CN108034667B - 一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种红色红曲霉α‑淀粉酶基因、其制备方法及应用。该技术方案从红色红曲霉NRRL1597全基因组中筛选得到一种与米曲霉α‑淀粉酶A高度同源的淀粉酶蛋白表达基因，并围绕其序列特征设计了PCR扩增方法。在此基础上，本发明先以红色红曲霉CICC41233为实验菌株，PCR扩增得到目的基因，再以其构建双元质粒表达载体pNeo0380‑440333，而后通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，得到一株红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。在此基础上，本发明围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产红曲色素的发酵方法，所产红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。

Description

一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，进一步涉及基因工程技术以及霉菌的发酵技术，具体涉及一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用。

背景技术

红曲色素是由微生物红曲霉菌(Monasus spp.)，以大米为原料发酵而成的天然色素，在我国有一千多年的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性如调血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也越来越受到重视。

红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，由脂肪酸合成途径和聚酮合成途径共同完成合成代谢。其化学结构主要分为聚酮和脂肪酸链两部分。脂肪酸链的合成以乙酰CoA为前体，经脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS)复合体作用，经过一系列合成反应形成中长链脂肪酸，其与乙酰CoA反应生成β-酮酸；聚酮的合成同样以乙酰CoA为前体，在聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)作用下，依次合成多聚酮体化合物，最终形成带有生色基团的聚酮。聚酮的羧基基团与脂肪酸链的羟基基团发生酯化反应，从而形成红曲色素。基于以上原理，为了提高红曲色素的产量，现有技术普遍通过发酵工艺改良来实现红曲霉的代谢调控，进而定向累积目的产物；尽管发酵条件的优化能在一定程度上改善红曲色素产量，但受限于红曲霉自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高。

此外，红曲霉所产红曲色素分为醇溶性色素和水溶性色素。醇溶性色素为红曲霉在发酵过程中直接合成，存在于胞内；水溶性色素是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的复合色素，分布于胞外。在天然菌株的生长过程中，这两种红曲色素均有产生，单纯凭借培养方法无法实现定向生产其中一种红曲色素。

在这种情况下，通过基因工程技术构建具有特定发酵能力的工程菌，成为了提升红曲色素产量、改善醇溶成分比例的重要技术手段。现有技术研究表明，在红曲霉基因组中引入同源的淀粉酶表达基因，是一种可行的方法；然而其效果优劣极大的依赖于淀粉酶表达基因的性能。因此，根据亲本红曲霉的基因组及代谢特性找到一种淀粉酶高效表达基因，并围绕其性质确定菌株构建方法，成为了解决以上技术问题的关键。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用，以解决现有技术缺乏一种用于基因工程的、α-淀粉酶高效表达基因的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是如何以红色红曲霉菌株CICC41233出发，构建一种红曲色素产量更高的基因工程菌。

本发明要解决的又以技术问题是如何以红色红曲霉菌株出发，构建一种醇溶性红曲色素产量更高的基因工程菌。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种红色红曲霉α-淀粉酶基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

以上基因可以是通过以下方法发现的。

从红色红曲霉(Monascus ruber)NRRL1597基因组数据库(https://genome.jgi.doe.gov/Monru1/Monru1.home.html)中查询预测有13种α-淀粉酶基因。依据米曲霉α-淀粉酶A基因的蛋白质(AOamyA，GenBank accession no.BAA00336.1)序列，构建系统进化树。其中蛋白质编号为P440333与AOamyA同源关系最近为79％。依据P440333的基因序列，设计引物。

同时，本发明提供了克隆的红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

同时，本发明提供了上述红色红曲霉α-淀粉酶基因的制备方法，包括以下步骤：提取红色红曲霉菌株的总DNA作为模板，以序列为SEQ ID No:4、SEQ ID No:5的一对引物进行PCR扩增，扩增产物即为所述红色红曲霉α-淀粉酶基因。作为优选，该制备方法中所选用的红色红曲霉菌株为红色红曲霉CICC41233株。作为优选，将所制备的红色红曲霉α-淀粉酶基因连接到pMD19-T载体上，用于测序。

此外，本发明还另外提取红色红曲霉CICC41233的总RNA，采用相应的引物进行RT-PCR扩增，得到直接编码该蛋白的mRNA的cDNA序列，将其连接到pMD19-T载体上，测序，序列如SEQ ID NO:2所示

应用上述红色红曲霉α-淀粉酶基因构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：

1)取所述红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因和pNeo0380载体，用限制性内切核酸酶Hind III、Sac I分别对二者进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，得到双元质粒表达载体pNeo0380-440333；

2)用根癌农杆菌EHA105介导所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。作为优选，该构建方法中所选用受体红色红曲霉菌株为红色红曲霉CICC41233株。

作为优选，步骤2)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。

作为优选，所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。

作为优选，所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105。

作为优选，所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：

取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；

取含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD₆₀₀值为0.15，再继续培养5～6h，至OD₆₀₀值为0.5～0.6；

将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。

作为优选，所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含80μg/mL G418、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的PDA培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含80μg/mL G418的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:4、SEQ ID No:5的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株。

同时，本发明提供了应用以上所构建高产菌株发酵产红曲色素的方法，该方法中：

发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO₃，0.1％(w/w)KH₂PO₄，0.2％(w/w)MgSO₄·7H₂O，0.2％(w/w)乙酸；

发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子10⁵个/mL；

发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。

在以上技术方案中，所述pNeo0380载体，是通过以下方法制备的：

m)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:20、SEQ ID No:21的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；

n)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:22、SEQ ID No:23的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；

o)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:24、SEQ ID No:25的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。

其中，步骤m)中所述的一对寡核苷酸序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点：Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II。其中，所述质粒pUR5750，其具体制备方法可以参照参考文献“de Groot MJA，Bundock P，Hooykaas PJJ，etal.1998.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentousfungi.Nature Biotechnology，16：839-842”实施。所述质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo可以通过质粒pAN52-mdh扩增得到，其具体制备方法可以参照中国专利文献CN106148209A实施。

在以上技术方案中，所述植物双元质粒pCambia0380、红色红曲霉CICC41233、根癌农杆菌EHA105、红色红曲霉NRRL1597，均属于常规商品化的生物材料，可自市面购得；其中，红色红曲霉CICC41233购自于中国工业微生物菌株保藏管理中心。

在以上技术方案中，所述YEP培养基的配方如下：5.0g蛋白胨，1.0g酵母提取物，5.0g蔗糖，5.0g牛肉膏，0.24g硫酸镁，pH 7.2；若为固体培养基则另添加2％的琼脂粉。

所述MPS培养基配方如下：10g/L麦芽提取物，10g/L蛋白胨，40g/L可溶性淀粉；若为固体培养基则另添加2g/L琼脂。

所述AIM诱导培养基配方如下：0.8mL磷酸钾缓冲液(1.25mol/L，pH 4.8，用磷酸二氢钾与磷酸氢二钾配制)，0.6g MgSO₄.7H₂O，0.3g NaCL，1mL CaCL₂(1％)，1mL FeSO₄(1mg/mL)，1mL(NH₄)₂SO₄(0.33g/L)，10mL甘油(50％)，40mL MES(pH值5.5，用NaOH调节)，5mL微量元素储存液，1mL CaCL₂(1％)，2g/L葡萄糖(液体培养基用)，1g/L葡萄糖(固体培养基用)。pH值5.4；若为固体培养基则另添加2％的琼脂粉。

本发明提供了一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用，该技术方案从红色红曲霉NRRL1597全基因组中筛选得到一种与米曲霉α-淀粉酶A高度同源的淀粉酶蛋白表达基因，并围绕其序列特征设计了PCR扩增方法。在此基础上，本发明先以红色红曲霉CICC41233为实验菌株，PCR扩增得到目的基因，再以其构建双元质粒表达载体pNeo0380-440333，而后通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，得到一株红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。在此基础上，本发明围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产红曲色素的发酵方法，所产红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。

与常规的红色红曲霉CICC41233比较发现，本发明所构建菌株发酵48小时，已经将淀粉基本降解，仅为0.06mg/mL；红色红曲霉CICC41233在48小时，剩余45.43mg/mL淀粉，在144小时，剩余10.48mg/mL淀粉。本发明所构建菌株在发酵第6天，总色价和醇溶色价分别为72.69U，68.65U。相比亲本红色红曲霉CICC41233，总色价和醇溶色价分别为42.34U，31.30U。总色价和醇溶色价分别提高了71.68％和119.33％，并且醇溶色价占总色价的比值分别由73.93％提高到94.44％。

附图说明

图1是系统进化树分析米曲霉α-淀粉酶(AOamyA)与红色红曲霉NRRL 159713种α-淀粉酶亲缘关系的示意图。

图2是本发明具体实施方式中红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因片段扩增(泳道1，2：Mramy1基因片段；泳道3，4：直接编码该蛋白的mRNA的cDNA片段)

图3是本发明具体实施方式中红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉440333-6A发酵表型比较图。

图4是本发明具体实施方式中红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉440333-6A发酵的红曲色素产量(A)和生物量(B)比较图。

图5是本发明具体实施方式中定量PCR分析红曲色素发酵过程中基因表达情况图。

图6是红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因编码蛋白质(MRamy1)序列与红色红曲霉NRRL1597α-淀粉酶基因编码蛋白质P440333序列比对图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用到的部分基因片段及引物如表1所示：

表1部分基因片段及引物的名称及序列

表1中，名称后缀为F的表示正向引物，名称后缀为R的为反向引物。

实施例1

1、目的基因的确定

本节说明从红色红曲霉NRRL1597全基因组数据库预测的13种α-淀粉酶基因中，寻找到有效的淀粉酶基因并克隆。

红色红曲霉数据库(https://genome.jgi.doe.gov/Monru1/Monru1.home.html)中，预测的13种α-淀粉酶基因的蛋白质编号(Protein ID)为：P324551，P379161，P411620，P435885，P63242，P440333，P454978，P460054，P464710，P469192，P469571，P501041，P472279。通过实验发现米曲霉α-淀粉酶A基因在红曲霉中表达，能够显著促进淀粉降解，提高红曲色素的产量。因此将米曲霉α-淀粉酶A基因的蛋白质(AOamyA)序列，与上述13种α-淀粉酶，构建系统进化树，模式如图1所示。其中蛋白质编号为P 440333与AOamyA同源关系最近为79％。依据P440333的基因序列，设计引物440333-HindIII-F和440333-SacI-R。

分别提取红色红曲霉CICC41233基因组DNA以及RNA，并将RNA反转录成cDNA。以此为模板，分别进行PCR扩增，获得目的基因片段，电泳结果如图2所示。将此片段连接到pMD19-T载体上，送样测序。测序结果表明，克隆得到α-淀粉酶基因(命名为Mramy1)序列，在NCBI数据库中进行Nucleotide Blast比对，没有相似性结果；编码蛋白质在NCBI数据库中进行Protein Blast比对，结果显示与菌株Rasamsonia emersonii CBS 393.64编码的α-淀粉酶(XP_013323067.1)同源性最高达69％；与菌株Aspergillus oryzae RIB40编码的α-淀粉酶A(XP_001821436.1)同源性为47％。表明成功克隆到α-淀粉酶基因。同时将MRamy1编码与P440333进行比对，个别氨基酸稍有不同(如图6所示)。2、双元质粒表达载体pNeo0380-440333的构建

取以上克隆得到的Mramy1基因，采用Hind III和Sac I酶切PCR片段并回收。同时酶切pNeo0380载体并回收。

利用T4DNA连接酶将酶切pNeo0380回收片段与酶切回收Mramy1片段连接，转化E.coli DH5α感受态细胞中，挑取克隆子于LB液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选。提取质粒后并酶切验证，该构建好的载体命名为pNeo0380-440333。

其中，pNeo0380载体是通过以下方法制备的：

1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:20(即寡核苷酸F)、SEQ ID No:21(即寡核苷酸R)的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；

2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:22(即PgpdA-BamH I-F)、SEQ IDNo:23(即PgpdA-Pst I-R)的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；

3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQ ID No:24(即TtrpC-BglII-F)、SEQ ID No:25(即Neo-Spe I-R)的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。

3、基因工程菌的构建

本节说明将构建成功的载体pNeo0380-440333，转化亲本红色红曲霉CICC41233，获得基因工程菌株红色红曲霉440333-6A。

3.1根癌农杆菌感受态细胞制备

①将农杆菌EHA105接种于5～10mL YEP液体培养基中(含有50μg/mL利福平)，28℃，200r/min培养24h。

②取l mL活化的菌液接种于20mL含有相同抗生素的YEP培养基中，同样条件下培养(约4h)至OD600值0.5。

③将菌液冰浴30min后，4℃，离心(5000r/min，5min)，收集菌体。

④弃上清，用0.15mmol/L氯化钠冰冷溶液l0mL重悬沉淀，在同样条件下离心收集菌体，然后悬浮于20mmol/L氯化钙冰冷溶液1mL中。

⑤按每管200μL分装，液氮速冻1min。

⑥此时的菌悬液可以直接转化，也可以储存于-70℃冰柜保存备用。

上述YEP培养基：5.0g蛋白胨，1.0g酵母提取物，5.0g蔗糖，5.0g牛肉膏，0.24g硫酸镁，pH 7.2。固体培养基再添加2％的琼脂粉。

3.2液氮冻融法将双元质粒载体导入根癌农杆菌

①取1μg双元质粒载体pNeo0380-440333加到200μL冰上溶化的农杆菌感受态细胞中，轻混，冰浴30min。

②液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再迅速冰浴2min。

③加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h。

④常温下离心(5000r/min，3min)，适当浓缩菌体。

⑤取200μL菌液涂布于YEP选择平板上(含有50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)，28℃倒置培养2d。

⑥挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子。

3.3根癌农杆菌介导转化红色红曲霉CICC41233

(1)菌体准备

红色红曲霉CICC41233：MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节合适孢子浓度。

根癌农杆菌：将含有双元质粒载体的农杆菌接种于3mL YEP培养基中(含有50μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)，28℃培养48h，然后转接于含有200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的5mL AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD₆₀₀为0.15，再继续培养5～6h，至OD₆₀₀为0.5～0.6。

上述MPS培养基：10g/L麦芽提取物，10g/L蛋白胨，40g/L可溶性淀粉。固体培养基：另加2g/L琼脂。

(2)农杆菌与红色红曲霉CICC41233共培养

制备AIM诱导培养基平板(含有200μmol/L AS)。将农杆菌与红色红曲霉CICC41233(按等比例)。混合物涂布于AIM平板上，25℃，避光放置培养48h。

(3)转化子筛选验证

在AIM培养基平板上再添加一层筛选培养基上(PDA培养基，含有80μg/mL G418，200μmol/L头孢噻肟，0.2％Triton X-100)。30℃，继续培养5～8d。将生长的单菌落菌株，转接至另一MPS固体平板(含有G418)，培养3d后观察，菌株仍然能够生长；将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析。采用引物对440333-HindIII-F和440333-SacI-R进行PCR验证，有7株为阳性菌株。经红曲色素初步发酵，确定一株菌株即440333-6A，为本发明的工程菌株红色红曲霉(Monascus ruber)440333-6A。

上述AIM培养基：0.8mL磷酸钾缓冲液(1.25mol/L，pH 4.8，用磷酸二氢钾与磷酸氢二钾配制)，0.6g MgSO₄.7H₂O，0.3g NaCL，1mL CaCL₂(1％)，1mL FeSO₄(1mg/mL)，1mL(NH₄)₂SO₄(0.33g/L)，10mL甘油(50％)，40mL MES(pH值5.5，用NaOH调节)，5mL微量元素储存液，1mL CaCL₂(1％)，2g/L葡萄糖(液体培养基用)，1g/L葡萄糖(固体培养基用)。pH值5.4。固体培养基再添加2％的琼脂粉。

4、发酵实验

本节说明新构建的工程菌株红色红曲霉440333-6A与亲本株CICC41233发酵产红曲色素能力的对比。

4.1采用MPS固体培养基培养

将红色红曲霉Amy9与红色红曲霉CICC41233，在MPS固体培养基培养7d后，收集孢子悬液，按照孢子接种量为1*10⁵个/mL。发酵条件为：30℃，180rpm发酵至第6天。

生产红曲色素的发酵培养基组分为：9.0％大米粉，0.2％NaNO₃，0.1％KH₂PO₄，0.2％MgSO₄·7H₂O，0.2％乙酸。

4.2红色红曲霉CICC41233与红色红曲霉440333-6A发酵表型分析

图3A和3B表明，红色红曲霉440333-6A发酵产红曲色素的表观产量明显要高于相比红色红曲霉CICC41233。进一步取发酵48h和144h的样品分析。

4.3剩余淀粉含量测定

配置I₂-KI(2.6g/L I₂,5.0g/L KI)溶液，在波长600nm处测定OD值，制备可溶性淀粉标准曲线。将发酵液常温离心(10000r/min，20min)，测定上清液中的淀粉的含量。图3C和3D表明，基因工程菌株红色红曲霉440333-6A，上清液比较澄清，而红色红曲霉CICC41233发酵的上清液比较浑浊。进一步测定淀粉含量，红色红曲霉440333-6A发酵48小时，已经将淀粉基本降解，为0.063mg/mL；红色红曲霉CICC41233在48小时，剩余45.43mg/mL淀粉，在144小时，剩余10.48mg/mL淀粉。

4.4淀粉酶酶活性测定

发酵液常温离心(10000r/min，20min)，上清液即为粗酶液，用于酶活测定。采用南京建成生物工程研究所提供的淀粉酶(AMS)测试盒(C016)检测。呈色反应结果如图3E和3F所示。因红色红曲霉CICC41233残余大量淀粉，因此颜色呈现黑色，无法准确测定出淀粉酶活性。而红色红曲霉440333-6A，已基本将淀粉完全降解，因此颜色呈现黄色，测定的淀粉酶活性，在第2天和第6天分别为63.98U/dL、64.01U/dL。

4.5红曲色素色价测定

胞外红曲色素(水溶)色价测定：将发酵液在离心管中定容到25mL，冷冻高速离心(10 000rpm，30min)，上清液即为胞外色素。取一定量的滤液用水稀释适当倍数，以水为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法为：总色价＝稀释倍数*吸光度。

胞内红曲色素(醇溶)色价测定：发酵液离心后收集沉淀，用70％乙醇在60℃下静置萃取1h，期间旋涡振荡数次。冷冻高速离心(10 000rpm，20min)，上清液即为胞内色素。取一定量的滤液用70％乙醇稀释适当倍数，以70％乙醇为参照，用分光光度计测定(红曲复合色素的吸收主峰在505nm)稀释液的吸收度值，计算其总色价。计算方法同上。

总色价为胞外红曲色素(水溶)色价与胞内红曲色素(醇溶)色价之和。

发酵第6天，红色红曲霉CICC41233总色价和醇溶色价分别为42.34U，31.30U；红色红曲霉440333-6A总色价和醇溶色价分别为72.69U，68.65U。如图4A所示。总色价和醇溶色价分别提高了71.68％和119.33％，并且醇溶色价占总色价的比值分别由73.93％提高到94.44％。

4.6生物量测定

将上述制备胞内红曲色素(醇溶)，离心得到的沉淀烘干至恒重(图4B)。4.7定量分析发酵过程中基因表达情况

收集发酵菌体样品后，采用液氮研磨结合Trizol试剂盒提取总RNA。Nanodrop核酸定量分析仪检测RNA含量。取等量的RNA，反转录成cDNA，以稀释10倍的样品做模板，加入靶基因上下引物，在20μl体系中进行荧光定量PCR分析。结果表明，相比亲本菌株红曲色素CICC41233，工程菌株红色红曲霉440333-6A，α-淀粉酶基因amy1提高了4.03和1.88倍，在48h和144h；。红曲色素合成过程中关键基因acl2(编码ATP-柠檬酸裂解酶)分别为0.78和1.15倍在48h和144h；pks(编码聚酮合成酶)分别提高了4.95和16.81倍在48h和144h；fasA(脂肪酸合成酶alpha亚基)分别提高了1.39和3.15倍在48h和144。fasB(脂肪酸合成酶beta亚基)分别提高了2.97和10.59倍在48h和144(图5)。

实施例2

一种红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

上述红色红曲霉α-淀粉酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

上述红色红曲霉α-淀粉酶基因的制备方法，包括以下步骤：提取红色红曲霉菌株的总DNA作为模板，以序列为SEQ ID No:4、SEQ ID No:5的一对引物进行PCR扩增，扩增产物即为所述红色红曲霉α-淀粉酶基因。

应用上述红色红曲霉α-淀粉酶基因构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：

1)取所述红色红曲霉α-淀粉酶基因和pNeo0380载体，用限制性内切核酸酶HindIII、Sac I分别对二者进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，得到双元质粒表达载体pNeo0380-440333；

2)先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。

应用以上所构建高产菌株发酵产红曲色素的方法，该方法中：

发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO₃，0.1％(w/w)KH₂PO₄，0.2％(w/w)MgSO₄·7H₂O，0.2％(w/w)乙酸；

发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子10⁵个/mL；

发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。

实施例3

一种红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

应上述红色红曲霉α-淀粉酶基因构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：

1)取所述红曲霉α-淀粉酶基因和pNeo0380载体，用限制性内切核酸酶Hind III、Sac I分别对二者进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，得到双元质粒表达载体pNeo0380-440333；

2)用根癌农杆菌EHA105介导所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江西科技师范大学

<120> 一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1704

<212> DNA

<213> 红色红曲霉(Monascus rubber)

<400> 1

atggctctcc gccgaatctc tgccgctcta gccctatccg gctttgcagg atgctctctc 60

gctgccagcg ccgaggaatg ggcctcccgt tccatctacc agatcatcac tgaccgttat 120

gcccgccccg atggcacctc aggaacatgc gatcccatga agtactgcgg tggctcttgg 180

aaggcgctgg ccgacaacct cgactacatc caggacatgg gattcactgc tctgcagatc 240

tcgcccatca acaagaacct ggaacagaac accatctacg gtgaggcata ccacggctac 300

tggccgcagg acctgtacac gctgaacgcg cactttggaa cgcccgatga tctcaagaac 360

ctcgtgtccg agctgcacaa gcgcgacatg tacctcatgg tcgatgtcgt gtccaacgag 420

atggcctacg acatcggaaa caacaccatg tccaacagca cgcacatcga ctactccgtg 480

ttcaacccct tcaattcctc cagtgactat acgcctttct gccccatcgg cgactggcag 540

gacgactacc agctcaccaa ctgctggctt ggttccgagg gcgtcgccac cccgcgcatg 600

aagaccaccg acccggccgt cagccagacc ctgaccaagt ggatcaagga cttggtcggc 660

acgtacaacg tcgacggtat ccgtatcgat ggcgccaagc agatcgaaac cccgtacatg 720

gaggcctttg tcaagagcgc cggcgtcttc tccatggctg aggtcatgga gggtgacgca 780

aagtacgtct gcaactacca gcagtactct agcggactgg aaaattaccc gtactactac 840

cagatcattg gcgccttcac cgcgggaaag atggacgatc tcgtctccat ggttaaggat 900

gtgcagtcca catgctcctc gccccagtac ctggtcaact tcatcgagaa ccaggacaac 960

ccgcgctttg cgtccgcagg tggtaacctc acggtgagtt gcctccagaa acataaaaaa 1020

aaaaaaaaaa cctaggctaa gcaatgccag ctcgctaaaa acgccgccgc attcaccatc 1080

ctcgccgacg gaatccccaa ggtctattac ggccaggagc aattcctcag cggccagtac 1140

tctccctata accgccagga tctgtggtcg accaagtacg acaccgacgc gcccctgtac 1200

cagctcatca gcacgctgaa caagctccgc aaccacgcta tctctctcga cgacagatac 1260

gtcaccaacg cctccaccat cctgtaccac gacggctcga cctacgccac ccgcaagggc 1320

cccgacggcg tccagatcgt cagcgtcctg tccaaccagg gcctcaacgg cggcgcctac 1380

aagctcgaca tcgacggtgc cgcccaggag ggcaccaacc tgaccgacgt cctctcctgc 1440

aagaccgtcg ttgccggcca caacgacacc atcaccgttg acatggacaa gggtgagcct 1500

cacgtcttct tccctaccta ccagctgaac gggaccggtt tgtgcggaaa ctccaagtct 1560

gccacttctg cgtcttcttc gccgtccggt acttcgactt ccgcgacggc tacgagcacc 1620

aaggacagcg ctgccaacgg tctgagcgcg tcgttcggcc tgatgggtct gggtgtgatg 1680

ggtgttgttg ggctgctttt gtaa 1704

<210> 2

<211> 1647

<212> DNA/RNA

<213> 红色红曲霉(Monascus rubber)

<400> 2

atggctctcc gccgaatctc tgccgctcta gccctatccg gctttgcagg atgctctctc 60

gctgccagcg ccgaggaatg ggcctcccgt tccatctacc agatcatcac tgaccgttat 120

gcccgccccg atggcacctc aggaacatgc gatcccatga agtactgcgg tggctcttgg 180

aaggcgctgg ccgacaacct cgactacatc caggacatgg gattcactgc tctgcagatc 240

tcgcccatca acaagaacct ggaacagaac accatctacg gtgaggcata ccacggctac 300

tggccgcagg acctgtacac gctgaacgcg cactttggaa cgcccgatga tctcaagaac 360

ctcgtgtccg agctgcacaa gcgcgacatg tacctcatgg tcgatgtcgt gtccaacgag 420

atggcctacg acatcggaaa caacaccatg tccaacagca cgcacatcga ctactccgtg 480

ttcaacccct tcaattcctc cagtgactat acgcctttct gccccatcag cgactggcag 540

gacgactacc agctcaccaa ctgctggctt ggttccgagg gcgtcgccac cccgcgcatg 600

aagaccaccg acccggccgt cagccagacc ctgaccaagt ggatcaagga cttggtcggc 660

acgtacaacg tcgacggtat ccgtatcgat ggcgccaagc agatcgaaac cccgtacatg 720

gaggcctttg tcaagagcgc cggcgtcttc tccatggctg aggtcatgga gggtgacgca 780

aagtacgtct gcaactacca gcagtactct agcggactgg aaaattaccc gtactactac 840

cagatcattg gcgccttcac cgcgggaaag atggacgatc tcgtctccat ggttaaggat 900

gtgcagtcca catgctcctc gccccagtac ctggtcaact tcatcgagaa ccaggacaac 960

ccgcgctttg cgtccgcagg tggtaacctc acgctcgcta aaaacgccgc cgcattcacc 1020

atcctcgccg acggaatccc caaggtctat tacggccagg agcaattcct cagcggccag 1080

tactctccct ataaccgcca ggatctgtgg tcgaccaagt acgacaccga cgcgcccctg 1140

taccagctca tcagcacgct gaacaagctc cgcaaccacg ctatctctct cgacgacaga 1200

tacgtcacca acgcctccac catcctgtac cacgacggct cgacctacgc cacccgcaag 1260

ggccccgacg gcgtccagat cgtcagcgtc ctgtccaacc agggcctcaa cggcggcgcc 1320

tacaagctcg acatcgacgg tgccgcccag gagggcacca acctgaccga cgtcctctcc 1380

tgcaagaccg tcgttgccgg ccacaacggc accatcaccg ttgacatgga caagggtgag 1440

cctcacgtct tcttccctac ctaccagctg aacgggaccg gtttgtgcgg aaactccaag 1500

tctgccactt ctgcgtcttc ttcgccgtcc ggtacttcga cttccgcgac ggctacgagc 1560

accaaggaca gcgctgccaa cggtctgagc gcgtcgttcg gcctgatggg tctgggtgtg 1620

atgggtgttg ttgggctgct tttgtaa 1647

<210> 3

<211> 548

<212> PRT

<213> 红色红曲霉(Monascus rubber)

<400> 3

Met Ala Leu Arg Arg Ile Ser Ala Ala Leu Ala Leu Ser Gly Phe Ala

1 5 10 15

Gly Cys Ser Leu Ala Ala Ser Ala Glu Glu Trp Ala Ser Arg Ser Ile

20 25 30

Tyr Gln Ile Ile Thr Asp Arg Tyr Ala Arg Pro Asp Gly Thr Ser Gly

35 40 45

Thr Cys Asp Pro Met Lys Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Lys Ala Leu Ala

50 55 60

Asp Asn Leu Asp Tyr Ile Gln Asp Met Gly Phe Thr Ala Leu Gln Ile

65 70 75 80

Ser Pro Ile Asn Lys Asn Leu Glu Gln Asn Thr Ile Tyr Gly Glu Ala

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Pro Gln Asp Leu Tyr Thr Leu Asn Ala His Phe

100 105 110

Gly Thr Pro Asp Asp Leu Lys Asn Leu Val Ser Glu Leu His Lys Arg

115 120 125

Asp Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ser Asn Glu Met Ala Tyr Asp

130 135 140

Ile Gly Asn Asn Thr Met Ser Asn Ser Thr His Ile Asp Tyr Ser Val

145 150 155 160

Phe Asn Pro Phe Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Thr Pro Phe Cys Pro Ile

165 170 175

Ser Asp Trp Gln Asp Asp Tyr Gln Leu Thr Asn Cys Trp Leu Gly Ser

180 185 190

Glu Gly Val Ala Thr Pro Arg Met Lys Thr Thr Asp Pro Ala Val Ser

195 200 205

Gln Thr Leu Thr Lys Trp Ile Lys Asp Leu Val Gly Thr Tyr Asn Val

210 215 220

Asp Gly Ile Arg Ile Asp Gly Ala Lys Gln Ile Glu Thr Pro Tyr Met

225 230 235 240

Glu Ala Phe Val Lys Ser Ala Gly Val Phe Ser Met Ala Glu Val Met

245 250 255

Glu Gly Asp Ala Lys Tyr Val Cys Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Ser Gly

260 265 270

Leu Glu Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gln Ile Ile Gly Ala Phe Thr Ala

275 280 285

Gly Lys Met Asp Asp Leu Val Ser Met Val Lys Asp Val Gln Ser Thr

290 295 300

Cys Ser Ser Pro Gln Tyr Leu Val Asn Phe Ile Glu Asn Gln Asp Asn

305 310 315 320

Pro Arg Phe Ala Ser Ala Gly Gly Asn Leu Thr Leu Ala Lys Asn Ala

325 330 335

Ala Ala Phe Thr Ile Leu Ala Asp Gly Ile Pro Lys Val Tyr Tyr Gly

340 345 350

Gln Glu Gln Phe Leu Ser Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Asn Arg Gln Asp

355 360 365

Leu Trp Ser Thr Lys Tyr Asp Thr Asp Ala Pro Leu Tyr Gln Leu Ile

370 375 380

Ser Thr Leu Asn Lys Leu Arg Asn His Ala Ile Ser Leu Asp Asp Arg

385 390 395 400

Tyr Val Thr Asn Ala Ser Thr Ile Leu Tyr His Asp Gly Ser Thr Tyr

405 410 415

Ala Thr Arg Lys Gly Pro Asp Gly Val Gln Ile Val Ser Val Leu Ser

420 425 430

Asn Gln Gly Leu Asn Gly Gly Ala Tyr Lys Leu Asp Ile Asp Gly Ala

435 440 445

Ala Gln Glu Gly Thr Asn Leu Thr Asp Val Leu Ser Cys Lys Thr Val

450 455 460

Val Ala Gly His Asn Gly Thr Ile Thr Val Asp Met Asp Lys Gly Glu

465 470 475 480

Pro His Val Phe Phe Pro Thr Tyr Gln Leu Asn Gly Thr Gly Leu Cys

485 490 495

Gly Asn Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ser Gly Thr

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Thr Ala Thr Ser Thr Lys Asp Ser Ala Ala Asn Gly

515 520 525

Leu Ser Ala Ser Phe Gly Leu Met Gly Leu Gly Val Met Gly Val Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu

545

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cccaagctta tggctctccg ccgaatctct gc 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cgagctctta caaaagcagc ccaacaacac c 31

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aggtggactt gccggttgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ttatcatttc ccgctgggtg 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gatgatctca agaacctcgt gtcc 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gcagttggtg agctggtagt cg 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

caacgccagc ggtcgtatc 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gcgcagcatc aaatccaaga 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cgggagggac aacgaagtg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cgtggcatga accgcatta 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

tggagctaag tgacggtgcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

atggaagagg tttgcgggag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gaggagggct ctacgggtca 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ggaatatcgg gagtcgtgct g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

tcctgttccg attggagacg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

ttggtgaagt ggctgggcta 20

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

agcttggtac cgagctctta attaagttta aacctcgagt ctagaa 46

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gatcttctag actcgaggtt taaacttaat taagagctcg gtacca 46

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

cgggatcctg tgacgaactc gtgtgctctg tac 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

aactgcaggg tgatgtctgc tcaagcgggg tag 33

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

gaagatctcc acttaacgtt actgaaatca tc 32

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

ggactagttc agaagaactc gtcaagaagg 30

Claims (5)

1.一种红色红曲霉α-淀粉酶基因，其特征在于该基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种红色红曲霉α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种权利要求1所述红色红曲霉α-淀粉酶基因的制备方法，其特征在于包括以下步骤：提取红色红曲霉菌株CICC41233的总DNA，以此作为模板，以序列为SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5的一对引物进行PCR扩增，扩增产物即为所述红色红曲霉α-淀粉酶基因。

4.应用权利要求1所述红色红曲霉α-淀粉酶基因构建红曲色素高产菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取所述红色红曲霉α-淀粉酶基因和pNeo0380载体，用限制性内切核酸酶Hind III、Sac I分别对二者进行酶切，将酶切产物用T4 DNA连接酶连接，得到双元质粒表达载体pNeo0380-440333；

2)用根癌农杆菌EHA105介导所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株；

其中，步骤2)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株；

所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取l mL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD₆₀₀值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中；

所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μL YEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105；

所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD₆₀₀值为0.15，再继续培养5～6h，至OD₆₀₀值为0.5～0.6；将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h；

所述筛选阳性克隆，包括以下步骤：在避光培养48h后的AIM诱导培养基平板上再添加一层含80μg/mL G418、200μmol/L头孢噻肟、0.2％Triton X-100的PDA培养基，30℃继续培养5～8d；挑取单菌落转接至含80μg/mL G418的MPS固体培养基平板上，培养3d后将能够生长的菌株，接于MPS液体培养基中培养，按照SDS裂解法提取丝状真菌总DNA进行分子分析，用序列为SEQ ID No:4、SEQ ID No:5的一对引物进行PCR验证，选取阳性菌株。

5.应用权利要求4所构建高产菌株发酵产红曲色素的方法，其特征在于该方法中：

发酵培养基成分包括：9％(w/w)大米粉，0.2％(w/w)NaNO₃，0.1％(w/w)KH₂PO₄，0.2％(w/w)MgSO₄·7H₂O，0.2％(w/w)乙酸；

发酵初始时，向培养基中接入所述高产菌株的孢子10⁵个/mL；

发酵条件为：温度30℃，搅拌转速180rpm，发酵6天。

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