CN117801124A - 利西那肽前体的融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利西那肽前体的融合蛋白及其应用。其中，融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在利西那肽前体N端的标签蛋白；利西那肽前体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；标签蛋白选自如下的任一种：Fh8标签蛋白、Ffu209标签蛋白、CBM标签蛋白、Sumo标签蛋白或Trx标签蛋白。本申请的利西那肽前体融合有上述标签蛋白，带有上述标签蛋白的利西那肽前体具有较高的表达量，能够制备得到大量、高纯度的利西那肽前体，更好地进行利西那肽的工业化生产及应用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白表达技术领域，具体而言，涉及一种利西那肽前体的融合蛋白及其应用。
背景技术
利西那肽的C端为NH2，经微生物重组表达获得的利西那肽前体的C端为COOH，需要经化学修饰后得到最终的利西那肽。目前利西那肽前体主要通过化学法偶联合成和重组表达获得。其中，化学法偶联合成工艺复杂且合成过程中易产生杂质，且化学试剂有毒，可能产生消旋体，纯度和回收率相对较低；合成周期较长，产品的质量控制比较困难。重组表达采用基因工程的技术手段在原核或真核生物中引入目标基因表达元件，通过微生物发酵可以实现目标多肽的高效合成。包括包涵体表达和可溶表达两种，其中包涵体表达在变性和复性的过程要用到大量变性剂如尿素或盐酸胍，纯化工艺复杂导致最终得率非常低。而可溶表达，由于引入的标签蛋白及连接标签蛋白及目的肽之间的酶切位点的种类不同，对得到的融合蛋白可溶性及目的肽产量存在一定的影响。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种利西那肽前体的融合蛋白及其应用，以解决现有技术中制备利西那肽前体的效率较低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种利西那肽前体的融合蛋白，融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在利西那肽前体N端的标签蛋白；利西那肽前体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；标签蛋白选自如下的任一种：Fh8标签蛋白、Ffu209标签蛋白、CBM标签蛋白、Sumo标签蛋白或Trx标签蛋白。
进一步地，上述融合蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种制备利西那肽前体的方法，方法包括：制备获得上述的融合蛋白；利用蛋白内切酶切除融合蛋白中的标签蛋白，得到利西那肽前体。
进一步地，上述蛋白内切酶选自Ulp1酶或KEX2酶；Ulp1酶与融合蛋白的质量比为1:20-100；KEX2酶与融合蛋白的质量比为1:40-500。
进一步地，上述制备获得上述的融合蛋白包括：将上述的融合蛋白与伴侣蛋白进行共表达，得到融合蛋白；伴侣蛋白的表达质粒包括：pGro7、pTF16、pKJE7或pG-KJE8。
进一步地，上述利用蛋白内切酶切除融合蛋白中的标签蛋白后，还包括对蛋白内切酶处理后的产物进行进一步纯化，得到利西那肽前体；纯化包括：调节酶切体系pH值至标签蛋白的等电点后，加入有机试剂进行离心，所得上清液即为利西那肽前体。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种DNA分子，DNA分子编码上述的融合蛋白。
进一步地，上述DNA分子的核苷酸序列为经密码子优化后的核苷酸序列。
进一步地，上述DNA分子具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种重组质粒，重组质粒连接有上述的DNA分子。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞内转化有上述的重组质粒。
进一步地，上述宿主细胞为原核细胞或酵母细胞。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种上述的融合蛋白或上述的方法制备得到的利西那肽前体在制备利西那肽中的应用。
应用本发明的技术方案，本申请融合蛋白中的利西那肽前体融合有标签蛋白，具有较高的表达量，能够以较为简单的方法制备得到大量、高纯度的利西那肽前体，更好地进行利西那肽的工业化生产及应用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本发明实施例1中经大肠杆菌表达的融合蛋白Fh8-lixi、Ffu209-lixi、CBM-lixi、Trx-lixi、Sumo-lixi的电泳图；
图2示出了本发明实施例2中经大肠杆菌表达后纯化获得融合蛋白Sumo-lixi的电泳图；
图3示出了本发明实施例4中通过乙腈沉淀纯化得到的利西那肽前体的电泳图；
图4示出了本发明实施例5中质谱检测利西那肽前体的示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有合成利西那肽前体的方法无法高效的合成得到大量的利西那肽前体产物。其中，化学法工艺复杂且易产生杂质，且利用基因工程的技术手段，存在包涵体纯化复杂，大标签蛋白可溶表达的得率较低的问题。因而，本申请欲保护一种能够高效大量表达的融合有标签蛋白的利西那肽前体。
本发明的第一种典型的实施方式中，提供了一种利西那肽的融合蛋白，该融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在利西那肽前体N端的标签蛋白；利西那肽前体具有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列；标签蛋白选自如下的任一种：Fh8标签蛋白、Ffu209标签蛋白、CBM标签蛋白、Sumo标签蛋白或Trx标签蛋白。
SEQ ID NO:1：（利西那肽前体的氨基酸序列）
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
将分子量较小的标签蛋白Sumo融合至具有上述氨基酸序列的利西那肽前体的N端，得到本申请的融合蛋白，能够在宿主细胞中进行高效的可溶性表达，为后续处理得到大量利西那肽前体提供了基础。另，在C端融合的蛋白表达后难以将标签蛋白去除干净。
在一种优选的实施例中，融合蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。本申请的融合蛋白为利西那肽前体的N端融合有标签蛋白的利西那肽前体，标签蛋白的氨基酸序列为下划线部分序列，斜体部分（SEQ ID NO:5中的第76-第96位的氨基酸序列、SEQ ID NO:6中的第164-第184位的氨基酸序列、SEQ ID NO:7中的第171-第191位的氨基酸序列或SEQ ID NO:8中的第116-第136位的氨基酸序列）为连接肽序列。
SEQ ID NO:2：Sumo-利西那肽前体的氨基酸序列
HHHHHHGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEM DSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
SEQ ID NO:5：Fh8-利西那肽前体的氨基酸序列
MHHHHHHPSVQEVEKLLHVLDRNGDGKVSAEELKAFADDSKCPLDSNKIKAFIKEHDKNKDGKLDLKE LVSILSSGGGSGGGSGGGSENLYFQGKRHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
SEQ ID NO:6：Ffu209-利西那肽前体的氨基酸序列
MHHHHHHATEPVPGFPQPTEHTQKAYSPTDDFTSRWTRADAKQIKAMSDPNAGSRENSMPKEYTMPTV PQDFPDMSNEEVWVWDTWPLTDEHANQYSVNGQEIIFSLVADRDLGFDERHQYARIGYFYRPAGVPADERPEDGGW TYGGQVFDEGVTGKIFEDQGGGSGGGSGGGSENLYFQGKRHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
SEQ ID NO:7：CBM-利西那肽前体的氨基酸序列
MHHHHHHTTPFMSNMTGWTTVNGTWADTIEGKQGRSDGDSFILSSASGSDFTYESDITIKDGNGRGAG ALMFRSDKDAKNGYLANVDAKHDLVKFFKFENGAASVIAEYKTPIDVNKKYHLKTEAEGDRFKIYLDDRLVIDAHD SVFSEGQFGLNVWDATAVFQNVTKESGGGSGGGSGGGSENLYFQGKRHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
SEQ ID NO:8：Trx-利西那肽前体的氨基酸序列
MHHHHHHSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNID QNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGGGSGGGSGGGSENLYFQGKRHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。
本发明的第二种典型的实施方式中，提供了一种制备利西那肽前体的方法，该方法包括：制备获得上述的融合蛋白；利用蛋白内切酶切除融合蛋白中的标签蛋白，得到利西那肽前体。本申请上述的融合蛋白能够在宿主细胞，优选为大肠杆菌中大量表达，得到上述的带有标签蛋白的利西那肽前体，为得到利西那肽前体需将标签蛋白切除，利用能够特异识别特定标签蛋白的蛋白内切酶处理后，能够得到利西那肽前体，以达到大量高效生产利西那肽前体的目的。
其中，制备获得上述的融合蛋白的方法包括：将经密码子优化的带有标签蛋白的利西那肽前体核苷酸序列与能够表达该蛋白的载体进行同源重组连接，经阳性筛选得到测序正常的重组质粒。将正确质粒转入合适的宿主细胞中进行预筛选，选择表达量最佳的表达菌株进行后续的蛋白纯化培养。利用表达量最佳的表达菌株进行蛋白诱导表达，将培养菌液进行离心集菌，重悬后进行破碎，对上清液进行逐级洗脱纯化，得到上述融合蛋白。
为了进一步提高利西那肽前体的表达量，提供蛋白的正确折叠和聚集，防止蛋白降解，可以将融合蛋白与伴侣蛋白进行共表达，在一种优选的实施例中，制备获得上述的融合蛋白包括：将上述的融合蛋白与伴侣蛋白进行共表达，得到融合蛋白；优选地，伴侣蛋白的表达质粒包括pGro7（包含伴侣蛋白groES和groEL）、pTF16(包含伴侣蛋白tig)、pKJE7（包含伴侣蛋白danK，danJ和grpE）或pG-KJE8（包含伴侣蛋白danK，dnaJ，grpE，groES和groEL）。更优选为pGro7或pTF16。
其中，伴侣蛋白groES和groEL是一对互作的蛋白质，它们在细胞内形成一个复合物，称为GroEL-GroES复合物，参与蛋白质的折叠和修复过程。groES是一个辅助因子，为groEL提供一个“盖子”，使其形成一个封闭的腔体，将受损或未折叠的蛋白质保持在内部，防止其与其他细胞成分发生非特异性相互作用。groEL是一个分子伴侣蛋白，它具有一个大的圆筒状结构，可以容纳未折叠的蛋白质。groEL通过与ATP结合和水解，可以在腔体内提供一个适宜的环境，促进蛋白质的正确折叠。
tig是另一种蛋白质折叠辅助因子，它在GroEL/GroES系统中的功能类似于groES，能够与groEL形成复合物，协助蛋白质的折叠。
danK是一种分子伴侣蛋白，也被称为DnaK，它属于Hsp70家族。danK参与细胞内蛋白质的折叠、修复和降解过程，与其他分子伴侣蛋白一起协同作用，帮助蛋白质正确折叠并防止聚集。danJ是danK的辅助因子，与danK形成复合物，帮助danK在蛋白质折叠和修复过程中发挥作用。
grpE是另一种分子伴侣蛋白，它与danK形成复合物，参与蛋白质的折叠、修复和降解过程。grpE在danK的ATPase活性调节中起到重要作用，帮助danK完成正确的蛋白质折叠。
针对不同的标签蛋白所需的蛋白内切酶种类也不同，在一种优选的实施例中，蛋白内切酶选自Ulp1酶或KEX2酶，其中，Ulp1酶能够特异性识别Sumo标签的三级结构，从而在Sumo标签与目的蛋白连接GH处将Sumo标签蛋白从目标蛋白上完全切除；KEX2能够识别连接肽的KR位点，将Trx标签蛋白和连接肽从目标蛋白上完全切除。为进一步将标签蛋白尽可能切除干净，在一种优选的实施例中，Ulp1酶与融合蛋白的质量比为1:20-100，包括1:20、1:40、1:50、1:60、1:80、1:100；KEX2酶与融合蛋白的质量比为1:40-500，包括1:40、1:80、1:100、1:120、1:200、1:300、1:400、1:500；优选地，酶切时间为16-18h。
为进一步得到纯度较高的利西那肽前体，需对经蛋白内切酶处理后的产物进行蛋白纯化处理，在一种优选的实施例中，利用蛋白内切酶切除融合蛋白中的标签蛋白后，还包括对蛋白内切酶处理后的产物进行进一步纯化，得到利西那肽前体。
进行蛋白纯化的方法有多种，包括等电点析出、盐析、柱层析、膜过滤法等，任何能够进一步将利西那肽前体与杂质进行分离的蛋白纯化方法均适用于本申请，在一种优选的实施例中，纯化包括：调节酶切体系pH值至标签蛋白的等电点，加入有机试剂，进行离心，上清液即为利西那肽前体。优选地，有机试剂包括甲醇或乙腈。其中，His-Sumo的等电点为5.6。经等电点析出的标签蛋白杂质经离心后以沉淀被去除，最后得到上清液中的纯化后的目标产物利西那肽前体。其中，由于利西那肽前体的分子量较小，比蛋白质稳定，在有机溶剂中溶解性好，不易被沉淀。
本发明的第三种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述的融合蛋白。
各宿主细胞在进行蛋白表达时，是对密码子进行翻译的过程，在翻译过程中，不同宿主细胞对于密码子都具有一定的偏好性，为了在特定的宿主细胞中得到表达量较高的蛋白产物，可以针对特定的宿主细胞种类对编码蛋白的核苷酸序列进行密码子优化。在一种优选的实施例中，DNA分子的核苷酸序列为经密码子优化后的核苷酸序列；优选地，DNA分子具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。本申请的进行编码带有Sumo标签蛋白的利西那肽前体的核苷酸序列是优化处理后的具有大肠杆菌偏好性的密码子，标签蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下划线部分序列。
SEQ ID NO:3：（融合蛋白的核苷酸序列）
ATGCATCATCATCATCATCATGGCAGTCTGCAAGATAGCGAAGTGAATCAAGAAGCGAAGCCAGAAGT GAAACCGGAAGTTAAACCGGAGACCCACATCAATCTGAAGGTGAGCGACGGCAGCAGCGAGATCTTCTTCAAGATC AAGAAGACGACCCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCCTTCGCCAAACGCCAAGGCAAAGAAATGGACAGTCTGCGCT TTCTGTACGATGGTATCCGCATCCAAGCCGATCAAGCCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGACAACGACATCATCGA GGCGCATCGCGAACAGATCGGCGGCCATGGCGAAGGCACCTTTACCAGCGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGCCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGCCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAATAA。
本发明的第四种典型的实施方式中，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述的DNA分子。
本发明的第五种典型的实施方式中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内转化有上述的重组质粒。宿主细胞为原核细胞或酵母细胞，优选为大肠杆菌。
利用上述宿主细胞，能够在宿主细胞中进行重组质粒的复制，也能够将重组质粒上携带的DNA分子进行转录、翻译，获得大量融合蛋白。利用现有技术，对宿主细胞进行破碎蛋白纯化或其他方式，能够获得融合蛋白，并利于后续利用利西那肽前体制备利西那肽。
本发明的第六种典型的实施方式中，提供了一种上述的融合蛋白或上述的方法制备得到的利西那肽前体在制备利西那肽中的应用。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1 构建不同标签融合表达利西那肽前体的基因工程菌株
构建基于可溶表达多肽的策略，具体是采用多种标签蛋白和利西那肽前体序列进行融合，构建于pET-28a(+)表达载体。由金唯智进行全基因合成经过密码子优化的Lixisenatide前体序列，密码子优化的Lixisenatide前体的核苷酸序列如下：SEQ ID NO:4：CATGGCGAAGGCACCTTTACCAGCGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGCCTGTTTATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGCCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAATAA。
将合成的DNA片段分别与pET-28a-GST，pET-28a-Fh8，pET-28a-Ffu209，pET-28a-Trx和pET-28a-Sumo载体骨架经同源重组进行连接，连接产物转化BL21（DE3）感受态细胞，单克隆测序分析获得正确的克隆表达载体pET-28a-Tag-lixi（lixi是利西那肽前体的缩写），挑取3个正确的克隆活化后作为种子接种于250 ml摇瓶进行预筛选，从中选出一个最优的作为最终的表达菌株。标签蛋白Fh8、Ffu209、CBM与标签蛋白Sumo、Trx均属于分子量较小（7.5-18kDa）的标签蛋白，其中Fh8是肝片吸虫在感染早期分泌的蛋白，分子量7.5kDa，Ffu209是盐藻谷氨酸杆菌来源蛋白，分子量17.75kDa，CBM是β-果糖苷酶的一个结构域，分子量17.96kDa，Trx是硫氧还蛋白，分子量11.7kDa。Sumo的分子量为11.1 kDa，较上述标签蛋白，能在不应用连接肽的情况下，与目标蛋白进行融合，其三级结构可直接被特异性酶识别，直接将Sumo完全酶切去除，得到较纯的利西那肽前体。
取含有重组质粒的BL21（DE3）菌株4 ml，接种于含400 mL LB培养基的2 L三角瓶，37℃ 200 rpm振荡培养至OD600为1.0时，加入终浓度为0.2 mM IPTG，25℃诱导过夜，诱导结束，离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，17%分离胶SDS-PAGE检测，结果表明，几种融合蛋白均呈可溶表达，如图1所示，其中Sumo标签融合表达的利西那肽前体的表达量最高。虽CBM标签融合的利西那肽前体的表达量较融合其他三种标签蛋白（Fh8、Ffu209和Trx）的利西那肽前体较高，但由于CBM-lixi纯化后的电泳检测结果中存在明显的两条条带，推测CBM-lixi纯化产物中不仅存在CBM-lixi还包括CBM标签蛋白，不利于后续对利西那肽前体的收集纯化。
实施例2 Sumo-lixi纯化
将表达Fh8-lixi、Ffu209-lixi、CBM-lixi、Trx-lixi和Sumo-lixi的菌泥以20%菌浓重悬，超声破碎（5 s超声，5 s间隔，30%功率），然后离心，上清过0.45 μm滤膜后获得粗酶液，然后采用亲和层析进行纯化（AKTA系统装配5 ml HisTrap HP）。具体流程是：滤膜过滤样品以5 ml/min流速上样，然后采用结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，pH 8.0）冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着采用缓冲液50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，50 mM咪唑，pH 8.0下洗脱杂蛋白4个柱体积，最后在洗脱缓冲液50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，300mM咪唑，pH 8.0下洗脱目标蛋白（如图2所示）。1 g湿细胞可以获得纯化的Sumo-lixi融合蛋白22.2 mg，较Fh8-lixi、Ffu209-lixi、Trx-lixi的表达量提升较大，且如实施例1中所提到的，由于CBM-lixi和CBM标签蛋白的大小相近，纯化得到的CBM-lixi存在一定量的杂质。
实施例3 共表达伴侣蛋白
为进一步提高融合蛋白的产量，将伴侣蛋白表达质粒pGro7, pTF6，pKJE7, pG-KJE8与pET28a-Sumo-lixi共转入BL21（DE3）感受态细胞，获得共表达伴侣蛋白的融合蛋白重组表达菌株。并对其诱导条件进行优化，最近诱导条件为：菌液培养至OD600为1.0时，加入终浓度为0.2 mM IPTG和1mg/mL的阿拉伯糖，25℃诱导过夜。可以看出与伴侣蛋白进行共表达的融合蛋白的产量均有所提升，且与伴侣蛋白载体pGro7和pTF6的促进效果更好。
实施例4 高密度发酵培养
发酵罐发酵基础培养基（11 L）：蛋白胨20g，酵母粉110g，NaCl 77g。
补碳液：七水硫酸镁30g，葡萄糖800g，甘油360mL。
补氮液：酵母粉400g，蛋白胨400g，硫酸铵400g。
20 L发酵罐中加入11 L发酵用的基础培养基，加入带有Sumo-lixi的活化种子菌50~100 mL，另加入适量消泡剂，于37℃，pH7.0的条件下发酵。发酵早起可控制通气量在5L/min，转速150 rpm，进入对数生长期控制溶解氧浓度在30%~50%，溶解氧浓度不足时，最大转速可达750 rpm。pH使用自动流加2N的HCl或氨水调节至7.0发酵过程中取样测定和菌体密度，当溶解氧增加、pH值逐渐升高时开始加入补碳液，半个小时后开始加入补氮液。当菌体生长至对数生长后期时一次性加入IPTG和阿拉伯糖进行诱导，IPTG终浓度为0.2 mM，阿拉伯糖终浓度为1 mg/mL，25℃诱导16h后结束。
其中，每升发酵液可获得180g以上的菌泥，每克含有伴侣蛋白的菌泥能够得到36.5mg的融合蛋白，即每升发酵液可得6.57 g的融合蛋白Sumo-lixi。由于多肽理论占比28.2%，利西那肽前体的理论产量为1.84 g/L，实际生产过程中得到的利西那肽前体的产量能够达到1.5 g/L 以上的水平。
实施例5 酶切
Ulp1酶切反应在30℃进行，具体过程是：50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，300 mM咪唑，pH 8.0纯化的Sumo-lixi和Ulp1质量比40:1 (mg/mg)，酶切16 h，经质谱检测酶切后体系中lixi（即利西那肽前体）和sumo-lixi的含量，切割效率可达90%以上。另外，当待酶切的融合蛋白与Ulp1的质量比为100:1时，切割效率能达到80%左右，为20:1时，切割效率能达到95%，但之后无法通过增加Ulp1进一步提高酶切效率。
实施例6 乙腈沉淀法纯化目标多肽
将实施例5酶切完成之后的产物，调整pH于5.6（His-sumo等电点），然后在反应体系加入60%的乙腈，混匀后在30℃振荡处理2 h，之后12000 rpm离心分离上清和沉淀，采用17% SDS-PAGE检测其纯化产物的纯度，并检测是否有目标多肽生成（实施例5酶切产物得到的纯化产物如图3所示），实施例5酶切完成之后的产物处理后lixi粗品的纯度为50%。
实施例7 质谱检测多肽分子量
制备的多肽分子量采用LC-MS进行分析。具体如下：样品先经过HPLC 柱子分离：Agilent ZORBAX Edipse Plus C18,4.6*100mm，3.5μm，流动相A：0.1%三氟乙酸，流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液，采用梯度洗脱方式：0 min 10%B，9 min 95%B，12 min 100%B，12.1min 10%B，15 min 10%B，柱温50℃，紫外检测器210 nm，流速0.3 ml/mi。经过HPLC分离后的组分采用Q Exactive HF组合型四极杆Orbitrap质谱仪，采用电喷雾离子源（Dual AJSESI），正离子模式检测，鞘气流速35 arb，辅助气流速8 arb，喷雾电压3800 V，离子传输管温度320℃，扫描范围200~3000m/z，并通过BioPharma Finder软件处理质谱数据（如图4所示），利西那肽前体的理论分子量为4857.5Da，质谱解析的利西那肽前体的分子量是4856.5Da，说明本申请制备得到的利西那肽前体与理论值相差不大，符合预期。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利西那肽前体的化学偶联合成，其工艺复杂且合成过程中易产生杂质，产品的质量控制比较困难，纯度和回收率相对较低。本发明通过基因重组对利西那肽前体进行可溶性表达，经标签筛选和表达条件的优化，使得利西那肽前体的发酵产量可以达到1 g/L以上的水平，实现了利西那肽前体的高效合成。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种利西那肽前体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括利西那肽前体以及融合在所述利西那肽前体N端的标签蛋白；
所述利西那肽前体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述标签蛋白选自如下的任一种：Fh8标签蛋白、Ffu209标签蛋白、CBM标签蛋白、Sumo标签蛋白或Trx标签蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:2、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.一种制备利西那肽前体的方法，其特征在于，所述方法包括：
制备获得权利要求1或2所述的融合蛋白；
利用蛋白内切酶切除所述融合蛋白中的标签蛋白，得到所述利西那肽前体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白内切酶选自Ulp1酶或KEX2酶；
所述Ulp1酶与所述融合蛋白的质量比为1:20-100；
所述KEX2酶与所述融合蛋白的质量比为1:40-500。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述制备获得权利要求1或2所述的融合蛋白包括：将所述权利要求1或2所述的融合蛋白与伴侣蛋白进行共表达，得到所述融合蛋白；
所述伴侣蛋白的表达质粒包括：pGro7、pTF16、pKJE7或pG-KJE8。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用蛋白内切酶切除所述融合蛋白中的标签蛋白后，还包括对所述蛋白内切酶处理后的产物进行进一步纯化，得到所述利西那肽前体；
所述纯化包括：调节酶切体系pH值至所述标签蛋白的等电点后，加入有机试剂进行离心，所得上清液即为利西那肽前体。
7.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2所述的融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列为经密码子优化后的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
10.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求7至9中任一项所述的DNA分子。
11.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞内转化有权利要求10所述的重组质粒。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或酵母细胞。
13.权利要求1或2所述的融合蛋白或权利要求3-6中任一项所述的方法制备得到的所述利西那肽前体在制备利西那肽中的应用。
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