CN103215297A - 鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶zh0-i的原核表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ZH0海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-I，该载体是含有鞘氨醇单胞菌ZH0海藻酸裂解酶基因ZH0-I的原核表达载体，本发明原核表达载体能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶ZH0-I，且获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-I具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，酶活可以达到53.2U/mg，是一种具有广阔运用前景的双功能酶，本发明原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶蛋白（ZH0-I）的原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-I及其在制备海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白中的应用。
背景技术
近年来，由于能源危机的加剧，环境问题日益突出，以海藻生物质为原料生产生物能源越来越受到重视。大型海藻含有丰富碳水化合物，如海藻酸，开发相应的技术可将其转化为生物乙醇，产量高，且容易预处理。目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。
目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量很低成本较高，难达到实际应用要求。因此，利用基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年，Boyd等首次克隆了Pseudomonas alginovora海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗蛋白活性达到146U/mg。1996年Frederic等将Pseudomonas alginovora中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，并且其催化活性达到97U/mg。2009年，Gaofei Duan等人在Pseudoalteromonas sp. CY24中克隆的到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大肠杆菌中表达得到一个58KD的蛋白，催化活性达到了121.6U/mg。2012年，Hwan Hee Park等利用Sphingomonas sp. MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对polyM 和polyG都有活性的双功能酶。
目前，国内外所发现的海藻酸分解菌的种类众多，主要分布于海洋细菌、土壤细菌和真菌等，但被成功克隆及异源表达的海藻酸裂解酶并不多，传统方法一般利用海藻酸钠分解菌，通过发酵生产分离、纯化得到海藻酸裂解酶，然而这种方法存在野生菌产酶量低、酶与降解产物难于分离，生产成本高等问题，成为酶解技术大量制备褐藻胶低聚糖的制约性技术难题，限制了海藻酸裂解酶的推广使用，且大多数海藻酸裂解酶只能单一的利用PloyG或者PloyM，本发明从鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ZH0中成功克隆出海藻酸裂解酶基因ZH0-I，并进行了异源表达和蛋白纯化的研究，将为进一步研究海藻酸裂解酶分子机理，进而推广到工业生产奠定基础，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-I具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，是一种具有广阔运用前景的双功能酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种鞘氨醇单胞菌的海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体，该载体含有海藻酸裂解酶基因ZH0-I、Ptac启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签， ZH0-I基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ZH0-I基因起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成易溶于水的融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。
本发明中所述海藻酸裂解酶ZH0-I基因来源于鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ZH0，其GenBank登录号为JX944512.1。
本发明另一目的是将鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体应用在制备海藻酸裂解酶ZH0-I中。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
1、鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-I的获得和原核表达载体的构建
（1）根据鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I基因（GenBank登录号JX944512.1）编码框序列和原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点，设计1对特异引物如下：
ZH0-1-F： 5’-GGATCCCACCCCTTCGACCAGGCCGTCGTG-3’，
ZH0-1-R：5’-GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG-3’，在上下游引物的5’端分别加入BamH I和Not I酶切位点（下划线为酶切位点）；提取鞘氨醇单胞菌ZH0的基因组，使用上述引物进行扩增；
（2）回收并纯化海藻酸裂解酶ZH0-I全长基因片段，并将其连接到Pmd19-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD19-ZH0-I；
（3）构建原核载体pGEX-4T-1-ZH0-I，用BamH I和Not I双酶切pMD19-ZH0-I和pGEX-4T-1，并回收纯化海藻酸裂解酶ZH0-I基因片段以及载体片段pGEX-4T-1，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-I，进行测序比对分析，将测序结果进行生物信息学分析。
2、海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达
使用热刺激法将pGEX-4T-1-ZH0-I转入大肠杆菌BL21（DE3）中，在终浓度1mM IPTG诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；
3、海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白纯化
收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于ZH0-I蛋白表达检测及下一阶段实验。
4、重组海藻酸裂解酶ZH0-I的特性研究
对纯化后的海藻酸裂解酶ZH0-I进行特性研究，内容包括最适pH，最适温度，热稳定性等，本发明获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-I，其最适pH为7.0，最适温度为42℃，在50℃，10min损失50%的酶活性；本发明中采用的测定方法为常规的海藻酸裂解酶活性测定方法，测定反应底物在A235nm处吸光值的变化。
本发明对海藻酸裂解酶ZH0-I基因进行了扩增，并进一步原核表达和蛋白纯化，获得的ZH0-I蛋白，现有技术海藻酸裂解酶野生菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天时间，而本发明的基因工程菌株只需要6h即可得到最大量的目的蛋白，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白具有广泛的底物特异性，既能利用PloyG又能利用PloyM为底物，酶活可以达到53.2U/mg，是一种具有广阔运用前景的双功能酶，本发明原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产；本发明解决了现有的产海藻酸裂解酶的菌株的酶产量比较低的问题，也为进一步对海藻酸裂解酶ZH0-I进行机理及机制研究奠定了基础。
附图说明
图1是本发明鞘氨醇单胞菌ZH0基因组DNA的检测，图中：M是DNA marker；1是基因组DNA；
图2是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I基因的TA克隆策略示意图；
图3是本发明重组质粒pMD19-ZH0-I的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-4是pMD19-ZH0-I；
图4是本发明重组质粒pMD19-ZH0-I的酶切检测示意图，图中： M是DNA marker；1-4是未酶切的pMD19-ZH0-I质粒；5-8是BamH I单酶切的pMD19-ZH0-I质粒；9-12是Not I单酶切的pMD19-ZH0-I质粒；13是BamH I与Not I双酶切的pMD19-ZH0-I质粒；
图5是本发明重组质粒pMD19-ZH0-I的PCR检验示意图，图中：M是DNA marker；1的负对照；2-5的以pMD19-ZH0-I为模板，用ZH0-1-F，ZH0-1-R为引物扩增的PCR产物；
图6是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I基因的原核表达载体构建策略示意图；
图7是本发明重组质粒pGEX-4T-1-ZH0-I的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是pGEX-4T-1-ZH0-I；
图8是本发明重组质粒pGEX-4T-1-ZH0-I的酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1是未酶切的pGEX-4T-1-ZH0-I质粒；2是BamH I单酶切的pGEX-4T-1-ZH0-I质粒；3是Not I单酶切的pGEX-4T-1-ZH0-I质粒；4是BamH I与Not I双酶切的pGEX-4T-1-ZH0-I质粒。
图9是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I表达的SDS-PAGE检测示意图，图中：M是蛋白marker；1是pGEX-4T-1质粒在37℃、未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；2是pGEX-4T-1-ZH0-I质粒在37℃、未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；3是pGEX-4T-1-ZH0-I质粒在37℃、经终浓度1mM IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；4是pGEX-4T-1-ZH0-I质粒在37℃、经终浓度1mM IPTG诱导后，8h的细菌总蛋白；
图10是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I在37℃下表达情况，图中：M是蛋白marker；1-6是pGEX-4T-1-ZH0-I质粒在37℃、经终浓度1mM IPTG诱导后，10、8、6、4、2、0h的细菌总蛋白；7-8是pGEX-4T-1质粒在37℃、经终浓度1mM IPTG诱导后，6h和0h的细菌总蛋白；
图11是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I在28℃下表达情况，图中：M是蛋白marker；1-6是pGEX-4T-1-ZH0-I质粒在28℃、经终浓度1mM IPTG诱导后，0、2、4、6、8、10h的细菌总蛋白；7是pGEX-4T-1-ZH0-I质粒在37℃下、经终浓度1mM IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；
图12是本发明海藻酸裂解酶的纯化电泳示意图，图中：M是蛋白marker；1是纯化前的细菌上清蛋白；2是纯化后的流川液；3是纯化后的洗涤液；4是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液一；5是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液二；6是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液三；7 是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液四；8是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液五；
图13是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I的最适pH示意图，图中： 黑色方块曲线为ZH0-I蛋白在pH5.0-8.0磷酸钠缓冲液中的活性示意图； 另一黑色倒三角曲线为ZH0-I蛋白在pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液中的活性示意图；
图14是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I的最适温度示意图；
图15是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I的热稳定性示意图；
图16是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I的金属离子影响示意图；
图17是本发明海藻酸裂解酶ZH0-I的底物特异性示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的实际如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
本实施例中试剂主要分为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司（大连）及北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器；所有引物序列均在上海生工合成。
实施例1：鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZH0基因组DNA的制备与检测
本发明所用的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZH0（ZH0）为本实验室筛选菌株，鞘氨醇单胞菌ZH0基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法，具体内容如下：取2mL过夜培养菌液于4℃4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；然后加入100ul Solution I悬菌、30ul 10%SDS、1ul 20mg/ml蛋白酶K混匀，37℃孵育1小时；加入100ul 15mol/L NaCl，混匀；加入20ul CTAB/NaCl溶液（CTAB 10%，NaCl 0.7mol/L），混匀，65℃，10分钟；加入等体积酚/氯仿/异戊醇25:24:1）混匀；离心12000rpm，5分钟；取上清，加入2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/L NaOAC，-20℃放置30分钟；离心12000rpm，10分钟；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20ul TE，-20℃保存。取2ul基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果（见图1）说明提取到的基因组DNA质量符合要求。
实施例2：海藻酸裂解酶ZH0-I基因的扩增与TA克隆
海藻酸裂解酶ZH0-I基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首先从GenBank中查找ZH0-I的全长基因序列（ZH0-I基因的GenBank登陆号为JX944512.1），并设计一对特异引物，序列如下：
ZH0-1-F：GGATCCCACCCCTTCGACCAGGCCGTCGTG
ZH0-1-R：GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG
5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位点；3’端加GCGGCC特征序列，形成Not I酶切位点。
在PCR反应混合液中加入10ng的鞘氨醇单胞菌ZH0基因组DNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物ZH0-I-F和ZH0-I-R、1.8uldNTP（10mM），2.5ul的Pfu反应Buffer和0.15ul的pfu（5U/ul）聚合酶（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），加入双蒸水使终体积为20ul；在PCR仪上于94℃加热5分钟，然后按照94℃、45秒，67℃、30秒，72℃、2.5分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到ZH0-I基因，反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。回收并纯化ZH0-I全长基因DNA（1.7Kb），然后用宝生物（TaKaRa）的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD19-T（大连宝生物公司）载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态JM109（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司），采用碱裂解法提取质粒DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其大小（图3），选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。分别用BamH I和Not I单酶切重组质粒，连接成功的重组质粒pMD19-ZH0-I有一条大小为4.4kb左右的ZH0-I基因DNA片段。进一步进行双酶切，连接成功的重组质粒pMD19-ZH0-I有两条片段，一条大小为2.6kb左右，另一条为1.7kb左右（图4-5）。测序分析证明重组质粒载体中插入的ZH0-I全长基因序列正确。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌JM109，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD19-ZH0-I。
实施例3：原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-I的构建
pGEX-4T-1-ZH0-I的构建策略如图6所示，用BamH I（TaKaRa）和Not I（TaKaRa）切开纯化的原核表达载体pGEX-4T-1（购自GE Healthcare公司）和pMD19-ZH0-I，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pGEX-4T-1被切割后产生的载体片段pGEX-4T-1（4.9kb）及pMD19-ZH0-I被切割产生的ZH0-I基因的DNA片段（1.7kb），然后用宝生物（TaKaRa）的连接酶试剂盒连接pGEX-4T-1载体片段和ZH0-I基因的DNA片段产生原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-I，用连接反应混合物转化高效率（108）的大肠杆菌感受态细胞（JM109，北京庄盟国际生物基因科技有限公司），把转化后的大肠杆菌涂于加油氨苄霉素（Amp，100ug/ml）的平板上，于37℃，过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒（图7），用BamH I、Not I（TaKaRa）进行双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生4.9kb和1.7kb左右大小的两条带（因为BamH I，Not I在载体处都只有单一识别位点，故双酶切质粒应有两个片段）（图8）。将连接成功的质粒载体pGEX-4T-1-ZH0-I重新转化大肠杆菌JM109，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pGEX-4T-1-ZH0-I。
实施例4：海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白的表达与表达条件的优化
用原核表达载体pGEX-4T-1-ZH0-I转化大肠杆菌BL21的感受态细胞（天根生化科技）。挑取单菌落加入2mL LB（含有Amp 100mg/L）中，37℃过夜培养（OD600约为1.5）。加入终浓度为1.0mM的IPTG分别于37℃、28℃诱导0-10小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入5XSDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10分钟煮沸菌体。冰浴冷却后于4℃离心（12000rpm）10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的融合蛋白大小为91kDa左右（GST融合标签为26kDa），采用12%分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南（第三版）》。SDS-PAGE电泳结果（图9）表示在37℃诱导6小时或者28℃诱导8小时后ZH0-I蛋白表达量最高（图10-11），出于减少包涵体的考虑，选取28℃诱导8小时为最佳诱导条件。
实施例5：海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白的纯化，具体步骤如下：
（1）菌体破碎：将在28℃、1mM IPTG下大量诱导表达6h的1L菌体，经超声破碎菌体（工作5s，休息5s）20min；
（2）收集上清和沉淀：将菌体破碎液4℃、12000rpm离心20min，分别保留上清和沉淀；
（3）蛋白破碎上清液使用0.22uM滤器进行过滤，除去杂质；
（4）GST Sefinose Resin柱的预处理：将柱子中保存用的20%乙醇放出；10倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl）平衡柱子，流速为0.5-1ml/min；
（5）蛋白样品上柱：流速为0.5ml/min，收集流出液；
（6）洗柱：使用5-10倍体积PBS缓冲液（4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）洗脱；
（7）洗脱：使用2倍柱体积洗脱缓冲液（10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，Ph8.0）洗脱，重复2-3次，收集洗脱液；
（8）GST Sefinose Resin柱的后处理：5倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）；5倍柱体积去离子水洗柱；于4℃，3倍柱体积的20%乙醇中保存；
（9）SDS-PAGE检测：分别取20ul各洗脱梯度流出液，流川液，洗涤液，粗酶液加入5ul的5X SDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10分钟煮沸，上样，进行SDS-PAGE分析，纯化结果见图12，最终获得ZH0-I纯化蛋白。
通过上述的实验，本发明达到了如下的结果：利用本发明的ZH0-I的原核表达载体（pGEX-4T-1-ZH0-I）转化大肠杆菌（BL21），可实现ZH0-I蛋白的高水平表达，载体表达的海藻酸裂解酶ZH0-I基本在上清中，ZH0-I重组蛋白表达量很高，根据纯化前后的蛋白总量计算，活力产量可达65.7%，因此不需要大规模培养细菌，纯化ZH0-I蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。
实施例6：海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白的特性分析，具体内容如下：
1、酶活测定
由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸钠产生的不饱和糖醛酸在235nm处具有吸收值，通过测量反应液在该波长下的变化而计算相应的酶活。
在反应体系（20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），0.3%海藻酸钠）中加入10ug的海藻酸裂解酶蛋白启动反应，10min后测量235nm处吸光值的变化。
酶活定义：在波长235nm下吸光值，以每分钟吸光值增加1定义为一个酶活单位（U）。
通过测定，纯化后的重组海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白的酶活可以达到53.2U/mg，而现有海藻酸裂解酶酶活基本在20-40U/mg的范围内，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白的酶活要高于现有海藻酸裂解酶酶活的平均值。
2、酶学性质的研究
（1）海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白最适催化pH值测定
在pH缓冲体系（pH5.0-8.0磷酸钠缓冲液或pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液）中用海藻酸钠为底物测定海藻酸裂解酶的最适反应pH，在37℃反应时间为10min，将处于最适pH下的酶活力定义为100%，海藻酸裂解酶ZH0-I的活性和稳定性与pH值的关系曲线如图13所示，在酸性或碱性条件下酶的活力和稳定性都不高，海藻酸裂解酶ZH0-I最适酶反应pH条件为7.0。
（2）海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白最适催化温度和温度稳定性测定
在pH7.0的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定酶的最适反应温度，反应时间为10min，将处于最适温度下的酶活力定义为100%，将酶液分别在不同温度下保温10min，结果如图14所示，酶的最适反应温度42℃，在37～52℃范围内有较高的酶活力；当温度升高到57℃时，酶活迅速下降，只有峰值的41.2％。
在pH7.0的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定酶的最适反应温度，反应时间为10min后，在不同温度环境下测定酶活性损失，测定反应液的剩余酶活力，酶的热稳定性实验结果如图15，由图可知该酶在37℃保温10min后．剩余酶活力为88.5％；在42℃保温10min后，剩余酶活力为85.4％；而在52℃时剩余酶活力仅有40.3％。
（3）金属离子对海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白活性的影响
在pH7.0的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定不同金属化合物（反应液中金属离子的浓度为5mM）对海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白活性的影响，以添加相同体积水的溶液作为对照组，在最适温度42℃下测定酶活力，将对照组的酶活力定义为100%，结果如图16所示，Hg2+对酶活有完全抑制作用，Zn2+与Co2+能对酶活有强烈抑制作用，Mg2+与Na2+对酶活有部分抑制作用，而K+，Ca2+与Mn2+对酶活有部分促进作用。
（4）海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白的底物特异性
将纯化后的海藻酸裂解酶ZH0-I（1ug）添加到20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，同时添加质量百分比0.3%的不同底物（海藻酸钠、PloyG、PloyM），在反应温度为42℃下反应10min，结果如图17所示，ZH0-I对PloyG与PloyM均有底物特异性，但对于PloyG的底物特异性相对略强一些。
传统方法一般利用海藻酸钠分解菌，通过发酵生产分离、纯化得到海藻酸裂解酶，然而这种方法存在野生菌产酶量低、酶与降解产物难于分离，生产成本高等问题，成为酶解技术大量制备褐藻胶低聚糖的制约性技术难题，限制了海藻酸裂解酶的推广使用。
本发明采用基因工程技术，构建含有海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通过诱导发酵大量生产重组型海藻酸裂解酶将解决这一制约性技术难题。与传统方法相比，该方法使得酶的得率大大提高，且酶的纯化过程简单高效，酶活力高于目前常见的海藻酸裂解酶。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学
<120> 鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatcccacc ccttcgacca ggccgtcgtg 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcggccgctc agctcgagtg ctttacgtgg ag 32
Claims (3)
1.鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体，其特征在于：该载体含有海藻酸裂解酶基因ZH0-I、Ptac启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签， ZH0-I基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ZH0-I基因起始密码子上游的是一个GST标签序列。
2.根据权利要求1所述鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体，其特征在于：海藻酸裂解酶ZH0-I基因来源于鞘氨醇单胞菌，其GenBank登录号为JX944512.1。
3.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表达载体在制备海藻酸裂解酶ZH0-I中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130724 |