CN104561081A - 一株能够利用木糖的酵母Candida amazonensis的表达系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能够利用木糖的酵母Candida？amazonensis的表达系统，包括一种新型表达载体，其为环状，从5’-3’依次可操作性地连接有以下元件：pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述能够利用木糖的酵母为Candida？amazonensis。本发明的表达载体可实现在Candida？amazonensis中的整合型稳定表达，对木糖利用酵母Candida？amazonensis的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种能够利用木糖的酵母Candida amazonensis的表达系统及其构建方法及应用。
背景技术
随着基因组学日新月异地发展，人们迫切寻求合适的表达系统用于新型基因的挖掘和新型工程细胞的构建，为此，各种不同的表达体系应运而生，如细菌、昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。其中，酵母具有微生物和真核生物的双重特点，既便于培养，繁殖快，基因操作简单，又可对真核基因产物进行翻译后加工，得到正确折叠、有活性的蛋白。因此，近年来酵母表达系统以其独特生物学特性，已成为代谢工程改造生产生物基产品、有效表达新型外源基因，服务于基础研究、工业和医药应用的重要工具。
木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一，可转化为清洁燃料乙醇、丁醇、大宗化学品乳酸、高附加值产品木糖醇、有机酸类以及微生物菌体蛋白等多种生物基产品，甚至可用于生产纤维素酶等多种工业用酶。其有效利用能够解决社会发展过程中所遇到的资源缺乏问题，因而受到人们的广泛关注。木糖是木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，其高效率生物转化与利用是影响木质纤维素产业发展的关键因素之一。
Candida amazonensis是新分离的能够利用木糖的酵母，该酵母能够代谢多种糖类，同时具有发酵纤维二糖、海藻糖等的能力(Cadete RM,Melo MA,Lopes MR,Pereira GM,Zilli JE,Vital MJ,Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Candida amazonensis sp.nov.,an ascomycetous yeast isolated from rotting wood in the Amazonian forest.International journal of systematic and evolutionary microbiology,2012,62(Pt 6):1438-1440.)。Cadete等(Cadete RM,Melo MA,Dussan KJ,Rodrigues RC,Silva SS,Zilli JE,Vital MJ,Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Diversity and physiological characterization of D-xylose-fermenting yeasts isolated from the Brazilian Amazonian Forest.PLoS ONE,2012,7(8):e43135.)在研究中发 现Candida amazonensis具有快速代谢木糖的能力，并在木糖醇生产方面表现出一定优势，有望成为新型木糖发酵模式菌株。
然而，良好的模式菌株，除自身具有的优良特色外，还需要基因表达与敲除等基本的分子生物学手段的有效支持，用以充分挖掘相关菌株优良信息。目前，Candida amazonensis基因水平上的研究尚处于起步阶段，急需一个可适用的遗传表达系统来进行更深入的研究。尽管市面上有多种应用于酿酒酵母、毕赤酵母等表达系统的表达载体，但该酵母属于利用木糖类酵母，使用特殊的基因编码系统，密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸(Wohlbach DJ,Kuo A,Sato TK,Potts KM,Salamov AA,Labutti KM,Sun H,Clum A,Pangilinan JL,Lindquist EA,Lucas S,Lapidus A,Jin M,Gunawan C,Balan V,Dale BE,Jeffries TW,Zinkel R,Barry KW,Grigoriev IV,Gasch AP.Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(32):13212-13217.)，因此上述常规表达载体很难通过修饰来适用于该酵母表达系统中。
因此，有必要构建适用于Candida amazonensis自身的基因表达系统，在此基础上，可采用该基因表达系统对Candida amazonensis进行基因工程改造或在该表达系统基础上挖掘Candida amazonensis的优良基因信息，为构建新型酵母基因工程菌和筛选新型优良基因，如纤维二糖酶基因等，奠定基础，同时通过基因工程手段使Candida amazonensis利用木糖转化生产人类有用产品，建立可再生资源循环利用的生物加工工艺成为可能。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一株能够利用木糖的酵母Candida amazonensis的表达系统。本发明的表达载体可实现在Candida amazonensis中的整合型稳定表达，对木糖利用酵母Candida amazonensis的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
本发明的技术方案如下：
本发明一方面涉及一种新型表达载体，其为环状，且可操作性地连接有以下元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因 插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
优选的，所述的rDNA同源重组序列为18s rDNA，序列如SEQ ID NO:1所示。另一个选择是，所述的rDNA序列与SEQ ID NO:1的相似性不低于90％，优选为95％，更优为98％。
所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子包括SpADHP、SpXYLP；转录终止子包括SpCYC1T、SpXYLT。
所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子和转录终止子的DNA序列来自一株能够利用木糖的酵母Spathaspora passalidarum，该酵母全基因组序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的编号为NZ_AEIK00000000，其中所述酵母可为来自美国农业研究菌种保藏中心的细胞株NRRL Y-27907。
所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和筛选标记基因，所述外源基因插入所述外源基因表达盒中启动子和转录终止子之间。在本发明的一个实施例中，所述外源基因为gfp基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO:11所示。
所述的SpADHP启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。
所述的SpXYLP启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的SpTEF1P启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的SpCYC1T终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的筛选标记基因表达盒中的启动子为SpTEF1P；抗生素抗性基因可以是表达载体中常用的；转录终止子为ScCYC1T；
所述的ScCYC1T终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
所述的筛选标记基因表达盒中可包括一个以上的标记基因，所述标记基因可为潮霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因和/或G418；在本发明的一个实施方案 中，所述标记基因是潮霉素B抗性基因；
所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明所使用的酵母为一株能够利用木糖的酵母Candida amazonensis。具体的，该酵母购自荷兰真菌菌种保藏中心，保藏编号为CBS 12363。
本发明还提供了含有酵母Candida amazonensis的基因表达系统；且其中还含有基因表达载体，所述基因表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性连接的元件：pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和抗生素筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述抗生素筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。本含有酵母Candida amazonensis的基因表达系统与上述环状的新型表达载体的各元件的序列相同。
具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型表达载体：
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列；以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子；以引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADH1P启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增获得片段hphm-ScCYC1T。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述P21-P32的核苷酸序列如SEQ ID NO.33-44所示。
以pMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切位点上进行的。具体连接方式为：在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位点连接18s rDNA后，沿着18s rDNA的方向在其3’端依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEF1P启动子、hphm-ScCYC1T。
酵母基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合适的启动子和转录终止子对外源蛋白的表达至关重要。本发明提供了可供外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合，包括SpADHP-SpCYC1T、SpXYLP-SpCYC1T、SpADHP-SpXYLT、SpXYLP-SpXYLT、SpTEF1P-SpCYC1T、、SpXYLP-SpXYLT。
所述启动子根据以下方法预测获得：
(1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的启动子所属基因与上一个基因的开放阅读框之间的所有核苷酸片段；
(2)采用启动子在线测评软件，对可能的启动子序列进行在线预测；
(3)根据高评分值的潜在启动子序列，设计引物扩增获得待测启动子序列。
所述终止子根据以下方法获得：
(1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的终止子所属基因的开放阅读框后约300bp作为待测终止子序列。
(2)设计引物扩增获得所述待测终止子。
所述外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合用于外源基因的功能表达。在实施例中，gfp基因插入所述外源蛋白表达的启动子和转录终止子之间。
所述的基因表达载体整合于所述Candida amazonensis宿主菌的基因组中。
所述Candida amazonensis宿主菌是(但不限于)来自荷兰真菌菌种保藏中心的细胞株CBS 12363。
在本发明的一个实施例中，所述Candida amazonensis宿主菌为来自荷兰真菌菌种保藏中心的细胞株CBS 12363。
本发明的另一个方面，提供了一种Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，包括以下步骤：
所述Candida amazonensis基因表达系统的表达载体构建：
根据酵母Spathaspora passalidarum全基因组序列，调取Spathaspora passalidarum 18s rDNA部分序列作为同源重组位点。以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列，同时在片段上游引入酶切位点EcoR I，下游引入酶切位点Bgl II、BamH I和Kpn I。将PCR产物纯化后克隆至质粒pMD19-Tsimple，获得重组质粒pMD-18s rDNA。
以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增获得片段hphm-ScCYC1T，同时在片段上游引入BamH I、Pst I，下游引入Kpn I。将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18s rDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PR-hphm。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P23和P24进行PCR 扩增获得SpTEF1P启动子，同时在片段两端引入酶切位点BamH I和Pst I。将纯化的PCR产物和重组质粒PR-hphm分别用BamH I和Pst I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PRTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADHP启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；同时在片段的上游引入酶切位点Bgl II，下游引入酶切位点Sal I和BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRTH分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切的重组质粒和PCR产物连接获得重组质粒PRATH和PRXTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。在片段上游引入酶切位点Sal I和Not I，在片段下游引入酶切位点BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRATH与PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，酶切产物连接获得PR系列重组质粒PRACTH、PRAXTH、PRXCTH和PRXXTH。
所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示。
所述P21-P32的核苷酸序列如SEQ ID NO.33-44所示。
宿主菌Candida amazonensis的活化与培养。
PR系列重组质粒在宿主菌Candida amazonensis中的遗传转化。
宿主菌Candida amazonensis阳性转化子筛选。
所述Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRACTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpCYC1T。
所述Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRAXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpXYLT。
所述Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRXCTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpCYC1T。
所述Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRXXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpXYLT。
所述Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，其中所述的遗传转化方法包括PEG-LiAC转化法、电转化法和原生质体转化法，优选的转化方法是PEG-LiAC转化法。
所述Candida amazonensis基因表达系统的构建方法，其中，所述宿主菌Candida amazonensis转化子筛选方法为抗性平板筛选，对经过初步筛选的转化子进行菌落PCR或基因组PCR检测，并最终通过检测外源蛋白活性或代谢产物的方法确定转化子。
本发明提供了一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：
(1)提供所述的整合型Candida amazonensis基因表达系统；
(2)将外源基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌Candida amazonensis并在宿主菌中表达所述外源基因。
本发明还提供了一种代谢工程改造宿主菌Candida amazonensis的方法，包括如下步骤：
(1)提供权利要求1所述的整合型Candida amazonensis表达系统；
(2)将目标基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌Candida amazonensis并在宿主菌中表达所述目标基因；
(4)培养所述重组菌，检测所述重组菌代谢产物。
发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明所使用的酵母是一株新型利用木糖的酵母，具有高效的木糖利用能力和较强的木糖醇生产能力，是一株极具工业生产前景的木糖发酵菌株。然而该酵母使用特殊的基因编码系统，密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸，因此市面上应用于酿酒酵母、毕赤酵母等表达系统的表达载体无法适用于该木糖利用酵母。鉴于此，本发明人构建了适用于该酵母自身的一系列新型表达载体，采用该系列表达载体，可方便地对该酵母进行外源蛋白的表达和代谢工程改造。
2、本发明提供了用其他DNA分子转化Candida amazonensis的方法，所述的DNA分子可来自在上述载体启动子和终止子之间连接Candida amazonensis基因组片段所构成的文库中或合成的DNA分子。本发明从而可提供，能够用于表达基因多样性文库，产生能够从中筛选新的生物活性物质的产品的技术。
3、本发明所述的整合型表达载体中，尝试采用多个rDNA序列作为整合位点，但仅有其中一个序列表现出整合效应，该序列为18s rDNA的部分序列，且该位点表现出拷贝数高，稳定性好的特点，使得该系列整合型表达载体成为能够适用于Candida amazonensis表达外源蛋白及代谢工程改造的酵母多拷贝整合型表达载体。
4、本发明所构建的新型表达载体中，对所使用的潮霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因等抗性基因开放阅读框中多个CUG密码子进行定点突变，突变为UUG，对报告基因gfp开放阅读框中的CUG密码子进行了定点突变，突变为UUG，从而实现了该系列新型表达载体在酵母Candida amazonensis中的有效转化和功能性表达。
附图说明
图1为实施例1的定点突变后hph基因CDS序列(表示定点突变位点)；
图2为实施例4的定点突变后gfp基因CDS序列(表示定点突变位点)；
图3为实施例4的绿色荧光蛋白重组质粒PRACTH-gfpm的质粒图谱；
图4为实施例4的为菌绿色荧光蛋白重组质粒转化子菌落PCR验证图(M为Maker，泳道1为阴性对照，泳道2-10为阳性转化子扩增结果)；
图5为实施例4的绿色荧光蛋白重组质粒PRACTH-gfpm转化Candida amazonensis及GFP荧光显微镜检测(左图为暗场，右图为明场)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均视为落入本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本都按照常用克隆手册或制造商所建议的条件进行实验操作；所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非在本文中另作限定，本文所用的全部术语具有本发明所属领域的普通人 员通常所理解的相同含义。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子序列被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得该目的基因的转录受到该启动子的引导，使表达变得可行，从而，启动子序列被“可操作地连接”到该核酸序列上。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是相邻的，所述序列的连接是通过在适当的限制酶切位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
实施例1：PR系列整合型表达载体的构建
一、重组质粒pMD-18s rDNA的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)，设计两条引物截取Spathaspora passalidarum 18s rDNA部分序列作为同源重组位点。引物序列如下：引物P1下划线部分为EcoR I的识别位点，引物P2下划线部分由5’到3’端分别为Bgl II、BamH I和Kpn I的识别位点。
P1：5’GCCGGAATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTC3’
P2：5’ATATTAGGGGTACCCGGGATCCGAAGATCTGTTGAAGAGCAATAAT3’
(2)过夜培养Spathaspora passalidarum，收集细胞，分离、提取基因组DNA。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。纯化回收PCR扩增产物后克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒pMD-18s rDNA。
二、重组质粒PMD-hphm的构建
(1)根据质粒pRS303H(Taxis C,Knop M.System of centromeric,episomal,and integrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae.BioTechniques,2006,40(1):73-78.)中潮霉素抗性基因表达盒序列设计引物P3和P4。
P3：5’ACATTTTGATGGCCGCACGG3’
P4：5’AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG 3’
(2)以pRS303H质粒DNA为模板，以引物P3和P4扩增hph表达盒片段，扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。纯化回收上述片段后，克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒PMD-hph。
(3)根据潮霉素抗性基因CDS中CUG密码子情况设计突变引物。
P5：5’GAGAAGTTTTTGATCGAAAAGTTCGACAGC 3’
P6：5’GCTGTCGAACTTTTCGATCAAAAACTTCTC 3’
P7：5’GACAGCGTCTCCGACTTGATGCAGCTCTCG 3’
P8：5’CGAGAGCTGCATCAAGTCGGAGACGCTGTC 3’
P9：5’GGGCGTGGATATGTCTTGCGGGTAAATAG 3’
P10：5’CTATTTACCCGCAAGACATATCCACGCCC 3’
P11：5’AATTCAGCGAGAGCTTGACCTATTGCATCT 3’
P12：5’AGATGCAATAGGTCAAGCTCTCGCTGAATT 3’
P13：5’TTGCAAGACTTGCCTGAAACCGAATTGCCCGCTGTT 3’
P14：5’AACAGCGGGCAATTCGGTTTCAGGCAAGTCTTGCAA 3’
P15：5’AATTGCCCGCTGTTTTGCAGCCGGT 3’
P16：5’ACCGGCTGCAAAACAGCGGGCAATT 3’
P17：5’AGGCTCTCGATGAGTTGATGCTTTGGGCCGAG 3’
P18：5’CTCGGCCCAAAGCATCAACTCATCGAGAGCCT 3’
P19：5’GCTCCAACAATGTCTTGACGGACAATGG 3’
P20：5’CCATTGTCCGTCAAGACATTGTTGGAGC 3’
以质粒PMD-hph为模板，采用Stratagene定点突变试剂盒(购自安捷伦科技有限公司)，以上述引物进行PCR扩增，获得环状PCR产物。扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火2min，68℃延伸3.5min，30个循环，68℃充分延伸5min。
(4)将上述PCR产物纯化后用内切酶Dpn I于37℃消化30min，于65℃反应15min以失活内切酶Dpn I。将酶切产物纯化后，转化E.coli JM109感受态细胞(购自北京全式金公司)，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选突变 位点正确的质粒。经过上述突变操作后，突变质粒命名为PMD-hphm，其中突变后hph的CDS序列如图1所示。
三、重组质粒PR-hphm的构建
(1)根据PMD-hphm质粒中潮霉素抗性基因表达盒序列，设计两条引物：引物P21下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Pst I的识别位点，引物P22下划线部分为Kpn I的识别位点。
P21：5’CGGGATCCAAACTGCAGATGGGTAAAAAGCCTGAACTCAC3’
P22：5’GGGGTACCAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG3’
(2)以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18s rDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Kpn I双酶切验证，获得重组质粒PR-hphm。
四、重组质粒PRTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum转录起始因子和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计两条引物，调取Spathaspora passalidarum转录起始因子上游700bp左右作为启动子SpTEF1P：引物P23下划线部分为BamH I的识别位点，引物P24下划线部分为Pst I的识别位点。
P23：5’CGGGATCCACCACTTACATAATAGAAAGAC 3’
P24：5’ACGAGCCTGCAGTTTTGATTGATTGATTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P23和P24进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒PR-hphm分别用BamH I和Pst I双酶切， 将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Pst I双酶切验证，获得重组质粒PRTH。
五、重组质粒PRATH和PRXTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶与木糖还原酶分别和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计引物，调取Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶和木糖还原酶开放阅读框上游1000bp左右作为启动子，即SpADHP和SpXYLP：引物P25和P27下划线部分为Bgl II的识别位点，引物P26和P28下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Sal I的识别位点。
P25：5’GCCGGAAGATCTGTAAATTAATGCTACATCAGTTGAGG 3’
P26：5’CGGGATCCACGCGTCGACTATATTTTATTTAGGAATT 3’
P27：5’GCCGGAAGATCTGTGACATAGTTAACTATGGC 3’
P28：5’CGGGATCCACGCGTCGACTTTATTGTATTGTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P25和P26进行PCR扩增，获得片段SpADHP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P27和P28进行PCR扩增，获得片段SpXYLP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpADHP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamHI双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRATH。
(5)将纯化的片段SpXYLP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于 LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamHI双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRXTH。
六、PR系列整合型表达载体的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游序列。设计引物调取Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游300bp左右作为转录终止子，即SpCYC1T和SpXYLT：引物P29和P31下划线部分由5’到3’端分别为Sal I和Not I的识别位点，引物P30和P32下划线部分为BamH I的识别位点。
P29：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGCTAACTTCAATTAGAA T3’
P30：5’CGGGATCCCATCACTATAAGCGAAATCGGGTTTC 3’
P31：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGTTTGATTCTAGTTTATA T3’
P32：5’GCGCGGATCCATAGTTAACTATGTCACTTGAACTC 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P29和P30进行PCR扩增，获得片段SpCYC1T。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P31和P32进行PCR扩增，获得片段SpXYLT。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRACTH。
(5)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I 双酶切验证，获得重组质粒PRXCTH。
(6)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRAXTH。
(7)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRXXTH。
实施例2：PEG/LiAc介导的Candida amazonensis转化方法的建立。
以Candida amazonensis CBS 12363作为宿主菌，采用PEG/LiAc介导转化酵母的方法实施如下：
一、Candida amazonensis CBS 12363感受态的制备
(1)将冻存管保藏的Candida amazonensis CBS 12363接种于YPD培养基，摇瓶活化培养48h。
(2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4℃保存。
(3)于YPD平板中挑取Candida amazonensis CBS 12363单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30℃过夜培养。
(4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD600到1.2左右。
(5)5000rpm室温离心5min，收集菌体细胞。
(6)将细胞重新悬浮于500μl 0.1mol/L的LiAc中，离心，弃上清，获得感受态细胞。
二、线性化重组质粒的制备
(1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
(2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质粒提取试剂盒。
(3)采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系(50μL)：40μL DNA，5μL buffer，1.5μL限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50μL，混匀 后置于37℃恒温箱中酶切2h。
(4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
三、PEG/LiAc法转化Candida amazonensis CBS 12363
(1)在感受态细胞中顺序加入下列转化混合液：240μL PEG3350，36μL 1.0mol/L LiAc，25μL鲑鱼精DNA，50μL待转化线性DNA，其中鲑鱼精DNA沸水浴10min后立即冰浴；
(2)剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；
(3)置于30℃温育1h；
(4)置于42℃金属浴热击22min；
(5)待降至室温后，5000rpm离心5min，弃上清；
(6)加入1ml YPD培养基，于30℃后培养2h；
(7)5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，混匀菌体并涂布潮霉素B(850mg/mL)抗性平板，30℃培养3-4d，获得转化子。
实施例3：电穿孔法介导的酵母Candida amazonensis转化方法的建立
以Candida amazonensis CBS 12363作为宿主菌，采用电穿孔法介导转化酵母的实施如下：
一、Candida amazonensis CBS 12363电转感受态细胞的制备
(1)将冻存管保藏的Candida amazonensis CBS 12363接种于YPD培养基，摇瓶活化培养48h；
(2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4℃保存；
(3)于YPD平板中挑取Candida amazonensis CBS 12363单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30℃过夜培养；
(4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD600到1.2左右；
(5)将菌液置于冰上30min，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(6)加入预冷的20ml双蒸水洗涤菌体2次，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(7)加入20ml预冷的1.0mol/L山梨醇洗涤菌体2次，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(8)加入200μl预冷的1.0mol/L山梨醇混匀菌体细胞，获得感受态细胞。
二、线性化重组质粒的制备
(1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
(2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质粒提取试剂盒。
(3)采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系(50μL)：40μL DNA，5μL buffer，1.5μL限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50μL，混匀后置于37℃恒温箱中酶切2h。
(4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
三、Candida amazonensis CBS 12363的电转化
(1)取100μl电转化感受态细胞和10μl DNA混合，加入到0.2cm电转杯中；
(2)电转杯冰浴5min，设定条件1500v，电击5s，进行电转化；
(3)立即向电转杯中加入1ml预冷的1.0mol/L山梨醇，转移至培养箱30℃温育1h；
(4)5000rpm离心5min，弃上清；
(5)加入1ml YPD培养基，混匀菌体细胞，于培养箱30℃后培养2h；
(6)5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，混匀菌体并涂布潮霉素B(850mg/mL)抗性平板，30℃培养3-4d，获得转化子。
实施例4：PR系列整合型表达载体在表达外源基因方面的应用。
一、构建绿色荧光蛋白重组表达载体
(1)根据绿色荧光蛋白的基因序列，设计引物：引物P33下划线部分为Sal I的识别位点，引物P34下划线部分为Not I的识别位点。
P33：5’ACGCGTCGACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCAC 3’
P34：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG 3’
(2)以绿色荧光蛋白基因的DNA为模板，以引物P33和P34进行PCR扩增，获得基因gfp。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化对gfp片段克隆至pMD19-Tsimple载体，转化E.coli JM109感受 态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得重组质粒pMD-gfp。
(4)由于gfp基因序列开放阅读框中存在密码子CUG，而酵母Candida amazonensis使用特殊的编码系统，即密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸。因此有必要对gfp基因进行定点突变，将密码子CUG突变为密码子UUG。
(5)以gfp基因序列CDS中601位的碱基C作为突变位点，设计单点突变引物：引物P35和P36下划线部分为突变位点。
P35：5’TACCAGACAACCATTACTTGTCCACACAATCTGCC3’
p36：5’GGCAGATTGTGTGGACAAGTAATGGTTGTCTGGTA 3’
(6)以重组质粒pMD-gfp为模板，采用Stratagene定点突变试剂盒，以引物P35和P36进行PCR扩增，获得环状PCR产物。扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火2min，68℃延伸3.5min，30个循环，68℃充分延伸5min；
(7)将上述PCR产物纯化后用内切酶Dpn I于37℃消化30min，于65℃反应15min以失活内切酶Dpn I。将酶切产物纯化后，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选突变位点正确的质粒，命名为pMD-gfpm。gfp基因定点突变后DNA序列为SEQ ID NO:11，如图2所示。
(8)将重组质粒pMD-gfpm和PRACTH分别用Sal I和Not I双酶切。gfp片段酶切纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coli JM109菌株，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得绿色荧光蛋白重组表达载体PRACTH-gfpm，质粒图谱如图3所示。
二、构建Candida amazonensis重组菌
将经Stu I线性化的质粒PRACTH-gfpm按实施例2或实施例3中所述方法，转化到Candida amazonensis CBS 12363中，获得转化子。
三、转化子筛选与验证
(1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将绿色荧光蛋白重组表达载体转化Candida amazonensis CBS 12363后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素B(1000μg/mL)抗性平板上，30℃培养2-3d，采用相同的方法连续转接3 次，获得纯培养转化子菌株。
(2)阳性转化子的菌落PCR验证。以引物P21和P22配制PCR扩增体系，并在体系中加入微量微波处理的转化子菌体。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示1100bp左右条带，如图4所示，与DNA片段hphm-ScCYC1T条带大小相符合。
(3)阳性转化子的荧光检测。将步骤(1)中获得的纯培养转化子菌株接种于YPD培养基中，摇瓶30℃培养18h后，收集菌体，双蒸水洗涤菌体细胞2次并重悬于双蒸水中。吸取少量悬液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用油镜观察并拍照。如图5所示，可以观察到细胞发出绿色荧光。
Claims (10)
1.一株能够利用木糖的酵母Candida amazonensis的表达系统，其特征在于包括一种表达载体，所述表达载体从5’-3’”依次包括以下可操作性元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；
所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；
所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
所述能够利用木糖的酵母为Candida amazonensis。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述rDNA同源重组序列为18s rDNA序列。
3.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述外源基因表达盒中的启动子包括SpADHP、SpXYLP；转录终止子包括SpCYC1T、SpXYLT。
4.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述筛选标记基因表达盒中的启动子包括SpTEF1P；抗生素抗性基因包括潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、G418；转录终止子包括SpCYC1T、ScCYC1T。
5.根据权利要求2～4任一项所述的表达系统，其特征在于：
所述的18s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的SpADHP启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的SpXYLP启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的SpTEF1P启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的SpCYC1T终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的ScCYC1T终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的潮霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
6.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述的宿主酵母Candidaamazonensis保藏于荷兰真菌菌种保藏中心，保藏编号为CBS 12363。
7.权利要求1～4任一所述的表达载体在宿主菌Candida amazonensis遗传转化中的应用。
8.权利要求1所述的一株能够利用木糖的酵母的表达系统的用途，其特征在于用于表达外源蛋白和宿主菌自身代谢工程改造。
9.一种表达外源基因的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备所述表达系统；
(2)将外源基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌Candida amazonensis并在宿主菌中表达所述外源基因。
10.一种代谢工程改造宿主菌Candida amazonensis的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备所述表达系统；
(2)将目标基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌Candida amazonensis并在宿主菌中表达所述目标基因；
(4)培养所述重组菌，检测所述重组菌代谢产物。
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