CN104152390A - 基于木质素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于木质素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码漆酶的核苷酸序列、编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列和编码锰过氧化物酶的核苷酸序列；然后将扩增得到的序列依次连接到共表达载体、将扩增得到的序列连接到重组表达载体，最终得到重组共表达载体和重组表达载体；之后将重组共表达载体与重组表达载体先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。本发明能够应用基因工程手段实现漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶体外的大量表达合成，最终应用于实现木质素的原位快速降解。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于漆酶、木质素过氧化酶和锰过氧化物酶的工程菌及其实现方法。
背景技术
木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、木质素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为l730亿t，所含总能量高达2×1018KJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，涉及众多酶系的参与。
木质纤维素中的木质素是由四种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5‐羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂酚类聚合物。根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(S‐木质素)，由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(G‐木质素)和由对‐羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对‐羟基苯基木质素(H‐木质素)。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素(G)，双子叶植物主要含愈创木基‐紫丁香基木质素(G‐S)，单子叶植物则为愈创木基‐紫丁香基‐对‐羟基苯基木质素(G‐S‐H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、木质素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。
由于木质素的复杂结构，高分子量及高度疏水性，与纤维素与木质素相比，木质素的降解相对较难。木质素降解过程中起主要作用的酶有漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶等。已证实，自然中的细菌、真菌乃至放线菌均具有上述三种木质素降解酶的合成能力。与真核生物相比，原核生物具有生长速度较快，且基因无内含子，具有易克隆、易表达等优势。链霉菌作为土壤中常见的一类细菌(放线菌)，对多数高分子化合物具有较强的分解能力并在碳循环中起至关重要的作用。其中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1经证实具有很强的木质素降解能力。
发明内容
本发明针对现有技术中漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶在灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)内多为诱导表达且表达水平很低的缺陷，提出一种基于木质素代谢 通路关键酶的工程菌及其实现方法，通过全基因组测序分析，从该链霉菌基因组分离到与木质素降解有关的基因序列，其中包括编码漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的基因序列。本发明通过对灰略红链霉菌内相关基因(GC含量70％以上)进行序列优化后进行全基因合成，并将目的基因序列插入到共表达载体中，最终实现木质素降解关键酶的体外共表达。本发明对灰色链霉菌内木质素降解通路的研究、新型木质素降解酶制剂的研发乃至实现木质素的快速降解均具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种木质素代谢通路关键酶的工程菌，该工程菌为通过全基因合成获得的漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的重组过表达菌株。
所述的木质素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。
所述的漆酶的核苷酸序列Lac，如SEQ ID No.1所示，木质素过氧化物酶的核苷酸序列Lip，如SEQ ID No.2所示，锰过氧化物酶的核苷酸序列Mnp，如SEQ ID No.3所示；其中：漆酶的基因序列为900bp，编码299个氨基酸；木质素过氧化物酶的基因序列为1278bp，编码425个氨基酸；锰过氧化物酶的基因序列为2226bp，编码741个氨基酸。
所述的全基因合成是指：通过对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E.coli K12，回避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。
所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。
本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到的pUC57‐Lac、pUC57‐Lip和pUC57‐Mnp载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码漆酶的核苷酸序列Lac、编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列Lip和编码锰过氧化物酶的核苷酸序列Mnp；然后将扩增得到的序列Lac和Lip依次连接到共表达载体pETDuet‐1、将扩增得到的序列Mnp连接到重组表达载体pET‐22b(+)，最终得到重组共表达载体pETDuet‐Lac‐Lip和重组表达载体pET‐22‐Mnp；之后将重组共表达载体pETDuet‐Lac‐Lip与重组表达载体pET‐22‐Mnp先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。
所述的含有酶切位点的引物包括：
Lac‐Nco I‐F:TACCATGGCTACCGCTACCGCTCGTACCGCTCCG
Lac‐BamH I‐R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
Lip‐Nde I‐F:TACATATGGCTGACCCGTCTCTGTCTCAGACCCG
Lip‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCTTCCAGCAGAGCCTGA
Mnp‐Msc I‐F:GATGGCCATGACCGAAAACCACGACGCTATCGTTA
Mnp‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAAACCAGGTCGAAACGGTCCAGGTTCATAACTTTGTC
所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s；30个循环后72℃终延伸3min。
所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
本发明涉及一种木质素代谢通路的工程菌的应用，将其用于木聚糖酶和木糖苷酶的体外高效表达，并最终实现木质素的原位快速降解。
技术效果
现有木聚糖酶和木糖苷酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制了其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的木聚糖酶和木糖苷酶基因序列；在特殊条件下(如高温以及碱性)具有更稳定的生物学活性；本发明通过构建外源表达载体，实现了木聚糖酶和木糖苷酶的体外共表达，并通过在重组蛋白C端添加聚组氨酸标签的方法，保证了纯化蛋白的质量；使用新型大肠杆菌表达宿主，最大程度提高蛋白活性与可溶性。
附图说明
图1为基于JCat预测漆酶基因序列优化前后密码子利用率对比图；
图2为基于JCat预测木质素过氧化物酶基因序列优化前后密码子利用率对比图；
图3为基于JCat预测锰过氧化物酶基因序列优化前后密码子利用率对比图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸秆，保藏编号为CGMCC No.5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32℃培养48h。
上述LB液体培养基组分为：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH6.8‐7.2。在液体培养基中加入15.0‐20.0g/L琼脂即得LB固体培养基。
1)灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)基因组DNA提取：收集2.0mL菌液，12000rpm离心2min。弃上清，收集菌体沉淀，加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μL EDTA溶液(0.5M,pH8.0)，37℃处理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒(TIANGEN)操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因 组DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。
2)灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)基因组测序：确定全基因组鸟枪法(WGS)策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Miseq(2×250bp)平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler v2.8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建contig及scaffold，最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。
3)蛋白编码基因功能预测：采用Glimmer 3.0软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为110bp，其余参数为Glimmer 3.0的默认设置。
4)木质素代谢通路编码基因序列的优化及人工合成：通过JCat在线程序对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E.coli K12，回避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点，基因序列优化前后密码子使用频率对比图如图1和图2所示。全基因合成优化后的基因序列并分别构建到pUC57载体，得到pUC57‐Lac、pUC57‐Lip和pUC57‐Mnp质粒。经过序列优化，基因密码子使用率大幅度提高，更适合在大肠杆菌宿主细胞内进行表达。
实施例2
共表达载体的构建
1)根据优化后核苷酸序列，设计含有酶切位点的PCR引物序列如下：
Lac‐Nco I‐F:TACCATGGCTACCGCTACCGCTCGTACCGCTCCG
Lac‐BamH I‐R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
Lip‐Nde I‐F:TACATATGGCTGACCCGTCTCTGTCTCAGACCCG
Lip‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCTTCCAGCAGAGCCTGA
Mnp‐Msc I‐F:GATGGCCATGACCGAAAACCACGACGCTATCGTTA
Mnp‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAAACCAGGTCGAAACGGTCCAGGTTCATAACTTTGTC
2)以pUC57‐Lac为模板，用含有Nco I和BamH I酶切位点的引物进行PCR扩增扩增获得漆酶基因序列，使用DNA A‐Tailing Kit加A后连接到T‐Vector PMDTM 19‐T(TaKaRa)，并将连接产物转入DH5α大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。若无误，Nco I和BamH I进行双酶切(37℃)，回收漆酶DNA片段Lac。用相同内切酶酶切共表达载体pETDuet‐1并回收载体DNA片段。将Lac与载体片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接(16℃)，将连接产 物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有质粒pETDuet‐Lac阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37℃培养16小时后提取质粒。
以pUC57‐Lip为模板，用含有Nde I和Xho I酶切位点引物进行PCR扩增获得木质素过氧化酶基因序列，加A后连接到PMDTM 19‐T，将连接产物转入DH5α大肠杆菌内。挑选阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用Nde I和Xho I双酶切该质粒，回收木质素过氧化酶DNA片段Lip。相同内切酶处理重组表达载体pETDuet‐Lac并回收载体DNA片段。将Lip与pETDuet‐Lac载体片段混合，T4DNA Ligase过夜连接，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组共表达载体pETDuet‐Lac‐Lip的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒。
以pUC57‐Mnp为模板，用含有Msc I和Xho I酶切位点引物进行PCR扩增获得锰过氧化物酶基因序列，加A后连接到PMDTM 19‐T，将连接产物转入DH5α大肠杆菌内。挑选阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用Msc I和Xho I双酶切该质粒，回收锰过氧化酶DNA片段Mnp。相同内切酶处理重组表达载体pET‐22b(+)并回收载体DNA片段。将Mnp与pET‐22b(+)载体片段混合，T4DNA Ligase过夜连接，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组表达载体pET‐22‐Mnp的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒。
上述PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s；30个循环后72℃终延伸3min。
上述PCR反应使用的DNA聚合酶为Max DNA Polymerase(TaKaRa)。
3)重组共表达菌株的构建：
将上述含有漆酶与木质素过氧化物酶编码基因的共表达载体pETDuet‐Lac‐Lip与含有锰过氧化物酶编码基因的表达载体pET‐22‐Mnp先后转入TransB(DE3)大肠杆菌，最终在同时含有氨苄青霉素(50μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)和四环素(20μg/mL)的LB固体培养基上筛选，获得漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共表达重组菌株。
上述的TransB(DE3)具有以下特征：具有卡那霉素(KanR)和四环素(TetR)抗性，此外，该菌株还包含突变的硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。
Claims (8)
1.一种木质素代谢通路关键酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为通过全基因合成获得的漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因的重组过表达菌株；
所述的木质素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，其中：漆酶的核苷酸序列Lac，如SEQ ID No.1所示，木质素过氧化物酶的核苷酸序列Lip，如SEQ ID No.2所示，锰过氧化物酶的核苷酸序列Mnp，如SEQID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.5706，保藏日期为2012年1月9日。
3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的全基因合成是指：通过对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E.coli K12，回避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。
4.一种根据权利要求1～3中任一所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到的pUC57‐Lac、pUC57‐Lip和pUC57‐Mnp载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码漆酶的核苷酸序列Lac、编码木质素过氧化物酶的核苷酸序列Lip和编码锰过氧化物酶的核苷酸序列Mnp；然后将扩增得到的序列Lac和Lip依次连接到共表达载体pETDuet‐1、将扩增得到的序列Mnp连接到重组表达载体pET‐22b(+)，最终得到重组共表达载体pETDuet‐Lac‐Lip和重组表达载体pET‐22‐Mnp；之后将重组共表达载体pETDuet‐Lac‐Lip与重组表达载体pET‐22‐Mnp先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括：
Lac‐Nco I‐F:TACCATGGCTACCGCTACCGCTCGTACCGCTCCG
Lac‐BamH I‐R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC
Lip‐Nde I‐F:TACATATGGCTGACCCGTCTCTGTCTCAGACCCG
Lip‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGACCTTCCAGCAGAGCCTGA
Mnp‐Msc I‐F:GATGGCCATGACCGAAAACCACGACGCTATCGTTA
Mnp‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAAACCAGGTCGAAACGGTCCAGGTTCATAACTTTGTC。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s；30个循环后72℃终延伸3min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。
8.一种根据上述任一权利要求所述的木质素代谢通路关键酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的体外高效表达，并最终实现木质素的原位快速降解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141119 |