CN105039386A - 一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，先从红曲霉基因组中扩增红曲霉酸性蛋白酶基因<i>Asp</i>片段，然后将扩增得到的所述<i>Asp</i>片段连接到空载体上构建红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体，将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，再利用根癌农杆菌介导法将所述重组根癌农杆菌导入红曲霉，得到所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株。本发明用基因重组法获得高产酸性蛋白酶的红曲霉转化子菌株，具有高效表达、准确加工、转化子遗传稳定的特点，可在非选择压力下实现稳定传代，高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株酸性蛋白酶基因的表达量是野生型表达量的3.30倍，能实现酸性蛋白酶的高产。

Description

一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法。

背景技术

红曲霉是发酵行业的功能菌株，其体内含有酸性蛋白酶Asp基因，该基因可表达产生酸性蛋白酶Asp，酸性蛋白酶Asp对白酒酿造有以下作用：

1、促进微生物生长：

微生物的发育需要有蛋白质为其提供氮源及能量，在入窖时发酵糟的酸度以及发酵初期窖内酸度较大，此时曲霉中的酸性蛋白酶可强化蛋白质分解为氨基酸，丰富酒醅中氨基酸含量，有利于微生物生长。

2、提高原材料的利用率：

酸性蛋白酶的应用可强化酒精代谢，使原料出酒率提高。

3、提供生香前体物质和风味物质：

酸性蛋白酶在酿酒的酸性环境中，将原料蛋白质水解成氨基酸，多种氨基酸是生成白酒香味成分的前体物质，经过不同微生物及酶的代谢，可生成多种香味物质。

然而，现有技术中，红曲霉的酸性蛋白酶表达量并不高，而酸性蛋白酶酶制剂成本高、活性低，不能广泛应用于生产，因而存在一定的缺陷。有鉴于此，如何获得高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株具有十分重要的意义。为了获得高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株，常见的方法有自然选育法、诱变育种法、基因重组育种法；但自然选育法的工作范围大，诱变育种法具有不定向性且诱变后稳定性低的缺点。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，使构建得到的红曲霉菌株具有酸性蛋白酶基因高表达量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，先从红曲霉基因组中扩增红曲霉酸性蛋白酶基因Asp片段，然后将扩增得到的所述Asp片段连接到空载体上构建红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体，将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，再利用根癌农杆菌介导法将所述重组根癌农杆菌导入红曲霉，得到所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明创造性地从红曲霉基因组中扩增Asp基因，利用pBC-Hygro质粒的强启动子，将红曲霉酸性蛋白酶基因片段与pBC-Hygro载体连接，构建重组载体pBC-Hygro-Asp，再利用根癌农杆菌介导法将Asp基因导入红曲霉，筛选出能高产酸性蛋白酶的红曲霉同源转化子菌株，解决了目前红曲霉菌株不具有高产酸性蛋白酶的性质，而且酸性蛋白酶酶制剂成本高、活性低、不能广泛应用于生产的技术问题，具有良好的市场应用前景。

2、本发明得到的红曲霉转化子菌株酸性蛋白酶基因的表达量是野生型红曲霉酸性蛋白酶基因表达量的3.30倍，能实现酸性蛋白酶的高产，具有转化子菌株在酸性条件下分解蛋白质能力强的特点。

3、本发明采用基因重组法获得的同源转化子红曲霉菌株，具有高效表达、准确加工、转化子遗传稳定的特点，可以在非选择压力下实现稳定传代，且与异源表达相比，同源表达构建的目的菌株稳定性更强。

附图说明

图1为红曲霉酸性蛋白酶PCR反应产物的电泳图；

图2为重组载体pBC-Hygro-Asp的构建图谱；

图3为pBC-Hygro空载体和重组载体pBC-Hygro-Asp的电泳图；

图4为重组载体pBC-Hygro-Asp扩增后的电泳图；

图5为红曲霉转化子菌株的hph验证图；

图6为在含有潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种野生型红曲霉菌株的菌落图；

图7为在含有潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种红曲霉转化子菌株的菌落图；

图8为在不含潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种红曲霉转化子菌株的菌落图；

图9为在不含潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种野生型红曲霉菌株的菌落图；

图10为发酵液中酸性蛋白酶产生的透明圈；

图11为红曲霉酸性蛋白酶基因qPCR结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。

实施例中红曲霉由四川省农科院水稻高粱研究所生物技术中心唐玉明提供；质粒pBC-Hygro由法国P.Silar教授惠赠；红曲霉酸性蛋白酶基因片段由英潍捷基贸易公司合成；高保真酶PfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性内切酶SmaI购于Takara公司；真菌RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、质粒小提试剂盒为OMEGA公司产品；氯霉素、潮霉素、头孢噻污钠、庆大霉素、其他常规分析纯试剂以及LB培养基和察氏培养基均购自北京康为世纪科技有限公司。

一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，先从红曲霉基因组中扩增红曲霉酸性蛋白酶基因Asp片段，然后将扩增得到的所述Asp片段连接到空载体上构建红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体，将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，再利用根癌农杆菌介导法将所述重组根癌农杆菌导入红曲霉，得到所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株。

实施例1：红曲霉酸性蛋白酶基因的克隆

1、红曲霉RNA的提取和cDNA双链的合成：

将用麦芽琼脂培养基培养12天的红曲霉菌丝用无菌药匙刮下，液氮研磨后用OMEGA公司的真菌RNA提取试剂盒提取其RNA；取500ng提取的红曲霉RNA使用逆转录试剂盒合成第一链和第二链，合成的cDNA双链置于-20℃保存。

2、引物设计和基因扩增：

根据GenBank中公布的紫红曲霉酸性蛋白酶基因Asp(AB090877.1)序列（SEQIDNO.1）和质粒pBC-Hygro多克隆位点的特征，用软件PrimerPremier5.0设计Asp基因引物。引物序列为：

Asp-ORF-F:5’-TCCCCCGGGATGGTCGTCTTCAGCAAGATCAC-3’

Asp-ORF-R：5’-TCCCCCGGGTTATGCCTGAGGGGCAAATCCGA-3’

以1中合成的cDNA为模板，用上述引物PCR扩增得到长度为1200bp左右的特异性条带，如图1所示；图1中M:DL2000DNAmarker，1~4：红曲霉酸性蛋白酶基因的PCR产物。将目的片段连接到T4载体，转化入大肠杆菌DH5α，用M13引物鉴定正确后送往测序公司测序，测序后进行Blast比对分析，结果与GenBankAB090877.1序列相似度达100%，表明红曲霉酸性蛋白酶基因被成功克隆。

实施例2酸性蛋白酶基因红曲霉表达载体pBC-Hygro-Asp的构建：

将实施例1测序正确的Asp片段和载体pBC-Hygro分别用SmaI限制性内切酶进行酶切，使用胶回收试剂盒回收和纯化酶切后的Asp和线性pBC-Hygro载体，然后使用T4DNA连接酶将Asp片段克隆到pBC-Hygro载体上；重组表达载体pBC-Hygro-Asp的构建图谱如图2所示。

用pBC-Hygro空载体和重组后的表达载体pBC-Hygro-Asp一起电泳，结果显示重组后的质粒比空质粒载体长1200bp左右，如图3所示，图3中M:DL23130DNAMarker，1：载体pBC-Hygro-Asp，2：pBC-Hygro载体；重组质粒用引物Asp-ORF-F和Asp-ORF-R进行PCR扩增，得到1200bp左右的特异性条带，如图4所示，图4中M:DL2000DNAMarker，1~3：载体pBC-Hygro-Asp的酸性蛋白酶基因片段Asp。由此可证明质粒pBC-Hygro-Asp构建成功。

实施例3农杆菌介导法对红曲霉的同源转化

1、介导转化：

采用冻融法将实施例2得到的载体pBC-Hygro-Asp的重组质粒转化到根癌农杆菌中。从YEB平板（含34μg/mL氯霉素、50μg/mL利福平）上挑取重组农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基（含34μg/mL氯霉素、50μg/mL利福平），于28℃、200r/min避光摇菌2days。

2、PCR验证：

取步骤1培养后的菌液做PCR验证，以确定重组载体是否已转入农杆菌。向步骤1培养后的重组农杆菌菌液中加入根癌农杆菌诱导剂，于200r/min摇菌4h；所述诱导剂为200μmol/mL的乙酰丁香酮溶液；同时用含有0.05%聚山梨酯-80（v/v）的0.85%生理盐水（m/v）洗脱固体培养的红曲霉孢子。

将诱导好的根癌农杆菌和红曲霉孢子OD₆₀₀值调至0.7，取等量诱导后的重组农杆菌与红曲霉孢子涂布在共培养诱导培养基中的玻璃纸上，于33℃共培养2days。将共培养诱导培养基中玻璃纸揭下置于察氏培养基平板（含34μg/mL氯霉素、20μg/mL头孢噻污钠）上，于33℃培养7days。将玻璃纸上长出的红曲霉挑菌转移至麦芽琼脂培养基（含100μg/mL潮霉素）平板扩培，提取基因组DNA，PCR检验hph序列，以验证重组质粒是否转化进入红曲霉。其中，检验抗潮霉素序列所用引物序列为：

hph-F：5’-GCAAGACCTGAAAC-3’

hph-R：5’-CTCCATACAAGCCAACCAC-3’

如上将经过转化处理的菌株提取基因组后用hph序列验证，扩增的目的产物长度为425bp（图5），图5中1~2：野生型红曲霉，3~4为红曲霉转化菌株；结果表明pBC-Hygro-Asp重组质粒被成功转入红曲霉，实现了红曲霉酸性蛋白酶菌株的同源转化。

分别在含有和不含有潮霉素的麦芽琼脂培养基上培养野生型红曲霉和上述得到的红曲霉转化子菌株；结果显示：在含有潮霉素（100μg/mL）的麦芽琼脂培养基上接种的野生型红曲霉，于33℃培养9天后并未生长（图6），而在相同条件下接种的红曲霉转化子菌株表现出生长能力（图7）。同时，在含潮霉素和不含潮霉素的条件下，转化菌株的表型产生一定的差异：在含潮霉素的培养基上，转化子菌株生长速度较缓慢，菌落边缘不规则且菌丝体较少（图7）；而在不含潮霉素的培养基上，红曲霉转化子菌株生长速度较快（图8），与在不含潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种的野生型菌株（图9）相比菌落形态相似，但在菌落外围出现了颜色更深的圆圈。通过以上试验可以看出，pBC-Hygro-Asp重组质粒被成功转入红曲霉，实现了红曲霉酸性蛋白酶菌株的同源转化。

实施例4验证试验:

1、配制红曲霉发酵培养基：17.79g麸皮，4.53g豆粉饼，0.205gKH₂PO₄，45mL水，pH5，灭菌20min；待培养基冷却后将上述得到的红曲霉转化子菌株和野生型菌株分别接种于发酵培养基，于33℃培养120h。

制备酸性蛋白酶酪素鉴定培养基平板并打孔，将上述培养后的野生型菌株和红曲霉转化子发酵液分别滴3mL到孔内（图10中A为转化子菌株发酵液，B为清水对照样，C为红曲霉野生型菌株发酵液），置于35℃，保温20h，观测水解圈直径。

结果表明：红曲霉转化子菌株和野生型菌株的等量发酵液在鉴别培养基上20h内产生的透明圈面积均值比为2.04，说明重组质粒转入红曲霉后，其酸性蛋白酶基因表达量更大，致使转化子菌株在酸性条件下分解蛋白质的能力比野生型红曲霉菌株强。证明了红曲霉酸性蛋白酶基因的同源表达能够实现红曲霉酸性蛋白酶高产菌株的构建。

2、参考GenBank:AJ417880.1设计红曲霉酸性蛋白酶qPCR内参引物，其序列为：actin-F:5′-CCCAAGTCCAACAGGGAG-3′，actin-R:5′-CACAGAGTCAAGCACGATA-3′。

提取红曲霉野生型菌株和红曲霉转化子菌株的cDNA，以其为模板，对红曲霉酸性蛋白酶基因进行qPCR反应。结果显示：红曲霉转化子酸性蛋白酶基因表达量是野生型红曲霉菌株酸性蛋白酶基因表达量的3.30倍（如图11）；进一步证明了红曲霉酸性蛋白酶基因的同源表达能够实现红曲霉酸性蛋白酶高产菌株的构建。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>重庆大学；

<120>一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法；

<160>7

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1188

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQIDNO.1

<400>1

ATGGTCGTCTTCAGCAAGATCACCGCCGTTGCGGCCGGTTTCTCCACTCTGGCTGCGGCA60

ATGCCCACGCTGAACCGTCCCAATGTCAAGTCGTTCAGTCTCAGCCAGTCTGCCATTCCT120

CGCCAGCAGAAGAATTTCAACTTTGCTGCGACCTACGCGAAGACTCTGGCCAAGTATGGC180

GGCCAGATCCCTGCGTCTCTCAAGGCTGCCGCCGAGAAAGGAAGTGTCAACACTTACCCT240

GAACCCCAGGACGCCGAGTACCTCACTGCTGTCGACGTCGGTGGCACTACCTTGAACCTG300

GACTTTGACACTGGCTCGGCTGATCTCTGGGTCTTCTCTGCCGAGCTTCCCTCCAGCGAG360

CAGTCTGGCCATGCTATCTACAAGCCATCCGGCAATGCCACCAAAATGAGCGGATACTCG420

TGGAGTATCTCCTACGGTGATGGTAGCTCCGCCAGTGGTGATGTCTACAAGGACACCGTC480

ACTGTCGCTGGCATTACGGCCCCCCAGCAGGCTGTTGAGGCTGCCAGCACGATCAGCTCG540

GAATTCACCCAGGACAAGAACAACGACGGTCTGTTGGGTCTGGCTTTCAGCTCCATCAAC600

ACCGTCCAGCCTAAGGCCCAGACCACCTGGTTCGACACCGTCAAGGAGGATCTGGATTCC660

CCTCTTTTCGCAGTGGCTCTGAAGCACAATGCCCCCGGCACCTTTGACTTTGGCTACGTC720

GACAAGTCCAAGTACACTGGTTCTCTCACCTACGCCGACGTGGACAACTCCCAGGGCTTC780

TGGCAATTCACCGCCGATAGCTATTCTGTTGGCTCCCAGAGCGGCTCTGAGTCCATTGTT840

GGCATTGCTGACACTGGTACCACCCTCCTCCTCCTCCCCGACGATGTCGTCGAAGCCTAC900

TACAAGCAGGTCGAGGGAGCCGAGAACGACTCCCAGGCTGGCGGCTACGTCTTCCCCTGC960

GACTCTCAACTCCCCAGCTTCACCGCGGTCATCAACGGCTACTCCGCCGTTGTCCCCGGC1020

AGCCTGATCAACTACGCCTCGGCTGGCGACGGTTCGAACAACTGCCTCGGCGGCATTCAG1080

TCCGACCAGGGCATCGGCCAGGCCATCTTCGGCGACATCTTCCTCAAGAGCCAGTACGTT1140

GTGTTTGACGCTGATGGTCCCAGACTCGGATTTGCCCCTCAGGCATAA1188

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Asp-ORF-F

<400>2

TCCCCCGGGATGGTCGTCTTCAGCAAGATCAC32

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Asp-ORF-R

<400>3

TCCCCCGGGTTATGCCTGAGGGGCAAATCCGA32

<210>4

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hph-F

<400>4

GCAAGACCTGAAAC14

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hph-R

<400>5

CTCCATACAAGCCAACCAC19

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>actin-F

<400>6

CCCAAGTCCAACAGGGAG18

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>actin-R

<400>7

CACAGAGTCAAGCACGATA19

Claims (4)

1.一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，其特征在于，先从红曲霉基因组中扩增红曲霉酸性蛋白酶基因Asp片段，然后将扩增得到的所述Asp片段连接到空载体上构建红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体，将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，再利用根癌农杆菌介导法将所述重组根癌农杆菌导入红曲霉，得到所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株。

2.根据权利要求1所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述扩增红曲霉酸性蛋白酶基因Asp片段，是以红曲霉cDNA为模板，采用引物Asp-ORF-F和Asp-ORF-R进行扩增；所述引物Asp-ORF-F的序列如SEQIDNO.2所示，引物Asp-ORF-R的序列如SEQIDNO.3所示。

3.根据权利要求1所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述空载体为pBC-Hygro质粒。

4.根据权利要求1所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，其特征在于，采用冻融法将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌。