CN102643844B

CN102643844B - 粳稻木糖异构酶基因的功能及其应用

Info

Publication number: CN102643844B
Application number: CN2011100419280A
Authority: CN
Inventors: 顿宝庆; 王智; 李桂英; 路明
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-02-21
Also published as: CN102643844A

Abstract

本发明发现了粳稻的木糖异构酶基因具有转化木糖为木酮糖的功能。本发明构建了包含该基因的重组质粒，并将该质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，将木糖异构酶基因在宿主细胞及中表达后，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母获得了该转化能力。

Description

粳稻木糖异构酶基因的功能及其应用

技术领域：

本发明涉及粳稻木糖异构酶基因转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。

背景技术：

将木质素纤维素以产业化方式生产乙醇是既经济又环保的方式。因为来自植物的木质纤维素原料是可以大量获得的可再生资源。但是许多能够发酵生产乙醇的酵母(如酿酒酵母)并不能以木糖作为碳源。因此，需要提供能够利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的酵母。

如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，木糖就可以作为碳源进行乙醇发酵。

木糖异构化所需的木糖异构酶(D-xylose isomerase，XI)催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，广泛存在于细菌、少部分真菌中。酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，木酮糖进入磷酸戊糖途径，发酵生成乙醇。如果发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，酿酒酵母就能够将木糖异构化成木酮糖，达到可利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的目的。

现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。曾有人分别克隆表达了多种来源的木糖异构酶基因，如Escherichia coli，Bacillus subtilis，Thormotoga species，Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。

发明内容

本发明的目的是从植物中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使所得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。

本发明人通过分析数据库粳稻基因组序列的方式，首次从粳稻基因组序列中发现了具有木糖异构化功能的基因(GenBank NO.4344231)，并将其命名为“粳稻木糖异构酶基因”，其编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。现有技术的文献仅在转录水平上证实了该基因的存在，但对其所具有何种功能，以及可利用该基因做何种用途的研发，尚未见到有文献报道。

本发明构建了具有上述粳稻木糖异构酶基因的重组质粒，并将该质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母赋予了该转化能力。

具体地说，本发明进行了如下工作：

1.提取粳稻mRNA，反转录生成cDNA，用保守引物克隆得粳稻木糖异构酶基因，其大小为1440bp；

2.将粳稻木糖异构酶基因片段连接到具有高效表达活性的pYES2质粒载体中，构建具有完整木糖异构酶基因的重组质粒pYES-RXI；

3.将含木糖异构酶基因的重组质粒pYES-RXI通过电击转化方法导入不具将木糖转化为木酮糖的能力的酿酒酵母中，获得能够将木糖转化为木酮糖的遗传工程酵母菌株R(详见实施例5)。

因此本发明的木糖异构酶基因有益效果是：粳稻木糖异构酶基因赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。且粳稻木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率可达57.39％，大大高于对照菌株。(详见实施例6)

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本发明的精神和思路。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：酿酒酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D(表型为：MatAura3-52)及大肠杆菌DH5α由所在实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶及连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(2)酵母培养基YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)

(3)选择培养基SC(0.67％YNB、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)

实施例1获取粳稻cDNA

(一)植物总RNA提取-Trizol法

1、将组织在液氮中磨成粉末后，取50-100mg组织，加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％。

2、研磨液室温放置5min，然后加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s。

3、取上层水相于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min。

4、弃去上清液，加入1ml75％乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5min。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70％乙醇并保存于-70℃。

(二)mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)⁺，当总RNA流经oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

1、用0.1MNaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3、用1×柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、将(一)中提取的RNA液于65℃温育5min后迅速冷却至室温，加入等体积2×柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1×层析柱加样溶液。

5、测定每一管的OD₂₆₀，当洗出液中OD₂₆₀为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

6、测定OD₂₆₀，合并含有RNA的洗脱组分。

7、加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30min。

8、4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5min。

9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10min，或真空干燥10min。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70％乙醇中并贮存于-70℃)。

(三)反转录生成cDNA

1、在冰浴的试管中加入如下反应混合物：

模板RNA：1-5μg总RNA(DNase处理后)

引物：oligo(dT)

无RNA酶去离子水(RNase-free ddH2O)：定容至12μl。

2、轻轻混匀后离心3-5s。反应混合物在70℃水浴5min后，冰浴30s，然后离心3～5s。

3、将试管冰浴，再加入如下组分：

5×Reaction Buffer：4μl

RNasin(20U/μl)：1μl

dNTP mix(10mM)：2μl

4、轻轻混匀后离心3-5s。37℃水浴5min，加入1μlMMLV(20U/μl)，终体积为20μl。

5、反应混合物37℃水浴60min。在70℃加热10min结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。

实施例2木糖异构酶基因的序列

用保守引物从反转录得到的粳稻cDNA中克隆到一个约1.5kb的片段，测序分析发现含有一个1440bp的ORF序列，比对证实是粳稻的木糖异构酶基因(GenBank登录号4344231)。

DNA测序由上海生工生物公司完成，核苷酸和氨基酸分析软件主要为DNAMAN和美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，National Center forBiotechnology Information，NCBI)的Blast程序。

实施例3木糖异构酶基因表达载体质粒的构建

用编码粳稻木糖异构酶的基因的5’和3’端序列设计引物，包括Mfe I和Spe I位点。用Mfe I和Spe I酶切PCR产物。终产物被克隆到由pYES2产生的载体上。在该载体中，pYES2上的GAU启动子用TPI1启动子替换来确保木糖异构酶的组成型表达，从而消除培养基中对半乳糖的需求。TPI1启动子从酿酒酵母基因组克隆得到。该启动子被酶切成Nhe I-EcoR I片段。TPI1启动子和木糖异构酶的编码基因的PCR产物都被连接到用Spe I和Xba I剪切的pYES2上，最终得到含木糖异构酶基因的重组质粒pYES-RXI。

大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化

1)感受态细胞的制备(氯化钙转化法)

①从活化的大肠杆菌(E.coli)BL21平板上挑取单菌落接种到含5ml的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养2.5h至3h使菌液的OD₆₀₀值达到0.4至0.6，冰上冷却培养物至0℃

②将培养物倒入无菌的1.5ml的离心管中

③4℃，4000rpm离心10min

④弃上清，收集菌体

⑤用预冷的0.5ml的0.1M的CaCl₂重悬菌体，离心，弃上清

⑥用预冷的0.5ml的0.1M的CaCl₂重悬菌体，冰浴15min，离心，弃上清

⑦加入200μl的预冷的0.1M的CaCl₂重悬菌体，冰浴放置

2)质粒转化感受态细胞

①取0.5ul质粒加于一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min

②将离心管置于42℃水浴中热激90s，不要晃动离心管

③迅速将离心管置于冰上，冷却2min

④加入800ul的LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养45min

⑤取50ul的培养液涂布于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体平板上，37℃培养12至16小时，检查转化菌落

⑥挑选单菌落，接种到含5ml的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养提取质粒酶切验证为正确的转化子，然后测序证明含有木糖异构酶基因。

实施例4工程菌株的构建

将含木糖异构酶基因的重组质粒pYES-RXI经电击转化法转入不具将木糖转化为木酮糖能力的酿酒酵母CEN.PK113-5D中，在以2％葡萄糖作为碳源的SC培养基平板上筛选转化子。未被转化的细胞不能在这些平板上生长。PCR鉴定证明R转化子含有带粳稻木糖异构酶基因的质粒。

酿酒酵母感受态细胞的制备及质粒的转化：

1)酵母感受态细胞的制备(电击转化法)

①在含5mlYPD的50ml离心管中，培养酿酒酵母，30℃过夜

②取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD₆₀₀＝1.3-1.5

③在4℃，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞

④如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞

⑤如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞

⑥如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml

注意：可冻存80ul等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多

2)质粒电击转化感受态细胞：

①取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。

②在冰上放置5min

③根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击

④立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中

⑤分成200-600ul等份，涂于SC平板上

⑥在30度孵育平板至克隆产生，PCR鉴定证明转化子R含有带粳稻木糖异构酶基因的质粒pYES-RXI。

实施例5工程菌株木糖异构酶酶活的测定

1、实验对象

实验菌株：含pYES-RXI酿酒酵母重组菌株R；

对照菌株：含pYES2空载体的酿酒酵母菌株。

2、实验方法

在以葡萄糖/木糖的混合物为唯一碳源的衡化培养生长，分别测定对照菌株和含pYES-RXI酿酒酵母重组株R的木糖异构酶酶活。酶活的测定按如下方法进行：

适当酿酒酵母细胞破碎后的上清液(通过OD₅₉₅测定调整为总蛋白量一致)100mMTris-HCl pH7.0缓冲液，10mMMgCl₂，2U SDH(山梨醇脱氢酶，Roche公司)和0.15mMNADH(还原型烟胺酸腺嘌呤二核苷酸，Roche公司)，混匀，500mM的木糖启动反应，30℃、340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。木糖异构酶(XI)的一个酶活单位(U)定义为每分钟转化1μmol底物。

3、具体操作过程

①分别挑取单菌落接种在20ml的SC培养液中，30℃200rpm摇培48h；

②1600g离心5min，弃上清，沉淀用10mM pH7.5的potassium-phosphate buffer(含2mM EDTA)洗两次；

③重悬于100mM pH 7.5的potassium-phosphate buffer(2mM MgCl₂和1mMdithiothreitol)；

④超声破碎，4度36000g离心20min，上清用做酶活分析和总蛋白测定。

4、测定结果

对照菌株未测出木糖异构酶酶活；

含pYES-RXI酿酒酵母重组株木糖异构酶酶活测定为0.64U/mg总蛋白。

5、结论

粳稻木糖异构酶基因编码的木糖异构酶在酿酒酵母中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。

实施例6工程菌株木糖利用的测定

1、实验对象

实验菌株：含pYES-RXI酿酒酵母重组菌株R；

对照菌株：含pYES2空载体的酿酒酵母菌株。

2、实验方法

在以葡萄糖/木糖的混合物(初始浓度分别为5.0g/L和7.5g/L)为唯一碳源的衡化培养生长，30℃200rpm摇培48h，高效液相色谱法(HPLC)测定上清葡萄糖和木糖含量，推算糖利用效率。

3、结果

测试结果显示：经过48h培养，重组菌株R培养基的葡萄糖几乎完全利用完，木糖利用率达到57.39％；对照菌株培养基的葡萄糖几乎完全利用完，木糖利用率仅达到3.02％。

4、结论

粳稻木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率大大高于对照菌株。

Claims

1.粳稻木糖异构酶基因GenBankNO.4344231的用途，其编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力，所述宿主细胞是酿酒酵母。

2.含粳稻木糖异构酶基因的重组质粒，是粳稻木糖异构酶基因GenBankNO.4344231连接到在酿酒酵母中具有表达特性的质粒。

3.权利要求2所述的重组质粒，所述具有表达特性的质粒是酿酒酵母表达载体pYES2。

4.一种酵母工程菌，含有权利要求2或3所述的重组质粒。

5.权利要求4所述酵母工程菌的用途，是转化木糖生成木酮糖。

6.权利要求4所述酵母工程菌的用途，是通过发酵含有木糖的物质制备乙醇和其他发酵产物。