CN109971776A - 基于光切割基序的蛋白纯化方法 - Google Patents

基于光切割基序的蛋白纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109971776A
CN109971776A CN201711456927.6A CN201711456927A CN109971776A CN 109971776 A CN109971776 A CN 109971776A CN 201711456927 A CN201711456927 A CN 201711456927A CN 109971776 A CN109971776 A CN 109971776A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
lys
peptide
fusion protein
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711456927.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109971776B (zh
Inventor
王靖
王磊
安泰
陈博
朱镜羲
杨凯
牛兴和
郝小明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cofco Corp
Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Original Assignee
Cofco Corp
Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cofco Corp, Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd filed Critical Cofco Corp
Priority to CN201711456927.6A priority Critical patent/CN109971776B/zh
Publication of CN109971776A publication Critical patent/CN109971776A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109971776B publication Critical patent/CN109971776B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于光切割基序对目的肽进行纯化的方法。具体而言，本发明的蛋白纯化方法通过光切割基序将功能片段与目的肽相连，利用功能片段进行纯化，随后通过使用365‑450nm的光照射使得光切割基序光解，将所述目的肽与所述功能片段分离，从而获得目的肽。该纯化方法适用于对多种表达系统表达的蛋白(特别是分子量低的小肽)进行纯化，具有成本低、流程简单、易于工业化实现等优点，可用于实验室规模的蛋白纯化，也有利于工业化规模的低成本蛋白生产。

Description

基于光切割基序的蛋白纯化方法
技术领域
本发明涉及一种基于光切割基序对目的肽进行纯化的方法。具体而言，本发明通过光切割基序将功能片段与目的肽相连，利用功能片段进行纯化，随后通过使用特定波长的光照射使得光切割基序处发生断裂(光解)，从而获得目的肽。
背景技术
无论是实验室规模还是工业生产领域，蛋白纯化都是基因工程和蛋白质工程中的关键环节。据统计，基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60％～80％(陈浩、陈玉红、朱德煦、刘建宁，重组蛋白纯化技术，中国生物工程杂志，2002，22(5)：87-92)。已经开发出高效的原核、真菌和真核细胞类蛋白表达体系，然而，不论通过何种体系表达，目的肽都可能与组织和细胞中的其它蛋白相互作用形成复杂的混合物，造成分离纯化十分困难。
目前使用的纯化方法主要包括层析(例如离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析等)和电泳技术。然而，就层析技术而言，离子交换层析和疏水性相互作用层析对初始样品的理化性质有一定的要求，通用性和纯化效率不高；亲和层析需要使用带有不同特异性标签的凝胶树脂，并且在纯化后需要添加蛋白酶去除特殊的标签氨基酸序列，纯化成本高昂。另一方面，对于电泳技术，其分离精度和纯化效率也难以满足现有的需求。因此，这两种方法均不利于大规模工业领域生产与应用。总体来说，蛋白纯化技术在效率和成本方面仍有待提高。
最近提出了利用自组装短肽对蛋白进行纯化的方法。这类短肽的氨基酸序列具有能够借助氢键、静电相互作用或亲疏水相互作用而形成聚集体的特征。例如，用于对蛋白进行纯化的自组装短肽的氨基酸序列可具有交替出现的正负电荷(例如-+-+-+-+，--++--++，----++++)，由于静电相互作用形成稳定的β折叠而发生聚集，最终形成脚手架式的水凝胶，因此易于通过离心等方式分离。此类短肽在组织工程、药物递送和生物膜工程中可发挥重要作用。然而，在这样的方法中，仍缺少对自组装过程进行有效控制的手段。此外，现有方法大多通过蛋白酶消化或化学切割的方式去除短肽，因此对目的肽的序列特征有一定的要求。
最近发展的光遗传学技术通过在体内表达能够响应于光刺激而发生肽键断裂的荧光蛋白，实现对功能蛋白定位的调控或蛋白纯化。例如，Floyd,N.等，2009，Photoinduced,family-specific,site-selective cleavage of TIM-barrel proteins.JAm Chem Soc 131，12518-12519公开了将响应于UV光而断裂GH-1片段与亲和层析标签(例如六聚组氨酸标签)相连，从而避免了洗脱中由于缓冲液pH的改变或蛋白变性剂的加入而导致的折叠错误。然而，在该方法中，为了使得肽键断裂，UV光的照射时间长达数小时；此外，仍需要变性和重新折叠才能释放GH-1片段。因此，本领域仍需开发新的用于蛋白纯化的光切割基序。
发明内容
本发明提供了一种蛋白纯化方法，所述方法包含如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离；
c)利用365-450nm波长的光对所述融合蛋白照射30-100min；以及
d)将所述目的肽从所述片段混合物中分离，从而获得纯化的所述目的肽。
有益效果
本发明基于光切割基序能够响应于特定波长的光照自发断裂的特性，方便快捷地将用于纯化的功能片段与目的肽进行分离，有利地克服了现有蛋白纯化技术成本高、纯化标签切割效率低、操作步骤复杂等缺陷。本发明的方法大幅度降低了蛋白纯化工艺的时间和经济成本，并提高了蛋白纯化的效率和收率，不但可用于实验室规模的高通量蛋白纯化，还能够应用于工业领域。此外，现有技术已建立的各种多肽或蛋白表达体系表达的蛋白均能够用本发明的方法进行纯化，本发明的方法具有较宽的适应性。
进而，在用于纯化的功能片段为自组装短肽的优选实施方式中，由于自组装肽和光切割基序的累计大小约为33kD，且能够在纯化后切除用于纯化的片段，本发明的方法特别适用于难以使用传统方法纯化的不超过100个氨基酸的小肽(分子量低于10,000Da)。此外，利用自组装短肽实施纯化的实施方式无需使用昂贵的亲和层析柱和蛋白酶，且操作步骤简单易行(例如可通过离心完成)，可高效便捷地获得纯度较高的目的肽。
附图说明
图1为本发明融合蛋白的设计原理示意图，在该融合蛋白中，通过光切割基序将目的肽与功能片段可操作地连接。利用365-450nm的光照射后功能片段与目的肽分离。
图2为根据本发明，利用金属螯合层析与光照切割相结合的实施方式的蛋白纯化原理示意图。在宿主细胞中表达融合蛋白后，通过高压匀浆破碎获得包含融合蛋白的匀浆上清。融合蛋白的N端含有His-tag，从而能够通过金属螯合层析(Ni柱)对融合蛋白进行纯化。利用凝胶过滤层析对纯化获得的融合蛋白进行脱盐，去除蛋白中的咪唑。然后利用365-450nm波长的光源对脱盐后的融合蛋白进行光照。由于His-tag位于融合蛋白N端的光切割蛋白上，因此将切割后的溶液进行第二次金属螯合层析(Ni-柱)，带有His-tag的光切割蛋白结合在层析柱上，目的多肽则不能与层析柱结合，收集此时的流出液即为目的多肽。
图3为根据本发明，融合蛋白包含自组装肽的实施方式的蛋白纯化原理示意图。在宿主细胞中表达融合蛋白后，通过超声破碎获得包含融合蛋白的细胞沉淀。融合蛋白带有的自组装短肽使得融合蛋白形成不溶性聚集体，从而能够通过离心的方式将可溶性杂质与不溶性融合蛋白(包含目的肽)分离。然后利用365-450nm波长的光源对脱盐后的融合蛋白进行光照，将含有自组装短肽的不溶性聚集体与目的肽分离，离心后获得可溶性的纯化后的目的肽。
图4为根据实施例1，融合蛋白6His-Light X-Histatin1表达、纯化、脱盐及光照切割产物、切割后蛋白溶液进行第二次Ni-柱分离的SDS-PAGE结果。加入各泳道的样品分别为蛋白Marker、细胞破碎液、结合缓冲液洗脱液(透过)、20mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、250mM咪唑洗脱液、包含融合蛋白的脱盐后样品、光照切割后样品(2个平行实验)、对二次镍柱纯化的结合缓冲液洗脱液冻干的样品。6His-Light X-Histatin1的分子量大小为34kDa，带有光切割基序C端27aa的目的多肽Histatin1的分子量大小为10kDa。二次镍柱纯化的结合缓冲液洗脱液(即，未与镍柱结合)中样品的分子量大小为10kDa，是纯度较高的Histatin1。
图5为实施例1获得的目的多肽Histatin1的抑菌活性测定结果。测得Histatin 1对白色念球菌的MIC值为30μg/mL。
图6为根据实施例2，融合蛋白聚集肽-Light I-Histatin1表达、光照切割产物的SDS-PAGE结果。加入各泳道的样品分别为蛋白Marker、细胞破碎液上清、细胞破碎液上清切割产物、细胞破碎液沉淀、细胞破碎液沉淀切割产物、细胞破碎液沉淀切割产物离心上清液、细胞破碎液沉淀切割产物离心沉淀。聚集肽-Light I-Histatin1的分子量大小为38kDa，带有光切割基序C端27aa的目的多肽Histatin1的分子量大小为10kDa。
图7为根据实施例3，融合蛋白6His-Light G-Defensin5纯化、及光照切割产物的SDS-PAGE结果。加入各泳道的样品分别为第一次镍柱纯化后的样品、第二次镍柱纯化后的250mM咪唑洗脱液样品和蛋白Marker。6His-Light G-Defensin5的分子量大小为35kDa，带有光切割基序C端27aa的目的多肽Histatin1的分子量大小为10kDa。
图8为实施例所使用的质粒pBAD的质粒图谱。
图9为根据实施例4，不同波长下切割产物的SDS-Page结果。
图10为根据实施例4，不同波长下切割产物的Western印迹结果。
图11为根据实施例4，不同切割时间产物的SDS-Page结果。
图12为根据实施例4，不同切割时间产物的Western印迹结果。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
本发明的蛋白纯化方法涉及利用光切割基序的光敏感性质，通过将带有纯化功能片段的光切割基序与目的多肽融合表达，首先将融合蛋白与其它细胞组分分离，随后利用光切割基序的光敏感性质，在365-450nm、优选385nm的光照条件下，将目的多肽与纯化功能片段-光切割基序片段分离，经过第二步去除带有纯化功能片段的光切割基序，实现目的多肽的纯化。
本文所述的目的多肽和蛋白可为任何感兴趣的多肽及蛋白，例如抗菌肽、不超过100个氨基酸的小肽(分子量低于10,000Da)或其它分子量较大的蛋白。由于在本发明中，目的多肽的序列并不影响纯化效率，目的多肽或蛋白可具有任何序列。由于光照后光切割基序产生的C端片段远小于N端片段，优选将目的多肽或蛋白设置于光切割基序的C端，功能片段设置于融合蛋白的N端。
本文所使用的术语“光切割基序”是指能够响应于特定波长的光照(例如365-450nm的光照、优选385nm光照)而发生肽键断裂的蛋白序列。能够用于本发明的光切割基序具有选自于由SEQ ID NO：1-6中任一项所组成的组。
SEQ ID NO：1(Light X，分子量27kDa)：
GGSHHHHHHSSSVIPDYFKQSFPEGYSWERSMTYEDGGICIATNDITMEGDSFINKIHFKGTNFPPNGPVMQKRTVGWEASTEKMYERDGVLKGDVKMKLLLKGGGHYRCDYRTTYKVKQKPVKLPDYHFVDHRIEILSHDKDYNKVKLYEHAVARNSTDSMDELYKGGSGGMVSKGEETITSVIKPDMKNKLRMEGNVNGHAFVIEGEGSGKPFEGIQTIDLEVKEGAPLPFAYDILTTAFHYGNRVFTKYPRGGGGS
SEQ ID NO：2(Light L，分子量27kDa)：
GGSHHHHHHSSSVIPDYFKQSFPEGYSWERSMTYEDGGICIATNDITMEDDSFINKIHFKGTNFPPNGPVMQKRTVGWEASTEKMYERDGVLKGDVKMKLLLKGGGHYRCDYRTTYKVKQKPVKLPDYHFVDHRIEILSHDKDYNKVKLYEHAVARNSTDSMDELYKGGSGGMVSKGEETITSVIKPDMKNKLRMEGNVNGHAFVIEGEGSGKPFEGIQTIDLEVKEGAPLPFAYDILTTAFHYGNRVFTKYPRGGGGS
SEQ ID NO：3(Light I，分子量27kDa)：
GGSHHHHHHSSSVIPDYFKQSFPEGYSWERSMTYEDGGICIATNDITMEGDSFINKIHFKGTNFPPNGPVMQKRTVGWEASTEKMYDRDGVLKGDVKMKLLLKGGGHYRCDYRTTYKVKQKPVKLPDYHFVDHRIEILSHDKDYNKVKLYEHAVARNSTDSMDELYKGGSGGMVSKGEETITSVIKPDMKNKLRMEGNVNGHAFVIEGEGSGKPFEGIQTIDLEVKEGAPLPFAYDILTTAFHYGNRVFTKYPRGGGGS
SEQ ID NO：4(Light G，分子量27kDa)：
GGSHHHHHHSSSVIPDYFKQSFPEGYSWERSMTYEDGGICIATNDITMEGDSFINKIHFKGTNFPPNGPVMQKRTVGWEASTEKMYDRDGVLKGDVKMKLLLKGGAHYRCDYRTTYKVKQKPVKLPDYHFVDHRIEILSHDKDYNKVKLYEHAVARNSTDSMDELYKGGSGGMVSKGEETITSVIKPDMKNKLRMEGNVNGHAFVIEGEGSGKPFEGIQTIDLEVKEGAPLPFAYDILTTAFHYGNRVFTKYPRGGGGS
SEQ ID NO：5(Ligh H，分子量27kDa)：
GGSHHHHHHSSSVIPDYFKQSFPEGYSWERSMTYEDGGICIATNDITMEGDSFINKIHFKGTNFPPNGPVMQKRTVGWEASTEKMYDRDGVLKGDVKMKLLLKGGAHYRCDYRTTYKVKQKGVKLPDYHFVDHRIEILSHDKDYNKVKLYEHAVARNSTDSMDELYKGGSGGMVSKGEETITSVIKPDMKNKLRMEGNVNGHAFVIEGEGSGKPFEGIQTIDLEVKEGAPLPFAYDILTTAFHYGNRVFTKYPRGGGGS
SEQ ID NO：6(Ligh T，分子量27kDa)：
GGSHHHHHHSSSVIPDYFKQSFPEGYSWERSMTYEDGGICIATNDITMEGDSFINKIHFKGTNFPPNGPVMQKRTVGWEASTEKMYDRDGVLKGDVKMKLLLKGGAHYRCDYRTTYKVKQKPVKLPDSHFVDHRIEILSHDKDYNKVKLYEHAVARNSTDSMDELYKGGSGGMVSKGEETITSVIKPDMKNKLRMEGNVNGHAFVIEGEGSGKPFEGIQTIDLEVKEGAPLPFAYDILTTAFHYGNRVFTKYPRGGGGS
本文使用的术语“功能片段”或“纯化功能片段”为方便目的肽纯化的片段，包括但不限于如下的一种或多种片段：具有自组装或自聚集功能的肽或纯化标签。
本领域知晓的在蛋白纯化中常用的标签均可用于本发明，例如多组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、血凝素标签、FLAG标签、myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
本领域知晓具有自组装或自聚集功能的肽。这些肽的序列中带有特定排列顺序的氨基酸，能够自组装或自聚集为β-折叠结构。在一些实施方式中，所述具有自组装或自聚集功能的肽例如为具有两亲性的肽。能够用于本发明的具有自组装或自聚集功能的肽包括但不限于LELELKLKLELELKLKSRENLYFQGWSHPQFEKAAHHHHHHH(SEQID NO：7)或LELELKLKLELELKLKHHHHHHH(SEQ ID NO：8)。在一些实施方式中，光切割基序与功能片段之间进一步设置有连接肽。所述连接肽为不具有功能域的柔性片段，例如PTPPTTPTPPTTPTPTP(SEQ ID NO：9)。
如上所述，本发明的纯化方法可针对利用多种表达系统所表达的蛋白，对于宿主细胞没有任何限制，所述宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。例如，本发明使用的宿主细胞包括但不限于源自于如下物种的细胞：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacilllus subtilis)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、昆虫或哺乳动物。
在一些实施方式中，宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选为Top10或DH10B菌株。在一些实施方式中，宿主细胞为昆虫表达系统的细胞，优选为细胞株Sf9、Sf21或High Five或它们的衍生细胞株；就这些宿主细胞而言，所使用的表达载体优选为杆状病毒表达系统的载体。在一些实施方式中，宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为细胞株CHO、HEK293及它们的衍生细胞株；就这些宿主细胞而言，所使用的表达载体可为瞬时转染或稳定转染表达体系。本发明使用的表达载体包括但不限于pBAD系列载体、pET系列载体、pGEX系列载体、pPIC系列载体、pFastBac系列载体、pcDNA系列载体。
在本发明的纯化方法中，步骤b)使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离、以及步骤d)使得所述目的肽与所述功能片段相分离依赖于所使用的功能片段。
在利用纯化标签作为功能片段的实施方式中，步骤b)中，通过将宿主细胞裂解或破碎，利用纯化标签对包含融合蛋白的细胞裂解液进行亲和层析，并在亲和层析后对所述融合蛋白进行脱盐，使得融合蛋白与杂质分离。步骤d)中，通过利用纯化标签对包含经步骤c)照射后的片段混合物进行亲和层析，并在亲和层析后对所述目的肽进行脱盐，获得纯化的所述目的肽。由于融合蛋白被切割后，只有带有纯化标签的光切割基序能够与亲和柱结合，能够获得不带有纯化标签的目的肽。亲和层析所使用的洗脱缓冲液优选为20mMNaH2PO4、500mM NaCl、250mM咪唑(pH 7.5)缓冲液。脱盐缓冲液优选为20mM NaH2PO4、20mMNaCl(pH 7.5)缓冲液。
在利用纯化标签作为功能片段的优选实施方式中，所述方法包含如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)利用高压匀浆装置破碎宿主细胞，利用所述纯化标签对包含融合蛋白的细胞裂解液进行亲和层析，并在亲和层析后对所述融合蛋白进行脱盐，使得融合蛋白与杂质分离；
c)利用385nm波长的光对所述融合蛋白照射80-100min，使得所述光切割基序断裂，得到片段混合物；以及
d)利用所述纯化标签对包含经步骤c)照射后的片段混合物进行亲和层析，并在亲和层析后对所述目的肽进行脱盐，获得纯化的所述目的肽，
其中，所述光切割基序具有选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所组成的组中的任一序列。
在利用具有自组装或自聚集功能的肽作为功能片段的实施方式中，步骤b)中，通过对所述宿主细胞进行裂解或破碎，离心去除所述宿主细胞的裂解液或匀浆液中的可溶部分，使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离。步骤d)中，由于具有自组装或自聚集功能的肽能够自发彼此结合形成沉淀，可在步骤c)的切割后通过离心或膜过滤，去除包含自组装肽的片段，从而获得纯化的目的肽。
在利用具有自组装或自聚集功能的肽作为功能片段的优选实施方式中，所述方法包含如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)利用匀浆装置破碎宿主细胞，离心去除所述宿主细胞的匀浆液的可溶部分，获得包含所述融合蛋白的沉淀部分；
c)利用385nm波长的光对所述融合蛋白照射80-100min，使得所述光切割基序断裂，得到片段混合物；以及
d)离心或过膜，去除经步骤c)照射后的片段混合物中包含所述功能片段的部分，获得纯化的所述目的肽，
其中，所述光切割基序具有选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所组成的组中的任一序列。
在优选的实施方式中，步骤c)的光切割条件首选385nm波长，切割时间90min。在优选的实施方式中，可将收集到的目的肽进行冷冻干燥，低温保存。
可通过以下的编号段落对本文各个方面的实施方式进行说明。
1.一种蛋白纯化方法，所述方法包含如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离；
c)利用365-450nm波长的光对所述融合蛋白照射80-100min，得到片段混合物；以及
d)将所述目的肽从所述片段混合物中分离，从而获得纯化的所述目的肽。
2.如段落1所述的方法，其中，所述光切割基序具有选自于由SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：6所组成的组中的任一序列。
3.如段落1或2所述的方法，其中，步骤a)中，所述目的肽具有小于50kDa的分子量、优选具有5kDa-10kDa的分子量。
4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中，步骤a)中，所述目的肽位于所述融合蛋白的C端，所述功能片段位于所述融合蛋白的N端。
5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中，步骤a)中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
6.如段落5所述的方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、里氏木霉、黑曲霉、昆虫或哺乳动物细胞。
7.如段落6所述的方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选为Top10或DH10B菌株。
8.如段落6所述的方法，其中，所述宿主细胞为昆虫细胞，优选为细胞株Sf9、Sf21或High Five细胞。
9.如段落6所述的方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为细胞株CHO或HEK293细胞。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中，步骤a)中，所述光切割基序与所述功能片段之间进一步设置有连接肽；优选地，所述连接肽为PTPPTTPTPPTTPTPTP。
11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中，步骤a)中，所述功能片段选自于如下的一种或多种片段：具有自组装或自聚集功能的肽或纯化标签。
12.如段落11所述的方法，其中，所述功能片段为具有自组装或自聚集功能的肽，并且所述具有自组装或自聚集功能的肽为具有两亲性的肽。
13.如段落11所述的方法，其中，所述功能片段为具有自组装或自聚集功能的肽，并且所述具有自组装或自聚集功能的肽所具有的序列选自于SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
14.如段落12或13所述的方法，其中，步骤b)中，通过对所述宿主细胞进行裂解或破碎，离心去除所述宿主细胞的裂解液或匀浆液中的可溶部分，获得包含所述融合蛋白的沉淀部分，从而使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离。
15.如段落12-14中任一项所述的方法，其中，步骤d)中，通过离心或膜过滤，去除经步骤c)照射后的所述片段混合物中包含所述具有自组装或自聚集功能的肽的部分，获得纯化的所述目的肽。
16.如段落12所述的方法，所述方法包含如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)利用匀浆装置破碎宿主细胞，离心去除所述宿主细胞的匀浆液的可溶部分，获得包含所述融合蛋白的沉淀部分；
c)利用365-450nm波长，优选为385nm波长的光对所述融合蛋白照射80-100min，使得所述光切割基序断裂，得到片段混合物；以及
d)离心或过膜，去除经步骤c)照射后的片段混合物中包含所述功能片段的部分，获得纯化的所述目的肽，
其中，所述光切割基序具有选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所组成的组中的任一序列。
17.如段落11所述的方法，其中，所述功能片段为纯化标签。
18.如段落17所述的方法，其中，所述纯化标签选自于多组氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、血凝素标签、FLAG标签、myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、几丁质结合蛋白标签和荧光标签。
19.如段落17或18所述的方法，其中，步骤b)中，通过将所述宿主细胞裂解或破碎，对所述宿主细胞的裂解液或匀浆液进行亲和层析，并在亲和层析后对所述融合蛋白进行脱盐，使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离。
20.如段落17-19中任一项所述的方法，其中，步骤d)中，利用所述纯化标签对包含经步骤c)照射后的片段混合物进行亲和层析，并在亲和层析后对所述目的肽进行脱盐，获得纯化的所述目的肽。
21.如段落17所述的方法，所述方法包括如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)利用匀浆装置破碎宿主细胞，利用所述纯化标签对包含融合蛋白的细胞裂解液进行亲和层析，并在亲和层析后对所述融合蛋白进行脱盐，使得融合蛋白与杂质分离；
c)利用365-450nm波长，优选为385nm波长的光对所述融合蛋白照射80-100min，使得所述光切割基序断裂，得到片段混合物；以及
d)利用所述纯化标签对包含经步骤c)照射后的片段混合物进行亲和层析，并在亲和层析后对所述目的肽进行脱盐，获得纯化的所述目的肽，
其中，所述光切割基序具有选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所组成的组中的任一序列。
22.如段落1-21中任一项所述的方法，其中，步骤c)中，利用385nm波长的光对所述融合蛋白照射90min，得到片段混合物。
23.如段落1-22中任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过冷冻干燥将对所述目的肽进行保存的步骤。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明，然而，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。
以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物均由英潍捷基Invitrogen公司合成。
实施例中所使用的溶液及培养基成分如下所示。
Luria-Bertani(LB)液体培养基：
蛋白胨(Fisher Scientific) 10g/L；
NaCl(Fisher Scientific) 10g/L；
酵母粉(Fisher Scientific) 5g/L；
pH＝7。
121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基：与LB液体培养基的配方相同，添加1.5％琼脂粉。
氯霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度50μg/ml。
卡那霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度50μg/ml。
L-阿拉伯糖(Sigma)：溶于ddH2O，储液浓度20％，终浓度0.02-0.2％。MH培养基(Oxoid)：
牛肉粉：5.0g/L；
可溶性淀粉：1.5g/L；
酸水解酪蛋白：17.5g/L；
pH值7.3±0.1(25℃条件下)。
121℃高压灭菌20min后使用。
质粒构建及菌株培养、维持、诱导中均使用LB液体和固体培养基。
限制性内切酶、T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶购自New England Biolabs(Frankfurt，Germany)。引物和单链DNA片段(寡核苷酸)购自英潍捷基Invitrogen公司。使用Nano分光光度计ND-2000(Peqlab，Erlangen，Germany)检测DNA浓度。
除另有说明，本实施例所使用的试剂购自SIGMA。
全部质粒构建利用大肠杆菌DH5α菌株(TransGen Biotech)作为克隆菌株。利用大肠杆菌Top10或DH10B菌株(TransGen Biotech)作为表达菌株。所使用的质粒为pBAD(Invitrogen)。质粒的图谱如图8所示。
实施例1以野生型富组氨酸肽1(Histatin 1)作为目的肽的融合蛋白表达及其纯化
1、表达菌株的构建
本实施例使用野生型富组氨酸肽1(Histatin 1)(GenBank：NM_002159.3)作为目的肽。Histatin 1分子量为7kDa，具有抑菌活性。通过测定其对白色念球菌的最小抑菌浓度MIC，能够直观地检测Histatin1的功能。
本实施例使用六聚组氨酸标签作为功能片段。包含六聚组氨酸的融合蛋白能够使用镍柱进行亲和纯化。
设计N’-六聚组氨酸-光切割基序-Histatin1三联体融合蛋白6His-Light X-Histatin1对应的DNA序列(SEQ ID NO：10)，在该序列的两端分别添加NdeI和HindIII的酶切位点及保护碱基。通过英潍捷基Invitrogen公司合成该序列，并将其克隆入pMD19-T载体(Takara，Cat:3271)的NdeI和HindIII位点。利用NdeI和HindIII限制性内切酶对带有SEQID NO：10序列的pMD19-T载体进行双酶切后，将切割后得到的融合蛋白编码序列连入pBAD载体。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化细胞涂布于添加有100μg/mL氨苄霉素抗性LB平板上，筛选阳性克隆，提取质粒，并对其进行测序。测序结果表明所克隆的融合蛋白编码序列是正确的。将测序正确的质粒转化到大肠杆菌DH10B感受态细胞中，将转化细胞涂布于添加有100μg/mL氨苄霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆。
将能够在抗性平板上生长的菌落接种至含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，并在37℃下进行培养。在培养物的OD600达到约0.6时，添加L-阿拉伯糖至终浓度0.02％。28℃继续培养过夜诱导表达后，收集大肠杆菌，超声破碎，并通过SDS-PAGE确认表达了6His-Light X-Histatin1，从而确认获得了期望的菌株。
2、融合蛋白的表达与纯化
将步骤1中构建的能够表达6His-Light X-Histatin1的菌株接种到含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，培养过夜，次日将菌液以1:100的比例转接至含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6左右时，加入终浓度为0.02％的L-阿拉伯糖，在28℃条件下诱导16小时，收获细胞。以每10OD细胞加入1ml裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、500mMNaCl、pH 7.5缓冲液)重悬，高压匀浆破碎细胞(美国PhD公司D-3L设备，低压50MPa处理两次，高压低于150MPa处理两次)，4℃、13000rpm离心20min，分离上清和沉淀。由于融合蛋白N端带有His-tag，利用镍柱(GE)对上清中的融合蛋白进行金属螯合层析分离纯化。上样后，分别使用20mM咪唑、50mM咪唑和250mM咪唑顺序洗脱。对于250mM咪唑洗脱液进行脱盐，以除去咪唑。脱盐所使用的缓冲液为20mM NaH2PO4、20mM NaCl(pH7.5)。
对脱盐后的融合蛋白进行光照切割，光照光源为365-450nm波长的功率在100-300W之间的LED光源，切割时间90min。由于融合蛋白被切割后，只有带有His-tag的蛋白片段与镍柱亲和，因此利用镍柱对切割后的溶液再一次进行亲和层析，上柱后用结合缓冲液洗脱即可得到Histatin1，最后用250mM咪唑洗脱液将带有His-tag的光切割基序片段洗脱下来。如图4所示，对各步骤的溶液进行SDS-PAGE，可以看到，本发明的方法能够有效地对小肽进行纯化。
将收集到的蛋白进行冷冻干燥后，用冻干前十分之一体积的水进行重悬，测定蛋白浓度为0.175mg/mL，电泳结果如图4所示。
3、目的肽Histatin 1的功能
利用肉汤稀释法测定纯化获得的Histatin1对白色念球菌(ATCC10231)的最小抑菌浓度(MIC)。在37℃的LB培养基中将白色念球菌过夜培养至OD600＝1.0。用LB培养基将白色念球菌活稀释1000倍，取50μL加入96孔细胞培养板，添加步骤2生成的Histatin 1，使得在100μL反应体系中的终浓度分别为50、40、30、20、15和10μg/mL，将96孔细胞培养板置于30℃恒温培养箱，180rpm转速下培养16h后，利用酶标仪测定OD600值，并计算不同浓度Histatin1对白色念球菌的抑制率。结果如图5所示，Histatin1的最小抑菌浓度为30μg/mL，结果与文献报道的数值接近。
实施例2以聚集肽作为标签的融合蛋白表达及其纯化
1、表达菌株的构建
本实施例使用野生型富组氨酸肽1(Histatin 1)(GenBank：NM_002159.3)作为目的肽。Histatin 1分子量为7kDa，具有抑菌活性。通过测定其对白色念球菌的最小抑菌浓度MIC，能够直观地检测Histatin1的功能。
本实施例使用具有自组装功能的E16H8(SEQ ID NO：8)作为功能片段，由于E16H8具有自组装功能，能够在表达菌体内聚集形成不溶性聚集体，易于通过离心将其从菌体匀浆液中分离。
设计E16H8-Light I-Histatin 1三联体融合蛋白(E16H8-Light I-Histatin 1)对应的DNA序列(SEQ ID NO：11)，在该序列的两端分别添加NdeI和HindIII的酶切位点及保护碱基。通过英潍捷基Invitrogen公司合成该序列，并将其克隆入pMD19-T载体(Takara，Cat:3271)的NdeI和HindIII位点。利用与实施例1相同的方法，将该片段连入pMD19-T载体和pBAD载体，并转入大肠杆菌DH10B。通过SDS确认该菌株表达E16H8-Light I-Histatin 1。
2、融合蛋白的表达与纯化
将步骤1中构建的能够表达E16H8-Light I-Histatin 1的菌株接种到含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，培养过夜，次日将菌液以1:100的比例转接至含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6左右时，加入终浓度为0.02％的L-阿拉伯糖，在28℃条件下诱导16小时，收获细胞。以每10OD细胞加入1ml裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、500mMNaCl、pH 7.5缓冲液)重悬，超声破壁(功率110W，工作2sec，间歇2sec，总时间3min20sec)，4℃、13000rpm离心30min，分离上清和沉淀。将沉淀用等体积的裂解缓冲液重悬，再次离心，实施三次。将缓冲液洗涤后的沉淀用PBS缓冲液重悬，以光照光源为365-450nm波长的功率在100-300W之间的LED光源，切割时间90min，将照射后的溶液再次以13000rpm转速离心10min时间，分离上清和沉淀。对照射前后的溶液进行SDS-PAGE分析。
如图6所示，对细胞破碎液上清(泳道2)、细胞破碎液上清光切割产物(泳道3)、细胞破碎液沉淀(泳道4)、细胞破碎液沉淀切割产物(泳道5)、细胞破碎液沉淀切割产物离心上清液(泳道6和7)以及细胞破碎液沉淀切割产物离心沉淀(泳道8)进行SDS-PAGE可以看出，光照后融合蛋白发生断裂，分别产生33kDa和10kDa左右的片段。说明上述条件可使得E16H8-Light I-Histatin 1光解，且光解后的非目的肽部分(自组装肽)依然在沉淀中。应用Bio-Rad的Quantity One软件对SDS-PAGE结果进行分析，利用以不同浓度的BSA标准品制成的标准曲线估算对应条带的浓度，计算出纯化的Histatin 1的浓度为90％，切割效率为60％，收率(切割后上清目的肽质量/切割前沉淀中目的肽理论总质量)为75％。
实施例3以野生型防御素5(Defensin 5)作为目的肽的融合蛋白表达及其纯化
1、表达菌株的构建
本实施例使用野生型防御素5(Defensin 5)(GenBank：EU600778.1)作为目的肽。Defensin 5具有抑菌活性。通过将其滴加于涂布有细菌的平板表面并观察抑菌圈的大小，能够直观地检测该蛋白的活性。
本实施例使用六聚组氨酸标签作为功能片段。包含六聚组氨酸的融合蛋白能够使用镍柱进行亲和纯化。
设计六聚组氨酸-Light G-Defensin 5三联体融合蛋白(6His-Light G-Defensin5)对应的DNA序列(SEQ ID NO：12)，在该序列的两端分别添加NdeI和HindIII的酶切位点及保护碱基。通过英潍捷基Invitrogen公司合成该序列，并将其克隆入pMD19-T载体(Takara，Cat:3271)的NdeI和HindIII位点。利用NdeI和HindIII限制性内切酶对带有SEQ ID NO：12序列的pMD19-T载体进行双酶切后，将切割后得到的融合蛋白编码序列连入pBAD载体。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化细胞涂布于添加有100μg/mL氨苄霉素抗性LB平板上，筛选阳性克隆，提取质粒，并对其进行测序。测序结果表明所克隆的融合蛋白编码序列是正确的。将测序正确的质粒转化到大肠杆菌DH10B感受态细胞中，将转化细胞涂布于添加有100μg/mL氨苄霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆。
将能够在抗性平板上生长的菌落接种至含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，并在37℃下进行培养。在培养物的OD600达到约0.6时，添加L-阿拉伯糖至终浓度0.02％。28℃继续培养过夜诱导表达后，收集大肠杆菌，超声破碎，并通过SDS-PAGE确认表达了6His-Light G-Defensin 5，从而确认获得了期望的菌株。
2、融合蛋白的表达与纯化
将步骤1中构建的能够表达6His-Light G-Defensin 5的菌株接种到含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，培养过夜，次日将菌液以1:100的比例转接至含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，培养至OD600为0.6左右时，加入终浓度为0.02％的L-阿拉伯糖，在28℃条件下诱导16小时，收获细胞。以每10OD细胞加入1ml裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、500mMNaCl、pH 7.5缓冲液)重悬，高压匀浆破碎细胞(美国PhD公司D-3L设备，低压50000kPa处理两次，高压低于150000kPa处理两次)，4℃、13000rpm离心20min，分离上清和沉淀。由于融合蛋白N端带有His-tag，利用镍柱(GE)对上清中的融合蛋白进行金属螯合层析分离纯化。上样后，分别使用20mM咪唑、50mM咪唑和250mM咪唑顺序洗脱。对于250mM咪唑洗脱液进行脱盐，以除去咪唑。脱盐所使用的缓冲液为20mM NaH2PO4、20mM NaCl(pH7.5)。
对脱盐后的融合蛋白进行光照切割，光照光源为365-450nm波长的功率在100-300W之间的LED光源，切割时间90min。由于融合蛋白被切割后，只有带有His-tag的蛋白片段与镍柱亲和，因此利用镍柱对切割后的溶液再一次进行亲和层析，上柱后用结合缓冲液洗脱即可得到目的蛋白，最后用250mM咪唑洗脱液将带有His-tag的光切割基序片段洗脱下来。
图7示出对第一次镍柱纯化后的样品(泳道1)以及第二次镍柱纯化后的250mM咪唑洗脱液样品(泳道2)进行SDS-PAGE，可以看到，本发明的方法能够有效的获得目的肽。
实施例4光切割条件(波长、时间)的优化
对于实施例1构建的融合蛋白，采用除切割波长以及切割时间外与实施例1相同的实验条件，对切割产物进行定性和定量检测，从而对切割波长和切割时间进行优化。对切割后的混合物进行SDS-Page或Western印迹。
如图9-10所示，对在365nm、385nm、405nm和450nm四个波长下的切割产物进行SDS-Page(图9)和Western印迹(图10)，可以看出，采用365-405nm的波长具有较好的效果，其中切割效果最好的为采用385nm的波长的条件。
如图11-12所示，在385nm下对进行5min、10min、20min、30min、60min和90min切割可以看出，切割时间最好不短于20min。
虽然上文中已经通过一般性说明及具体实施方式对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上可以进行修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中粮集团有限公司；中粮健康营养研究院有限公司
<120> 基于光切割基序的蛋白纯化方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Ser His His His His His His Ser Ser Ser Val Ile Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met
20 25 30
Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Thr Asn Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Gly Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe Lys Gly Thr Asn Phe
50 55 60
Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Val Gly Trp Glu Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Met Tyr Glu Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
85 90 95
Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Tyr
100 105 110
Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Pro Val Lys Leu Pro Asp Tyr
115 120 125
His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Thr Asp
145 150 155 160
Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ser Val Ile Lys Pro Asp Met Lys Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asp Leu Glu
210 215 220
Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gly Ser His His His His His His Ser Ser Ser Val Ile Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met
20 25 30
Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Thr Asn Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Asp Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe Lys Gly Thr Asn Phe
50 55 60
Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Val Gly Trp Glu Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Met Tyr Glu Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
85 90 95
Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Tyr
100 105 110
Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Pro Val Lys Leu Pro Asp Tyr
115 120 125
His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Thr Asp
145 150 155 160
Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ser Val Ile Lys Pro Asp Met Lys Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asp Leu Glu
210 215 220
Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 3
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Ser His His His His His His Ser Ser Ser Val Ile Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met
20 25 30
Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Thr Asn Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Gly Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe Lys Gly Thr Asn Phe
50 55 60
Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Val Gly Trp Glu Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Met Tyr Asp Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
85 90 95
Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Tyr
100 105 110
Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Pro Val Lys Leu Pro Asp Tyr
115 120 125
His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Thr Asp
145 150 155 160
Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ser Val Ile Lys Pro Asp Met Lys Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asp Leu Glu
210 215 220
Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 4
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Ser His His His His His His Ser Ser Ser Val Ile Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met
20 25 30
Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Thr Asn Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Gly Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe Lys Gly Thr Asn Phe
50 55 60
Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Val Gly Trp Glu Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Met Tyr Asp Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
85 90 95
Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Ala His Tyr Arg Cys Asp Tyr
100 105 110
Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Pro Val Lys Leu Pro Asp Tyr
115 120 125
His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Thr Asp
145 150 155 160
Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ser Val Ile Lys Pro Asp Met Lys Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asp Leu Glu
210 215 220
Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 5
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Gly Ser His His His His His His Ser Ser Ser Val Ile Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met
20 25 30
Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Thr Asn Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Gly Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe Lys Gly Thr Asn Phe
50 55 60
Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Val Gly Trp Glu Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Met Tyr Asp Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
85 90 95
Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Ala His Tyr Arg Cys Asp Tyr
100 105 110
Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Gly Val Lys Leu Pro Asp Tyr
115 120 125
His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Thr Asp
145 150 155 160
Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ser Val Ile Lys Pro Asp Met Lys Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asp Leu Glu
210 215 220
Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 6
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Gly Ser His His His His His His Ser Ser Ser Val Ile Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met
20 25 30
Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Thr Asn Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Gly Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe Lys Gly Thr Asn Phe
50 55 60
Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Val Gly Trp Glu Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Met Tyr Asp Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
85 90 95
Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Ala His Tyr Arg Cys Asp Tyr
100 105 110
Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Pro Val Lys Leu Pro Asp Ser
115 120 125
His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser His Asp Lys Asp Tyr
130 135 140
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Thr Asp
145 150 155 160
Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ser Val Ile Lys Pro Asp Met Lys Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile Asp Leu Glu
210 215 220
Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Ala Ala His His His His His His His
35 40
<210> 8
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5 10 15
His His His His His His His
20
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 10
<211> 897
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat agctcgagtg tgatccctga ctacttcaag 60
cagagcttcc ccgagggcta cagctgggag cgcagcatga cctacgagga cggcggcatc 120
tgcatcgcca ccaacgacat cacaatggag ggggacagct tcatcaacaa gatccacttc 180
aagggcacga acttcccccc caacggcccc gtgatgcaga agaggaccgt gggctgggag 240
gccagcaccg agaagatgta cgagcgcgac ggcgtgctga agggcgacgt gaagatgaag 300
ctgctgctga agggcggcgg ccactatcgc tgcgactacc gcaccaccta caaggtcaag 360
cagaagcccg taaagctgcc cgactaccac ttcgtggacc accgcatcga gatcctgagc 420
cacgacaagg actacaacaa ggtgaagctg tacgagcacg ccgtggcccg caactccacc 480
gacagcatgg acgagctgta caagggtggc agcggtggca tggtgagcaa gggcgaggag 540
accattacaa gcgtgatcaa gcctgacatg aagaacaagc tgcgcatgga gggcaacgtg 600
aacggccacg ccttcgtgat cgagggcgag ggcagcggca agcccttcga gggcatccag 660
acgattgatt tggaggtgaa ggagggcgcc ccgctgccct tcgcctacga catcctgacc 720
accgccttcc actacggcaa ccgcgtgttc accaagtacc cacggggagg tggaggtagc 780
gatagccacg agaaacgtca ccatgggtat cgtcgtaaat ttcacgaaaa gcatcacagc 840
catcgtgaat ttccgtttta tggcgattat ggcagcaatt atctgtatga taactaa 897
<210> 11
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgctggaac ttgaactgaa gttaaaactg gaattagaat taaagctgaa accgacccca 60
ccgaccacgc caacgccacc aaccacccca accccgacgc cggggggttc tcatcatcat 120
catcatcata gctcgagtgt gatccctgac tacttcaagc agagcttccc cgagggctac 180
agctgggagc gcagcatgac ctacgaggac ggcggcatct gcatcgccac caacgacatc 240
acaatggagg gggacagctt catcaacaag atccacttca agggcacgaa cttccccccc 300
aacggccccg tgatgcagaa gaggaccgtg ggctgggagg ccagcaccga gaagatgtac 360
gaccgcgacg gcgtgctgaa gggcgacgtg aagatgaagc tgctgctgaa gggcggcggc 420
cactatcgct gcgactaccg caccacctac aaggtcaagc agaagcccgt aaagctgccc 480
gactaccact tcgtggacca ccgcatcgag atcctgagcc acgacaagga ctacaacaag 540
gtgaagctgt acgagcacgc cgtggcccgc aactccaccg acagcatgga cgagctgtac 600
aagggtggca gcggtggcat ggtgagcaag ggcgaggaga ccattacaag cgtgatcaag 660
cctgacatga agaacaagct gcgcatggag ggcaacgtga acggccacgc cttcgtgatc 720
gagggcgagg gcagcggcaa gcccttcgag ggcatccaga cgattgattt ggaggtgaag 780
gagggcgccc cgctgccctt cgcctacgac atcctgacca ccgccttcca ctacggcaac 840
cgcgtgttca ccaagtaccc acggggaggt ggaggtagcg atagccacga gaaacgtcac 900
catgggtatc gtcgtaaatt tcacgaaaag catcacagcc atcgtgaatt tccgttttat 960
ggcgattatg gcagcaatta tctgtatgat aactaa 996
<210> 12
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggggggtt ctcatcatca tcatcatcat agctcgagtg tgatccctga ctacttcaag 60
cagagcttcc ccgagggcta cagctgggag cgcagcatga cctacgagga cggcggcatc 120
tgcatcgcca ccaacgacat cacaatggag ggggacagct tcatcaacaa gatccacttc 180
aagggcacga acttcccccc caacggcccc gtgatgcaga agaggaccgt gggctgggag 240
gccagcaccg agaagatgta cgagcgcgac ggcgtgctga agggcgacgt gaagatgaag 300
ctgctgctga agggcggcgc ccactatcgc tgcgactacc gcaccaccta caaggtcaag 360
cagaagcccg taaagctgcc cgactaccac ttcgtggacc accgcatcga gatcctgagc 420
cacgacaagg actacaacaa ggtgaagctg tacgagcacg ccgtggcccg caactccacc 480
gacagcatgg acgagctgta caagggtggc agcggtggca tggtgagcaa gggcgaggag 540
accattacaa gcgtgatcaa gcctgacatg aagaacaagc tgcgcatgga gggcaacgtg 600
aacggccacg ccttcgtgat cgagggcgag ggcagcggca agcccttcga gggcatccag 660
acgattgatt tggaggtgaa ggagggcgcc ccgctgccct tcgcctacga catcctgacc 720
accgccttcc actacggcaa ccgcgtgttc accaagtacc cacggggagg tggaggtagc 780
ggtctggact tctctcagcc gttcccgtct ggtgaattcg cggtttgcga atcttgcaaa 840
ctgggtccgg gtaaatgccg taaagaatgc ctggaaaacg aaaaaccgga cggtaactgc 900
cgtctgaact tcctgtgctg ccgtcagcgt atctaa 936

Claims (1)

1.一种蛋白纯化方法，所述方法包含如下步骤：
a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；
b)使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离；
c)利用365-450nm波长的光对所述融合蛋白照射30-100min；以及
d)将所述目的肽从所述片段混合物中分离，从而获得纯化的所述目的肽。
CN201711456927.6A 2017-12-28 2017-12-28 基于光切割基序的蛋白纯化方法 Active CN109971776B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711456927.6A CN109971776B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 基于光切割基序的蛋白纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711456927.6A CN109971776B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 基于光切割基序的蛋白纯化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109971776A true CN109971776A (zh) 2019-07-05
CN109971776B CN109971776B (zh) 2021-04-09

Family

ID=67074423

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711456927.6A Active CN109971776B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 基于光切割基序的蛋白纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109971776B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114315979A (zh) * 2021-12-03 2022-04-12 中粮营养健康研究院有限公司 高光切割效率的光可切割蛋白突变体及其应用
WO2022179551A1 (zh) * 2021-02-26 2022-09-01 重庆誉颜制药有限公司 一种制备多肽的细胞裂解液分离设备、系统及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921819A (zh) * 2009-06-12 2010-12-22 复旦大学 一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统
CN102226172A (zh) * 2011-05-09 2011-10-26 清华大学 基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法
CN107354189A (zh) * 2016-12-29 2017-11-17 中粮营养健康研究院有限公司 基于α‑羟基酸的蛋白纯化方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921819A (zh) * 2009-06-12 2010-12-22 复旦大学 一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统
CN102226172A (zh) * 2011-05-09 2011-10-26 清华大学 基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法
CN107354189A (zh) * 2016-12-29 2017-11-17 中粮营养健康研究院有限公司 基于α‑羟基酸的蛋白纯化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICOLA FLOYD等: "Photoinduced,Family-Specific,Site-Selective Cleavage of TIM-Barrel Proteins", 《J.AM.CHEM.》 *
WEI ZHANG等: "Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl", 《NATURE METHODS》 *
张德华: "《蛋白质与酶工程》", 1 September 2015 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022179551A1 (zh) * 2021-02-26 2022-09-01 重庆誉颜制药有限公司 一种制备多肽的细胞裂解液分离设备、系统及其应用
CN114315979A (zh) * 2021-12-03 2022-04-12 中粮营养健康研究院有限公司 高光切割效率的光可切割蛋白突变体及其应用
CN114315979B (zh) * 2021-12-03 2022-06-03 中粮营养健康研究院有限公司 高光切割效率的光可切割蛋白突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109971776B (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593127B (zh) 基因重组胶原样肽mjlgg-34及其制备方法与应用
CN111206008B (zh) 一株重组大肠杆菌及其应用
CN101519446A (zh) 一种重组人胰岛素及其类似物的制备方法
CN111117977B (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
Shlyapnikov et al. Bacterial production of latarcin 2a, a potent antimicrobial peptide from spider venom
WO2011094765A2 (en) A targeting signal for integrating proteins, peptides and biological molecules into bacterial microcompartments
CN111349177B (zh) 一种融合抗菌肽cat的制备方法和应用
CN112094833B (zh) 一种抑菌蛋白及其编码基因、用途和菌株
CN109971776A (zh) 基于光切割基序的蛋白纯化方法
CN111499759B (zh) 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用
CN108314718B (zh) 一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体、其编码基因及其表达和应用
CN105622763A (zh) 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN109055339A (zh) Tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用
CN106754851B (zh) TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用
CN114507293B (zh) 一种基因重组串联表达利那洛肽的融合蛋白及表达利那洛肽的方法
CN110776569A (zh) 一种具有粘附-抗冻双功能的二嵌段融合蛋白及合成方法和应用
CN110305887A (zh) 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用
CN114276413A (zh) 一种人工抗菌肽g3的制备方法
KR102084065B1 (ko) 써모토가 마리티마 유래의 내열성 재조합 셀룰라아제 b 단백질 및 이의 용도
Wu et al. Functional expression, purification and identification of modified antioxidant peptides from pinctada fucata muscle
Jung et al. Biochemical and molecular characterization of an antifungal protein from Tenebrio molitor larvae
Wu et al. Preparation and antioxidant activities in vitro of a designed antioxidant peptide from Pinctada fucata by Recombinant Escherichia coli
CN116162133B (zh) 除皱短肽及其制备方法
CN109750021A (zh) 一种扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因及其应用
CN113817695B (zh) 一种胺氧化酶ndao、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant