CN107815459B

CN107815459B - 一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用

Info

Publication number: CN107815459B
Application number: CN201711276928.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡永萍; 王燕; 李国庆; 焦小雨; 聂凡; 金青; 林毅
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN107815459A

Abstract

本发明公开了一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3基因，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。本发明将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较未转化菌株分别提高了8.62％和7.46％。

Description

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括两种锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在糙皮侧耳中的过表达、检测及其在木质素降解中的应用。

背景技术

作物秸秆中的主要成分有木质素、纤维素和半纤维素等，其中木质素和半纤维素以共价键形式相结合，使纤维素分子包埋在其中，导致秸秆资源难以被充分利用。利用真菌分泌的胞外氧化酶来降解木质素,不但条件温和、无二次污染，可实现秸秆再利用，而且还可以获得一定经济效益。

现已知白腐真菌分泌的木质素降解酶主要有木质素过氧化物酶(ligninperoxidase， LiP)，锰过氧化物酶(manganese-dependent peroxidase，MnP)，漆酶(laccase，Lac)和多功能过氧化物酶(versatile peroxidase，VP)。

其中，锰过氧化物酶(MnP，EC1.11.1.13)是一种含有血红素的酶蛋白，在含有H₂O₂和Mn^2﹢的催化条件下，MnP能将芳香环类化合物氧化，在木质素降解过程中起着至关重要的作用。此外，VPs是一类特殊的锰过氧化物酶，它能够同时具有LiP和MnP的活性。近年来，随着研究的深入，发现VP既能够氧化Mn²⁺，又能够氧化VA、CIP等，由于它的催化具有多功能性，因此在研究木质素生物降解过程中同样具有极其重要的意义。

糙皮侧耳是一类重要的食用菌，在全球食用菌市场占第二大重要位置，在中国也是一种很受欢迎的食用菌。它不仅可以作为菌类被食用，还可以降解木质素，对生物质利用具有重要作用。但糙皮侧耳本身降解木质素能力较弱，且降解机制尚未阐明。因此，研究木质素降解酶系对指导实际生产和木质素降解具有极其重要的作用。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其获取方法，质粒载体的构建方法，检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳野生型菌株的方法，将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较野生型分别提高了8.62％和7.46％。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ IDNO:1所示,所述糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因的获取方法，包括以下步骤：

1)cDNA反转录，糙皮侧耳菌丝接种到PDA培养基上培养7d扩繁后，将菌丝取出，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用荧光反转录试剂盒反转录成cDNA；

2)引物设计，引物设计采用Primer Premier 5.0完成，设计的引物包括gpd-F、gpd-R、 mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R，并进行引物合成；

3)基因片段扩增，根据gpd-F、gpd-R引物对RNA采用PCR扩增技术克隆出gpd 启动子基因片段，根据mnp6-F、mnp6-R、vp3-F、vp3-R引物对cDNA采用PCR扩增技术克隆出mnp6基因片段和vp3基因片段。

Pogpd扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s；58℃退火30s，72℃ 延伸90s；30个PCR循环，最后72℃延伸10min，20℃保温。扩增反应体系为50μl： 31.5μl ddH₂O，5μl Buffer，4μl dNTP，上游引物3μl，下游引物3μl，DNA 3μl，EasyTaq 酶0.5μl。

Pomnp6扩增反应条件:94℃预变性3min，94℃变性30s；54℃退火30s，72℃延伸70s；30个PCR循环，最后72℃延伸10min，20℃保温。扩增反应体系为50μl： 31.5μl dd H₂O，5μl Buffer，4μl dNTP，上游引物3μl，下游引物3μl，cDNA 3μl，EasyTaq 酶0.5μl。

Povp3扩增反应条件:94℃预变性3min，94℃变性30s；59℃退火30s，72℃延伸70s；30个PCR循环，最后72℃延伸10min，20℃保温。扩增反应体系为50μl：31.5 μl ddH₂O，5μl Buffer，4μl dNTP，上游引物3μl，下游引物3μl，cDNA 3μl，EasyTaq 酶0.5μl。

优选地，所述引物具体如下：

gpd-F，5'-CCCAAGCTTTCGAGGCTACCTCGCTACTG-3'

gpd-R，5'-CATGCCATGGTTCAAGGCCGTTGTATTAGT-3'

mnp6-F，5'-GAAGATCTGATGTCTTTCAAGGCTCTATTCACTT-3'

mnp6-R，5'-GGACTAGTCACAGGAGGAACGGTGGT-3'

vp3-F，5'-GAAGATCTGATGACCTTCGCCTCTCTTTCC-3'

vp3-R，5'-GGACTAGTCGAAGGGGGGACGGG-3'。

优选地，一种真菌转化方法，包括糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒电击法转入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法转化糙皮侧耳菌株，具体步骤如下：

1)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态细胞50μl，冰上放置5min，待其融化后，加入 1μl重组表达质粒，轻轻混匀，冰浴静置2min；

2)将混合菌液迅速转入无菌预冷电击杯内槽底部，加69μl灭菌去离子水，吸打混匀，避免气泡产生；

3)用吸水纸将电击杯金属侧壁擦干，将电击杯放入电脉冲仪电极间，电转条件设置为2.5kV，25mF，200ohms，电击5ms；

4)取出电击杯，迅速加到含1ml无抗液体LB培养基的1.5ml离心管内，28℃， 150r/min，培养6h；

5)4500r/min离心10min后，弃上清800μl,将剩余的200μl重悬菌体后，涂布于相应的抗性平板上，含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性，28℃培养2d，待有单菌落长出后，进行PCR鉴定，保菌；

6)取1mL验证成功的农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基中，含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性，200r/min，28℃，培养24h,收集菌液，4℃，5000r/min离心10min，去上清后，用等体积IM培养液，IM培养液为LB液体培养基+200μmol/LAS，pH5.5，重新悬浮，测量菌液OD₆₀₀值，并用IM稀释至OD₆₀₀＝0.5左右，以IM为对照，然后 150r/min，28℃培养6h；

7)将培养好的菌丝块，菌丝块大小9cm×9cm，浸入农杆菌菌液30min，然后转入含有200μmol/LAS的PDA共培养基上，25℃培养3d；

8)取步骤7)中共培养基上的菌丝块接种到筛选培养基上筛选3代，筛选培养基配制为PDA+100mg/L hph+300mg/L Cefotaxime，之后再在PDA不含抗性平板上进行复壮3代。

优选地，一种真菌转化方法，所述锰过氧化物酶基因mnp6和vp3重组表达质粒载体的构建方法如下：

1)利用限制性内切酶HindIII和NcoI将pCAMBIA1304载体线性化，利用T4连接酶将gpd基因片段连接到pCAMBIA1304，转化到大肠杆菌DH5α内，构建改造表达载体pCAMBIA1304-Pogpd；

2)将步骤1)中pCAMBIA1304-Pogpd重组质粒利用限制性内切酶BglII和SpeI 将pCAMBIA1304-Pogpd载体线性化，将mnp6和vp3分别连接到pCAMBIA1304-Pogpd 上，转化到大肠杆菌DH5α内，分别构建重组表达质粒pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6， pCAMBIA1304-Pogpd-vp3，并对重组质粒进行双酶切验证。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，所述应用的具体步骤为：

1)称取5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉花秸秆干粉于广口瓶中，加入 22mL合成培养液，用封口膜封好；

2)121℃高温蒸汽灭菌30min；

3)将野生型和转化菌株分别用打孔器取9mm×9mm菌块，接种到棉花秸秆固体筛选培养基上，25℃±1℃条件下培养30d，置于60℃烘干后，利用纤维素测定仪测定培养前后木质素含量，设置3个重复组。

合成培养液为低氮无糖高无机盐培养液，配方具体成分比例如下：酒石酸铵液：大量元素液：微量元素液：VB₁液：水＝1：15：15：3：16，其中，酒石酸铵为氮源，浓度为22.0g/L；大量元素液含20g/LKH₂PO₄、13.8g/LMgSO₄·7H₂O、1.0g/L CaCl₂和 0.6g/L NaCl；微量元素液为0.35g/L MnSO₄·H₂O、60mg/L FeSO₄·7H₂O、110mg/L CoCl₂·6H₂O、60mg/L ZnSO₄·7H₂O、95mg/L CuSO₄·5H₂O、6mg/LAlK(SO4)₂·12H₂O、 6mg/L H₃BO₃和6mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，VB₁为100mg/L。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳菌株的检测方法如下：将拟转化的糙皮侧耳菌株子实体置入新鲜配制的200μl GUS 染色液中，染色12h，若子实体变蓝，则目的基因插入糙皮侧耳基因组中，不变蓝则未插入，采取未转化的菌株子实体做空白对照，其在GUS染色液中不变蓝，GUS染色液配方为X-gluc 20μl，GUS缓冲液1ml。

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒的构建方法以及采用该重组表达质粒包含来自糙皮侧耳的gpd启动子和GUS报告基因的GUS检测方法在真菌转化和检测中的应用。其他物种菌株的遗传转化未发现相关研究或研究转化成功实验例。

本发明中，采用GUS基因作为报告基因，对转化菌株子实体进行染色分析，若变蓝则为转化菌株，不变蓝则未转化成功；将成功转化的过表达菌株接种到棉花固体培养基上培养30d，测定木质素含量，结果发现Pomnp6和Povp3过表达菌株的木质素降解率较未转化菌株分别提高了8.62％和7.46％。

说明书附图

图1为本发明提出的糙皮侧耳gpd启动子克隆凝胶电泳图分析，图中M为Maker；图中1和2为gpd目的条带。

图2：为本发明提出的糙皮侧耳P.ostreatus mnp6/vp3PCR扩增产物凝胶电泳图分析；其中a为P.ostreatus mnp6，b为P.ostreatus vp3，图中M为Maker,图中1和2为目的条带。

图3：pCAMIBA1304-Pogpd-Povp3和pCAMIBA1304-Pogpd-Pomnp6真核载体构建双酶切验证；M：DL2000Maker；1:重组质粒；2：目的基因；3：空载质粒；4：对照。

图4：真核载体构建示意图。

图5为图4中pCAMBIA1304载体示意图。

图6为图4中pCAMBIA1304-Pogpd示意图。

图7为图4中pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6/vp3示意图。

图8-1、8-2：pCAMIBA1304-Povp3PDA+AS诱导培养3d；图8-3：潮霉素平板筛选重组菌株T3代。

图9：糙皮侧耳抗性筛选T3代后，PDA复壮T3代后GUS染色分析；A:子实体原基B:子实体分化期C:子实体幼菇D：野生型。

图10：转基因菌株复壮T3代后PCR鉴定；M：DL5000/2000Maker；+：重组质粒； —：阴性对照；WT：野生型；T1-T5：转化菌株。

图11：野生型和转基因菌株对棉结杆的木质素降解率；CK：阴性对照；WT：野生型；Pogpd:Pomnp6/Povp3：转化菌株；**P<0.01差异极显著；*P<0.05差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因，包括糙皮侧耳gpd启动子，其DNA序列如SEQ IDNO:1所示,所示糙皮侧耳锰过氧化物酶基因包括mnp6和vp3，其DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示，mnp6的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：3所示，vp3的蛋白质氨基酸序列如Seq ID NO：5所示。

实施例2

糙皮侧耳选择现有商业化菌株均可。

糙皮侧耳菌丝总RNA的提取：

将糙皮侧耳菌丝接种到PDA培养基上培养7d扩繁后，将菌丝取出，利用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京全式金生物公司)提取总RNA，然后反转录成cDNA，反转录采用荧光反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(北京全式金生物公司)；

引物设计，实验中所涉及到的引物利用Primer Premier 5.0设计完成，并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成，具体引物序列见下表1。

表1引物序列表

引物名称	引物序列
		gpd-F	CCCAAGCTTTCGAGGCTACCTCGCTACTG
gpd-R	CATGCCATGGTTCAAGGCCGTTGTATTAGT
		mnp6-F	GAAGATCTGATGTCTTTCAAGGCTCTATTCACTT
mnp6-R	GGACTAGTCACAGGAGGAACGGTGGT
		vp3-F	GAAGATCTGATGACCTTCGCCTCTCTTTCC
vp3-R	GGACTAGTCGAAGGGGGGACGGG
		gus-F	GTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGA
gus-R	TTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTCA

利用PCR扩增技术从糙皮侧耳RNA里扩增糙皮侧耳gpd启动子片段(图1为gpd 启动子片段凝胶电泳图)，并从糙皮侧耳cDNA中克隆mnp6和vp3基因片段(图2为 mnp6和vp3基因片段凝胶电泳图)。

实施例3

mnp6基因和vp3基因重组表达质粒载体的构建方法如下：

1)利用限制性内切酶HindIII和NcoI将pCAMBIA1304载体线性化，利用T4连接酶将gpd连接到pCAMBIA1304，转化大肠杆菌DH5α，构建改造表达载体 pCAMBIA1304-Pogpd；

2)将上述pCAMBIA1304-Pogpd重组质粒利用限制性内切酶BglII和SpeI将pCAMBIA1304-Pogpd载体线性化，将mnp6和vp3连接到pCAMBIA1304-Pogpd上，转化大肠杆菌DH5α，分别构建重组表达质粒pCAMBIA1304-Pogpd-mnp6， pCAMBIA1304-Pogpd-vp3，并对重组质粒进行双酶切验证，结果如图3所示，载体构建示意图如图4所示。

实施例4

一种真菌转化方法，包括糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3的重组表达质粒电击法转入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法转化糙皮侧耳菌株，具体步骤如下：

4)取出电击杯，迅速加到含1ml无抗液体LB培养基的1.5ml离心管，28℃，150 r/min，培养6h；

5)4500r/min离心10min后，弃上清800μl,将剩余的200μl重悬菌体后，涂布于相应的抗性平板上(含50mg/l Kan+、50mg/l Rif+抗性)，28℃培养2d，待有单菌落长出后，进行PCR鉴定，保菌；

7)将培养好的菌丝块，菌丝块大小9cm×9cm，浸入农杆菌菌液30min，然后转入含有200μmol/LAS的PDA共培养基上，25℃培养3d，结果如图8-1、8-2所示。

8)取上述共培养基上的菌丝块接种到筛选培养基上筛选3代，筛选培养基配制为PDA+100mg/Lhph+300mg/L Cefotaxime，之后再在PDA不含抗性平板上进行复壮3代。

实施例5

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在检测重组表达质粒是否插入糙皮侧耳菌株的检测方法如下：将拟转化的糙皮侧耳菌株子实体置入新鲜配制的200μl GUS 染色液中，染色12h，若子实体变蓝，则目的基因插入糙皮侧耳基因组中，不变蓝则未插入，采取未转化的菌株子实体做空白对照，其在GUS染色液中不变蓝，GUS染色液配方为X-gluc 20μl，GUS缓冲液1ml。值得注意的是，GUS染色法检验必须采用子实体，而对菌丝体染色则表现出不稳定性。图9A-C图为转基因菌株子实体原基、分化期和幼菇的GUS染色结果，均变蓝色，图9D为野生型菌株，未被染蓝。

进一步验证目的基因是否插入，利用GUS基因进行PCR验证，结果证明mnp6和 vp3均已插入到糙皮侧耳基因组中，如图7所示。

实施例6

一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，所示应用的具体步骤为：

2)121℃高温蒸汽灭菌30min；

通过对栽培糙皮侧耳菌株和转基因糙皮侧耳菌株的棉结杆培养基木质素含量进行测定，结果发现mnp6和vp3过表达转化菌株和未转化菌株相比木质素降解率分别提高了8.62％和7.46％，如图11所示，直接揭示了这两种木质素降解酶基因对木质素降解有一定的影响，为进一步地探明木质素降解机制奠定了理论基础，对提高秸秆资源利用率起到了很好的指导作用。糙皮侧耳测定木质素含量采用F800纤维测定仪。

表2木质素降解率

WT表示未转化菌株。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

SEQ ID NO:1

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> Pabellonia incrassata

<400> 1

tcgaggctac ctcgctactg tctttgctcc attcttctcc aaaactggag gagattgaag 60

tccacggtgt ttttcaagat agcaccatag atgtctccta gttgccccag attcggcttc 120

ccaacctctc aaatatatat atcggtgcca atgccctggg agtctctgcc attctagccc 180

acatagaatg tccacttgat gcaaaggtca cgttcgaaaa tacagaccct caccacggag 240

agcctgacct ttcaggtttg gtcacaatat gtggtcgcct cgccaaaacc ggctctcccc 300

cacttgactt cgttctactc gacggctcgc ttgacggcgg attccaattg aacgttcggg 360

gtggcgacag aacatatatt ctcctcagat tacgcgtaga agaacgctat taccctatgc 420

tcggcttagc ggtgtgctca gccttgccaa tcaaacataa ctccaccttg atgatggaag 480

ggtttggaga gatgacacag acggaatggg cgaacgcgtt ccgcagctgg gaacgagtgc 540

ataccctcca tctggttgac atcaatatag gtgccctcat ggctctgatg aaaccatcat 600

ccgaggaccc cccattgtct aaactgcaca ccctttatct ctctttctgc catttgtcaa 660

gggggcgtgg tagcaacgat agatcagagt ttcacattgt caagaatctc cttgaggaac 720

gcaagcacct cggcattccg ataacgaagg tctcaatcaa agactgcacc attctcaaag 780

aagacgttga tgacctcatg gagttggcgg atattgattg ggactacgac gatggaggct 840

cgcctgagga agcgtactgg accgactcta gctttggatc agacatgtaa actgattctt 900

ccgatgaaat tattgccata cctatggtga ccataagtca cgatgttggt ctttgattgt 960

gtttaccatg gactttacag aatcaatctc aagccatgat gcatgaaagt tcgtcgaaac 1020

cctcgaaagt tgtcttgtcg tacatttcaa agtcccacac ttgtactacc ttgtgcggcc 1080

atcattgcag cgatcgtctc ttgagctcaa tctagtcgaa ggacgaacac atcacatgcg 1140

gcactgcagc ctattgaggg acggaccgca cggaccgctc agcccgagtc cctgatatcc 1200

gcactgtgaa ttcactgaaa atcaaatgtg tcttctatcg tagttgggat tgttgaattt 1260

ctcaactcga tggtccagaa taagttgtag tgtagaagag aaccatcagg gatcatgaac 1320

gtgcgcaaag gaaatatttg ggattggacg cctaatccaa tacccctatg ctcgaaagtc 1380

ccggtccgct tgattccaat tgacaccaag gttgattcaa tgcattccac agatttatcc 1440

gactcctcct ttgattacaa ccgccacctc gacggctgga actaatacaa cggccttgaa 1500

SEQ ID NO:2

<210> 2

<211> 1083

<212> DNA

<213> Pabellonia incrassata

<400> 2

atgtctttca aggctctatt cactttcgcc actctcgctg tagcggccct cgctgctcct 60

agccacacca agcgcgccac atgctcgggc ggcaggacca ctgctcatgc atcctgctgc 120

atctggttcg acgttttgga cgacattcaa gagaacctct ttgatggtgg cgagtgcggt 180

gaggaagtcc acgagtctct ccgtttgacc ttccacgacg ctattggatt ctcccctaag 240

ctcttcctcc aaggcaaatt tggtggtctc ggcgctgatg gttccatcat ggcccactct 300

gagatcgaaa ccgccttccc cgccaatctt ggtgtcgatg agatcattga agctcaaagg 360

ccgtttgcca tcaagcacaa agtatctttc ggtgacttca tccaattcgc tggtgccgtc 420

ggtgttagca actgcgctgg tggtgctcgc attcctttcc acgccggacg tctcaacgtc 480

tctttgccct cgccagacct cctcgtcccc gaacctagcg actctgttga caccatcttg 540

gcccgcatgg gcgatgctgg cttctcccct aacgaagtag ttgatttgct catctctcac 600

accgtcgctg ctcaggacaa cgttgacccc actattcccg gaactccctt cgactctact 660

cccaacagct tcgacgctca gttcttcgtc gagactctcc tcaagggaag catcaccccc 720

ggaaacggaa ctaaccgagg ccaatccctc tctcccatcc cgggcgagtt ccgccttact 780

tctgacttcc ttcttgcccg cgatgcccgc actgcttgcg aatggcaatc cttcatcacc 840

gaccacgcct ccatggtctc gaaattcgag aaggtcatgg acaagatgtc cactctaggc 900

caaatccgag ctctcctcac tgactgctcc gacgttattc ctgtgcccaa ggtcgccctc 960

accaagaccc ctaccctccc agctgggcgc agcttggctg atattgaggc cgcatgccgc 1020

gccacgccat tcccagccct cactgctgac cctggcccag ttaccaccgt tcctcctgtg 1080

taa 1083

SEQ ID NO:3

<210> 3

<211> 360

<212> PRT

<213> Pabellonia incrassata

<400> 3

Met Ser Phe Lys Ala Leu Phe Thr Phe Ala Thr Leu Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ala Pro Ser His Thr Lys Arg Ala Thr Cys Ser Gly Gly Arg

20 25 30

Thr Thr Ala His Ala Ser Cys Cys Ile Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp

35 40 45

Ile Gln Glu Asn Leu Phe Asp Gly Gly Glu Cys Gly Glu Glu Val His

50 55 60

Glu Ser Leu Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Lys

65 70 75 80

Leu Phe Leu Gln Gly Lys Phe Gly Gly Leu Gly Ala Asp Gly Ser Ile

85 90 95

Met Ala His Ser Glu Ile Glu Thr Ala Phe Pro Ala Asn Leu Gly Val

100 105 110

Asp Glu Ile Ile Glu Ala Gln Arg Pro Phe Ala Ile Lys His Lys Val

115 120 125

Ser Phe Gly Asp Phe Ile Gln Phe Ala Gly Ala Val Gly Val Ser Asn

130 135 140

Cys Ala Gly Gly Ala Arg Ile Pro Phe His Ala Gly Arg Leu Asn Val

145 150 155 160

Ser Leu Pro Ser Pro Asp Leu Leu Val Pro Glu Pro Ser Asp Ser Val

165 170 175

Asp Thr Ile Leu Ala Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asn Glu

180 185 190

Val Val Asp Leu Leu Ile Ser His Thr Val Ala Ala Gln Asp Asn Val

195 200 205

Asp Pro Thr Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Asn Ser Phe

210 215 220

Asp Ala Gln Phe Phe Val Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ser Ile Thr Pro

225 230 235 240

Gly Asn Gly Thr Asn Arg Gly Gln Ser Leu Ser Pro Ile Pro Gly Glu

245 250 255

Phe Arg Leu Thr Ser Asp Phe Leu Leu Ala Arg Asp Ala Arg Thr Ala

260 265 270

Cys Glu Trp Gln Ser Phe Ile Thr Asp His Ala Ser Met Val Ser Lys

275 280 285

Phe Glu Lys Val Met Asp Lys Met Ser Thr Leu Gly Gln Ile Arg Ala

290 295 300

Leu Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Val Pro Lys Val Ala Leu

305 310 315 320

Thr Lys Thr Pro Thr Leu Pro Ala Gly Arg Ser Leu Ala Asp Ile Glu

325 330 335

Ala Ala Cys Arg Ala Thr Pro Phe Pro Ala Leu Thr Ala Asp Pro Gly

340 345 350

Pro Val Thr Thr Val Pro Pro Val

355 360

SEQ ID NO:4

<210> 4

<211> 1083

<212> DNA

<213> Pabellonia incrassata

<400> 4

atgaccttcg cctctctttc cgctcttgtt cttgcattag gcgcggctct ccaggccgtc 60

aatgccgtaa ctttgcccca gaagcgcgcg acttgcgctg gcggtcaagt cactgccaac 120

gctgcttgct gtgtcctctt cccaatcttg gaagaccttc agcagaacct cttcgacggc 180

ggcgaatgcg gtgaagaagt gcacgaatcc cttcgcctaa cattccacga cgccattgga 240

ttctctccca ccaaaggtgg aggcggcgct gatggttccg tccttacgtt ctctgacccg 300

gaagtcaact tcccggctaa cctcggtatt gacgaaattg tcgaggcgca gaaaccattc 360

cttgcaagac acaacatatc cgcaggtgac ctagtccaat tcgctggcgc attaggtgtt 420

tccaactgcc cgggtgcccc gcgaatcccg ttcttcttgg gtcgcccccc agccaaggcg 480

gcgtctccaa ttggcttggt tcccgaaccg ttcgataccg taacagacat tctagacaga 540

atgggcgacg ctggatttgc tgccgttgag gtcgtctggc tcctttcttc acacacaatc 600

gctgcagccg accatgtaga tgaaagtatt cctggaaccc cattcgactc gacgccgtcc 660

atcttcgact ctcaattctt catcgagacc caactccgtg gaacttcctt cccaggatcc 720

ggtggtaacc acggtgaggt tgagtcgcct ttggcgggtg aaatcaggct tcaatccgac 780

cacttgcttg cccgagactc caggacttcc tgtgaatggc agtccatggt tgacaatatg 840

ccgaagatcc agaaccgttt cgcagcgacc atgcttaaga tgtcgctgct cggacagaac 900

caggccgact tgatcgactg ttctgatgtc atccccacgc cccctgctct cgtaggcaag 960

gcacatctcc ccgccggaaa ggtccagtcc gacgtcgaac aagcctgtgc caccaccccc 1020

ttcccagcta tcgctgccga ccctggtcca gtcaccgctg tccctcccgt ccccccttcg 1080

taa 1083

SEQ ID NO:5

<210> 5

<211> 360

<212> PRT

<213> Pabellonia incrassata

<400> 5

Met Thr Phe Ala Ser Leu Ser Ala Leu Val Leu Ala Leu Gly Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gln Ala Val Asn Ala Val Thr Leu Pro Gln Lys Arg Ala Thr Cys

20 25 30

Ala Gly Gly Gln Val Thr Ala Asn Ala Ala Cys Cys Val Leu Phe Pro

35 40 45

Ile Leu Glu Asp Leu Gln Gln Asn Leu Phe Asp Gly Gly Glu Cys Gly

50 55 60

Glu Glu Val His Glu Ser Leu Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile Gly

65 70 75 80

Phe Ser Pro Thr Lys Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Val Leu Thr

85 90 95

Phe Ser Asp Pro Glu Val Asn Phe Pro Ala Asn Leu Gly Ile Asp Glu

100 105 110

Ile Val Glu Ala Gln Lys Pro Phe Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Ala

115 120 125

Gly Asp Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Leu Gly Val Ser Asn Cys Pro

130 135 140

Gly Ala Pro Arg Ile Pro Phe Phe Leu Gly Arg Pro Pro Ala Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Pro Ile Gly Leu Val Pro Glu Pro Phe Asp Thr Val Thr Asp

165 170 175

Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ala Ala Val Glu Val Val

180 185 190

Trp Leu Leu Ser Ser His Thr Ile Ala Ala Ala Asp His Val Asp Glu

195 200 205

Ser Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ser

210 215 220

Gln Phe Phe Ile Glu Thr Gln Leu Arg Gly Thr Ser Phe Pro Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Asn His Gly Glu Val Glu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Ile Arg

245 250 255

Leu Gln Ser Asp His Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ser Cys Glu

260 265 270

Trp Gln Ser Met Val Asp Asn Met Pro Lys Ile Gln Asn Arg Phe Ala

275 280 285

Ala Thr Met Leu Lys Met Ser Leu Leu Gly Gln Asn Gln Ala Asp Leu

290 295 300

Ile Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Thr Pro Pro Ala Leu Val Gly Lys

305 310 315 320

Ala His Leu Pro Ala Gly Lys Val Gln Ser Asp Val Glu Gln Ala Cys

325 330 335

Ala Thr Thr Pro Phe Pro Ala Ile Ala Ala Asp Pro Gly Pro Val Thr

340 345 350

Ala Val Pro Pro Val Pro Pro Ser

355 360

Claims

1.一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用,所述应用的具体步骤为：

1)称取5g过60目分样筛、粒径小于0.25mm的棉花秸秆干粉于广口瓶中，加入22mL合成培养液，用封口膜封好；

2)121℃高温蒸汽灭菌30min；

3)将未转化菌株和转化菌株分别用打孔器取9mm×9mm菌块，接种到棉花秸秆固体筛选培养基上，25℃±1℃条件下培养30d，置于60℃烘干后，利用纤维素测定仪测定培养前后木质素含量，设置3个重复组；

所述mnp6和vp3的DNA序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因mnp6和vp3在降解木质素中的应用，其特征在于，步骤1)中合成培养液为低氮无糖高无机盐培养液，配方具体成分比例如下：酒石酸铵液：大量元素液：微量元素液：VB1液：水＝1：15：15：3：16，其中，酒石酸铵为氮源，浓度为22.0g/L；大量元素液含20g/L KH₂PO₄、13.8g/LMgSO₄·7H₂O、1.0g/L CaCl₂和0.6g/LNaCl；微量元素液为0.35g/L MnSO₄·H₂O、60mg/LFeSO4·7H₂O、110mg/L CoCl₂·6H₂O、60mg/L ZnSO₄·7H₂O、95mg/L CuSO₄·5H₂O、6mg/L KAl(SO4)₂·12H₂O、6mg/L H₃BO₃和6mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，VB1为100mg/L。