CN106754851B - TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106754851B
CN106754851B CN201611033436.6A CN201611033436A CN106754851B CN 106754851 B CN106754851 B CN 106754851B CN 201611033436 A CN201611033436 A CN 201611033436A CN 106754851 B CN106754851 B CN 106754851B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucose
leu
protein
val
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611033436.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106754851A (zh
Inventor
高飞
刘翠敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Original Assignee
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS filed Critical Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority to CN201611033436.6A priority Critical patent/CN106754851B/zh
Publication of CN106754851A publication Critical patent/CN106754851A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106754851B publication Critical patent/CN106754851B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01009—Glucose-6-phosphate isomerase (5.3.1.9)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种蛋白质，是将6‑磷酸葡萄糖异构酶蛋白第543位丝氨酸突变为丙氨酸得到的；所述蛋白质是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列4的氨基酸序列经过除第543为氨基酸以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白质具有6‑磷酸葡萄糖异构酶的活性，并且酶活力较现有的6‑磷酸葡萄糖异构酶显著提高。本发明有望被用于实际的生产实践以提高植物光合效力及淀粉的合成能力，具有非常广阔的应用前景。

Description

TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
植物淀粉是一类最初在植物叶绿体中合成、最终在其他异养器官(如种子、根、果实等)贮存的高聚化、非水溶性的碳水化合物。它为地球上异氧生物提供了主要的碳源和能量源；对人类来讲，它是我们必不可少的食物和能量来源。与此同时，淀粉还被广泛的应用于医疗、能源、化工、建筑、材料等多种行业之中，可以说淀粉生产和应用与我们的生活息息相关。
6-磷酸葡萄糖异构酶(简称GPI)是植物淀粉合成、代谢途径中的关键酶，它可逆的催化了6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖的相互转变。在叶绿体中，作为淀粉合成途径的关键酶，它催化了6-磷酸果糖到6-磷酸葡萄糖的生化反应。6-磷酸果糖是卡尔循环重要的终产物之一，而6-磷酸葡萄糖是淀粉合成代谢、糖代谢中的重要中间产物。6-磷酸葡萄糖异构酶是连接卡尔文循环、淀粉合成代谢、糖代谢的重要蛋白(酶)。PGI既存在于质体中，又定位在胞质之中，质体PGI突变后，植物表现为叶片淀粉合成明显减少，生长缓慢等表型，而胞质PGI突变后，植物生长受阻、叶片淀粉明显积累、生殖生长受到严重干扰等表型，因此两种类型的PGI对植物都是十分重要的。在动物中，大量的研究表明它参与了人类能量代谢相关的多种疾病的发生过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供了一种蛋白质(命名为TaGPI1mS543A蛋白)，是将6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白第543位丝氨酸突变为丙氨酸得到的。
所述TaGPI1mS543A蛋白是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列4的氨基酸序列经过除第543位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
所述6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白是如下(a3)或(a4)：
(a3)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a4)将序列2的氨基酸序列经过除第543位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明还保护编码权利要求1所述蛋白质的基因。
将所述基因命名为TaGPI1mS543A基因。
所述基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：
(b1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本发明还保护含有TaGPI1mS543A基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
所述重组表达载体具体可为在pHUE载体的多克隆位点(例如SacII和KpnI酶切位点间)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护TaGPI1mS543A蛋白的应用，为如下(c1)-(c6)中至少一种：
(c1)作为6-磷酸葡萄糖异构酶；
(c2)催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸葡萄糖；
(c3)催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；
(c4)以6-磷酸果糖为原料制备6-磷酸葡萄糖酸；
(c5)促进植物淀粉的合成；
(c6)提高植物光合效力。
本发明还保护一种重组菌，是将TaGPI1mS543A基因导入宿主菌中得到的。
所述TaGPI1mS543A基因可通过含有TaGPI1mS543A基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。
所述重组表达载体具体可为将pHUE载体的SacII和KpnI酶切位点间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还保护一种6-磷酸葡萄糖异构酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到6-磷酸葡萄糖异构酶。
所述“从重组菌中得到6-磷酸葡萄糖异构酶”具体可包括步骤(d1)和(d2)：
(d1)破碎所述重组菌菌体，得到含有6-磷酸葡萄糖异构酶的粗提液；
(d2)分离所述粗提液中的6-磷酸葡萄糖异构酶并去除His-Ub融合标签，得到6-磷酸葡萄糖异构酶。
所述分离所述粗提液中的6-磷酸葡萄糖异构酶可采用亲和层析的方法对所述粗提液中的6-磷酸葡萄糖异构酶进行纯化，具体可采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。
所述纯化还包括将蛋白液进行透析处理。
所述透析的步骤具体可为使用dialysis buffer(20mMTris-HCL，pH 8.0、100mMNaCl)透析过夜。
所述去除His-Ub融合标签具体可为采用Usp2-cc蛋白酶对蛋白液进行酶切。
所述酶切的步骤具体可为4℃酶切24小时。
每1mg蛋白液加入20U Usp2-cc蛋白酶。
本发明还保护所述重组菌或所述方法在制备6-磷酸葡萄糖异构酶产品中的应用。
本发明还保护一种组合物，包括所述蛋白质和6-磷酸葡萄糖脱氢酶；所述组合物的用途为制备6-磷酸葡萄糖酸或催化6-磷酸果糖到6-磷酸葡萄糖酸的生化反应。
所述组合物还包括6-磷酸果糖。
所述组合物还包括NADP。
所述组合物还包括双甘氨肽和MgCl2。
所述蛋白质、6-磷酸葡萄糖脱氢、6-磷酸果糖、NADP、双甘氨肽和MgCl2的配比具体可为3.8U∶0.008U∶0.011μmol∶0.0022μmol∶0.7μmol∶0.011μmol。
以上任一所述6-磷酸果糖具体可为D-6-磷酸果糖。
本发明提供了一种TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用。实验证明，本发明的TaGPI1mS543A蛋白具有6-磷酸葡萄糖异构酶的活性，并且酶活力较现有的6-磷酸葡萄糖异构酶显著提高。本发明有望被用于实际的生产实践以提高植物光合效力及淀粉的合成能力，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为TaGPI1和TaGPI1mS543A蛋白纯化过程中收集样品的SDS-PAGE检测结果。
图2为TaGPI1和TaGPI1mS543A蛋白酶活力检测曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小偃54小麦：参考文献：陈海莲，王剑环，王新芳，等.小偃54小麦的抗逆性表现[J].气象与环境科学，2005(2)：28-30.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
pHUE载体：参考文献：Catanzariti A，Soboleva T A，Jans D A，et al.Anefficient system for high-level expression and easy purification of authenticrecombinant proteins[J].Protein Science，2004，13(5)：1331-1339.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
大肠杆菌BL21(DE3)：天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号：CB105-02。
Usp2-cc蛋白酶：北京毅事合生物科技有限公司，货号：G11502。
Ni-NTA亲和层析柱：Merck(Novagen)，货号：70666。
双甘氨肽：Sigma，货号：G-1002。
D-6-磷酸果糖：Sigma，货号：F-3627。
NADP：Sigma，货号：0505。
MgCl2：Sigma，货号：M-0250。
6-磷酸葡萄糖脱氢酶：Sigma，货号：G-6378。
实施例1、TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因的获得
对各物种中6-磷酸葡萄糖异构酶(GPI)进行序列分析和功能验证，从小麦中发现一种蛋白质，将其命名为TaGPI1蛋白。TaGPI1蛋白的编码基因如序列表的序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质。
将序列2所示的蛋白第543位丝氨酸突变为丙氨酸，将突变后得到的蛋白命名为TaGPI1mS543A蛋白。TaGPI1mS543A蛋白的编码基因如序列表的序列3所示，编码序列表的序列4所示的蛋白质。
实施例2、小麦TaGPI1蛋白及TaGPI1mS543A蛋白的克隆及原核表达载体的构建
1、提取小偃54小麦的总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物pHUE-TaGPI1-For和引物pHUE-TaGPI1-rev进行PCR扩增，得到扩增产物。
pHUE-TaGPI1-For：5′-TCCCCGCGGTGGTATGGCGTCGCCGGC-3′；
pHUE-TaGPI1-rev：5′-GGGGTACCTTACACTTTTGGAAGCACTGTTGTGTC-3′。
pHUE-TaGPI1-For和pHUE-TaGPI1-rev中，下划线分别标注SacII和KpnI酶切位点。
3、用限制性内切酶SacII和KpnI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶SacII和KpnI双酶切pHUE载体，回收约5927bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体连接，得到重组载体pHUE-TaGPI1。根据测序结果，对重组载体pHUE-TaGPI1进行结构描述如下：将pHUE载体的SacII和KpnI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-1704位核苷酸所示的DNA分子。序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。
6、以步骤5得到的重组载体pHUE-TaGPI1为模板，采用引物pHUE-TaGPI1mS543A-For和引物pHUE-TaGPI1mS543A-rev进行PCR定点突变(方法参照文献：Fisher，C.L.，andPei，G.K.(1997).Modification of a PCR-based site-directed mutagenesismethod.Biotechniques 23，570-574.)，得到重组载体pHUE-TaGPI1mS543A。
pHUE-TaGPI1mS543A-For：5′-CGAGGGCTTCAACCCCAGCGCGGCAAGTTTGCT-3′；
pHUE-TaGPI1mS543A-rev：5′-GCTGGGGTTGAAGCCCTCGACGGGCTTTCC-3′。
根据测序结果，对重组载体pHUE-TaGPI1mS543A进行结构描述如下：将pHUE载体的SacII和KpnI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3的自5′端第1-1704位核苷酸所示的DNA分子。序列3所示的DNA分子编码序列4所示的蛋白质。(序列2和序列4只有第543位氨基酸不同，其余氨基酸相同；序列2第543位氨基酸为丝氨酸，序列4第543位氨基酸为丙氨酸)。
实施例3、小麦TaGPI1蛋白及TaGPI1mS543A蛋白体外表达和纯化
将实施例2得到的重组载体pHUE-TaGPI1和重组载体pHUE-TaGPI1mS543A分别进行如下步骤：
1、将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将重组菌接种至50mlLB液体培养基(氨苄抗性：100μg/ml)中，37℃、220rpm/min震荡培养过夜。
2、将20ml步骤1得到的菌液转接到1L新鲜LB液体培养基中，继续37℃、220rpm震荡培养至菌液OD600nm＝0.8-1.0，向菌液中加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.1mM，16℃、220rpm/min诱导24小时，诱导结束后4000rpm/min离心收集菌体。
3、按照如下步骤进行蛋白纯化：
(1)用Ni-NTA lysis buffer(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑)重悬步骤2收集的菌体，置冰上超声破碎后得到全细胞裂解液。
(2)将全细胞裂解液50000g离心30分钟，收集上清液。
(3)将上清液经0.22μm滤膜过滤后，加载到Ni-NTA亲和层析柱，收集流穿液。
(4)向亲和层析柱中加入10倍柱床体积的wash buffer(50mM NaH2PO4、300mMNaCl、25mM咪唑)，收集流穿液。
(5)向亲和层析柱中加入4倍柱床体积的elute buffer(50mM NaH2PO4、300mMNaCl、250mM咪唑)，收集洗脱蛋白(即为带His-Ub融合标签的目的蛋白)。
(6)向洗脱蛋白中加入Usp2-cc蛋白酶(20U/mg洗脱蛋白)进行酶切反应(4℃酶切24小时)，以去除His-Ub融合标签，得到酶切反应液。
(7)将酶切反应液使用dialysis buffer(20mMTris-HCL，pH 8.0、100mM NaCl)透析过夜后再一次加载到Ni-NTA柱，收集流穿蛋白(即为不带His-Ub融合标签的目的蛋白)。
4、将步骤3纯化过程中每一步流程中收集的样品进行SDS-PAGE检测。结果如图1所示。图1A为TaGPI1蛋白纯化过程中收集的样品，图1B为TaGPI1mS543A蛋白纯化过程中收集的样品。图中，泳道1为步骤(1)得到的全细胞裂解液，泳道2为步骤(2)收集的上清液，泳道3为步骤(3)收集的流穿液，泳道4为步骤(4)收集的流穿液，泳道5为步骤(5)收集的洗脱蛋白，泳道6为步骤(6)得到的酶切反应液，泳道7为步骤(7)收集的流穿蛋白，即纯化产物。
结果显示大量、可溶且纯度较高TaGPI1蛋白和TaGPI1mS543A蛋白被纯化。
重组载体pHUE-TaGPI1进行步骤1至4，收集的流穿蛋白命名为TaGPI1溶液。
重组载体pHUE-TaGPI1mS543A进行步骤1至4，收集的流穿蛋白命名为TaGPI1mS543A。
5、将步骤4得到的TaGPI1溶液进行BCA定量，蛋白浓度为20.4mg/ml。将步骤4得到的TaGPI1mS543A溶液进行BCA定量，蛋白浓度为30.6mg/ml。
结果表明，在相同培养条件下，TaGPI1mS543A较TaGPI1产量提高。
实施例4、小麦TaGPI1蛋白及TaGPI1mS543A蛋白外酶活力的检测和比较
对实施例3纯化得到的TaGPI1蛋白和TaGPI1mS543A蛋白进行酶活力检测(方法参照文献：Guilbault G G.Enzymatic methods of analysis[J].AnalyticaChimicaActa，1970，52(1)：75-82.)。TaGPI1蛋白或TaGPI1mS543A蛋白可以作为6-磷酸葡萄糖异构酶，催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸葡萄糖，但该反应无法直接通过分光度计直接检测。6-磷酸葡萄糖异构酶与其底物6-磷酸果糖反应产生的6-磷酸葡萄糖，可在6-磷酸葡萄糖脱氢酶的催化下转化为6-磷酸葡萄糖酸，并伴随NADP向NADPH的转化。NADPH在分光度计340nm处有光吸收，因此在6-磷酸葡萄糖脱氢酶过量情况下，NADPH光吸收变化可以反映TaGPI1蛋白或TaGPI1mS543A蛋白的酶活力。
反应体系(100μL)：42mM双甘氨肽(pH 7.4)16.67μL，3.3mMD-6-磷酸果糖3.33μL，0.67mM NADP 3.33μL，3.3mMMgCl2 3.33μL，2.5U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶3.33μL，H2O65.01μL，蛋白稀释液5μL。
蛋白稀释液的制备方法：取实施例3制备的TaGPI1溶液或TaGPI1mS543A溶液，用dialysis buffer(20mMTris-HCL，pH 8.0、100mM NaCl)稀释，得到蛋白浓度为1mg/ml的蛋白母液，将蛋白母液稀释至500倍体积，得到蛋白浓度为0.002mg/ml的蛋白稀释液。
反应在25℃条件下进行，分光光度计在340nm处测取5分钟内的吸光度值。
结果如图2所示。选取酶反应最初3分钟内的数据进行计算。
酶活力计算公式为：
酶活力(U/ml)＝(Δ340/min×0.1×500)/(6.22×0.005)
公式中：Δ340/min为反应时间内340nm处吸光度值变化/反应时间；
0.1为实验体系总体积(0.1ml)；
500为稀释倍数(蛋白母液浓度/蛋白稀释液浓度)；
6.22为1mmol NADPH在340nm波长的消光系数；
0.005为反应体系中加入蛋白溶液的体积(0.005ml)。
计算得到的酶活力(U/ml)数值/蛋白母液浓度(1mg/ml)＝酶活力(U/mg)
经过计算，TaGPI1酶活力为580±55U/mg，而TaGPI1mS543A酶活力为763±47U/mg，TaGPI1mS543A的酶活力对比TaGPI1的酶活力提升了约百分之三十。
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用
<130> GNCYXMN161846
<160> 4
<210> 1
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atggcgtcgc cggcgctcat ctccgacacc gaccagtgga aggccctcca ggcgcacgtc 60
ggcgcgatcc acaagacgca cctgcgcgac ctcatgacgg acgccgaccg atgcaaggca 120
atgacggcgg aattcgaagg cgtctacctg gactactcga ggcagcaggc caccacggag 180
accatcgaca agctgttcaa gctggcagag gctgcaaagc tcaaggagaa gattgacaag 240
atgtttaaag gcgaaaagat aaataccact gagaacagat cagtgctcca tgtggctcta 300
agggctccaa gagacgcagt cataaacagt gacggtgtga atgtggtccc cgaagtttgg 360
gctgttaagg ataaaatcaa gcagttttca gagactttca gaagtggctc atgggttggg 420
gcaactggga aaccattgac aaatgttgtc tcggtcggga ttggtggtag cttccttgga 480
cctctgtttg tgcatacggc tctccagact gacccggaag cagcggaagc tgccaaaggc 540
cgacaactga gatttcttgc aaatgttgat ccagttgatg ttgcacggag catcaaagat 600
ttagatcctg caaccactct tgttgtggtt gtctcaaaga ccttcacgac agctgaaaca 660
atgttaaatg ctcgaactat caaggagtgg attgtctctt ctcttggacc tcaggctgtt 720
tccaaacaca tgattgctgt cagtactaat cttaagcttg tcaaggagtt cggaattgac 780
cctaacaacg cttttgcgtt ttgggactgg gttggcggcc gctatagtgt ttgcagtgct 840
gtcggtgttc tgcccttatc tcttcagtat ggatttccaa ttgttcagaa atttctggag 900
ggtgcttcta gcattgacaa tcatgtccat acatcttcat ttgagaaaaa tatacctgta 960
ctccttggtt tgttgagtgt gtggaatgtt tcatttctcg gatatccggc tagggcaata 1020
ttgccatact gtcaagcact tgagaaacta gcaccacata ttcagcagct tagcatggag 1080
agtaatggaa agggtgtctc cattgatggt gttcgacttc catttgaggc tggtgaaatt 1140
gattttggtg aacctggaac aaacgggcaa cacagcttct atcaattaat ccatcaggga 1200
agagttattc cttgtgattt tattggcgtc ataaaaagcc agcagcccgt ttacctgaaa 1260
ggggaaactg ttagcaatca tgatgagttg atgtccaatt tctttgctca gcctgatgcg 1320
cttgcctatg ggaagactcc tgagcaatta cacagcgaga aagttcccga aaatcttatc 1380
cctcacaaga cttttcaggg caaccggcca tcactgagtt tcttgctgtc ttcgttatct 1440
gcctatgaga ttggacagct tttatccatc tatgagcacc ggatcgcagt tcagggtttc 1500
atatggggaa tcaactcgtt tgaccagtgg ggagtggagc tgggcaagtc actggcttct 1560
acagtgagga aacagttgca tgcatcacgc atggaaggaa agcccgtcga gggcttcaac 1620
cccagcagcg caagtttgct cacacggttt cttgcggtta aaccatccac cccatatgac 1680
acaacagtgc ttccaaaagt gtaa 1704
<210> 2
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Ala Ser Pro Ala Leu Ile Ser Asp Thr Asp Gln Trp Lys Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala His Val Gly Ala Ile His Lys Thr His Leu Arg Asp Leu Met
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Arg Cys Lys Ala Met Thr Ala Glu Phe Glu Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Asp Tyr Ser Arg Gln Gln Ala Thr Thr Glu Thr Ile Asp Lys
50 55 60
Leu Phe Lys Leu Ala Glu Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Ile Asp Lys
65 70 75 80
Met Phe Lys Gly Glu Lys Ile Asn Thr Thr Glu Asn Arg Ser Val Leu
85 90 95
His Val Ala Leu Arg Ala Pro Arg Asp Ala Val Ile Asn Ser Asp Gly
100 105 110
Val Asn Val Val Pro Glu Val Trp Ala Val Lys Asp Lys Ile Lys Gln
115 120 125
Phe Ser Glu Thr Phe Arg Ser Gly Ser Trp Val Gly Ala Thr Gly Lys
130 135 140
Pro Leu Thr Asn Val Val Ser Val Gly Ile Gly Gly Ser Phe Leu Gly
145 150 155 160
Pro Leu Phe Val His Thr Ala Leu Gln Thr Asp Pro Glu Ala Ala Glu
165 170 175
Ala Ala Lys Gly Arg Gln Leu Arg Phe Leu Ala Asn Val Asp Pro Val
180 185 190
Asp Val Ala Arg Ser Ile Lys Asp Leu Asp Pro Ala Thr Thr Leu Val
195 200 205
Val Val Val Ser Lys Thr Phe Thr Thr Ala Glu Thr Met Leu Asn Ala
210 215 220
Arg Thr Ile Lys Glu Trp Ile Val Ser Ser Leu Gly Pro Gln Ala Val
225 230 235 240
Ser Lys His Met Ile Ala Val Ser Thr Asn Leu Lys Leu Val Lys Glu
245 250 255
Phe Gly Ile Asp Pro Asn Asn Ala Phe Ala Phe Trp Asp Trp Val Gly
260 265 270
Gly Arg Tyr Ser Val Cys Ser Ala Val Gly Val Leu Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Gln Tyr Gly Phe Pro Ile Val Gln Lys Phe Leu Glu Gly Ala Ser Ser
290 295 300
Ile Asp Asn His Val His Thr Ser Ser Phe Glu Lys Asn Ile Pro Val
305 310 315 320
Leu Leu Gly Leu Leu Ser Val Trp Asn Val Ser Phe Leu Gly Tyr Pro
325 330 335
Ala Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Cys Gln Ala Leu Glu Lys Leu Ala Pro
340 345 350
His Ile Gln Gln Leu Ser Met Glu Ser Asn Gly Lys Gly Val Ser Ile
355 360 365
Asp Gly Val Arg Leu Pro Phe Glu Ala Gly Glu Ile Asp Phe Gly Glu
370 375 380
Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ser Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly
385 390 395 400
Arg Val Ile Pro Cys Asp Phe Ile Gly Val Ile Lys Ser Gln Gln Pro
405 410 415
Val Tyr Leu Lys Gly Glu Thr Val Ser Asn His Asp Glu Leu Met Ser
420 425 430
Asn Phe Phe Ala Gln Pro Asp Ala Leu Ala Tyr Gly Lys Thr Pro Glu
435 440 445
Gln Leu His Ser Glu Lys Val Pro Glu Asn Leu Ile Pro His Lys Thr
450 455 460
Phe Gln Gly Asn Arg Pro Ser Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Ser
465 470 475 480
Ala Tyr Glu Ile Gly Gln Leu Leu Ser Ile Tyr Glu His Arg Ile Ala
485 490 495
Val Gln Gly Phe Ile Trp Gly Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val
500 505 510
Glu Leu Gly Lys Ser Leu Ala Ser Thr Val Arg Lys Gln Leu His Ala
515 520 525
Ser Arg Met Glu Gly Lys Pro Val Glu Gly Phe Asn Pro Ser Ser Ala
530 535 540
Ser Leu Leu Thr Arg Phe Leu Ala Val Lys Pro Ser Thr Pro Tyr Asp
545 550 555 560
Thr Thr Val Leu Pro Lys Val
565
<210> 3
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
atggcgtcgc cggcgctcat ctccgacacc gaccagtgga aggccctcca ggcgcacgtc 60
ggcgcgatcc acaagacgca cctgcgcgac ctcatgacgg acgccgaccg atgcaaggca 120
atgacggcgg aattcgaagg cgtctacctg gactactcga ggcagcaggc caccacggag 180
accatcgaca agctgttcaa gctggcagag gctgcaaagc tcaaggagaa gattgacaag 240
atgtttaaag gcgaaaagat aaataccact gagaacagat cagtgctcca tgtggctcta 300
agggctccaa gagacgcagt cataaacagt gacggtgtga atgtggtccc cgaagtttgg 360
gctgttaagg ataaaatcaa gcagttttca gagactttca gaagtggctc atgggttggg 420
gcaactggga aaccattgac aaatgttgtc tcggtcggga ttggtggtag cttccttgga 480
cctctgtttg tgcatacggc tctccagact gacccggaag cagcggaagc tgccaaaggc 540
cgacaactga gatttcttgc aaatgttgat ccagttgatg ttgcacggag catcaaagat 600
ttagatcctg caaccactct tgttgtggtt gtctcaaaga ccttcacgac agctgaaaca 660
atgttaaatg ctcgaactat caaggagtgg attgtctctt ctcttggacc tcaggctgtt 720
tccaaacaca tgattgctgt cagtactaat cttaagcttg tcaaggagtt cggaattgac 780
cctaacaacg cttttgcgtt ttgggactgg gttggcggcc gctatagtgt ttgcagtgct 840
gtcggtgttc tgcccttatc tcttcagtat ggatttccaa ttgttcagaa atttctggag 900
ggtgcttcta gcattgacaa tcatgtccat acatcttcat ttgagaaaaa tatacctgta 960
ctccttggtt tgttgagtgt gtggaatgtt tcatttctcg gatatccggc tagggcaata 1020
ttgccatact gtcaagcact tgagaaacta gcaccacata ttcagcagct tagcatggag 1080
agtaatggaa agggtgtctc cattgatggt gttcgacttc catttgaggc tggtgaaatt 1140
gattttggtg aacctggaac aaacgggcaa cacagcttct atcaattaat ccatcaggga 1200
agagttattc cttgtgattt tattggcgtc ataaaaagcc agcagcccgt ttacctgaaa 1260
ggggaaactg ttagcaatca tgatgagttg atgtccaatt tctttgctca gcctgatgcg 1320
cttgcctatg ggaagactcc tgagcaatta cacagcgaga aagttcccga aaatcttatc 1380
cctcacaaga cttttcaggg caaccggcca tcactgagtt tcttgctgtc ttcgttatct 1440
gcctatgaga ttggacagct tttatccatc tatgagcacc ggatcgcagt tcagggtttc 1500
atatggggaa tcaactcgtt tgaccagtgg ggagtggagc tgggcaagtc actggcttct 1560
acagtgagga aacagttgca tgcatcacgc atggaaggaa agcccgtcga gggcttcaac 1620
cccagcgcgg caagtttgct cacacggttt cttgcggtta aaccatccac cccatatgac 1680
acaacagtgc ttccaaaagt gtaa 1704
<210> 4
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
Met Ala Ser Pro Ala Leu Ile Ser Asp Thr Asp Gln Trp Lys Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala His Val Gly Ala Ile His Lys Thr His Leu Arg Asp Leu Met
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Arg Cys Lys Ala Met Thr Ala Glu Phe Glu Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Asp Tyr Ser Arg Gln Gln Ala Thr Thr Glu Thr Ile Asp Lys
50 55 60
Leu Phe Lys Leu Ala Glu Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Ile Asp Lys
65 70 75 80
Met Phe Lys Gly Glu Lys Ile Asn Thr Thr Glu Asn Arg Ser Val Leu
85 90 95
His Val Ala Leu Arg Ala Pro Arg Asp Ala Val Ile Asn Ser Asp Gly
100 105 110
Val Asn Val Val Pro Glu Val Trp Ala Val Lys Asp Lys Ile Lys Gln
115 120 125
Phe Ser Glu Thr Phe Arg Ser Gly Ser Trp Val Gly Ala Thr Gly Lys
130 135 140
Pro Leu Thr Asn Val Val Ser Val Gly Ile Gly Gly Ser Phe Leu Gly
145 150 155 160
Pro Leu Phe Val His Thr Ala Leu Gln Thr Asp Pro Glu Ala Ala Glu
165 170 175
Ala Ala Lys Gly Arg Gln Leu Arg Phe Leu Ala Asn Val Asp Pro Val
180 185 190
Asp Val Ala Arg Ser Ile Lys Asp Leu Asp Pro Ala Thr Thr Leu Val
195 200 205
Val Val Val Ser Lys Thr Phe Thr Thr Ala Glu Thr Met Leu Asn Ala
210 215 220
Arg Thr Ile Lys Glu Trp Ile Val Ser Ser Leu Gly Pro Gln Ala Val
225 230 235 240
Ser Lys His Met Ile Ala Val Ser Thr Asn Leu Lys Leu Val Lys Glu
245 250 255
Phe Gly Ile Asp Pro Asn Asn Ala Phe Ala Phe Trp Asp Trp Val Gly
260 265 270
Gly Arg Tyr Ser Val Cys Ser Ala Val Gly Val Leu Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Gln Tyr Gly Phe Pro Ile Val Gln Lys Phe Leu Glu Gly Ala Ser Ser
290 295 300
Ile Asp Asn His Val His Thr Ser Ser Phe Glu Lys Asn Ile Pro Val
305 310 315 320
Leu Leu Gly Leu Leu Ser Val Trp Asn Val Ser Phe Leu Gly Tyr Pro
325 330 335
Ala Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Cys Gln Ala Leu Glu Lys Leu Ala Pro
340 345 350
His Ile Gln Gln Leu Ser Met Glu Ser Asn Gly Lys Gly Val Ser Ile
355 360 365
Asp Gly Val Arg Leu Pro Phe Glu Ala Gly Glu Ile Asp Phe Gly Glu
370 375 380
Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ser Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly
385 390 395 400
Arg Val Ile Pro Cys Asp Phe Ile Gly Val Ile Lys Ser Gln Gln Pro
405 410 415
Val Tyr Leu Lys Gly Glu Thr Val Ser Asn His Asp Glu Leu Met Ser
420 425 430
Asn Phe Phe Ala Gln Pro Asp Ala Leu Ala Tyr Gly Lys Thr Pro Glu
435 440 445
Gln Leu His Ser Glu Lys Val Pro Glu Asn Leu Ile Pro His Lys Thr
450 455 460
Phe Gln Gly Asn Arg Pro Ser Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Ser
465 470 475 480
Ala Tyr Glu Ile Gly Gln Leu Leu Ser Ile Tyr Glu His Arg Ile Ala
485 490 495
Val Gln Gly Phe Ile Trp Gly Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val
500 505 510
Glu Leu Gly Lys Ser Leu Ala Ser Thr Val Arg Lys Gln Leu His Ala
515 520 525
Ser Arg Met Glu Gly Lys Pro Val Glu Gly Phe Asn Pro Ser Ala Ala
530 535 540
Ser Leu Leu Thr Arg Phe Leu Ala Val Lys Pro Ser Thr Pro Tyr Asp
545 550 555 560
Thr Thr Val Leu Pro Lys Val
565

Claims (9)

1.一种蛋白质，是将6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白第543位丝氨酸突变为丙氨酸得到的，
所述蛋白质是序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为序列表中序列3所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
5.权利要求1所述的蛋白质的应用，为如下（c1）-（c6）中至少一种：
（c1）作为6-磷酸葡萄糖异构酶；
（c2）催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸葡萄糖；
（c3）催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；
（c4）以6-磷酸果糖为原料制备6-磷酸葡萄糖酸；
（c5）促进植物淀粉的合成；
（c6）提高植物光合效力。
6.一种重组菌，是将权利要求2或3所述的基因导入宿主菌中得到的。
7.权利要求6所述的重组菌在制备6-磷酸葡萄糖异构酶产品中的应用。
8.一种6-磷酸葡萄糖异构酶的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求6所述的重组菌，从重组菌中得到6-磷酸葡萄糖异构酶。
9.一种组合物，包括权利要求1所述蛋白质和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，所述组合物的用途为制备6-磷酸葡萄糖酸或催化6-磷酸果糖到6-磷酸葡萄糖酸的生化反应。
CN201611033436.6A 2016-11-15 2016-11-15 TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用 Active CN106754851B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611033436.6A CN106754851B (zh) 2016-11-15 2016-11-15 TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611033436.6A CN106754851B (zh) 2016-11-15 2016-11-15 TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106754851A CN106754851A (zh) 2017-05-31
CN106754851B true CN106754851B (zh) 2019-07-02

Family

ID=58971840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611033436.6A Active CN106754851B (zh) 2016-11-15 2016-11-15 TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106754851B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112094838B (zh) * 2020-09-28 2022-12-20 中国科学院遗传与发育生物学研究所 6-磷酸葡萄糖异构酶在调控植物淀粉含量和生物量中的应用
CN114317511B (zh) * 2022-03-10 2022-06-14 北京爱普益医学检验中心有限公司 蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途
CN115820695B (zh) * 2022-08-31 2024-03-26 四川农业大学 一种调控稻米垩白的基因pgi1、pgi2及其编码蛋白和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1390943A (zh) * 2002-04-12 2003-01-15 杭州华大基因研发中心 耐高温6－磷酸葡萄糖异构酶基因及其编码的多肽和制备方法
US20110065111A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-17 Ibis Biosciences, Inc. Compositions For Use In Genotyping Of Klebsiella Pneumoniae
JP2015154768A (ja) * 2014-01-14 2015-08-27 国立大学法人九州大学 新規人工遺伝子回路

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1390943A (zh) * 2002-04-12 2003-01-15 杭州华大基因研发中心 耐高温6－磷酸葡萄糖异构酶基因及其编码的多肽和制备方法
US20110065111A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-17 Ibis Biosciences, Inc. Compositions For Use In Genotyping Of Klebsiella Pneumoniae
JP2015154768A (ja) * 2014-01-14 2015-08-27 国立大学法人九州大学 新規人工遺伝子回路

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Fitness differences associated with Pgi SNP genotypes in the Glanville fritillary butterfly (Melitaea cinxia)";L.ORSINI et al.;《J.EVOL.BIOL.》;20091231;第22卷;第367-375页 *
"From DNA to Fitness Differences: Sequences and Structures of Adaptive Variants of Colias Phosphoglucose Isomerase (PGI)";Christopher W. Wheat et al.;《Mol Biol Evol.》;20060331;第23卷(第3期);第499-512页 *
"Nucleotid e Polymorph ism at a Gene ( Pgi) under Balancing Selection in a Butterfly Metapopulation";Christopher W. Wheat et al.;《Mol. Biol. Evol.》;20090930;第27卷(第2期);第267-281页 *
"Triticum aestivum glucose-6-phosphate isomerase(GPI)mRNA,complete cds"Accession Number:DQ456872.1;Zou L.;《GenBank》;20060415;第1-2页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106754851A (zh) 2017-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104220602B (zh) 用于合成错误最小化核酸分子的材料和方法
WO2018188672A1 (zh) 唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法
CN106754851B (zh) TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用
US10336990B2 (en) Helicobacter pylori α-1,3 fucosyltransferase gene and protein with improved soluble protein expression and activity, and thereof application for synthesis of α-1,3 fucosyloligosaccharide
CN109312375A (zh) 一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶
CN110381751A (zh) 莱鲍迪苷e生物合成产生甜菊醇糖苷莱鲍迪苷d4
CN109266595A (zh) 一种转化l-苏氨酸生产l-2-氨基丁酸的重组菌的构建及应用
CN108048438A (zh) 一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用
CN108884120A (zh) 用于通过使用微生物纯化3，6-脱水-l-半乳糖的新颖方法
CN104673809B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
CN107460203A (zh) 一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法及用途
CN113801240B (zh) 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
CN106916838A (zh) 催化UDP‑鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其编码蛋白和应用
CN104726435B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株
CN111499759A (zh) 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用
CN109280673A (zh) 糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用
CN113337495A (zh) 一种提高唾液酸产量的方法与应用
CN104450762B (zh) α‑硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法
CN109402080B (zh) 蛋白质ugt142及其编码基因与应用
CN109161556B (zh) 一种海带中的m1pdh基因、其蛋白质及用途
CN113736762B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用
CN113584002B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
CN105132400A (zh) 具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备方法
CN107779443A (zh) 纤维二糖水解酶突变体及其应用
CN113151377A (zh) 一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法与酶用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant