CN104736558A - 用于治疗代谢综合征的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一种FGF-21(成纤维细胞生长因子-21)化合物和至少一种GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂的融合蛋白，以及牵涉该融合蛋白的药物组合物、医药用途和治疗方法，特别是在糖尿病、血脂异常、肥胖症和/或多脂的领域中。

Description

用于治疗代谢综合征的融合蛋白
本发明涉及FGF-21融合蛋白以及包含FGF-21融合蛋白的药物化合物、牵涉FGF融合蛋白的药物组合物、用途和方法，特别是治疗至少一种代谢综合征和/或动脉粥样硬化，特别是糖尿病、血脂异常、肥胖症(obesity)和/或多脂(adipositas)。
背景技术
糖尿病由其临床表现表征，即非胰岛素依赖性或成人发病型(maturityonset form)，也称为2型糖尿病，和胰岛素依赖性或青年发病型(juvenile onsetform)，也称为1型糖尿病。2型糖尿病和潜在肥胖症临床症状的表现通常在超过40的年龄出现。相比之下，1型糖尿病通常显示更快的疾病发作，通常在30以前。该疾病为人代谢性疾病，在普通人群中的发病率约为百分之一，其中四分之一为1型糖尿病而四分之三为2型糖尿病。2型糖尿病的疾病特征为高循环血糖、胰岛素和皮质类固醇水平。
目前，存在多种治疗2型糖尿病的药理学方法，其可单独或组合使用，并通过不同的作用模式发挥作用：
1)磺酰脲刺激胰岛素分泌；
2)双胍(二甲双胍)通过促进葡萄糖利用、减少肝脏葡萄糖生成并减少肠内葡萄糖产出发挥作用；
3)胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1R激动剂)，称作“肠降血糖素模拟物”，通过胰腺β细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌发挥作用，并且减缓胃排空。
4)oc葡糖苷酶(oc-glucosidase)抑制剂(阿卡波糖、米格列醇)减缓碳水化合物消化，并因此减缓肠道吸收并降低餐后高血糖；
5)噻唑烷二酮类(曲格列酮)增强胰岛素作用，从而促进外周组织中血糖利用；和
6)胰岛素刺激组织葡萄糖利用并抑制肝脏葡萄糖产出。
然而，大多数药物功效有限，且无法解决最重要的问题——β-细胞功能降低和相关的肥胖。
1型糖尿病因胰腺中产生胰岛素的β-细胞的自身免疫性破坏造成，并且特征性地显示出非常低的或不可测量的血浆胰岛素，伴有升高的胰高血糖素。因为β-细胞分泌胰岛素，所以特异性针对β－细胞的免疫应答导致1型糖尿病。目前1型糖尿病的治疗方案试图最小化因天然胰岛素缺乏导致的高血糖。
肥胖症为一种在现代社会高度普遍的慢性疾病，并与包括糖尿病、胰岛素抗性、高血压、高胆固醇血症和冠心病在内的多种医学难题相关。其与糖尿病和胰岛素抗性进一步高度相关，后者通常伴有高胰岛素血症或高血糖或两者。另外，2型糖尿病与二至四倍冠状动脉疾病风险相关。
成纤维细胞生长因子21(FGF21或FGF-21)为主要由肝脏产生的新型代谢调节物，其在肥胖症和2型糖尿病动物模型中发挥有效的抗糖尿病和降脂作用。这种激素有助于体重调节，并且参与小鼠对营养缺乏(nutritionaldeprivation)和生酮状态(ketogenic state)的应答。FGF-21代谢作用的主要位点为脂肪组织、肝脏和胰腺。实验性研究已经显示，在对糖尿病小鼠和灵长类中施用FGF-21后，糖尿病代偿和血脂障碍有改善(Dostalova等，2009)。已显示在存在和不存在胰岛素时，FGF21刺激小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收，并以剂量依赖的方式减少ob/ob及db/db小鼠和8周龄的ZDF大鼠中摄食和空腹血糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，如此，这为FGF-21用作治疗糖尿病和肥胖症的疗法提供了基础(例如参见WO03/011213)。
成纤维细胞生长因子(FGF)是在发育中的和成体的组织中广泛表达的多肽。FGF家族目前由FGF-1到FGF-23的23个成员组成。FGF家族成员在脊椎动物物种间的基因结构和氨基酸序列高度保守。有18种哺乳动物成纤维细胞生长因子(FGF1-FGF10和FGF16-FGF23)，它们根据序列同源性和种系发生上的差异分为6个亚家族。少数几个未分配到亚家族的“FGF”，即FGF同源因子(之前称为FGF11-FGF14)，与FGF家族具有高度序列同一性，但不激活FGF受体(FGFR)，因此通常不被认为是FGF家族的成员。
尽管大多数FGF充当细胞生长和分化的局部调节物，但最近研究显示包括FGF-15/-19、FGF-21和FGF-23在内的FGF-19亚家族成员通过内分泌方式发挥重要的代谢作用。FGF-19亚家族成员调节多种不受经典FGF影响的生理过程。这些内分泌因子种类广泛的代谢活性包括调节胆汁酸、碳水化合物和脂质代谢，以及磷酸盐、钙和维生素D体内稳态(Tomlinson等2002，Holt等2003，Shimada等2004，Kharitonenkov等2005，Inagaki等2005，Lundasen等2006)。
FGF-21最初从小鼠胚胎中分离。FGF-21mRNA在肝脏中表达最丰富，在胸腺中表达程度较少(Nishimura等2000)。人FGF-21与小鼠FGF-21高度同一(约75％的氨基酸同一性)。在人FGF家族成员中，FGF-21与FGF-19最相似(约35％的氨基酸同一性)(Nishimura等2000)。FGF-21没有增殖和致瘤效应(Kharitonenkov等2005，Huang等2006，Wente等2006)，而所述效应对FGF家族的大部分成员很典型(Ornitz和Itoh 2001,Nicholes等，2002，Eswarakumar等，2005)。
向瘦蛋白缺陷型肥胖ob/ob小鼠、瘦蛋白受体缺陷型db/db小鼠和肥胖ZDF大鼠施用FGF-21显著地降低了血糖和甘油三酯，减低了空腹胰岛素水平，并且在口服葡萄糖耐受实验中改善了葡萄糖清除率。在两周的施用过程中，FGF-21没有影响糖尿病或瘦小鼠和大鼠的食物摄入或体重/构成。重要的是，FGF-21在糖尿病或健康动物中测试的任何剂量下，或当在转基因小鼠中过表达时，都没有诱导有丝分裂、低血糖或体重增加(Kharitonenkov等2005)。FGF-21过表达的转基因小鼠对饮食诱导的肥胖症有抗性。
向糖尿病恒河猴施用FGF-216周后降低了空腹血浆葡萄糖、果糖胺、甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素(glucagone)水平。重要的是，尽管有显著的降低葡萄糖作用，但在研究中没有观察到低血糖。施用FGF-21也显著减少了LDL胆固醇和增加了HDL胆固醇，并且相比小鼠(Kharitonenkov等2005)，轻微但显著地降低了体重(Kharitonenkov等2007)。
进一步的信息可从下列参考文献中获得：
1.Dostalova I.等：Fibroblast Growth Factor 21:A Novel Metabolic RegulatorWith Potential Therapeutic Properties in Obesity/Type 2Diabetes Mellitus.Physiol Res 58:1-7,2009。
2.ESWARAKUMAR V.P.等：Cellular signaling by fibroblast growth factorreceptors.Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149,2005。
3.HOLT J.A.等：Definition of a novel growth factor-dependent signalcascade for the suppression of bile acid biosynthesis.Genes Dev 17:1581-1591,2003。
4.HUANG X.等：Forced expression of hepatocytespecific fibroblast growthfactor 21delays initiation of chemically induced hepatocarcinogenesis.MolCarcinog 45:934-942,2006。
5.INAGAKI T.等：Endocrine regulation of the fasting response byPPARα-mediated induction of fibroblast growth factor 21.Cell Metab 5:415-425,2007。
6.KHARITONENKOV A.等：FGF-21as a novel metabolic regulator.J ClinInvest 115:1627-1635,2005。
7.KHARITONENKOV A.等：The metabolic state of diabetic monkeys isregulated by fibroblast growth factor-21.Endocrinology 148:774-781,2007。
8.SEN T.等：Circulating intestinal fibroblast growth factor 19has apronounced diurnal variation and modulates hepatic bile acid synthesis in man.JIntern Med 260:530-536,2006。
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10.NISHIMURA T.等：Identification of a novel FGF,FGF-21,preferentially expressed in the liver.Biochim Biophys Acta 1492:203-206,2000。
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12.SHIMADA T.等：FGF-23is a potent regulator of vitamin Dmetabolism and phosphate homeostasis.J Bone Miner Res 19:429-435,2004。
13.TOMLINSON E.等：Transgenic mice expressing human fibroblastgrowth factor-19display increased metabolic rate and decreased adiposity.Endocrinology 143:1741-1747,2002。
14.WENTE W.等：Fibroblast growth factor-21improves pancreaticbeta-cell function and survival by activation of extracellular signal-regulatedkinase 1/2and Akt signaling pathways.Diabetes 55:2470-2478,2006。
15.ANGELIN B.等：Circulating fibroblast growth factors as metabolicregulators-a critical appraisal.Cell Metab.2012Dec 5；16(6):693-705。
16.ZHAO Y.等：FGF21as a therapeutic reagent.Adv Exp Med Biol.2012；728:214-28。
消化道肽胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠降血糖素激素，并且以营养依赖性方式分泌。其刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌。GLP-1还促进β-细胞增殖，并且通过对葡萄糖感应物、抑制胃排空、食物摄入和胰高血糖素分泌的另外作用控制血糖过多。此外，GLP-1刺激胰岛素分泌，并且降低患有2型糖尿病人受试者中的血糖。以将血浆浓度提高到约3-4倍餐后生理水平的剂量外源性施用生物活性的GLP-1、GLP-1(7-27)或GLP-1(7-36酰胺)使2型糖尿病患者中的空腹高血糖完全常态化(Nauck,M.A.等，(1997)Exp ClinEndocrinol Diabetes,105,187-197)。人GLP-1受体(GLP-1R)为463个氨基酸的七螺旋G蛋白偶联受体，其在胰岛、肾、肺、心和外周及中枢神经系统的多个区域中广泛表达。在胰岛中，GLP-1R主要定位于胰岛β-细胞。GLP-1R信号传导的激活启动向更内分泌样表型(more endocrine-like phenotype)分化的程序，特别是来源于人胰岛的祖细胞向功能β-细胞的分化(Drucker,D.J.(2006)Cell Metabolism,3，153-165)。
不幸的是，FGF-21和生物活性的GLP-1两者以及其他已知药物自身对复杂和多因素的代谢异常的功效有限，这在2型糖尿病或其它代谢病症中可观察到。这也适用于所述化合物自身在降低血糖水平中的功效。
根据本发明，意想不到地发现了包含与GLP-1R激动剂融合的FGF-21激动剂的FGF-21融合蛋白以协同方式显著地使血糖水平降直至正常血糖水平。
本发明所解决的技术问题
本发明是基于发明人使用包含与GLP1R-激动剂融合的FGF-21作用剂的融合蛋白以及使用FGF-21化合物和GLP-1-R激动剂的体外和动物研究。
发明人惊讶地发现，包含与GLP-1R激动剂融合的FGF-21激动剂的FGF-21融合蛋白以协同方式使血糖水平降低直至正常血糖水平并且与通过施用单独组分实现的效果相当。
以上概述不见得描述了本发明解决的所有问题。
发明内容
本发明涵盖以下方面：
在第一方面，本发明涉及融合蛋白，其包含具有结构A-B-C或C-B-A或B-A-C或B-C-A或A-C-B或C-A-B或A-B-C-B-C或A-C-B或A-B-C-B或A-C-B-C的多肽，其中
A是GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂，且
C是FGF-21(成纤维细胞生长因子21)化合物，且
B是包含约1-1000个氨基酸的接头，或其中
B是包含约0-1000个氨基酸的接头。
在第二方面，本发明涉及本发明的融合蛋白用作药物的用途。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物。
在第四方面，本发明涉及本发明的融合蛋白或包含本发明的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物用作药物的用途。
在第五方面，本发明涉及制品，其包含
a)本发明的融合蛋白或药物组合物，和
b)容器或包装材料。
在第六方面，本发明涉及治疗患者的疾病或病症的方法，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或其中FGF-21功效的增加有益于所述疾病或病症的治疗(curing)、预防或改善，其中所述方法包括向所述患者施用本发明的融合蛋白或药物组合物。
在第七方面，本发明涉及治疗患者的心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病和/或糖尿病风险的代谢综合征优选2型糖尿病的方法，包括向所述患者施用本发明的融合蛋白或药物组合物。
在第八方面，本发明涉及为患者降低血浆葡萄糖水平、降低肝脏中脂质含量、治疗高脂血症、治疗高血糖、增加葡萄糖耐受、降低胰岛素耐受、增加体温和/或降低重量的方法，包括向所述患者施用本发明的融合蛋白或药物组合物。
在第九方面，本发明涉及编码本发明的融合蛋白的核酸，其优选包含以下核酸序列之一或由以下核酸序列之一组成：
a)根据具有SEQ ID NOs:27-38的序列之一的核酸序列，
b)编码根据SEQ ID NOs:15-26和39-44的蛋白质序列的核酸，
c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸。
在第十方面，本发明涉及包含本发明的核酸的载体，其适合于在真核或原核宿主中表达编码的蛋白质。
在第十一方面，本发明涉及稳定或瞬时携带本发明的载体并且能够在合适的培养条件下表达本发明的融合蛋白的细胞。
在第十二方面，本发明涉及制备本发明的融合蛋白的方法，包括
a)在用于所述融合蛋白在细胞中表达的合适培养条件下培养本发明的细胞的培养物，或
b)从培养物收获或纯化所述融合蛋白，所述培养物包含已经在用于所述融合蛋白表达的合适条件下培养的本发明的细胞，或
c)根据步骤a)培养细胞并根据步骤b)纯化融合蛋白，和任选地
d)使用蛋白酶切割His标记，如果所述融合蛋白是包含His标记的融合蛋白。
概述
在下文详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文描述的特定方法学、方案(protocol)和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另行限定，否则本文使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本领域普通技术人员所通常理解的相同。
优选地，将本文使用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所述进行定义。
本说明书通篇引用了数篇文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书、GenBank登录号序列提交等)，无论是在上文或是下文中，通过提述将其整体并入本文。不应将本文的任何内容解释为承认本发明因在先发明而没有资格优先于这些公开内容。
在本说明书和所附权利要求书的全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及其变型如“含有”和“含”应理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排出任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。这同样适用于术语“包括”及其变型如“含有”和“含”。
序列：本文涉及的所有序列公开在所附的序列表中，所述序列表以其全部内容和公开作为本说明书的一部分。下文提供了本文公开的序列的概要：
FGF-21化合物
GLP1-激动剂
用于构建接头的功能性部分
融合蛋白
融合蛋白的构建体(DNA序列)
融合蛋白
融合蛋白的构建体(DNA序列)
用于构建接头的功能性部分
GLP1-激动剂
SEQ ID NO:102 FGF-21突变蛋白
              (G+FGF-21，不含信号序列)
融合蛋白的构建体(DNA序列)
术语“约”当与数值关联使用时意在包括如下范围内的数值，该范围具有比所示数值小5％的下限并具有比所示数值大5％的上限。
定义
术语“药物组合物”如用于本文包括(但不限于)活性化合物与载体的制剂。在一个实施方案中，所述制剂包含如本文所述的融合蛋白并且忒被是本发明第一方面的融合蛋白。所述载体可以是例如包封材料(encapsulatingmaterial)，其提供其中活性化合物/成分(有或没有其他载体)被所述载体包围的胶囊，如此其与之相关联。所述载体也可以是适合于活性成分的液体制剂的载体，并且优选其本身是液体。所述载体还可以是任何其他适合于药物组合物的预期极性的载体。
“可药用的”意指联邦或州政府或超国家组织如欧盟或经济区如欧洲经济区的监管机构批准的、或美国药典或其他普遍承认的药典中所列出的、在给定国家或经济区中用于动物的，并且更特别是用于人。
术语“载体”如用于本文指药理学无活性的物质，例如但不限于稀释剂、赋形剂或载剂，其与治疗活性成分一起施用。这样的药用载体可以是液体或固体。液体载体包括但不限于无菌液体，如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)中的盐水溶液。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。当药物组合物静脉内施用时，盐水溶液是优选的载体。在药物组合物包含本文所述的融合蛋白并且特别是根据第一或第三方面的融合蛋白的背景下，无菌注射用溶液或供溶解的干粉制剂属于优选制剂。
合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin的"Remington'sPharmaceutical Sciences"中。术语“活性材料”指具有治疗活性的任何材料，如一种或多种活性成分。待用作治疗剂的活性成分能够采用本身为本领域可用的药用材料容易地制成这种单位剂量形式，并且能够通过既定流程制备。
术语“活性成分”指药物组合物或制剂中的生物活性物质，即提供药用价值的物质。药物组合物可包含一种或多种活性成分，它们可彼此联合发挥作用或彼此独立发挥作用。
活性成分可以配制成中性或盐形式。可药用盐包括与游离氨基形成的那些盐，如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与游离羧基形成的那些盐，例如但不限于源自钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
如用于本文，“单位剂量形式”指适合作为单一剂量用于人和/或动物受试者的物理离散单位，每个单位含有预定量的活性材料(例如，约50至约500mg的融合蛋白并任选地包含药学有效量的DPP IV抑制剂和/或抗糖尿病药物)，其经计算以产生期望的治疗效果，连同需要的药用稀释剂、载体或载剂(vehicle)。本文描述的单位剂量形式的规格受制于并直接依赖于(a)活性材料的独特性质和待实现的具体治疗效果，和(b)将该种活性材料调配用于动物或人中的治疗用途的技术中固有的限制，如本说明书中所公开的，这些属于本发明的特征。根据本发明合适的单位剂量形式的实例是小瓶、片剂、胶囊、锭剂、栓剂、粉末包、糯米纸囊剂(wafer)、扁囊(cachet)、安瓿、预填充注射器、离散的前述任意多种或前述的混合物，并且如本文所述或本领域中通常已知的其他形式。包含所述融合蛋白的一个或多个这种单位剂量形式可以包含在本发明的制品中，任选地进一步包含一个或多个单位剂量形式的抗糖尿病药物(例如包含作为活性成分的抗糖尿病药物的吸塑片剂)或包含一个或多个单位剂量形式的DPP IV-抑制剂(例如包含作为活性成分的DPP IV-抑制剂的吸塑片剂)或二者兼有(即融合蛋白、抗糖尿病药物和DPP IV抑制剂)。
以下制备物示例说明了本发明的单位剂量形式的制备物，但不作为对其的限制。可以制备几种剂量形式体现本发明。例如，每小瓶的单位剂量可含有0,5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml的融合蛋白，包含范围在约40至约500mg的治疗有效量的融合蛋白，并优选范围在约0,5至1ml，包含有效治疗量如约40至约500mg的融合蛋白。如有必要，这些制备物可以通过向每个小瓶添加无菌稀释剂调整至期望的浓度。在一个实施方案中，本发明的制剂的成分或者单独供应或者以单位剂量形式混合在一起供应，例如，作为干燥冻干粉末或不含水浓缩物于表明活性剂的量的紧密密封的容器如小瓶、安瓿或小药囊中。在组合物要通过输注施用的情况下，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在组合物要通过注射施用的情况下，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，从而所述成分可在施用前混合。
如本文所述的制剂包括可用于生产药物组合物(例如，适合于向受试者或患者施用的组合物)的原料药组合物，其可用于制备单位剂量形式。在优选的实施方案中，本发明的组合物是药物组合物。这样的组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种预防或治疗剂(例如，本发明的融合蛋白、DPP-IV抑制剂、抗糖尿病药物或另一预防或治疗剂)，以及可药用载体。优选地，将所述药物组合物配制成适合于向患者施用的途径。
可将活性材料、药剂或成分(例如融合蛋白、抗糖尿病药物或DPP IV-抑制剂)配制成多种剂量形式，包括用于口服施用的固体剂量形式，如胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒，用于口服施用的液体剂量形式如可药用乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆和酏剂，可注射制备物，例如，无菌注射水性或油性混悬液，用于直肠或阴道施用的组合物，优选栓剂，和用于局部或经皮施用的剂量形式如软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。
在具体的实施方案中，术语“可药用的”意指美国联邦或州政府的监管机构或EMA(欧洲药品管理局(European Medicines Agency))批准的、或美国药典(United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28Reissue,the UnitedStates Pharmacopeial Conventionchu,Inc.出版,Rockville Md.,出版日期：2010年4月)或其他普遍承认的药典中所列出的用于动物并且更特别是用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂{例如，弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或载剂，它们与治疗剂一起施用}。这样的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。关于(另外的)赋形剂的使用及其用途同样参见“Handbook ofPharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey and S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。如果期望，所述组合物还可含有少量的润湿剂和乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。口服制剂可包括标准载体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"。这样的组合物会包含预防或治疗有效量的抗体，优选以纯化形式，连同合适量的载体，从而提供用于恰当地施用于患者的形式。所述制剂应适合于施用模式。
概括而言，本发明的组合物的成分或者单独供应或者以单位剂量形式混合在一起供应，例如，作为供溶解的干燥制剂如冻干粉末、冷冻干粉或不含水浓缩物，于表明活性剂的量的紧密密封的容器如安瓿或小药囊中。本发明的组合物的成分还可以作为混合的液体制剂供应(即注射或输注溶液)，于紧密密封的容器中如安瓿、小药囊、预填充注射器或自动注射器(autoinjector)中，或用于可重复使用的注射器或施用器(applicator)(例如笔或自动注射器)的药筒中。在组合物要通过输注施用的情况下，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在组合物要通过注射施用的情况下，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，从而所述成分可在施用前混合。
本发明还提供包装在表明抗体量的紧密密封的容器如安瓿或小药囊中的制剂。在一个实施方案中，包含抗体的本发明制剂作为干燥制剂供应，如灭菌的冻干粉末、冷冻干粉、喷雾干粉或无水浓缩物，于紧密密封的容器中，并且可以重构，例如用水或盐水重构成合适浓度以供向受试者施用。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段作为作为液体制剂供应，如注射或输注溶液。在一个实施方案中，包含抗体的本发明制剂作为干燥制剂或作为液体制剂在紧密密封的容器中以至少40mg、至少50mg、至少75mg、至少100mg、至少150mg、至少200mg、至少250mg、至少300mg、至少350mg、至少400mg、至少450mg或至少500mg融合蛋白的单位剂量供应。包含抗体的本发明冻干制剂应该在其原始容器中在2-8℃储存，并且所述抗体应该在重构之后12小时内施用，优选6小时内，5小时内，3小时内或1小时内。包含所述融合蛋白的本发明制剂可以配置成中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子形成的那些盐，所述阴离子如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与阳离子形成的那些盐，所述阳离子如源自钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
可通过本发明的治疗方法和医药用途治疗的具体群体包括具有以下状况中的一种或多种的受试者：具有升高的血糖水平的受试者、具有高血糖的受试者、具有肥胖症的受试者、具有糖尿病的受试者、具有1或2型糖尿病的受试者、具有受损葡萄糖代谢的受试者、具有降低的葡萄糖耐受的受试者、具有高脂血症的受试者、具有糖尿病(diabetes mellitus)的受试者、具有胰岛素抗性的受试者、具有高血压的受试者、具有高胆固醇血症的受试者和具有心血管疾病如冠心病的受试者。
可通过本发明的治疗方法和医药用途治疗的具体适应症包括具有以下状况中的一种或多种的受试者：具有升高的血糖水平的受试者、具有高血糖的受试者、具有肥胖症的受试者、具有糖尿病的受试者、具有1或2型糖尿病的受试者、具有受损葡萄糖代谢的受试者、具有降低的葡萄糖耐受的受试者、具有高脂血症的受试者、具有糖尿病(diabetes mellitus)的受试者、具有胰岛素抗性的受试者、具有高血压的受试者、具有高胆固醇血症的受试者和具有心血管疾病如冠心病的受试者。
列出的以上群体或受试者的状况或病症是用本发明的融合蛋白治疗尤其合适的状况或病症。
然而，依赖于前述疾病或状况的严重性，用本发明的融合蛋白治疗受试者对于某些疾病和状况可能是禁忌。
术语“不良作用”(或副作用)指因药物产生的有害且不希望有的作用。当被判定为次于主要作用或治疗作用时，不良作用可以称为“副作用”。一些不良作用仅发生在开始、增加或中断治疗时。不良作用可能引起疾病的医学并发症并负面影响其预后。副作用的实例是变态反应、呕吐、头痛或眩晕或任何其他本文描述的作用。
术语“升高的血糖水平”、“升高的血糖”、“高血糖(hyperglycemia)”、“高血糖(hyperglycaemia)”和“高的血糖”在本文作为同义词使用，指过量葡萄糖在血浆中循环的状况，例如200mg/dL或更高的葡萄糖水平。血液测试的参考范围是11.1mmol/l，但是症状可能要到甚至更高的值如250–300mg/dl或15–20mmol/l才开始引起注意。根据美国糖尿病协会(American DiabetesAssociation)指南，将具有一贯的范围在100-126mg/dL的受试者认为是高血糖，而126mg/dl或7mmol/l以上通常被认为患有糖尿病。超过7mmol/l(125mg/dl)的慢性水平可产生器官损伤。
如用于本文，“患者”指任何可能受益于使用如本文所述的药物组合物治疗的哺乳动物、爬行类或鸟类。优选地，患者选自下组：实验动物(例如猴、小鼠或大鼠)、家畜(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、龟(turtle)、乌龟(tortoise)、蛇或蜥蜴)或灵长类包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人。尤其优选的是所述“患者”是人。
术语“受试者”或“个体”在本文可互换使用。如用于本文，“受试者”指人或非人动物(例如哺乳动物、鸟类、爬行类、鱼类、两栖动物或无脊椎动物；优选能够受益于本发明的不同方面之一(例如治疗方法或通过本方法鉴定的药物)的个体或能够用作实验动物用于鉴定或表征治疗药物或方法的个体)。所述受试者可以例如是人、野生动物、家畜或实验动物；实例包括：哺乳动物，例如人、非人灵长类(黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩)、狗、猫、啮齿动物(例如小鼠、豚鼠、大鼠、仓鼠或兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、骆驼；鸟类、如鸭、鸽子、火鸡、鹅或鸡；爬行动物如：龟、乌龟、蛇、蜥蜴；两栖动物如青蛙(例如非洲爪蟾(Xenopus laevis))；鱼类如koy或斑马鱼；无脊椎动物如蠕虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))或昆虫(如蝇，例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))。术语受试者还包括鸟类、鱼类、爬行动物或昆虫的不同形态发育阶段，如卵、蛹、幼虫或成虫。术语“受试者”包括术语“患者”。根据优选的实施方案，所述受试者是“患者”。
如用于本文，“治疗”或“处理”疾病或病症指达成以下中的一项或多项：(a)降低病症的严重性；(b)限制或预防所治疗病症的特征性症状的发展；(c)抑制所治疗病症的特征性症状的恶化；(d)限制或预防之前患有所述病症的患者中该病症的复发；和(e)限制和预防之前有所述病症症状的患者中该症状的复发。
如用于本文，“预防”疾病或病症指防止病症在受试者中发生。如用于本文，“用于施用的”和“待施用的”的表述与“制备要施用的”具有相同含义。换言之，陈述“用于施用”的活性化合物必需理解为已经配制了所述活性化合物并将其制成剂量，因而所述活性化合物处于能够发挥其治疗活性的状态。
如用于本文，“施用”包括体内施用，以及直接离体施用至组织，如静脉移植物。
“有效量”是足以实现预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量会随着如药剂性质、施用途径、接受该治疗剂的动物大小和物种以及施用目的等因素而变化。在每个单独情况下的有效量可由熟练技术人员根据本领域既定方法凭经验决定。
术语“成纤维细胞生长因子21”或FGF-21或FGF21指任何本领域已知的FGF-21，并且特别是指人FGF-21，并且更特别是指根据本文描述的任一序列的FGF-21。
“FGF-21化合物”用于本文为具有FGF-21活性的化合物，具体包括(i)天然FGF-21或(ii)具有FGF-21活性的FGF-21模拟物或(iii)具有FGF-21活性的FGF-21片段。
术语“天然FGF-21”用于本文指天然存在的FGF-21或与天然FGF-21基本上同源的变体。典型地，这种FGF-21变体在生物学上等同于天然FGF-21，即能够以与天然存在的FGF-21相同或类似的方式展现出全部或一些性质。在优选的实施方案中，所述天然FGF-21是哺乳动物FGF-21，优选选自下组：小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、狗、猫、马、猪、猴和人FGF-21。尤其优选如SEQ ID NO:102中所示的FGF-21突变蛋白。天然人FGF-21包含信号序列(参见SEQ ID NO:1)。尤其优选不含信号序列的FGF-21化合物，如SEQ ID NO:3中所示。
与天然FGF-21化合物“基本上同源的”变体的特征在于与其所源自的FGF-21某种程度的序列同一性。更准确来说，在本发明的上下文中，与FGF-21基本上同源的变体与FGF-21展现至少80％序列同一性，并且特别是与根据SEQ ID NO:3的FGF-21展现至少80％序列同一性。
本说明书通篇使用关于多肽序列比较的术语“至少80％序列同一性”。该表述优选指与各参考序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。FGF-21变体可以额外地或备选地包含氨基酸的缺失，其可以是N-端截短、C-端截短或内部缺失或这些的任意组合。包含N-端截短、C-端截短和/或内部缺失的这些变体在本发明的上下文中称作“缺失变体”或“片段”。术语“缺失变体”或“片段”在本文可互换使用。片段可以是天然存在的(例如剪接变体)或其可以人工构建，优选通过基因技术手段。优选地，片段(或缺失变体)与亲本多肽相比在其N-端和/或其C-端和/或内部具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的缺失，优选在其N-端，在其N-端和C-端，或在其C-端。在比较两个序列并且没有指定与之比较来计算序列同一性百分比的参考序列的情况下，如果没有另行特别说明，参考所比较的两个序列中较长则好来计算序列同一性。如果指明了参考序列，如果没有另行特别说明，那么基于由SEQ ID表明的参考序列的全长来测定序列同一性。例如，由105个氨基酸组成的肽序列相比根据SEQ ID NO:1的FGF-21的氨基酸序列可展现最高50.24％(105/209)的序列同一性百分比，而长度为181个氨基酸的序列可展现最高86.6％181/209)的序列同一性百分比。例如，由105个氨基酸组成的肽序列相比根据SEQ ID NO:3的FGF-21的氨基酸序列可展现最高58.01％(105/181)的序列同一性百分比。
氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过序列比对测定。这样的比对可以用数种本领域已知算法进行，优选用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)，用hmmalign(HMMER软件包,http://hmmer.wustl.edu/)或用CLUSTAL算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22,4673-80)，可得自例如http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html或http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clustalw.html。优选使用的参数是缺省参数，如http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上所设置的。序列同一性(序列匹配)的等级可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算。类似的算法纳入在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST多核苷酸检索使用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12进行，以获得与编码F、N或M2-1的那些核酸同源的多核苷酸序列。BLAST蛋白质检索使用BLASTP程序、得分＝100、字长＝3进行，以获得与F多肽、N多肽或M2-1多肽同源的氨基酸序列。为了处于比较目的获得带缺口的比对，利用Gapped BLAST，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序的缺省参数。序列匹配分析可以通过既定的同源性制图技术(homologymapping techniques)如Shuffle-LAGAN(Brudno M.,Bioinformatics 2003b,19Suppl 1:I54-I62)或Markov随机场(Markov random field)来补充。当本发明涉及序列同一性的百分比时，如果没有另行特别说明，这些百分比相对于较长序列的全长计算。
具有FGF-21活性的FGF-21模拟物包括带有对天然FGF-21氨基酸链的改变的FGF-21分子，如此它们展现FGF-21活性并进一步展现其他性质，例如但不限于修饰的化学性质和/或延长的血清半衰期。FGF-21模拟物包括但不限于FGF-21突变蛋白、FGF-21融合蛋白和FGF-21缀合物。优选的FGF-21突变蛋白是例如根据SEQ ID NO:2的FGF-21和根据SEQ ID NO:102的FGF-21。
术语“FGF-21活性”指天然FGF-21的任何已知生物活性，例如但不限于上文所列和以下那些活性：
1)在胰岛素存在下或在胰岛素不存在时刺激葡萄糖摄取(例如在脂肪细胞如人或小鼠脂肪细胞中，例如小鼠3T3-L1脂肪细胞中)。
2)增加来自糖尿病胰岛(例如来自糖尿病患者或糖尿病测试动物如糖尿病啮齿动物，或来自从糖尿病测试动物如糖尿病啮齿动物分离的β细胞，或从糖尿病测试动物如糖尿病啮齿动物分离的胰岛)的葡萄糖诱导性胰岛素分泌。
3)降低摄食和空腹血糖水平(例如在ob/ob小鼠中，在db/db小鼠中或在8周龄ZDF大鼠中，以剂量依赖性的方式)。
4)降低摄食和空腹甘油三酯(例如在ob/ob小鼠中，在db/db小鼠中或在8周龄ZDF大鼠中，以剂量依赖性的方式)。
5)降低摄食和空腹胰高血糖素水平(例如在ob/ob小鼠中，在db/db小鼠中或在8周龄ZDF大鼠中，以剂量依赖性的方式)。
6)降低LDL脂蛋白胆固醇和/或提高HDL脂蛋白胆固醇。
7)增加Glut-1蛋白或mRNA稳态水平。
8)与其他蛋白质相互作用，所述蛋白质如FGF-受体，特别是FGF-受体1、2或3或其能够与FGF-21相互作用的部分。
9)激活特定信号传导途径，例如激活胞外信号相关激酶1/2，激活Akt信号传导途径。
术语“FGF-21活性”还指上文所列活性中任意两种或更多种的组合，并且还指它们中的一种或多种与FGF-21的任何其他已知有益活性的组合。
“FGF-21活性”可以例如以本领域技术人员通常已知的FGF-21活性测定法测量。FGF-21活性测定法为例如在Kharitonenkov,A.等(2005),115；1627,No.6中描述的“葡萄糖摄取测定法”。作为葡萄糖摄取测定法的实例，使脂肪细胞在DMEM/0.1％BSA中饥饿3小时，用FGF-21刺激24小时，用KRP缓冲液(15mM HEPES，pH7.4，118mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM MgSO4，1.3mM CaCl2,1.2mM KH2PO4，0.1％BSA)洗涤两次，并将100μL含有2-脱氧-D-[14C]葡萄糖(2-DOG)(0.1μCi，100μΜ)的KRP缓冲液添加至每个孔。对照孔含有100μL的带有2-DOG(0.1μCi，10mM)的KRP缓冲液以监测非特异性。在37℃进行摄取反应1小时，通过添加细胞松弛素B(20μΜ)终止反应，并使用Wallac 1450MicroBeta计数器(PerkinElmer,USA)测量。
FGF-21模拟物的实例为：
(a)与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少约96％，特别是99％的氨基酸序列同一性，并具有FGF-21活性的蛋白质，
(b)FGF-21融合蛋白，其包含天然FGF-21，例如根据SEQ ID NO:1，或不含信号序列的FGF-21，例如根据SEQ ID NO:3，或其功能性片段，或包含与另一多肽融合的FGF-21突变蛋白(例如FGF-21-Fc融合物，GLP-1R激动剂融合蛋白，FGF-21-HSA融合蛋白)
(c)FGF-21缀合物，例如聚乙二醇化FGF-21、HES化FGF-21(HESylatedFGF-21)、与小分子单元偶联的FGF-21，等等。
FGF-21融合蛋白的实例描述于例如WO2004/110472或WO2005/113606，例如FGF-21-Fc融合蛋白或FGF-21-HSA融合蛋白。“Fc”意为免疫球蛋白的Fc部分，例如IgG4的Fc部分。“HSA”意为人血清白蛋白。这样的FGF-21融合蛋白相比天然FGF-21或其基本上同源的变体通常显示出延长的作用时间，例如但不限于延长的血清半衰期。
术语“缀合物”如用于本文指天然FGF-21或基本上同源的FGF-21变体的氨基酸链或指根据SEQ ID NO:3的FGF-21化合物，其包含所述氨基酸链的一个或多个变化，允许氨基酸链的化学缀合，例如但不限于聚乙二醇化(PEGylation)、HES化或聚唾液酸化(Polysialylation)。这样的FGF-21缀合物相比天然FGF-21或其基本上同源的变体通常显示延长的作用时间，例如但不限于延长的血清半衰期。
FGF-21缀合物的实例描述于例如WO2005/091944、WO2006/050247或WO2009/089396，例如乙二醇连接的FGF-21化合物。这样的乙二醇连接的FGF-21化合物通常在例如半胱氨酸或赖氨酸氨基酸残基处或在引入的N-联或O-联的糖基化位点处携带聚乙二醇(PEG)(本文中称为“聚乙二醇化FGF-21”)。这样的聚乙二醇化FGF-21化合物相比人FGF-21通常显示延长的作用时间。合适的PEG具有约20,000-40,000道尔顿的分子量。
“突变蛋白”通常包含变化，例如但不限于对FGF-21氨基酸链的氨基酸交换、添加和/或缺失，所述变化维持FGF-21活性并且通常改变氨基酸链的化学性质，例如但不限于氨基酸链的糖基化或胺化的增加或减少，和/或蛋白水解性降解潜力的增加或减少，和/或蛋白质的静电表面电势的改变。
FGF-21突变蛋白的实例描述于例如WO2005/061712、WO2006/028595、WO2006/028714、WO2006/065582或WO2008/121563。示例性突变蛋白为当例如在酵母中表达时相比野生型人FGF-21具有降低的O糖基化能力的突变蛋白，例如在167位(丝氨酸)具有取代的人FGF-21，例如具有如下取代之一的人FGF-21：Ser167Ala、Ser167Glu、Ser167Asp、Ser167Asn、Ser167Gln、Ser167Gly、Ser167Val、Ser167His、Ser167Lys或Ser167Tyr。另一实例为相比野生型人FGF-21显示脱酰胺作用降低的突变蛋白，例如在人FGF-21的121位(天冬酰胺)具有取代的突变蛋白，例如Asn121Ala、Asn121Val、Asn121Ser、Asn121Asp或Asn121Glu。备选的突变蛋白为具有一个或多个非天然编码氨基酸的人FGF-21，例如WO2008/121563的权利要求29中的通式所描述。其它突变蛋白包含荷电氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或极性但不荷电氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)分别对例如极性但不荷电氨基酸或荷电氨基酸的取代。实例为Leu139Glu、Ala145Glu、Leu146Glu、Ile152Glu、Gln156Glu、Ser163Glu、lle152Glu、Ser163Glu或Gln54Glu。另一种突变蛋白为当在例如酵母中表达时相比人FGF-21显示对蛋白水解降解的敏感性降低的突变蛋白，具体为由选自如下的氨基酸取代Leu153的人FGF-21：Gly、Ala、Val、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Glu、Cys或Met。优选的FGF-21突变蛋白为根据SEQ ID NO:2的突变FGF-21(其包括信号序列)，其在N端含有附加的甘氨酸。优选的FGF-21突变蛋白为根据SEQ ID NO:102的突变FGF-21，其携带人FGF-21氨基酸1-28的缺失(根据SEQ ID NO:1)(即其不含信号序列)并在N端含有附加的甘氨酸。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被另一具有化学性质(例如，电荷或疏水性)相似的侧链的氨基酸残基取代的取代。概括而言，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此的区别在于保守取代的情况下，可调高相似性百分比或程度以修正取代的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods MoI.Biol.24:307-331。具有化学性质相似的侧链的氨基酸组的实例包括
1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；
3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；
4)芳香族侧链：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；
5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及
7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。
优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可供选择的是，保守取代是在Gonnet等(1992)Science256:1443-45中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中具有正值的任何变化。“中度保守”取代是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。鉴于已知的遗传编码，以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家能够容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。
如用于本文，“非保守取代”或“非保守氨基酸交换”定义为氨基酸交换为上文所示七个标准氨基酸组1)-7)中不同组所列的另一氨基酸。
术语“基本同一性”或“基本上相同的”当涉及核酸或其片段时，表明当与另一核酸(或其互补链)在带有适当核苷酸插入或缺失的条件下以最佳方式对其时，在至少约90％，并且更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法所测定的，所述算法如FASTA、BLAST或GAP，如下文所讨论。
如用于多肽，术语“基本相似性”或“基本上相似”指两个肽序列，当以最佳方式对其时(如通过GAP或BESTFIT程序使用缺省缺口权重)，共享至少80％序列同一性，并且优选至少90％、95％、96％、98％或99％或99.5％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守氨基酸取代。
多肽的序列相似性通常使用序列分析软件来测定。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰包括保守氨基酸取代的相似性量度来匹配相似序列。比如，GCG软件含有如GAP和BESTFIT等程序，其可以按缺省参数使用以测定紧密相关多肽(例如来自不同种的生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG版本6.1。多肽序列还可以使用FASTA(GCG版本6.1中的程序)以缺省或推荐参数进行比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供在查询序列和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(2000)参见上文)。在将本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一优选算法是计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数。参见，例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403410和(1997)Nucleic Acids Res.25:3389402，其各自通过提述并入本文。
在本发明涉及序列同一性百分比时，如果没有另行特别说明，这些百分比相对于较长序列的全长计算。这种相对于较长序列的全长的计算方式适用于核酸序列和多肽序列二者。
如用于本文，术语“融合蛋白”指通过将两个或更多个原先编码单独蛋白质的蛋白质编码核酸结合而创造的融合蛋白或嵌合蛋白。这种融合基因的翻译产生单一多肽，其具有源自原始蛋白质中每一个的功能性质。重组融合蛋白通过用于生物学研究或治疗的重组DNA技术人工创造。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程创造的蛋白质。本发明涉及重组融合蛋白，并且术语融合蛋白和重组融合蛋白在本文以相同含义使用。本文描述的融合蛋白通常包含至少两个结构域(A和C)，并且任选地包含第三组分，介于所述两个结构域之间的接头C。重组融合蛋白的生成是本领域已知的，并且通常涉及自编码第一蛋白或多肽的cDNA序列去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR以符合读框的方式附接第二蛋白的cDNA序列。该DNA序列然后会由细胞表达成为单一蛋白质。该蛋白质可以经工程化以包括两种原始蛋白质或多肽的完整序列，或仅仅任一的一部分。
术语“接头”如用于本文指结构单元能插入在两个或更多个其他单元(例如两个或更多个肽或多肽或蛋白质，或肽和蛋白质、多肽和蛋白质、肽和多肽)之间，并且将这样的两个或更多个其他单元彼此偶联以创造一个分子。两个单元的偶联优选通过共价键。术语“接头”如用于本文还指能够与两个或更多个单元(例如两个或更多个肽或多肽或蛋白质，或肽和蛋白质、多肽和蛋白质、肽和多肽)的N-或C-端连接的结构单元，其中所述两个或更多个其他单元直接偶联在一起。术语“连接”如用于本文还指前述定义的组合，即将一个结构单元插入至两个或更多个其他单元(例如两个或更多个肽或多肽或蛋白质，或肽和蛋白质、多肽和蛋白质、肽和多肽)之间，并且将一个或多个另外的结构单元与两个或更多个其他单元(例如两个或更多个肽或多肽或蛋白质，或肽和蛋白质、多肽和蛋白质、肽和多肽)的N-或C-端连接。优选通过共价键将所述结构单元与两个或更多个其他单元的N-或C-端连接。
结构接头单元可包含，例如
a)一个或多个聚合物(如化学聚合物、蛋白质、多肽或肽、核酸或其衍生物(如聚酰胺-核酸(polyamide-nucleic acid))、聚碳聚合物等，糖类的聚合物)，其中所述接头可以由一个聚合物或两个或更多个相同类型或不同类型的聚合物构成(例如由两个或多个肽构成的接头是包含超过一个相同类型的聚合物的接头，而例如由一段或多段肽和核酸构成的接头如肽-核酸-肽接头等是由不同类型的聚合物构成的接头)。
b)糖类
c)有机化合物单元
d)a和b或a和c或b和c或a和b和c的混合物。
在本发明的上下文中优选的接头由一个或多个肽或多肽构成。在一个本发明融合蛋白的实施方案中，所述接头是肽接头。在一个本发明融合蛋白的实施方案中，所述接头包含赋予除连接A和C之外一种或多种其他功能的功能性部分。
可以添加接头用于使形成所述融合蛋白的蛋白质或多肽之一或二者可改善的或独立的折叠，和/或用于避免空间位阻，和/或用于引入另外的期望的官能性，例如用于别的部分的共价连接的进入位点、用于蛋白质纯化的标记、蛋白酶切割位点、蛋白质稳定化和/或蛋白质半衰期延长。
接头通常由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸构成，从而使相邻的蛋白质结构域可相对于彼此自由移动。当有必要保证所述两个相邻结构域在空间上彼此不干扰时，使用较长的接头。在本发明的上下文中使用的接头的实例是例如包含富含GS的单元的接头，例如：
a.一个或多个(GS)n单元，其中n＝0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100；
b.一个或多个(GGS)n单元，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100；
c.一个或多个(GGSG)n单元，其中n＝0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100；
d.一个或多个(GaSb)c单元，其中a,b,c＝0,1,2,3,4,5,6,7,8,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100；
e.一个或多个(SbGA)c单元，其中a,b,c＝0,1,2,3,4,5,6,7,8,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100；
其中每种接头可任选地进一步含有一个或多个额外的氨基酸，优选选自组氨酸、丙氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸。
本发明的接头包含0、1至1000个氨基酸。所述接头也可以不存在(即0氨基酸)。如上所述，所述接头可以是肽、多肽或蛋白质，或者可以包含其他结构性部分如核酸段或其他聚合物。如此，所述接头可包含例如约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000氨基酸的长度。
例如，典型接头类型可为螺旋或非螺旋型，其中螺旋接头被认为作为刚性间隔物发挥作用将两个结构域隔开，而非螺旋接头含有脯氨酸或富含脯氨酸，其也导致结构刚性并使所述接头与连接的结构域隔离。这意味着两种接头类型都很可能发挥支架的作用以防止折叠的结构域之间的不利相互作用。
例如，所述接头可包括以下功能性部分a)-g)中的一种或多种：
a)为融合物赋予增加的稳定性和/或半衰期的部分，如XTEN化(XTENylation)、rPEG或PAS化或HES化(HESylation)序列或弹性蛋白样多肽(ELP)；
b)用于共价修饰所述融合蛋白的进入位点，如半胱氨酸或赖氨酸残基；
c)具有胞内或胞外靶向功能的部分，如蛋白质结合支架(如抗体、抗原结合片段或其他非抗体结合性蛋白质支架)、核酸(如适配体(aptamer)、PNA、DNA或类似物)；
d)a蛋白酶切割位点such as a因子Xa切割位点或a切割位点foranother(preferably extracellular)protease；
e)白蛋白结合结构域(ABD)；
f)免疫球蛋白的Fc部分,例如IgG4的Fc部分；
g)包含一个或多个组氨酸(His接头，缩写为“His”)氨基酸的氨基酸序列，例如HAHGHGHAH。
所述接头可由一个或多个功能性部分组成，所述一个或多个功能性部分例如蛋白酶切割位点、半衰期稳定化部分、用于共价修饰的进入位点(在其最简单的意义上为半胱氨酸或赖氨酸)等。所述接头还可包含一个或多个不为所述接头赋予额外官能性的氨基酸和赋予官能性的部分。所述接头还可包含功能性部分的组合或由功能性部分的组合组成；可考虑的实例是例如：
A–[稳定化部分–蛋白酶切割位点–稳定化部分]-C
A–[稳定化部分–蛋白酶切割位点–稳定化部分]-C
A–[XX//X–蛋白酶切割位点–X//XX]-C
A–[X–用于共价连接的进入位点–X//XXXXX]-C
A–[X–蛋白酶切割位点–XX-用于共价连接的进入位点-X]-C
可考虑不同部分的许多其他组合。
其中[]是接头，且X代表任意氨基酸并且可是＝0至约1000个氨基酸，其中所述列表是非穷举性的，并且其中所述排列方式始终也可以是从N-端至C-端的顺序为C-接头-A，而非下文所列的A-至C-的排列方式。
根据本发明融合蛋白的一些实施方案，所述接头包含以下蛋白酶切割位点中的一种或多种：
a)因子Xa切割位点，并且优选包含IEGR序列(SEQ ID NO:11)或由IEGR序列(SEQ ID NO:11)组成
b)蛋白酶切割位点，并且优选包含至少一个精氨酸或由至少一个精氨酸组成，并且更优选包含序列GGGRR(SEQ ID NO:14)或由序列GGGRR(SEQID NO:14)组成。
根据本发明融合蛋白的一个实施方案，所述接头包含用于共价修饰的进入位点或由用于共价修饰的进入位点组成，并且优选包含如下序列或由如下序列组成：根据SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的序列。
根据本发明融合蛋白的另一实施方案，所述接头包含蛋白质稳定化序列或由蛋白质稳定化序列组成，并且优选包含PAS化序列如根据SEQ ID NO:12的序列。
根据本发明融合蛋白的又一实施方案，所述接头包含一个或多个用于共价修饰所述融合蛋白的进入位点或由一个或多个用于共价修饰所述融合蛋白的进入位点组成，所述进入位点如半胱氨酸或赖氨酸，并且优选半胱氨酸。
根据本发明融合蛋白的一个实施方案，B包含或是IEGR(SEQ IDNO:11)、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13GGGRR(SEQ ID NO:14)、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101。
天然FGF-21或FGF-21的基本上同源的变体的氨基酸链包含一个或多个另外的氨基酸链。每个氨基酸链优选是完整蛋白，即横跨整个开读框(ORF)，或是其片段、结构域或表位。融合蛋白的各别部分可以永久或暂时地彼此相连。融合蛋白中永久相连的部分翻译自单一ORF，随后在共翻译水平或翻译后水平也不分开。融合蛋白中暂时相连的部分也可源自单一ORF，但由于在翻译过程中或翻译后因肽链的切割(例如通过内肽酶)而分离，于是在共翻译水平分开。另外或可选的是，融合蛋白的部分也可源自两个不同的ORF，并且在翻译后水平是相连的，例如通过共价键。
“GLP-1R激动剂”定义为结合到并激活GLP-1受体的化合物，如GLP-1(胰高血糖素样肽1)。GLP-1和/或GLP-1R激动剂的生理作用在例如Nauck,M.A.等，(1997)Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes,105,187-195中描述。在正常受试者特别是人中这些生理作用包括例如对胰岛素分泌的葡萄糖依赖性刺激、对胰高血糖素分泌的阻抑、对胰岛素(原)生物合成的刺激、食物摄取的减少、胃排空的减速和/或不明确的胰岛素敏感性(equivocal insulin sensitivity)。
发现GLP-1R激动剂的合适测定法描述于例如Thorkildsen，Chr.等(2003),Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,307,490-496；Knudsen,L.B.等(2007),PNAS,104,937-942,No.3；Chen,D.等(2007),PNAS,104,943-948,No.3或US2006/0003417A1中(例如参见实施例8)。简而言之，在“受体结合测定法”中，将含有例如人重组GLP-1受体的真核细胞(例如CHO、BHK或HEK293细胞)的纯化膜部分在例如人GLP-1(例如标记有例如125l(例如80kBq/pmol)的GLP-1(7-36)酰胺)存在下与一种或多种测试化合物一起温育。通常使用不同浓度的一种或多种测试化合物，且IC50值测定为减少人GLP-1特异结合的浓度。在“受体功能测定法”中，制备表达例如人GLP-1受体的、例如根据上文所述从真核细胞分离的质膜，并将其与测试化合物一起温育。通过测量作为对测试化合物刺激的应答的cAMP进行功能性测定。在“报告基因测定法”中，在测试化合物存在下培养表达例如人GLP-1受体且含有例如多重应答元件/cAMP应答元件驱动的萤光素酶报告质粒的例如上文所述的真核细胞。测量cAMP应答元件驱动的萤光素酶活性作为对测试化合物刺激的应答。
合适的GLP-1R激动剂选自生物活性的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1替代物中，如例如Drucker,D.J.(2006)Cell Metabolism,3,153-165；Thorkildsen,Chr.(2003；参见上文)；Chen,D.等(2007；参见上文)；Knudsen,L.B.等(2007；参见上文)；Liu,J.等(2007)Neurochem Int.,51,361-369,No.6-7；Christensen,M.等(2009),Drugs,12,503-513；Maida,A.等(2008)Endocrinology,149,5670-5678,No.11和US2006/0003417中所述。示例性化合物为GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺、毒蜥外泌肽-4(Extendin-4)、利拉鲁肽(liraglutide)、CJC-1131、albugon、阿必鲁肽(albiglutide)、艾塞那肽(exenatide)、艾塞那肽-LAR、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)、利西拉肽(lixisenatide)、京尼平苷(geniproside)、具有GLP-1R激动活性的短肽和/或具有GLP-1R激动活性的小分子有机化合物。
具体而言，人GLP-1(7-37)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。人GLP-1(7-36)酰胺具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。毒蜥外泌肽-4具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列。艾塞那肽具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且胃泌酸调节素具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。利西拉肽的氨基酸序列在SEQ IDNO:9中示出。利西拉肽的结构基于用6个附加的赖氨酸残基进行C末端修饰的毒蜥外泌肽-4(1-39)，所述修饰用来抵抗由DPP-IV(二肽基肽酶-4)造成的立即生理降解。利西拉肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中示出。
利拉鲁肽的化学结构在图4中示出。利拉鲁肽通过将GLP-1(7-37)的Lys34取代为Arg并使用γ-谷氨酸间隔物在26位加入C16脂肪酸而获得。其化学名为[N-ε(γ-L-谷氨酰基(N-α-十六酰基)-Lys26,Arg34-GLP-1(7-37)]。
CJC-1131的化学结构在图5中示出。白蛋白连接在GLP-1的C末端，且在第8位具有d-丙氨酸取代。CJC-1131显示非常良好的稳定性和生物活性组合。
其它具有GLP-1R激动活性的肽在US2006/0003417中示例性公开，而具有GLP-1R激动活性的小分子有机化合物示例性公开于Chen等2007，PNAS,104,943-948,No.3或Knudsen等2007,PNAS,104,937-942中。
如用于本文，术语“抗糖尿病药物”指显示出减少糖尿病的症状和/或原因并且特别是糖尿病(Diabetes mellitus)的症状和/或原因的作用模式的药物。示例性示例性抗糖尿病药物是
a)胰岛素，
b)噻唑烷二酮，例如罗格列酮(rosiglitazone)或吡格列酮(pioglitazone)(例如参见WO2005/072769)、二甲双胍(N,N-二甲基亚氨基二碳亚胺-二酰胺)，或
c)磺酰脲，如氯磺丙脲(4-氯-N-(丙基氨基甲酰基)-苯磺酰胺)、妥拉磺脲(N-[(氮杂环庚烷-1-基氨基)羰基]-4-甲基-苯磺酰胺)、格列齐特(N-(六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-基-氨基甲酰基)-4-甲基苯磺酰胺)或格列美脲(3-乙基-4-甲基-N-(4-[N-((1r,4r)-4-甲基环己基氨基甲酰基)-氨磺酰基]苯乙基)-2-氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酰胺)。
根据本发明并且如用于本文时，“胰岛素”意为天然存在的胰岛素、修饰的胰岛素或胰岛素类似物，包括它们的盐和它们的组合，例如修饰的胰岛素和胰岛素类似物的组合，例如具有氨基酸交换/缺失/添加以及进一步修饰如酰化或其它化学修饰的胰岛素。这类型化合物的一个实例为地特胰岛素(insulindetemir)，即LysB29-十四烷酰基/des(B30)人胰岛素。另一实例可为如下胰岛素，其中掺入了非天然氨基酸或在真核生物中通常不编码的氨基酸如D-氨基酸(Geiger,R.等，Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.(1976)357,1267-1270；Geiger,R.等，Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.(1975)356,1635-1649,No.10；Krail,G.等，Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.(1971)352,1595-1598,No.11)。又一实例为胰岛素类似物，其中A-链或B-链或两者的C-端羧酸由酰胺置换。
“修饰的胰岛素”优选选自具有胰岛素活性的酰化胰岛素，特别是胰岛素A-链和/或B-链的一个或多个氨基酸为酰化的，优选B29位酰化的人胰岛素(Tsai,Y.J.等，(1997)Journal of Pharmaceutical Sciences,86,1264-1268,No.11)。其它酰化胰岛素为desB30人胰岛素或B01牛胰岛素(Tsai,Y.J.等，参见上文)。其它酰化胰岛素实例公开于例如US5,750,497和US6,011,007中。修饰的胰岛素的结构-活性关系的综述在Mayer,J.P.等，(2007)Biopolymers,88,687-713,No.5中提供。修饰的胰岛素通常通过化学和/或酶处理胰岛素或合适的胰岛素前体(如前胰岛素原、胰岛素原或其截短类似物)制备。修饰的胰岛素的其他实例包括，但不限于以下：(i)“地特胰岛素”，其与人胰岛素的区别在于B30位的苏氨酸被去除并且将脂肪酸残基(肉豆蔻酸)连接至B29位赖氨酸的ε-氨基官能团。(ii)“德谷胰岛素(insulin degludec)”，其与人胰岛素的区别在于自B链缺失最末的氨基酸并且通过添加谷氨酰基将LysB29与十六碳烷二酸连接。
“胰岛素类似物”优选选自具有胰岛素活性并具有一个或多个突变、取代、缺失和/或添加的胰岛素，特别是在A-链和/或B-链具有C-和/或N-端截短或延伸的胰岛素，优选des(B30)胰岛素、PheB1胰岛素、B1-4胰岛素、AspB28人胰岛素(门冬胰岛素(insulin aspart))、LysB28/ProB29人胰岛素(赖脯胰岛素(insulin lispro))、LysB03/GluB29人胰岛素(谷赖胰岛素(insulin glulisine))或GlyA21/ArgB31/ArgB32人胰岛素(甘精胰岛素(insulin glargine))。胰岛素类似物的唯一前提是其具有足够的胰岛素活性。胰岛素类似物结构-活性关系的综述及关于容许哪些氨基酸交换、缺失和/或添加的论述在Mayer,J.P.等，(2007；参见上文)中提供。胰岛素类似物优选为其中一个或多个天然存在的氨基酸残基(优选其中的一个、两个或三个)由另一种氨基酸残基取代的那些。胰岛素类似物的另外的实例为C-端截短衍生物如des(B30)人胰岛素；B-链N-端截短的胰岛素类似物如des PheB1胰岛素或des B1-4胰岛素；其中A-链和/或B-链具有N-端延伸的胰岛素类似物，包括B-链具有N-端延伸的所谓“前胰岛素”；和其中A-链和/或B-链具有C-端延伸的胰岛素类似物。例如可加入一个或两个Arg到B1位。胰岛素类似物的实例在下述专利及其等同专利中描述：US5,618,913、EP 0 254 516 A2和EP 0 280 534 A2。临床应用中胰岛素类似物的综述在Mayer J.P.等，(2007,参见上文)中提供。胰岛素类似物或其前体通常使用本领域技术人员熟知的基因技术制备，并通常在细菌或酵母中制备，如有需要接着进行酶或合成操作。可选择地，胰岛素类似物可用化学方法制备(Cao,Q.P.等，(1986)Biol.Chem.Hoppe Seyler,367,135-140,No.2)。具体胰岛素类似物的实例为门冬胰岛素(即AspB28人胰岛素)、赖脯胰岛素(即LysB28,ProB29人胰岛素)、谷赖胰岛素(即LysB03,GluB29人胰岛素)和甘精胰岛素(即GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰岛素)。
示例性的DPP-IV抑制剂为：
式I的化合物(图3)，西他列汀：(R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]-吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-2-胺,
维格列汀：(S)-1-[N-(3-羟基-1-金刚烷基)甘氨酰]吡咯烷-2-甲腈,
沙格列汀：(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羟基-1-金刚烷基)-乙酰基]-2-氮杂二环[3.1.0]己烷-3-甲腈，
利拉利汀(linagliptin)：8-[(3R)-3-氨基哌啶-1-基]-7-(丁-2-炔-1-基)-3-甲基-1-[(4-甲基-喹唑啉-2-基)甲基]-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮)，
adogliptin(2-({6-[(3R)-3-氨基哌啶-1-基]-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基}甲基)-苯甲氰，和
黄连素，其为来自异喹啉生物碱群体的季铵盐，存在于诸如小檗属(Berberis)、白毛茛(Hydrastis canadensis)和黄连(Coptis chinensis)等植物的根、根茎、茎和茎皮中。
本发明的药物组合物优选包含治疗有效量的各别的化合物和通常的可接受的药物载体、稀释剂或赋形剂，例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(即含有约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank氏溶液、Ringer氏乳酸盐、乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等。该组合物优选配制为溶液或混悬液。冻干或其他干粉制剂、固体制剂、脂质体制剂或任何其他类型的制剂也可考虑。本发明的药物组合物可通过口服、皮下、肌内、肺部、吸入和/或通过缓释施用来施用。优选皮下施用所述组合物。
术语“治疗有效量”或“治疗量”意指药物或药剂会引起研究者、兽医、医生或其他临床工作者所追求的组织、系统、动物或人的生物或医学反应的量。术语“预防有效量”意指药物会防止生物或医学事件发生或降低其发生风险的量，该生物或医学事件的发生是研究者、兽医、医生或其他临床工作者试图在组织、系统、动物或人中避免的。具体而言，术语“治疗有效量”如用于本文指化合物使期望的治疗和/或预防效果产生而不引起无法接受的副作用的量。具体而言，患者接受的剂量可以经选择从而实现期望的血糖水平或血糖的水平；患者接受的剂量也可以随着时间滴定以达到目标血糖或血糖水平。使用如本文所述的剂量方案根据多种因素选择，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、重量、体重指数、性别和医学状况；要治疗的状况的严重性；要施用的所选化合物的功效；施用途径；施用目的；和患者的肾脏和肝脏功能。
典型剂量范围为约0.01mg每天至约1000mg每天。对于每种治疗有效化合物的优选剂量范围为约0.1mg每天至约100mg每天，并且最优选的剂量范围为约1.0mg/天至约10mg/天，特别是约1-5mg/天。
在连续施用的情况中，例如在例如实施例中所示的“葡萄糖耐受试验”中在融合蛋白和任选的抗糖尿病药物和/或DPP-IV抑制剂的效果仍可测量的时间段内，施用各别化合物(individual compounds)(例如所述融合蛋白和任选的抗糖尿病药物和任选的DPP-IV抑制剂)。葡萄糖耐受试验为测定施用葡萄糖后葡萄糖多久从血液中清除的试验。葡萄糖最常口服施用(“口服葡萄糖耐量测试”或“OGTT”)。连续施用各别化合物(特别是所述融合蛋白)的时间段通常在1小时内，优选半个小时内，最优选15分钟内，尤其是5分钟内。
通常，向患者施用所述融合蛋白或所述药物组合物为每天一次或几次，或一周一次或几次，或甚至在更长的时间段内，视情况而定。最优选的本发明的融合蛋白或药物组合物应用为每天皮下施用一次至三次，如果能以组合剂量施用。
术语“代谢综合征”如用于本文指一种或多种增加发生心血管疾病和/或糖尿病的风险的医学病症。增加发生心血管疾病和/或糖尿病的风险的医学病症包括但不限于血脂障碍、脂肪肝病(FLD)、血糖异常(dysglycemia)、受损的葡萄糖耐受(IGT)、肥胖症和/或多脂。
心血管疾病是本领域已知的一类涉及心脏或血管(动脉和静脉)的疾病，例如但不限于动脉粥样硬化。
血脂障碍是血管中存在不正常量的脂质(例如胆固醇，特别是LDL胆固醇和/或脂肪如甘油三酯)的状况。在发达国家中，最多的血脂障碍是高脂血症；即血液中脂质(例如甘油三酯和/或LDL胆固醇)的升高，通常由饮食和生活方式引起。持续的胰岛素水平升高也可能导致血脂障碍。
脂肪肝病(FLD)是一种可逆的状况，其中由于脂肪变性(即脂肪在细胞内的不正常驻留)，甘油三酯脂肪的大液泡在肝脏细胞中积累。FLD可能有多种原因，然而，主要与过量醇摄入和肥胖症(伴有或没有胰岛素抗性作用)相关。
血糖异常指机体的糖代谢/能量产生机制失衡。糖尿病是特征在于存在高血糖的代谢病症。受损的葡萄糖耐受(IGT)是糖尿病前的血糖异常状态，其与胰岛素抗性和心血管病风险升高相关，并且可早于2型糖尿病许多年。
肥胖症是多余身体脂肪已经积累到其可能对健康产生不良作用的程度的医学状况，导致预期寿命的降低和/或健康问题的增多。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用，指任何肽连接的氨基酸链，无论其长度或翻译后修饰如何。可在本发明中使用的蛋白质(包括蛋白质衍生物、蛋白质变体、蛋白质片段、蛋白质区段、蛋白质表位和蛋白质结构域)可通过化学或生物修饰进一步修饰。这意味着这种经生物学或化学修饰的多肽包含除20种天然存在的氨基酸之外的其他化学基团。这样的其他化学基团的实例包括但不限于糖基化氨基酸、磷酸化氨基酸或共价连接的氨基酸链，例如用于稳定蛋白质/多肽(例如连接例如rPEG、XTEN或PAS)。修饰多肽可提供相比亲本多肽更有利的性质，例如增强的稳定性、增加的生物半衰期或增加的水溶性中的一种或多种。可用于在本发明中可用的变体的化学修饰包括但不限于：PEG化、非糖基化亲本多肽的糖基化或对亲本多肽中存在的糖基化模式的修饰、rPEG化、XTEN化或PAS化。
术语“XTEN”和/或“XTEN化”指包含氨基酸A,E,G,P,S和T的主要为非结构化的重组多肽。XTEN可具有约864个氨基酸的长度，但是也可更短(例如根据WO2010091122 A1的864个氨基酸的长多肽的片段)。术语XTEN化指XTEN与目标治疗性蛋白质(“装载物”)的融合物。如用于本文，XTEN可以融合至接头、至GLP-1R激动剂和/或至FGF-21化合物，或者也可以用作本文融合蛋白中两个蛋白质部分之间的接头或接头的一部分。XTEN化作用于增加治疗性蛋白质(即本文所述的本发明的融合蛋白)的血清半衰期。术语“XTEN”和/或“XTEN化”也指包含至少40个连续氨基酸的非结构化重组多肽(URP)，其中(a)URP中含有的甘氨酸(G)、天门冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基总和构成所述非结构化重组多肽的全部氨基酸的至少80％，并且剩余部分(当存在时)由精氨酸或赖氨酸组成，并且剩余部分不含甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
术语“PEG”和/或“PEG化”指将聚乙二醇(PEG)聚合物链共价连接至感兴趣的生物药物蛋白，如本发明的生物药物蛋白(包含GLP-1R激动剂和FGF-21化合物)。将PEG共价连接至感兴趣的生物药物蛋白能够掩蔽所述药剂免于宿主的免疫系统(降低的免疫原性和抗原性)，并增加感兴趣的生物药物蛋白的水动力学大小，这通过降低肾清除率来延长其循环时间(并由此调节所述感兴趣的生物药物蛋白的药代动力学)。如用于本文，PEG能够共价连接至接头，至GLP-1R激动剂，和/或至FGF-21化合物，或者也可用作本文融合蛋白中两个蛋白质部分之间的接头或接头的一部分。
术语“PAS”和/或“PAS化”指感兴趣的生物药物蛋白如本文的融合蛋白与由氨基酸Pro、Ala和Ser构成的构象上无序的多肽序列的遗传融合物(因此称作“PAS化”)。如用于本文，PAS可以融合至接头、至GLP-1R激动剂和/或至FGF-21化合物，或者也可用作本文融合蛋白中两个蛋白质部分之间的接头或接头的一部分。PAS化作用于增加感兴趣的蛋白质的血清半衰期，例如所述融合蛋白(作为参考，参见WO2008155134A1)。术语“PAS”和/或“PAS化”还指包含至少两个结构域的生物活性蛋白质，其中(a)所述两个结构域中的第一结构域包含具有和/或介导所述生物活性的氨基酸序列；并且(b)所述至少两个结构域中的第二结构域包含由至少约100个氨基酸残基组成的形成随机卷曲构象的氨基酸序列，并且其中所述第二结构域由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基组成，由此所述随机卷曲构象介导所述生物活性蛋白增加的体内和/或体外稳定性。在优选的实施方案中，所述第二结构域包含选自下组的氨基酸序列：
-ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:95)；
-AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:96)；
-APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:97)；
-SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:98)；
-SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:99)；
-AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:100)；
-ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:101).
The PAS化序列可含有一个或多个用于共价修饰的位点。
rPEG是具有类PEG的性质、具有增加的水动力学半径的多肽，其遗传融合至生物药物。如用于本文，rPEG可以融合至接头、至GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂和/或至FGF-21(成纤维细胞生长因子21)化合物，或者也可以用作本文融合蛋白中两个蛋白质部分之间的接头或接头的一部分。
弹性蛋白样多肽(ELP)是一类刺激物响应性生物聚合物，其物理化学性质和生物相容性适合于体内应用，如药物递送和组织工程。ELP的低临界溶解温度(LCST)表现使它们能够在它们的LCST之下用作可溶性大分子或在它们的LCST之上用作自组装纳米级颗粒如微团、微米级团聚体或粘性凝胶，取决于ELP结构。由于在其遗传水平上具体指定了每个ELP序列，ELP用肽和蛋白质的官能化通过将编码ELP的基因与感兴趣的肽或蛋白质的基因融合来实现。蛋白质ELP融合物(其中附加的蛋白质发挥治疗或靶向功能)适合于其中ELP能够改善蛋白质的系统药代动力学和生物分布的应用，或者可以用作注射用库(injectable depot)用于持续、局部的蛋白质递送。ELP中的重复单元是五肽(Val-Pro-Gly-X-Gly)，其中X是“访客残基”，其可以是脯氨酸以外的任何氨基酸(Hassouneh等,Methods Enzymol.2012；502:215–237)。如本文所述，ELP可以共价连接至接头、至至GLP-1R激动剂和/或至FGF-21化合物，或者也可以用作本文融合蛋白中两个蛋白质部分之间的接头或接头的一部分。
在本发明不同方面的上下文中，术语“肽”指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物。其与蛋白质具有相同的化学(肽)键，但是通常在长度上较短。最短的肽是二肽，由两个通过单一肽键结合的氨基酸组成。也可存在三肽、四肽、五肽等。优选地，所述肽具有多至8、10、12、15、18或20个氨基酸的长度。肽具有氨基末端和羧基末端，除非其是环肽。
在本发明不同方面的上下文中，术语“多肽”指通过肽键键合在一起的氨基酸的单一线性链，并且优选至少包含约21个氨基酸。多肽可以是由超过一条链组成的蛋白质中的一条链，或者其可以是蛋白质本身，如果蛋白质由一条链组成。
在本发明不同方面的上下文中，术语“蛋白质”指包含形成(resume)二级和三级结构的一个或多个多肽的分子，并且另外也指由几个形成四级结构的多肽(即几种亚基)构成的蛋白质。所述蛋白质有时具有连接的非肽基团，其可以称作辅基(prosthetic group)或辅因子。
在本发明的上下文中，蛋白质或多肽的一级结构是多肽链中的氨基酸顺序。蛋白质中的二级结构是蛋白质的局部区段的大致三维形式。然而，其不描述三维空间中具体的原子位置，这被认为是三级结构。在蛋白质中，二级结构由骨架酰胺和羧基基团之间的氢键模式限定。蛋白质的三级结构是通过原子坐标决定的蛋白质的三维结构。四级结构是多亚基复合物中多个折叠或卷曲的蛋白质或多肽分子的排列。术语“氨基酸链”和“多肽链”在本发明的上下文中以同义使用。
术语“核酸”或“核酸分子”以同义使用，并且理解为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或二者的单链或双链寡聚物或聚合物。典型地，核酸通过单独核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成。在本发明的上下文中，术语核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)分子。对单链核酸的描述也限定(至少部分地)互补链的序列。核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列二者的部分。核酸可以通过生物、生物化学或化学合成方法或任何本领域已知的方法获得。如用于本文，术语“核酸”包括术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”。
在本发明不同方面的上下文中，术语核酸包含cDNA、基因组DNA、重组DNA、cRNA和mRNA。核酸可以由完整基因或其部分组成，所述核酸也可为微RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。miRNA是平均仅22个核苷酸长的短核糖核酸(RNA)分子，存在于所有真核细胞中。微小RNA(miRNA)是转录后调节物，其结合至目标信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列，通常导致翻译阻遏和基因沉默。小干扰RNA(siRNA)，有时也称作短干扰RNA或沉默RNA，是长度在20-25个核苷酸的短核糖核酸(RNA分子)。它们残余RNA干扰(RNAi)途径，在该途径中它们干扰特定基因的表达。核酸也可以是人工核酸。人工核酸包括聚酰胺或肽核酸(PNA)，吗啉代和锁定核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每种与天然存在的DNA或RNA的区别在于对分子骨架的改变。
核酸可以例如化学合成，例如根据磷酸三酯法(参见，例如，Uhlmann,E.&Peyman,A.(1460)Chemical Reviews,90,543-584)。
适配体是以高亲和力与多肽结合的核酸。适配体可以通过选择方法如SELES(参见例如Jayasena(1469)Clin.Chem.,45,1628-50；Klug and Famulok(1464)M.Mol.Biol.Rep.,20,97-107；US 5,582,981)从不同单链RNA分子的大型池中分离。适配体也可以以它们的镜像形式合成和选择，例如作为L-核糖核苷酸(Nolte等(1466)Nat.Biotechnol.,14,1116-9；Klussmann等(1466)Nat.Biotechnol.,14,1112-5)。以这种方式分离的形式享有的优势是它们不被天然存在的核糖核酸酶降解，并因此具有更好的稳定性。核酸可被内切核酸酶或外切核酸酶降解，特别是细胞中可能存在的DNA酶和RNA酶。因此，有利的是修饰所述核酸，从而使其针对降解稳定，由此确保在长时间范围内细胞中维持高浓度的核酸(Beigelman等(1465)Nucleic Acids Res.23:3989-94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116)。典型地，通过引入一个或多个核苷酸间磷基团或通过引入一个或多个非磷核苷酸间基团(non-phosphorusinternucleotide)可获得这种稳定化。适当修饰的核苷酸间基团汇编在Uhlmannand Peyman(1460)中，参见上文(同样案件Beigelman等(1465)Nucleic AcidsRes.23:3989-94；WO 95/11910；WO 98/37240；WO 97/29116)。在根据本发明的用途之一中能够使用的核酸中经修饰的核苷酸间磷酸基团和/或非磷桥接含有，例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或磷酸酯，而非磷核苷酸间类似物含有，例如，硅氧烷桥接、碳酸桥接、羧甲基酯、乙酰胺桥接和/或硫醚桥接。其目的还在于这种修饰应该可改进根据本发明的用途之一使用的药物组合物的持久性。
现将在详述中更详细地描述本发明。
发明详述
在下文中，将详细描述本发明的不同方面和实施方案。
本发明的不同方面、优选方面和实施方案可以彼此组合，除非有明确的相反说明。本发明的任何方面或优选方面的任何实施方案可以与本发明任何其他方面或优选方面的任何实施方案组合，除非有明确的相反说明。
在第一方面，本发明涉及融合蛋白，其包含具有结构A-B-C或C-B-A或B-A-C或B-C-A或A-C-B或C-A-B或A-B-C-B-C或A-C-B或A-B-C-B或A-C-B-C的多肽，其中
A是GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂，且
C是FGF-21(成纤维细胞生长因子21)化合物，且
B是包含约0、1至1000个氨基酸的接头。
所述组分A-B-C优选从融合蛋白的氨基端(N-端)至羧基端(C-端)排列，从而使所述融合蛋白具有A-B-C或C-B-A或B-A-C或B-C-A或A-C-B或C-A-B或A-B-C-B-C或A-C-B或A-B-C-B或A-C-B-C结构。根据优选的实施方案，所述组分从融合蛋白的N-端至C-端具有排列A-B-C。
根据本发明的第一和其他方面的FGF-21化合物可以是任何具有FGF-21活性的多肽，并且优选是FGF-21化合物，并且优选是根据如本文所述的SEQID NO:3的FGF-21化合物。
根据本发明的第一和其他方面的一个实施方案，所述FGF-21化合物是天然FGF-21或FGF-21模拟物或根据SEQ ID NO:3的FGF-21。根据本发明的第一和其他方面的优选实施方案，所述FGF-21模拟物可以是例如与SEQID NO:3中所示氨基酸序列具有至少约96％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质，或具有FGF-21活性的FGF-21融合蛋白或具有FGF-21活性的FGF-21缀合物。所述FGF-21模拟物可以是例如FGF-21突变蛋白、FGF-21-Fc融合蛋白、FGF-21-HSA融合蛋白和/或聚乙二醇化FGF-21。
本发明的第一和其他方面的融合蛋白中包含的GLP-1R激动剂可以是任何具有GLP-1受体-激动作用的多肽，并且优选是如本文所述的GLP-1R激动剂。在本发明的融合蛋白的一个实施方案中，所述GLP-1R激动剂是生物活性的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1替代物。在本发明的融合蛋白的优选实施方案中，所述GLP-1R激动剂是例如GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺、毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、CJC-1131、albugon、阿必鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽-LAR、胃泌酸调节素、利西拉肽、京尼平苷或具有GLP-1R激动活性的短肽。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽且B是IEGR。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是根据SEQ IDNO:3的FGF-21化合物且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽且B是IEGR。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白，包括SEQ ID NO:2或102。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，C是艾塞那肽。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是根据SEQ IDNO:3的FGF-21化合物。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白，包括SEQ ID NO:2或102，且C是艾塞那肽。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白，包括SEQ ID NO:102，且所述接头B是IEGR。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，所述接头B是IEGR且C是艾塞那肽。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是根据SEQ IDNO:3的FGF-21化合物且C是艾塞那肽。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，A是根据SEQ ID NO:3的FGF-21化合物且所述接头B是IEGR。在本发明的融合蛋白的另一优选实施方案中，所述接头B是IEGR且C是艾塞那肽。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中，A是FGF-21突变蛋白，包括SEQ ID NO:2或102，所述接头B是IEGR，且C是艾塞那肽。
在本发明的第一和其他方面的另一优选实施方案中,A是根据SEQ IDNO:3的FGF-21化合物，所述接头B是IEGR，且C是艾塞那肽。
所述融合蛋白还可在组分A、B和C之外包含其他组分。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含与接头中用于共价修饰的进入位点共价连接的部分D。
例如，共价连接的一个或多个部分D可以为融合蛋白赋予增加的半衰期或稳定性，使蛋白质靶向患者体内的一些分子或细胞靶标，吸引免疫系统，增加融合蛋白的功效等。连接的部分可以是肽/多肽、核酸、糖、脂肪酸、有机分子或其组合。根据一个实施方案，所述一个或多个部分D选自下列：
a)靶向单元，如抗体或蛋白质结合支架或适配体
b)蛋白质稳定化单元，如羟乙基淀粉衍生物(HES)或聚乙二醇或其衍生物(PEG或PEG衍生物)；
c)脂肪酸；
d)糖。
本发明的融合蛋白也可包含其他组分，如用于蛋白质纯化的标记；例如His标记。在一个实施方案中，所述标记与融合蛋白在末端连接(N-或C-端)。
在第二方面，本发明涉及本发明的融合蛋白，其用作药物的用途。
在本发明的第二和其他方面的一个实施方案中，所述医药用途是在对疾病或病症的治疗中的用途，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或FGF-21功效的提高有益于所述疾病的治疗、预防或改善。
在本发明的第二和其他方面的另一实施方案中，所述医药用途是在对心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病和/或糖尿病风险的代谢综合征优选2型糖尿病的治疗中的用途。
在本发明的第二和其他方面的另一实施方案中，所述医药用途是在降低血浆葡萄糖水平中、在降低肝脏中脂质含量中、用于治疗高脂血症、用于治疗高血糖、用于增加葡萄糖耐受、用于降低胰岛素耐受、用于增加体温和/或用于降低重量的用途。
在本发明的第二和其他方面的另一实施方案中，所述医药用途进一步涉及施用至少一种抗糖尿病药物和/或至少一种DPP-IV(二肽基肽酶-4)抑制剂。在这种实施方案中，所述融合蛋白和抗糖尿病药物和/或所述DPP-IV抑制剂可以与所述融合蛋白同时或顺序施用。这意味着，可考虑以下施用方案：将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白同时施用，将抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用，将DPP IV-抑制剂和抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用，将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将抗糖尿病药物与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂和抗糖尿病药物与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白同时施用而将抗糖尿病药物与包含融合蛋白的组合物的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白顺序(即在之前或之后)施用而将抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用。
本发明第二和其他方面的抗糖尿病药物可为任何具有抗糖尿病活性的药剂或药物，并且优选任何如本文所述的抗糖尿病药物。在本发明的第一和其他方面的一些实施方案中，所述抗糖尿病药物是二甲双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、胰岛素或这些抗糖尿病药物中两种、三种或四种的组合。
本发明第二和其他方面的DPP-IV抑制剂可以是任何具有DPP-IV拮抗或抑制作用的药剂或药物。在本发明的第一和其他方面的一些实施方案中，DPP-IV抑制剂是西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、adogliptin或黄连素，或这些DPP-IV抑制剂中两种、三种、四种、五种、或六种的组合。
第二方面的其他实施方案和细节还可取自本文所述的其他方面、概述、实施例或其任何其他部分。第二方面的融合蛋白的实施方案和优选实施方案在讨论本发明第一方面的部分中详细描述，并在本文的概述部分、定义部分和实施例部分中也有描述。关于医药用途、适应症、患者群体、施用或剂量方案的进一步细节可取自例如本文所述的本发明的第六、第七或第八方面的描述。
在第三方面，本发明涉及包含本发明的融合蛋白与可药用赋形剂一起的药物组合物。
本文描述并且特别是在本发明的第一、第三和其他方面的上下文中的融合蛋白可以例如配制成中性或盐形式。可药用盐包括与游离氨基形成的那些盐，如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与游离羧基形成的那些盐，例如但不限于源自钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
第三方面的其他实施方案和细节还可取自本文所述的其他方面、概述、实施例或其任何其他部分。第二方面的融合蛋白的实施方案和优选实施方案在讨论本发明第一方面的部分中详细描述，并在本文的概述部分、定义部分和实施例部分中也有描述。
在第四方面，本发明涉及本发明的融合蛋白或包含本发明的融合蛋白以及可药用赋形剂的药物组合物用作药物的用途。
在本发明的第四和其他方面的一个实施方案中，所述药物组合物用于在对疾病或病症的治疗中的用途，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或FGF-21功效的提高有益于所述疾病的治疗、预防或改善。
在本发明的第四和其他方面的另一实施方案中，所述药物组合物用于在对心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病的代谢综合征的治疗中和/或用于在对糖尿病优选2型糖尿病的治疗中的用途。
在本发明的第四和其他方面的另一实施方案中，所述医药用途是在降低血浆葡萄糖水平中、在降低肝脏中脂质含量中、用于治疗高脂血症、用于治疗高血糖、用于增加葡萄糖耐受、用于降低胰岛素耐受、用于增加体温和/或用于降低重量的用途。
在本发明的第四和其他方面的另一实施方案中，所述药物组合物的医药用途进一步涉及施用至少一种抗糖尿病药物和/或至少一种DPP-IV(二肽基肽酶-4)抑制剂。在这种实施方案中，例如可将抗糖尿病药物和任选地DPP-IV抑制剂或其二者与包含融合蛋白的药物组合物同时或顺序施用。这意味着，可考虑以下施用方案：将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白同时施用，将抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用，将DPP IV-抑制剂和抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用，将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将抗糖尿病药物与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂和抗糖尿病药物与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂与包含所述融合蛋白的药物组合物同时施用而将抗糖尿病药物与包含融合蛋白的组合物的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂与所述包含融合蛋白的药物组合物顺序(即在之前或之后)施用而将抗糖尿病药物与包含所述融合蛋白的组合物同时施用。
用于本发明第四和其他方面的用途的抗糖尿病药物可以是任何如上所述的本发明第一方面的抗糖尿病药物，并且优选二甲双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲或胰岛素，或这些抗糖尿病药物中两种、三种或四种的组合。
用于本发明第四和其他方面的用途的DPP-IV抑制剂可以是任何如上所述的本发明第一方面的抗糖尿病药物，并且优选西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、adogliptin或黄连素，或这些DPP-IV抑制剂中两种、三种、四种、五种、或六种的组合。
在本发明的第四或任何其他方面中，所述融合蛋白、抗糖尿病药物和DPP-IV抑制剂可以包含在一个制剂中或包含在单独的制剂中。
在本发明的第四或其他方面的一个实施方案中，所述融合蛋白和抗糖尿病剂包含在一个制剂中。在本发明第二和其他方面的另一实施方案中，所述融合蛋白和抗糖尿病药剂包含在单独药剂中。
在本发明第四和任何其他方面的一个实施方案中，所述任何蛋白和DPP-IV抑制剂包含在一个制剂中。在本发明第二和其他方面的另一实施方案中，所述融合蛋白和DPP-IV抑制剂包含在单独药剂中。
在本发明第四和任何其他方面的一个实施方案中，所述抗糖尿病药物和DPP-IV抑制剂包含在一个制剂中。在本发明第二和其他方面的另一实施方案中，所述抗糖尿病药物和DPP-IV抑制剂包含在单独药剂中。
在本发明第四和任何其他方面的一个实施方案中，抗糖尿病药物和DPP-IV抑制剂合并在一个制剂中，而所述融合蛋白包含在单独制剂中。在本发明第二和其他方面的另一实施方案中，所述抗糖尿病药物和所述融合蛋白包含在一个制剂中，而所述DPP-IV抑制剂包含在单独制剂中。在本发明第二和其他方面的其他方面中，所述融合蛋白和DPP-IV抑制剂包含在一个制剂中，而所述抗糖尿病药物包含在单独制剂中。
在本发明第四和任何其他方面的另一实施方案中，所述DPP-IV抑制剂和抗糖尿病药物和融合蛋白全部博涵在单独制剂中。在本发明第二或任何其他方面的又一实施方案中，所述DPP-IV抑制剂和抗糖尿病药物和融合蛋白合并在一个制剂中。
第四方面的其他实施方案和细节还可取自本文所述的其他方面。例如，关于医药用途、适应症、患者群体、施用或剂量方案的进一步细节可取自本文所述的本发明的第二、第六、第七或第八方面的描述。例如，关于融合蛋白的进一步细节可取自第一方面、概述定义部分、实施例或附图的描述。
在第五方面，本发明涉及制品，包含
a)本发明的融合蛋白或药物组合物，和
b)容器或包装材料。
关于用于第五方面制品上下文中的融合蛋白的某些实施方案可取自上述第一方面的描述，取自概述、定义部分或实施例部分。关于用于第五方面制品上下文中的药物组合物的某些实施方案可取自上文描述的第三方面，取自概述、定义部分或实施例部分。关于用于第五方面制品上下文中的医药用途的某些实施方案可取自上文描述的第二、第四或第六至第八方面，取自概述、定义部分或实施例部分。
进一步的实施方案将在在下文描述：
在一些实施方案中，所述制品可额外包含
c)包含DPP-IV抑制剂的药物组合物，或
d)包含抗糖尿病药物的药物组合物，或
e)二者(a和b)。
所述制品可进一步包含一种或多种数据载体。所述数据载体可以是有益于所述制品使用的数据的任何载体。所述数据载体可以例如是标签、包装插页、数据数据载体如芯片、条形码等。包含在所述数据载体之中或之上的信息可以是例如以下的一项或多项：
a)对根据本发明任一方面(例如第一或第二方面)或如概述或定义部分中所述或如实施例部分中所述的医药用途的涉及，和/或对本发明任一方面(例如第六、第七、第八或第九方面)的治疗方法的涉及，
b)所述制品的储存条件(例如温度、湿度、对光的曝露)和/或其组分的储存条件(例如缓冲液的储存条件、治疗剂或包含所述治疗剂(即包含所述融合蛋白、DPP-IV抑制剂或抗糖尿病药剂或这些中的两种或三种)的药物组合物或单位剂量形式的储存条件)
c)所述制品的批号(lot number)或批次号(batch number)
d)制品和任选地其组分的组成
e)制品和任选地其组分的操作说明
f)制品的有效期(优选如果储存在表明的储存条件下)，其中所述有效期可指制品整体、其单独组分的有效期，或制品或其单独组分在打开包含一种或多种所述组分的包装或包装材料之后的有效期(或二者兼有)。
制品可进一步包含一种或多种用于施用所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物的装置，和所述装置的使用说明。如果所述装置是预填充装置，那么所述装置优选含有表明含量的标签，并且更优选还有有效期。
根据本发明第五方面的一个实施方案，所述制品包含以下组分中的一种或多种：
a)一个或多个包含所述融合蛋白的单位剂量形式
b)一个或多个包含所述抗糖尿病药物的单位剂量形式
c)一个或多个包含所述DPP-IV抑制剂的单位剂量形式
d)数据载体，所述数据载体优选包含标签或包装插页；
e)用于施用所述融合蛋白的装置，如注射器和所述装置的使用说明。
所述制品中的融合蛋白可以例如配制成供溶解的干燥制剂，优选包含在紧密密封的容器如小瓶、安瓿或小药囊中。
所述制品中的融合蛋白也可以配制成液体制剂，优选包含在紧密密封的容器如小瓶、小药囊、预填充注射器、预填充自动注射器或用于可重复使用的注射器或施用器的药筒中。
本发明的制品也可包含一个或多个抗糖尿病药物的单位剂量形式，其作为片剂或胶囊或其他用于口服施用的制剂在紧密密封的容器或吸塑包装(blister)中。
本发明的制品也可包含一个或多个DPP-IV抑制剂的单位剂量形式，其作为片剂或胶囊或其他用于口服施用的制剂在紧密密封的容器或吸塑包装中。
含有所述包含融合蛋白或任何其他治疗剂或药物组合物的单位剂量形式的容器或吸塑包装适合含有标签，所述标签表明
a)含量(如活性成分和可能的任何赋形剂的身份和量)，并且优选还有
b)有效期，并且可能还有
c)活性成分(所述融合蛋白和/或DPP-IV抑制剂和/或抗糖尿病药物)或制品的储存条件。
根据一个实施方案，所述制品包含充分的单位剂量形式的所述融合蛋白，并且优选还包含充分的单位剂量形式的所述抗糖尿病药物或DPP IV-抑制剂，或充分的单位剂量形式的所述融合蛋白和抗糖尿病药物和DPP IV-抑制剂，以供一次单一的，以供两周(即14天)治疗，以供四周(即28天)治疗或以供一个月治疗，所述治疗使用融合蛋白和优选地所述抗糖尿病药物或DPP IV-抑制剂或使用融合蛋白和所述抗糖尿病药物和所述DPP IV-抑制剂。
根据另一实施方案，所述制品包含充分的单位剂量形式的融合蛋白和任选地抗糖尿病药物或DPP-IV抑制剂或其二者，以供每日施用方案，并且更优选地以供在一天、一周、两周或四周/一个月的治疗期内的每日施用方案。
制品中任选包含的一种或多种装置可以是用于施用任何或全部治疗剂(融合蛋白、DPP-IV抑制剂、抗糖尿病药剂)的任何装置，可以是例如注射器或其他类型的注射装置。特别适合将所述活性剂被配置成注射溶液或供溶解和后续注射施用的干粉制剂。在这种情况下，可能适合的是所述装置或注射器是预填充的或适合于皮下注射或预填充和适合于皮下注射二者兼有。
在第六方面，本发明涉及治疗患者的疾病或病症的方法，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或其中FGF-21功效的增加有益于所述疾病或病症的治疗、预防或改善，其中所述方法包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
在第七方面，本发明涉及治疗患者的心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病和/或糖尿病风险的代谢综合征优选2型糖尿病的方法的方法，包括向所述患者施用融合蛋白或药物组合物。
在第八方面，本发明涉及为患者降低血浆葡萄糖水平、降低肝脏中脂质含量、治疗高脂血症、治疗高血糖、增加葡萄糖耐受、降低胰岛素耐受、增加体温和/或降低重量的方法，包括向所述患者施用本发明的融合蛋白或药物组合物
关于用于治疗方法的上下文中的融合蛋白的某些实施方案可取自上述第一方面的描述，取自概述、定义部分或实施例部分。关于用于本文描述的治疗方法的上下文中的药物组合物的某些实施方案可取自上文描述的第三方面，取自概述、定义部分或实施例部分。关于用于本文描述的治疗方法的上下文中的医药用途的某些实施方案可取自上文描述的第二方面，取自概述、定义部分或实施例部分。本文描述的治疗方法的进一步实施方案将在在下文描述：
在第六、第七或第八方面的一个实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种抗糖尿病药物或施用二肽基肽酶-4(DPP-IV)抑制剂或二者。
在本发明的第六、第七或第八方面的另一实施方案中，所述治疗方法进一步涉及施用至少一种抗糖尿病药物和/或至少一种DPP-IV(二肽基肽酶-4)抑制剂。在这种实施方案中，例如可将所述抗糖尿病药物和任选地DPP-IV抑制剂或其二者与包含融合蛋白的药物组合物同时或顺序施用。这意味着，可考虑以下施用方案：将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白同时施用，将抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用，将DPP IV-抑制剂和抗糖尿病药物与所述融合蛋白同时施用，将DPP-IV抑制剂与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将抗糖尿病药物与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂和抗糖尿病药物与所述融合蛋白的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂与包含所述融合蛋白的药物组合物同时施用而将抗糖尿病药物与包含融合蛋白的组合物的施用顺序(即在之前或之后)施用，将DPP-IV抑制剂与所述包含融合蛋白的药物组合物顺序(即在之前或之后)施用而将抗糖尿病药物与包含所述融合蛋白的组合物同时施用。
用于本发明第六、第七和第八方面的用途的抗糖尿病药物可以是任何如上所述的本发明第一方面的抗糖尿病药物，并且优选二甲双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲或胰岛素，或这些抗糖尿病药物中两种、三种或四种的组合。
用于本发明第六、第七和第八方面的用途的DPP-IV抑制剂可以是任何如上所述的本发明第一方面的抗糖尿病药物，并且优选西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、adogliptin或黄连素，或这些DPP-IV抑制剂中两种、三种、四种、五种、或六种的组合。
在本发明的第六、第七和第八方面的一个实施方案中，所述融合蛋白在与抗糖尿病药物或DPP-IV抑制剂或其二者相同的时间向患者施用。
在本发明的第六、第七和第八方面的另一实施方案中，所述融合蛋白在抗糖尿病药物或DPP-IV抑制剂或其二者之前或之后向患者施用。
在本发明的第六、第七和第八方面的一个实施方案中，所述代谢综合征选自血脂障碍、脂肪肝病(FLD)、血糖异常(dysglycemia)、受损的葡萄糖耐受(IGT)、肥胖症、多脂和2型糖尿病。
第六、第七和第八方面的心血管疾病可以例如是动脉粥样硬化。
在本发明第六、第七和第八方面的上下文中治疗的患者优选选自：1型糖尿病患者、2型糖尿病患者，饮食治疗的2型糖尿病患者、磺酰脲治疗的2型糖尿病患者、极晚期2型糖尿病患者和/或长效胰岛素治疗的2型糖尿病患者。
在本发明第六、第七和第八方面的一些实施方案中，在糖尿病患者中使血浆葡萄糖水平降低，使肝脏中脂质含量降低，使葡萄糖耐受增加，使胰岛素耐受增加，使体温增加，和/或使重量降低，所述糖尿病患者优选选自1型糖尿病患者、2型糖尿病患者，特别是饮食治疗的2型糖尿病患者、磺酰脲治疗的2型糖尿病患者、极晚期2型糖尿病患者和/或长效胰岛素治疗的2型糖尿病患者。根据优选的实施方案，所述患者是哺乳动物并且特别是人。
在本发明第一、第二、第五、第六、第七或第八方面的不同医药用途和治疗方法的上下文中，适合向患者使用治疗有效量的融合蛋白或药物组合物或任选地抗糖尿病药物或DPP IV-抑制剂或其二者。
在本发明第一、第二、第五、第六、第七或第八方面的不同医药用途和治疗方法的上下文中，所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物的施用可根据任何可用的施用方案，其足以将充分的活性物质或活性剂递送至患者体内。根据一个实施方案，所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物的施用是皮下施用。
在本发明第一、第二、第五、第六、第七或第八方面的不同医药用途和治疗方法的上下文中，DPP-IV抑制剂的施用可根据任何可用的施用方案，其足以将充分的活性物质或活性剂递送至患者体内。依赖于使用的DPP-IV抑制剂，这可以经口、口服、皮下、肌内、肺部、吸入和/或通过缓释施用。在一个合适的实施方案中，所述DPP-IV抑制剂口服施用。
在本发明第一、第二第五、第六、第七或第八方面的不同医药用途和治疗方法的上下文中，抗糖尿病药物的施用可根据任何可用的施用方案，其足以将充分的活性物质或活性剂递送至患者体内。依赖于使用的抗糖尿病药物，这可以经口、口服、皮下、肌内、肺部、吸入和/或通过缓释施用。在一个合适的实施方案中，所述抗糖尿病药物口服施用。
在第九方面，本发明涉及编码本发明的融合蛋白的核酸，优选包含以下核酸序列之一或由其组成：
a)根据具有ID NOs:27-38的序列之一的核酸序列
b)编码根据SEQ ID NOs:15-26和39-44的蛋白质序列的核酸
c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸。
在第十方面，本发明涉及包含本发明核酸的载体，所述载体适合于在真核或原核宿主中表达编码的蛋白质。
载体是环状或线性的多核苷酸分子，例如DNA质粒、噬菌体或粘粒，在其帮助下多核苷酸片段(例如从其他载体切出的或通过PCR扩增的，并插入至克隆载体中)能够在合适的宿主中特异性地扩增(即克隆)。合适的生物体大多为具有高增殖速率的单细胞生物体，像是例如细菌或酵母。合适的生物体也可以是从多细胞组织分离和培养的细胞，像是例如从各种生物体(例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的SF9细胞等)生成的细胞系。合适的克隆载体在本领域是已知的，并且可在各种生物技术供应商处以商业方法获得，所述供应商像是例如Roche Diagnostics,New England Biolabs,Promega,Stratagene和许多其他供应商。例如合适的细胞系可在美国典型培养物保藏中心(ATCC)处以商业方法获得。
在第十一方面，本发明涉及稳定或瞬时携带本发明的载体并且能够在合适的培养条件下表达本发明的融合蛋白的细胞。
所述细胞可以是能够用核酸载体转染并且能够表达基因的任何原核或真核细胞。理论上，这些包括原代细胞和来自细胞培养物的细胞，所述细胞培养物优选真核细胞培养物或原核细胞培养物，所述真核细胞培养物包含或者源自多细胞生物体和组织(如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或者源自单细胞生物体如酵母(例如裂殖酵母(S.pombe)或酿酒酵母(S.cerevisiae))的细胞，所述原核细胞培养物优选毕赤酵母属(Pichia)或大肠杆菌。源自组织的细胞和样品可以通过熟知的技术获得，如采血、组织穿刺或外科手术技术。
在第十二方面，本发明涉及制备本发明的融合蛋白的方法，包括：
a)在用于所述融合蛋白在细胞中表达的合适培养条件下培养本发明的细胞的培养物，或
b)从培养物收获或纯化所述融合蛋白，所述培养物包含已经在用于所述融合蛋白表达的合适条件下培养的本发明的细胞，或
c)根据步骤a)培养本发明的细胞并根据步骤b)纯化融合蛋白，和任选地
d)使用蛋白酶切割His标记，如果所述融合蛋白是包含His标记的融合蛋白。
用于实施本发明第九、第十、第十一和第十二方面的方法，以及用于生成根据本发明第一方面的蛋白质的方法可以从概述、定义部分、以下分子学方法部分、引用的关于标准方法的文献以及从实施例部分获得。
用于克隆和表达蛋白质的分子生物学方法
用于克隆核酸和表达蛋白质的方法是本领域熟知的。关于克隆和生成本发明的蛋白质和核酸的一些一般性参考文献将在下文提供，而不意在限制。
制备重组多肽或多核苷酸分子和从细胞或组织纯化天然存在的分子，以及制备细胞或组织提取物是本领域技术人员熟知的(同样参见例如上文所列的标准文献)。
这些包括例如通过聚合酶链式反应(PCR)基于公布的基因组或编码多核苷酸序列扩增期望长度的多核苷酸，和后续将产生的多核苷酸克隆至宿主细胞中(参见例如下文所列的标准文献)。
PCR是能够特异性扩增序列段的体外技术，所述序列段在其5’和3’附近具有序列已知的核苷酸段。为了扩增所选序列，使用短的单链DNA分子(“引物”)，其与框出待扩增多核苷酸序列的序列段互补。多核苷酸模板可以是DNA或RNA。通过选择在限定温度并以限定时间间隔进行的限定顺序的温育步骤，使其周期性重复，指数扩增感兴趣的多核苷酸。
合适的引物可以根据熟知流程借助化学合成生成。这些引物也可以商业方法通过商业供应商获得。
DNA和RNA模板，还有cDNA模板，可借助熟知的标准流程获得(如借助克隆载体克隆的DNA模板；从培养的细胞、组织等制备基因组DNA或RNA，或从这些RNA来源等制备cDNA，参见，例如下文的标准文献)，并且也可购自商业供应商，如Promega和Stratagene等。用于实施PCR的合适的缓冲液和酶以及反应方案是本领域已知的，并且也可以商业方法获得。反应产物可以通过已知流程纯化(例如凝胶纯化或柱纯化)。
生成分离的多核苷酸的另一方法是克隆期望的序列，和其之后借助标准方法的完全或部分纯化。为了生成分离的多肽，将多核苷酸克隆至表达载体中，并使多肽在合适的宿主细胞(优选单细胞生物体如合适的细菌或酵母菌株)中表达，其后是后续的对多肽进行的完全或部分纯化。
产生分离的核酸分子的方法是本领域熟知的。这些包括例如通过聚合酶链式反应(PCR)基于公布的基因组或编码多核苷酸序列扩增期望长度的多核苷酸，和后续将产生的多核苷酸克隆至宿主细胞中。
PCR(聚合酶链式反应)是能够特异性扩增序列段的体外技术，所述序列段在其5’和3’附近具有序列已知的核苷酸段。为了扩增给定序列，已知待扩增序列的5’去的序列是足够的。在这种情况下，首先生成待扩增的多核苷酸的片段(这可以通过已知技术进行，如用限制性内切核酸酶消化)。接下来，将序列已知的DNA分子(“接头”)借助连接酶(如T4DNA连接酶，其可从不同供应商通过商业方法获得)偶联至生成的多核苷酸片段的3’端。如此所得序列被两个已知序列(已知的5’序列和3’的已知接头序列)包围，使得通过PCR的特异性扩增能够进行(在这种情况下，为接头介导的PCR“lmPCR”)。
为了扩增所选序列，使用短的单链DNA分子(“引物”)，其与框出待扩增多核苷酸序列的序列段互补。多核苷酸模板可以是DNA或RNA。然后在限定且熟知的条件下，通过称为聚合酶的特定的酶(或为识别作为模板的DNA并产生互补DNA多核苷酸的DNA聚合酶，或为识别作为模板的RNA并产生互补DNA多核苷酸的反转录酶)，将引物退火至单链模板并延伸，如此致使新DNA链的生成，所述新DNA链具有与模板链的序列互补的序列。通过选择在限定温度下并以限定时间间隔进行的限定顺序的温育步骤，将其周期性重复，生成变性/退火/扩增步骤的顺序，最终使感兴趣的多核苷酸指数扩增。为了能够施加必需的温度用于变性而不破坏聚合酶，使用热稳定酶，其良好耐受高如95℃和更高的温度，如Taq-DNA聚合酶(来自水生栖热菌(thermusaquaticus)DNA聚合酶)、PFU等，二者均可从不同供应商通过商业方法获得。合适的聚合酶的选择依赖于使用目的(例如对于通过PCR的克隆，优选选择具有校正能力的聚合酶如PFU)并且属于本领域人员的技术。
典型PCR反应包含多核苷酸模板(例如0,01-20ng)、两个合适的引物(每种以例如0,2-2μM的浓度)、dNTPs(每种以例如200μM的浓度)、1-2mMMgCl2和1-10个单位的热稳定聚合酶，如Taq。典型的组分和缓冲液是本领域技术人员熟知的，并且通常可通过商业供应商获得。
合适的引物可以借助化学合成根据熟知的方案生成。这些引物也可通过不同给商业供应商通过商业方法获得。
DNA和RNA模板，还有还有cDNA模板，可借助熟知的标准流程获得(参见，例如下文的标准文献)，并且也可购自商业供应商，如Promega和Stratagene等。用于实施PCR的合适的缓冲液和酶是本领域已知的，并且也可以通过商业方法获得。
借助本领域熟知的特定载体，分离的多肽，例如根据本发明的融合蛋白可以使用亚克隆的多核苷酸产生。这优选通过在合适的宿主细胞中的表达来进行，所述宿主细胞例如细菌(优选大肠杆菌菌株)或真核宿主(例如SF9细胞、酵母细胞等)。为此，将多核苷酸亚克隆至适合于所选宿主细胞类型的表达载体中，再引入所选宿主细胞中。本领域熟知用于转化和转染的合适方法，以及用于细胞培养和异源蛋白表达诱导的条件(参见例如下文所列的标准文献)。
关于标准实验方法的文献
除非另行说明，否则标准实验方法根据或可以根据以下标准文献来进行：
Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Secondedition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.545pp；
Current Protocols in Molecular Biology；定期更新，例如2000卷；Wiley&Sons,Inc；Editors:Fred M.Ausubel,Roger Brent,Robert Eg.Kingston,David D.Moore,J.G.Seidman,John A.Smith,Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics；定期更新；Wiley&Sons,Inc；Editors:Nicholas C.Dracopoli,Honathan L.Haines,Bruce R.Korf,Cynthia C.Morton,Christine E.Seidman,J.G.Seigman,Douglas R.Smith.
Current Protocols in Protein Science；定期更新；Wiley&Sons,Inc；Editors:John E.Coligan,Ben M.Dunn,Hidde L.Ploegh,David W.Speicher,Paul T.Wingfield.
Molecular Biology of the Cell；第三版；Alberts,B.,Bray,D.,Lewis,J.,Raff,M.,Roberts,K.,Watson,J.D.；Garland Publishing,Inc.New York&London,1994；
Short Protocols in Molecular Biology,第五版，Frederick M.Ansubel(Editor),Roger Brent(Editor),Robert E.Kingston(Editor),David D.Moore(Editor),J.G.Seidman(Editor),John A.Smith(Editor),Kevin Struhl(Editor),October 2002,John Wiley&Sons,Inc.,New York“
Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook.C.A.Pinkert,editor；Academic Press Inc.,San Diego,California,1994(ISBN:0125571658)
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优选的方面
在下文中，列出了本发明优选的方面。
1.一种融合蛋白，其包含具有结构A-B-C或C-B-A或B-A-C或B-C-A或A-C-B或C-A-B或A-B-C-B-C或A-C-B或A-B-C-B或A-C-B-C的多肽，其中
A是GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂，且
C是FGF-21(成纤维细胞生长因子21)化合物，且
B是包含约0、1-1000个氨基酸的接头。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述接头包含赋予除连接A和C的功能之外的一种或多种其他功能的功能性部分。
3.根据权利要求1或2的融合蛋白，其中所述接头是肽接头。
4.根据权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述FGF-21化合物选自天然FGF-21或FGF-21模拟物。
5.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约96％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
6.根据权利要求4或5的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自FGF-21突变蛋白、FGF-21-Fc融合蛋白、FGF-21-HSA融合蛋白和/或聚乙二醇化FGF-21。
7.根据权利要求1-6中任一项的融合蛋白，其中所述GLP-1R激动剂选自生物活性的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1替代物。
8.根据权利要求1-7中任一项的融合蛋白，其中所述GLP-1R激动剂选自GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺、毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、CJC-1131、albugon、阿必鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽-LAR、胃泌酸调节素、利西拉肽、京尼平苷或具有GLP-1R激动活性的短肽。
9.根据权利要求1-8中任一项的融合蛋白，其中所述接头包含以下功能性部分a)-g)中的一种或多种：
a)为融合物赋予增加的稳定性和/或半衰期的部分，如XTEN化或PAS化序列或弹性蛋白样多肽(ELP)；
b)用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点如半胱氨酸或赖氨酸残基；
c)具有胞内或胞外靶向功能的部分如蛋白质结合支架；
d)蛋白酶切割位点如因子Xa切割位点或另一胞外蛋白酶的切割位点；
e)白蛋白结合结构域(ABD)；
f)免疫球蛋白的Fc部分,例如IgG4的Fc部分；
g)包含一个或多个组氨酸(His接头，缩写为“His”)氨基酸的氨基酸序列，例如HAHGHGHAH。
10.根据权利要求1-9中任一项的融合蛋白，其中所述接头由一个或多个功能性部分组成。
11.根据权利要求1-9中任一项的融合蛋白，其中所述接头在所述功能性部分之外还包含其他氨基酸。
12.根据权利要求9-11的融合蛋白，其中所述接头包含以下蛋白酶切割位点中的一种或多种：
a)因子Xa切割位点，并且优选地包含序列IEGR(SEQ ID NO:11)或由序列IEGR(SEQ ID NO:11)组成；
b)蛋白酶切割位点，并且优选地包含至少一个精氨酸或由至少一个精氨酸组成，并且更优选地包含序列GGGRR(SEQ ID NO:14)或由序列GGGRR(SEQ ID NO:14)组成。
13.根据权利要求9-12中任一项的融合蛋白，其中所述接头包含用于共价修饰的进入位点或由用于共价修饰的进入位点组成，并且优选地包含根据SEQ ID NO:13的序列或由根据SEQ ID NO:13的序列组成。
14.根据权利要求9-13中任一项的融合蛋白，其中所述接头包含蛋白质稳定化序列或由蛋白质稳定化序列组成，并且优选地包含PAS化序列，如根据SEQ ID NO:12的序列。
15.根据权利要求9-14中任一项的融合蛋白，其中所述接头包含一个或多个用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点或由一个或多个用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点组成，所述进入位点如半胱氨酸或赖氨酸，并且优选半胱氨酸。
16.根据权利要求15的融合蛋白，其包含与接头的用于共价修饰的进入位点共价连接的一个或多个部分D。
17.根据权利要求16的融合蛋白，其中所述共价连接的一个或多个部分D选自下列：
a)靶向单元如抗体或蛋白质结合支架
b)蛋白质稳定化单元如羟乙基淀粉衍生物(HES)或聚乙二醇或其衍生物(PEG或PEG衍生物)
c)脂肪酸。
18.根据权利要求1-17中任一项的融合蛋白，其包含用于蛋白质纯化的标记如His标记，并且其中所述标记优选地与所述融合蛋白在N-或C-端连接。
19.根据权利要求18的融合蛋白，在蛋白质纯化标记和所述融合蛋白的其余部分之间包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶切割位点优选为Sumo蛋白酶切割位点。
20.根据权利要求1-19中任一项的融合蛋白，其中A是FGF-21突变蛋白并且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽。
21.根据权利要求20的融合蛋白，其中B包含根据SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列。
22.根据权利要求20或21的融合蛋白，其中A是包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:102或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:102组成的FGF-21突变蛋白。
23.根据权利要求20-22中任一项的融合蛋白，其中C是艾塞那肽。
24.根据权利要求1-23中任一项的融合蛋白，其用作药物的用途。
25.一种包含权利要求1-23中任一项的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物。
26.一种包含权利要求1-23中任一项的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物，其用作药物的用途。
27.制品，其包含
a)根据权利要求1-23中任一项的融合蛋白或权利要求25的药物组合物，和
b)容器或包装材料。
28.一种治疗患者的疾病或病症的方法，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或其中FGF-21功效的增加有益于所述疾病或病症的治疗、预防或改善，其中所述方法包括向所述患者施用权利要求1-23中任一项的融合蛋白或权利要求23的药物组合物。
29.一种治疗患者的心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病和/或糖尿病风险的代谢综合征优选2型糖尿病的方法，包括向所述患者施用权利要求1-23中任一项的融合蛋白或权利要求25的药物组合物。
30.一种为患者降低血浆葡萄糖水平、降低肝脏中脂质含量、治疗高脂血症、治疗高血糖、增加葡萄糖耐受、降低胰岛素耐受、增加体温和/或降低重量的方法，包括向所述患者施用权利要求1-23中任一项的融合蛋白或权利要求25的药物组合物。
31.一种核酸，其编码根据权利要求1-23中任一项的融合蛋白，任选地包含以下核酸序列中的一种或由以下核酸序列中的一种组成：
a)根据具有ID NOs:27-38的序列之一的核酸序列
b)编码根据SEQ ID NOs:15-26和39-44的蛋白质序列的核酸
c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸。
32.一种包含权利要求31的核酸的载体，其适合于在真核或原核宿主中表达编码的蛋白质。
33.一种细胞，其稳定或瞬时携带权利要求32的载体并且能够在合适的培养条件下表达权利要求1-23中任一项的融合蛋白。
34.一种制备权利要求1-23中任一项的融合蛋白的方法，包括
a)在用于所述融合蛋白在细胞中表达的合适培养条件下培养权利要求33的细胞的培养物，或
b)从培养物收获或纯化所述融合蛋白，所述培养物包含已经在用于所述融合蛋白表达的合适条件下培养的根据权利要求33的细胞，或
c)根据步骤a)培养细胞并根据步骤b)纯化融合蛋白，和任选地
d)如果所述融合蛋白是根据权利要求18-23中任一项的融合蛋白，那么使用蛋白酶切割His标记。
35.根据优选方面24的融合蛋白或根据优选方面26的药物化合物的医药用途，其中所述医药用途是在对疾病或病症的治疗中的用途，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或FGF-21功效的提高有益于所述疾病的治疗、预防或改善。
36.根据优选方面24的融合蛋白或根据优选方面26的药物化合物的医药用途，其中所述医药用途是在对心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病风险的代谢综合征的用途，和/或在对糖尿病优选2型糖尿病的治疗中的用途。
37.根据优选方面24的融合蛋白或根据优选方面26的药物化合物的医药用途，其中所述医药用途是在降低血浆葡萄糖水平中、在降低肝脏中脂质含量中、用于治疗高脂血症、用于治疗高血糖、用于增加葡萄糖耐受、用于降低胰岛素耐受、用于增加体温和/或用于降低重量的用途。
38.根据方面24、26、28-30或35-37中任一项的医药用途或治疗方法，包括施用至少一种抗糖尿病药物和/或至少一种DPP-IV(二肽基肽酶-4)抑制剂。
39.根据方面38的医药用途或治疗方法，其中所述融合蛋白和抗糖尿病药物和/或DPP-IV抑制剂同时或顺序施用。
40.根据方面38或39的医药用途或治疗方法，其中所述抗糖尿病药物选自二甲双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲和/或胰岛素。
41.根据优选方面38-40之一的医药用途或治疗方法，其中所述DPP-IV抑制剂选自西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、adogliptin和/或黄连素。
42.根据优选方面38-40之一的医药用途或治疗方法，其中将所述融合蛋白和DPP-IV抑制剂组合在一个制剂中或包含在几个制剂中。
43.根据优选方面38-40之一的医药用途或治疗方法，其中将所述融合蛋白和抗糖尿病药物组合在一个制剂中或包含在几个制剂中。
44.根据优选方面38-40之一的医药用途或治疗方法，其中将所述DPP-IV抑制剂和抗糖尿病药物组合在一个制剂中。
45.根据优选方面38-40之一的医药用途或治疗方法，其中所述融合蛋白和抗糖尿病药物和/或其他DPP-IV抑制剂适合于同时或顺序施用。
46.优选方面45的医药用途或方法，其中将所述融合蛋白与所述抗糖尿病药物或DPP-IV抑制剂或其二者同时向患者施用。
47.优选方面45的医药用途或方法，其中将所述融合蛋白在所述抗糖尿病药物或DPP-IV抑制剂或其二者之前或之后向患者施用。
48.优选方面36-48中任一项的医药用途或方法，其中所述代谢综合征选自血脂障碍、脂肪肝病(FLD)、血糖异常(dysglycemia)、受损的葡萄糖耐受(IGT)、肥胖症、多脂和2型糖尿病。
49.优选方面36-47中任一项的方法，其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
50.优选方面35-51中任一项的医药用途或方法，其中所述患者选自下组：1型糖尿病患者、2型糖尿病患者、饮食治疗的2型糖尿病患者、磺酰脲治疗的2型糖尿病患者、极晚期2型糖尿病患者和长效胰岛素治疗的2型糖尿病患者。
51.优选方面35-50中任一项的医药用途或方法，其中在糖尿病患者中使血浆葡萄糖水平降低，使肝脏中脂质含量降低，使葡萄糖耐受增加，使胰岛素耐受增加，使体温增加，和/或使重量降低，所述糖尿病患者优选选自1型糖尿病患者、2型糖尿病患者，特别是饮食治疗的2型糖尿病患者、磺酰脲治疗的2型糖尿病患者、极晚期2型糖尿病患者和/或长效胰岛素治疗的2型糖尿病患者。
52.优选方面35-51中任一项的医药用途或方法，其中所述患者是哺乳动物，优选人。
53.优选方面35-52中任一项的医药用途或方法，其中施用治疗有效量的所述融合蛋白或药物组合物和任选地抗糖尿病药物或DPP IV-抑制剂或其二者。
54.优选方面35-53中任一项的医药用途或方法，其中将所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物皮下施用。
55.优选方面35-54中任一项的医药用途或方法，其中所述DPP-IV抑制剂通过口服、皮下、肌内、肺部、吸入和/或通过缓释施用来施用，优选地所述DPP-IV抑制剂口服施用。
56.优选方面35-55中任一项的医药用途或方法，其中所述抗糖尿病药物通过口服、皮下、肌内、肺部、吸入和/或通过缓释施用来施用，优选地所述抗糖尿病药物口服施用。
57.根据优选方面27的制品，进一步包含
c)包含DPP-IV抑制剂的药物组合物，和/或
d)包含抗糖尿病药物的药物组合物。
58.根据优选方面27或57的制品，进一步包含数据载体，优选标签或包装插页(package insert)或其二者，其包含关于以下中的一项或多项的信息：
a)对根据优选方面24、28-30或35-56中任一项的医药用途或治疗方法的涉及，
b)关于所述制品和/或其组分的储存条件的信息
c)一种或多种活性成分如融合蛋白、DPP-IV抑制剂或抗糖尿病药物和/或所述制品的批号或批次号
d)制品和任选地其组分的组成
e)制品和任选地其组分的操作说明
f)有效期或最迟销售日期。
59.根据优选方面27、57或58中任一项的制品，进一步包含用于施用所述融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物的装置，和所述装置的使用说明。
60.根据优选方面27或57-59中任一项的制品，包含以下组分a)至e)中的一种或多种：
a)一个或多个包含所述融合蛋白的单位剂量形式
b)一个或多个包含所述抗糖尿病药物的单位剂量形式
c)一个或多个包含所述DPP-IV抑制剂的单位剂量形式
d)数据载体，所述数据载体优选包含标签或包装插页；
e)用于施用所述融合蛋白的装置，如注射器和所述装置的使用说明。
61.根据优选方面60的制品，包含一个或多个包含融合蛋白的单位剂量形式，其作为供溶解的干燥制剂在紧密密封的容器如小瓶、安瓿或小药囊中。
62.根据优选方面61的制品，包含一个或多个包含融合蛋白的单位剂量形式，其作为液体制剂在紧密密封的容器如小瓶、小药囊、预填充注射器、预填充自动注射器或用于可重复使用的注射器或施用器的药筒中。
63.根据优选方面60-62之一的制品，包含一个或多个抗糖尿病药物的单位剂量形式，其作为片剂或胶囊或其他用于口服施用的制剂在紧密密封的容器或吸塑包装(blister)中。
64.根据优选方面60-63之一的制品，包含一个或多个DPP-IV抑制剂的单位剂量形式，其作为片剂或胶囊或其他用于口服施用的制剂在紧密密封的容器或吸塑包装中。
65.根据优选方面60-64之一的制品，其中活性成分的量在紧密密封的容器或吸塑包装上表明。
66.根据优选方面60-65之一的制品，包含充分的单位剂量形式的所述融合蛋白，并且优选还包含充分的单位剂量形式的所述抗糖尿病药物或DPPIV-抑制剂，或充分的单位剂量形式的所述融合蛋白和抗糖尿病药物和DPPIV-抑制剂，以供一次单一的，以供两周(即14天)治疗，以供四周(即28天)治疗或以供一个月治疗，所述治疗使用融合蛋白和优选地所述抗糖尿病药物或DPP IV-抑制剂或使用融合蛋白和所述抗糖尿病药物和所述DPP IV-抑制剂。
67.根据优选方面66的制品，包含充分的单位剂量形式的融合蛋白和任选地抗糖尿病药物或DPP-IV抑制剂或其二者，以供每日施用方案。
68.根据优选方面60-67之一的制品，其中所述装置是注射器或另一种类型的注射装置。
69.根据优选方面68的制品，其中所述注射器或注射装置是预填充的或适合于皮下注射的或二者兼有。
在下文中，列出了本发明的其他优选方面。
1.一种融合蛋白，其包含具有结构A-B-C或C-B-A或B-A-C或B-C-A或A-C-B或C-A-B或A-B-C-B-C或A-C-B或A-B-C-B或A-C-B-C的多肽，其中
A是GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂，且
C是FGF-21(成纤维细胞生长因子21)化合物，且
B是包含约0-1000个氨基酸的接头。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述接头包含赋予除连接A和C的功能之外的一种或多种其他功能的功能性部分。
3.根据权利要求1或2的融合蛋白，其中所述接头是肽接头。
4.根据权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述FGF-21化合物选自天然FGF-21、FGF-21模拟物或SEQ ID NO:3。
5.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
6.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
7.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约96％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
8.根据权利要求4-7中任一项的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自FGF-21突变蛋白、FGF-21-Fc融合蛋白、FGF-21-HSA融合蛋白和/或聚乙二醇化FGF-21。
9.根据权利要求1-8中任一项的融合蛋白，其中所述GLP-1R激动剂选自生物活性的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1替代物。
10.根据权利要求1-9中任一项的融合蛋白，其中所述GLP-1R激动剂选自GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺、毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、CJC-1131、albugon、阿必鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽-LAR、胃泌酸调节素、利西拉肽、京尼平苷或具有GLP-1R激动活性的短肽。
11.根据权利要求1-10中任一项的融合蛋白，其中所述接头包含以下功能性部分a)-h)中的一种或多种：
a)为融合物赋予增加的稳定性和/或半衰期的部分，如XTEN化或PAS化序列或弹性蛋白样多肽(ELP)；
b)用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点如半胱氨酸或赖氨酸残基；
c)具有胞内或胞外靶向功能的部分如蛋白质结合支架；
d)蛋白酶切割位点如因子Xa切割位点或另一胞外蛋白酶的切割位点；
e)免疫球蛋白的Fc部分，例如IgG4的Fc部分；
f)HSA；
g)包含一个或多个组氨酸(His接头，缩写为“His”或“His标记”)氨基酸的氨基酸序列，例如HAHGHGHAH；
h)白蛋白结合结构域(ABD)。
12.根据权利要求1-11中任一项的融合蛋白，其中所述接头由一个或多个功能性部分组成。
13.根据权利要求1-10中任一项的融合蛋白，其中所述接头在所述功能性部分之外还包含其他氨基酸。
14.根据权利要求11-13的融合蛋白，其中所述接头包含以下蛋白酶切割位点中的一种或多种：
a)因子Xa切割位点，并且优选地包含序列IEGR(SEQ ID NO:11)或由序列IEGR(SEQ ID NO:11)组成；
b)蛋白酶切割位点，并且优选地包含至少一个精氨酸或由至少一个精氨酸组成，并且更优选地包含序列GGGRR(SEQ ID NO:14)或由序列GGGRR(SEQ ID NO:14)组成。
15.根据权利要求11-14的融合蛋白，其中所述接头包含用于共价修饰的进入位点或由用于共价修饰的进入位点组成，并且优选地包含根据SEQ IDNO:13的序列或由根据SEQ ID NO:13的序列组成。
16.根据权利要求11-15的融合蛋白，其中所述接头包含蛋白质稳定化序列或由蛋白质稳定化序列组成，并且优选地包含选自下组的PAS化序列：SEQID NO:12、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
17.根据权利要求11-16的融合蛋白，其中所述接头包含一个或多个用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点或由一个或多个用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点组成，所述进入位点如半胱氨酸或赖氨酸，并且优选半胱氨酸。
18.根据权利要求17的融合蛋白，其包含与接头的用于共价修饰的进入位点共价连接的一个或多个部分D。
19.根据权利要求18的融合蛋白，其中所述共价连接的一个或多个部分D选自下列：
a)靶向单元如抗体或蛋白质结合支架
b)蛋白质稳定化单元如羟乙基淀粉衍生物(HES)或聚乙二醇或其衍生物(PEG或PEG衍生物)
c)脂肪酸。
20.根据权利要求1-19中任一项的融合蛋白，其包含用于蛋白质纯化的标记如His标记，并且其中所述标记优选地与所述融合蛋白在N-或C-端连接。
21.根据权利要求20的融合蛋白，其在蛋白质纯化标记和所述融合蛋白的其余部分之间包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶切割位点优选为Sumo蛋白酶切割位点。
22.根据权利要求1-21中任一项的融合蛋白，其中A是FGF-21突变蛋白并且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽。
23.根据权利要求22的融合蛋白，其中B具有选自下组的序列：SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
24.根据权利要求22或23的融合蛋白，其中A是包含SEQ ID NO:102或由SEQ ID NO:102组成的FGF-21突变蛋白。
25.根据权利要求22-24之一的融合蛋白，其中C是艾塞那肽。
26.根据权利要求1-25之一的融合蛋白，其用作药物的用途。
27.一种包含权利要求1-25中任一项的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物。
28.一种包含权利要求1-25中任一项的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物，其用作药物的用途。
29.制品，其包含
a)根据权利要求1-25之一的融合蛋白或权利要求27的药物组合物，和
b)容器或包装材料。
30.一种治疗患者的疾病或病症的方法，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或其中FGF-21功效的增加有益于所述疾病或病症的治疗、预防或改善，其中所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1-25中任一项的融合蛋白或权利要求27的药物组合物。
31.一种治疗患者的心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病和/或糖尿病风险的代谢综合征优选2型糖尿病的方法，包括向所述患者施用根据权利要求1-25中任一项的融合蛋白或权利要求27的药物组合物。
32.一种为患者降低血浆葡萄糖水平、降低肝脏中脂质含量、治疗高脂血症、治疗高血糖、增加葡萄糖耐受、降低胰岛素耐受、增加体温和/或降低重量的方法，包括向所述患者施用根据权利要求1-25中任一项的融合蛋白或权利要求27的药物组合物。
33.一种核酸，其编码根据权利要求1-25中任一项的融合蛋白，优选包含以下核酸序列之一或由其组成：
a)根据具有ID NOs:27-38的序列之一的核酸序列
b)编码根据SEQ ID NOs:15-26和39-44的蛋白质序列的核酸
c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸。
34.一种包含权利要求33的核酸的载体，其适合于在真核或原核宿主中表达编码的蛋白质。
35.一种细胞，其稳定或瞬时携带权利要求34的载体并且能够在合适的培养条件下表达权利要求1-25之一的融合蛋白。
36.一种制备权利要求1-25之一的融合蛋白的方法，包括
a)在用于所述融合蛋白在细胞中表达的合适培养条件下培养权利要求35的细胞的培养物，或
b)从培养物收获或纯化所述融合蛋白，所述培养物包含已经在用于所述融合蛋白表达的合适条件下培养的根据权利要求35的细胞，或
c)根据步骤a)培养细胞并根据步骤b)纯化融合蛋白，和任选地
d)使用蛋白酶切割His标记，如果所述融合蛋白是根据权利要求20-25之一的融合蛋白。
本发明的另一优选实施方案是具有以下结构的融合蛋白：
艾塞那肽-(B1)n-HSA-(B2)n-FGF-21，其中
-B1是(GaSb)c；并且
-B2是(GxSy)z；
其中a、b、c、x、y、z、n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
本发明的另一优选实施方案是具有以下结构的融合蛋白：
艾塞那肽-FGF-21-(GGGGS)m-ABD-(GGGGS)n-FGF-21，
其中m和n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
本发明的另一优选实施方案是具有以下结构的融合蛋白：
艾塞那肽-FGF-21-(GGGGS)n-ABD，
其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.
本发明的另一优选实施方案是具有以下结构的融合蛋白：
艾塞那肽-(GGGGS)m-ABD-(GGGGS)n-FGF-21,
其中m和n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
以下附图和实施例仅用于示例目的，而不旨在限制本发明。
附图简述
图1:hGLP-1R(A)、人FGFR1c+KLB(B)或下游效应物ERK(C)的剂量依赖性体外激活。
A)化合物对人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)的激动作用通过测量稳定表达人GLP-1受体的HEK-293细胞系的cAMP应答的功能性测定来测定。细胞的cAMP含量使用来自Cisbio Corp.(目录号62AM4PEC)的试剂盒基于HTRF(均匀时间分辨荧光)测定。
EC50值从剂量应答曲线获得并且总结于表1。
B)FGF诱导的FGFR自磷酸化经由特异性和高灵敏的细胞内Western(ICW)在稳定表达人FGFR1c连同人betaKlotho(KLB)的CHO细胞中测量。In-Cell Western测定是通常以微板形式进行的免疫细胞化学测定。将目标特异性的第一抗体和红外标记的第二抗体用于检测固定细胞中的目标蛋白，并定量每个孔的荧光信号(例如来自LI-COR Biosciences,USA的In-Cell Western测定法)。
EC50值获得自剂量应答曲线并总结于表1。
C)下游效应物ERK的剂量依赖性体外激活。FGF信号传导的下游效应物(即MAP激酶ERK1/2)的激活经由In-Cell Western测定在稳定表达人FGFR1c和KLB的CHO细胞中使用针对ERK1/2磷酸化氨基酸残基苏氨酸202和酪氨酸204的抗体测定。
EC50值获得自剂量应答曲线并总结于表1。
图2：在ob/ob小鼠中每日一次皮下治疗10天之后的血糖变化(A)，在口服葡萄糖耐受测试期间的血糖水平(B)和对应的AUC(C)。所有数据呈现为平均值±SEM。通过使用单向ANOVA或双向ANOVA和之后的Dunnett事后测试(Dunnett’s post test)分析数据。低于0.05的P值被认为是显著的。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，相对于载剂处理的肥胖对照小鼠。
图3：a)、b)、c)、d)：融合蛋白单元的序列(a-c：FGF-21化合物、GLP-1受体激动剂、用于构建接头的功能性部分)，融合蛋白和核酸构建体：图3显示了FGF-21化合物、不同的GLP-1激动剂肽和接头单元，用于构建或形成融合蛋白的不同模块A、C和B。
d)图3d从N-至C-端显示了不同的融合蛋白。序列ID号15-26是以受体激动剂–FGF-21化合物(ABC)排列的融合蛋白，包含不同的接头并包含或不包含His标记和Sumo切割位点。带有His标记/Sumo切割位点的构建体可以切割成不含所述His标记/Sumo切割位点的构建体，仅留下FGF-21化合物-接头-GLP1受体激动剂或GLP1受体激动剂–接头–FGF-21化合物融合蛋白。序列ID号39-40涉及FGF-21化合物-GLP1受体激动剂(CBA)排列的融合蛋白，其中CR9443包含具有完整因子Xa切割位点的接头，而CR 9444包含含有突变的(缺陷的)因子Xa切割位点的GS-rich接头。构建体9445按照GLP1受体激动剂–FGF-21化合物的顺序并且包含缺陷的因子Xa切割位点。
e)图3e显示了不同的编码融合蛋白的构建体的核酸序列：
SEQ ID NO:27：构建体CR8829(未经密码子优化)
              起始-His(6)-SUMO切割位点–艾塞那肽–
              Xa切割位点-人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：28 构建体CR8846(未经密码子优化)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-艾塞那肽–
              人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：29 构建体CR8847(未经密码子优化)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-艾塞那肽–
              GGGRR-人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：30 构建体CR8848(未经密码子优化)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-利西拉肽–
              人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：31 构建体CR8849(未经密码子优化)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-利西拉肽–
              因子Xa切割位点-人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：32 构建体CR8850(未经密码子优化)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-利西拉肽–
              GGGRR-人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：33 构建体CR9443(针对大肠杆菌优化了密码子)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-人FGF-21
              His29-Ser209-GSGSIEGR-艾塞那肽–终止
SEQ ID NO：34 构建体CR9444(针对大肠杆菌优化了密码子)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-人FGF-21
              His29-Ser209–GSGSIEGQ-艾塞那肽–终止
SEQ ID NO：35 构建体CR9445(针对大肠杆菌优化了密码子)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-艾塞那肽–IEGQ
              -人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：36 构建体CR9446(针对大肠杆菌优化了密码子)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-艾塞那肽–
              APASPAS-人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：37 构建体CR9447(针对大肠杆菌优化了密码子)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-艾塞那肽–
              APASCPAS-人FGF-21His29-Ser209-终止
SEQ ID NO：38 构建体CR9448(针对大肠杆菌优化了密码子)
              起始-His(6)-SUMO切割位点-艾塞那肽–
              GSGS-人FGF-21His29-Ser209–终止
图4：利拉鲁肽的化学结构。
图5：CJC-1131的化学结构。
图6：用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白经由Alzet微型渗透泵以0.03,0.1,0.3和1mg/kg的剂量治疗的ob/ob小鼠的体重发展(绝对平均值±SE)。
图7：用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白经由Alzet微型渗透泵以0.03,0.1,0.3和1mg/kg的剂量治疗的ob/ob小鼠的相对体重变化(％,平均值±SE)。用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白治疗的ob/ob小鼠显示了剂量依赖性的体重减少，其中17.8％的最大降幅在1mg/kg。
图8：用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白经由Alzet微型渗透泵以0.03,0.1,0.3和1mg/kg的剂量治疗的ob/ob小鼠的平均肝脏重量(g，平均值±SE)。用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白治疗的ob/ob小鼠显示了剂量依赖性的肝脏总重量减少。
图9：用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白经由Alzet微型渗透泵以0.03,0.1,0.3和1mg/kg的剂量治疗的ob/ob小鼠的平均肝脏甘油三酯(mg/g肝脏重量，平均值±SE)。用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白治疗的ob/ob小鼠显示了剂量依赖性的肝脏甘油三酯减少。
图10：用艾塞那肽-IEGR-FGF21融合蛋白经由Alzet微型渗透泵以0.03,0.1,0.3和1mg/kg的剂量治疗的ob/ob小鼠在11天之后的平均血糖浓度(mmol/l,平均值±SE)。
图11：在11天之后，以0.03,0.1,0.3和1mg/kg的剂量的研究开始和研究结束之间的Δ血糖值(mmol/l,平均值±SE)。用融合蛋白艾塞那肽-IEGR-FGF21治疗的ob/ob小鼠在慢性输注11天之后显示了剂量依赖性的血糖降低。
实施例
1.克隆、表达和纯化GLP1-R激动剂/FGF-21融合蛋白
表达盒通过Geneart(Regensburg,Germany)合成并经由NcoI/XhoI或NcoI/BamHI克隆至pET16b载体中。将质粒转化至大肠杆菌BL21[DE3]中并从新鲜的转化体制备甘油原种。从甘油原种出发，将重组体接种至新鲜的Luria-Bertani(LB)培养基+氨苄青霉素中，并在振荡温育箱中在37℃和150rpm过夜温育。从这种预备培养物取一定量接种新鲜的LB培养基+Amp，起始OD600为0.1。当OD600达到0.6是，将温度降至18℃并添加异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至0.5mM的终浓度用于诱导表达。在22小时之后通过离心收集细胞。
将细胞重悬在裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，1mMImidazol，0.1mg/ml Lysozym，2mM MgCl2，25U/ml Benzonase)中，并通过法压(French Press)裂解。离心(4℃,27000g,60min)并以0.22μm过滤器过滤之后，将上清加至IMAC(例如HisTrap HP)柱上。使用50mM Tris pH 8.0,300mM NaCl和40mM咪唑(imidazol)将不含His标记的蛋白质去除。用250咪唑的逐步梯度洗脱SUMO融合蛋白。将合并的含有SUMO融合蛋白的级分针对缓冲液(20mM Tris pH 8.0,100mM NaCl)透析并在RT用酵母ULP1蛋白酶以1/250的比例切割24小时。将切割后的蛋白质用50mM Tris pH 8.5稀释以降低氯化钠至10mM。进一步的纯化使用阴离子交换柱(例如Source 15Q)进行。将His-SUMO标记和其他污染物使用平缓梯度的氯化钠从目标蛋白质中去除。将合并的含有目标蛋白质的级分使用一次性超滤设备device(例如Vivaspin 20,10000MWCO)浓缩。最终纯化步骤通过用PBS平衡的大小排阻色谱(例如Superdex 75)进行，其后是另一超滤和无菌过滤步骤。
2.对于人GLP-1受体功效的体外细胞测定
化合物对人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的激动作用通过测量稳定表达人GLP-1受体的HEK-293细胞系的cAMP应答的功能性测定来确定。
细胞的cAMP含量使用来自Cisbio Corp.(目录号62AM4PEC)的试剂盒基于HTRF(均匀时间分辨荧光)测定。关于制备，将细胞分入T175培养瓶中，并在培养基中(DMEM/10％FBS)过夜培养至几近汇合。然后去除培养基并用缺乏钙和镁的PBS清洗细胞，之后是用Accutase(Sigma-Aldrich目录号A6964)的蛋白酶处理。清洗脱离的细胞并重悬在测定缓冲液(1×HBSS；20mMHEPES,0.1％BSA,2mM IBMX)中，并测定细胞密度。然后将其稀释至4×105细胞/mL并以25μL等分试样分配到96孔板的孔中。关于测量，将25μL测定缓冲液中的测试化合物添加至孔，然后在室温温育30分钟。添加在裂解缓冲液中稀释的HTRF试剂(试剂盒组分)之后，将平板温育1小时，然后在665/620nm测量荧光比。激动剂的体外功效通过测定引起最大应答的50％激活的浓度(EC50)来定量。结果总结在表1中，并且剂量应答曲线示于图1A中。
3.对于人FGF-21受体功效的体外细胞测定和下游信号传导的激活(In-Cell Western)
将FGF-21或FGF-21融合蛋白的细胞功效使用特异性和高灵敏的In-CellWestern(ICW)测定来测量。ICW测定是通常以微板形式进行的免疫细胞化学测定。
将稳定表达人β-Klotho(KLB)的CHO Flp-In细胞(Invitrogen,Darmstadt,Germany)用于使用In-Cell Western的FGF-21受体自磷酸化测定[1]。为了测定受体自磷酸化水平，将2×104细胞/孔接种到96孔板中并且培养48小时。使用无血清培养基含GlutaMAX的Ham's F-12 Nutrient Mix(Gibco,Darmstadt,Germany)使细胞血清饥饿3-4小时。然后将细胞用增加浓度的人FGF-21(指明的FGF-21融合蛋白)或其他肽在37℃处理5分钟。温育之后，弃去培养基并且将细胞在3.7％新鲜制备的低聚甲醛(para-formaldehyde)中固定20分钟。将细胞用PBS中的0.1％Triton-X-100渗透化20分钟。用Odyssey封闭缓冲液(LICOR,Bad Homburg,Germany)在室温进行2小时封闭。将抗pFGFRTyr653/654(New England Biolabs,Frankfurt,Germany)在4℃温育过夜。温育第一抗体之后，将细胞用PBS+0.1％Tween20清洗。将第二抗小鼠800CW抗体(LICOR,Bad Homburg,Germany)在室温温育1小时。然后将细胞再次用PBS+0.1％Tween20清洗，并用Odyssey成像仪(LICOR,Bad Homburg,Germany)定量红外染料信号。将结果通过用TO-PRO3染料(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)定量来标准化。数据可以作为任意单位(AU)互动偶尔，并且EC50值从剂量应答曲线获得并总结在表1中。表1B显示了来自使用过表达人FGFR1c和KLB的CHO细胞的ICW的结果。
为了评估FGF-21-GLP-1RA融合蛋白对FGFR信号传导的下游效应物的激活，分析了MAP激酶ERK1/2的磷酸化。使用如上所述的相同的ICW方案，仅将第一抗体用抗-磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(NewEngland Biolabs,Frankfurt,Germany)替代。图1C显示了来自过表达人FGFR1c和KLB的CHO细胞的ICW和ERK1/2磷酸化检测的结果。EC50值总结在表1中。
表1：融合蛋白对人GLP-1R、人FGFR1c加KLB或下游效应物MAP激酶ERK1/2的体外EC50值
4.ob/ob小鼠的治疗
雌性ob/ob小鼠(B6.V-LEP OB/J，10周龄)获得自Charles Rivers实验室(Sulzfeld,Germany)。将小鼠随机分配到治疗组或载剂组中，且根据体重和摄食血糖水平将随机分配(randomization)进行分级。在23℃下和12小时光照-黑暗循环中，分6组关养动物。所有的实验程序按照German Animal ProtectionLaw执行。在药物治疗期间使小鼠随意摄食标准啮齿动物饲料(rodent chow)。在整个研究过程中隔日(every other day)记录体重和食物摄入。
用载剂(PBS)、0.05mg·kg-1·天-1艾塞那肽(SEQ ID NO:4)、0.75mg·kg-1·天-1重组人FGF-21(SEQ ID NO:2)或组合剂量的FGF-21与艾塞那肽(0.75+0.15mg·kg-1·天-1)、0.9mg·kg-1·day-1艾塞那肽-IEGR-FGF-21(SEQID NO:3)或0.9mg·kg-1·day-1艾塞那肽-FGF-21(SEQ ID NO:4)每天一次皮下治疗ob/ob小鼠。在第一次治疗前一天和研究的第10天，在饲喂条件下通过尾尖放血测量血糖。如在图2A中所示，经治疗小鼠的血糖水平变为正常血糖水平。在研究第8天进行血糖耐受测试(OGTT)。用2g·kg-1葡萄糖经口服攻击空腹小鼠。在指定的时间点通过尾尖放血测量血糖，不进行麻醉。OGTT的结果在图2B中示出。计算各曲线下的面积(AUC)示于图2C。相比仅给予FGF-21或仅给予艾塞那肽，葡萄糖耐受通过组合治疗显著更有效地得到改善，并且以融合蛋白形式使用两种功能性分子将葡萄糖耐受正常化。
5.通过慢性输注治疗ob/ob小鼠
雌性ob/ob小鼠(B6.V-LEP OB/J，9周龄)获得自Charles Rivers实验室(Sulzfeld,Germany)。将小鼠随机分配到治疗组或载剂组中，且根据体重和摄食血糖水平将随机分配进行分级。在23℃下和12小时光照-黑暗循环中，分8组关养动物。所有的实验程序按照German Animal Protection Law执行。在药物治疗期间使小鼠随意摄食标准啮齿动物饲料。在整个研究过程中隔日记录体重和食物摄入。
用载剂(PBS)、0.03、0.1、0.3和1.0mg·kg-1·-1重组艾塞那肽-IEGR-FGF-21(SEQ ID NO:15)经由通过Alzet泵历时11天的慢性输注治疗ob/ob小鼠。
用所述融合蛋白艾塞那肽-IEGR-FGF-21治疗ob/ob小鼠显示了剂量依赖性的体重降低，其中17.8％的最大降幅在1mg/kg(图6和7，表2)。
表2：治疗11天之后ob/ob小鼠的相对体重变化(％)
在研究结束时，分析了肝脏重量和肝脏甘油三酯。通过用所述融合蛋白治疗ob/ob小鼠，剂量依赖性地降低了总肝脏重量和肝脏甘油三酯。
在泵植入之前两天和治疗11天之后，在喂食条件下通过尾尖放血测量了血糖。如图10和11中所示，慢性输注小鼠的血糖水平剂量依赖性地降低，其中在1.0mg·kg-1·天-1重组融合蛋白的剂量下效果最高。即使0.03mg·kg-1·天-1的最低剂量也产生了与健康对照瘦动物的血糖水平相当的血糖水平正常化结果。

Claims (36)

1.一种融合蛋白，其包含具有结构A-B-C或C-B-A或B-A-C或B-C-A或A-C-B或C-A-B或A-B-C-B-C或A-C-B或A-B-C-B或A-C-B-C的多肽，其中
A是GLP-1R(胰高血糖素样肽-1受体)激动剂，且
C是FGF-21(成纤维细胞生长因子21)化合物，且
B是包含约0-1000个氨基酸的接头。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述接头包含赋予除连接A和C的功能之外的一种或多种其他功能的功能性部分。
3.根据权利要求2的融合蛋白，其中所述接头是肽接头。
4.根据权利要求3的融合蛋白，其中所述FGF-21化合物选自天然FGF-21、FGF-21模拟物和SEQ ID NO:3。
5.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
6.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
7.根据权利要求4的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自与SEQ IDNO:3中所示氨基酸序列具有至少约96％氨基酸序列同一性并且具有FGF-21活性的蛋白质、FGF-21融合蛋白和/或FGF-21缀合物。
8.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述FGF-21模拟物选自FGF-21突变蛋白、FGF-21-Fc融合蛋白、FGF-21-HSA融合蛋白和/或聚乙二醇化FGF-21。
9.根据权利要求8的融合蛋白，其中所述GLP-1R激动剂选自生物活性的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1替代物。
10.根据权利要求9的融合蛋白，其中所述GLP-1R激动剂选自GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺、毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、CJC-1131、albugon、阿必鲁肽、艾塞那肽、艾塞那肽-LAR、胃泌酸调节素、利西拉肽、京尼平苷或具有GLP-1R激动活性的短肽。
11.根据权利要求10的融合蛋白，其中所述接头包含以下功能性部分a)-h)中的一种或多种：
a)为融合物赋予增加的稳定性和/或半衰期的部分，如XTEN化或PAS化序列或弹性蛋白样多肽(ELP)；
b)用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点如半胱氨酸或赖氨酸残基；
c)具有胞内或胞外靶向功能的部分如蛋白质结合支架；
d)蛋白酶切割位点如因子Xa切割位点或另一胞外蛋白酶的切割位点；
e)免疫球蛋白的Fc部分，例如IgG4的Fc部分；
f)HSA；
g)包含一个或多个组氨酸的氨基酸序列；
h)白蛋白结合结构域(ABD)。
12.根据权利要求11的融合蛋白，其中所述接头由一个或多个功能性部分组成。
13.根据权利要求10的融合蛋白，其中所述接头在所述功能性部分之外还包含其他氨基酸。
14.根据权利要求13的融合蛋白，其中所述接头包含以下蛋白酶切割位点中的一种或多种：
a)因子Xa切割位点，并且优选地包含序列IEGR(SEQ ID NO:11)或由序列IEGR(SEQ ID NO:11)组成；
b)蛋白酶切割位点，并且优选地包含至少一个精氨酸或由至少一个精氨酸组成，并且更优选地包含序列GGGRR(SEQ ID NO:14)或由序列GGGRR(SEQ ID NO:14)组成。
15.根据权利要求14的融合蛋白，其中所述接头包含用于共价修饰的进入位点或由用于共价修饰的进入位点组成，并且优选地包含根据SEQ ID NO:13的序列或由根据SEQ ID NO:13的序列组成。
16.根据权利要求15的融合蛋白，其中所述接头包含蛋白质稳定化序列或由蛋白质稳定化序列组成，并且优选地包含选自下组的PAS化序列：SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
17.根据权利要求16的融合蛋白，其中所述接头包含一个或多个用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点或由一个或多个用于对融合蛋白进行共价修饰的进入位点组成，所述进入位点如半胱氨酸或赖氨酸，并且优选半胱氨酸。
18.根据权利要求17的融合蛋白，其包含与接头的用于共价修饰的进入位点共价连接的一个或多个部分D。
19.根据权利要求18的融合蛋白，其中所述共价连接的一个或多个部分D选自下列：
a)靶向单元如抗体或蛋白质结合支架
b)蛋白质稳定化单元如羟乙基淀粉衍生物(HES)或聚乙二醇或其衍生物(PEG或PEG衍生物)
c)脂肪酸。
20.根据权利要求19的融合蛋白，其包含用于蛋白质纯化的标记如His标记，并且其中所述标记优选地与所述融合蛋白在N-或C-端连接。
21.根据权利要求20的融合蛋白，其在蛋白质纯化标记和所述融合蛋白的其余部分之间包含蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶切割位点优选为Sumo蛋白酶切割位点。
22.根据权利要求21的融合蛋白，其中A是FGF-21突变蛋白并且C是艾塞那肽、毒蜥外泌肽-4或利西拉肽。
23.根据权利要求22的融合蛋白，其中B具有选自下组的序列：SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101。
24.根据权利要求23的融合蛋白，其中A是包含SEQ ID NO:102或由SEQ ID NO:102组成的FGF-21突变蛋白。
25.根据权利要求24的融合蛋白，其中C是艾塞那肽。
26.根据权利要求25的融合蛋白，其用作药物的用途。
27.一种包含权利要求1的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物。
28.一种包含权利要求1的融合蛋白以及可药用的赋形剂的药物组合物，其用作药物的用途。
29.制品，其包含
a)根据权利要求27的药物组合物，和
b)容器或包装材料。
30.一种治疗患者的疾病或病症的方法，其中FGF-21受体自磷酸化的增加或其中FGF-21功效的增加有益于所述疾病或病症的治疗、预防或改善，其中所述方法包括向所述患者施用权利要求1的融合蛋白。
31.一种治疗患者的心血管疾病和/或糖尿病和/或至少一种增加形成心血管疾病和/或糖尿病风险的代谢综合征优选2型糖尿病的方法，包括向所述患者施用权利要求1的融合蛋白。
32.一种为患者降低血浆葡萄糖水平、降低肝脏中脂质含量、治疗高脂血症、治疗高血糖、增加葡萄糖耐受、降低胰岛素耐受、增加体温和/或降低重量的方法，包括向所述患者施用权利要求的融合蛋白。
33.一种核酸，其编码根据权利要求1的融合蛋白，任选地包含以下核酸序列中的一种：
a)根据具有ID NOs:27-38的序列之一的核酸序列
b)编码根据SEQ ID NOs:15-26和39-44的蛋白质序列的核酸
c)在严格条件下与根据a)或b)的核酸杂交的核酸。
34.一种包含权利要求33的核酸的载体，其适合于在真核或原核宿主中表达编码的蛋白质。
35.一种细胞，其稳定或瞬时携带权利要求34的载体并且能够在合适的培养条件下表达权利要求1的融合蛋白。
36.一种制备权利要求1的融合蛋白的方法，包括
a)在用于所述融合蛋白在细胞中表达的合适培养条件下培养细胞的培养物，或
b)从培养物收获或纯化所述融合蛋白，所述培养物包含已经在用于所述融合蛋白表达的合适条件下培养的细胞，或
c)根据步骤a)培养细胞并根据步骤b)纯化融合蛋白，和任选地
d)使用蛋白酶切割融合蛋白的His标记。
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