CN107815459A - 一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用 - Google Patents

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3基因，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。本发明将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较未转化菌株分别提高了8.62％和7.46％。

Description

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括两 种锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在糙皮侧耳中的过表达、检测及其在木质素降解中的应用。
背景技术
作物秸秆中的主要成分有木质素、纤维素和半纤维素等，其中木质素和半纤维素以 共价键形式相结合，使纤维素分子包埋在其中，导致秸秆资源难以被充分利用。利用真菌分泌的胞外氧化酶来降解木质素,不但条件温和、无二次污染，可实现秸秆再利用， 而且还可以获得一定经济效益。
现已知白腐真菌分泌的木质素降解酶主要有木质素过氧化物酶(ligninperoxidase， LiP)，锰过氧化物酶(manganese-dependent peroxidase，MnP)，漆酶(laccase，Lac)和多功 能过氧化物酶(versatile peroxidase，VP)。
其中，锰过氧化物酶(MnP，EC1.11.1.13)是一种含有血红素的酶蛋白，在含有H2O2和Mn2﹢的催化条件下，MnP能将芳香环类化合物氧化，在木质素降解过程中起着至关 重要的作用。此外，VPs是一类特殊的锰过氧化物酶，它能够同时具有LiP和MnP的 活性。近年来，随着研究的深入，发现VP既能够氧化Mn2+，又能够氧化VA、CIP等， 由于它的催化具有多功能性，因此在研究木质素生物降解过程中同样具有极其重要的意 义。
糙皮侧耳是一类重要的食用菌，在全球食用菌市场占第二大重要位置，在中国也是 一种很受欢迎的食用菌。它不仅可以作为菌类被食用，还可以降解木质素，对生物质利用具有重要作用。但糙皮侧耳本身降解木质素能力较弱，且降解机制尚未阐明。因此， 研究木质素降解酶系对指导实际生产和木质素降解具有极其重要的作用。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其 获取方法，质粒载体的构建方法，检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳野生型菌株的方法，将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结 果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较野生型分别提高了8.62％和7.46％。
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ IDNO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋 白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因的获取方法，包括以下步骤：
1)cDNA反转录，糙皮侧耳菌丝接种到PDA培养基上培养7d扩繁后，将菌丝取 出，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用荧光反转录试剂盒反转录成cDNA；
2)引物设计，引物设计采用Primer Premier 5.0完成，设计的引物包括gpd-F、gpd-R、 mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R，并进行引物合成；
3)基因片段扩增，根据gpd-F、gpd-R引物对RNA采用PCR扩增技术克隆出gpd 启动子基因片段，根据mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R引物对cDNA采用PCR扩增 技术克隆出mnp6基因片段和vp3基因片段。
Pogpd扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s；58℃退火30s，72℃ 延伸90s；30个PCR循环，最后72℃延伸10min，20℃保温。扩增反应体系为50μl： 31.5μl ddH2O，5μl Buffer，4μl dNTP，上游引物3μl，下游引物3μl，DNA 3μl，EasyTaq 酶0.5μl。
Pomnp6扩增反应条件:94℃预变性3min，94℃变性30s；54℃退火30s，72℃延 伸70s；30个PCR循环，最后72℃延伸10min，20℃保温。扩增反应体系为50μl： 31.5μl dd H2O，5μl Buffer，4μl dNTP，上游引物3μl，下游引物3μl，cDNA 3μl，EasyTaq 酶0.5μl。
Povp3扩增反应条件:94℃预变性3min，94℃变性30s；59℃退火30s，72℃延伸70s；30个PCR循环，最后72℃延伸10min，20℃保温。扩增反应体系为50μl：31.5 μl ddH2O，5μl Buffer，4μl dNTP，上游引物3μl，下游引物3μl，cDNA 3μl，EasyTaq 酶0.5μl。
优选地，所述引物具体如下：
gpd-F，5'-CCCAAGCTTTCGAGGCTACCTCGCTACTG-3'
gpd-R，5'-CATGCCATGGTTCAAGGCCGTTGTATTAGT-3'
mnp6-F，5'-GAAGATCTGATGTCTTTCAAGGCTCTATTCACTT-3'
mnp6-R，5'-GGACTAGTCACAGGAGGAACGGTGGT-3'
vp3-F，5'-GAAGATCTGATGACCTTCGCCTCTCTTTCC-3'
vp3-R，5'-GGACTAGTCGAAGGGGGGACGGG-3'。
优选地，一种真菌转化方法，包括糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒电击法转入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法转化糙皮侧耳菌株，具体步 骤如下：
1)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态细胞50μl，冰上放置5min，待其融化后，加入 1μl重组表达质粒，轻轻混匀，冰浴静置2min；
2)将混合菌液迅速转入无菌预冷电击杯内槽底部，加69μl灭菌去离子水，吸打 混匀，避免气泡产生；
3)用吸水纸将电击杯金属侧壁擦干，将电击杯放入电脉冲仪电极间，电转条件设置为2.5kV，25mF，200ohms，电击5ms；
4)取出电击杯，迅速加到含1ml无抗液体LB培养基的1.5ml离心管内，28℃， 150r/min，培养6h；
5)4500r/min离心10min后，弃上清800μl,将剩余的200μl重悬菌体后，涂布 于相应的抗性平板上，含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性，28℃培养2d，待有单菌落长 出后，进行PCR鉴定，保菌；
6)取1mL验证成功的农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基中，含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性，200r/min，28℃，培养24h,收集菌液，4℃，5000r/min离心10min， 去上清后，用等体积IM培养液，IM培养液为LB液体培养基+200μmol/LAS，pH5.5， 重新悬浮，测量菌液OD600值，并用IM稀释至OD600＝0.5左右，以IM为对照，然后 150r/min，28℃培养6h；
7)将培养好的菌丝块，菌丝块大小9cm×9cm，浸入农杆菌菌液30min，然后转 入含有200μmol/LAS的PDA共培养基上，25℃培养3d；
8)取步骤7)中共培养基上的菌丝块接种到筛选培养基上筛选3代，筛选培养基 配制为PDA+100mg/L hph+300mg/L Cefotaxime，之后再在PDA不含抗性平板上进行 复壮3代。
优选地，一种真菌转化方法，所述锰过氧化物酶基因mnp6和vp3重组表达质粒载体的构建方法如下：
1)利用限制性内切酶HindIII和NcoI将pCAMBIA1304载体线性化，利用T4连 接酶将gpd基因片段连接到pCAMBIA1304，转化到大肠杆菌DH5α内，构建改造表达 载体pCAMBIA1304-Pogpd；
2)将步骤1)中pCAMBIA1304-Pogpd重组质粒利用限制性内切酶BglII和SpeI 将pCAMBIA1304-Pogpd载体线性化，将mnp6和vp3分别连接到pCAMBIA1304-Pogpd 上，转化到大肠杆菌DH5α内，分别构建重组表达质粒pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6， pCAMBIA1304-Pogpd-vp3，并对重组质粒进行双酶切验证。
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，所述应用的具体步骤为：
1)称取5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉花秸秆干粉于广口瓶中，加入 22mL合成培养液，用封口膜封好；
2)121℃高温蒸汽灭菌30min；
3)将野生型和转化菌株分别用打孔器取9mm×9mm菌块，接种到棉花秸秆固 体筛选培养基上，25℃±1℃条件下培养30d，置于60℃烘干后，利用纤维素测定 仪测定培养前后木质素含量，设置3个重复组。
合成培养液为低氮无糖高无机盐培养液，配方具体成分比例如下：酒石酸铵液：大量元素液：微量元素液：VB1液：水＝1：15：15：3：16，其中，酒石酸铵为氮源，浓 度为22.0g/L；大量元素液含20g/LKH2PO4、13.8g/LMgSO4·7H2O、1.0g/L CaCl2和 0.6g/L NaCl；微量元素液为0.35g/L MnSO4·H2O、60mg/L FeSO4·7H2O、110mg/L CoCl2·6H2O、60mg/L ZnSO4·7H2O、95mg/L CuSO4·5H2O、6mg/LAlK(SO4)2·12H2O、 6mg/L H3BO3和6mg/L Na2MoO4·2H2O，VB1为100mg/L。
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳菌株的检测方法如下：将拟转化的糙皮侧耳菌株子实体置入新鲜配制的200μl GUS 染色液中，染色12h，若子实体变蓝，则目的基因插入糙皮侧耳基因组中，不变蓝则未 插入，采取未转化的菌株子实体做空白对照，其在GUS染色液中不变蓝，GUS染色液 配方为X-gluc 20μl，GUS缓冲液1ml。
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒的构建方法以及采用该重组表达质粒包含来自糙皮侧耳的gpd启动子和GUS报告基因的GUS检测方法在真 菌转化和检测中的应用。其他物种菌株的遗传转化未发现相关研究或研究转化成功实验 例。
本发明中，采用GUS基因作为报告基因，对转化菌株子实体进行染色分析，若变 蓝则为转化菌株，不变蓝则未转化成功；将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养 基上培养30d，测定木质素含量，结果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解 率较未转化菌株分别提高了8.62％和7.46％。
说明书附图
图1为本发明提出的糙皮侧耳gpd启动子克隆凝胶电泳图分析，图中M为Maker； 图中1和2为gpd目的条带。
图2：为本发明提出的糙皮侧耳P.ostreatus mnp6/vp3PCR扩增产物凝胶电泳图分析；其中a为P.ostreatus mnp6，b为P.ostreatus vp3，图中M为Maker,图中1和2为 目的条带。
图3：pCAMIBA1304-Pogpd-Povp3和pCAMIBA1304-Pogpd-Pomnp6真核载体构建 双酶切验证；M：DL2000Maker；1:重组质粒；2：目的基因；3：空载质粒；4：对照。
图4：真核载体构建示意图。
图5为图4中pCAMBIA1304载体示意图。
图6为图4中pCAMBIA1304-Pogpd示意图。
图7为图4中pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6/vp3示意图。
图8-1、8-2：pCAMIBA1304-Povp3PDA+AS诱导培养3d；图8-3：潮霉素平板筛 选重组菌株T3代。
图9：糙皮侧耳抗性筛选T3代后，PDA复壮T3代后GUS染色分析；A:子实体 原基B:子实体分化期C:子实体幼菇D：野生型。
图10：转基因菌株复壮T3代后PCR鉴定；M：DL5000/2000Maker；+：重组质粒； —：阴性对照；WT：野生型；T1-T5：转化菌株。
图11：野生型和转基因菌株对棉结杆的木质素降解率；CK：阴性对照；WT：野 生型；Pogpd:Pomnp6/Povp3：转化菌株；**P<0.01差异极显著；*P<0.05差异显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ IDNO:1所示,所示糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋 白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。
实施例2
糙皮侧耳选择现有商业化菌株均可。
糙皮侧耳菌丝总RNA的提取：
将糙皮侧耳菌丝接种到PDA培养基上培养7d扩繁后，将菌丝取出，利用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京全式金生物公司)提取总RNA，然后反 转录成cDNA，反转录采用荧光反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(北京全式金生物公司)；
引物设计，实验中所涉及到的引物利用Primer Premier 5.0设计完成，并送生工生 物工程(上海)股份有限公司进行引物合成，具体引物序列见下表1。
表1引物序列表
引物名称 引物序列
gpd-F CCCAAGCTTTCGAGGCTACCTCGCTACTG
gpd-R CATGCCATGGTTCAAGGCCGTTGTATTAGT
mnp6-F GAAGATCTGATGTCTTTCAAGGCTCTATTCACTT
mnp6-R GGACTAGTCACAGGAGGAACGGTGGT
vp3-F GAAGATCTGATGACCTTCGCCTCTCTTTCC
vp3-R GGACTAGTCGAAGGGGGGACGGG
gus-F GTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGA
gus-R TTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTCA
利用PCR扩增技术从糙皮侧耳RNA里扩增糙皮侧耳gpd启动子片段(图1为gpd 启动子片段凝胶电泳图)，并从糙皮侧耳cDNA中克隆mnp6和vp3基因片段(图2为 mnp6和vp3基因片段凝胶电泳图)。
实施例3
mnp6基因和vp3基因重组表达质粒载体的构建方法如下：
1)利用限制性内切酶HindIII和NcoI将pCAMBIA1304载体线性化，利用T4连 接酶将gpd连接到pCAMBIA1304，转化大肠杆菌DH5α，构建改造表达载体 pCAMBIA1304-Pogpd；
2)将上述pCAMBIA1304-Pogpd重组质粒利用限制性内切酶BglII和SpeI将pCAMBIA1304-Pogpd载体线性化，将mnp6和vp3连接到pCAMBIA1304-Pogpd上， 转化大肠杆菌DH5α，分别构建重组表达质粒pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6， pCAMBIA1304-Pogpd-vp3，并对重组质粒进行双酶切验证，结果如图3所示，载体构 建示意图如图4所示。
实施例4
一种真菌转化方法，包括糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒电击法转入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法转化糙皮侧耳菌株，具体步骤如下：
1)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态细胞50μl，冰上放置5min，待其融化后，加入 1μl重组表达质粒，轻轻混匀，冰浴静置2min；
2)将混合菌液迅速转入无菌预冷电击杯内槽底部，加69μl灭菌去离子水，吸打 混匀，避免气泡产生；
3)用吸水纸将电击杯金属侧壁擦干，将电击杯放入电脉冲仪电极间，电转条件设置为2.5kV，25mF，200ohms，电击5ms；
4)取出电击杯，迅速加到含1ml无抗液体LB培养基的1.5ml离心管，28℃，150 r/min，培养6h；
5)4500r/min离心10min后，弃上清800μl,将剩余的200μl重悬菌体后，涂布 于相应的抗性平板上(含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性)，28℃培养2d，待有单菌落 长出后，进行PCR鉴定，保菌；
6)取1mL验证成功的农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基中，含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性，200r/min，28℃，培养24h,收集菌液，4℃，5000r/min离心10min， 去上清后，用等体积IM培养液，IM培养液为LB液体培养基+200μmol/LAS，pH5.5， 重新悬浮，测量菌液OD600值，并用IM稀释至OD600＝0.5左右，以IM为对照，然后 150r/min，28℃培养6h；
7)将培养好的菌丝块，菌丝块大小9cm×9cm，浸入农杆菌菌液30min，然后转 入含有200μmol/LAS的PDA共培养基上，25℃培养3d，结果如图8-1、8-2所示。
8)取上述共培养基上的菌丝块接种到筛选培养基上筛选3代，筛选培养基配制为PDA+100mg/Lhph+300mg/L Cefotaxime，之后再在PDA不含抗性平板上进行复壮3代。
实施例5
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳菌株的检测方法如下：将拟转化的糙皮侧耳菌株子实体置入新鲜配制的200μl GUS 染色液中，染色12h，若子实体变蓝，则目的基因插入糙皮侧耳基因组中，不变蓝则未 插入，采取未转化的菌株子实体做空白对照，其在GUS染色液中不变蓝，GUS染色液 配方为X-gluc 20μl，GUS缓冲液1ml。值得注意的是，GUS染色法检验必须采用子实 体，而对菌丝体染色则表现出不稳定性。图9A-C图为转基因菌株子实体原基、分化期 和幼菇的GUS染色结果，均变蓝色，图9D为野生型菌株，未被染蓝。
进一步验证目的基因是否插入，利用GUS基因进行PCR验证，结果证明mnp6和 vp3均已插入到糙皮侧耳基因组中，如图7所示。
实施例6
一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，所示应用的具体步骤为：
1)称取5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉花秸秆干粉于广口瓶中，加入 22mL合成培养液，用封口膜封好；
2)121℃高温蒸汽灭菌30min；
3)将野生型和转化菌株分别用打孔器取9mm×9mm菌块，接种到棉花秸秆固 体筛选培养基上，25℃±1℃条件下培养30d，置于60℃烘干后，利用纤维素测定 仪测定培养前后木质素含量，设置3个重复组。
合成培养液为低氮无糖高无机盐培养液，配方具体成分比例如下：酒石酸铵液：大量元素液：微量元素液：VB1液：水＝1：15：15：3：16，其中，酒石酸铵为氮源，浓 度为22.0g/L；大量元素液含20g/LKH2PO4、13.8g/LMgSO4·7H2O、1.0g/L CaCl2和 0.6g/L NaCl；微量元素液为0.35g/L MnSO4·H2O、60mg/L FeSO4·7H2O、110mg/L CoCl2·6H2O、60mg/L ZnSO4·7H2O、95mg/L CuSO4·5H2O、6mg/LAlK(SO4)2·12H2O、 6mg/L H3BO3和6mg/L Na2MoO4·2H2O，VB1为100mg/L。
通过对栽培糙皮侧耳菌株和转基因糙皮侧耳菌株的棉结杆培养基木质素含量进行 测定，结果发现mnp6和vp3过表达转化菌株和未转化菌株相比木质素降解率分别提高了8.62％和7.46％，如图11所示，直接揭示了这两种木质素降解酶基因对木质素降解 有一定的影响，为进一步地探明木质素降解机制奠定了理论基础，对提高秸秆资源利用 率起到了很好的指导作用。糙皮侧耳测定木质素含量采用F800纤维测定仪。
表2木质素降解率
WT表示未转化菌株。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽农业大学
<120> 一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用
<130> 1
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SEQ ID NO:1
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> Pabellonia incrassata
<400> 1
tcgaggctac ctcgctactg tctttgctcc attcttctcc aaaactggag gagattgaag 60
tccacggtgt ttttcaagat agcaccatag atgtctccta gttgccccag attcggcttc 120
ccaacctctc aaatatatat atcggtgcca atgccctggg agtctctgcc attctagccc 180
acatagaatg tccacttgat gcaaaggtca cgttcgaaaa tacagaccct caccacggag 240
agcctgacct ttcaggtttg gtcacaatat gtggtcgcct cgccaaaacc ggctctcccc 300
cacttgactt cgttctactc gacggctcgc ttgacggcgg attccaattg aacgttcggg 360
gtggcgacag aacatatatt ctcctcagat tacgcgtaga agaacgctat taccctatgc 420
tcggcttagc ggtgtgctca gccttgccaa tcaaacataa ctccaccttg atgatggaag 480
ggtttggaga gatgacacag acggaatggg cgaacgcgtt ccgcagctgg gaacgagtgc 540
ataccctcca tctggttgac atcaatatag gtgccctcat ggctctgatg aaaccatcat 600
ccgaggaccc cccattgtct aaactgcaca ccctttatct ctctttctgc catttgtcaa 660
gggggcgtgg tagcaacgat agatcagagt ttcacattgt caagaatctc cttgaggaac 720
gcaagcacct cggcattccg ataacgaagg tctcaatcaa agactgcacc attctcaaag 780
aagacgttga tgacctcatg gagttggcgg atattgattg ggactacgac gatggaggct 840
cgcctgagga agcgtactgg accgactcta gctttggatc agacatgtaa actgattctt 900
ccgatgaaat tattgccata cctatggtga ccataagtca cgatgttggt ctttgattgt 960
gtttaccatg gactttacag aatcaatctc aagccatgat gcatgaaagt tcgtcgaaac 1020
cctcgaaagt tgtcttgtcg tacatttcaa agtcccacac ttgtactacc ttgtgcggcc 1080
atcattgcag cgatcgtctc ttgagctcaa tctagtcgaa ggacgaacac atcacatgcg 1140
gcactgcagc ctattgaggg acggaccgca cggaccgctc agcccgagtc cctgatatcc 1200
gcactgtgaa ttcactgaaa atcaaatgtg tcttctatcg tagttgggat tgttgaattt 1260
ctcaactcga tggtccagaa taagttgtag tgtagaagag aaccatcagg gatcatgaac 1320
gtgcgcaaag gaaatatttg ggattggacg cctaatccaa tacccctatg ctcgaaagtc 1380
ccggtccgct tgattccaat tgacaccaag gttgattcaa tgcattccac agatttatcc 1440
gactcctcct ttgattacaa ccgccacctc gacggctgga actaatacaa cggccttgaa 1500
SEQ ID NO:2
<210> 2
<211> 1083
<212> DNA
<213> Pabellonia incrassata
<400> 2
atgtctttca aggctctatt cactttcgcc actctcgctg tagcggccct cgctgctcct 60
agccacacca agcgcgccac atgctcgggc ggcaggacca ctgctcatgc atcctgctgc 120
atctggttcg acgttttgga cgacattcaa gagaacctct ttgatggtgg cgagtgcggt 180
gaggaagtcc acgagtctct ccgtttgacc ttccacgacg ctattggatt ctcccctaag 240
ctcttcctcc aaggcaaatt tggtggtctc ggcgctgatg gttccatcat ggcccactct 300
gagatcgaaa ccgccttccc cgccaatctt ggtgtcgatg agatcattga agctcaaagg 360
ccgtttgcca tcaagcacaa agtatctttc ggtgacttca tccaattcgc tggtgccgtc 420
ggtgttagca actgcgctgg tggtgctcgc attcctttcc acgccggacg tctcaacgtc 480
tctttgccct cgccagacct cctcgtcccc gaacctagcg actctgttga caccatcttg 540
gcccgcatgg gcgatgctgg cttctcccct aacgaagtag ttgatttgct catctctcac 600
accgtcgctg ctcaggacaa cgttgacccc actattcccg gaactccctt cgactctact 660
cccaacagct tcgacgctca gttcttcgtc gagactctcc tcaagggaag catcaccccc 720
ggaaacggaa ctaaccgagg ccaatccctc tctcccatcc cgggcgagtt ccgccttact 780
tctgacttcc ttcttgcccg cgatgcccgc actgcttgcg aatggcaatc cttcatcacc 840
gaccacgcct ccatggtctc gaaattcgag aaggtcatgg acaagatgtc cactctaggc 900
caaatccgag ctctcctcac tgactgctcc gacgttattc ctgtgcccaa ggtcgccctc 960
accaagaccc ctaccctccc agctgggcgc agcttggctg atattgaggc cgcatgccgc 1020
gccacgccat tcccagccct cactgctgac cctggcccag ttaccaccgt tcctcctgtg 1080
taa 1083
SEQ ID NO:3
<210> 3
<211> 360
<212> PRT
<213> Pabellonia incrassata
<400> 3
Met Ser Phe Lys Ala Leu Phe Thr Phe Ala Thr Leu Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Pro Ser His Thr Lys Arg Ala Thr Cys Ser Gly Gly Arg
20 25 30
Thr Thr Ala His Ala Ser Cys Cys Ile Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp
35 40 45
Ile Gln Glu Asn Leu Phe Asp Gly Gly Glu Cys Gly Glu Glu Val His
50 55 60
Glu Ser Leu Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Lys
65 70 75 80
Leu Phe Leu Gln Gly Lys Phe Gly Gly Leu Gly Ala Asp Gly Ser Ile
85 90 95
Met Ala His Ser Glu Ile Glu Thr Ala Phe Pro Ala Asn Leu Gly Val
100 105 110
Asp Glu Ile Ile Glu Ala Gln Arg Pro Phe Ala Ile Lys His Lys Val
115 120 125
Ser Phe Gly Asp Phe Ile Gln Phe Ala Gly Ala Val Gly Val Ser Asn
130 135 140
Cys Ala Gly Gly Ala Arg Ile Pro Phe His Ala Gly Arg Leu Asn Val
145 150 155 160
Ser Leu Pro Ser Pro Asp Leu Leu Val Pro Glu Pro Ser Asp Ser Val
165 170 175
Asp Thr Ile Leu Ala Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asn Glu
180 185 190
Val Val Asp Leu Leu Ile Ser His Thr Val Ala Ala Gln Asp Asn Val
195 200 205
Asp Pro Thr Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Asn Ser Phe
210 215 220
Asp Ala Gln Phe Phe Val Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ser Ile Thr Pro
225 230 235 240
Gly Asn Gly Thr Asn Arg Gly Gln Ser Leu Ser Pro Ile Pro Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Leu Thr Ser Asp Phe Leu Leu Ala Arg Asp Ala Arg Thr Ala
260 265 270
Cys Glu Trp Gln Ser Phe Ile Thr Asp His Ala Ser Met Val Ser Lys
275 280 285
Phe Glu Lys Val Met Asp Lys Met Ser Thr Leu Gly Gln Ile Arg Ala
290 295 300
Leu Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Val Pro Lys Val Ala Leu
305 310 315 320
Thr Lys Thr Pro Thr Leu Pro Ala Gly Arg Ser Leu Ala Asp Ile Glu
325 330 335
Ala Ala Cys Arg Ala Thr Pro Phe Pro Ala Leu Thr Ala Asp Pro Gly
340 345 350
Pro Val Thr Thr Val Pro Pro Val
355 360
SEQ ID NO:4
<210> 4
<211> 1083
<212> DNA
<213> Pabellonia incrassata
<400> 4
atgaccttcg cctctctttc cgctcttgtt cttgcattag gcgcggctct ccaggccgtc 60
aatgccgtaa ctttgcccca gaagcgcgcg acttgcgctg gcggtcaagt cactgccaac 120
gctgcttgct gtgtcctctt cccaatcttg gaagaccttc agcagaacct cttcgacggc 180
ggcgaatgcg gtgaagaagt gcacgaatcc cttcgcctaa cattccacga cgccattgga 240
ttctctccca ccaaaggtgg aggcggcgct gatggttccg tccttacgtt ctctgacccg 300
gaagtcaact tcccggctaa cctcggtatt gacgaaattg tcgaggcgca gaaaccattc 360
cttgcaagac acaacatatc cgcaggtgac ctagtccaat tcgctggcgc attaggtgtt 420
tccaactgcc cgggtgcccc gcgaatcccg ttcttcttgg gtcgcccccc agccaaggcg 480
gcgtctccaa ttggcttggt tcccgaaccg ttcgataccg taacagacat tctagacaga 540
atgggcgacg ctggatttgc tgccgttgag gtcgtctggc tcctttcttc acacacaatc 600
gctgcagccg accatgtaga tgaaagtatt cctggaaccc cattcgactc gacgccgtcc 660
atcttcgact ctcaattctt catcgagacc caactccgtg gaacttcctt cccaggatcc 720
ggtggtaacc acggtgaggt tgagtcgcct ttggcgggtg aaatcaggct tcaatccgac 780
cacttgcttg cccgagactc caggacttcc tgtgaatggc agtccatggt tgacaatatg 840
ccgaagatcc agaaccgttt cgcagcgacc atgcttaaga tgtcgctgct cggacagaac 900
caggccgact tgatcgactg ttctgatgtc atccccacgc cccctgctct cgtaggcaag 960
gcacatctcc ccgccggaaa ggtccagtcc gacgtcgaac aagcctgtgc caccaccccc 1020
ttcccagcta tcgctgccga ccctggtcca gtcaccgctg tccctcccgt ccccccttcg 1080
taa 1083
SEQ ID NO:5
<210> 5
<211> 360
<212> PRT
<213> Pabellonia incrassata
<400> 5
Met Thr Phe Ala Ser Leu Ser Ala Leu Val Leu Ala Leu Gly Ala Ala
1 5 10 15
Leu Gln Ala Val Asn Ala Val Thr Leu Pro Gln Lys Arg Ala Thr Cys
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Val Thr Ala Asn Ala Ala Cys Cys Val Leu Phe Pro
35 40 45
Ile Leu Glu Asp Leu Gln Gln Asn Leu Phe Asp Gly Gly Glu Cys Gly
50 55 60
Glu Glu Val His Glu Ser Leu Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile Gly
65 70 75 80
Phe Ser Pro Thr Lys Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Val Leu Thr
85 90 95
Phe Ser Asp Pro Glu Val Asn Phe Pro Ala Asn Leu Gly Ile Asp Glu
100 105 110
Ile Val Glu Ala Gln Lys Pro Phe Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Ala
115 120 125
Gly Asp Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Leu Gly Val Ser Asn Cys Pro
130 135 140
Gly Ala Pro Arg Ile Pro Phe Phe Leu Gly Arg Pro Pro Ala Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ser Pro Ile Gly Leu Val Pro Glu Pro Phe Asp Thr Val Thr Asp
165 170 175
Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ala Ala Val Glu Val Val
180 185 190
Trp Leu Leu Ser Ser His Thr Ile Ala Ala Ala Asp His Val Asp Glu
195 200 205
Ser Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ser
210 215 220
Gln Phe Phe Ile Glu Thr Gln Leu Arg Gly Thr Ser Phe Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Asn His Gly Glu Val Glu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Ile Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Asp His Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ser Cys Glu
260 265 270
Trp Gln Ser Met Val Asp Asn Met Pro Lys Ile Gln Asn Arg Phe Ala
275 280 285
Ala Thr Met Leu Lys Met Ser Leu Leu Gly Gln Asn Gln Ala Asp Leu
290 295 300
Ile Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Thr Pro Pro Ala Leu Val Gly Lys
305 310 315 320
Ala His Leu Pro Ala Gly Lys Val Gln Ser Asp Val Glu Gln Ala Cys
325 330 335
Ala Thr Thr Pro Phe Pro Ala Ile Ala Ala Asp Pro Gly Pro Val Thr
340 345 350
Ala Val Pro Pro Val Pro Pro Ser
355 360

Claims (10)

1.一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，其特征在于，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。
2.一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)cDNA反转录，糙皮侧耳菌丝接种到PDA培养基上培养7d扩繁后，将菌丝取出，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用荧光反转录试剂盒反转录成cDNA；
2)引物设计，引物设计采用Primer Premier 5.0完成，设计的引物包括gpd-F、gpd-R、mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R，并进行引物合成；
3)基因片段扩增，根据gpd-F、gpd-R引物对RNA采用PCR扩增技术克隆出gpd启动子基因片段，根据mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R引物对cDNA采用PCR扩增技术克隆出mnp6基因片段和vp3基因片段。
3.根据权利要求2所述的一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因的获取方法，其特征在于，所述引物具体如下：
gpd-F，5'-CCCAAGCTTTCGAGGCTACCTCGCTACTG-3'
gpd-R，5'-CATGCCATGGTTCAAGGCCGTTGTATTAGT-3'
mnp6-F，5'-GAAGATCTGATGTCTTTCAAGGCTCTATTCACTT-3'
mnp6-R，5'-GGACTAGTCACAGGAGGAACGGTGGT-3'
vp3-F，5'-GAAGATCTGATGACCTTCGCCTCTCTTTCC-3'
vp3-R，5'-GGACTAGTCGAAGGGGGGACGGG-3'。
4.一种真菌转化方法，其特征在于，包括糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒电击法转入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法转化糙皮侧耳菌株，具体步骤如下：
1)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态细胞50μl，冰上放置5min，待其融化后，加入1μl重组表达质粒，轻轻混匀，冰浴静置2min；
2)将混合菌液迅速转入无菌预冷电击杯内槽底部，加69μl灭菌去离子水，吸打混匀，避免气泡产生；
3)用吸水纸将电击杯金属侧壁擦干，将电击杯放入电脉冲仪电极间，电转条件设置为2.5kV，25mF，200ohms，电击5ms；
4)取出电击杯，迅速加到含1ml无抗液体LB培养基的1.5ml离心管内，28℃，150r/min，培养6h；
5)4500r/min离心10min后，弃上清800μl,将剩余的200μl重悬菌体后，涂布于相应的抗性平板上，含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性，28℃培养2d，待有单菌落长出后，进行PCR鉴定，保菌；
6)取1mL验证成功的农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基中，含50mg/l Kan+、50mg/lRif+抗性，200r/min，28℃，培养24h,收集菌液，4℃，5000r/min离心10min，去上清后，用等体积IM培养液，IM培养液为LB液体培养基+200μmol/LAS，pH5.5，重新悬浮，测量菌液OD600值，并用IM稀释至OD600＝0.5左右，以IM为对照，然后150r/min，28℃培养6h；
7)将培养好的菌丝块，菌丝块大小9cm×9cm，浸入农杆菌菌液30min，然后转入含有200μmol/LAS的PDA共培养基上，25℃培养3d；
8)取步骤7)中共培养基上的菌丝块接种到筛选培养基上筛选3代，筛选培养基配制为PDA+100mg/L hph+300mg/L Cefotaxime，之后再在PDA不含抗性平板上进行复壮3代。
5.根据权利要求4所述的一种真菌转化方法，其特征在于，所述锰过氧化物酶基因mnp6和vp3重组表达质粒载体的构建方法如下：
1)利用限制性内切酶HindIII和NcoI将pCAMBIA1304载体线性化，利用T4连接酶将gpd基因片段连接到pCAMBIA1304，转化到大肠杆菌DH5α内，构建改造表达载体pCAMBIA1304-Pogpd；
2)将步骤1)中pCAMBIA1304-Pogpd重组质粒利用限制性内切酶BglII和SpeI将pCAMBIA1304-Pogpd载体线性化，将mnp6和vp3分别连接到pCAMBIA1304-Pogpd上，转化到大肠杆菌DH5α内，分别构建重组表达质粒pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6，pCAMBIA1304-Pogpd-vp3，并对重组质粒进行双酶切验证。
6.一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用。
7.根据权利要求6所述的一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：
1)称取5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉花秸秆干粉于广口瓶中，加入22mL合成培养液，用封口膜封好；
2)121℃高温蒸汽灭菌30min；
3)将未转化菌株和转化菌株分别用打孔器取9mm×9mm菌块，接种到棉花秸秆固体筛选培养基上，25℃±1℃条件下培养30d，置于60℃烘干后，利用纤维素测定仪测定培养前后木质素含量，设置3个重复组。
8.根据权利要求7所述的一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，其特征在于，步骤1)中合成培养液为低氮无糖高无机盐培养液，配方具体成分比例如下：酒石酸铵液：大量元素液：微量元素液：VB1液：水＝1：15：15：3：16，其中，酒石酸铵为氮源，浓度为22.0g/L；大量元素液含20g/L KH2PO4、13.8g/LMgSO4·7H2O、1.0g/L CaCl2和0.6g/LNaCl；微量元素液为0.35g/L MnSO4·H2O、60mg/LFeSO4·7H2O、110mg/L CoCl2·6H2O、60mg/L ZnSO4·7H2O、95mg/L CuSO4·5H2O、6mg/LAlK(SO4)2·12H2O、6mg/L H3BO3和6mg/L Na2MoO4·2H2O，VB1为100mg/L。
9.一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳菌株的检测方法，其特征在于，具体检测方法如下：将拟转化的糙皮侧耳菌株子实体置入新鲜配制的200μl GUS染色液中，染色12h，若子实体变蓝，则目的基因插入糙皮侧耳基因组中，不变蓝则未插入，采取未转化的菌株子实体做空白对照，其在GUS染色液中不变蓝，GUS染色液配方为X-gluc 20μl，GUS缓冲液1ml。
10.一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒的构建方法以及采用该重组表达质粒包含来自糙皮侧耳的gpd启动子和GUS报告基因的GUS检测方法在真菌转化和检测中的应用。
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