MX2007001559A

MX2007001559A - Proteinas de fusion de receptor para productos finales glicados avanzados y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2007001559A
Application number: MX2007001559A
Authority: MX
Inventors: Robert Rothlein; Adnan M M Mjalli; Ye E Tian; Jeffrey C Webster
Original assignee: Transtech Pharma Inc
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2005-08-03
Publication date: 2007-04-10
Also published as: US7981423B2; GEP20105110B; CN1993378A; KR101323411B1; NZ552128A; ZA200906459B; US20110244516A1; NO20065949L; UA93356C2; IL180554A; AU2005271452A1; EP1781700B1; ZA200700643B; US8877192B2; US20120171202A1; US20080075733A1; AP2007003869A0; WO2006017647A1; EP1781700A1; KR20070039981A

Abstract

Se describen proteinas de fusion de RAGE que comprenden secuencias de polipeptido de RAGE enlazadas a un segundo polipeptido de RAGE; la proteina de fusion de RAGE puede utilizar un dominio de polipeptido de RAGE que comprende un sitio de union de ligando de RAGE y un enlazador de interdominio directamente enlazado a un dominio de inmunoglobulina CH2; dichas proteinas de fusion pueden proveer alta afinidad especifica de union de ligandos de RAGE; tambien se describe el uso de las proteinas de fusion de RAGE como agentes terapeuticos para patologias mediadas por RAGE.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE RECEPTOR PARA PRODUCTOS FINALES GLICADOS AVANZADOS Y MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama prioridad bajo 35 USC 119(e) de la solicitud de patente provisional de E.U.A., con número de serie 60/598,555 presentada el 3 de agosto de 2004. La descripción de la solicitud de patente provisional de E.U.A. 60/ 598,555 se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la regulación del receptor para productos finales glicados avanzados (RAGE). Muy particularmente, la presente invención describe proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de RAGE, métodos para hacer dichas proteínas de fusión, y el uso de dichas proteínas para tratamiento de trastornos basados en RAGE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La incubación de proteínas o lípídos cuyos azúcares de aldosa dan por resultado glicación no enzimática y oxidación de grupos amino en proteínas para formar aductos de Amadori. Con el tiempo, los aductos pasan por redisposicones adicionales, deshidrataciones, y entrelazamiento con otras proteínas para formar complejos conocidos como productos finales de glicosilación avanzada (AGEs). Los factores que promueven la formación de AGEs incluyen recambio de proteína retardado (v.gr., como en amiloidosis), acumulación de macromoléculas que tienen alto contenido de lisína, y altos niveles de glucosa en la sangre (v.gr., como en diabetes) (Hori et al, J. Biol. Chem. 270: 25752-761 , (1995)). Los AGEs han sido implicados en una variedad de trastornos incluyendo complicaciones asociadas con diabetes y envejecimiento normal. Los AGEs despliegan unión específica y saturable a receptores de superficie celular en monocitos, macrófagos, células endoteliales de la microvasculatura, células de músculo liso, células mesengiales, y neuronas. El receptor para productos finales glicados avanzados (RAGE) es un miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulina de moléculas. El dominio extracelular (N-terminal) de RAGE incluye tres regiones de tipo inmunoglobulina: un dominio de tipo V (variable) seguido por dos dominios de tipo C (constante) (Neeper et al, J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); -Schmidt et al, Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)). Un solo dominio de extensión de transmembrana y una cola citosólíca corta, altamente cargada siguen al dominio extracelular. El dominio extracelular N-terminal puede ser aislado por proteólisis de RAGE o por enfoques biológicos moleculares para generar RAGE soluble (RAGEs) compuesto de los dominios V y C.

RAGE se expresa en tipos de células múltiples incluyendo leucocitos, neuronas, células microgliales y endotelio vascular (v.gr., Hori et al, J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). Niveles cada vez mayores de RAGE también se encuentran en tejidos en envejecimiento (Schleicher et al, J. Clin. Invest, 99 (3): 457-468 (1997)), y la retina diabética, vasculatura y riñon (Schmidt et al, Nature Med., 1 :1002-1004 (1995)). Además de AGEs, otros compuestos pueden unirse a RAGE y modularlo. RAGE se une a múltiples ligandos funcionalmente y esttructuralmente diversos incluyendo amiloide beta (Aß), amiloide A en el suero (SAA), productos finales de glicosílación avanzada (AGEs), S100 (un miembro proinflamatorio de la familia de calgranulina), carboximetil lisina (CML), anfoterina y CDI VolCDI 8 (Bucciarelli et al, Cell Mol. Life Sci, 59: 1117-128 (2002); Chavakis et al, Microbes Infecí., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al, Scand. J. Immunol, 61 :1-9 (2005); Schmidt et al, J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001 ); Rocken et al, Am. J. Pathol, 162:1213-1220 (2003)). La unión de ligandos tales como AGEs, S100/calgranulína, ß-amiloide, CML (N-carboximetil lisina), y anfoterina a RAGE se ha mostrado que modifica la expresión de una variedad de genes. Estas interacciones entonces pueden iniciar mecanismos de transducción de señal incluyendo activación de p38, p21 ras, MAP cinasas, fosforilación de Erkl-2, y la activación del mediador transcriptional de señalización inflamatoria, NF-?B (Yeh et al, Diabetes, 50:1495-1504 (2001 )). Por ejemplo, en muchos tipos de células, la interacción entre RAGE y sus ligandos pueden generar estrés oxidativo, que da por resultado así la activación del factor de transcripción sensible a radicales libres NF-KB, y la activación de genes regulados por NF-?B, tales como las citocinas IL-I ß y FNT-a. Además, la expresión de RAGE es regulada ascendentemente a través de NF-?B y muestra expresión incrementada en sitios de inflamación o estrés oxidativo (Tanaka et al, J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Por lo tanto, una espiral ascendente y a menudo perjudicial puede ser impulsada por un bucle de retroalimentación positiva iniciado por unión de ligando. La activación de RAGE en diferentes tejidos y órganos puede conducir a un número de consecuencias patofisiológicas. RAGE ha sido implicado en una variedad de condiciones incluyendo: inflamación aguda y crónica (Hofhiann et al, Cell 97:889-901 (1999)), el desarrollo de complicaciones tardías diabéticas tales como permeabilidad vascular incrementada (Wautier et al, J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995)), nefropatía (Teillet et al, J. Am. Soc. Nephrol, 11 :1488-1497 (2000)), arterioesclerosis (Vlassara et. al, The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)), y retinopatía (Hammes et al, Diabetologia, 42:603-607 (1999)). RAGE también ha sido implicada en enfermedad de Alzheimer (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996)), y en invasión y metástasis tumoras (Taguchi et al, Nature, 405:354-357 (2000)). A pesar de la amplia expresión de RAGE y su aparente papel pleiotrópico en múltiples modelos de enfermedad diversos, RAGE no parece ser esencial para el desarrollo normal. Por ejemplo, ratones privados de RAGE son sin un fenotipo anormal manifiesto, que sugiere que aunque RAGE puede jugar un papel en la patología de la enfermedad cuando es estimulado crónicamente, la inhibición de RAGE no parece contribuir a ningún fenotipo no agudo deseado (Liliensiek et al, J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)). El antagonismo de la unión de ligandos fisiológicos para RAGE puede regular descendentemente los cambios patofisiológícos llevados a cabo por concentraciones excesivas de AGEs y otros ligandos de RAGE. Al reducir la unión de lígandos endógenos a RAGE, los síntomas asociados con trastornos mediados por RAGE se pueden reducir. RAGE soluble (RAGEs) es capaz de antagonizar de manera efectiva la unión de ligandos de RAGE a RAGE. Sin embargo, RAGEs puede tener una vida media cuando se administran in vivo que puede ser demasiado corta para ser terapéuticamente útil para uno o más trastornos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar compuestos que antagonicen la unión de los AGEs y otros ligandos fisiológicos al receptor RAGE en donde el compuesto tiene un perfil farmacocinético deseable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención comprenden proteínas de fusión de RAGE y métodos para usar dichas proteínas. La presente invención puede ser modalizada en una variedad de formas. Las modalidades de la presente invención pueden comprender una proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE ligado a un segundo, polipéptido no RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión comprende un sitio de unión de ligando de RAGE. La proteína de fusión puede comprender además un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende dominio CH2 de una inmunoglobulína, o una porción del dominio CH2. La presente invención también comprende un método para hacer una proteína de fusión de RAGE. En una modalidad, el método comprende unir un polipéptido de RAGE a un segundo polipéptido no RAGE. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión de ligando de RAGE. El método puede comprender unir un polipéptido de RAGE directamente a un polipéptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción del dominio CH2. En otras modalidades, la presente invención puede comprender métodos y composiciones para tratar un trastorno mediado por RAGE en un sujeto. El método puede comprender administrar una proteína de fusión de la presente invención al sujeto. La composición puede comprender una proteína de fusión de RAGE de la presente invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Hay varias ventajas que se pueden asociar con modalidades particulares de la presente invención, En una modalidad, la proteínas de fusión de la presente invención pueden ser metabólicamente estables cuando se administran a un sujeto. También, la proteínas de fusión de la presente invención pueden presentar unión de alta afinidad para ligandos de RAGE. En ciertas modalidades, las proteínas de fusión de la presente invención se unen a ligandos de RAGE con afinidades en el intervalo nanomolar micromolar bajo. Al unir con alta afinidad a ligandos fisiológicos de RAGE, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para inhibir la unión de ligandos endógenos a RAGE, proveyendo así un medio para mitigar enfermedades mediadas por RAGE. También, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden proveer en forma de proteína o ácido nucleico. En una modalidad de ejemplo, la proteína de fusión se puede administrar por vía sistémica y permanecer en la vasculatura para tratar potencialmente enfermedades vasculares mediadas en parte por RAGE. En otra modalidad de ejemplo, la proteína de fusión se puede administrar localmente para tratar enfermedades en donde los ligandos de RAGE contribuyen a la patología de la enfermedad. Alternativamente, una construcción de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se puede suministrar a un sitio por el uso de un vehículo apropiado tal como un virus o ADN desnudo en donde la expresión local transitoria puede inhibir localmente la interacción entre ligandos de RAGE y receptores. Por lo tanto, la administración puede ser transitoria (v.gr., como en donde se administra la proteína de fusión) o es más permanente en la naturaleza (v.gr., como en donde la proteína de fusión se administra como un ADN recombinante). Hay características adicionales de la invención que se describirán más adelante. Cabe entender que la invención no se limita en su aplicación a los detalles expuestos en las siguientes reivindicaciones, descripción y figuras. La invención es capaz de tener otras modalidades y de ponerse en práctica o llevarse a cabo de varias maneras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Varias características, aspectos y ventajas de la presente invención se harán más evidentes con reference a las siguientes figuras. Las figuras 1A a U muestran varias secuencias de RAGE de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención: figura 1A, SEQ ID NO: 1 , la secuencia de aminoácidos para RAGE humano; y SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos para RAGE humano sin la secuencia de aminoácidos de señal 1-22; figura 1 B, SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos para RAGE humano sin la secuencia de aminoácidos de señal 1-23; figura 1C, SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de RAGEs humanos; SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de RAGEs humanos sin la secuencia de aminoácidos de señal 1-22, y SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de RAGEs humanos sin la secuencia de aminoácidos de señal 1-23; figura 1 D, SEQ ID NO: 7, una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 8, una secuencia de aminoácidos alternativa que comprende el dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 9, un fragmento N-terminal del dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 10, un fragmento N-terminal alternativo del dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 11 , la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 124-221 de RAGE humano; SEQ ID NO: 12, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 227-317 de RAGE humano; SEQ ID NO: 13, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-123 de RAGE humano; figura 1 E, SEQ ID NO: 14, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-123 de RAGE humano; SEQ ID NO: 15, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-136 de RAGE humano; SEQ ID NO: 16, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-136 de RAGE humano; SEQ ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-226 de RAGE humano; SEQ ID NO: 18, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-226 de RAGE humano; figura 1 F, SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23- 251 de RAGE humano; SEQ ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-251 de RAGE humano; SEQ ID NO: 21 , un enlazador de interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 22, un segundo enlazador de interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 23, un tercer enlazador de interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 24, un cuarto enlazador de interdominio de RAGE; figura 1 G, SEQ ID NO: 25, ADN que codifica aminoácidos de RAGE humano 1-118; SEQ ID NO: 26, ADN que codifica aminoácidos de RAGE humano 1-123; y SEQ ID NO: 27, ADN que codifica aminoácidos de RAGE humano 1-136; figura 1 H, SEQ ID NO: 28, ADN que codifica aminoácidos de RAGE humano 1-230; y SEQ ID NO: 29, ADN que codifica aminoácidos de RAGE humano 1-251 ; figura 11, SEQ ID NO: 38, una secuencia de aminoácidos parcial para los dominios C 2 y C 3 de IgG humana; SEQ ID NO:39, ADN que codifica una porción de los dominios CH2 y CH3 humanos de IgG humana; SEQ ID NO: 40, una secuencia de aminoácidos para los dominios CH2 y CH3 de IgG humana; figura 1J, SEQ ID NO: 41 , un ADN que codifica los dominios CH2 y CH3 humanos de IgG humana; SEQ ID NO: 42, una secuencia de aminoácidos para el dominio CH2 de IgG humana; SEQ ID NO: 43, una secuencia de aminoácidos para el dominio CH3 de IgG humana; y SEQ ID NO: 44, un quinto enlazador de interdomínio de RAGE. La figura 2 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) de una región que codifica proteína de fusión de RAGE (TTP-4000) de conformidad con una modalidad de la presente invención. La secuencia de codificación 1-753 resaltada en negritas codifica la secuencia de proteína N-terminal de RAGE mientras que la secuencia 754-1386 codifica la secuencia de proteína IgG Fc (?l) humana. La figura 3 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 31 ) de una región de codificación de proteína de fusión de RAGE alternativa (TTP-3000) de conformidad con una modalidad de la presente invención. La secuencia de codificación 1-408 resaltada en negritas codifica secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia 409-1041 codifica la secuencia de proteína IgG Fc (?l) humana. La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 32 (TTP-4000), SEQ ID NO: 33, y SEQ ID NO: 34, cada una codifica una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención. La secuencia de RAGE es resaltada en negritas. La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 35 (TTP-3000), SEQ ID NO: 36, y SEQ ID NO: 37, cada una codifica una proteína de fusión de RAGE de tres dominios de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención. La secuencia de RAGE es resaltada en negritas. Las figuras 6A-6B, la figura 6A muestra una comparación de los dominios de proteína en RAGE humano y proteína Ig gamma-1 Fc humana, y puntos de digestión usados para hacer TTP-3000 (en la posición 136) y TTP-4000 (en la posición 251 ) de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención; y la figura 6B muestra la estructura de dominio para TTP-3000 y TTP-4000 de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención. La figura 7 muestra los resultados de una prueba de unión in vitro para RAGEs, y proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) y TTP-3000 (TT3), a los ligandos de RAGE amiloide-beta (A-beta), S100b (S100), y anfoterina (Anfo), de conformidad con una modalidad de la presente invención. La figura 8 muestra los resultados de una prueba de unión in vitro para proteína de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) ("Proteína") a amiloide-beta en comparación con un control negativo sólo incluyendo los reactivos de inmunodetección ("complejo solo"), y antagonismo de dicha unión por un antagonista de RAGE ("ligando de RAGE") de conformidad con una modalidad de la presente invención. La figura 9 muestra los resultados de una prueba de unión in vitro para proteína de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) ("proteína") a amiloide-beta en comparación con un control negativo sólo incluyendo los reactivos de inmunodetección ("complejo solo"), y antagonismo de dicha unión por un antagonista de RAGE ("ligando de RAGE") de conformidad con una modalidad de la presente invención. La figura 10 muestra los resultados de una prueba basada en células que mide la inhibición de producción de FNT-a inducida por S100b-RAGE por proteínas de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4), y RAGEs de conformidad con una modalidad de la presente invención. La figura 11 muestra un perfil farmacocinético para proteína de fusión de RAGE TTP-4000 de conformidad con una modalidad de la presente invención en donde cada curva representa un animal diferente bajo las mismas condiciones experimentales. La figura 12 muestra niveles relativos de liberación de FNT-a de células THP-I debido a estimulación por proteína de fusión de RAGE TTP-4000 y estimulación de IgG humana como una medida de una respuesta inflamatoria de conformidad con una modalidad de la presente invención Las figuras 13A-13B muestran el uso de proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir restenosis en animales diabéticos de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención, en donde la figura 13A muestra que TTP-4000 RAGE-proteína de fusión redujo la relación de íntima/media en comparación con un control negativo (IgG), y la figura 13B muestra que TTP-4000 RAGE-proteína de fusión redujo la proliferación de células de músculo liso vascular de una manera que responde a la dosis. Las figuras 14A-14B muestran el uso de proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir la formación de amíloide y disfunción cognitiva en animales con enfermedad de Alzheimer (AD) de conformidad con modalidades alternativas de la presente invención en donde la figura 14A muestra que TTP-4000 RAGE-proteína de fusión redujo la carga de amiloide en el cerebro, y la figura 14B muestra que TTP-4000 RAGE- proteína de fusión mejoró la función cognitiva. La figura 15 muestra curvas de saturación-unión con TTP-4000 para varios ligandos de RAGE conocidos inmovilizados de conformidad con una modalidad de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para los propósitos de esta especificación, a menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc., usados en la especificación se deben entender como que son modificados en todos los casos por el término "aproximadamente" Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente especificación son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Cuando menos, y no como un intento para limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico por lo menos debe ser considerado a la luz del número de dígitos significativos reportados y al aplicar técnicas de redondeo ordinarias. Independientemente de que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se reportan lo más preciso posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrados en sus mediciones de prueba respectivas. Más aún, todos los intervalos descritos aquí deben entenderse que abarcan cualesquiera y todos los subintervalos subsumados en la misma. Por ejemplo, un intervalo establecido de "1 a 10" debe considerarse que incluye cualesquiera y todos los subintervalos entre (e inclusive de) el valor mínimo de 1 y el valor máximo de 10; es decir, todos los subintervalos que empiezan con un valor mínimo de 1 o más, v.gr., 1 a 6.1 , y que terminan con un valor máximo de 10 o menos, v.gr., 5.5 a 10. Además, cualquier referencia referida como siendo "incorporada aquí" debe entenderse como que es incorporada en su totalidad.

Cabe notar además que, como se usa en ésta especificación, las formas singulares "un", "una", "el", y "la" incluyen rerentes plurales a menos que se limite expresamente o inequívocamente a un referente. El término "o" se usa intercambiablemente con el término "y/o" a menos que el contexto claramente indique otra cosa. También, los términos "porción" y "fragmento" se usan intercambiablemente para referirse a partes de un polipéptido, ácido nucleico u otra construcción molecular. Como se usa aquí, el término "hacia el extremo 5'" se refiere a un residuo que es N-terminal a un segundo residuo en donde la molécula es una proteína, o 5' a un segundo residuo en donde la molécula es un ácido nucleico. También como se usa aquí el término "hacia el extremo 3'" se refiere a un residuo que es C-terminal a un segundo residuo en donde la molécula es una proteína, o 3' a un segundo residuo en donde la molécula es un ácido nucleico. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica. Quienes practican la técnica son dirigidos particularmente a Cúrrente Protocols ¡n Molecular Biology (Ansubel) para definiciones y términos de la técnica. Las abreviaturas para residuos de aminoácidos son los códigos estándares de tres letras y/o de una letra usados en la técnica para referirse a uno de los 20 L-aminoácidos comunes.

Un "ácido nucleico" es un polinucleótido tal como un ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). El término se usa para incluir ácidos nucleicos de una sola cadena, ácidos nucleicos de doble cadena y ARN y ADN hechos de nucleótidos o análogos de nucleótidos. El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se puede usar para transportar una segunda molécula de ácido nucleico a una célula. En una modalidad, el vector permite la replicación de secuencias de ADN insertadas en el vector. El vector puede comprender un promotor para incrementar la expresión de la molécula de ácido nucleico en por lo menos algunas células hospedero. Los vectores pueden replicarse autónomamente (extracromosomalmente) o pueden ser integrados en un cromosoma de una célula hospedero. En una modalidad, el vector puede comprender un vector de expresión capaz de producir una proteína derivada de por lo menos parte de una secuencia de ácidos nucleicos insertada en el vector. Como se conoce en la técnica, las condiciones para hibridar secuencias de ácido nucleico unas a otras se pueden describir como que varían de baja astringencia a alta astringencia. Generalmente, las condiciones de hibridación de alta astringencia se refieren a lavado de híbridos en un regulador de PH con bajo contenido de sal a altas temperaturas. La hibridación puede ser para filtrar ADN ligado usando soluciones de hibridación estándares en la técnica tales como NaHP0 0.5m, dodeciisulfato de sodio al 7% (SDS)5 a 65°C, y lavado en NaHP0 0.25M, SDS al 3.5% seguido por lavado de 0.1 x SSC/0.1 % SDS a una temperatura que varia desde temperatura ambiente hasta 68CC dependiendo de la longitud de la sonda (véase, v.g., Ausubel, F.M. et at. Short Protocols in Molecular Biology, 4a. Ed., capítulo 2, John Wiley & Sons, N.Y.). Por ejemplo, un lavado de alta astringencia comprende lavar un 6x SSC/0.05% de pirofosfato de sodio a 37°C durante una sonda de oligonucleótidos de 14 bases, o a 48°C para una sonda de oligonucleótidos de 17 bases, o a 55°C para una sonda de oligonucleótidos de 20 bases, o a 60°C para una sonda de oligonucleótidos de 25 bases, o a 65°C para una sonda de nucleótidos de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Las sondas de ácidos nucleicos pueden ser marcadas con radionucleótidos mediante marcado extremo, por lo menos, [?-32P]ATP, o la incorporación de nucleótidos radiomarcados tales como [a-32P]dCTP medíante marcado de iniciador aleatorio. Alternativamente, las sondas se pueden marcar mediante la incorporación de nucleótidos biotinilados o marcados con fluoresceína, y la sonda detectada usando estreptavidina o anticuerpos antí-fluoresceína. Como se usa aquí, "moléculas orgánicas pequeñas" son moléculas de peso molecular menor que 2,000 Daltons que contiene por lo menos un átomo de carbono. "Polipéptidos" y "proteínas" se usan intercambiablemente aquí para describir moléculas de proteína que pueden comprender ya sea proteínas parciales o de longitud completa. El término "proteínas de fusión" se refiere a una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de dos o más proteínas. La proteína de fusión también puede incluir regiones de enlace de aminoácido entre porciones de aminoácidos derivadas de proteínas separadas. Como se usa aquí, un "polipéptido no RAGE" es un polipéptido que no es derivado de RAGE o un fragmento del mismo. Dichos polipéptidos no RAGE incluyen péptidos de inmunoglobulina, polipéptidos de dimerización, polipéptídos estabilizadores, péptidos anfifílicos o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que proveen "etiquetas" para etiquetado o purificación de la proteína. Como se usa aquí, "péptidos de ¡nmunoglobulinas" pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina o una porción de la misma. En una modalidad, la porción de la cadena pesada puede ser el fragmento Fc de una porción de la misma. Como se usa aquí, el fragmento Fc comprende el polipéptido de gozne de la cadena pesada, y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de una inmunoglobulína ya sea en forma monomérica o dimérica. O bien, el fragmento CH1 Fc se puede usar como el polipéptido de inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (s), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de cualquiera de los subtipos de cadena pesada: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. Un ejemplo de actividad biológica que puede ser alterado incluye en la reducción de capacidad de un isotípo para unirse a unos receptores de Fc como por ejemplo, mediante la modificación de la región de gozne En los términos "identidad" o "por ciento idéntico" se refieren a identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de ácidos nucleicos. El por ciento de identidad se puede determinar alineando dos secuencias y se refiere al numero de residuos idénticos (v.gr., aminoácido o ácido nucleico) en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. La alineación y comparación secuencias puede conducir usando los algoritmos estándares en la técnica (v.g., Smith y Waterman, 1981 , Adv. Appl. Math. 2:482, Needleman y Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443; Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati Ac. Sci, USA, 85:2444) o mediante versiones computarizadas de estos algoritmos (Wisconsin Genetics Sofware Package Realease 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wl) públicamente disponibles, BLAST y FASTA. También, ENTREZ, disponible a través de Nacional Institutes of Health, Bethesda MD, se puede usar para comparación de secuencias. En una modalidad, el por ciento de identidad de dos secuencias se pueden determinar usando GCG con un peso de espacio de 1 , de tal manera que cada espacio de aminoácido que es pesado como si fuera una sola coincidencia de aminoácidos entre las dos secuencias. Como se usa aquí el término "residuos conservados" se refiere a aminoácidos que son los mismos entre una pluralidad de proteínas que tienen la misma estructura y/o función. Una región de residuos conservados puede ser importante para la estructura o función de la proteína. Por lo tanto, residuos conservados contiguos como se identifica en una porción tridimensional pueden ser importantes para la estructura o función de la proteína. Para encontrar residuos conservados, o regiones conservadas de estructura 3-D, se puede hacer una comparación de secuencias para las mismas o proteínas similares de diferentes especies, o de individuos de la misma especie. Como se usa aquí, el término "homólogo" significa un polipéptido que tiene un grado de homología con la secuencia de aminoácido de tipo silvestre. Comparaciones de homología pueden ser conducidas ocularmente, o más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencia fácilmente disponibles. Estos programas de computadora comercialmente disponibles pueden calcular el por ciento de homología entre dos o más secuencias (v.g., Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:726-730). Por ejemplo, secuencias de homología pueden tomarse para incluir secuencias de aminoácidos que en modalidades alternativas son por lo menos 75% idénticas, a 85% idénticas, 90% idénticas, 95% idénticas o 98% idénticas unas a otras. Como se usa aquí, un dominio de polipéptido o proteína comprende una región a lo largo de un polipéptído o proteína que comprende una unidad independiente. Los dominios se pueden definir en términos de estructura, secuencia y/o actividad biológica. En una modalidad, un dominio de polipéptido puede comprender una región de una proteína que se dobla de una manera que es sustancialmente independiente del resto de la proteína. Los dominios pueden ser identificados usando bases de datos de dominio tales como, pero sin limitarse a PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC, PROFILES, SAMRT y PROCLASS. Como se usa aquí, "dominio de inmunoglobulinas" es una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homologa, o idéntica a, una dominio de una inmunoglobulina. La longitud de secuencia de aminoácidos de un dominio de inmunoglobulina puede ser cualquier longitud. En una modalidad, un dominio de inmunoglobulina puede ser menor que 250 aminoácidos. En una modalidad del ejemplo, un domino de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 80-150 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, la región variable, y las regiones CH1 , CH2 y CH3 de una IgG son cada una dominios de inmunoglobulína. En otro ejemplo, la variable, las regiones CH1 , CH2 CH3 y CH4 de una IgM son cada una dominios de inmunoglobulina. Como se usa aquí, un "dominio de inmunoglobulina de RAGE" es una secuencia de aminoácidos de proteína de RAGE que es estructuralmente homologa o idéntica a, un dominio de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender el V-dominio de RAGE, el dominio C2-tipo 1 similar a IG de RAGE ("dominio C1 "), o el dominio C2-tipo 2 similar a Ig de RAGE ("dominio C2"). Como se usa aquí, un "enlazador de interdominio" comprende un polipéptido que une dos dominios entre sí. Una región de gozne de Fc es un ejemplo de un enlazador de interdominío en una IgG. Como se usa aquí, "directamente enlazado" identifica un enlace covalente entre dos grupos diferentes (v.g., secuencias de ácido nucleico, polipéptidos, dominio de polipéptidos) que no tienen ningún átomo de intervención entre los dos grupos que están siendo enlazados. Como se usa aquí, "dominio de unión de ligando" se refiere a un dominio de proteína responsable de unir un ligando. El término dominio de unión de ligando incluye homólogos de un dominio de un ligando o porciones del mismo. A este respecto, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos deliberadas en el sitio de unión de ligando sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, carácter hidrofóbico o carácter hidrofílico de los residuos, siempre que la especificad de unión del dominio de unión de ligando sea retenida. Como se usa aquí, un "sitio de unión de ligando" comprende residuos en una proteína que interactúan directamente con un ligando, o residuos implicados en la ubicación del ligando en estrecha proximidad a aquellos residuos que interactúan directamente con el ligando. La interacción de residuos en el sitio de unión de ligando se pueden definir por la proximidad espacial de los residuos a un ligando en el modelo o estructura. El término sitio de unión de ligando incluye homólogos de un sitio de unión de ligando, o porciones del mismo, a este respecto, se pueden hacer sustituciones de aminoácido deliberadas en el sitio de unión de ligando sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, carácter hidrofóbico o carácter hidrofílico de los residuos, siempre que la especificidad de unión del sitio de unión de ligando sea retenida. Un sitio de unión retenido puede existir en uno o más dominios de unión de ligando de una proteína o polípéptido. Como se usa aquí, el término "interactúa" se refiere a una condición de proximidad entre un ligando o compuesto, o porciones o fragmentos del mismo, y una porción de la segunda molécula de interés. La interacción puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de unión a hidrógeno, interacciones de van der Waals, o interacciones electroestáticas o hidrofóbicas, o puede ser covalente. Como se usa aquí, un "ligando" se refiere a una molécula o compuesto o entidad que interactúa con un sitio de unión de ligando, incluyendo sustratos o análogos o partes de los mismos. Como se describe aquí, el término "ligando" se puede referir a compuestos que se unen a la proteína de interés. Un ligando puede ser un agonista, un antagonista o un modulador. O bien, un ligando puede no tener un efecto biológico. O bien, un ligando puede bloquear la unión de otros ligandos inhibiendo así un efecto biológico. Los ligandos pueden incluir, pero no se limitan a, inhibidores de molécula pequeña. Estas moléculas pequeñas pueden incluir péptidos, péptidomíméticos, otros compuestos y similares. Los ligandos también pueden incluir polipéptidos y/o proteínas. Como se usa aquí, un "compuesto modulador" se refiere a una molécula que cambia o altera la actividad biológica de una molécula de interés. Un compuesto modulador puede incrementar o reducir la actividad, o cambiar las características físicas o químicas, o propiedades funcionales o inmunológicas, de la molécula de interés. Para RAGE, un compuesto modulador puede incrementar o reducir la actividad, o cambiar las características, o propiedades funcionales o inmunológícas del RAGE o una porción del mismo. Un compuesto modulador puede incluir péptidos naturales y/o químicamente sintetizados o artificiales, péptidos modificados (v.g., fosfopéptidos), anticuerpos, carbohidratos, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, glicolípídos, compuestos heterocíclicos, nucleótidos o nucleótidos o partes de los mismos, y moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas. Un compuesto modulador puede ser un compuesto fisiológico endógeno o puede ser un compuesto natural o sintético. O bien, el compuesto modulador puede ser una molécula orgánica pequeña. El término "compuesto modulador" también incluyen un ligando o compuesto químicamente modificado, e incluye isómeros formas racémicas. Un "agonista" comprende un compuesto que se une a un receptor para formar un complejo que induce una respuesta farmacológica, específica para el receptor implicado. Un "antagonista" comprende un compuesto que se une a un agonista o a un receptor para formar un complejo que no da origen a una respuesta farmacológica sustancial y puede inhibir la respuesta biológica inducida por un agonista. Los agonistas de RAGE por lo tanto se pueden unir a RAGE y estimular procesos celulares mediados por RAGE, y los antagonistas de RAGE pueden inhibir procesos mediados por RAGE de ser estimulados por un agonista de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad, el proceso celular estimulado por agonistas de RAGE comprende la activación de descripción de gen de FNT-a. El término "miméticos de péptidos" se refiere a estructuras que sirven como sustitutos para péptidos en interacciones entre moléculas (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252). Los miméticos de péptido pueden incluir estructuras sintéticas que pueden o no contener aminoácidos y/o enlaces peptídicos si no que retienen la característica estructural y funcional de un péptido o agonista, o antagonista. Los miméticos de péptido también incluyen peptoides, oligopeptoides (Simón et al., 1972, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89:9367); y genotecas de péptido que contienen péptidos de una longitud designada que representa todas las secuencias posibles de aminoácidos correspondientes a un péptido, o agonista o antagonista de la invención. El término "tratar" se refiere a mejorar un síntoma de una enfermedad o trastorno y puede comprender curar el trastorno, prevenir sustancialmente el inicio del trastorno, o mejorar la condición del sujeto. El término "tratamiento" como se usa aquí se refiere al espectro completo de tratamientos para un trastorno dado del cual padece el paciente, incluyendo alivio de un síntoma o la mayoría de los síntomas que resultan de ese trastorno, una curación para el trastorno particular o prevención del inicio del trastorno.

Como se usa aquí, el término "CE50" se define como la concentración de un agente que da por resultado 50% de un efecto biológico medido. Por ejemplo, el CE50 de un agente terapéutico que tiene un efecto biológico medible puede comprender el valor al cual el agente despliega 50% del efecto biológico. Como se usa aquí, el término "CI50" se define como la concentración de un agente que da por resultado el 50% de inhibición de un efecto medido. Por ejemplo, la CI50 de un antagonista de unión de RAGE puede comprender el valor actual el antagonista reduce la unión de ligando al sitio de unión de ligando de RAGE el 50%. Como se usa aquí, una "cantidad efectiva" significa la cantidad de un agente que es efectiva para producir un efecto deseado en un sujeto. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" denota aquella cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que inducirá respuesta terapéutica de un animal o humano que está siendo buscada. La dosis real que comprende la cantidad efectiva puede depender de la vía de administración, en tamaño y salud del sujeto, el trastorno que está siendo tratado y similares. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa aquí, puede referirse a compuestos y composiciones que son adecuados para usarse en sujetos humanos o animales, como por ejemplo, para composiciones terapéuticas administradas para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediada por RAGE. El término "composición farmacéutica" se usa aquí para denotar una composición que puede ser administrada a un hospedero mamífero, v.g., oralmente parenteralmente, tópicamente, por aspersión mediante inhalación, intranasalmente o rectalmente, en formulaciones de dosis unitaria que contienen vehículos, diluyentes, ayudantes, portadores o similares no tóxicos convencionales. El término "parenteral" como se usa aquí, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección ¡ntracistemal o técnicas de infusión.

Proteínas de fusión de RAGE Modalidades de la presente invención comprenden proteínas de fusión de RAGE, métodos para hacer dichas proteínas de fusión y métodos para usar dichas proteínas de fusión. La presente invención se puede modalizar en una variedad de formas. Por ejemplo, modalidades de la presente invención proveen proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de EAGE enlazado a un segundo polipéptido no RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión de ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión de ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión de ligando de RAGE puede comprender dominio V de RANGE o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión de RAGE comprende SEQ ID NO:9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO:10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede ser enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulína o una porción (v.g., un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polípéptido que comprende un dominio de inmunoglobulína comprende por lo menos una porción de por lo menos uno de los dominios CH2 O CH3 de una IgG humana. Una proteína o polipéptído de RAGE puede comprender proteína de RAGE humana de longitud completa (v.g., SEQ ID NO:1 ), o un fragmento de RAGE humano. Como se muestra aquí, un fragmento de un polípéptido de RAGE es por lo menos 5 aminoácidos de longitud, puede ser mayor que 30 aminoácidos de longitud, pero de menor que una secuencia de aminoácidos completa. En modalidades alternativas, el polipéptido de RAGE puede comprender una secuencia que es 70%, o 80%, o 85%, o 90% a RAGE humano, o un fragmento de la misma. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un RAGE humano, o un fragmento del mismo, siendo glicina el primer residuo en vez de una metionina (v.g., Beeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender un RAGE de longitud completa con la secuencia de señal removida (v.g., SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3) (figuras 1A y 1 B) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGE, un polipéptido al 90% idéntico a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Como se usa aquí, RAGEs es la proteína RAGE que no incluye la región de transmembrana de la cola citoplásmica (Park et al, Nature Med., 4:1025-1031 (1998)). Por ejemplo, el polipéptido, RAGE pude comprender RAGEs humano o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo en vez de una metionina (véase, v.g., Beeper et al, (1992)). O bien, un polipéptido RAGE puede comprender un RAGEs humano con la secuencia de señal removida (v.g., SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6) (figura 1C) o una proteína de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína RAGE puede comprender un dominio V de RAGE (v.gr., SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; fig. ID) (Neeper et al, (1992); Schmidt et al. (1997)). O bien, una secuencia 90% idéntica al dominio V de RAGE o un fragmento del mismo se puede usar. O bien, la proteína de RAGE puede comprender un fragmento del dominio V de RAGE (v.gr., SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 Figura 1 D). En una modalidad, la proteína de RAGE puede comprender un sitio de unión de ligando, en una modalidad, el sitio de unión de ligando puede comprender SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma o SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma, en otra modalidad más, el fragmento de RAGE es un péptido sintético. Por lo tanto, el péptido RAGE usado en las proteína de fusión de la presente invención puede comprender un fragmento de RAGE longitud completa. Como se conoce en la técnica, RAGE comprende tres dominios de polipéptido similares a inmunoglobulina, el dominio V, y los dominios C1 y C2 cada uno ligados uno a otro por un enlazador de interdominio. RAGE de longitud completa también incluye un polipéptido de transmembrana y una cola citoplásmica hacia el extremo 3' (C-terminal) del dominio C2, y enlazado al dominio C2. En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender cualquiera de los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7) o una secuencia a 90% idéntica a la misma, o aminoácidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia a 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE. O bien, el polipéptído de RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11 ) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O bien, el polipéptído de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdominio hacia el extremo 3'. O bien, el polípéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el enlazador de interdominio enlazando a estos dos dominios. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente a RAGEs (es decir, codifica los dominios V, C1 y C2 y los enlazadores de interdominio). O bien, los fragmentos de cada uno de esta secuencia se pueden usar. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no son derivados de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polípéptido de inmunoglobulina puede comprender una cadena pesada de inmunoglobulína o porción (es decir, fragmento) del mismo. Por ejemplo, el fragmento de cadena pesada puede comprender un polipéptido derivado del fragmento Fc de una inmunoglobulina en donde el fragmento Fc comprende el polipéptído de gozne de cadena pesada, y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina como un monómero. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ),lgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma se puede derivar de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), o lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. En el segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y C 3 de una lgG1 humana o porciones de cualquiera o ambos de estos dominios. Como modalidades de ejemplo, el polipéptído que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender SEQ ID NO:40. La porción Fc de la cadena inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por lo tanto, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un enlazador de interdominio derivado de RAGE en vez de un polipéptido de gozne de interdomínio derivado de una inmunoglobulina. Por lo tanto, en una modalidad, la proteína de fusión comprende un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulína, o un fragmento o porción del dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el dominio CH2 O un fragmento del mismo comprenden SEQ ID NO:42. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un sitio de unión de ligando. El sitio de unión de ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO:9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO:10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. El polipéptido de RAGE usado en las proteínas de fusión de la presente invención puede comprender un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Además o alternativamente, el fragmento de RAGE puede comprender un enlazador de interdominio. O bien, el polipéptído de RAGE puede comprender un dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a un enlazador de interdominio hacia el extremo 5' (es decir, más cerca del N-terminal) o hacia el extremo 3' (es decir, más cerca del C-terminal). En otra modalidad más, el polipéptido de RAGE puede comprender dos (o más) dominios de inmunoglobulina de RAGE cada uno enlazado al otro por un enlazador de interdominio. El polipéptido de RAGE puede comprender además múltiples dominios de inmunoglobulina de RAGE enlazados unos a otros por uno o más enlazadores de interdominio y teniendo un enlazador de interdomínio terminal unido al dominio de inmunoglobulina de RAGE N-terminal y/o al dominio de inmunoglobulina C-terminal. Combinaciones adicionales de los dominios de inmunoglobulína de RAGE y enlazadores de interdominio están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como una modalidad de ejemplo, el polípéptido que comprende los dominios CH2 y CH3, o una porción de los mismos, de una lgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. Como se describió antes, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido de RAGE que comprende un enlazador de interdominio enlazado a un dominio de polipéptido de RAGE puede comprender un fragmento de proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdominio hacia el extremo 3'. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 , el enlazador de interdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazador de interdominio hacia el extremo 3' de C1. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de ¡nterdominio de RAGE enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulína de RAGE y un segundo enlazador de ¡nterdominío de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-termínal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdomínio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina C 2. En una modalidad, una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios puede comprender SEQ ID NO: 32. En modalidades alternativas, una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios comprende SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34. Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulína derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdomínio de RAGE al aminoácido N-terminal de un dominio de inmunoglobulina CH2 O una porción de un dominio de inmunoglobulina CH2. En una modalidad, una proteína de fusión de tres dominios de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 35. En modalidades alternativas, una proteína de fusión de tres dominios de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37. Un fragmento de enlazador de interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' de, y por lo tanto, enlazado a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazador de ¡nterdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente hacia el extremo 3' del dominio V. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 21 , correspondiente a los aminoácidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador de ¡nterdominio que comprende varios aminoácidos (v.gr., 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 21. Por lo tanto, en una modalidad, el enlazador de interdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ ID NO: 21 deletando, por ejemplo, 1 , 2 ó 3, aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. En modalidades alternativas, el enlazador puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazador puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' del dominio C1. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, un enlazador que comprende varios (1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) aminoácidos hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 22 se puede usar. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ E) NO: 22, deletando por ejemplo, 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazador de interdomínio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los aminoácidos 222-226. O bien, un enlazador de interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los aminoácidos 318-342 de RAGE.

Métodos para producir proteínas de fusión de RAGE La presente invención también comprende un método para hacer una proteína de fusión de RAGE. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención comprende un método para hacer una proteína de fusión de RAGE que comprende el paso de unir covalentemente un polipéptido de RAGE enlazado a un segundo polipéptido no RAGE en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión de ligando de RAGE. Por ejemplo, el polipéptído de RAGE enlazado y el segundo polípéptido no RAGE pueden ser codificados por una construcción de ADN recombínante. El método puede comprender además el paso de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión. También, el método puede comprender el paso de insertar el vector de expresión en una célula hospedero. Por ejemplo, las modalidades de la presente invención proveen proteínas de fusión que comprendes un polipéptido de RAGE enlazado a un segundo polipéptido no RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión de ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión de ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión de ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede ser enlazado a un polipéptído que comprende un dominio de inmunoglobulína o una porción (v.gr., un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende por lo menos una porción de por lo menos uno de los dominios C 2 o CH3 de una IgG humana. La proteína de fusión puede ser manipulada por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de RAGE enlazado a un segundo polipéptído no RAGE. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un sitio de unión de ligando de RAGE. La proteína o polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (v.gr., SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender ya sea los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ED NO: 1 ). En modalidades alternativas, el polipéptido de RAGE puede comprender a secuencia 70%, ó 80%, ó 90% idéntica a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con la glicina como el primer residuo en vez de una metionina (véase, v.gr., Neeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1 B) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (v.gr., SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGEs humanos, o un fragmento de los mismos, con la glicina como el primer residuo en vez de una metionína (véase, v.gr., Neeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1 C) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; ID de figura). O bien, se puede usar una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo. O bien, la proteína de RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, ID de figura). En una modalidad, el sitio de unión de ligando puede comprender SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En otra modalidad más, el fragmento de RAGE es un péptido sintético. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 25 para codificar los aminoácidos 1-118 de RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, una secuencia que comprende los nucleótidos 1-348 de SEQ ID NO: 25 se puede usar para codificar los aminoácidos 1-116 de RAGE humano. O bien, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 26 para codificar los aminoácidos 1-123 de RAGE humano. O bien, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 27 para codificar los aminoácidos 1-136 de RAGE humano. O bien, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 28 para codificar los aminoácidos 1-230 de RAGE humano. O bien, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 29 para codificar los aminoácidos 1-251 de RAGE humano. O bien, fragmentos de estas secuencias de ácido nucleico se pueden usar para codificar fragmentos de polipéptido de RAGE. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no son derivados de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivados de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquiera de los ¡sotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotípos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como modalidades de ejemplo, el polipéptído que comprende los dominios C 2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma pueden comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede ser codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por lo tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un enlazador de interdominio derivado de RAGE en vez de un péptido de gozne de interdominio derivado de una ¡nmunoglobulina. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede ser codificada por una construcción de ADN recombinante. También, el método puede comprender el paso de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión. También, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en una célula hospedero. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención comprende un método para hacer una proteína de fusión de RAGE que comprende el paso de unir covalentemente un polipéptido de RAGE a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulína. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión de ligando de RAGE. El sitio de unión de ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. En una modalidad, el dominio CH2, o un fragmento del mismo, comprende SEQ ID NO: 42. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana. Como una modalidad de ejemplo, el polípéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede ser codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender un polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de ambos, o cualquiera, de estos dominios. Como una modalidad de ejemplo, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana, o una porción del mismo, puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido de RAGE que comprende un enlazador de interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína de RAGE y dos dominios de ¡nmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de interdominio enlazado a un segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de interdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de ¡nterdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de ¡nterdominio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O fragmento del mismo. Por ejemplo, el polípéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 , el enlazador de interdomínio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazador de interdominio hacia el extremo 3' de C1. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios. Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdominío hacia el extremo 3'. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de tres dominios de RAGE. Un fragmento de enlazador de interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' de, y por lo tanto, enlazado a, un dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazador de interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente hacia el extremo 3' del dominio V. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 21 , correspondiente a los aminoácidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador de interdominio que comprende varios aminoácidos (v.gr., 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 21. Por lo tanto, en una modalidad, el enlazador de interdominio comprende SEQ ID NO: 23 comprende los aminoácidos 1 17-136 de RAGE de longitud completa. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ ID NO: 21 deletando, por ejemplo, 1 , 2 ó 3, aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. En modalidades alternativas, el enlazador puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, o 80% idéntica, o 90% idéntica a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazador puede comprender secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' del dominio C1. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondientes a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se pueden usar un enlazador que comprende varios (1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) aminoácidos hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 22. O bien, fragmentos de SEQ ED NO: 22 se pueden usar, deletando por ejemplo, 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazador de interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondientes a los aminoácidos 222-226. O bien, un enlazador de ¡nterdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los aminoácidos de RAGE 318-342. El método puede comprender además el paso de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención comprende un vector de expresión que codifica para una proteína de fusión que comprende un polipéptído de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulína. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende construcciones, tales como aquellas descritas aquí, que tienen un enlazador de interdomínio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdomínio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo. Por ejemplo, el vector de expresión usado para transfectar las células puede comprender la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 30, o un fragmento del mismo, o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento del mismo. El método puede comprender además el paso de transfectar una célula con el vector de expresión de la presente invención. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención comprende una célula transfectada con el vector de expresión que expresó la proteína de fusión de RAGE de la presente invención, de tal manera que la célula expresa una proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una ¡nmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende construcciones, tales como aquellas descritas aquí, que tienen un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-termínal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo. Por ejemplo, el vector de expresión puede comprender la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:30, o un fragmento de la misma, o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de la misma. Por ejemplo, se pueden construir plásmidos para expresar proteínas de fusión RAGE-lgG Fc al fusionar diferentes longitudes de una secuencia de ADNc 5' de RAGE humano con una secuencia de ADNc 3' de IgG humanal Fc (?1). Las secuencias de cassette de expresión se pueden insertar en un vector de expresión tal como el vector de expresión pcADN3.1 (Invitrogen, CA) usando técnicas recombinantes estándares. También, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en una célula hospedero. En una modalidad, el recombinante puede ser transfectado en células de ovario de hámster chino y la expresión optimizada. En modalidades alternativas, las células pueden producir 0.1 a 20 gramos/litro, o 0.5 a 10 gramos/litro, o aproximadamente 1-2 gramos/litro. Como se conoce en la técnica, dicha construcción de ácidos nucleicos puede ser modificada por mutación, como por ejemplo, mediante amplificación por PCR de una plantilla de ácido nucleico con iniciadores que comprende la mutación de interés. De esta manera, se pueden diseñar polipéptidos que comprendan afinidad variable para ligandos de RAGE. En una modalidad, las secuencias mutadas pueden ser 90% o más idénticas al ADN de partida. Como tales, las variantes pueden incluir secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones astringentes (es decir, equivalentes a aproximadamente 20-27°C por debajo de la temperatura de fusión (Tf) del duplicado de ADN en 1 molar de sal). La secuencia de codificación puede ser expresada transfectando el vector de expresión en un hospedero apropiado. Por ejemplo, los vectores recombinantes pueden ser establemente transfectados en células de ovario de hámster chino (CHO), y células que expresan la proteína de fusión seleccionadas y clonadas. En una modalidad, las células que expresan la construcción recombinante se seleccionan para resistencia a neomicina codificada por plásmido al aplicar antibiótico G418. Los clones individuales se pueden seleccionar y los clones que expresan niveles altos de proteína recombinante como se detecta por el análisis de Western Blot del sobrenadante de células se puede expandir, y el producto de gen se puede purificar por cromatografía de afinidad usando columnas de proteína A. Modalidades de muestra de ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas de fusión de la presente invención se muestran en las figuras 2-5. Por ejemplo, como se describió antes, la proteína de fusión producida por la construcción de ADN recombinante puede comprender un polipéptido de RAGE enlazado a un segundo polipéptido no RAGE. La proteína de fusión puede comprender dos dominios derivados de proteína de RAGE y dos dominios derivados de una inmunoglobulina. Una construcción de ejemplo de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, TTP-4000 (TT4), que tiene este tipo de estructura se muestra como figura 2 (SEQ ID NO: 30). Como se muestra en la figura 2, secuencia de codificación 1 -753 (resaltada en negritas) codifica la secuencia de proteína N-termínal de RAGE mientras que la secuencia de 754-1386 codifica la secuencia de proteína Fc de IgG. Cuando se deriva de SEQ ID NO: 30, o una secuencia 90% idéntica a la misma, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de cuatro dominios de SEQ ID NO: 32, o el polipéptido con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34) (figura 4). En la figura 4, la secuencia de aminoácidos de RAGE es resaltada en negritas. La secuencia de inmunoglobulina es los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG. Como se muestra en la figura 6B, los primeros 251 aminoácidos de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 de longitud completa contiene como la secuencia de polipéptído de RAGE una secuencia de señal que comprende los aminoácidos 1-22/23, el dominio de inmunoglobulina V (incluyendo el sitio de unión de ligando) que comprende los aminoácidos 23/24-116, un enlazador de interdominio que comprende los aminoácidos 117 a 123, un segundo dominio de ¡nmunoglobulina (C1 ) que comprende los aminoácidos 124-221 , y un enlazador de interdominio hacia el extremo 3' que comprende los aminoácidos 222-251. En una modalidad, la proteína de fusión puede no necesariamente comprender el segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un dominio de ¡nmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Una construcción de ejemplo de ácido nucleico que codifica este tipo de proteína de fusión se muestra como figura 3 (SEQ ID NO: 31 ). Como se muestra en la figura 3, la secuencia de codificación de los nucleótidos 1 a 408 (resaltada en negritas) codifica la secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de 409-1041 codifica la secuencia de proteína Fc (?l) de lgG1. Cuando se deriva de SEQ ID NO: 31 , o una secuencia 90% idéntica a la misma, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de tres dominios de SEQ ID NO: 35, o el polipéptido con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37) (figura 5). En la figura 5, la secuencia de aminoácidos de RAGE es resaltada en negritas. Como se muestra en la figura 6B, los primeros 136 aminoácidos de la proteína de fusión de RAGE TTP-3000 de longitud completa contiene como el polipéptido de RAGE una secuencia de señal que comprende los aminoácidos 1-22/23, el dominio de inmunoglobulina V (incluyendo el sitio de unión de ligando) que comprende los aminoácidos 23/24-116, y un enlazador de interdomínio que comprende los aminoácidos 117 a 136. La secuencia de 137 a 346 incluye los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender estabilidad mejorada in vivo sobre el polipéptido de RAGEs que no comprende un segundo polipéptido. La proteína de fusión además puede ser modificada para incrementar la estabilidad, eficacia, potencia y biodísponibilidad. Por lo tanto, las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser modificadas mediante procesamiento post-traduccional o por modificación química. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede preparar sintéticamente para incluir aminoácidos L-, D- o no naturales, aminoácidos alfa-disustituidos, o N-alquilaminoácidos. Además, las proteínas pueden ser modificadas por acetilación, acilacíón, ADP-ribosílación, amidación, unión de lípídos tales como fosfatidilínositol, formación de enlaces de disulfuro, y similares. Además, el polietílenglicol se puede añadir para incrementar la estabilidad biológica de la proteína de fusión.

Unión de antagonistas de RAGE a proteínas de fusión de RAGE La proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender un número de aplicaciones. Por ejemplo, la proteína de fusión de la presente invención se pueden usar en una prueba de unión para identificar ligandos de RAGE, tales como agonistas, antagonistas o moduladores de RAGE.

Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención provee un método para detección de moduladores de RAGE que comprende: (a) proveer una proteína de fusión que comprende un polipéptído de RAGE enlazado a un segundo polipéptido no RAGE, en donde el polipéptído de RAGE comprende un sitio de unión de ligando; (b) mezclar un compuesto de interés y un ligando que tiene una afinidad de unión conocida para RAGE con la proteína de fusión; y (c) medir la unión del ligando de RAGE conocido a la proteína de fusión de RAGE en presencia del compuesto de interés. En una modalidad, el sitio de unión de ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. Las proteínas de fusión de RAGE también pueden proveer equipos para la detección de moduladores de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad, un equipo de la presente invención puede comprender (a) un compuesto que tiene afinidad de unión conocida a RAGE como un control positivo; (b) una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptído de RAGE enlazado a un segundo polípéptido no RAGE, en donde el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión de ligando de RAGE; y (c) instrucciones para usarse. En una modalidad, el sitio de unión de ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. La proteína o polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (v.gr., SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender ya sea los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternativas, el polípéptido de RAGE puede comprender una secuencia 70%, 80% o 90% idéntica a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo en vez de una metionina (véase, v.gr., Neeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1 B) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. La proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprende RAGEs (v.gr., SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntica a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGEs humanos, o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo en vez de una metíonina (véase, v.gr., Neeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1 C) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; ID de figura). O bien, una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo se puede usar. O bien, la proteína de RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, ID de figura). En una modalidad, el sitio de unión de ligando puede comprender SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En otra modalidad más, el fragmento de RAGE es un péptido sintético. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no son derivados de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como una modalidad de ejemplos, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción del mismo puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El péptido de ¡nmunoglobulina puede ser codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por lo tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender una secuencia de Fc derivada de RAGE en vez de una cadena de inmunoglobulina. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de ¡nmunoglobulina CH2 O un fragmento del mismo. En una modalidad, el polipéptído de RAGE puede comprender un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulína de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de ¡nterdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender un polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de ambos, o cualquiera, de estos dominios. Como una modalidad de ejemplo, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana, o una porción del mismo, puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polípéptido de RAGE que comprende un enlazador de interdominio enlazado a un dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína de RAGE y dos dominios de inmunoglobulína derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de interdominio enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulína de RAGE y un segundo enlazador de interdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de ¡nterdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdominio, el aminoácido N-termínal del segundo enlazador de interdomínio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de ¡nterdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 , el enlazador de ¡nterdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazador de interdominio hacia el extremo 3' de C1. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios. Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdomínio de RAGE al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdominio hacia el extremo 3'. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de tres dominios de RAGE. Como se describe aquí, el fragmento enlazador de ¡nterdominio de RAGE puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' de, y por lo tanto, enlazado a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazador de interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente hacia el extremo 3' del dominio V. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 21 , correspondiente a los aminoácidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador de interdominio que comprende varios aminoácidos (v.gr., 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 21. Por lo tanto, en una modalidad, el enlazador de ¡nterdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ ID NO: 21 deletando, por ejemplo, 1 , 2 ó 3, aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. En modalidades alternativas, el enlazador puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, ó 80% idéntica, ó 90% idéntica a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazador puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' del dominio C1. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador que comprende varios aminoácidos (1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 22. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ ID NO: 22, deletando por ejemplo, 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazador de ¡nterdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los aminoácidos 222-226. O bien, un enlazador de interdominío puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los aminoácidos de RAGE 318-342. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE se pueden usar en una prueba de unión para identificar ligandos de RAGE potenciales. En una modalidad de ejemplo de dicha prueba de unión, un ligando de RAGE conocido puede aplicarse com revestimiento sobre un sustrato sólido (v.gr., placas de Maxisorb) a una concentración de aproximadamente 5 microgramos por pozo, en donde cada pozo contiene un volumen total de aproximadamente 100 microlitros (µl). Las placas se pueden incubara 4°C durante la noche para dejar que se absorba el ligando. Alternativamente, se pueden usar períodos de incubación más cortos a temperatura más alta (v.gr., temperatura ambiente). Después de un período para dejar que el ligando se una al sustrato, los pozos de prueba pueden ser aspirados y un regulador de pH de bloqueo (v.gr., 1 % BSA en 50 mM de regulador de pH de imidizol, pH 7.2) se puede añadir para bloquear la unión no específica. Por ejemplo, el regulador de pH de bloqueo se puede añadir a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas pueden entonces ser aspiradas y/o lavadas con un regulador de pH de lavado. En una modalidad, un regulador de pH que comprende 20 mM de imidazol, 150 mM de NaCI, 0.05% de Tween-20, 5 mM de CaCI2 y 5 mM de MgCI2, pH 7.2 se pueden usar como un regulador de pH de lavado. La proteína de fusión entonces se puede añadir a diluciones cada vez mayores a los pozos de prueba. La proteína de fusión de RAGE puede entonces dejarse incubar con el ligando inmovilizado en un pozo de prueba de tal manera que la unión puede alcanzar el equilibrio. En una modalidad, la proteína de fusión de RAGE se deja incubar con el ligando inmovilizado durante aproximadamente una hora a 37°C. En modalidades alternativas, se pueden usar periodos de incubación más largos a temperaturas más bajas.

Después de que la proteína de fusión y el ligando inmovilizado han sido incubados, la placa se puede lavar para remover cualquier proteína de fusión no unida. La proteína de fusión unida al ligando inmovilizado puede ser detectada en una variedad de formas. En una modalidad, la detección utiliza una ELISA. Por lo tanto, en una modalidad, un complejo de ¡nmunodetección que contiene una anti-lgG1 humana de ratón monoclonal, IgG antí-ratón de cabra biotinilada, y una fosfatasa alcalina ligada a avidina se puede añadir a la proteína de fusión inmovilizada en el pozo de prueba. Se puede dejar que el complejo de inmunodetección se una a la proteína de fusión inmovilizada de tal manera que la unión entre la proteína de fusión y el complejo de inmunodetección alcanza el equilibrio. Por ejemplo, se puede dejar que el complejo se una a la proteína de fusión durante una hora a temperatura ambiente. En ese punto, cualquier complejo no unido puede ser removido lavando el pozo de prueba con regulador de pH de lavado. El complejo unido puede ser detectado añadiendo el sustrato de fosfatasa alcalina, para-nitrofenilfosfato (PNPP), y midiendo la conversión de PNPP a para-nítrofenol (PNP) como un incremento en absorbancia a 405 ran. En una modalidad, el ligando de RAGE se une a la proteína de fusión de RAGE con afinidad nanomolar (nM) o micromolar (µM). Un experimento que ilustra la unión de ligandos de RAGE a proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se muestra en la figura 7. Se prepararon soluciones de TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4) que tenían concentraciones iniciales de 1.082 mg/ml, y 370 µg/ml, respectivamente. Como se muestra en la figura 7, a varias diluciones, las proteínas de fusión TTP-3000 y TTP-4000 son capaces de unirse a ligandos inmovilizados de amiloide-beta de RAGE (Abeta) (Amyloid Beta (1-40) de Biosource), S100b (S100), y anfoterina (Ampho), dando por resultado un incremento en absorbancia. En ausencia de ligando (es decir, revistiendo sólo con BSA) no hay incremento en absorbancia. La prueba de unión de la presente invención se pueden usar para cuantificar unión de ligando a RAGE. En modalidades alternativas, los ligandos de RAGE se pueden unir a la proteína de fusión de la presente invención con afinidades de unión que varían de 0.1 a 1000 nanomolar (nM), o de 1 a 500 nM, o de 10 a 80 nM. La proteína de fusión de la presente invención también se puewde usar para identificar compuestos que tienen la capacidad para unirse a RAGE. Como se muestra en las figuras 8 y 9, respectivamente, un ligando de RAGE se puede probar por su capacidad para competir con amiloide beta inmovilizado para unirse a proteínas de fusión TTP-4000 (TT4) o TTP-3000 (TT3). Por lo tanto, se puede ver que un ligando de RAGE a una concentración de prueba final (FAC) de 10 µM puede desplazar la unión de proteína de fusión de RAGE a amiloide-beta a concentraciones de 1 :3, 1 :10, 1 :30 y 1 :100 de la solución de TTP-4000 inicial (figura 8) o TTP-3000 (figura 9).

Modulación de efectores celulares Modalidades de las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para modular una respuesta biológica mediada por RAGE. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden ser diseñadas para modular incrementos en expresión de gen inducidos por RAGE. Por lo tanto, en una modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para modular la función de enzimas biológicas. Por ejemplo, la interacción entre RAGE y sus ligandos puede generar estrés oxidatívo y activación de NFKB; y genes regulados por NF-?B, tales como las citocinas IL-1 ß, FNT-a, y similares. Además, algunas otras vías reguladoras, tales como aquellas que involucran p21 ras, MAP cinasas, ERKI, y ERK2, han mostrado ser activadas por la unión de AGEs y otros lígandos a RAGE. El uso de la proteínas de fusión de la presente invención para modular la expression del efector celular FNT-a se muestra en la figura 10. Células mieloides THP-I pueden ser cultivadas en un medio RPMI-1640 complementado con 10% de FBS e inducidas para secretar FNT-a medíante estimulación de RAGE con S100b. Cuando ocurre dicha estimulación en presencia de una proteína de fusión de RAGE, la inducción de FNT-a por unión de S100b a RAGE puede ser inhibida. Por lo tanto, como se muestra en la figura 10, la adición de 10 µg de proteína de fusión TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) de RAGE reduces inducción por S100b de FNT-a en aproximadamente 50% a 75%. La proteína de fusión TTP-4000 puede ser por lo menos tan efectiva en bloquear la inducción por S100b de FNT-a como es RAGEs (figura 10). La especificidad de la inhibición para las secuencias de RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se muestra por el experimento en el cual IgG solo se añadió a células estimuladas por S100b. La adición de IgG y S100b a la prueba muestra los niveles de FNT-a como S100b solo.

Características fisiológicas de proteínas de fusión de RAGE Aunque RAGEs puede tener un beneficio terapéutico en la modulación de enfermedades mediadas por RAGE, RAGEs humano puede tener limitaciones como un terapéutico individual basado en la vida media relativamente corta de RAGEs en el plasma. Por ejemplo, mientras que RAGEs de roedores tiene una vida media en ratas normales y diabéticas de aproximadamente 20 horas, RAGEs humano tiene una vida media menor que 2 horas cuando se evalúa por retención de RAGEs de inmunoreactívidad (Renard et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)). Para generar un agente terapéutico de RAGE que tenga características de unión similares a RAGEs, pero un perfil farmacocinético más estable, se puede usar una proteína de fusión de RAGE que comprende un sitio de unión de ligando de RAGE enlazado a uno o más dominios de inmunoglobulina humana. Como se conoce en la técnica, los dominios de ¡nmunoglobulina pueden incluir la porción Fc de la cadena pesada de ¡nmunoglobulina. La porción Fc de inmunoglobulina puede conferir varios atributos a una proteína de fusión. Por ejemplo, la proteína de fusión Fc puede incrementar la vida media en el suero de dichas proteínas de fusión, a menudo de horas a varios días. El incremento en estabilidad farmacocinética es generalmente un resultado de la interacción del enlazador entre las regiones CH2 y CH3 del fragmento Fc con el receptor FcRn (Wines et al, J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)). Aunque las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido Fc de inmunoglobulina pueden proveer la ventaja de estabilidad incrementada, las proteínas de fusión de inmunoglobulina pueden inducir una respuesta inflamatoria cuando son introducidas a un hospedero. La respuesta inflamatoria se puede deber, en gran parte, a la porción Fc de la inmunoglobulína de la proteína de fusión. La respuesta proinflamatoria puede ser una característica deseable si el objetivo se expresa en un tipo de célula deseado que necesita ser eliminado (v.gr., una célula cancerosa, un linfocito o población de linfocitos que causan una enfermedad autoinmune). La respuesta proinflamatoria puede ser una característica neutra si el objetivo es una proteína soluble, cuando mucho las proteínas solubles no activan inmunoglobulinas. Sin embargo, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si el objetivo se expresa en tipos de célula cuya destrucción conduciría a efectos colaterales no dirigidos. También, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si se establece una cascada inflamatoria en el sitio de una proteína de fusión que se une a un objetivo de tejido, ya que muchos mediadores de inflamación pueden ser perjudiciales para el tejido circundante, y/o pueden causar efectos sistémicos. El sitio proinflamatorío primario en fragmentos Fc de inmunoglobulína radica en la región de gozne entre el CH1 y C 2. Esta región de gozne interactúa con FcR1-3 sobre varios leucocitos y activa a estas células para atacar el objetivo. (Wines et al, J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)). Como agentes terapéuticos para enfermedades mediadas por RAGE, las proteínas de fusión de RAGE pueden no requerir la generación de una respuesta inflamatoria. Por lo tanto, las modalidades de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden comprender una proteína de fusión que comprenda un polipéptido de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina(s) en donde la región de gozne de Fc de la inmunoglobulina ¡es removida y reemplazada con un polipéptido de RAGE. De esta manera, la interacción entre la proteína de fusión de receptores RAGE y Fc sobre células inflamatorias se puede reducir al mínimo. Sin embargo, puede ser importante mantener aplacamiento apropiado y otras interacciones estructurales tridimensionales entre los diversos dominios de la proteína de fusión de inmunoglobulina. Por lo tanto, la modalidades de la proteínas de fusión de la presente invención pueden sustituir al enlazador de interdominio de RAGE biológicamente inerte, pero estructuralmente similar que separa los dominios V y C1 de RAGE, o el enlazador que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en lugar de la región de gozne normal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Por lo tanto, el polipéptído de RAGE de la proteína de fusión puede comprender un enlazador de secuencia de interdominio que se encuentra naturalmente hacia el extremo 3' de un dominio de inmunoglobulina de RAGE para formar un fragmento de dominio de inmunoglobulína de RAGE/enlazador. De esta manera, las interacciones tridimensionales entre los dominios de inmunoglobulina contribuidos ya sea por RAGE o la inmunoglobulina se pueden mantener. En una modalidad, una proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un incremento sustancial en la estabilidad farmacocinética en comparación con RAGEs. Por ejemplo, la figura 11 muestra que una vez que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 ha saturado sus ligandos, puede retener una vida media mayor que 300 horas. Esto puede contrastar con la vida media para RAGEs de sólo unas cuantas horas en plasma humano. Por lo tanto, en una modalidad, la proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se pueden usar para antagonizar la unión de ligandos fisiológicos a RAGE como un medio para tratar enfermedades mediadas por RAGE sin generar una cantidad inaceptable de inflamación. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden presentar una disminución sustancial en la generación de una respuesta proinflamatoria en comparación con IgG. Por ejemplo, como se muestra en la figura 12, la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 no estimula la liberación de FNT-a de células bajo condiciones en donde la estimulación de liberación de FNT-a por IgG humana es detectada.

Tratamiento de enfermedad con proteínas de fusión de RAGE La presente invención también puede comprender métodos para el tratamiento de trastorno mediado por RAGE en un sujeto humano. En una modalidad, el método puede comprender administrar a un sujeto una proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE que comprende un sitio de unión de ligando de RAGE enlazado a un segundo polipéptido no RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión de ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión de ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión de ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede ser enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (v.gr., un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende por lo menos una porción de por lo menos uno de los dominios CH2 o CH3 de una IgG humana. La proteína o polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (v.gr., SEQ ID NO: 1), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptído de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender ya sea los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternativas, el polipéptido de RAGE puede comprender una secuencia que es 70%, 80% ó 90% idéntica a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo en vez de una metionina (véase, v.gr., Neeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1 B) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. La proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (v.gr., SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntica a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGEs humano, o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo en vez de una metionina (véase, v.gr., Neeper et al, (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; ID de figura). O bien, se pueden usar una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo. O bien, la proteína de RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, ID de figura). En una modalidad, el sitio de unión de ligando puede comprender SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En otra modalidad más, el fragmento de RAGE es un péptido sintético. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptídos que no son derivados de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquiera de los isotípos e cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 dominios de una lgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como una modalidad de ejemplos, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulína puede ser codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41. Por ejemplo, el polípéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polípéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdomínio hacia el extremo 3'. O bien, el polipéptído de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el enlazador de interdominio que enlaza estos dos dominios. O bien, el polipéptído de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente a RAGEs (es decir, codificando los dominios V, Cl y C2 y enlazador de interdominios). O bien, se pueden usar fragmentos de cada una de estas secuencias. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por lo tanto, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un enlazador de interdominio derivado de RAGE más que un péptído de gozne de interdominio derivado de una ¡nmunoglobulina. Por lo tanto, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender además un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio C 2 de una ¡nmunoglobulina, o un fragmento del mismo. En una modalidad, el dominio C 2, o un fragmento del mismo comprende SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulína de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominío, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-termínal de un polipéptido que comprende un dominio CR2 de una inmunoglobulína, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana . Como una modalidad de ejemplo, el polípéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polípéptido de RAGE que comprende un enlazador de ¡nterdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulína derivados de proteína de RAGE y dos dominios de inmunoglobulína derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de ¡nterdominio enlazado a un segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de ¡nterdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de ¡nterdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdomínio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 , el enlazador de interdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazador de interdominio hacia el extremo 3' de C1. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios. Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulína de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulína CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdominio hacia el extremo 3', En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de tres dominios de RAGE. Un fragmento de enlazador de interdomínio de RAGE puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' de, y por lo tanto, puede ser enlazado a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazador de interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente hacia el extremo 3' del dominio V. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 21 , correspondiente a los aminoácidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador de ¡nterdomínio que comprende varios aminoácidos (v.gr., 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 21. Por lo tanto, en una modalidad, el enlazador de interdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ ID NO: 21 deletando, por ejemplo, 1 , 2 ó 3, aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. En modalidades alternativas, el enlazador puede comprender a secuencia que es 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazador puede comprender secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' del dominio C1. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador que comprende varios aminoácido (1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 22. O bien, se pueden usar fragmentos de SEQ ID NO: 22, deletando por ejemplo, 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazador de interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los aminoácidos 222-226. O bien, un enlazador de interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los aminoácidos de RAGE 318-342. En una modalidad, una proteína de fusión de la presente invención se puede administrar por varias vías. La administración de la prot?ína de fusión de RAGE de la presente invención puede utilizar inyección intraperitoneal (IP). Alternativamente, la proteína de fusión de RAGE se puede administrar oralmente, intranasalmente, o como un aerosol. En otra modalidad, la administración es intravenosa (TV). La proteína de fusión de RAGE también se puede inyectar subcutáneamente. En otra modalidad, la administración de la proteína de fusión es intra-arterial. En otra modalidad, la administración es sublingual. También, la administración puede utilizar una cápsula de liberación con el tiempo. En otra modalidad más, la administración puede ser transrectal, como por un supositorio o similar. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar trastornos crónicos cuando es deseable la auto-administración. Una variedad de modelos animales se han usado para validar el uso de compuestos que modulan RAGE con agentes terapéuticos. Ejemplos de estos modelos son los siguientes: a) RAGEs inhibió la formación de neoíntíma en un modelo de rata de restenosis después de lesión arterial tanto en ratas diabéticas como normales al inhibir la activación endotelial, de músculo liso y macrófagos mediante RAGE (Zhou et al, Circulation 107:2238-2243 (2003)); b) Inhibición de interacciones de RAGE/ligando, usando ya sea RAGEs o un anticuerpo anti-RAGE, formación de placa de amiloide reducida en un modelo de ratón de amiloidosís sistémíca (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Acompañando la reducción en placas amiloides fue una reducción en las citocínas inflamatorias, interleucina-6 (IL-6) y factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF) así como activación reducida de NF-kB en los animales tratados; c) ratones transgénicos de RAGE (sobreexpresadores de RAGE y expresadores negativos dominantes de RAGE) presentan formación de placa y déficits cognitivos en un modelo de ratón de AD (Arancio et al, EMBO J., 23:4096-4105 (2004)); d) El tratamiento de ratas diabéticas con RAGEs redujo la permeabilidad vascular (Bonnardel-Phu et al, Diabetes, 48:2052-2058 (1999)); e) El tratamiento con RAGEs redujo lesiones ateroscleróticas en ratones E-nulos con apolipoproteína diabética y evitó los índices funcionales y morfológicos de neuropatía diabética en ratones db/db (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); y f) RAGEs atenuó la severidad de inflamación en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Hofmann et al, Genes Immunol, 3: 123-135 (2002)), un modelo de ratón de encefalomielitis alérgica experimental (Yan et al, Nat. Med. 9:28-293 (2003)) y un modelo de ratón de enfermedad intestinal inflamatoria (Hofmann et al, Cell, 97:889-901 (1999)). Por lo tanto, en una modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar un síntoma de diabetes y/o complicaciones que resultan de diabetes mediada por RAGE. En modalidades alternativas, el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías pueden comprender nefropatía diabética, retinopatía diabética, una úlcera diabética de los pies, una complicación cardiovascular de diabetes, o neuropatía diabética. Originalmente identificado como un receptor para moléculas cuya expresión está asociada con la patología de diabetes, RAGE mismo es esencial para la patofisíología de complicaciones diabéticas. In vivo, la inhibición de interacción de RAGE con su(s) ligando(s) ha mostrado se terapéutica en múltiples modelos de complicaciones diabéticas e inflamación (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)). Por ejemplo, un tratamiento de dos meses con anticuerpos anti-RAGE normalizó la función renal y redujo la histopatología renal anormal en ratones diabéticos (Flyvbjerg et al, Diabetes 53:166-172 (2004)). Además, el tratamiento con una forma soluble de RAGE (RAGEs) que se une a ligandos de RAGE e inhibe las interacciones de RAGE/ligando, redujo las lesiones ateroscleróticas en ratones E-nulos con apolipoproteína diabética y atenuó la patología funcional y morfológica de nefropatía diabética en ratones db/db (Bucciarelli et al, Circulation 106:2827-2835 (2002)). También, se ha mostrado que la glicoxidación no enzimátíca de macromoléculas finalmente da por resultado la formación de productos finales de glicación avanzados (AGEs) se incrementa en sitios de inflamación, en insuficiencia renal, en presencia de hiperglicemia y otras condiciones asociadas con estrés oxidante sistémíco o local (Dyer et al, J. Clin. Invest, 91 :2463-2469 (1993); Reddy et al, Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al, J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991 ); Degenhardt et al, Cell Mol. Biol, 44:1139-1145 (1998)). La acumulación de AGEs en la vasculatura puede ocurrir focalmente, como en el amiloide de articulación compuesto de AGE-ß2-mícroglobulina encontrada en pacientes con amiloidosis relacionada con diálisis (Miyata et al, J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al, J. Clin. Invest, 98:1088-1094 (1996)), o generalmente, como se ejemplifica por la vasculatura y tejidos de pacientes con diabetes (Schmidt et al, Nature Med., 1 :1002-1004 (1995)). La acumulación progresiva de AGEs con el tiempo en pacientes con diabetes sugiere que mecanismos de aclaramiento endógenos no pueden funcionar de manera efectiva en sitios de deposición de AGE. Dichos AGEs acumulados tienen la capacidad de alterar las propiedades celulares por un número de mecanismos. Aunque RAGE se expresa a niveles bajos en tejidos y vasculatura normales, en un ambiente en donde los ligandos del receptor se acumulan, se ha mostrado que RAGE es regulado ascendentemente (Li et al, J. Biol Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al, J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al, J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). La expresión de RAGE se incrementa en el endotelio, células de músculo liso y fagocitos mononucleares infiltrantes en vasculatura diabética. También, estudios en cultivo de células han demostrado que la interacción de AGE-RAGE causa cambios en las propiedades celulares importantes en homeostasis vascular. El uso de la proteína de fusión de RAGEs en el tratamiento de patología relacionada con diabetes se ilustra en la figura 13. La proteína de fusión de RAGE TTP-4000 se evaluó en un modelo de rata diabética de restenosis que involucró la medición de proliferación de músculo liso y expansión de la íntima después de lesión vascular. Como se ilustra en la figura 13, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir significativamente la relación de íntima/media (LM) (figura 13 A; cuadro 1) en restenosis asociada con diabetes de una manera que responde a la dosis. También, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir significativamente la proliferación de células de músculo liso asociadas con restenosis de una manera que responde a la dosis.

CUADRO 1 Efecto de TTP-4000 en modelo de rata de restenosis *P<0.05 ** Para dosis alta y baja, una dosis de carga de 3 mg/animal. En otras modalidades, las proteínas de fusión de la presente invención también se pueden usar para tratar o revertir amiloidosos y enfermedad de Alzheimer. RAGE es un receptor para amiloide beta (Aß) así como otras proteínas amíloidogénicas incluyendo SAA y amilina (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al, Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)). También, los ligandos de RAGE, incluyendo proteínas AGEs, S100b y Aß, se encuentran en tejido que rodean la placa senil en el hombre (Luth et al, Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al, Neurosci. Lett.., 336:167-170 (2003); Sasakí et al, Brain Res., 12:256-262 (2001 ; Yan et al, Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)). Se ha mostrado que RAGE se une a material fibrilar de láminas ß independientemente de la composición de las subunidades (péptido de amiloide-ß, amilina, amiloide A del suero, péptido derivado de prionnes) (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Además, la deposición de amiloide ha mostrado dar por resultado expresión incrementada de RAGE. Por ejemplo, en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD), la expresión de RAGE incrementa en neuronas y glia (Yan, et al, Nature 382:685-691 (1996)). Concurrente con la expresión de ligandos RAGE, RAGE es regulada ascendentemente en astrocitos y células de microglia en el hipocampo de individuos con AD pero no es regulado ascendentemente en individuos que no tienen AD (Lúe et al, Exp. Neurol, 171 :29-45 (2001 )). Estos hallazgos sugieren que las células que expresan RAGE son activadas por interacciones de RAGE/ligandoRAGE en la vecindad de la placa senil. También, in vitro, la activación de células microgliales mediada por Aß puede ser bloqueada con anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión a ligando de RAGE (Yan et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 94:5296-5301 (1997)). También se ha demostrado que RAGE puede servir como un punto focal para ensamble fibril (Deane et al, Nat. Med. 9:907-913 (2003)). También, la inhibición in vivo de interacciones de RAGE/ligando usando ya sea RAGEs o un anticuerpo anti-RAGE puede reducir la formación de placa amiloide en un modelo de ratón de amiloidosis sistémica (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Ratones transgénicos dobles que sobreexpresan RAGE humano y proteína precursora de amiloide humana (APP) con las mutaciones sueca y de London (APPh mutante) en neuronas desarrollan defectos de aprendizaje y anormalidades neuropatológicas más temprano que sus contrapartes transgénicas de APPh mutantes. Por el contrario, ratones transgénicos dobles con capacidad de señalamiento de Aß disminuida debido a que las neuronas que expresan una forma negativa dominante de RAGE en el mismo fondo de APPh mutante, muestran un inicio retrasado de anormalidades neuropatológicas y de aprendizaje comparadas con su contraparte transgénica de APP individual (Arancío et al., EMBOJ., 23:4096-4105 (2004)). Además, se ha mostrado que la inhibición de la interacción de RAGE-amiloide reduce la expresión de RAGE celular y marcadores de estrés celular (así como acción de NF-?B), y disminuye la deposición de amiloide (Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)) lo que sugiere un papel para la interacción de RAGE-amiloide tanto en perturbación de propiedades celulares en un ambiente enriquecido para amiloide (incluso en etapas tempranas) como en acumulación de amiloide. Por lo tanto, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también se pueden usar para tratar amiloidosis y para reducir placas de amiloide y disfunción cognitiva asociada con enfermedad de Alzheimer (AD). Comoo se describió antes, se ha mostrado que RAGEs reduce tanto la formación de placa de amiloide en el cerebro e incremento subsecuente en marcadores inflamatorios en un modelo animal de AD. Las figuras 14A y 14B mostraron que los ratones que tienen AD, y se tratan durante 3 meses ya sea con TTP-4000 o RAGEs de ratón tuvieron menos placas de amiloide beta (Aß) y menos disfunción cognitiva que los animales que recibieron un vehículo o un control negativo de IgG humana (lgG1 ). Igual que RAGEs, TTP-4000 también puede reducir las citocinas inflamatorias IL-1 y TNF-a (no se muestra datos) asociadas con AD. También, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar aterosclerosis y otros trastornos cardiovascular. Por lo tanto, se ha mostrado que la insuficiencia cardiaca isquémica es particularmente alta en pacientes con diabetes (Robertson, et al, Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al, J. Am. Med. Assoc, 241 :2035-2038 (1979); Kannel et al, Diab. Care, 2:120- 126 (1979)). Además, estudios han mostrado que la aterosclerosis en pacientes con diabetes es más acelerada y extensiva que en pacientes que no padecen de diabetes (véase v.gr., Waller et al, Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al, Chest, 2:251-257 (1976); y Pyorala et al, Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)). Aunque las razones para aterosclerosis acelerada en el caso de diabetes son muchas, se ha mostrado que la reducción de AGEs pueda reducir la formación de placa. Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención también se puede usar para tratar accidente vascular cerebral. Cuando TTP-4000 se comparó con RAGEs en un modelo animal relevante de enfermedad de accidente vascular cerebral, se encontró que TTP-4000 provee una reducción significativamente mayor en volumen de infarto. En este modelo, la arteria carótida media de un ratón es ligada y después sometida a reperfusión para formar un infarto. Para evaluar la eficacia de proteínas de fusión de RAGE para tratar o prevenir accidente vascular cerebral, los ratones fueron tratados con RAGEs o TTP-4000 o inmunoglobulina de control inmediatamente antes de reperfusión. Como se puede ver en el cuadro 2, TTP-4000 fue más eficaz que RAGEs en limitar el área de infarto en estos animales sugiriendo que TTP-4000, debido a su mejor vida media en el plasma, pudo matener mayor protección que RAGEs.

CUADRO 2 Reducción de infarto por accidente vascular cerebral ?Signific En otra modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar cáncer. En una modalidad, el cáncer tratado usando las proteínas de fusión de la presente invención comprende células cancerosas que expresan RAGE. Por ejemplo, cánceres que pueden ser tratados con la proteína de fusión de RAGE de la presente invención incluyen algunos cánceres de pulmón, algunos gliomas, algunos papilomas, y similares. La anfoterina es una proteína de unión a ADN cromosómico no histónica de grupo I de alta movilidad (Rauvala et al, J. Biol. Chem., 262: 16625- 16635 (1987); Parkikinen et al, J. Biol Chem. 268:19726-19738 (1993)) que se ha mostrado que interactúa con RAGE. Se ha mostrado que la anfoterina promueve crecimiento de neuritas, así como para servir como una suprficie para el ensamblaje de complejos de proteasa en el sistema fibrinolítíco (también se sabe que contribuye a la movilidad celular). Además, un efecto inhibidor de crecimiento tumoral local de bloqueo de RAGE se ha observado en un modelo de tumor primario (glioma C6), el modelo de metástasis pulmonar de Lewís (Taguchi et al, Nature 405:354-360 (2000)), y papilomas que surgen espontáneamente en ratones que expresan el transgen v-Ha-ras (Leder et al, Proc. Nati. Acad. Sci, 87:9178-9182 (1990)). En otra modalidad más, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar inflamación. Por ejemplo, en modalidades alternativas, la proteína de fusión de la presente invención se usa para tratar inflamación asociada con autoinmunidad, inflamación asociada con enfermedad intestinal inflamatoria, inflamación asociada con artritis reumatoide, inflamación asociada con psoriasis, inflamación asociada con esclerosis múltiple, inflamación asociada con hipoxia, inflamación asociada con accidente vascular cerebral, inflamación asociada con ataque cardiaco, inflamación asociada con choque hemorrágico, inflamación asociada con sepsia, inflamación asociada con trasplante de órganos o inflamación asociada con cicatrización de heridas deteriorada. Por ejemplo, después de tratamiento trombolítíco, las células inflamatorias tales como granulocitos infiltran el tejido isquémico y producen radicales de oxígeno que pueden destruir más células que fueron muertas por hipoxia. La inhibición del receptor en los neutrófilos responsables para los neutrófilos que son capaces de infiltrar el tejido con anticuerpos u otros antagonistas de proteína se ha mostrado que mitigan la respuesta. Puesto que RAGE es un ligando para este receptor de neutrófílos, una proteína de fusión que contiene un fragmento de RAGE puede actuar como un señuelo y evita que los neutrófilos pasen al sitio de reperfusión y por lo tanto evita destrucción de tejido posterior. El papel de RAGE en la prevención de inflamación puede ser indicado por estudios que muestran que RAGEs inhibió la expansión neoíntima en un modelo de rata de restenosis después de lesión arterial tanto en ratas diabéticas como normales, supuestamente al inhibir activación endotelial, de proliferación de células de músculo liso y activación de macrófagos a través de RAGE (Zhou et al, Circulation, 107:2238-2243 (2003)). Además, RAGEs inhibió modelos de inflamación incluyendo hipersensibilídad de tipo retardado, encefalitis autoinmune experimental y enfermedad intestinal inflamatoria (Hofman et al, Cell, 97:889-901 (1999)). También, en una modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar trastornos de base auto-inmune. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar insuficiencia renal. Por lo tanto, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar nefritis por lupus sistémico o nefritis por lupus inflamatorio. Por ejemplo, se ha mostrado que las S100/calgranulinas comprenden una familia de polipéptídos de unión a calcio estrechamente relacionados caracterizados por dos regiones de mano EF enlazadas por un péptido de conexión (Schafer et al, TIBS, 21 :134-140 (1996); Zímmer et al, Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995); Rammes et al, J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al, Eur. J. Clin. Invest, 25:659-664 (1995)). Aunque carecen de péptidos de señal, desde hace mucho se sabe que S100/calgranulinas ganan acceso al espacio extracelular, especialmente en sitios de respuestas inmune/inflamatoria crónicas, como en fibrosís quística y artritis reumatoide. RAGE es un receptor para muchos miembros de la familia de S100/calgranulina, que media sus efectos proínflamatorios sobre células tales como linfocitos y fagocitos mononucleares. También, estudios sobre respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado, colitis en ratones IL-10-nulos, artritis inducida por colágeno, y modelos de encefalitis autoinmune experimentales sugieren que la interacción de RAGE-ligando (supuestamente con S-100/calgranulinas) tiene un papel principal en la cascada inflamatoria. Por lo tanto, en varias modalidades seleccionadas, la presente invención puede proveer un método para inhibir la interacción de un AGE con RAGE en un sujeto al administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención. El sujeto tratado que usa la proteína de fusión de RAGEs de la presente invención puede ser un animal. En una modalidad, el sujeto es un humano. El sujeto puede padecer de una enfermedad relacionada con AGE tal como diabetes, complicaciones diabéticas tales como nefropatía, neuropatía, retinopatía, úlceras en los pies, amiloidosis, o insuficiencia renal, e inflamación. O bien, el sujeto puede ser un individuo con enfermedad de Alzheimer. En una modalidad alternativa, el sujeto puede ser un individuo con cáncer. En otras modalidades, el sujeto puede padecer de eritematosis por lupus sistémico o nefritis por lupus inflamatorio. Otras enfermedades pueden ser mediadas por RAGE y por lo tanto, pueden ser tratadas usando las proteínas de fusión de la presente invención. Por lo tanto, en modalidades alternativas adicionales de la presente invención, las proteínas de fusión se pueden usar para tratamiento de enfermedad de Crohn, artritis, vasculitis, nefropatías, retinopatías, y neuropatías en sujetos humanos o anímales. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede comprender una cantidad que es capaz de prevenir la interacción de RAGE con un AGE u otro tipo de ligandos de RAGE ligandos en un sujeto. Por consiguiente, la cantidad variará con el sujeto que se esté tratando. La administración del compuesto puede ser por hora, día, semana, mes, año, o como un solo evento. En varías modalidades alternativas, la cantidad efectiva de la proteína de fusión puede variar de aproximadamente 1 ng/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. La cantidad efectiva real se puede establecer por pruebas de dosis/respuesta usando métodos estándares en la técnica (Johnson et al, Diabetes. 42: 1179, (1993)). Por lo tanto, como se conoce en la técnica, la cantidad efectiva puede depender de la biodisponíbilidad, bioactividad, y biodegradabilidad del compuesto.

Composiciones La presente invención puede comprender una composición que comprende una proteína de fusión de la presente invención mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína de fusión puede comprender un polipéptido de RAGE enlazado en un segundo polipéptido no RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión pueden comprender un sitio de unión de ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión de ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido de RAGE puede ser enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (v.gr., un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulína. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende por lo menos una porción de por lo menos uno de los dominios CH2 o CH3 de una IgG humana. La proteína o polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (v.gr., SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia de señal. La secuencia de señal de RAGE puede comprender ya sea los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternativas, el polipéptido de RAGE puede comprender una secuencia que es 70%, 80% o 90% idéntica a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, como glicina como el primer residuo en vez de la metionina (véase, v.gr., Neeper et al., (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ED NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1B) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (v.gr., SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender RAGEs humano, o un fragmento del mismo, como glicina como el primer residuo en vez de la metionina (véase, v.gr., Neeper et al., (1992)). O bien, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia de señal removida (v.gr., SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína de RAGE puede comprender un dominio V (v.gr., SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; figura ID). O bien, una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo se puede usar. O bien, la proteína de RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio de V (v.gr., SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, figura ID). En una modalidad, el sitio de unión de ligando puede comprender SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En otra modalidad más, el fragmento de RAGE es un péptido sintético. Por ejemplo, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11 ) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de ¡nterdominio hacia el extremo 3'. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el enlazador de interdominio que enlaza a estos dos dominios. O bien, el polipéptido de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente a RAGEs (es decir, que codifica los dominios V, Cl y C2 y enlazadores de interdominio). O bien, se pueden usar fragmentos de cada una de estas secuencias. La proteína de fusión puede incluir diversos tipos de péptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una ¡nmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) se puede derivar de cualquiera de los isotipos de cadena pesada: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e), o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede ser derivada de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotípos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como modalidades de ejemplo, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma pueden comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede ser codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por lo tanto, en una modalidad, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un enlazador de ¡nterdominio derivado de RAGE en vez de un péptido de gozne de ¡nterdominio derivado de una inmunoglobulína. Por lo tanto en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender además un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulína, o un fragmento del mismo. En una modalidad, el dominio CH2, O un fragmento del mismo, comprende SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de ¡nterdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptído que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo, puede comprender el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana . Como una modalidad de ejemplo, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptído de RAGE que comprende un enlazador de ¡nterdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulína de RAGE y un primer enlazador de interdomínío enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de interdomínio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de interdomínio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de ¡nterdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulína CH2 O fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptído de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia 90% idéntica a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 , el enlazador de interdomínío que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazador de interdominio hacia el extremo 3' de C1. En una modalidad, a construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios. Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polípéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulína de RAGE enlazado a través de un enlazador de ¡nterdominio de RAGE al aminoácido N-terminal del polipéptído que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptído de RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia 90% idéntica a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un enlazador de interdominio hacia el extremo 3'. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de tres dominios de RAGE. Un fragmento de enlazador de interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de péptido que está naturalmente hacía el extremo 3' de, y por lo tanto, enlazado a, un dominio de inmunoglobulína de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazador de interdominio puede comprender secuencias de aminoácidos que están naturalmente hacia el extremo 3' del dominio V. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 21 , correspondiente a los aminoácidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, un enlazador de interdominio que comprende varios aminoácidos (v.gr., 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 21 se puede usar. Por lo tanto, en una modalidad, el enlazador de ¡nterdominio comprende SEQ ID NO: 23 comprende los aminoácidos 1 17-136 de RAGE de longitud completa. O bien, fragmentos de SEQ ID NO: 21 deletando, por ejemplo, 1 , 2 ó 3, aminoácidos de cualquier extremo del enlazador se pueden usar. En modalidades alternativas, el enlazador puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, o 80% idéntica, o 90% idéntica a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazador puede comprender secuencia de péptido que está naturalmente hacia el extremo 3' del dominio C1. En una modalidad, el enlazador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondientes a los aminoácidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O bien, el enlazador puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, se puede usar un enlazador que comprende varios (1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos) aminoácidos hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de SEQ ID NO: 22. O bien, fragmentos de SEQ ED NO: 22 se pueden usar, deletando por ejemplo, 1-3, 1-5, ó 1-10, ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazador. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazador de interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondientes a los aminoácidos 222-226. O bien, un enlazador de interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los aminoácidos de RAGE 318-342. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptables estándares conocidos en la técnica. El vehículo puede comprender un diluyente. En una modalidad, el vehículo farmacéutico puede ser un líquido y la proteína de fusión o construcción de ácido nucleico puede estar en forma de una solución. En otra modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido en forma de un polvo, un polvo liofilizado o una tableta. O bien, el vehículo farmacéutico puede ser un gel, supositorio o crema. En modalidades alternativas, el vehículo puede comprender un liposoma, una microcápsula, una célula encapsulada de polímero o un virus. Por lo tanto, el término vehículo farmacéuticamente aceptable abarca, pero no se limita a, cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptables estándares tales como agua, alcoholes, fosfato, solución salina regulada en su PH, azúcares (v.gr., sacarosa o manitol), aceites o emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua o una emulsión de triglicérido, varios tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas revestidas y cápsulas. La administración de proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede utilizar varias vías. Por lo tanto, la administración de proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede utilizar inyección intraperitonial (JP). Alternativamente, la proteína de fusión de RAGE puede ser administrada oralmente, intranasalmente o como un aerosol. En otra modalidad, la administración es intravenosa (IV). La proteína de fusión de RAGE también puede ser inyectada subcutáneamente. En otra modalidad, la administración de la proteína de fusión es intra arterial. En otra modalidad, la administración es sublingual. También, la administración puede utilizar una cápsula de liberación en el tiempo. En otra modalidad más, la administración puede ser transrectal, como mediante un supositorio o similar. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar enfermedades crónicas cuando es deseable la autoadministración. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una solución inyectable estéril en un solvente o vehículo parenteralmente aceptable no tóxico. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden utilizar están el agua, solución de Ringer, 3-butanodiol, solución isotónica de cloruro de sodio, o reguladores de pH acuosos como por ejemplo, reguladores de pH de citrato, acetato, glicina, histídina, fosfato, tris o succinato fisiológicamente aceptables. La solución inyectable puede contener estabilizadores para proteger contra degradación química y formación de agregados. Los estabilizadores pueden incluir antioxidantes tales como hidroxi anisol butilado (BHA) e hidroxítolueno butílado (BHT) reguladores de pH (citratos, glicina o histídina) o agentes tensioactivos (polysorbate 80, poloxameros). La solución también puede contener conservadores antimícrobianos, tales como alcohol bencílico y parabeno. La solución también puede contener agentes tensioactívos para reducir la agregación, tales como Polysorbate 80, poloxómero, o los agentes tensioactívos conocidos en la técnica. La solución también puede contener otros aditivos tales como azúcar(es) o solución salina, para ajustar la presión osmótica de la composición para que sea similar a la sangre humana. La composición farmacéutica puede estar en forma de un polvo liofilizado estéril para inyección bajo reconstitución con un diluyente. El diluyente puede ser agua para inyección, agua bactereoestática para inyección o solución salina estéril. El polvo liofilizado se puede producir medíante secado por congelamiento de una solución de la proteína de fusión para producir una proteína en forma seca. Como se conoce en la técnica, la proteína liofilizada generalmente tiene estabilidad incrementada y una vida de anaquel más larga que una solución líquida de la proteína. El polvo liofilízado (tortas) puede contener un regulador de pH para ajustar el pH, como por ejemplo un regulador de pH de citrato, acetato, glicina, histidina, fosfato, tris o succinato fisiológicamente aceptables. El polvo liofilizado también puede contener lipoprotectores para mantener la estabilidad física y química. Los lipoprotectores comúnmente usados son azúcares no reductores y disacáridos tales como sacarosa, manidol o trealosa. El polvo liofilizado puede contener estabilizadores para proteger contra degradación química y formación de agregados. Los estabilizadores pueden incluir pero no se limitan a antioxidantes (BHA, BHT), reguladores de pH (citratos, glicina, histídina), o agentes tensioactivos (polysorbate 80, poloxámeros). El polvo liofilizado también puede contener conservadores antimicrobianos, tales como alcohol bencílico y parabeno. El polvo liofilizado también puede contener agentes tensioactívos para reducir la agregación, tal como pero sin limitarse a polysorbate 80 y poloxómero. El polvo liofilizado también pude contener aditivos (v.gr., azúcares o solución salina) para ajustar la presión osmótica para que sea similar a la sangre humana bajo reconstitución del polvo. El polvo liofilizado también puede contener agentes formadores de cuerpo tales como azúcares y disacáridos. Las composiciones farmacéuticas para inyección también pueden estar en forma de una suspensión oleaginosa. Esta suspensión puede ser formulada de conformidad con métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión anteriormente descritos. Además, aceites fijos estériles se utilizan convenientemente como solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede utilizar cualquier aceite fijo blando que use monoglicéridos o diglícéridos. También, las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de araquis, aceite de olivo, aceite de ajonjolí o aceite de coco o en un aceite mineral tal como una parafina líquida. Por ejemplo, ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de materiales inyectables. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Estas composiciones pueden ser conservadas mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua o suspensiones acuosas. La fase oleosa puede ser un agente vegetal, por ejemplo, aceite de olivo o aceite de araquis, o un aceite mineral, por ejemplo una parafina líquida, o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma de acacia o goma tragacanto, fosfátidos naturales, por ejemplo fríjol de soya, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexítol, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de esteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo polioxietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también contienen los compuestos activos en mezcla con excipientes. Dichos excipientes pueden incluir agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxípropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, y goma de acacia; agentes dispersantes o humectantes, tales como fosfátidos naturales tales como fosfátidos naturales tales como lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadenas largas, por ejemplo, heptadecaetil-eneoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbítol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. Polvos y granulos dispensables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua pueden proveer el compuesto activo en mezcla con un agente dispersante, agente de suspensión y uno o más conservadores. Los conservadores, agentes dispersantes y agentes de suspensión adecuados se describieron anteriormente. Las composiciones también pueden estar en forma de supositorios para administración rectal de los compuestos de la invención. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a temperatura rectal y por lo tanto se derretirán en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, manteca de cacao y polietilenglicoles. Para uso se pueden usar tópico, cremas, pomadas, jaleas, soluciones o suspensiones que contienen los compuestos de la invención. Las aplicaciones tópicas también pueden incluir lavados bucales y gárgaras. También se pueden usar conservadores, antioxidantes tales como BHA y BHT, dispersantes, agentes tensioactivos o reguladores de pH. Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar en forma de sistemas de suministro de liposoma, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unílaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas se pueden formular a partir de una variedad de fosfolípidos tales como colesterol, esterilamina o fosfatidilolinas. En ciertas modalidades, los compuestos de la presente invención pueden ser modificados para retrasar adicionalmente el aclaramiento de la circulación por enzimas metabólicas. En una modalidad, los compuestos pueden ser modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol (PEG), copolímeros de PEG y polípropilenglicol, polivinilpirrolidona o poliprolína, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Dichas modificaciones también pueden incrementar la solubilidad del compuesto en solución acuosa. Polímeros tales como PEG pueden ser covalentemente unidos a uno o más residuos activos, residuos de sulfhidrilo o residuos de carboxílo. Se han descrito numerosas formas activadas de PEG, incluyendo esteres activos de ácido carboxílico o derivados de carbonato, particularmente aquellos en los cuales los grupos residuales son N-hidroxísuccinimida, p-nitrofenol, imdazol o 1-hidroxi-2-nitrobencen-3-sulfona para reacción con grupos amino, derivados multímodo o de halogenoacetilo para reacción con grupo sulfhidrilo, y derivados de amino hidroazina o hidroazida para reacción con grupos carbohidrato. Métodos adicionales para la preparación de formulaciones de proteína que se pueden usar con las proteínas de fusión de la presente invención se describen en las patentes de EUA No. 6,267,958 y 5,567,677. En un aspecto adicional de la presente invención, los moduladores de RAGE de la invención se utilizan en tratamientos terapéuticos de adyuvantes o terapéuticos de combinación con otros agentes terapéuticos conocidos. La siguiente es una lista no exhaustiva de adyuvantes y agentes terapéuticos adicionales que se pueden utilizar en combinación con moduladores de proteínas de fusión de RAGE de la presente invención: Clasificaciones farmacológicas de agentes anticancerosos 1. Agentes alquilantes: Ciclofosfamida, nitrosoureas, carboplatin, cisplatin, procarbacina. 2. Antibióticos: Bleomicina, daunorubicina, doxorubicína. 3. Antimetabolitos: Metotrexato, citarabine, fluorouracilo. 4. Alcaloides vegetales: Vinblastine, vincristine, etopósido, paclitaxel, 5. Hormonas: Tamoxifen, acetato de octreótido, finastreride, flutamide. 6. Modificadores de respuesta biológica: Interferones, interleucinas, Clasificaciones farmacológicas de tratamiento para artritis reumatoide 1. Analgésicos: Aspirina 2. NSAlDs (fármacos anti-inflamatorios no esteroideos): Ibuprofeno, naproxeno, diclofenaco 3. DMARDs (fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad): Metotrexato, preparaciones de oro, hidroxicloroquina, sulfasalazina. 4. Modificadores de respuesta biológica, DMARDs: Etanercept, infliximab, glucocorticoides.

Clasificaciones farmacológicas para tratamiento de diabetes mellitus 1. Sulfonilurea:Tolbutam¡da, tolazamida, gliburida, glipizida 2. Biguanidas: Metformin 3. Agentes orales diversos: Acabosa, Troglitazona 4. Insulina Clasificación farmacológica de tratamiento para enfermedad de Alzheimer 1. Inhibidor de colinesterasa: Tacrine, donepezil 2. Antísicóticos: Haloperidol, tioridazina 3. Antidepresivos: Desipramina, fluoxetina, trazodona, paroxetina 4. Anticonvulsivantes: Carbamazepina, ácido valproico En una modalidad, la presente invención por lo tanto puede proveer un método de tratamiento de enfermedades mediadas de RAGE, el método comprende administrar a un sujeto que necesita el mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de función RAGE en combinación con agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste de agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetales, antibióticos, hormonas, modificadores de respuesta biológica, analgésicos, NSAlDs, DMARDs, glucocorticoides, sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de colinesterasa, antisicóticos, antidepresivos y anticonvulsivantes. En una modalidad adicional, la presente invención provee la composición farmacéutica de la invención como se describió antes, que comprende además uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste de agentes alquilantes, antimetabolítos, alcaloides vegetales, antibióticos, hormonas, modificadores de respuesta biológica, analgésicos, NSAlDs, DMARDs, glucocorticoides, sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de colinesterasa, antisicóticos, antidepresivos y anticonvulsivantes.

EJEMPLOS Aspectos y ventajas de concepto inventivo cubierto por la presente invención se ilustran además en los siguientes ejemplos.

EJEMPL0 1 Producción de proteínas de fusión de RAGE-lgG Fc Se construyeron dos plásmidos para expresar proteínas de fusión de RAGE-lgG Fc. Ambos plásmidos se construyeron ligando diferentes longitudes de una secuencia de ADNc 5' de RAGE humano con la misma secuencia de ADNc 3' de IgG Fc (Yl) humano. Estas secuencias de expresión (es decir, productos de ligación) se insertaron en vector de expresión pcADN3.1 (¡nvítrogen, CA). Las secuencias de ácido nucleico que codifican la región de codificación de proteína de fusión se muestran en las figuras 2 y 3. Para proteína de fusión TTP-4000, la secuencia de ácido nucleico de 1 a 753 (resultado en negritas) codifica la secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de ácido nucleico de 754 a 1386 codifica la secuencia de proteína IgG Fc (figura 2). Para TTP-3000, la secuencia de ácido nucleico de 1 a 408 (resaltada en negritas) codifica la secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de ácido nucleico de 409 a 1041 codifica la secuencia de proteína IgG Fc (figura 3). Para producir las proteínas de fusión de RAGE, los vectores de expresión que comprenden las secuencias de ácido nucleico ya sea de SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 fueron establemente transfectadas en células de CHO. Los transformantes positivos se seleccionaron para resistencia a neomicina conferida por el plásmído y se clonaron. Los clones de producción alta, como se detectó por análisis de Western Blot de sobrenadante, se expandieron y el producto de genes se purificó por cromatografía de afinidad usando columnas de proteína A. La expresión se optimizó de modo que las células produjeran TTP-4000 recombinante a niveles de aproximadamente 1.3 gramos por litro. Los polipéptidos expresados que codifican las dos proteínas de fusión se ilustran en las figuras 4-6. Para la estructura de cuatro dominios de TTP-4000, los primeros 251 aminoácidos (mostrados en negritas en la figura 4) contienen una secuencia de señal (1-22/23), el dominio de inmunoglobulina V (y unión de ligando) (23/24-116), un segundo enlazador de interdominío (117-123), un segundo domino de inmunoglobulína (CH1 ) (124-221 ), y un segundo enlazador (222-251 ) de la proteína de RAGE (figuras 4, 6B). Las secuencia de 252 a 461 incluye dominios de inmunoglobulina C 2 y CH3 de IgG. Para la estructura de tres dominios de TTP-3000, los primeros 136 aminoácidos (mostrados en negritas) contienen una secuencia de señal (1-22/23), dominio de inmunoglobulina V (y unión de ligando) (23/24-1 16) y la secuencia de enlazador ¡nterdominio (117-136) de la proteína de RAGE (figura 5, 6B). Además, para TT3, la secuencia de 137 a 346 incluye los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG.

EJEMPLO 2 Método para probar actividad de una proteína de fusión RAGE-lgG1 A. Unión de ligando in vitro Ligandos de RAGE conocidos fueron aplicadas como revestimientos sobre la superficie de placas de Maxisorb a una concentración de 5 microgramos por pozo. Las placas se incubaron a 4°C durante la noche. Después de la incubación de ligando, las placas se aspiraron y un regulador de pH bloqueador de 1 % de BSA en regulador de pH de imidazol 50 mM (pH 7.2) se añadió a las placas durante una hora a temperatura ambiente. Las placas después se aspiraron y/o se lavaron con un regulador de pH de lavado (20mM de Imidiazol, 150 mM de NaCI, 0.05 de Tween-20, 5 mM de CaCI2 y 5 mM MgCI2, pH 7.2). Se prepararon una solución de TTP-3000 (TT3) a una concentración final de 1.082 mg/ml y una solución de TTP-4000 (TT4) a una concentración inicial de 370 µg/ml. La proteína de fusión se añadió en diluciones cada vez mayores de la muestra inicial. La proteína de fusión de RAGE se dejó incubar con el ligando inmovilizado a 37°C durante 1 hora después de lo cual la placa se lavó y se probó para unión de proteína de fusión. La unión se detectó mediante la adición de un complejo de inmunodetección que contenía IgG antihumano de ratón monoclonal diluido 1 :1 1 ,000 a una concentración de prueba final (FAC) de 21 ng/100µl, una IgG anti-ratón de cabra biotinilada diluida 1 :500, a FAC de 500 ng/µl, y una fosfatasa alcalina ligada a avidina. El completo se incubó con la proteína de fusión inmovilizada durante una hora a temperatura ambiente después de lo cual la placa se lavó y se añadió el sustrato de fosfatasa alcalina para-nitrofenilfosfato (PNPP). La unión del complejo a la proteína de fusión inmovilizada se cuantificó midiendo la conversión de PNP a para-nitrofenol (PNP) que se midió espectro foto métrica mente a 405 nm. Como se ilustra en la figura 7, las proteínas de fusión TTP-4000 y TTP-3000 (TT3) interactúan específicamente con ligandos de RAGE conocidos amiloide-beta (Abeta), S100b (S100), y anfoterina (Ampho). En ausencia de ligando, es decir, revestimiento de BSA solo (BSA o BSA + lavado) no se incrementó en absorbancia sobre niveles atribuibles a unión no específica de complejo de inmunodetección. En donde se usa amiloide beta como el ligando marcado puede ser necesario preincubar el amiloide beta antes de la prueba. La preincubación puede permitir que el amiloíde beta se auto-agregue en forma de lámina plegada, ya que el amiloide beta preferiblemente se puede unir a RAGE en forma de una lámina plegada. Evidencia adicional para interacción específica entre proteína de fusión de RAGE TTP-4000 y TTP-3000 con ligandos de RAGE se ¡lustran en estudios que muestran que un ligando de RAGE es capaz de competir efectivamente con un ligando de RAGE conocido para unión a las proteínas de fusión. En estos estudios, el amiloide-beta (A-beta) fue inmovilizado en una placa de Maxisorb y la proteína de fusión se añadió como se describió antes. Además, un ligando de RAGE se añadió a algunos de los pozos al mismo tiempo que la proteína de fusión. Se encontró que el ligando de RAGE podría bloquear la unión de TTP-4000 (TT4) por aproximadamente 25% a 30% en donde TTP-4000 estaba presente a 123 µg/ml (dilución de 1 :3 figura 8), cuando la solución inicial de TTP-4000 se diluyó por un factor de 10 a 30 (1 :10 ó 1 :30), la unión de la proteína de fusión al ligando inmovilizando fue inhibida por completo por el ligando de RAGE. De manera similar, la unión bloqueada por el ligando de RAGE de TTP-3000 (TT3) en aproximadamente 50% en donde TTP-3000 estaba presente a 360 µg/ml (dilución de 1 :3 figura 9). Cuando la solución inicial de TTP-3000 se dividió por un factor de 10 (1 :10), la unión de la proteína de fusión al ligando inmovilizado fue inhibido por completo por el ligando de RAGE. Por lo tanto, la especificidad de unión de la proteína de fusión de RAGE al ligando de fusión de RAGE fue dependiente de la dosis.

También, como se muestra en las figuras 8 y 9, no hubo esencialmente unión detectada en ausencia de proteína de fusión, es decir, usando sólo el complejo de ¡nmunodetección ("complejo solo"). B. Efecto de proteínas de fusión de RAGE en una prueba basada en célula El trabajo anterior ha mostrado que las células THP-I mieloides pueden secretar FNT-a en respuesta a ligandos de RAGE. En esta prueba, las células THP-I se cultivaron en medios RPMI-1640 complementados con 10% de FBS usando un protocolo provisto por ATCC. Las células fueron inducidas a secretar FNT-a mediante estimulación de RAGE con 0.1 mg/ml S 100b tanto en ausencia como en presencia de las proteínas de fusión TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) (10 µg), RAGEs (10 µg), y una IgG humana (10 µg) (es decir, como un control negativo). La cantidad de FNT-a secretada por las células THP-I se midió 24 horas después de la adición de las proteínas al cultivo de células usando un equipo de ELISA comercialmente disponible para FNT-a (R&D Systems, Minneapolís, MN). Los resultados en la figura 10 demuestran que las proteínas de fusión inhiben la producción de FNT-a inducida por S100b/RAGE en estas células. Como se muestra en la figura 10, al añadir 10 µg de TTP-3000 o proteína de fusión TTP-4000 RAGE, la inducción de FNT-a por S100b (0.1 mg/ml FAC) se redujo en aproximadamente 45% a 70%, respectivamente. La proteína de fusión TTP-4000 puede ser por lo menos tan efectiva para bloquear la inducción por S100b de FNT-a como lo es RAGEs (figura 10). La especificidad de la inhibición de las secuencias de RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se muestra por el experimento en el cual IgG sola se añadió a células estimuladas por S100b. La adición de IgG y S100b a la prueba muestra los mismos niveles de FNT-a que S100b solo. La especificidad de la inhibición de inducción de FNT-a por TTP-4000 y TTP-3000 para secuencias de RAGE de la proteína de fusión se muestra por el experimento en el cual IgG sola se añadió a células estimuladas por S100b. se puede ver que la adición de IgG, es decir, IgG humana sin la secuencia de RAGE (IgG humana de Sigma añadida a 10 µg/pozo), y S100b a la prueba muestra los mismos niveles de FNT-a que S100b solo.

EJEMPLO 3 Perfil farmacocinético de TTP-4000 Para determinar si TTP-4000 tendría un perfil farmacocinético superior como se compara con RAGEs humano, a ratas y primates no humanos se les dio una inyección intravenosa (IV) de TTP-4000 (5 mg/kg) y después el plasma se evaluó para presencia de TTP-4000. En estos experimentos, dos monos machos intactos recibieron una sola dosis de bolo IV de TTP-4000 (5 mg/ml/kg) en una vena periférica seguido por un lavado a chorro con 1.0 mililitros (ml) de solución salina. Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 1.0 ml) a predosis (es decir, antes de la inyección de TTP-4000), o a 0.083, 0.25, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288, y 336 horas después de la dosis en tubos que contenían heparina de litio. Después de la extracción, los tubos se colocaron sobre hielo húmedo (máximo 30 minutos) hasta centrifugación bajo refrigeración (a 2 a 8°C) a 1500 x g durante 15 minutos. Cada muestra de plasma cosechada se almacenó después bajo congelamiento (-70°C ±10°C) hasta que se probó para polipéptido de RAGE usando una prueba de ELISA en varios puntos de tiempo después de la inyección, como se describe en el ejemplo 6. El perfil cinético mostrado en la figura 11 revela que una vez que TTP-4000 ha saturado sus ligandos como lo evidencia la pendiente muy inclinada de la fase alfa en 2 animales, retiene una vida media terminal mayor de 300 horas. Esta vida medida es significativamente mayor que la vida media de RAGEs humano en el plasma (generalmente de aproximadamente 2 horas) y provee una oportunidad para inyecciones individuales para indicaciones agudas y semicrónicas. En la figura 11 cada curva representa un animal diferente bajo las mismas condiciones experimentales.

EJEMPLO 4 Activación de Fc por TTP-4000 Se realizaron experimentos para medir la activación del receptor Fc por la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 en comparación con IgG humana. La activación de receptor de Fc se midió midiendo la secreción de FNT-a a partir de las células THP-I que expresan el receptor Fc. En estos experimentos, una placa de 96 pozos fue revestida con 10 µg/pozo TTP-4000 o IgG humana. La estimulación de Fc da por resultado la secreción de FNT-a. La cantidad de FNT-a se midió por una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA). Por lo tanto, en esta prueba, la línea de células mieloides THP-I (ATTC # TIB-202) se mantuvo en un medio de RPMI-1640 complementado con 10% de suero de bovino fetal por instrucciones de ATCC. Típicamente, 40,000-80,000 células por pozo fueron inducidas a secretar FNT-alfa a través de estimulación de receptor de Fc mediante prerevestimíento del pozo con 10 ug/pozo de ya sea TTP-4000 agregado con calor (63°C durante 30 minutos) o lgG1 humana. La cantidad de FNT-alfa secretada por las células THP-I se midió en sobrenadantes recolectados de cultivos de células de 24 horas en los pozos tratados usando un equipo de FNT ELISA comercialmente disponible (R&D Systems, Minneapolis, MN # DTAOOC) por instrucciones. Los resultados se muestran en la figura 12 en donde se puede ver que TTP-4000 genera menos que 2 ng/pozo de FNT y IgG genera más de 40 ng/pozo.

EJEMPLO 5 Actividad in vivo de TTP-4000 La actividad de TTP-4000 se comparó con RAGEs en varios modelos in vivo de enfermedad humana.

A. TTP-4000 en un modelo animal de restenosis La proteína de fusión de RAGE TTP-4000 se evaluó en un modelo de rata diabética de restenosis que implicó la medición de proliferación de músculo liso y expansión inicial 21 días después de lesión vascular. En estos experimentos, la lesión con balón de la artería carótida común izquierda se realizó en ratas Zucker diabéticas y no diabéticas usando un procedimiento estándar. Una dosis de carga (3 mg/rata) de IgG, TTP-4000 o solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) se administró intraperitonealmente (IP) un día antes de la lesión. Una dosis de mantenimiento se suministró un día sí y un día no hasta el día 7 después de la lesión (es decir, los días 1 , 3, 5 y 7 después de la lesión). La dosis de mantenimiento fue alta = 1 mg/animal para un grupo o baja = 0.3 mg/animal para el segundo g. Para medir la proliferación de células de músculo liso vascular (VSMC), los animales fueron sacrificados a 4 días y 21 días después de la lesión. Para la medición de la proliferación celular, animales de 4 días recibieron inyección intraperitoneal de bromodesoxíuridina (BrDdU) 50 mg/pata a 18, 12, y 2 horas antes de la eutanasia. Después de sacrificar a los animales, se cosecharon las arterias carótida izquierda y derecha enteras. Los especímenes se almacenaron en Histochoice por lo menos durante 24 horas antes de ser embebidos. La evaluación de proliferación de VSMC se realizó usando anticuerpo monoclonal anti-BrdU de ratón. Se aplicó un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con fluorescencia. El número de núcleos BrdU-positivos por sección fueron contados por dos observadores en forma ciega a los regímenes de tratamiento. Las ratas restantes fueron sacrificadas a los 21 días para análisis morfométrico. Los análisis morfométricos fueron revisados por un observador en forma ciega a los grupos de estudio, usando software de planimetría microscópica digital computarizada Image-Pro Plus sobre secciones en serie (5 mm de separación) las arterias carótidas se tiñeron mediante tinción de Van Gieson. Todos los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. Análisis estadísticos se realizaron con el uso de software SPSS. Las variables continuas se compararon usando pruebas de t no pareadas. Un valor de P < 0.05 se consideró que era estadísticamente significativo. Como se ve en las figuras 13A y 13B, el tratamiento con TTP-4000 redujo significativamente la relación íntima/media y la proliferación de células de músculo liso vascular de una manera de respuesta a la dosis. En la figura 13B, el eje y representa el número de células prolíferativas de BrdU.

B. TTP4000 en modelo animal de AD Se realizaron experimentos para evaluar si TTP-4000 podría afectar la formación amiloide y disfunción cognítiva en modelo de ratón de AD.

Los experimentos utilizaron ratones transgénicos que expresaban proteína precursora de amiloide mutante sueca humana (APP) bajo el control del promotor de cadena de PDGF-B. Con el tiempo, estos ratones generaron altos niveles del ligando de RAGE, amíloide beta (Aß). Anteriormente, el tratamiento de RAGEs durante 3 meses se ha mostrado que reduce tanto la formación de placa amiloíde en el cerebro como el incremento asociado en marcadores inflamatorios en este modelo. Los ratones APP (machos) usados en este experimento fueron designados por microinyección del gen APP humano (con mutaciones sueca y de Londres) en óvulos de ratón bajo el control del promotor del gen de cadena del factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B). Los ratones fueron generados sobre un fondo C57BL/6 y fueron desarrollados por Molecular Therapeutics Inc. Los animales se alimentaron ad libitum y se mantuvieron mediante acoplamiento de hermanos-hermanas. Los ratones generados a partir de esta construcción desarrollan depósitos de amiloide empezando a 6 meses de edad. Los animales se dejaron crecer durante 6 meses y después se mantuvieron durante 90 días y fueron sacrificados para cuantificación de amíloide. A los ratones transgénícos APP se administró vehículo o TTP4000 un día sí y un día no [cada dos días (i.p.)] durante 90 días empezando a los 6 meses de edad. Al final del experimento, los animales fueron sacrificados y examinados para carga de placa Aß en el cerebro (es decir, número de placas). Un grupo APP de control de 6 meses se usó para determinar la línea basal de depósito de amiloide. Además, al final del estudio, los anímales fueron sometidos a análisis de comportamiento (laberinto de agua de Morris). Los investigadores no conocían los compuestos del estudio.

Las muestras se dieron a los ratones a 0.25 ml/ratón/cada dos días. Además, a un grupo de ratones se dio 200 ug/día de RAGEs humano. 1. Deposición de amiloide Beta para examinacíón histológica, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal (IP) de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Los animales fueron transcardialmente prefundidos con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) a 4°C, seguido por 4% de paraformaldehído. Los cerebros fueron removidos y colocados en 4% de paraformaldehído durante la noche. Los cerebros fueron procesados a parafína y embebidos. Diez secciones de 30 mieras de espesor en serie a través del cerebro se obtuvieron. Las secciones se sometieron a anticuerpo primario durante la noche a 4°C (anticuerpo de péptido Aß) a fin de detectar los depósitos de amiloide en el cerebro de los animales transgénicos (Guo et al, J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)). Las secciones se lavaron en solución salina regulada en su pH con Tris (TBS) y anticuerpo secundario se añadió y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavarse, las secciones se incubaron como se instruye en el equipo Vector ABC Élite (Vector Laboratories) y se tiñeron con ácido diaminobenzoico (DAB). Las reacciones se detuvieron en agua y se hicieron deslizar sobre una cubierta después de tratamiento con xileno. El área de amiloide en cada sección se determinó con un sistema de análisis de imagen auxiliado por computadora, que consistía de una computadora Power Macintosh equipada con una tarjeta de Quick Capture frame grabber, una cámara Hitachi CCD montada sobre un microscopio Olympus y soporte para cámara. Software NIH Image Analysis, v. 1.55 se usó. Las imagines fueron capturadas y el área total de amiloide se determinó sobre las diez secciones. Un solo operador en forma ciega al estado de tratamiento realizó todas las mediciones. La suma de los volúmenes de amiloide de las secciones y la división entre el número total de secciones se hizo para calcular el volumen de amiloíde. Para análisis cuantitativo, se usó una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) para medir los niveles de Aß, Aßtotai y Aß¡- 2 total humano en los cerebros de ratón transgénico APP (Biosource International, Camarillo, CA). Aßtota? y Aß¡-42 se extrajeron de cerebros de ratón mediante clorhidrato de guanidina y se cuantifícaron como lo describe el fabricante. Esta prueba extrae el péptido Aß total del cerebro (tanto soluble como agregado). 2.- Función cognitiva La prueba de laberinto con agua de Morris se realizó de la siguiente manera: ratones AU fueron probados una vez en la prueba de laberinto con agua de Morris al final del experimento. Los ratones fueron entrenados en un laberinto con agua de campo abierto de 1.2 metros. El estanque se llenó a una profundidad de 30 cm con agua y se mantuvo a 25°C. La plataforma de escape (10 cm cuadrados) se colocó 1 cm por debajo de la superficie del agua. Durante las pruebas, la plataforma se removió del estanque. La prueba de indicios se llevó a cabo en el estanque rodeado por cortinas blancas para ocultar cualesquiera indicios del laberinto adicional. Animales AU pasaron por preentrenamiento de espacio (NSP) durante tres días consecutivos. Estas pruebas eran para preparar a los animales para la prueba de comportamiento final para determinar la retención de memoria para encontrar la plataforma. Esas pruebas no fueron registradas, pero fueron para propósitos de entrenamiento únicamente. Para los estudios de entrenamiento y aprendizaje, las cortinas fueron removidas para los indicios de laberinto adicionales (esto permitió la identificación de animales con alteraciones para el nado). El día 1 , los ratones fueron colocados en la plataforma oculta durante 20 segundos (ensayo 1 ), para los ensayos 2-3 los animales fueron liberados en el agua a una distancia de 10 cm de la plataforma indicios o la plataforma oculta, (ensayo 4) y se dejó que nadaran a la plataforma. En el segundo día de ensayos, la plataforma oculta fue movida aleatoriamente entre el centro del estanque o el centro de cada cuadrante. Los animales fueron liberados en el estanque, aleatoriamente mirando hacia la pared y se dejó que alcanzaran la plataforma en 60 segundos (3 ensayos), en el tercer ensayo, se dieron tres ensayos para los animales, dos con una plataforma oculta y uno con una plataforma con indicios. Dos días después de NSP, los anímales fueron sometidos a ensayos de comportamiento finales (prueba de laberinto con agua de Morris). Para estos ensayos (3 por animal) la plataforma se colocó en el centro de un cuadrante del estanque y los anímales fueron liberados mirando hacia la pared de una manera aleatoria. Se dejó que el animal encontrara la plataforma o nadara durante 60 segundos (periodo de latencia, el tiempo que se requiere para encontrar la plataforma). Los animales AU se probaron dentro de 4-6 horas de dosificación y fueron seleccionados aleatoriamente para prueba por un operador en forma ciega al grupo de prueba. Los resultados se expresan como la media ± desviaciones estándares (DE). La significancia de diferencias en los estudios de mieloide y de comportamiento se analizaron usando una prueba de t. Se hicieron comparaciones entre el grupo de control de APP de 6 meses de edad y los anímales tratados con TTP-4000, así como el grupo tratado con vehículo de APP de 9 meses de edad y los animales tratados con TTP-4000. diferencias por debajo de 0.05 se consideraron significativas. El por ciento en cambios en amiloide y comportamiento se determinaron tomando la suma de los datos en cada grupo y dividiendo entre la comparación (es decir, 1 , i.p./6 meses control = % de cambio). Las figuras 14A y 14B muestran que los ratones tratados durante 3 meses ya sea con TTP-4000 o RAGEs de ratón tuvieron menos placas Aß y menos disfuncíón cognitiva que animales tratados con vehículo y con lgG1 humana de control negativo (lgG1 ). Estos datos indican que TTP-4000 es efectiva para reducir patología de AD en un modelo de ratón transgénico. También se encontró que igual que RAGEs, TTP-4000 puede reducir las citosinas inflamatorias IL-I y FNT-a (no se muestran datos).

C. Eficacia de TTP-4000 en un modelo animal de accidente vascular cerebral TTP-4000 también se comparó con RAGEs en un modelo animal de accidente vascular cerebral relevante en enfermedad. En este modelo, la arteria carótida medía de un ratón fue ligada durante 1 hora seguido por 23 horas de reperfusión punto en el cual los ratones fueron sacrificados y el área del infarto en el cerebro se evaluó. Los ratones fueron tratados con RAGEs o TTP-4000 o inmunoglobulina de control inmediatamente antes de reperfusión. En estos experimentos, C57BL/6 machos fueron inyectados con vehículo a 250 µl/ratón o artículos de prueba de TTP (TTP-3000, TTP-4000 a 250 µl/ratón). Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente, 1 hora después de inicio de isquemia. Los ratones fueron sometidos a una hora de isquemia cerebral seguido por 24 horas de reperfusión. Para inducir isquemia, cada ratón fue anestesiado y la temperatura corporal se mantuvo a 36-37°C medíante calentamiento externo. La arteria carótida común izquierda (CCA) se expuso a través de una incisión de línea media en el cuello. Una grapa microquirúrgica se colocó alrededor del origen de la arteria carótida interna (ICA). El extremo distal de la ECA se ligó con seda y fue transfectado. Una seda de 6-0 se amarró sueltamente alrededor del extremo de ECA. La punta pulida con fuego de una sutura de nylon se insertó suavemente en el extremo de ECA. El bucle de la seda de 6-0 se apretó alrededor del extremo y la sutura de nylon se hizo avanzar hacía y a través de la arteria carótida interna (ICA), hasta que descansó en la arteria cerebral anterior, ocluyendo así la comunicación anterior y las arterias cerebrales medias. Después de que la sutura de nylon había sido colocada durante 1 hora, el animal se volvió a anestesiar, la temperatura rectal se registró y la sutura se removió y la incisión se cerró. El volumen del infarto se determinó anestesiando a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) y después removiendo los cerebros. Los cerebros después se seccionaron en cuatro secciones de 2 mm a través de la región infartada y se colocaron en cloruro de trifeniltetrazolio al 2% (TTC) durante 30 minutos. Después, las secciones se colocaron en paraformaldehído al 4% durante la noche. El área de infarto en cada sección se determinó con un sistema de análisis de imagen auxiliado por computadora, que consistía en una computadora Power Macintosh equipada con una tarjeta de tomador de cuadros de captura rápida, una cámara Hitachi CCD montada sobre un soporte de cámara. Se usó software de análisis de imagen NTH, v. 1.55. Las imágenes fueron capturadas y el área toral de infarto se determinó sobre las secciones. Un solo operador en forma ciega al estado de tratamiento realizó todas las mediciones. La suma de los volúmenes de infarto de las secciones calcularon el volumen de infarto total. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (DE). La significancia de la diferencia en los datos de volumen de infarto se analizaron usando una prueba de t. Como se ilustra mediante los datos en el cuadro 2, TTP-4000 fue más eficaz que RAGEs en limitar el área de infarto en estos animales lo que sugiere que TTP-4000, debido a su mayor vida media en el plasma, pudo mantener una mayor protección en estos ratones.

EJEMPLO 6 Detección de proteína de fusión de RAGE por ELISA Inicíalmente, 50 ul de anticuerpo monoclonal específico de RAGE 1 HB101 a una concentración de 10 ug/ml en IX PBS pH 7.3 se aplicó como revestimiento sobre placas mediante incubación durante la noche. Cuando estaban listas para usarse, las placas se lavaron tres veces con 300 ul de regulador de pH de lavado IX Imidazole-Tween y se bloquearon con 1 % de BSA. Las muestras (diluidas) y diluciones estándares de diluciones de TTP-4000 conocidas se añadieron a 100 ul de volumen final. Las muestras se dejaron incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces. Se añadió un conjugado de AP de lgG1 anti-humano de cabra (Sigma A3312) en IXPBS con 1% de BSA y se dejó incubar a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron tres veces. El color fue elucidado con fosfato de para nitrofenilo.

EJEMPLO 7 Cuantificación de unión de ligando de RAGE a proteína de fusión de RAGE La figura 15 muestra curvas de saturación-unión con TTP-4000 a varios ligandos de RAGE conocidos inmovilizados. Los ligandos fueron inmovilizados sobre una placa de microtítulación e incubados en presencia de concentraciones cada vez mayores de proteína de fusión desde el 0 hasta 360 nM. La interacción de proteína de fusión-ligando es detectada usando un anticuerpo policlonal conjugado con fosfatasa alcalina que es específica para la porción IgG de la quimera de fusión. Kds relativo se calcularon usando software Graphpad Prizm y coincidieron con los valores de la literatura establecidos de valores de ligando de RAGE-RAGE. HMG1 B = Anfoterina, CML= carboximetil lisína, A beta = amiloide beta 1-40. Lo anterior se considera como ilustrativo únicamente del principio de la invención. Puesto que numerosas modificaciones y cambios se le ocurrirán a los expertos en la técnica, no se debe limitar la invención a modalidades exactas mostradas y descritas, y todas las modificaciones y equivalentes adecuados que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas se consideran dentro del presente concepto inventivo.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de

RAGE directamente enlazado a un polípéptido que comprende un dominio CH2 de una ¡nmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. 2.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulína de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdomínío de RAGE está directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo.

3.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptído de RAGE comprende un sitio de unión de ligando.

4.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

5.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el polípéptido de RAGE que comprende un enlazador de interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulína de RAGE comprende un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa.

6.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de interdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de interdomínio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdomínio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2 o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

7.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.

8.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32.

9.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el enlazador de interdominio de RAGE directamente enlazado al dominio de inmunoglobulinuna CH2 O una porción del mismo comprende SEQ ID NO: 22 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 24, o una secuencia 90% idéntica a la misma.

10.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

11.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

12.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35.

13.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el enlazador de RAGE directamente enlazado a la inmunoglobulina CH2 comprende SEQ ID NO: 21 o una secuencia 90% idéntica a la misma o SEQ ID NO: 23 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

14.- Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio de CH2 de una inmunoglobulina.

15.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulína, o una porción del mismo.

16.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, que comprende SEQ ID NO:30, o un fragmento del mismo, o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento del mismo.

17.- Un vector de expresión que codifica para una proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulína o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

18.- El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdomínio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulína de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominío, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polípéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo.

19.- El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:30, o un fragmento del mismo, o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento del mismo.

20.- Una célula transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 17, de tal manera que la célula expresa una proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polípéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

21.- Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de RAGE en un vehículo farmacéuticamente efectivo, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende un polipéptido de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una ¡nmunoglobulina.

22.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulína de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de ¡nterdominío, y el aminoácido C-terminal del enlazador de ¡nterdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo.

23.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión de ligando.

24.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

25.- La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el polipéptido de RAGE que comprende un enlazador de interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE comprende un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa.

26.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el polipéptido de RAGE comprende un primer dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de ¡nterdominio de RAGE enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de ¡nterdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdominio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de interdomínio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2 o una porción de un dominio C 2 de una inmunoglobulina.

27.- La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.

28.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque la proteína de fusión comprende un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C 2 o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

29.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

30.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque la proteína de fusión de RAGE se formula como una solución inyectable.

31.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque la proteína de fusión de RAGE se formula como un polvo liofilizado estéril.

32.- Un método para hacer una proteína de fusión de RAGE que comprende el paso de unir covalentemente un polipéptido de RAGE a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio C 2 de una inmunoglobulina.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de ¡nterdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdomínio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio C 2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión de ligando.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el polipéptído de RAGE que comprende un enlazador de ¡nterdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE comprende un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido de RAGE comprende un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de ¡nterdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de interdomínio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C-termínal del segundo enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2 O una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido de RAGE comprende un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a través de un enlazador de interdominio de RAGE al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la proteína de fusión es codificada por una construcción de ADN recombinante.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque comprende el paso de incorporar la construcción de ADN en un vector de expresión.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque comprende transfectar el vector de expresión en una célula hospedero.

42.- El uso de una proteína de fusión de RAGE que comprende un polipéptído de RAGE directamente enlazado a un polipéptido que comprende un domino CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulína en la fabricación de un medicamento útil para tratar un trastorno mediado por RAGE en un sujeto.

43.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el polipéptido de RAGE comprende un enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido N-terminal del enlazador de interdominio, y el aminoácido C-terminal del enlazador de interdominío de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo.

44.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el sitio de unión de ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

45.- El uso como se reclama en la reivindicación 43, en donde el polipéptido de RAGE que comprende un enlazador de interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE comprende un fragmento de una proteína de RAGE de longitud completa.

46.- El uso como se reclama en la reivindicación 45, en donde también comprende un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazador de interdominio de RAGE enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazador de interdominio de RAGE, de tal manera que el aminoácido N-terminal del primer enlazador de interdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulína de RAGE, el aminoácido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE es enlazado al aminoácido C-terminal del primer enlazador de ¡nterdominio, el aminoácido N-terminal del segundo enlazador de ¡nterdominio es enlazado al aminoácido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulína de RAGE, y el aminoácido C-terminal del segundo enlazador de interdominio de RAGE es directamente enlazado al aminoácido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2 O una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

47.- El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.

48.- El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35.

49.- El uso como se reclama en la reivindicación 46, en donde el enlazador de interdomínio de RAGE directamente enlazado al dominio de inmunoglobulina C 2 o una porción del mismo, comprende SEQ ID NO: 22 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 24 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

50.- El uso como se reclama en la reivindicación 45, en donde un solo dominio de inmunoglobulína de RAGE enlazado a través de un enlazador de ¡nterdominío de RAGE al aminoácido N-terminal de un polipéptído que comprende un dominio de inmunoglobulina C 2 o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina.

51.- El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

52.- El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde la proteína de fusión de RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35.

53.- El uso como se reclama en la reivindicación 50, en donde el enlazador de interdominio de RAGE directamente enlazado a la ¡nmunoglobulina C 2 o una porción de la misma, comprende SEQ ID NO: 21 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o SEQ ID NO: 23 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

54.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento está adaptado para administrarlo en forma intravenosa al sujeto.

55.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento está adaptado para administrarlo en forma intraperitoneal al sujeto.

56.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento está adaptado para administrarlo en forma subcutánea al sujeto.

57.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar un síntoma de diabetes o un síntoma de complicaciones diabéticas tardías.

58.- El uso como se reclama en la reivindicación 57, en donde el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías comprende nefropatía diabética.

59.- El uso como se reclama en la reivindicación 57, en donde el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías comprende retinopatía diabética.

60.- El uso como se reclama en la reivindicación 57, en donde el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías comprende una úlcera diabética de los pies.

61.- El uso como se reclama en la reivindicación 57, en donde el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías comprende una complicación cardiovascular.

62.- El uso como se reclama en la reivindicación 57, en donde el síntoma de diabetes o complicaciones diabéticas tardías comprende neuropatía diabética.

63.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar amiloídosis.

64.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar enfermedad de Alzheimer.

65.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar cáncer.

66.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con autoínmunídad.

67.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con enfermedad intestinal inflamatoria.

68.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con artritis reumatoide.

69.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con psoriasis.

70.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con esclerosis múltiple.

71.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con hipoxia.

72.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con accidente vascular cerebral.

73.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con ataque cardiaco.

74.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con choque hemorrágico.

75.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con sepsía.

76.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con trasplante de órganos.

77.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar inflamación asociada con cicatrización de heridas alterada.

78.- El uso como se reclama en la reivindicación 42, en donde el medicamento es útil para tratar insuficiencia renal.