) Μ Λ •HdgÄgrHgOgMOrHQJ-H
. MHO 4-)4-1 g Λ Μ Ό W idg (OO (0M (0 Ό CO go
·,· I >1 C ·Η I g CO Id I w I Λ 1 >1 -H 01 I -H
... CM£lQ)H(M-H>;-HICCM-HCM4-)CMgCMi0g4-)CMjH
• w I Λ >1 wrH ^T3 CO Q) '-'rH (G ^ d •'r· I (0(0 ^ O
... I CM I >, I O I -H - 0) I O I ·Η I -H I CM I -H I rH
.. CO CO 4-) CO 01 CO g CM H CO 01 CO 4-) CO rH CO '— (0+) CO
• · * · |L“ —1 1 I — L~— I " I .4——ί——^ 1 — 1 ··· 2
LO O LO O
H H OO
63
•H I
+J -H ~ £5 0-1 Ο r—»» 1"1«» -1™v
id ^s^^HOOOOOO
flj O O O N—’ H H rH H rH rH
Ή U) rH rH iH ^ s—" s—^ ^ Nw" '—"
O W WWW
< G
I ω o\° o\o o\° o\o o\0 oV> o\o o\° o\o
H -pH
ρ g co -a1 vo o -a· h in -a· o t" h G G G σι -a1 ra n > in r> m1 h vo g (0 ω 3 0 0) G g Ό o\° o\o o\° o\<> o\o o\0 o\o o\» o\0 oY> <λο •H g 3 G ^ G n ra h in h in en r- -a· h- ra
.iiGc^racacaincararacaHin P C -H 3 w O
« m p
G
<
•H M
*
Id-h £
•H -P O
Ή jj? 1 ° « o o o — ° e w o 3 0 ra ra wC O \
I - Q
O-H O S
ir>P
U G
H 3
III I
. I <—i >i E I I I g
·;··; g -H I P G I Ca >i G G
G H g -H -H g I I I P g -H
··· -H >i3 G i—I G ^ ra ra -H I H
• 1 · l—I -rH 0) O -pH -H -H I -H I -H G -a1 O
• · o p rH g m h .-ηό^ό-ρπόο) i g
.···. G G O g Ρ 0 >1-H -H-H H-H g .->P
·.- P O 0) G Id CO >lgHg>lgg-HG
.· G 10 P -H -H p CO >i O >i O G H-H
: . . -h m g ph p g g p >i p g p -h >ip :.· P O -H O I -H Ρ A G A G A H >,1 .. I I P CO -H p -H g G g P g O P o-1
··. ^ ra O P rH o COGPG-HGCA Q)-H
• -H I CO G >-( G -pH -H -H g -H P O rH
·· rH I—lp -H >1 P OrHgrHOHG CO^-1 ::: >,-h g p g g pooogo-h >i
>1 rH 0) -pH I -H -H 0) -H 0) CO g G rH CO P OP
p >, A P -H > P A P gp ΛΡ ΉΡ -H 10)
0) >ί -H P i—I ip -HP IG IG I G rH ra-H
G O G g G >i in G g G - -H - -H - -H >i ICO
P W G OG>i iGOG-a'P-a'P^Pin
G M p -H O G P -HGOG'-rO'^O-rOP -HO
•H O -H Ό HO O-rHrHOHO IG IG IG G-H HP
Ό I G-H ,¾ p gp ϊ^Ηη^Ίη rap rap rap gp ShO
A ra 1 g IH lp >iH i h ujc — g ^ G i ρ >,>,
·· >1 I OO-^G-tfGPGvoGcoGcoGnGinGP.G
G -H P g IG IG GG IG 1,0 IP IP I G H I
• O H G A O-H OG g-H O-H Op^Or-,Or->OC G - .·;· W >i g g GG GO IG GG G-H G-H G-H CO Gra
• · I G 1H G -H P G -H G -H H -H H -H H -H Ρ I
G --HgGgHIGgGg>ig>ig>igH-l ... G -H n H GH GG OH GH G >i G >a G Sh GG ratn-H
• · p -O L_J o -H >i -H G G >i -H >i -H p -H p -H p -H G -— I Ό
. I -H I G Ό Ρ Ό -H -H p Ό Ρ Ό G Ό G Ό G Ό -H l -H -H
... cagoap I -H lGg-H i-h 10 10 10 l G ra h g
: : — O w G n G MG GG n G voG 10 lii VOG n G 1—1 N O
... lp l-H -G -G IG -G -,¾ ·· ,Χ -G I >i g
·· coAmpragraHrogragraOraOraOraHcoPA
• · in o in o in H H ra ra · · "1 1......
• · · ·
"H I
62 C ft O O O o o O O ^
(O H H H H H H H H CO
H 10 0 10 i< O) o\° o\° o\° o\<> o\o 1 CO A° o\o A» oV>
-H -H CO CO CO CM H
p M CO t" CO *3* H CM H ^ CM
C to (0 co m -s)· in (0(010 ^ V \ \ ^ H 10 X \ ^ \ 3 O (1) o\° o\o o\o o\° A» CO g Ό A° o\« A® o\o h g C o ro h
(0 '— d in CO H H CM CM CM H H
X to cm co co
P < H
(0 en o
« PQ P
(0 .
Li μ ω •h ®
^-H
co +2 H G H O
38 i < e. (0
°-H
inp U C H (0
tl III
. I -H >1 I I HIP >1 ·;··: i >i i M p h ό h ^ co i>i
IO >ι I CM O-H H >i I >1 0(0 ,¾ P
··· ^ftO 4->^ Il Olfl H ,C g >i H C OQ) : · : i p <dh ^x ho) ci d p ό o i h
·· >—1(0 OH OO * i (0- -H O) -H <1-1 CM CO
.···. -H-H CO >1 CM Ή g H CM H H CH I X
• · H p ,* >ι -HO Ό d CO O 10 H 0) d —o
*·* >ι I OP H >1 l-H ^ I -H CO ,¾ P 0) tfl -HM
: . . >i^-v Id) -H x -H OinO -P OP HH Ht3 :.· P Ή CM-H Cl LO O M I -H (0 M (0 >i C >1 >i .. 0) H ICO <0 - H - tfl Ό H g H Ό (0 P 0) : o >1 *~>x h cm ό - p >ih op >i e o) o) li • to >1 O O H '—H CM (C Xi >ι M H ,C O g H LO -
• · X P CM >ι I g ----H I >ιΛ H I <H H >i I CM
::: o ο) ·η to >i m o i p - p g >1 mnMP e — • l-H H >ί ft I M (Ml CO O) d >i-H Id PH (0 1
CM tO H X3 O H ,Ω 1—11—i | g -H p p -H (0 ItO t0in-H
ΙΛί Cl M H g l-H H I H Q) p H H - Q) ίί I O
oo (0- ft>idmn to ^ o gto >iC ^ g o-h-h 0) e M -H CM O >1-H l>i ,¾ I tfl H Cd >i 0) -g -H H g
p H Ό to '—H (ΟΡΗ H >i O >—> P Ό C PQ) - -H Ό >i O
to g>i ^ I O ·Η 0) O ΗΡ·Η p H (0 ΙΟ fl)H n H 10>iM
H (0Ä Oin-H Igtfl >i<UP 0) H -H tn <W g >i '-'O PPÄ T3 Hl P I g H I p >i~P g >iP « H IP I 10 C 0) g ·· X H- O) H O >ΰ**(0Ρ H (0£l>il ^d^Hinp Q)gd : >1 >iCM Λ H M II H <Dtfl(Ö M P ^ ItO ItO 1(0 ΛΙΗ
• 0) >ι^Η M >ιΛ “ 1—1P g C (0 0) H OH OQ) OH I 'S· H
.*:· O P I Ό (0 >i g LO H I lOO^OHCCdgCP - I O
·· « dm-H^Pd · H ^ *3· H <H I tfl >, H Q) H g H H ^ >—> 10
Λ I g I 0) H >ίΗ I H H - ,¾ >i ga) g H gH -HP
... HHO“gHCM!>iH O >1 d ^31 O P (OH (OH (0 * H (0
:· 'ÖHM'3,IO"-P>iC>ilQ-'IQ>H>iHOH>i H >,H
. I >ι Λ I to I 0) >i H tfl -H I CM H Ό P Ό tfl T3C ^>iP
... CM>igCMlPtMOPgPCCMltfllHIPIQ) IPI
: ; i—>pd <—> >—< cö i—>100) (0CQ)1—'^^cotOncOcoP cm 0) —
··· I 0) H I H H I ^ H I Q) Q) I o O -0) -H -H H >—> O H
·_ CO g e—I CO H p (M O t0 CO Ω H CO C M (Mg CM P CM tfl P Π tfl H
• · · « I I ___ . ____
• · · ^^^^——^I
• · · · in o in o in
H H CM CM
_63_
H I
P H — G ft — — co ^
(0 --v CO O O O
rtj O v ^ H H HO H
H W .»-* HO H s— s— v— ’—' O W O w ^
< Φ H
I 01 — o\° o\<> o\o o\o o\o o\° <λ° •Η -H o\<> +J M ^ oo cn σι oo <no r-
C (0 (0 O H CM VO O' CO coin CO
(0 (0 ω 3 0<U
W β 73 o\o o\° o\o o\o o\o o\o 0\0 o\° o\° •H β 3
3^3^ t" ^ in CO VO IN CN CO
,¾ ω co hh vo <a· in vo co eg
P C H ttj CO O « « P
0Ö
fÖ *H
H ti * rl β
O «3 O
/-» ^ H VO
c W r- - \ a O - o o C-<i o V ^
I ^ Q Q
o'1^ co 3 3 mp
U G
H 3
II I I I I I
. ^ ^ II II I -H II in 0) >1 o
·;··· -HI Η Λ-H X-H yd HH I <td >. W
H ,¾ rH OP OP Ο >ι Η β -H -H e P
·♦· >iO>iPi ρ i ρ >i >i-h h ω -h to
>iP>i73H73H7JP>il >i r* > H
• · CO G >|H >id >,0) P i—1 >1 OI P
.··*. Φ >ι Φ Ä >i Ä >ι Ä β 3·Ρ P pm I
·. Hd Ä <ld H I Sd I >ί I *H ÄH φ 73 I —
* · -Hl H 73 - P - P - 73 I >ι β >iH -H
: . tn- in-H^tD <· <u <* i p >i i äh h :.· X cg ΛίβΙβ Ιβ I *· Ρ Ρ ^ I >ί >1 .. O —H O O H I Hl Hv φ Φ I - >1 >i • · h i 73 Hp h ^j· h in H^t po — p p ' 73 in H 73 Ä >ι I >ι I >ι I Iin H H ΙΟ) 0)
·· H I β H β >i I—i >i <—i >,i—i H Ä H 73 H fi O
: : · G H 0 G 3 P h pH pH 73 O >1·Η H I 0)
• <|) H P O) H 3 H 3 H 3 H II >ιβ >,7 X
Q) >,Ä Φ H Ä >i Ä >i Ä >i -Cl PO>il O
π>,βΗθΐ>ι i>i i>i mi tupp ^h i >iP3>itnPP PP PP v^ O Ä 3 H 73 cn
+J<UHPP PO) PO) PO) -H W β Λ H H I
Φ β H φ (Ö φ O Φ O ΦΟ-HCOH ,¾ 3 I >1 fi H
φ β I o β h p tn Pin p tn 73 >i-h oh p >, o h p H "V* tn HP I X H I X H IÄH I >i 73 IH PPP >i tn PIP Pl H O 73 H O 73 H O β cg G H ego Φ Φ Ä >i .. H ρπ(0ρπ73ΙΗ73ΙΗ73ΙΟ·-·φβ ΙΐηΡΟβΡ 73 I h h ι-H l cg β ΐηιβ icgp iPOHp Itn3 3
• Ä -HP - H - IO -10 - I Ä CO H M H(0 - X H ÄH
.·;· >1 -f >,1 ιη^ρ ιη^ρ in ^ β imä >iH in o h i 73
·.· Φ v >,^ v >, v-H Ä vH Ä vH 3 Η,^β >iP -10 PH
O -pH - Ρ- Ηβ-Ηβ-ΗΗΗ03 Cl - ΜΙΟΡβ
... 3 coOHcoOco>i3co>i3co >iH >t p H Φ H co l p φ O
· — O >1 '-'O ^ >iH >,-H ^>,0 >iT3H IHH '—(0 PP
. IW>iliniGHlGHIGinp>iOI>ilHHIÄ ·.. CM ^ P eg ,¾ cg φ 0 NOO (ΝΦΡ Φ Ä tn cg>i (NHp cg β : —'ΟΦ·—‘0·—«ptn·—>ριη>—Ή(0βΐρ·^β>—^ >ι i 3
··· I I H I I I H p I H p I H H I - (0 I H I >ιΗ I H
·_· COCNtn COCM CO tn (Ö CO tn fO CO tn P H ^ 73 CO> COGH COH
• · I ______ • · · · in o in o in h h cg cg • · · · 54 •H I P ·Η β (h (Ö o o o o
W ω H H H H
O W ^ ^ w ^ C Q> I 0) •H -H o\° o\° o\° o\o P p -- β (0 (0 σι in r-· n
<0 <d in η οο <M H
h in d o <D ^ ^ ^ ^ in e ό •rl g ί θ\° o\° θ\° θ\° <d w d
,¾ w Tt ^ 10 H
p Ή H rH
n)(fl O
« tn p (O ^
XJ CO
5“ «•ti •h *
H «J
ig | 4 w (0
o-H
inp U β H (0 I Ή
. g I Ό I
·;·· Id ·Η -H-H -
O) -H ΙΌ H g CM
··· g H in-rl>lOw
: . ίο I g >i p I
• · ^ ω -h o p xx m ή .**·. I -P HP Q) g I Ό
«... ~ (Ö >ιΛ gs Η -H
.. . -Η -H >, g I H H g
·· Ή P -P β 'J* H >, O
: . >1 I CD -H I Ο >i p .. >ir> g rH ^ M p Λ : ·. -P -H I Ο -H p Q) g • 0) rH <4· CO rH (d g β
• · O >H I P >ι·Η I -H
t . W >1 (d >1p rH
• X p -H -H in I 10 0 Q) HP P ^ ^ in 1 -H >i I β ·Η ·Η p CM Oi I>1 ^ Q) rH rH (d
I ,¾ in -Η Λ >1 >i'H
<D -HO P H H >, >,p p Hp β>,ρριηι in >ιΌ <u >i o 0) p r-v •H >. >1 XX P Ο Η β ·Η
·· Ό P P HO H in H) H
:·. Ä 31 in ·η * χ p >, • >1 Λ - ,¾ W -H O O >i .*:* a» i cm οΑίΌΡΡΡ .. o P ^ PO I Ό PO)
« U I <U P - >1 -H-H
... a) in -h g ό io P β in : : p i ό i >i - i i x
. I -H -H - p - - - O
··· (M H g Cl I (MCM CMp
: . ^ >1 O '-r- —— ^O
··· I >i P l CM II I Sh co P Ä n — n in n p • · _l ____
• · ^^——*»—»J
• · · in o
rH
• · · · 65
Esimerkki 10
Keksinnön mukaisten yhdisteiden kyky vähentää IgG:n määrää, joka on silloittunut kiertäviin punaisiin verisoluihin rotis-5 sa, joilla on streptotsotosiinilla aikaan saatu sokeritauti, varmistettiin mittaamalla seuraavalla menetelmällä. Koeyhdis-teitä annetaan koe-eläimille joko suun kautta tai vatsaonteloon ja tutkittavat verinäytteet kootaan eri ajankohtina, esimerkiksi neljäntenä, seitsemäntenä tai 19. päivänä annon 10 jälkeen tehon arvioimiseksi.
RBC-IgG-määrityksen ohje Ά. Punasolujen valmistelu 15
Rotista kootaan veri heparinisoituihin putkiin ja niitä sent-rifugoidaan nopeudella 2000 x g kymmenen minuutin ajan ja plasma poistetaan huolellisesti. Sitten lisätään noin viisi millitraa PBS:ää millitraa kohti verta, sekoitetaan huolelli-20 sesti ja sentrifugoidaan jälleen. Supernatantti poistetaan . sitten imemällä. Pesu toistetaan vielä kaksi kertaa. Putken • · · · pohjalle pakkautuneista RBCristä vedetään 0,2 - 0,3 millitraa 0 · : · pipettiä käyttäen ja lisätään PBS:ään, jotta saadaan laimennus • · · *... 1:10. Tämä laimennus laimennetaan sitten edelleen PBS:ssään • · · • *. 25 suhteessa 1:25 ja 1:50.
• · • · • · :Y B. Määritysjärjestys 1. Lämmitä Superbloc 37 °C:seen.
30 2. Ota Multiscreen-HA:n levy, 0,45 ju. Selluloosaesterikalvolla suljettu 96-kammioinen levy (Millipore MAHAS45) .
• · *... 3. Kostuta kammiot 100 μΙίίτΆΐΐΆ PBS:ää.
• · \ . 4. Lisää 300 μΙϊ^ΆΆ supeblockia kuhunkin kammioon ja inkuboi ··· 37 °C:ssa yhden tunnin ajan.
35 5. Aseta levy Millititer Vacuum -pidikkeeseen, kytke tyhjö ja • · · . *.* purista levy alas tiiviin otteen saavuttamiseksi. Kammioi t · • · · • · · · 66 den sisältämät nesteet imetään pois. Pese kammiot 300 Mlitralla PBS-Tweeniä (0,05 prosenttia).
6. Poista tyhjö ja lisää kuhunkin kammioon 100 PBS:ää.
7. Sekoita RBC-näytteitä varovaisesti Vortexilla ja pipetoi 5 niitä 50 Mlitraa kammioihin ohjeen mukaan. Jätä kolme ensimmäistä kammiota sokeakokeille. Jätä vielä kolme kammiota vasta-aineen sokeakokeille.
8. Ime neste pois, kuten edellä on esitetty, ja pese RBC:t kaksi kertaa PBS:llä.
10 9. Laimenna AP(kani-anti-rotta) (Sigma A-6066) PBS:ssä, suh teessa 1:25000.
10. Lisää kammioihin 50 ^litraa ja jätä seisomaan huoneenlämpötilaan kahdeksi tunniksi.
11. Ime neste pois kuten edellä ja pese RBC:t kaksi kertaa 15 PBS:llä.
12. Lisää pNPP-substraatti (1 mg/ml, DEA-puskurissa). 100 kammiota kohti.
13. Anna värin kehittyä kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.
14. Aseta 96-kammioinen corning micrometer -levy tyhjökam- 20 mioon.
15. Aseta näytelevy tyhjöimusarjaan. Varmista, että levyn • » ♦ · , pohja on täysin kuiva.
• · : · 16. Kytke tyhjö viideksi minuutiksi. Nosta levyä varovaisesti *... ja varmista, että levyn pohjassa ei riipu yhtään neste- • · · • 25 pisaraa. Jos on tarpeellista, kytke tyhjö muutamaksi • i j minuutiksi. Lue Corning-levyssä kootun liuoksen OD Dyna :Y tech-levynlukijalla, siten että käytät näytesuodatintä 1 ja vertailusuodatinta 4.
17. Laske katkeamisprosentti: 100* (kontrollin OD410 - käsitel-30 lyn OD410)/ kontrollin OD410.
• · • · • ·
Inhibitioprosentit eläimillä, joille on annettu mainittua • · *. , yhdistettä suun kautta kymmenen milligrammaa kehonpainon ··· kilogrammaa kohti, ovat seuraavat: *·· 35 3-amino-4-metyyli-5-vinyyli-tiatsolium- 3-[2-(2'-naftyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli- ; V mesityleenisulfonaatti 11+ § 19 päivää • · 67 5-(2'-hydroksietyyli)-tiatsoliumbromidi 40+24 @ 19 päi vää 3-[2-(3',5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksi-fenyyli)-2-oksoetyyli]-5-metyyli-tiatso-5 liumbromidi 65+15 @ 19 päi vää 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5- vinyyli-tiatsoliumbromidi 58+21 § 19 päi vää 10
Silloittumisen palautumisen laaja aste, joka havaittiin näissä tutkimuksissa, korostaa keksijöiden tekemää kahta tärkeää johtopäätöstä. Ensinnä, in vivo muodostuneiden siltojen suuri prosenttimäärä on herkkä tämän keksinnön mukaisten dinukleo-15 fiilisten, tiatsoliumpohjäisten yhdisteiden toiminnalle ja pilkkomiselle ja täten häirinnälle, jos nämä sillat sisältävät α-diketonisegmentin yhdenmukaisesti mallin mukaan, joka esitetään kaavioissa A ja B. Toiseksi, keksinnön mukaiset vaikuttavat aineet, jotka katkaisevat sillan, voivat toimia kata-20 lyyttisesti, siinä mielessä, että yksinkertainen, dinukleofii-mttm4 linen, tiatsoliumpoh jäinen molekyyli voi vaikuttaa useampaan . kuin yhteen glykointisiltaan ja aiheuttaa sen katkeamisen.
• · « • · • · · *··· Tämä esimerkki kuvaa rotan jänteen sellaisen säilöön pannun II · : 25 kollageenin CNBr-peptidikarttojen valmistusta, joka on saatu • * • *· normaaleilta ja sokeritautia potevilta eläimiltä, sen jälkeen » · kun kollageeniä on käsitelty kaavan I mukaisella yhdisteellä, esimerkiksi 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidilla (ALT 766). Kollageenisäikeet (5 mg), jotka oli saatu rotilta, 30 joille sokeritauti oli aikaansaatu streptotsotosiinilla, sekä ;·4 vastaavasti samanikäisiltä rotilta, hydrattiin PBSrssä 60
« I
°C:ssa yhden tunnin ajan, liukoinen kollageeni poistettiin ja • · . saostumaa pestiin useita kertoja PBS:llä, sitten sitä käsitel-
»M
tiin 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli) tiatsoliumbromidilla, jonka 35 pitoisuus oli 30 mmoolia litrassa, 16 tunnin ajan. Inkuboinnin . V jälkeen saostumat sentrifugoitiin, pestiin ja niitä käsitel- » » tiin CNBrrllä, 40 mg millitrassa, muurahaishapossa, 30 °C:ssa, ··#· 68 48 tunnin ajan. CNBr-uutteet lyofilisoitiin toistetusti CNBR:n ja hapon poistamiseksi ja sitten niille toteutettiin SDS-PAGE (20-prosenttinen akryyliamidi) pelkistävissä olosuhteissa (kaistat 1, 2 ja 9, MWS = molekyylipainostandardi; kaistat 3, 5 4 ja 5, ovat hännän jänteen kollageeniä, joka on saatu eläi miltä, joissa ei ole sokeritautia ja joista 3 ja 5 on käsitelty 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidilla, 4 käsiteltiin PBS:llä; kaistat 6, 7 ja 8 ovat kollageeniä, joka on saatu sokeritautia potevilta eläimiltä ja joista 6 ja 8 on 10 käsitelty 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumbromidilla, 7 käsiteltiin PBS:llä). Saadut geelit esitetään kuviossa 1.
Esimerkki 12 15 AGE-BSA:n ja silloitetun AGE-BSA:n valmistus
Valmista seuraavat liuokset.
1. Puskuri: 0,4-molaarinen natriumfosfaatti, pH 7,4.
NaH2P04 :6 g/ 100 ml 20 Na2HP04 :7 g/ 100 ml
Yksiemäksisen natriumfosfaatin pH säädettiin 7,4.ksi kak-siemäksisellä natriumfosfaatilla, lisättiin 0,02 g natriumat- : ’.·’ sidia 100 millitraa kohti puskuria.
• · · • · • · · 25 2. BSA-liuos • · BSA: Calbiochem, tyyppi V; 400 mg millitrassa puskuria 1.
;y: Valmistettu kokonaistilavuus 50 g/125 ml. Liuos suodatettiin 0,45 μ:η suodattimen läpi steriiliin, yhden litran vetoiseen Corning-pulloon.
30 3. Glukoosiliuos. 400 μταοΐΆΆτίηθη • « • ’* Glukoosi: 400 mmolaarinen, 9 g /125 ml puskuria. Tämä suoda- • · · *.* tettiin 0,45 μ: n suodattimen läpi Corningin yhden litran • · vetoiseen, steriiliin pulloon.
.’··. 35 • · • · · » · • · • · · • · · • · · · • · 69
Reaktion toteuttaminen: BSA:ta ja glukoosiliuosta (100 millitraa kutakin) sekoitettiin Corningin yhden litran vetoisessa, steriilissä pullossa, 5 suljettiin tiiviisti kierrekorkilla ja inkuboitiin 56 °C:ssa ravistelematta. Pullo avattiin kerran viikossa erän poistamiseksi koetta varten. Reaktion annettiin jatkua yhdeksän viikon ajan, kun AGE-BSA-polymeerin muodostuminen havaittiin.
10 Polymeerin katkaiseminen: AGE-BSA-geelin paloja pestiin PBSrllä, kunnes proteiinia ei enää yhtään liuennut supernatanttiin, ja ne kuivattiin paperi-pyyhkeillä. Noin 50 milligrammaa pestyä geeliä inkuboitiin 15 joko PBS:n tai 10-mmolaarisen 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiat- soliumbromidin (ALT 766) kanssa yön ajan 37 °C:ssa. Superna-tantit analysoitiin SDS-PAGElla ja värjättiin coommassie-sinisellä. Saadut geelit esitetään kuviossa 2.
20 Esimerkki 13 * ’ Tutkittaessa tämän keksinnön mukaisten aineiden kykyä palaut- : V taa ja inhiboida AGE-silta, jotta pinnalla sijaitsevan prote- • · · iinin sellainen värjäytyminen estetään, joka tapahtuu esimer- : ·*: 25 kiksi hampaan pinnalla, toteutetaan seuraava pinnan ruskettu- ·*·.. miskoe. Kalvon peittämän hampaan pinnan tilalla käytetään valottamatonta ja kehitettyä valokuvapaperia, jotta saadaan käyttöön kiinnitetty proteiinipinta (gelatiini, esimerkiksi kollageeni), joka sijaitsee paperin takaosan pinnalla. Lävis- 30 tetään viiden millimetrin suuruiset ympyrät ja ne upotetaan .. yhdeksi viikoksi 50 °C:ssa 0,5-molaariseen fosfaattipuskuriin, • · • pH 7,4, joka on 100-mmolaarinen glukoosi-6-fosfaatin suhteen ja 3-mmolaarinen natriumatsidin suhteen. Glukoosi-6-fosfaatti • · ;*·* on sokeri, joka pystyy osallistumaan ei-entsymaattiseen rus- .·**. 35 kettumiseen nopeammin kuin glukoosi. Glukoosi-6-fosfaatin • · ·
lisäksi sisällytetään klooriheksidiiniä ja (tai) kaavan I
• · :·: : mukaista yhdistettä. Inkuboinnin jälkeen gelatiini-paperilevyt 70 huuhdotaan vedellä, niistä havainnoidaan ruskea väri ja ne va1okuvataan.
Jos levyjä inkuboidaan glukoosi-6-fosfaatissa yksinään, ilme-5 nee niissä vähäistä ruskeaa väriä verrattuina levyihin, jotka on upotettu vain puskuriin. Klooriheksidiinin sisällyttäminen (PeridexRin muodossa, lopullisena pitoisuutena, joka on 0,04 prosenttia klooriheksidiiniä) osoittaa merkittävää ruskettumista. Kaavan I mukaisen yhdisteen lisääminen klooriheksi-10 diiniin inhiboi täydellisesti gelatiinin ruskettumisen, kuten tekee kaavan I mukaisen yhdisteen sisällyttäminen silloin, kun klooriheksidiini puuttuu. Vähäinen ruskea väri, joka muodostuu glukoosi-6-fosfaatin vaikutuksesta gelatiinin pinnalla yksinään, ja sen muodostumisen estyminen kaavan I mukaisella 15 yhdisteellä havainnollistavat tämän keksinnön käyttökelpoisuutta, kun estetään hampaiden pintojen ruskettumista, joka ei ole entsymaattista. Lisääntynyt ruskettuminen klooriheksidiinin läsnäollessa ja sen estyminen kaavan I mukaisella yhdisteellä havainnollistavat tämän keksinnön käyttökelpoisuutta, 20 kun estetään plakinestoaineen aiheuttamaa ei-entsymaattista ruskettumista, joka tapahtuu klooriheksidiinillä.
• · · : V Esimerkki 14 • · · • · • · · 25 Tämä keksinnön mukaisten yhdisteiden yleisen käyttökelpoisuu- ·*·. den havainnollistamiseksi katkaistaessa ei-toivottuja siltoja • lääketieteellisesti merkittävissä molekyyleissä, keksinnön tekijät toteuttivat seuraavan kokeen Alzheimerin sairauden almyloidipeptidillä. Tämä 14 kdaltonin suuruinen peptidi 30 sisältää päärakenneosana plakin kaltaisia keräymiä, jotka .. muodostuvat aivojen peruskudoksessa eli parenkyymissä poti- • ♦ • ]’ lailla, jotka potevat Alzheimerin tautia. Tällaisten amyloidi- • φ *♦* plakkien asteittaisen kerääntymisen, sekä muiden epänormaalien • ♦ :*·* piirteiden, kuten verisuonia ympäröivien amyloidi- ja neurofi- .**· 35 lamenttikimppuvyyhtien, on arveltu vastaavan neurotoksisista ·♦ · . */ ja muista patogeenisistä tapahtumista mainitussa dementiassa, • « « :·: · joka on muuttumattomasti kuolemaan johtava ja tällä hetkellä ·««· 71 parantumaton. Alzheimerin amyloidipeptidin tiedetään keräävän AGE:n muunnoksia in vivo sekä altistettaessa fysiologisesti merkityksellisille glukoosin pitoisuuksille in vivo, joka glykointi voimistaa peptidin sellaisten liukenemattomien 5 kerääntymien muodostumista, jotka muistuttavat Alzheimerin amyloidiplakkej a.
AGE-B-peptidi valmistettiin, siten että erä liukoista B-amy-loidipeptidiä, joka oli valmistettu synteettisesti ja joka 10 vastaa sellaisen B-amyloidipeptidin sekvenssiä, joka esiintyy Alzheimerin taudille tyypillisissä plakeissa, inkuboitiin neutraaliksi puskuroidussa glukoosiliuoksessa kolmen kuukauden ajan, kuten edellä kuvataan yleisesti AGE-BSA-valmisteen suhteen, paitsi että B-peptidi korvasi BSA:n glykointisubstraat-15 tina. Tämän pitkitetyn, glukoosille in vivo toteutetun altistuksen jälkeen glykoitunut ja silloitettu AGE-B-peptidi erotettiin pienimolekyylipainoisista reaktion osapuolista eks-kluusiokromatografiällä (esimerkiksi PFD-10-pylvään kautta), jossa erottelu perustuu kokoon, ja se jodeerattiin normaalein 20 menetelmin, jotta saatiin 125J-AGE-B-peptidi halutuksi ra-dioleimatuksi reagenssiksi, joka on käyttökelpoinen, kun • · · · · ' testataan tai seulotaan yhdisteitä AGE:tä pilkkovan molekulaa- • · · : ’.· risen aktiivisuuden suhteen seuraavaa menettelytapaa noudatta- en. 125J-AGE-B-peptidin eriä inkuboitiin lisättyjen, tämän j ·*· 25 keksinnön mukaisten koeyhdisteide kanssa tai ilman niitä, ennalta määrätyissä pitoisuuksissa (esimerkiksi yhdisteen 766 .*.· 10-mmolaarisessa pitoisuudessa) , ennalta määrätty aika (esi merkiksi yön ajan), minkä jälkeen valmistettiin inkuboitiseok-sen näytegeelielektroforeesi (SDS-PAGE) denaturointia varten 30 ja analysoitiin näennäisen molekyylipainon määrittämiseksi hyvin tunnettujen menettelytapojen mukaan.
• · • · *»* • ♦ *.* Autoradiogrammit, jotka oli altistettu saaduille geelielektro- • · ;*·* foreeseille, skannattiin digitaaliseen, radiografiseen kuvaus- .**· 35 ja analyysijärjestelmään, jota käytettiin radioaktiivisuuden ··· rekisteröintiin näennäisen molekyylipainon funktiona (elektro- • · :·: · foreettinen liikkuvuus SDS:ää sisältävässä puskurissa). Tämän « ··· 72 kokee tulosten tarkastelu osoitti, että 125J-AGE-B-peptidiä ei asetettu alttiiksi tämän keksinnön mukaiselle "AGE:n katkaisijalle", se eluoitui suurimolekyylipainoisena vyöhykkeenä (>40 kdaltonia), mikä viittaa siihen, että sen glykointia 5 seurasi kerääntymä ja stabiilien, kovalenttisten siltojen muodostuminen. Jos 125J-AGE-fi-peptidi inkuboitiin kuitenkin ensin tämän keksinnön mukaisen, AGE-siltaa kantavan aineen liuoksessa, 125J-AGE-B-peptidikerääntymä oli merkittävästi hajonnut, kuten pienimolekyylipainoisen (>18 kdaltonia), 10 jodeeratun materiaalin esiintyminen lopullisessa radiogrammis-sa osoittaa.
Tämä koe viittaa siihen, että tämän keksinnön mukaisia di-nukleofiilisiä, tiatsoliumin kaltaisia vaikuttavia aineita 15 voidaan käyttää hydrolysoimaan kovalenttisia, AGE-välitteisiä siltoja proteiinisäikeiden väliltä mutta että tällainen inhi-bitio ja AGE:iden suunnan muutos voi muuttaa täysin AGE:n kerääntymisen haitallisia molekulaarisia seurauksia sellaisen proteiinin pinnalla, joka on merkityksellinen ihmisen sai-20 raudelle.
Esimerkki 15 • · · • · • « • · ·
Siltarakenteella ja tämän keksinnön mukaisilla, läheisillä • 25 yhdisteillä on käyttöä antigeeneinä tai hapteeneina, kun :*·. muodostetaan vasta-aineita, jotka ovat spesifisesti suunnatut :V; niihin. Samalla tavalla tämän keksinnön mukaiset tällaiset vasta-aineet ovat vuorostaan käyttökelpoisia, kun identifioidaan tämän keksinnön mukaisia AAA-rakenteita. Konstruoimalla 30 immunologisia määrityksiä, joissa käytetään anti-sidosrakenne- .. vasta-aineita, voidaan mitata esimerkiksi aste, jolla tällai- • » *\m\' set sillat ovat muuntaneet proteiineja. Kuten edellä pohdit- • · tiin, näin muunnetun proteiinin puoliintumisajan mukaisesti, :’·* siltaepitooppien immunokemiallinsen mittaus proteiininäyt- .··· 35 teellä, kuten hemoglobiinilla, antaa käyttöön viimeaikaisen • · · , ·,* AGE:n muodostumisindeksin. Samalla tavalla voidaan käyttää • t siltaepitooppien immunokemial lista ilmaisua kiertävien ja ·»·· 73 (tai) kudosproteiinien pinnalla, kun tarkkaillaan sellaisen hoidon kulkua, joka toteutetaan tämän keksinnön mukaisilla vaikuttavilla aineilla, jotka ovat suunnatut pitkälle edenneen glykoinnin inihibitioon ja katkaisuun.
5
Sillan avulla muunnettu BSA voidaan valmistaa immunogeeninä toteutettavaa käyttöä varten, siten että siltarakenne kytketään häränseerumin albumiinin (BSA) kanssa käyttämällä mitä tahansa lukuisista hyvin tunnetuista, divalenttisista kytken-10 täreagensseista, kuten esimerkiksi karbodi-imidiä, esimerkiksi EDC:tä. Voidaan valmistaa vaivatta erilaisia muita hapteenei-ta, antigeenejä ja konjugoituja immunogeenejä, jotka vastaavat tämän keksinnön siltarakenteita, mukaan lukien rakenteet, joita kuvataan spesifisesti tässä keksinnössä, mutta ei niihin 15 rajoittuen, joko eristämällä inkubointiseoksista tai synte-tisoimmalla ne suoraan. Tätä siltarakennetta voidaan käyttää sitten saamaan aikaan suuri määrä vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisiä epitooppeja tai niiden molekyylipiirteitä.
20 Edullisessa sovellusmuodossa pidetään siltarakennetta itseään . hapteenina, joka kytketään vastaavasti johonkin useista edul- ··«· [ > lisistä kantajaproteiineista, joihin kuuluvat muun muassa : maljakotilon (keyhole limpet) hemosyaniini (KLH), tyreoglobu- • · · ·... liini ja edullisimmin häränseerumin albumiini (BSA) , siten • · · j 25 että käytetään divalenttisia kytkentäreagensseja kuten EDCrtä ohjeiden mukaan, jotka ovat tekniikan tason mukaan laajalti ·*.* tunnettuja.
Siltarakennetta, joko yksinään tai kantajaproteiiniin kytket- 30 tynä, voidaan käyttää minkä tahansa hyvin tunnetun immunisoin- .. tiohjeen mukaan tuottamaan vasta-aineita ja niille läheisiä • · immunologisia reagensseja, joita voidaan käyttää monissa • ♦ *♦[ % sovelluksissa, mikä johtuu vasta-aineiden spesifisyydestä siltarakenteen molekyyliominaisuuksia kohtaan.
.“· 35 ··· . V Edullisen ohjeen mukaan voidaan immunisoida mikä tahansa • · ··· * useista eläinlajeista, jotta tuotetaan polyklonaalisia an- • ··· • ·> 74 tiseerumeita, jotka kohdistuvat siltarakenneproteiinikonju-gaattiin, mukaan luettuina esimerkiksi hiiret, rotat, hamsterit, vuohet, kaniinit ja kananpojat. Ensimmäiset kolme edellä mainituista eläinlajeista ovat erityisesti toivotut valinnat 5 sellaisten hybridoomien myöhempää tuottoa varten, jotka erittävät hapteenille spesifisiä vasta-aineita. Mainittuja hybri-doomia voidaan tuottaa immunisoitujen eläinten pernasoluista mukavasti millä tahansa ohjeista, joita käytetään yleisesti tekniikan tason mukaisesti ja jotka kuvaavat sellaisia olosuh-10 teitä, jotka sopivat immunisoitujen pernasolujen kuolemattomaksi tekemiseen, siten että ne sulautetaan yhteen sopivan solulinjan, esimerkiksi myeloomasolulinjan, kanssa. Hybridoomien mainitut tuottamisohjeet antavat käyttöön menetelmiä myös immuuunisplenosyyttien eli immuunipernasolujen ja myeloo-15 masolujen muodostamien hybridoomien valintaa ja kloonausta sekä sellaisten hybridoomakloonien identifiointia varten, jotka erittävät pysyvästi vasta-aineita, jotka kohdistuvat haluttua epitooppia (haluttuja epitooppeja) kohtaan. Eläinlajeista kania ja vuohta käytetään yleisemmin polyklonaalisten 20 antiseerumeiden valmistukseen, mutta siitä huolimatta, halutaanko viime kädessä polyklonaalista antiseerumia vai mono- • · · · ' klonaalisia vasta-aineita, hapteenilla muunnettua kantajapro- • · ί . teiinia annetaan normaalisti aluksi adjuvanttiin, kuten täy- • · · ·...’ delliseen Freundin adjuvanttiin yhdistettynä. Immunisoinnit
M I
• *. 25 voidan toteuttaa monia eri teitä, tyypillisesti vatsaontelon sisään, lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti; tekniikan tason :Y mukaan tietyt tiet ovat edullisia, mihin immuni- soitavat lajit ja viimekädessä tuotettava vasta-aine vaikuttavat. Myöhemmin annetaan tavallisesti tehosteimmuniointeja adju- 30 vantin, kuten esimerkiksi alunan tai Freundin epätäydellisen .. adjuvantin, kanssa. Tehosteimmunisoinnit annetaan aika ajoin • · alkuimmunisoinnin jälkeen; yksi kuukausi on tavallisesti • · **| > sopiva väli, siten että verinäytteet otetaan yhden tai kahden ;*·’ kuukauden välein kunkin tehosteimmunisoinnin jälkeen. Vaih- • ·’* 35 toehtoisesti käytetään joskus monia hyperimmunisointisuunni- • · · . V telmiä, joille ovat luonteenomaisia immunisoinnit, jotka » · ··· sijoittuvat ajallisesti yhteen, jotta tuotetaan anti-hap- • · ·· 75 teenivasta-aineita enemmän kuin anti-kantajaproteiinivasta-aineita.
Tehosteen jälkeisten verinäytteiden vasta-ainetiittereitä 5 voidaan verrata hapteenille spesifiseen immuunitiitteriin jossain useista sopivista formaateista, joihin kuuluvat esimerkiksi Ouchterloney-diffuusiogeelit ja suorat ELISA-menetel-mät. Tyypillisessä suorassa ELISAssa määrätty antigeeni tehdään liikkumattomaksi määrityskammion pinnalle, normaalisti 10 96-kammioisessa tai mikrotiitterilevyformaatissa, mitä seuraa sarja inkubointeja, joiden välillä määrityskammion pinta huuhdotaan, jotta poistetaan sitoutumattomat sidospartnerit. Esimerkin tavoin, ei keksintöä rajoittaen, määrityslevyn kammioihin voidaan panna laimeata, puskuroitua hapteeni-kanta-15 jakonjugaatin vesiliuosta, mieluummin sellaista, jossa kantajaproteiini eroaa proteiinista, jota käytettiin immunisoitaessa vasta-ainetta tuottavaa, tutkittavaa eläintä; esimerkiksi seerumi, joka on peräisin AAA/KLH-konjugaatilla immunisoidusta eläimestä, voidaan tutkia sellaisia määrityskammioita vastaan, 20 joihin on käytetty liikkumattomaksi tehtyä AAA/BSA-konjugaat-tia. Määrityspinta voidaan käsitellä vaihtoehtoisesti inkuboi- • ®* · maila sitä yksinään hapteenin kanssa. Määrityskammioiden pinta • · ϊ . saatetaan sitten alttiiksi soveltumattoman proteiinin, kuten ··« ·... kaseiinin, liuokselle, jotta suljetaan muovipinnan miehittä- ·· » • \ 25 mättömät kohdat. Sen jälkeen kun on huudottu neutraalilla {*·. puskuriliuoksella, joka sisältää tyypillisesti suoloja sekä detergentin saattamaan epäspesifiset vuorovaikutukset vähim-milleen, kammio saatetaan sitten kosketuksiin sellaisen seerumin laimennussarjän kanssa, joka on valmistettu kiinnostavasta 30 verinäytteestä (primaarinen antiseerumi). Sen jälkeen kun on .. jälleen huudottu, voidaan määrittää sellaisten koevasta-ainei- • · * · den laajuus, jotka on kiinnitetty määrityskammioihin, siten • · *·* # että inkuboidaan entsyymi-vasta-ainekonjugaatin kanssa, joka :T on saatavissa kaupallisesti, jolloin tämän sekundaarisen :*'* 35 konjugaatin vasta-aineosa kohdistuu lajeja kohtaan, joita ·· · . V käytetään tuottamaan primaarista antiseerumia; esimerkiksi, • * *·* jos primaarinen vasta-aine muodostetaan kaneissa, sekundaa- « ♦*· 76 risena vasta-aineena voidaan käyttää anti-kanivasta-aineiden kaupallista valmistetta, jonka annetaan muodostua vuohessa ja joka konjugoidaan johonkin useista entsyymeistä, kuten pipar-juuriperoksidaasiin. Valmistajan tarkoin määrittelemiä ohjeita 5 noudattamalla voidaan määrittää kvantitatiivisesti sitten tämän sekundaarisen vasta-aineen määrä siihen liitetyn entsyy-mikonjugaatin aktiivisuuden perusteella kolorimetrisenä määrityksenä. Voidaan valinnaisesti korvata monia läheisiä ELISA-tai radioimmunologisia ohjeita, kuten kompetitiiviset ELISAt 10 tai voileipä-ELISAt, jotka kaikki ovat hyvin tunnettuja, halutun suuritiitterisen antiseerumin identifioimiseksi, toisin sanoen, tietyn antiseerumin, joka antaa todellisen positiivisen tuloksen suurena laimennuksena (esimerkiksi suurempana kuin 1:1000 tai vielä mieluummin suurempana kuin 1:10 15 000.
Samanlaisia immunometristen menetelmien ohjeita voidaan käyttää määritettäessä vasta-aineiden tiitteri sellaisissa viljel-mäsupernatanteissa, jotka ovat peräisin hybridoomista, jotka 20 on valmistettu immunisoitujen eläinten pernasoluista. Täten luonnehdittujen antiseerumeiden tai hybridoomasupernatanttien * yhteydessä on toivottavaa käyttää erilaisia kontrolli-inkubaa-·« « i \ tioita, esimerkiksi erilaisia kantajaproteiineja, jotka ovat • · · läheisiä hapteeneille tai antigeeneille mutta rakenteellisesti | 25 selvästi erilaisia, ja poistaa immunometrisen menetelmän eri- ·’·. laisia reagensseja, jotta vähennetään määrityksen epäspesifi- ;*.* siä signaaleita ja tunnistetaan vasta-ainespesifisyyden luo tettavat määritykset ja tiitteri, joka on peräisin vääristä positiivisista ja vääristä negatiivisista tuloksista. Tunne-30 taan hyvin kontrolli-inkubaatioiden tyypit, joita voidaan ,, käyttää tässä suhteessa. Voidaan käyttää myös samoja yleisiä • · immunometrisiä menetelmiä antiseerumeiden kanssa, jotka on • · *·* > tunnistettu edellä esitetyin menetelmin ja joilla on määrä :*·* olla korkea tiitteri ja jotka ovat suunnatut biologisten » .’** 35 näytteiden, ruoka-aineiden ja muiden ruokatavaroiden tai ··» . v muiden amiinia kantavien aineiden ja kiinnostavien biomolekyy- • · lien siltarakenteiden spesifisiä determinantteja vastaan.
···· 77
Haluttuja, anti-aldehydillä muunnettuja Amadori-tuote-vasta-aineita, joko poly- tai monoklonaalisia, voidaan antaa käyttäjälle sopivan reagenssipakkauksen muodossa, yhdessä ohjeiden ja valinnaisesti muiden käyttökelpoisten reagenssien ja lai-5 mennusaineiden kanssa rajoituksetta, siltarakenteen molekyyli- standardien sarja mukaan luettuna.
Tällä keksinnöllä voi olla myös muita sovellusmuotoja, tai se voidaan toteuttaa muilla tavoin poikkeamatta keksinnön henges-10 tä tai sen varsinaisista ominaisuuksista. Tämän julkaisun tarkoituksena on olla kaikissa suhteissa valaiseva eikä rajoittava, keksinnön piiri esitetään liitteeinä seuraavissa vaatimuksissa, ja niiden tarkoituksena on sulkea sisääntä kaikki muutokset, jotka ovat tarkoitukseltaan ja alueeltaan 15 samanarvoisia.
• · · • · · • · • · • · · • · · • • · • · * · · • · • · · • · 4 • * • · • · · • · · • · • · l> · • · · • · • ·
«M
• « · • · • · • · · • · · • · · ·

Claims (23)

1. Yhden tai useamman seuraavan rakennekaavan mukaisen yhdisteen Y χΘ r1\^N© ,X)~* R s (i) 5 jossa R1 ja R2 on itsenäisesti valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety, hydroksi(alempi)alkyyli, (alempi)asyylioksi(alempi) alkyyli, alempi alkyyli, alempi alkenyyli, Cg-C^g aryyli (jossa aryyli on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai kahdella seuraavista ryhmistä: halogeeni-, hydroksi-, alempi 10 alkoksi-, alkyleenidioksi- tai di(alempi)alkyyliaminoryhmä) tai jossa R1 ja R2 yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä kanssa voivat muodostaa Cg-C^o aromaattisen, yhdistetyn renkaan, joka on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useam maila amino-, halogeeni- tai alkyleenidioksiryhmällä; 15. on vety tai aminoryhmä; Y on amino; ryhmä, jolla on seuraava kaava 0 00 0 0 • · 0 Il -ch2c-r • 0 00 0 0 0 0 jossa R on alempi alkyyli-, (alempi)alkoksi-, hydroksi-, ami- • · • *·· no- tai C6-C10 aryyliryhmä, joka aryyliryhmä on valinnaisesti :’;’:20 substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, alemmalla alkoksi-, halogeeni-, di(alempi)alkyyliamino-, hydrok-si-, nitro- tai alkyleenidioksiryhmällä; • · · * 0 ...* ryhmä, jolla on seuraava kaava 0 000 0 0 0 -ch2r' • · 0 0 0 00 .*.25 jossa R' on vety tai alempi alkyyli, alempi alkynyyli tai Cg-c10 aryyliryhmä, joka aryyliryhmä on valinnaisesti substitu- oitu yhdellä tai kahdella seuraavista ryhmistä: halogeeni-, hydroksi-, alempi alkoksi- tai di(alempi)alkyyliaminoryhmä; tai ryhmä, jolla on seuraava kaava
0 R' ' Il I -CH2C-N-R''' 5 jossa (a) R' ' on vety ja R" 1 on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu Cg-C^o aryyliryhmällä, tai Cg-C^Q aryyliryhmä, jotka aryyliryhmät on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, halogeeni- tai (alempi)alkoksyylikarbonyyliryhmällä; tai (b) R1 ' ja R'' ' 10 ovat molemmat alempia alkyyliryhmiä; X on farmaseuttisesti hyväksyttävä anioni; ja mikä tahansa mainituista alkyyleistä, alkynyyleistä tai al-kokseista voi olla substituoitu yhdellä tai useammalla halogeeni-, amino- tai alemmalla alkyyliaminoryhmällä; 15 käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen, joka farmaseuttinen koostumus on tarkoitettu käytettäväksi humaanilla tai ei-humaanilla eläimellä (i) diabeteksen hoitoon tai (ii) diabeteksen haitallisten myöhäisvaikutusten, (iii) munuais· ;·♦♦ vaurioiden, (iv) verisuonivaurioiden, (v) kohonneen verenpai- :*.*.20 neen, (vi) retinopatian, (vii) perifeerisen neuropatian, .···. (viii) kaihien tai (ix) kudosvaurioiden, joita aiheuttavat pelkistävien sokerien korkeat pitoisuudet, hoitamiseen tai • · ** * ehkäisemiseen tai (x) ihon joustavuuden parantamiseen tai • · ihon ryppyisyyden vähentämiseen. • · · • · ·
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että R1 ja R2 on itsenäisesti valittu ryhmästä, johon kuulu- .···. vat vety, hydroksi (alempi) alkyyli, (alempi) asyylioksi (alem- ’·] pi)alkyyli, alempi alkyyli, alempi alkenyyli, tai että R1 ja *.· * R2 yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä kanssa voivat • · · muodostaa Cg-C^o aromaattisen, yhdistetyn renkaan, joka on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla amino-, ha- • · logeeni- tai alkyleenidioksiryhmällä. • ·
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen käytettäväksi diabetekseen tai diabeteksen haitallisiin myöhäisvaikutuksiin.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö farmaseuttisen 5 koostumuksen valmistamiseen käytettäväksi (iii) munuaisvaurioiden hoitoon.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen käytettäväksi (iv) verisuonivau-rioiden hoitoon.
6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä» että Y on kaavan O II -ch2c-r mukainen ryhmä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 15 että R on aryyliryhmä.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen käytettäväksi diabetekseen tai diabeteksen haitallisiin myöhäisvaikutuksiin. • *·· • · ·'·*: 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö farmaseuttisen .*•*.20 koostumuksen valmistamiseen käytettäväksi (iii) munuaisvauri- • · · ··.·. oiden hoitoon. • · ·· · • · i *** 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö farmaseuttisen • t · : koostumuksen valmistamiseen käytettäväksi (iv) verisuonivau- rioiden hoitoon. • · ...25 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, • · * *;* että yhdiste on 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyyli- • · * • m'· · tiatsolium, tai sen jokin biologisesti tai farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. « · • · · • M • · • ·
12. Yhden tai useamman seuraavista yhdisteistä: 3-aminotiatsoliumsuola; 3 -amino-4,5-dimetyyliaminot iätsoiiumsuola; 2.3- diaminot iätsoiiumsuola; 5 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-tiatsoliumsuola; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyylitiatsoliumsuola; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumsuola; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyylitiatsoliumsuola; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyylitiatsoliumsuola; 10 3-amino-4-metyylitiatsoliumsuola; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-5-metyylitiatsoliumsuola; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-5-metyylitiatsoliumsuola; 3-[2-(4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]tiatsoliumsuola; 3-(2-(4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyylitiatsoliumsuola; 15 3- [2- (4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]-5-metyylitiatsoliumsuola; 3-[2-(4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]-4,5-dimetyylitiatsoliumsuola; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli)tiatsoliumsuola ; 20 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli)tiät- soiiumsuola; 3-[2-(4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli) tiatsoliumsuola; 3.4- dimetyyli-5- (2-hydroksietyyli) tiatsoliumsuola; : \’·25 3-etyyli-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyylitiatsoliumsuola; 3-bentsyyli-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyylitiatsoliumsuola; ··« ·*·*; 3- (2-metoksi-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumsuola; * ♦ · 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumsuola; 3- [2- (4' -bromifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatsoliumsuola; • ♦ · 30 3-(karboksimetyyli)bentsotiatsoliumsuola; . 2,3-(diamino)bentsotiatsoliumsuola; 3- (2-amino-2-oksoetyyli) tiatsoliumsuola; • · ···* 3- (2-amino-2-oksoetyyli) -4-metyylitiatsoliumsuola; 3- (2-amino-2-oksoetyyli) -5-metyylitiatsoliumsuola; • :***:35 3- (2-amino-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyylitiatsoliumsuola; • · · .* . 3-(2-amino-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumsuola; • ♦ ♦ • ·· • · • · 3-(2-amino-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2-hydroksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-amino-5-(2-hydroksietyyli)-4-metyylitiatsoliumsuola; 3-(2-metyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumsuola; 5 3-amino-4-metyyli-5-(2-asetoksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumsuola; 3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2-asetoksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-(2-amino-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2-asetoksietyyli)tiatso-10 liumsuola; 2-amino-3-(2-metoksi-2-oksoetyyli)tiatsoliumsuola; 2. amino-3- (2-metoksi-2 -oksoetyyli)bentsotiatsoliumsuola; 2-amino-3-(2-amino-2-oksoetyyli)tiatsoliumsuola; 2- amino-3- (2 -amino-2 -oksoetyyli)bentsot iatsoliumsuola; 15 3- [2-(4'-metoksifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumsuola; 3- [2-(2',4'-dimetoksifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumsuola; 3-[2-(4'-fluorifenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumsuola; 3- [2- (2^41 -difluorifenyyli) -2-oksoetyyli] -tiatsoliumsuola; 3-[2-(4'-dietyyliaminofenyyli)-2-oksoetyyli]-tiatsoliumsuola; 20 3-propargyyli-tiatsoliumsuola; 3 -propargyyli-4 -metyy1i t iat soliumsuola; 3-propargyyli-5 -metyylitiatsoliumsuola; 3 -propargyyli-4,5 -dimetyylit iatsoliumsuola; 3-propargyyli-4-metyyli-5- (2-hydroksietyyli) -t iatsol iumsuola; • · .. . 25 3-(2-[3'-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli)-tiatsoliumsuola; • · · 3- (2- [3 ' -metoksifenyyli] -2-oksoetyyli) -4-metyyli-5- (2' -hydrok- • · *···* sietyyli)-tiatsoliumsuola; • · · * :. .* 3-(2-[3'-metoksifenyyli]-2-oksoetyyli)-bentsotiatsoliumsuola; • *·· 2,3-diamino-4-klooribentsotiatsoliumsuola; :30 2,3-diamino-4-metyyli-tiatsoliumsuola; 3 -amino-4-metyyli-5-vinyyli-1iatsoliumsuola; ·:··· 2,3 -diamino- 6-klooribentsot iatsol iumsuola; .**·. 2,6-diamino-bentsotiatsolin dihydrosuola; **# 2,6-diamino-3 [2- (4' -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatso- • ♦ · *·* *35 liumsuola; ·«· 2,6-diamino-3 [2- (3' -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli]bentsotiatso- :*·.· liumsuola; • · • · 2.6- amino-3[2-(4'-dietyyliaminofenyyli)-2-oksoetyyli]bentso-tiatsoliumsuola; 2,6 -diamino- 3[2-(4'-bromifenyyli)-2-oksoetyyli]bentsotiatso-liumsuola; 5 2,6-diamino-3(2-fenyyli-2-oksoetyyli)bentsotiatsoliumsuola; 2.6- diamino-3[2-(4'-fluorifenyyli)-2-oksoetyyli]bentsotiatso-1iumsuola; 3 -asetamido-4 -metyyli- 5 -1 iatsolyyli-etyyliasetaattisuola; 2.3 -diamino- 5 -me tyyli t iats oliumsuola; 10 3- [2- (2'-naftyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyy- li)tiatsoliumsuola; 3- [2-(3',5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]- 4- metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-[2-(2',6'-dikloorifenetyyliamino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-15 (2'-hydroksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-[2-dibutyyliamino-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyy-li)tiatsoliumsuola; 3- [2-(4'-karbetoksianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydr-oksietyyli)tiatsoliumsuola; 20 3-[2-(2',6'-di-isopropyylianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5- (2'-hydroksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-[2-(4'-karbmetoksi-3'-hydroksianilino)-2-oksoetyyli]-4-metyy-li-5- (2 1 -hydroksietyyli) tiatsoliumsuola; 2.3 -diamino-4,5 -dimetyylitiatsoliummesityleenisulf onaatti; ···· * *25 2,3-diamino-4-metyyli-5-hydroksietyyli-tiatsoliummesityleeni- ·· · • *.· sulf onaatti; ··· :...: 2,3-diamino-5- (3' ,4' -trimetyleenidioksifenyyli) -tiatsolium- :*·]: mesityleenisulf onaatti; ·’·.. 3 [2- (1' ,4-bentsodioksan-6-yyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2' - • ;*:*j30 hydroksi etyyli) tiatsoliumsuola; 3-[2-(3',4'-trimetyleenidioksifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli- 5- (2 ' -hydroksietyyli) tiatsoliumsuola; • ♦ ... 3- (2- [1·, 4-bentsodioksan-6-yyli] -2-oksoetyyli) t iat sol iumsuol a; • · 3-[2-(31,4'-trimetyleenidioksifenyyli)-2-oksoetyyli]tiatsolium- ♦ ♦♦ ::25 suola; 3 -[2 -(31,51-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]- .* . tiatsoliumsuola; • · · « ·· • · • · 3-[2-(3',5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]4-metyylitiatsoliumsiaola; 3-[2-(3',5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]- 5-metyylitiatsoliumsuola; 5 3-[2-(3',5'-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]- 4,5-dimetyylitiatsoliumsuola; 3-[2-(3',51-di-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]-bentsotiatsoliumsuola; 3-[2-(4'-n-pentyylifenyyli)-2-oksoetyyli]tiatsoliumsuola; 10 3- [2-(4'-n-pentyylifenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydr- oksietyyli)tiatsoliumsuola; 3 -[2 -(4'-dietyyliaminofenyyli)-2-oksoetyyli]-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)tiatsoliumsuola; 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-vinyyli-tiatsoliumsuola; 15 3-[2-(3',5'-tert-butyyli-4'-hydroksifenyyli)-2-oksoetyyli]-4- metyyli-5-vinyyli-1 iatsoliumsuola; 3-(2-tert-butyyli-2-oksoetyyli)tiatsoliumsuola; 3-(2-tert-butyyli-2-oksoetyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli) tiatsoliumsuola; 20 3-(3'-metoksibentsyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)tiatso liumsuola; 3-(2',6'-diklooribentsyyli)-4-metyyli-5-(2'-hydroksietyyli)-t iatsoliumsuola; ...: 3- (2' -nitrobentsyyli) -4-metyyli-5- (2' -hydroksietyyli) tiatso- • · .. . 25 liumsuola; • · · *..* 3- [2- (4' -kloorifenyyli) -2-oksoetyyli] tiatsoliumsuola; • · ]···* 3- [2- (4' -kloorifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2' -hydrok- • · · sietyyli) tiatsoliumsuola, tai ·· : 1 3- [2- (4' -metoksifenyyli) -2-oksoetyyli] -4-metyyli-5- (2' -hydrok- ··· :30 sietyyli) tiatsoliumsuola, ·:··: joissa suola on muodostettu farmaseuttisesti hyväksyttävän 1. anionin kanssa, ··· • · • · · *;]#35 käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen, joka far- ♦ · *···’ maseuttinen koostumus on tarkoitettu käytettäväksi humaanilla tai ei-humaanilla eläimellä (i) diabeteksen hoitoon tai (ii) diabeteksen haitallisten myohäisvaikutusten, (iii) munuais- vaurioiden, (iv) verisuonivaurioiden, (v) kohonneen verenpaineen, (vi) retinopatian, (vii) perifeerisen neuropatian, (viii) kaihien tai (ix) kudosvaurioiden, joita aiheuttavat pelkistävien sokerien korkeat pitoisuudet, hoitamiseen tai 5 ehkäisemiseen tai (x) ihon joustavuuden parantamiseen tai ihon ryppyisyyden vähentämiseen.
13. Ulkoisesti käytettävä koostumus, jossa on yhtä tai useampaa yhdistettä, jotka on valittu kaavan (I) mukaisista yh-10 disteistä: Y ΧΘ r1\/N0 XX R s (I) jossa R1 ja R2 on itsenäisesti valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety, hydroksi(alempi)alkyyli, (alempi)asyylioksi(alempi) alkyyli, alempi alkyyli, alempi alkenyyli, Cg-Cio aryyl-15 (jossa aryyli on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai kahdella seuraavista ryhmistä: halogeeni-, hydroksi-, alempi alkoksi-, alkyleenidioksi- tai di(alempi)alkyyliaminoryhmä) tai jossa R ja R yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä :·*: kanssa voivat muodostaa Cg-C^o aromaattisen, yhdistetyn ren- •*•*•20 kaan, joka on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useam-• · .···. maila amino-, halogeeni- tai alkyleenidioksiryhmällä; ··· ·· · • · · ί· ·* Z on vety tai aminoryhmä; ·· • · • ·· .*:*· Y on amino; ryhmä, jolla on seuraava kaava « 0 ....: Il * * -ch2c-r ··· • ♦ ··♦ #.|.25 jossa R on alempi alkyyli-, (alempi)alkoksi-, hydroksi-, ami-• · · no- tai Cg-C^o aryyliryhmä, joka aryyliryhmä on valinnaisesti *”* substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, alem- • · • · · • ·♦ • · • · maila alkoksi-, halogeeni-, di(alempi)alkyyliamino-, hydrok-si-, nitro- tai alkyleenidioksiryhmällä; ryhmä, jolla on seuraava kaava -CH2R' 5 jossa R' on vety tai alempi alkyyli, alempi alkynyyli tai Cg-Cio aryyliryhmä, joka aryyliryhmä on valinnaisesti substitu· oitu yhdellä tai kahdella seuraavista ryhmistä: halogeeni-, hydroksi-, alempi alkoksi- tai di(alempi)alkyyliaminoryhmä; tai ryhmä, jolla on seuraava kaava
0 R' ' Il I
10 -CH2C-N-R' ' ' jossa (a) R' ' on vety ja R" 1 on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu Cg-C^g aryyliryhmällä, tai Cg-C^g aryyliryhmä, jotka aryyliryhmät on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, halogeeni- tai 15 (alempi)alkoksyylikarbonyyliryhmällä; tai (b) R'' ja R'' ' ovat molemmat alempia alkyyliryhmiä; X on farmaseuttisesti hyväksyttävä anioni; ja mikä tahansa mainituista alkyyleistä, alkynyyleistä tai ai- • · · • kokseista voi olla substituoitu yhdellä tai useammalla halo- :]”:20 geeni-, amino- tai alemmalla alkyyliaminoryhmällä; ja • · · m · · • t * farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta, joka soveltuu • · • ’* ulkoiseen antoon. ··· ♦ · · • · «
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ulkoisesti käytettävä koostumus, tunnettu siitä, että yhdiste on 3- (2-fenyyli-2- .•••£5 oksoetyyli) -4,5-dimetyyli-tiatsolium. • · ·
15. Silmään annosteltavaksi sovitettu koostumus, jossa on yh- ;***: tä tai useampaa yhdistettä, jotka on valittu kaavan (I) mu- • · · .* . kaisista yhdisteistä: • · · • ·· • · • · Υ χΘ jjy^ R S (I) jossa R1 ja R2 on itsenäisesti valittu ryhmästä, johon kuuluvat vety, hydroksi(alempi)alkyyli, (alempi)asyylioksi(alempi) alkyyli, alempi alkyyli, alempi alkenyyli, Cg-C^o aryyli 5 (jossa aryyli on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai kahdella seuraavista ryhmistä: halogeeni-, hydroksi-, alempi alkoksi-, alkyleenidioksi- tai di(alempi)alkyyliaminoryhmä) tai jossa R1 ja R2 yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä kanssa voivat muodostaa Cg-Cio aromaattisen, yhdistetyn ren-10 kaan, joka on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla amino-, halogeeni- tai alkyleenidioksiryhmällä; Z on vety tai aminoryhmä; Y on amino; ryhmä, jolla on seuraava kaava 0 II -ch2c-r ^15 jossa R on alempi alkyyli-, (alempi)alkoksi-, hydroksi-, ami-no- tai Cg-Cio aryyliryhmä, joka aryyliryhmä on valinnaisesti ·· · • V substituoitu yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, alem- • » · :tt>: maila alkoksi-, halogeeni-, di (alempi) alkyyliamino-, hydrok- ·*·*: si-, nitro- tai alkyleenidioksiryhmällä; • · · • · • · 20 ryhmä, jolla on seuraava kaava • · · • · · -CH2R' • · ... jossa R' on vety tai alempi alkyyli, alempi alkynyyli tai Cg- ·;·* Cio aryyliryhmä, joka aryyliryhmä on valinnaisesti substitute ί oitu yhdellä tai kahdella seuraavista ryhmistä: halogeeni-, •***j25 hydroksi-, alempi alkoksi- tai di (alempi) alkyyliamino ryhmä; »·· • · tai ryhmä, jolla on seuraava kaava • · O R' ' Il I -CH2C-N-R’ ' ' jossa (a) R' ' on vety ja R" 1 on alempi alkyyliryhmä, joka on valinnaisesti substituoitu Cg-C^o aryyliryhmällä, tai Cg-C1g aryyliryhmä, jotka aryyliryhmät on valinnaisesti substituoitu 5 yhdellä tai useammalla alemmalla alkyyli-, halogeeni- tai (alempi)alkoksyylikarbonyyliryhmällä; tai (b) R'' ja R' ' ' ovat molemmat alempia alkyyliryhmiä; X on farmaseuttisesti hyväksyttävä anioni; ja mikä tahansa mainituista alkyyleistä, alkynyyleistä tai al-10 kokseista voi olla substituoitu yhdellä tai useammalla halogeeni-, amino- tai alemmalla alkyyliaminoryhmällä; ja farmaseuttisesti hyväksyttävästä kantajasta, joka soveltuu annettavaksi silmään.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen koostumus, tunnettu sil-15 tä, että yhdiste on 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyyli- tiatsolium.
17. Kaavan (I) mukainen yhdiste: ϊ x® . a. J,® Ίρ \_ /~z / ·»·* RS (j) • · • · • ·« *1 o :*!*: jossa R ja R on itsenäisesti valittu ryhmästä, johon kuulu- 20 vat vety, hydroksi(alempi)alkyyli, (alempi)asyylioksi(alem-pi)alkyyli, alempi alkyyli, tai jossa R1 ja R2 yhdessä ren- • ♦ kaaseen sisältyvien hiillensä kanssa voivat muodostaa aro- T maattisen, yhdistetyn renkaan; ··* • · · • · · .··*. Z on vety tai aminoryhmä; ·♦· :\&5 Y on aikynyylimetyyliryhmä; ja • · X on biologisesti tai farmaseuttisesti hyväksyttävä anioni.
18. Kaavan (I) mukainen yhdiste: V X® R\X® X)- R S (I) jossa R1 ja R2 on itsenäisesti valittu ryhmästä, johon kuulu-5 vat vety, hydroksi(alempi)alkyyli, (alempi)asyylioksi(alempi) alkyyli, alempi alkyyli, tai jossa R1 ja R2 yhdessä renkaaseen sisältyvien hiillensä kanssa voivat muodostaa aromaattisen, yhdistetyn renkaan; Z on vety tai aminoryhmä; 10. on 2-amino-2-oksoetyyliryhmä; ja X on biologisesti tai farmaseuttisesti hyväksyttävä anioni.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on 3-(2-fenyyli-2-oksoetyyli)-4,5-dimetyyli-tiatso-lium tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. ί**ϊ 15 20. Farmaseuttinen koostumus, jossa on jonkin patenttivaati- : mukeista 17 ja 18 mukaista yhdistettä ja farmaseuttisesti hy- j***: väksyttävää täyteainetta. ··· M · • 1 · • · ·· • · • · · • ·· « · · • · · 0 • · ·· · • · m 000 • «·· • · « • · · ··· • · • · ··· • · · • ·· • 0 0 0 0
FI973031A 1995-01-18 1997-07-17 Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa FI119756B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37515595 1995-01-18
US08/375,155 US5656261A (en) 1995-01-18 1995-01-18 Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
US47318495A 1995-06-07 1995-06-07
US47318495 1995-06-07
US08/588,249 US5853703A (en) 1995-01-18 1996-01-18 Preventing and reversing the formation of advanced glycosylation endproducts
US9600663 1996-01-18
PCT/US1996/000663 WO1996022095A2 (en) 1995-01-18 1996-01-18 Use of thiazolium compounds for preventing and reversing the formation of advanced glycosylation endproducts
US58824996 1996-01-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI973031A0 FI973031A0 (fi) 1997-07-17
FI973031A FI973031A (fi) 1997-09-15
FI119756B true FI119756B (fi) 2009-03-13

Family

ID=27409228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI973031A FI119756B (fi) 1995-01-18 1997-07-17 Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa

Country Status (3)

Country Link
US (6) US6007865A (fi)
FI (1) FI119756B (fi)
NO (1) NO315930B1 (fi)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO315930B1 (no) * 1995-01-18 2003-11-17 Picower Inst For Medical Res T Anvendelse av tiazoliumforbindelser ved fremstilling av farmasöytiske preparater, preparater som inneholder forbindelsene, samt nyetiazoliumforbindelser
US5656261A (en) 1995-01-18 1997-08-12 The Picower Institute For Medical Research Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
US7361481B2 (en) * 1999-04-09 2008-04-22 Women's And Children's Hospital Diagnosis of lysosomal storage disorders using saposins and other markers
JP2003523388A (ja) * 2000-02-23 2003-08-05 アルテオン インコーポレーテッド チアゾリウム化合物及びタンパク質老化に関連する障害の治療
DK1267812T3 (da) 2000-03-17 2009-04-27 Lg Household & Health Care Ltd Plastre til tandblegning
US8652446B2 (en) 2000-03-17 2014-02-18 Lg Household & Healthcare Ltd. Apparatus and method for whitening teeth
US7785572B2 (en) 2000-03-17 2010-08-31 Lg Household And Health Care Ltd. Method and device for teeth whitening using a dry type adhesive
US6689344B2 (en) 2000-03-17 2004-02-10 Lg Household & Healthcare Ltd. Patches for teeth whitening
GB0010957D0 (en) * 2000-05-05 2000-06-28 Novartis Ag Compound & method
JP2004504389A (ja) * 2000-07-13 2004-02-12 アルテオン　インコーポレーテッド シアノメチル置換化チアゾリウム及びイミダゾリウム、並びにタンパク質老化と関連する疾患の治療
EP1353669B1 (en) * 2000-12-29 2007-08-15 Alteon, Inc. Method for treating glaucoma
WO2002053161A1 (en) * 2000-12-29 2002-07-11 Alteon, Inc. Method for treating fibrotic diseases or other indications
WO2002067851A2 (en) * 2000-12-29 2002-09-06 Alteon, Inc. Method for treating fibrotic diseases or other indications iiic
AU2002243636A1 (en) * 2001-01-22 2002-07-30 Farrington Pharmaceuticals, Llc Method and composition for rejuvenating hair, nails, tissues, cells and organs by ex-vivo or immersive treatment
GB0121189D0 (en) * 2001-08-31 2001-10-24 Diagnoswiss Sa Apparatus and method for separating an analyte
CA2495663A1 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Wyeth Compositions and methods for treating rage-associated disorders
US20060166879A1 (en) * 2002-12-20 2006-07-27 Chakshu Research Inc Treatment of conditions associated with the presence of macromolecular aggregates, particularly ophthalmic disorders
US20060177430A1 (en) * 2002-12-20 2006-08-10 Chakshu Research Inc Treatment of ocular disorders with ophthalmic formulations containing methylsulfonylmethane as a transport enhancer
US20060172972A1 (en) * 2002-12-20 2006-08-03 Chakshu Research Inc Formulation and method for administration of ophthalmologically active agents
WO2004058289A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-15 Chakshu Research, Inc. Ophthalmic formulation for the prevention and treatment of ocular conditions
US20050014747A1 (en) * 2003-04-18 2005-01-20 Emily Reinhard Dihydrothiazine prodrugs of thiazolium agents
US8119651B2 (en) * 2004-01-30 2012-02-21 Biotie Therapies Corp. Compositions useful especially for treatment or prevention of metabolic syndrome
WO2006017563A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for reversing age-related changes in extracellular matrix proteins
US20090060925A1 (en) * 2004-08-03 2009-03-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of Rage Fusion Proteins and Methods of Use
CA2570324C (en) * 2004-08-03 2014-07-22 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
WO2007011843A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Chakshu Research Inc. Prevention and treatment of ophthalmic complications of diabetes
EP1963786B1 (en) * 2005-12-23 2013-07-24 GCoder Systems AB Positioning pattern
CN101007789B (zh) * 2006-01-27 2014-08-20 北京摩力克科技有限公司 取代五元氮杂环盐类化合物及其治疗蛋白老化相关疾病的用途
WO2007094926A2 (en) * 2006-02-09 2007-08-23 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
SG171670A1 (en) 2006-05-05 2011-06-29 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
CN101842382A (zh) 2007-06-14 2010-09-22 卡拉狄加制药公司 Rage融合蛋白
EP2421892A1 (en) 2009-04-20 2012-02-29 Pfizer Inc. Control of protein glycosylation and compositions and methods relating thereto
WO2015051258A1 (en) * 2013-10-03 2015-04-09 David Spiegel Crosslink breakers for preservation of biological substances
WO2024062164A1 (fr) 2022-09-23 2024-03-28 A2P Sciences Acide sagerinique et compositions le contenant pour utilisation dans la prevention et/ou le traitement des troubles lies a la senescence chez un etre humain ou animal

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1364779A (en) * 1972-05-09 1974-08-29 Soc D Etudes Prod Chimique Thiazole derivative
ATE25913T1 (de) * 1983-03-25 1987-03-15 Bbc Brown Boveri & Cie Plattenhalterung, insbesondere fuer rfleiterplatten, sowie ein verfahren zu deren herstellung.
JPS60184038A (ja) * 1984-03-01 1985-09-19 Nippon Kasei Kk １−ヒドロキシ−２−オン類の製造方法
US5869534A (en) * 1992-05-21 1999-02-09 The Picower Institute For Medical Research Glycosylation of lipids and lipid-containing particles, and diagnostic and therapeutic methods and materials derived therefrom
US5399560A (en) * 1984-03-19 1995-03-21 The Rockefeller University 1,2,4-triazine products resulting from the inhibition of advanced glycosylation
US4758583A (en) * 1984-03-19 1988-07-19 The Rockefeller University Method and agents for inhibiting protein aging
US5262152A (en) * 1984-03-19 1993-11-16 The Rockefeller University Amidrazones and derivatives thereof
CA1273011A (en) * 1984-07-02 1990-08-21 Susan M. Schmitt Carbapenems having an externally alkylated mono- or bicyclic 2-quaternary heteroarylalkylthio substituent
DE3428483C1 (de) * 1984-08-02 1985-06-20 Zündwarenfabrik Starcke GmbH & Co, 4520 Melle Springrollo
US4609670A (en) * 1984-11-13 1986-09-02 Eli Lilly And Company Imidazolium hypoglycemic agents
US4683312A (en) * 1984-11-13 1987-07-28 Eli Lilly And Company Imidazolium hypoglycemic agents
JP2507764B2 (ja) * 1987-11-30 1996-06-19 三井石油化学工業株式会社 低級アルキルスルフアモイルアミン類、その塩およびその用途
ZA897515B (en) * 1988-10-07 1990-06-27 Merrell Dow Pharma Novel peptidase inhibitors
US5108930A (en) * 1990-02-20 1992-04-28 Alteon Inc. Aminoguanidine assay and applications thereof
US5230998A (en) * 1991-07-25 1993-07-27 Neurath Alexander R Method for the prescreening of drugs targeted to the V3 hypervariable loop of the HIV-1 envelope glycoprotein gp 120
US5366885A (en) * 1992-06-09 1994-11-22 Barranco Iii Sam C Method and kit for testing tumors for drug sensitivity
DE4222980A1 (de) * 1992-07-13 1994-01-20 Cassella Ag Verwendung von 2-(N-(2-Aminoethyl)amino)-essigsäure-derivaten
EP0614886B1 (en) * 1992-07-30 1996-10-16 Drug Delivery System Institute, Ltd. Compound capable of intracerebral residence and use thereof
NO315930B1 (no) * 1995-01-18 2003-11-17 Picower Inst For Medical Res T Anvendelse av tiazoliumforbindelser ved fremstilling av farmasöytiske preparater, preparater som inneholder forbindelsene, samt nyetiazoliumforbindelser
US5656261A (en) * 1995-01-18 1997-08-12 The Picower Institute For Medical Research Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
MX9705449A (es) * 1995-01-18 1998-02-28 Alteon Inc Uso de compuestos de tiazolio para evitar y revertir la formacion de productos finales de glicosilacion avanzada.
US5662152A (en) * 1995-09-25 1997-09-02 Msa Aircraft Interior Products, Inc. Modular aircraft window unit
US5850840A (en) * 1995-11-15 1998-12-22 Alteon Inc. Methods for measurement and treatment predicated on the presence of advanced glycosylation endproducts in tobacco and its combustion byproducts
US6391899B1 (en) * 1998-07-17 2002-05-21 North Shore—Long Island Jewish Research Institute Compounds and compositions for treating tissue ischemia
US6121300A (en) 1998-11-10 2000-09-19 Wagle; Dilip R. Reversing advanced glycosylation cross-links using heterocyclic-substituted thiazolium salts
AU2001249683A1 (en) * 2000-03-29 2001-10-08 Alteon Inc. Synthesis of thiazolium compounds
AU2002243636A1 (en) * 2001-01-22 2002-07-30 Farrington Pharmaceuticals, Llc Method and composition for rejuvenating hair, nails, tissues, cells and organs by ex-vivo or immersive treatment
US7022721B1 (en) * 2001-02-07 2006-04-04 Peter C Ulrich Method and composition for rejuvenating cells, tissues, organs, hair and nails
WO2002062301A2 (en) * 2001-02-07 2002-08-15 Farrington Pharmaceuticals, Llc Method and composition for rejuvinating cells, tissues, organs, hair and nails

Also Published As

Publication number Publication date
FI973031A0 (fi) 1997-07-17
AU4759996A (en) 1996-08-07
US20080132553A1 (en) 2008-06-05
FI973031A (fi) 1997-09-15
US6440749B1 (en) 2002-08-27
NO973308L (no) 1997-09-18
US20070025926A1 (en) 2007-02-01
US20040034074A1 (en) 2004-02-19
NO973308D0 (no) 1997-07-17
AU714607B2 (en) 2000-01-06
US6007865A (en) 1999-12-28
US7022719B2 (en) 2006-04-04
NO315930B1 (no) 2003-11-17
US20020192842A1 (en) 2002-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119756B (fi) Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa
ES2203677T3 (es) Uso de compuestos de tiazolio para prevenir y invertir la formacion de productos finales de glicosilacion avanzada.
US5130337A (en) Amidrazones and derivatives thereof
USRE38330E1 (en) Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
US5130324A (en) 2-alkylidene-aminoguanidines and methods of use therefor
US5358960A (en) Method for inhibiting advanced glycosylation of proteins using aminosubstituted imidazoles
US5100919A (en) Biguanides and derivatives thereof as inhibitors of advanced glycosylation of a target protein
US5272165A (en) 2-alkylidene-aminoguanidines and methods of use therefor
US5106877A (en) Aminoalcohol compounds in methods of use as inhibitors of the advanced glycosylation of proteins and methods of use therefor
US5221683A (en) Diaminopyridine compounds and methods of use
US5258381A (en) 2-substituted-2-imidazolines
US6458819B1 (en) Thiazolium compounds and treatments of disorders associated with protein aging
US5262152A (en) Amidrazones and derivatives thereof
US5318982A (en) Inhibition of the advanced glycosylation of proteins using substituted-1,2,4-triazoles
US5661139A (en) Bis-(2-aryl) hydrazones
US5500439A (en) Aminopyrazoles
CA2210257A1 (en) Bis-[hydrazones]
US5326779A (en) Method of inhibiting the advanced glycosylation of proteins using 1,2-disubstituted-benzimidazoles
US5534540A (en) Methods of inhibiting the advanced glycosylation of proteins using tetramic and tetronic acids and compositions therefor
AU714607C (en) Use of thiazolium compounds for preventing and reversing the formation of advanced glycosylation Endproducts
US5243071A (en) 2-alkylidene-aminoguanidines and methods of use therefor
JP2002515033A (ja) 置換イミダゾリウム塩、及びタンパク質老化を阻止するためのそれらの使用
WO2009023207A1 (en) Thiazolium compounds for treating gastrointestinal complications
WO1996040663A1 (en) Di- and tri-aminoguanidines and their use to inhibit the advanced glycosylation of proteins
US20040198795A1 (en) Substituted imidazoliums and methods of use therefor

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119756

Country of ref document: FI