CN114409759B

CN114409759B - 一种具有抑菌功能的rp23蛋白

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Publication number: CN114409759B
Application number: CN202210105811.2A
Authority: CN
Inventors: 张国玉; 张帆
Original assignee: Changchun Pushkang Medical Technology Co ltd
Current assignee: Changchun Pushkang Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114409759A

Abstract

本发明提供一种蛋白，其氨基酸序列包括SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有90％以上一致性的序列；本发明还提供了用于编码所述的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2‑4。本发明提供的蛋白对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及白色念珠菌等真菌均具有良好的抑菌效果；本发明提供的表达修复蛋白的核酸分子表达效率较高，尤其SEQ ID NO.2提供的核酸分子优于其他核酸分子的表达效率。

Description

一种具有抑菌功能的RP23蛋白

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有抑菌功能的RP23蛋白。

背景技术

修复蛋白是一类具有抗菌活性的生物蛋白，其作用机理是能够与细菌的细胞膜表面相互作用，使膜的通透性发生改变，形成离子通道，导致细菌内容物溢出而死亡，所以修复蛋白对细菌不容易产生耐药性，因而有望成为新一代的抗菌类药品，在医药、畜牧养殖添加剂、食品添加剂等方向具有广泛应用价值。

目前市场上具有抗菌功能的蛋白开发过程中提取困难，化学合成成本高，且抗菌活性没有达到最理想的效价，还可能有细胞毒性等副作用，提示我们需要对传统抗菌蛋白分子进行适当修饰，以提高其抗菌效价、降低或消除其副作用。

中国专利201510064471.3中公开了一种杂合抗菌肽及其编码基因和应用，所述杂合抗菌肽包括串联连接的抗菌肽LfcinB和抗菌肽G13；该杂合抗菌肽具有更强的杀菌活性；该发明还提供了该杂合抗菌肽的真核表达系统，即将该杂合抗菌肽的编码基因导入酿酒酵母蛋白表达系统中，易于操作、安全无毒素、易于纯化、工艺简单、成本低廉，具有广阔的应用前景。但其仅对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表现出明显的抑菌活性，抗菌谱覆盖面较窄。

中国专利202010831482.0中公开了一种抗菌肽及其应用，属于生物技术领域。该抗菌肽是基于从牛中性粒细胞中分离得到的抗菌肽Indolicidin通过理性分子设计得到的，该发明提供的抗菌肽具有良好的结构特性，可显著提高对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和黄曲霉的抑菌效果，同时有效降低鸡红细胞的溶血率和细胞毒性，可有效用于动物相关的生产活动中。但该多肽序列较短，不稳定性较强。

发明内容

为了解决上述问题，本发明基于BMAP 28(NCBI Reference Sequence:NP_776935.1)设计了一种RP23蛋白，其制备方法简便，抗菌活性高，且不易产生耐药性。

本发明中，“肽”指α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。由21个以下氨基酸分子组成的肽叫“多肽”；21个以上氨基酸分子组成的叫“蛋白”。

本发明中，所述的“密码子简并性”指同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。特别是密码子第三位的胞嘧啶和尿嘧啶或鸟嘌呤和腺嘌呤的简并性常常等同。

本发明中，“重组表达载体”是指在载体骨架上插入相应的需要表达的蛋白的核酸分子构建出的能够表达相应蛋白的载体。通常来讲，载体骨架为质粒，也可以是其他形式的能够起到相同作用的载体骨架。所述的“重组表达载体”可以用于转染细胞并通过细胞进行蛋白的表达。

本发明中，“基因工程细胞”是指通过基因工程手段进行改造的细胞，所述的基因工程手段可以是质粒转化或者细胞融合等。

本发明中，“诱导剂”用于培养细胞时诱导表达蛋白，一般添加至培养细胞的培养液中完成诱导。

本发明中，“阳离子层析”又称阳离子交换层析，是指利用不同分子在所设计的条件(如pH、离子强度等)下，携带电荷情况不同，与阳离子交换剂结合的强度不同，可以用不同的条件洗脱出不同的组分的一种层析法。

本发明中，“亲和层析”又称亲和色谱层析、亲和色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。

本发明中，“革兰氏阴性菌”和“革兰氏阳性菌”是指用结晶紫液加碘液染色，再用酒精脱色，然后用稀复红液染色。经过这样的处理，被染成紫色的细菌是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。

一方面，本发明提供了一种蛋白。

所述的蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有90％以上一致性的序列。

所述的一致性表示序列间的一致程度。与SEQ ID NO.1具有90％以上一致性的序列通常理解为与SEQ ID NO.1发挥同样功能作用。

另一方面，本发明提供了一种核酸分子。

所述的核酸分子用于表达前述的蛋白。

优选地，所述的核酸分子用于表达SEQ ID NO.1。

优选地，所述的核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-4；进一步优选为SEQ IDNO.2。

所述的核酸分子还可以是根据密码子简并性对SEQ ID NO.2-4进行碱基替换后的序列。

所述的碱基替换为将核酸分子序列上的碱基从一种类型替换至另一种类型，但该种替换不影响最终的表达产物的氨基酸序列。

再一方面，本发明提供了一种重组表达载体。

所述的重组表达载体上包括前述的核酸分子。

优选地，所述的重组表达载体上还包括驱动所述核酸分子表达的启动子。

优选地，所述启动子为T7启动子。

优选地，所述重组表达载体的骨架为pET-28a。

优选地，所述核酸分子位于所述载体的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间。

又一方面，本发明提供了一种基因工程细胞。

所述的基因工程细胞中包括前述的重组表达载体。

优选地，所述的基因工程细胞为大肠杆菌。

又一方面，本发明提供了前述的蛋白的制备方法。

所述的制备方法中包括培养前述的基因工程细胞。

优选地，所述基因工程细胞的培养液的OD₆₀₀达到0.5-1.5时，加入诱导剂进行诱导培养。

优选地，所述基因工程细胞的诱导培养的温度为28-32℃，pH为6.8-7.2，诱导培养的时间10-15h。

所述的诱导剂在培养液中的浓度控制为0.1-2mM。

优选地，所述的诱导剂为IPTG。

在本发明的一些实施方案中，当重组细胞为大肠杆菌时，所述方法包括：在培养结束后，收集菌体对其进行细胞壁破碎，收集破壁液。

在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：对所述破壁液进行酸解破壁，离心收集上清。

在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括，对前述的上清液进行调pH值，离心收集上清液。

在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：将调pH值后的上清液后再进行阳离子层析，用洗脱溶液洗脱后，收集洗脱液。

优选地，所述的阳离子层析所用的层析介质为CM-Sepharose Fast Flow介质。

优选地，所述的洗脱溶液是含1.2M NaCl的Tris-HCl溶液和/或2M NaCl的Tris-HCl溶液。

在本发明的一些实施方案中，前述的洗脱液需要通过亲和层析。

优选地，所述的亲和层析所用的层析介质为Ni亲和层析树脂。

优选地，所述的亲和层析洗脱溶液是含0.5M NaCl、0.1M咪唑的Tris-HCl溶液和2MNaCl或0.5M咪唑的Tris-HCl溶液。

在本发明的一些实施方案中，所述方法还包括：采用分子截留量为1KD的透析袋对亲和层析的洗脱峰透析脱盐，得到所述重组修复蛋白RP23。

又一方面，本发明提供了前述的蛋白和/或核酸分子和/或重组表达载体和/或基因工程细胞在制备抗菌剂中的应用。

所述的抗菌剂适用于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌。

优选地，所述菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌中的一种或多种。

所述的抗菌剂可以是喷雾剂、溶液剂、凝胶剂、乳液剂、软膏剂、含漱剂、贴剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、膜剂或泡沫剂。

又一方面，本发明提供了一种抗菌剂。

所述的抗菌剂中包括前述的蛋白和/或核酸分子和/或重组表达载体和/或基因工程细胞。

所述的抗菌剂适用于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的蛋白对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及白色念珠菌等真菌均具有良好的抑菌效果。

(2)本发明提供的表达蛋白的核酸分子表达效率较高，尤其SEQ ID NO.2提供的核酸分子优于其他核酸分子的表达效率。

(3)本发明提供的蛋白的制备方法和纯化方法得到的产物纯度高，在95％以上。

附图说明

图1为重组大肠杆菌诱导表达结果。

图2为RP23蛋白纯化后凝胶电泳图。

图3为RP23蛋白的CM-sepharose FF层析图。

图4为RP23蛋白的Ni亲和层析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

依据美国药典规定，21个氨基酸以下的定义为多肽，21个氨基酸以上的定义为蛋白。本发明所述的氨基酸序列由23个氨基酸组成，故称RP23蛋白。

实施例1RP23重组大肠杆菌的构建

1、首先构建含有表达RP23蛋白的基因的表达载体，方法如下：

采用全基因合成技术合成含RP23基因片段：

CCATGGATGGGTCTGCGTAAACTGGGCCGTAAAAAACTGCGCGCATGGAAAAAAGGCCGTTCTCACCA TCATCACTGACTCGAG(SEQ ID NO.5)。

其中，下划线处字母为RP23基因序列SEQ ID NO.2，该序列是根据大肠杆菌密码子偏好性进行设计，编码的氨基酸序列为MGLRK LGRKK LRAWK KGRSH HHH(RP23 ID NO.1)；5’端和3’端分别具有限制性内切酶NcoI和XhoI位点。

pET-28a载体使用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，SDS凝胶电泳确认酶切成功后，与以上合成的含RP23基因片段进行酶连，送检确认构建无误，得到pET28a(+)-RP23表达载体。

2、构建含有pET28a(+)-RP23表达载体的重组大肠杆菌

将测序正确的重组载体pET-28a(+)-RP23用热激法转化BL21(DE3)Plys大肠杆菌，并用LB(含硫酸卡那霉素，100μg/mL)平皿进行筛选。热激法采用42℃热激1.5分钟，冰上静置5分钟；然后加入600μL无抗性的LB肉汤培养基37℃、120rpm培养约1小时，在12000r/min下离心1min，去除600uL上清液后吹打均匀；最后将其均匀涂布在含有硫酸卡那霉素的LB抗性平板上，37℃倒置培养过夜，进行阳性克隆筛选。

得到的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)Plys-RP23。

实施例2-3RP23其他基因片段的工程菌制备

参照实施例1的制备方法，差别如下

	与实施例1的差别
		实施例2	RP23基因为SEQ ID NO.3
实施例3	RP23基因为SEQ ID NO.4

制备得到重组大肠杆菌BL21(DE3)Plys-RP23-2(实施例2)和BL21(DE3)Plys-RP23-3(实施例3)。

实施例4重组大肠杆菌的表达检测

分别取实施例1-3的重组大肠杆菌，采用LB基础培养基在37℃、220rpm培养，当菌体密度OD₆₀₀达到1-2时，降温至30℃，添加1mM IPTG诱导4-5小时；取0.1mL菌液离心收集菌体，加入4×loading buffer 20μL、纯化水60μL，100℃煮10min，12000rpm离心后取上清进行全菌电泳，用于检测诱导表达情况，结果见图1。

图1中，第1泳道为实施例2的重组大肠杆菌诱导表达量，第4泳道为实施例3的重组大肠杆菌诱导表达量，泳道5为实施例1的重组大肠杆菌诱导表达量，泳道2为空白菌，泳道3为RP23化学合成样品；可以看出，泳道5的条带颜色更深，说明实施例1的重组大肠杆菌中的RP23表达水平较高，表明实施例1中的RP23编码序列(RP23 ID NO.2)其表达效率更高，高于实施例2-3的RP23编码序列。

实施例5重组RP23的纯化

为了获得RP23，采用4个2L的三角瓶摇菌，培养基为LB培养基培养实施例1的重组大肠杆菌。

培养基配方：10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl溶于1L纯化水。

接种比例按1：1000，37℃170r/min培养8h，OD₆₀₀在1.0左右时，加入诱导剂IPTG，IPTG浓度在1mM，在30℃170r/min过夜诱导。诱导完成后在9000r/min 4℃下离心15min，收集菌体。

重组RP23的纯化步骤如下：

(1)将培养的菌液，在9000r/min 4℃下离心15min，收集菌体；

(2)将收集的菌体重悬纯化水中，添加浓12M HCl使其终浓度在0.3M左右，放入65℃水浴锅时孵育30分钟。在4℃12000r/min下离心25min，收集上清；

(3)采用1M NaOH裂解液pH至7.2，在4℃12000r/min下离心30min，收集上清；

(4)上述澄清液进行阳离子层析，阳离子层析所用的层析介质为CM-SepharoseFast Flow介质，首先含1.2M NaCl的PH7.2 0.02M Tris-HCl缓冲液洗涤杂质蛋白，再用含2M NaCl的PH7.2 0.02M Tris-HCl缓冲液洗涤目的蛋白，收集洗脱峰；

(5)上述洗脱液用0.02M Tris-HCl PH7.2缓冲液稀释5倍，通过Ni亲和层析，先用0.1M咪唑、0.5M NaCl、PH7.2 0.02M Tris-HCl缓冲液去除杂质，再用0.5M咪唑、0.5M NaCl、PH7.2 0.02M Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰；

(6)上述洗脱液经过截留分子量1KD的超滤膜在纯化水中4℃下透析脱盐，每次透析4h，换液3次，得到RP23。

本实施例制备的蛋白纯度均大于95％。

RP23纯化后凝胶电泳图如图2所示，泳道1为化学合成重组修复蛋白RP23蛋白、泳道2为纯化后重组修复蛋白RP23蛋白、泳道3为marker。

RP23的CM-sepharose FF层析图如图3所示。

RP23的Ni亲和层析图谱如图4所示。

实施例6重组修复蛋白RP23生物学活性检测

对使用实施例1的重组大肠杆菌制备并纯化的的RP23按照以下实验步骤进行MIC实验：

(1)将指示菌接种于TSB(北京三药，批号2101152)、SDB(北京三药，批号2010132)培养基，其中大肠杆菌(杭州微球，菌种编号CMCC(B)44102)和金黄色葡萄球菌(杭州微球，菌种编号CMCC(B)26003)接种于TSB中；白色念球菌(杭州微球，菌种编号CMCC(F)98001)接种于SDB中。33℃，180-220rpm培养48小时，调整OD₆₀₀为0.8-0.9左右作为待用菌悬液，用MH肉汤培养基(北京三药，批号210315)稀释500倍后备用；

(2)取一支样品吸取50μL，2倍法逐级，稀释液为无菌超纯水，共稀释11级；

(3)吸取50μL的各级稀释样品或者硫酸卡那霉素标品(阿拉丁，lot：D2117217)加入到96孔板，再吸取50μL待测菌加入96孔板中，第12孔为不含待测样品的生长对照。同时设置稀释液与MH肉汤的阴性对照组，每组两个平行。35℃，孵育17h，观测记录结果，结果见下表：

其中，1、2为大肠杆菌，3、4为金黄色葡萄球菌，5、6白色念球菌；可以看出，本发明制备的RP23对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及白色念珠菌等真菌均具有良好的抑菌效果。

对比例

对现有技术中的抗菌肽的抗菌性能(MIC值)进行总结如下：

注：[1]顾晨涛,黄洒,王雪燕,等.鲫鱼鱼鳞抗菌多肽的制备纯化及其抑菌活性研究[J].食品科学,2019,40(22):6.

与实施例6的数据进行对比表明，本申请提供的RP23的抑菌效果更好。

序列表

<110> 长春普思康医疗科技有限公司

<120> 一种具有抑菌功能的RP23蛋白

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Leu Arg Lys Leu Gly Arg Lys Lys Leu Arg Ala Trp Lys Lys

1 5 10 15

Gly Arg Ser His His His His

20

<210> 2

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtctgc gtaaactggg ccgtaaaaaa ctgcgcgcat ggaaaaaagg ccgttctcac 60

catcatcact ga 72

<210> 3

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtctgc gtaaactggg tcgtaaaaaa ctgcgtgcat ggaaaaaggg ccgttctcac 60

catcaccata tga 73

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggtctgc gtaaactggg tcgtaagaaa ctgcgcgcct ggaaaaaagg ccgttctcac 60

caccaccact ga 72

<210> 5

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatggatgg gtctgcgtaa actgggccgt aaaaaactgc gcgcatggaa aaaaggccgt 60

tctcaccatc atcactgact cgag 84

Claims

1.一种蛋白在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1；所述的抗菌剂针对的菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌中的一种或多种。

2.一种核酸分子在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述的核酸分子用于表达SEQID NO.1所示的氨基酸序列，所述的抗菌剂针对的菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的核酸分子包含SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4中的一种或两种。

4.一种重组表达载体在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述的重组表达载体中包括权利要求2-3任一项中所述的核酸分子，所述的抗菌剂针对的菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌中的一种或多种。

5.一种基因工程细胞在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述的基因工程细胞中包括权利要求4中所述的重组表达载体，所述的抗菌剂针对的菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌中的一种或多种。