CN103173476B

CN103173476B - 鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因zh0-ii及其原核表达载体和应用

Info

Publication number: CN103173476B
Application number: CN201310132790.4A
Authority: CN
Inventors: 伊日布斯; 过敏; 钱龙; 赵琳; 唐丽薇; 严金平
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2033-04-17
Also published as: CN103173476A

Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II及其高效表达海藻酸裂解酶ZH0-II的原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II，该载体用Ptac启动子控制它在大肠杆菌中的表达，本发明将海藻酸裂解酶基因采用大肠杆菌表达载体进行表达，能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶ZH0-II，且获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-II具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，酶活可以达到61.7U/mg，本发明的原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产。

Description

鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II及其原核表达载体和应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II及其高效表达鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶蛋白ZH0-II的原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II及其在制备海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白中的应用。

背景技术

近年来，由于能源危机的加剧，环境问题日益突出，以海藻生物质为原料生产生物能源越来越受到重视。大型海藻含有丰富碳水化合物，如海藻酸，开发相应的技术可将其转化为生物乙醇，产量高，且容易预处理。目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。

目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量很低成本较高，难达到实际应用要求。因此，利用基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年，Boyd等首次克隆了Pseudomonas alginovora海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗蛋白活性达到146U/mg。1996年Frederic等将Pseudomonas alginovora中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，并且其催化活性达到97U/mg。2009年，Gaofei Duan等人在Pseudoalteromonassp. CY24中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大肠杆菌中表达得到一个58KD的蛋白，催化活性达到了121.6U/mg。2012年，Hwan Hee Park等利用Sphingomonas sp. MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对polyM 和polyG都有活性的双功能酶。

目前，国内外所发现的海藻酸分解菌的种类众多，主要分布于海洋细菌、土壤细菌和真菌等，但被成功克隆及异源表达的海藻酸裂解酶并不多，传统方法一般利用海藻酸钠分解菌，通过发酵生产分离、纯化得到海藻酸裂解酶，这种方法存在野生菌产酶量低、酶与降解产物难于分离，生产成本高等问题，成为酶解技术大量制备褐藻胶低聚糖的制约性技术难题，限制了海藻酸裂解酶的推广使用，且大多数海藻酸裂解酶只能单一的利用PloyG或者PloyM，本发明从鞘氨醇单胞菌ZH0中成功克隆出海藻酸裂解酶基因ZH0-II，并进行了异源表达和蛋白纯化的研究，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-II具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，是一种具有广阔运用前景的双功能酶，本发明为进一步研究海藻酸裂解酶分子机理，进而推广到工业生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种鞘氨醇单胞菌的海藻酸裂解酶基因ZH0-II，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明另一目的是提供一种鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II的原核表达载体，该载体含有海藻酸裂解酶基因ZH0-II、Ptac启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，ZH0-II基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ZH0-II基因的起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成易溶于水的融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。

本发明中所述海藻酸裂解酶基因ZH0-II来源于鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZH0。

本发明的另一目的是将鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II的原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II应用在制备海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白中。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-II基因的获得及原核表达载体的构建

（1）根据鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶N端和C端的保守序列和原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点，设计如下1对特异引物：

ZH0-2-F：5’-GGATCCGCACCGGCCGCAGCGCACTCGGCC-3’，

ZH0-2-R：5’-GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG-3’，在上下游引物的5’端分别加入BamH I和Not I酶切位点（下划线为酶切位点）；提取鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZH0的基因组，使用上述引物进行扩增，得到海藻酸裂解酶ZH0-II的全长DNA序列；

（2）回收并纯化海藻酸裂解酶ZH0-II全长基因片段，并将其连接到Pmd19-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD19-ZH0-II；

（3）构建原核载体pGEX-4T-1-ZH0-II，用BamH I和Not I双酶切pMD19-ZH0-II和pGEX-4T-1，并回收纯化ZH0-II基因片段以及载体片段pGEX-4T-1，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II，进行测序比对分析，将测序结果进行生物信息学分析。

2、海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白的原核表达

使用热刺激法将pGEX-4T-1-ZH0-II转入大肠杆菌BL21（DE3）中，在终浓度1mM IPTG诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；

3、海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白纯化

收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于ZH0-II蛋白表达SDS-PAGE检测及下一阶段实验。

4、海藻酸裂解酶ZH0-II的特性研究

对纯化后的海藻酸裂解酶ZH0-II进行特性研究，内容包括最适pH，最适温度，热稳定性等，本发明获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白，其最适pH为6.5，最适温度为47℃，在50℃，10min损失50%的酶活性；本发明中使用的测定方法为常规的海藻酸裂解酶活性测定方法，测定反应底物在A235nm处吸光值的变化。

本发明对海藻酸裂解酶基因ZH0-II进行了扩增，并进一步原核表达和蛋白纯化，获得的ZH0-II蛋白，现有技术海藻酸裂解酶野生菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天时间，而本发明的基因工程菌株只需要6h即可得到最大量的目的蛋白，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-II具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，是一种具有广阔运用前景的双功能酶，本发明解决了现有的产海藻酸裂解酶的菌株的酶产量比较低的问题，也为进一步对裂解酶ZH0-II进行机理及机制研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明鞘氨醇单胞菌ZH0基因组DNA的检测示意图；其中M是DNA marker；1是基因组DNA；

图2为本发明海藻酸裂解酶基因ZH0-II的TA克隆策略示意图；

图3为本发明TA克隆重组质粒pMD19-ZH0-II的电泳检测及酶切检测示意图，其中：A图为质粒的电泳检测示意图，图中：M为DNA marker；1-2为pMD19-ZH0-II；B图为重组质粒的酶切检测示意图，图中：M为DNA marker；1为BamH I单酶切的pMD19-ZH0-II质粒；2为Not I单酶切的pMD19-ZH0-II质粒；3-4为BamH I与Not I双酶切的pMD19-ZH0-II质粒；

图4为本发明海藻酸裂解酶基因ZH0-II的原核表达载体构建策略示意图；

图5为本发明重组质粒pGEX-4T-1-ZH0-II的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-8是pGEX-4T-1-ZH0-II；

图6为本发明重组质粒pGEX-4T-1-ZH0-II的单酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是BamH I单酶切的pGEX-4T-1-ZH0-II质粒；3-4是Not I单酶切的pGEX-4T-1-ZH0-II质粒；

图 7为本发明重组质粒pGEX-4T-1-ZH0-II的双酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1是未酶切的pGEX-4T-1-ZH0-II质粒；2-5 是Not I与BamH I双酶切的pGEX-4T-1-ZH0-II质粒；

图8为本发明海藻酸裂解酶ZH0-II表达的SDS-PAGE检测示意图，图中：M是蛋白marker；1是pGEX-4T-1质粒在37℃、经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；2是pGEX-4T-1-ZH0-II质粒在37℃、未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；3-9是pGEX-4T-1-ZH0-II质粒在37℃、经终浓度1mM IPTG诱导后，0、2、4、6、8、10、12h的细菌总蛋白；

图9为本发明海藻酸裂解酶的纯化电泳示意图，图中：M是蛋白marker；1是纯化前的细菌上清蛋白；2是纯化后的流川液；3是纯化后的洗涤液：4是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液一；5是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液二；

图10为本发明海藻酸裂解酶ZH0-II的最适pH示意图，图中：黑色方块曲线为ZH0-II蛋白在pH5.0-8.0磷酸钠缓冲液中的活性示意图；另一黑色倒三角曲线为ZH0-II蛋白在pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液中的活性示意图；

图11为本发明海藻酸裂解酶ZH0-II的最适温度示意图；

图12为本发明海藻酸裂解酶ZH0-II的热稳定性示意图；

图13为本发明海藻酸裂解酶ZH0-II的金属离子影响示意图；

图14为本发明海藻酸裂解酶ZH0-II的底物特异性示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的实际如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。

本实施例中试剂主要分为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司（大连）及北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器；所有引物序列均在上海生工合成。

实施例1：鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZH0基因组DNA的制备与检测

本发明所用的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZH0（ZH0）为本实验室筛选菌株，鞘氨醇单胞菌ZH0基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法，具体内容如下：取2mL过夜培养菌液于4℃，4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；加入100ul Solution I悬菌，然后加入30ul 10%SDS；1ul 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃孵育1小时；加入100ul 15mol/L NaCl，混匀；加入20ul CTAB/NaCl溶液（CTAB 10%，NaCl 0.7mol/L），混匀，65℃，10分钟；加入等体积酚/氯仿/异戊醇25:24:1）混匀， 12000rpm离心5分钟；取上清，加入2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/LNaOAC，-20℃放置30分钟； 12000rpm离心10分钟；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20ul TE，-20℃保存；取2ul基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果（见图1）说明提取到的基因组DNA质量符合要求。

实施例2：海藻酸裂解酶基因ZH0-II的扩增与TA克隆：

海藻酸裂解酶基因ZH0-II的扩增及TA克隆的策略如图2所示，根据鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶N端和C端的保守序列，并设计一对特异引物，序列如下：

ZH0-2- F：GGATCCGCACCGGCCGCAGCGCACTCGGCC

ZH0-2- R：GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG

5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位点；3’端加GCGGCC特征序列，形成Not I酶切位点；

在PCR反应混合液中加入10ng的鞘氨醇单胞菌ZH0基因组DNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物ZH0-2-R和ZH0-2-F、1.8uldNTP（10mM），2.5ul的Pfu反应缓冲液和0.15ul的pfu（5U/ul）聚合酶（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），加入双蒸水使终体积为20ul；在PCR仪上于94℃加热5分钟，然后按照94℃、45秒，69℃、30秒，72℃、2.5分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到ZH0-II基因，反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收并纯化ZH0-II全长基因DNA（0.7Kb），然后用宝生物（TaKaRa）的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD19-T（大连宝生物公司）载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态JM109（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司），采用碱裂解法提取质粒DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其大小（图3A），选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。分别用BamH I和Not I单酶切重组质粒，连接成功的重组质粒pMD19-ZH0-II有一条大小为3.3kb左右的ZH0-II基因DNA片段，进一步进行双酶切，连接成功的重组质粒pMD19-ZH0-II有两条片段，一条大小为2.6kb左右，另一条为0.7kb左右（图3B）。测序分析证明重组质粒载体中插入的ZH0-II全长基因序列正确，再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌JM109，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD19-ZH0-II。

实施例3：原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II的构建

pGEX-4T-1-ZH0-II的构建策略如图4所示，用BamH I（TaKaRa）和Not I（TaKaRa）切开纯化的原核表达载体pGEX-4T-1（购自GE Healthcare公司）和pMD19-ZH0-II，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pGEX-4T-1被切割后产生的载体片段pGEX-4T-1（4.9kb）及pMD19-ZH0-II被切割产生的ZH0-II基因的DNA片段（0.7kb），然后用宝生物（TaKaRa）的连接酶试剂盒连接pGEX-4T-1载体片段和ZH0-II基因的DNA片段产生原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II，用连接反应混合物转化高效率（10⁸）的大肠杆菌感受态细胞（JM109，北京庄盟国际生物基因科技有限公司），把转化后的大肠杆菌涂于加油氨苄霉素（Amp，100ug/ml）的平板上，于37℃，过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒（图5），用BamH I、Not I（TaKaRa）进行双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生4.9kb和0.7kb左右大小的两条带（因为BamH I，Not I在载体处都只有单一识别位点，故双酶切质粒应有两个片段）（图6-7）。将连接成功的质粒载体pGEX-4T-1-ZH0-II重新转化大肠杆菌JM109，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pGEX-4T-1-ZH0-II。

实施例4：海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白的表达与表达条件的优化

用原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-II转化大肠杆菌BL21的感受态细胞（天根生化科技），挑取单菌落加入2mL LB（含有Amp 100mg/L）中，37℃过夜培养（OD₆₀₀约为1.5），加入终浓度为1.0mM的IPTG分别于37℃诱导0-12小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入5XSDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10分钟煮沸菌体，冰浴冷却后于4℃离心（12000rpm）10分钟，取上清作SDS-PAGE，根据文献资料和软件分析预测目的融合蛋白大小为52kDa左右（GST融合标签为26kDa），采用12%分离胶，SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南（第三版）》，SDS-PAGE电泳结果表示在37℃诱导6小时后ZH0-II蛋白表达量达到最大值，故选取6h为最佳诱导时间（见图8）。

实施例5：海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白的纯化，具体步骤如下：

a、菌体破碎：将在37℃、1mM IPTG下大量诱导表达6h的1L菌体，经超声破碎菌体（工作5s，休息5s）20min；

b、收集上清和沉淀：将菌体破碎液4℃、12000rpm离心20min，分别保留上清和沉淀；

c、蛋白破碎上清液使用0.22uM滤器进行过滤，除去杂质；

d、 GST Sefinose Resin柱的预处理：将柱子中保存用的20%乙醇放出；10倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl）平衡柱子，流速为0.5-1ml/min；

e、蛋白样品上柱：流速为0.5ml/min，收集流出液；

f、洗柱：使用5-10倍体积PBS缓冲液（4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）洗脱；

g、洗脱：使用2倍柱体积洗脱缓冲液（10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，Ph8.0）洗脱，重复2-3次，收集洗脱液；

h、 GST Sefinose Resin柱的后处理：5倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）；5倍柱体积去离子水洗柱；于4℃，3倍柱体积的20%乙醇中保存；

i、 SDS-PAGE检测：分别取20ul各洗脱梯度流出液，流川液，洗涤液，粗酶液加入5ul的5X SDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10分钟煮沸，上样，进行SDS-PAGE分析，纯化结果如图9，最终获得ZH0-II纯化蛋白。

通过上述的实验，本发明达到了如下的结果：利用本发明海藻酸裂解酶ZH0-II的原核表达载体（pGEX-4T-1-ZH0-II）转化大肠杆菌（BL21），可实现ZH0-II蛋白的高水平表达，表达的ZH0-II基本在上清中，ZH0-II重组蛋白表达量很高，根据纯化前后的蛋白总量计算，活力产量可达63.1%，因此不需要大规模培养细菌，纯化ZH0-II蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。

实施例6：海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白的特性分析，具体内容如下：

1、酶活测定

由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸钠产生的不饱和糖醛酸在235nm处具有吸收值，通过测量反应液在该波长下的变化而计算相应的酶活。

在反应体系（20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），0.3%海藻酸钠）中加入10ug的海藻酸裂解酶蛋白启动反应，10min后测量溶液235nm处吸光值的变化。

酶活定义：在波长235nm下吸光值，以每分钟吸光值增加1定义为一个酶活单位（U）。

通过测定，纯化后的重组海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白的酶活可以达到61.7U/mg，而现有海藻酸裂解酶酶活基本在20-40U/mg的范围内，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白的酶活要高于现有海藻酸裂解酶酶活的平均值。

2、酶学性质的研究

（1）海藻酸裂解酶蛋白最适催化pH值测定

在pH缓冲体系（pH5.0-8.0磷酸钠缓冲液或pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液）中用海藻酸钠为底物测定海藻酸裂解酶的最适反应pH，在37℃下反应时间为10min，将处于最适pH下的酶活力定义为100%，海藻酸裂解酶ZH0-II酶的活性和稳定性与pH值的关系曲线如图10所示，在pH5.0-8.0磷酸钠缓冲液中，海藻酸裂解酶ZH0-II最适酶反应pH条件为6.5，而在pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液中，海藻酸裂解酶ZH0-II的最适酶反应pH条件为8.5。

（2）海藻酸裂解酶蛋白最适催化温度和温度稳定性测定怎么

在pH值6.5的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定海藻酸裂解酶的最适反应温度，反应时间为10min，将处于最适温度下的酶活力定义为100%，将酶液分别在不同温度下保温10min，结果如图11所示，酶的最适反应温度47℃，在42～52℃范围内有较高的酶活力；当温度升高到57℃时，酶活迅速下降，只有峰值的60.6％。

在pH值6.5的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定海藻酸裂解酶的最适反应温度，反应10min后，在不同温度环境下测定酶活性损失，测定反应液的剩余酶活力，酶的热稳定性实验结果如图12所示，该酶在37℃保温10min后．剩余酶活力为89.2％；在42℃保温10min后，剩余酶活力为87.8％；而在52℃时剩余酶活力仅有19.3％。

（3）金属离子对海藻酸裂解酶蛋白酶活性的影响

在pH6.5的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定不同金属化合物（反应液中金属离子的浓度为5mM）对海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白活性的影响，以添加相同体积水溶液作为对照组，在最适温度47℃下测定酶活力，将对照组的酶活力定义为100%，结果如图13所示，Hg²⁺对酶活有完全抑制作用，Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺与Fe²⁺能对酶活有强烈抑制作用，Na²⁺对酶活有部分抑制作用，K⁺、Co²⁺、Ca²⁺对酶活基本无影响，而Mg²⁺对酶活有部分促进作用。

（4）海藻酸裂解酶ZH0-II的底物特异性实验

将纯化后的海藻酸裂解酶ZH0-II（1ug）添加到20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，同时添加质量百分比0.3%的不同底物（海藻酸钠、PloyG、PloyM），在反应温度为47℃下反应10min，结果如图14所示，ZH0-II对于PloyG的底物特异性较强，而对于PloyM的底物特异性较差，海藻酸裂解酶对于海藻酸钠的底物特异性均强于PloyG与PloyM。

传统方法一般利用海藻酸钠分解菌，通过发酵生产分离、纯化得到海藻酸裂解酶，然而这种方法存在野生菌产酶量低、酶与降解产物难于分离，生产成本高等问题，成为酶解技术大量制备褐藻胶低聚糖的制约性技术难题，限制了海藻酸裂解酶的推广使用。

本发明采用基因工程技术，构建含有海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通过诱导发酵大量生产重组型海藻酸裂解酶将解决这一制约性技术难题。与传统方法相比，该方法使得酶的得率大大提高，且酶的纯化过程简单高效，酶活力高于目前常见的海藻酸裂解酶。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大学

<120> 鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II及其原核表达载体和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> Sphingomonassp.ZH0

<400> 1

gcaccggccg cagcgcactc ggccgtcgac ctgtcgaaat ggaagctgca gattccggtt 60

gatccgatcg acgtgagcac gcgcgatctg ctcaagggct accaggacaa gtacttctat 120

gtggacaagg acggcgcgct tgctttctgg tgcccggcca gcggtttcaa gaccactgcc 180

aacaccaagt acccgcgtag cgaactgcgt gaaatgctcg acccggacaa ccacgcggtg 240

aactggggct ggcagggcac gcatgagatg aacctgcgtg gcgcggtcat gcatgtgtcg 300

cccagtggca agaccatcgt catgcagatt cacgccgtca tgcccgatgg ctcgaacgcg 360

ccgccgctgg tgaaggggca gttctacaag aacacgctcg actttctcgt gaagaacgcc 420

gccaccggcg gcaaggacac gcactacgtg ttcgaaggca tcgagctggg caagccgtat 480

gacgcgcaga tcaaggttgt cgatggcgtg ctgtcgatga ccgtcaacgg tcaaaccaag 540

acggtcgact ttgtcggcaa ggacgctggc tggaaagacc tgaagttcta cttcaaggca 600

ggcaattatc tgcaggaccg ccagcctgac ggatcggaca ccagcgcgct ggtcaagctg 660

tacaagctcg acgtaaagca ctcgagctga 690

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> Sphingomonassp. ZH0

<400> 2

Ala Pro Ala Ala Ala His Ser Ala Val Asp Leu Ser Lys Trp Lys Leu Gln Ile Pro Val

5 10 15 20

Asp Pro Ile Asp Val Ser Thr Arg Asp Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Asp Lys Tyr Phe Tyr

25 30 35 40

Val Asp Lys Asp Gly Ala Leu Ala Phe Trp Cys Pro Ala Ser Gly Phe Lys Thr Thr Ala

45 50 55 60

Asn Thr Lys Tyr Pro Arg Ser Glu Leu Arg Glu MET Leu Asp Pro Asp Asn His Ala Val

65 70 75 80

Asn Trp Gly Trp Gln Gly Thr His Glu MET Asn Leu Arg Gly Ala Val MET His Val Ser

85 90 95 100

Pro Ser Gly Lys Thr Ile Val MET Gln Ile His Ala Val MET Pro Asp Gly Ser Asn Ala

105 110 115 120

Pro Pro Leu Val Lys Gly Gln Phe Tyr Lys Asn Thr Leu Asp Phe Leu Val Lys Asn Ala

125 130 135 140

Ala Thr Gly Gly Lys Asp Thr His Tyr Val Phe Glu Gly Ile Glu Leu Gly Lys Pro Tyr

145 150 155 160

Asp Ala Gln Ile Lys Val Val Asp Gly Val Leu Ser MET Thr Val Asn Gly Gln Thr Lys

165 170 175 180

Thr Val Asp Phe Val Gly Lys Asp Ala Gly Trp Lys Asp Leu Lys Phe Tyr Phe Lys Ala

185 190 195 200

Gly Asn Tyr Leu Gln Asp Arg Gln Pro Asp Gly Ser Asp Thr Ser Ala Leu Val Lys Leu

205 210 215 220

Tyr Lys Leu Asp Val Lys His Ser Ser

225

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatccgcac cggccgcagc gcactcggcc 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggccgctc agctcgagtg ctttacgtgg ag 32

Claims

1.鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II的原核表达载体，其特征在于：该载体含有海藻酸裂解酶基因ZH0-II、Ptac启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，ZH0-II基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ZH0-II基因的起始密码子上游的是一个GST标签序列。

2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因的原核表达载体在制备海藻酸裂解酶ZH0-II蛋白中的应用。