CN105274114B - 一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子p-c2h201及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子P‑C2H201及其应用。本发明的启动子P‑C2H201为如下1)‑3)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)中所述DNA分子具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。利用本发明的水稻背侧糊粉层中特异表达的启动子可以驱动目的基因的表达，该启动子不仅对于研究糊粉层的发育调控和生产应用具有重要的意义，而且将为提高水稻种子蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等营养成分的含量提供理论指导。

Description

一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子P-C2H201及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子P-C2H201及其应用。

背景技术

启动子是一种能够精确调控基因表达的顺式作用元件，它通常是位于结构基因5’端的DNA序列。高等植物启动子一般由两部分组成：即核心启动子区域和决定基因转录特异性和活性的区域。核心启动子区域是能够实现转录起始的最短启动子片段，包括转录起始点及邻近的TATA框；决定基因转录特异性和活性的区域则是由多个保守序列组成，用于结合特异的反式作用因子以实现基因在特定的组织、发育阶段以及环境条件下表达。由于启动子是调控基因表达的“开关”，所以针对启动子的研究主要集中在如何利用这个“开关”来调节目的基因的表达而实现它在生产和生活中的应用价值。在植物基因工程发展的30年以来，组成型启动子得到了普遍的应用。但是持续、泛在及高效的表达某个目的基因会造成受体植物生长不良或者产生能量的浪费，更甚者产生共抑制的现象。所以组织、器官特异型或诱导型启动子的挖掘对于解决组成型启动子带来的负面问题起着十分重要的作用。

果实和种子是储存营养物质的重要器官，是人们的生产和生活中重要能源的来源。探索果实和种子特异表达的启动子不仅可以改善和提高果实和种子的品质还可以利用这个“生物反应器”来表达所人们所需要的稀有氨基酸、维生素和必需氨基酸。水稻作为重要的粮食作物之一，其种子尤其是胚乳是人们食物的重要来源，挖掘在水稻胚乳中特异表达的启动子有着十分重要的生产意义。水稻胚乳包括淀粉胚乳和糊粉层，淀粉胚乳中累积了大量的淀粉，目前在水稻中已经克隆了很多淀粉胚乳中特异表达的启动子，包括水稻16kDa醇溶蛋白基因启动子；水稻26kDa的球蛋白启动子；过敏蛋白RA5基因Os07g11510的启动子等。糊粉层是胚乳细胞分化过程中形成的累积蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等营养成分位于淀粉胚乳外侧的活细胞，通过糊粉层特异性启动子将外源基因导入糊粉层从而改善稻米品质具有重要的实际意义。因此，寻找具有糊粉层表达特性的启动子或其相关调控序列具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3)与1)中所述DNA分子具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

本发明的第二个目的是提供与上述DNA分子相关的生物材料。

本发明提供的与上述DNA分子相关的生物材料为下述A1)至A19)中的任一种：

A1)含有上述DNA分子的表达盒；

A2)含有上述DNA分子的重组载体；

A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；

A4)含有上述DNA分子的重组微生物；

A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；

A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有上述DNA分子的转基因植物细胞系；

A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有上述DNA分子的转基因植物组织；

A13)含有A1)所述表达盒的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述重组载体的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有上述DNA分子的转基因植物器官；

A17)含有A1)所述表达盒的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述重组载体的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官。

本发明的第三个目的是提供扩增上述DNA片段的引物对。

本发明提供的引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。

本发明的第四个目的是提供上述DNA片段的新用途。

本发明提供了上述DNA片段在启动目的基因在植物中表达中的应用。

上述应用中，所述植物为植物的种子。

上述应用中，所述种子为种子的糊粉层。

上述应用中，所述糊粉层为背侧糊粉层。

上述应用中，所述基因为GUS基因。

上述应用中，所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

本发明还提供了上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用。

上述应用中，所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

上述背侧糊粉层的范围是珠心凸下方多余一层的糊粉层细胞。

水稻的糊粉层细胞在靠近背侧维管束部分是3-4层细胞，在侧面和腹侧则是单层细胞，这是不同于大麦和玉米的单层糊粉层细胞，这预示着水稻背侧糊粉层细胞和其他部位的糊粉层细胞在细胞分化和功能上有着不同之处。本发明分离和鉴定了一种新的在水稻种子背侧糊粉层中特异表达的启动子P-C2H201，利用在水稻种子背侧糊粉层中特异表达的启动子P-C2H201可以驱动目的基因的表达，该启动子不仅对于研究糊粉层的发育调控和生产应用具有重要的意义，而且将为提高水稻种子蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等营养成分的含量提供理论指导。

附图说明

图1为实时定量PCR检测C2H201基因在水稻不同组织中的表达情况。

图2为pPLV15载体结构图。

图3为T1代转P-C2H201水稻中的GUS基因在水稻不同部位的表达模式。其中，a:叶舌；b:叶片；c,d,e:花序轴，节和节间的横切；f:小花；g:花药和子房；h:愈伤组织；i-n:分别为受精后4天，7天，11天，14天，21天和28天种子的纵切；o-t:分别为受精后4天，7天，11天，14天，21天和28天种子的横切。

图4为半薄切片显示T1代转P-C2H201水稻中的GUS基因在水稻种子背侧糊粉层中表达情况。其中，u:种子背侧，放大20倍；v,w:种子背侧，放大40倍；NP:nucellarprojection珠心凸；AL:aleurone layer糊粉层。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中水稻转化主要培养基的配制如下：

(一)、诱导培养基和继代培养基的配方如表1所示。

表1、诱导培养基和继代培养基

(二)、NB2C共培养基的配制

NB2C共培养基的配方如下：NB2培养基+10g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮(As)+7g/L琼脂，调pH：5.2。

(三)、AAM-As转化培养基的配方如表2所示。

表2、AAM-As转化培养基

(四)、NBS1筛选培养基的配制

NBS1筛选培养基的配制方法：500ml NB1培养基(调pH 5.8)中加入3.5g琼脂，灭菌后当冷却至50℃时加入250μl 50mg/ml的潮霉素Hyg B(终浓度为：25mg/L)和1125μl的TMT100mg/ml(225mg/L)。

(五)、NBS2筛选培养基的配制

NBS2筛选培养基的配制方法：500ml NB1培养基(调pH 5.8)中加入3.5g琼脂，灭菌后当冷却至50℃时加入500μl 50mg/ml的潮霉素Hyg B(终浓度为：50mg/L)和900μl的TMT100mg/ml(180mg/L)。

(六)、RE1分化培养基RE2继代培养基的配方如表3所示。

表3、RE1分化培养基RE2继代培养基

(七)、生根培养基(1/2MS培养基)的配方如表4所示(NAA 0.2mg/ml，也可不加)。

表4、生根培养基

(八)、培养基母液成分的配制

1、N6大量(10×)的配方如表5所示。

表5、N6大量(10×)

2、B5微量(1000×)的配方如表6所示。

表6、B5微量(1000×)

3、B5有机(100×)的配方如表7所示。

表7、B5有机(100×)

4、铁盐(100×)的配方如表8所示。

表8、铁盐(100×)

5、N6钙盐(10×)：CaCl₂ ^.2H₂O 1.66g溶解于100ml水中。

6、肌醇(200×)：4g溶解于200ml(20mg/ml)。

7、2，4－D(1mg/ml)：少量酒精溶解，容量瓶定容(1M NaOH有助于溶解，最好用乙醇溶解)。长期保存会有结晶，用前先在80℃溶解。

8、MS大量(20×)的配方如表9所示。

表9、MS大量(20×)

9、MS微量(1000×)的配方如表10所示。

表10、MS微量(1000×)

10、MS有机：甘氨酸0.4g、Vb1 0.08g、Vb6 0.1g、烟酸(Vb5)0.1g。

11、MS钙盐(100×)：4.4g CaCl₂.2H₂O溶解于100ml水中。

12、激素的配制：

(1)2，4－D(1mg/ml)：先用少量无水乙醇或95％乙醇溶解后，再用水定容。0.1g溶解于100ml水。

(2)6－BA(1mg/ml)：先用1M HCl溶解后再定容，0.1g溶于100ml水。

(3)ZT(玉米素，1mg/ml)先用95％乙醇加热溶解后再用水定容。

(4)KT(激动素，0.5mg/ml)0.05g KT先溶于少量1M HCl，再用水定容至100ml。

(5)NAA(萘乙酸，0.5mg/ml)：0.05g NAA先溶于少量95％乙醇，再用水定容至100ml。

13、AAM-AS大量(10×)的配方如表11所示。

表11、AAM-AS大量(10×)

14、AAM-AS有机(1000×)的配方如表12所示。

表12、AAM-AS有机(1000×)

15、AAM-AS氨基酸(10×)的配方如表13所示。

表13、AAM-AS氨基酸(10×)

16、AS(已酰丁香酮)的配制：Mr：196.2，母液浓度：50mM/L。

17、TMT(特美汀)的配制方法:1.6mg/瓶TMT加14ml灭菌水，完全溶解后过滤除菌并分装至灭菌的EP管中。

下述实施例中的GUS染色液的配方如下：Phosphate buffer(pH 7)0.1M、EDTAoplossing(pH 8)0.01M、K+ferricyanide oplossing 2mM、K+ferrocyanide oplossing2mM、Triton X-100 1μl/ml、X-gluc 0.5μg/μl。

下述实施例中的水稻中花11(Oryza.sativa L.)在文献“倪玉冲，水稻花培新品种—中花11号[J].农业科技通讯.1989(07)，35”中公开过；公众可从中国科学院植物研究所获得。

下述实施例中的表达载体pPLV15(Gene bank号JF909468)在文献“Bert DeRybel，Willy van den Berg，Annemarie S.Lokerse,Che-Yang Liao，Hilda van Mourik,Barbara Mo¨ller,Cristina I.Llavata-Peris,and Dolf Weijers，A Versatile Set ofLigation-Independent Cloning Vectors for Functional Studies in Plants.，Plantphysiology,(2011),156:1292-1299”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得，该载体的结构示意图如图2所示。

下述实施例中的农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)在文献“Hood,Elizabeth E；Gelvin,Stanton B；Melchers,Leo S；Hoekema,Andre，NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.TransgenicResearch,2(4):p.208-218-218(1993)”中公开过.公众可从中国科学院植物研究所获得。

下述实施例中的pSOUP质粒在文献“Hellens RP,Edwards EA,Leyland NR,BeanS,Mullineaux PM,pGreen:a versatile and flexible binary vector forAgrobacterium-mediated transformation.Plant Mol Bio(2000),42:819–832”中公开过；公众可从中国科学院植物研究所获得。

实施例1、启动子的获得

一、水稻种子糊粉层特异性表达基因的筛选

1、cDNA的获得

分别提取水稻中花11的叶片、根、小穗和不同发育时期的水稻种子(受精后4、7、11、14、21天)及手工分离的水稻种子淀粉胚乳、糊粉层(11天的种子)的RNA，反转录合成cDNA。

2、RT-PCR

以步骤1获得的cDNA为模板，采用FP：5’-GGACTACATGAGGATGGGGCTGC-3’和RP：5’-GCCATCGAGGACGACGAGGAGA-3’进行荧光定量PCR，通过荧光定量PCR鉴定水稻C2H201基因(基因号：LOC_Os01g63980)在不同组织及发育时期的表达情况。

结果如图1所示：从图中可以初步确定C2H201基因在水稻种子的糊粉层中特异性表达。

二、水稻种子糊粉层特异性表达基因启动子片段的克隆

以水稻中花11叶片的基因组DNA为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

引物1：5’-TAGTTGGAATGGGTTCGAAGCTAATACTCGATGTTACACAGG-3’；(序列2，其中斜体部分为接头)；

引物2：5’-TTATGGAGTTGGGTTCGAAGTAGTCCTCGATTATACCGATC-3’(序列3，其中斜体部分为接头)。

上述PCR扩增的体系如下：KOD FX buffer:25μl、基因组DNA(ZH11):5μl、dNTP:4μl、Forward primer(2μM):4μl、Reverse primer(2μM):4μl、KOD FX:0.5μl、ddH₂O:7.5μl。

上述PCR扩增程序如下:95℃2分钟，98℃30秒，60℃30秒，68℃延伸(1Kb/分钟)，68℃5分钟，2-4步35个循环。

对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化PCR扩增产物。并对其进行测序。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为2445 bp的C2H201的启动子区域，其中，C2H201的启动子的大小为2407bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将其命名为P-C2H201。

实施例2、启动子的功能验证

一、转P-C2H201水稻的获得

1、重组载体的获得

将上述实施例1获得的PCR产物(P-C2H201)连入表达载体pPLV15，得到重组载体pPLV15-P-C2H201。具体方法如下：

(1)用Hpa Ⅰ酶切pPLV15载体，得到大小为7432 bp的线性化的pPLV15。pPLV15载体的酶切体系(50μl)：pPLV15质粒:1μg、10X HpaⅠbuffer:5μl、HpaⅠ:2μl、ddH₂O补加到50μl；37℃酶切2小时。

(2)用T4 DNA聚合酶酶切实施例1中的PCR产物(P-C2H201)，得到大小为2445 bp的P-C2H201酶切产物；PCR产物的酶切体系如下(20μl)：PCR产物(P-C2H201):200ng、10XT4buffer:2μl、100mM dGTP:2μl、100mM DTT:2μl、BSA(100X):0.2μl、T4 DNA polymerase:0.4μl、ddH₂O:补加到20μl；22℃酶切2小时，75℃变性20分钟。

(3)用T4 DNA聚合酶对线性化的pPLV15进行酶切，得到大小为7432bp的pPLV15酶切产物。线性化的pPLV15的酶切体系(50μl)：线性化pPLV15载体:500ng、10X T4buffer:5μl、100mM dCTP:5μl、100mM DTT:2.5μl、BSA(100X):0.5μl、T4DNA polymerase:1μl，ddH₂O:补加到50μl。22℃酶切2小时，75℃变性20分钟。

(4)连接

将大小为2445 bp的P-C2H201酶切产物(20μl)和大小为7432 bp的pPLV15酶切产物(3μl)在22℃条件下连接2小时，得到连接产物。

将上述连接产物热击转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，得到克隆。经过菌液PCR(引物1和引物2)鉴定得到阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，并对其进行测序。

测序结果表明：该质粒为将序列表中的序列1所示的P-C2H201插入表达载体pPLV15的HpaⅠ酶切位点间(插入的位置为GUS基因的前面)，且保持表达载体pPLV15的其他序列不变得到的载体，将该质粒命名为重组载体pPLV15-P-C2H201。表达载体pPLV15上有GUS基因，但是没有启动子，重组载体pPLV15-P-C2H201上有GUS基因，且GUS基因前有启动子。

2、重组菌的获得

将重组载体pPLV15-P-C2H201电击转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌。提取重组菌的质粒，经过测序，该质粒为pPLV15-P-C2H201，说明含有该质粒的重组菌为阳性，命名为EHA105/pPLV15-P-C2H201。上述转化农杆菌EHA105具体方法如下：

(1)分别取1μl的重组载体pPLV15-P-C2H201和1μl的pSOUP质粒，加入到EHA105农杆菌感受态细胞中，混匀。

(2)冰上孵育30分钟，同时准备电极杯，将电极杯用无水乙醇清洗，并晾干放置冰上备用。

(3)电击:1800伏，6.2秒。

(4)加入1ml YEB液体培养基，28℃温箱或摇床中活化2小时。

(5)涂抗性板：YEB培养基中加入利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的固体培养基。

(6)28℃温箱中培养48小时。

(7)挑取单克隆于加入利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的YEB液体培养基中，28℃摇床中200rpm培养1天。

(8)从中取0.5ml转接到50ml(1/100比例稀释)同样YEB抗性培养基中，同样条件培养到OD₆₀₀＝0.5左右便可进行转化愈伤组织。

3、转P-C2H201水稻的获得及分子鉴定

(1)转P-C2H201水稻的获得

将重组菌EHA105/pPLV15-P-C2H201转化水稻中花11愈伤组织中，得到T₀代转P-C2H201水稻。转化的方法参照文献“Hiei et al.,1994”和文献“Hiei et al.,1997”中的方法，具体步骤如下：

a)种子消毒：饱满、成熟的水稻中花11种子剥去颖壳，置于70％乙醇水溶液中表面消毒10min，在0.1％HgCl水溶液中浸泡消毒10min，无菌水冲洗10次；浸泡16小时后，倒掉多余水分，但不要太干；

b)接种及愈伤组织的诱导：超净台中，在无菌滤纸上切取消毒种子胚，将盾片朝上置于诱导培养基NB2上，每个13*13cm的方皿培养基接种40粒，25℃暗培养4周诱导愈伤的形成；

c)继代：诱导出的愈伤组织转接于继代培养基NB1上，置于25℃的培养箱内，24小时黑暗条件下培养3周(不可超过4周)，浅黄色质地较致密的胚性愈伤组织转移至新的NB1继代培养基上继续培养3周；

d)待转化的愈伤组织预培养：选择生长状态良好的黄白色致密胚性愈伤组织，把愈伤组织切成2mm大小，转移到新的NB1培养基上，25℃再暗培养4天；

e)农杆菌活化培养：将携带转化质粒的农杆菌EHA105划线培养，挑取单菌落于10ml YEB(含Kan 50μg/ml，Rif 25μg/ml)，28℃振荡培养至对数期(OD₆₀₀＝0.8)，从中取0.5ml转接到50ml(1/100比例稀释)同样培养基，同样条件培养到OD₆₀₀＝0.5左右；

f)共培养、转化：将活化好的农杆菌4200g离心10min，倒掉培养基，用等体积的AAM-AS培养基重悬菌体。将预培养4天的愈伤组织块(切成2mm大小)收集到一个小烧杯中，浸入AAM-AS菌液浸染20min，倒掉菌液再用枪吸干菌液，然后将组织块放到铺有4层滤纸的平皿中吹干约30min，最后转移到覆盖一层滤纸的NB2C共培养基上，25℃暗处共培养2天；

g)共培养后农杆菌的去除及筛选培养：将在NB2C培养基上培养的愈伤组织块转移至NBS1筛选培养基上暗培养两周，两周后再转移至NBS2筛选培养基暗培养两代，每代15天；最后得到鲜黄色的潮霉素抗性愈伤组织。

h)分化培养：将抗性愈伤组织转移至预分化培养基RE1上进行分化培养，先25℃暗培养2周，再置光下23℃培养2周，已分化出不定芽的愈伤组织转到分化培养基RE2上光照培养2周，如果状态不好可再在RE2上继代；未分化的愈伤组织块经第二次部分干燥处理及在RE1和RE2上再次预分化和分化后，再生植株获得率可达100％。

i)分化的植株当长至2cm高时，转移至含50mg/L潮霉素的生根培养基。在生根培养基上生根壮苗23℃，12小时光照培养；

j)待根系生长良好，小苗长至8cm时，打开盖炼苗6天。取出组织培养苗转移到土壤中，放到无阳光直射的温室中适应培养，然后移入室外栽培。得到T₀代转P-C2H201水稻。

采用同样的方法将空载体pPLV15导入野生型水稻中，获得T₀代转pPLV15水稻。

(2)转P-C2H201水稻的获得的鉴定

将T₀代转P-C2H201水稻移栽至人工气候室中，30℃/28℃，光照16h/黑暗8h，提取其叶片的基因组DNA，用潮霉素(pPLV15载体上有潮霉素)特异引物(hygB FP-2:CATGTGTATCACTGGCAAACTG；hygB RP-2:GTACTTCTACACAGCCATCGGTC)鉴定外源基因是否存在并整合到基因组上。扩增得到大小为501bp的PCR产物，为阳性T₀代转P-C2H201水稻。

将得到的T₀代转P-C2H201水稻和T₀代转pPLV15的水稻收种并播种下一代，得到T₁代转P-C2H201水稻植株和T₁代转pPLV15的水稻植株，而后用上述同样的方法鉴定T₁代转P-C2H201水稻并确认阳性植株。

二、转P-C2H201水稻GUS染色验证启动子功能

将灌浆期(开花后第4、7、11、14、21、28天)的阳性的T₁代转P-C2H201水稻的种子去掉内外稃片后，分别对种子进行横切或纵切。将横切或纵切好的种子放入丙酮溶液中，丙酮溶液放于冰上预冷，而后抽真空10分钟后将材料放入-20℃冰箱固定1小时。倒掉丙酮，加入用没有加入X-gluc的GUS染色液500μl洗脱两遍，后加入带有X-gluc的GUS染色液，放入37℃培养箱反应1小时。于体视镜下观察是否出现GUS信号并拍照。并以T₁代转pPLV15水稻为对照。

T₁代转P-C2H201水稻的染色结果如图3所示：其中，a:叶舌；b:叶片；c,d,e:花序轴，节和节间的横切；f:小花；g:花药和子房；h:愈伤组织；i-n:分别为受精后4天，7天，11天，14天，21天和28天种子的纵切；o-t:分别为受精后4天，7天，11天，14天，21天和28天种子的横切。从图中可以看出，T₁代转P-C2H201水稻的GUS基因在种子的背侧糊粉层中具有表达活性(蓝色)，而在种子的其他部分不表达。T₁代转pPLV15水稻的GUS基因在任何部分均无表达。

为了进一步确认P-C2H201是否在种子的背侧糊粉层中表达，将经GUS染色的种子进行了半薄切片的观察。具体步骤如下：

1、取材：取经PCR鉴定为阳性的受精后11天的T₁代转P-C2H201水稻种子，去掉内外稃片，而后分别对种子进行横切或纵切。

2、固定：将横切或纵切好的种子放入丙酮溶液中，丙酮溶液放于冰上预冷，而后抽真空10分钟后将材料放入-20℃冰箱固定1小时。

3、GUS染色：倒掉丙酮，加入用没有加入X-gluc的GUS染色液500μl洗脱两遍，后加入带有X-gluc的GUS染色液，放入37℃培养箱反应1小时或过夜。于体视镜下观察是否出现GUS信号，若有信号进行下一步脱水处理。

4、脱水：30％→50％→60％→75％，每步处理2小时，停在75％乙醇中进行拍照，而后再继续脱水75％→80％→90％乙醇，每步处理2小时。

5、包埋：将材料放于100％乙醇中处理2小时，重复两次，后加入乙醇：Technovit7100基本液＝1:1处理过夜，4℃冰箱保存，配置预处理液，每100mlTechnovit7100基本液加入1克Harder I(可4摄氏度保存1个月)，将材料放入预处理液中反应过夜，4℃保存。

6、配置固化液：将预处理液(含有Harder I)加入Harder II，每15ml预处理液加入1毫升Harder II。将材料放入胶囊中，加入固化液(约300μl)，盖好盖子后竖直静置直到其凝固，放置2-3天后切片。

7、切片：用半薄切片机切片，厚度为5μm，而后夹取切片放置于滴有水滴的载玻片上，而后进行45℃烤片2-3小时。

8、PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色观察：57℃烘箱中用0.5％的高碘酸氧化切片30分钟。高碘酸及玻璃缸57℃烘箱中提前预热10分钟，用水龙头中流动的自来水冲洗掉多余的高碘酸，冲洗1分钟，再用去离子水冲洗3-5次，室温条件下用Schiff试剂处理2-3分钟，时间不能太长，否则颜色太深，同样用自来水冲洗后再用去离子水冲洗3-5次，一定要冲洗干净再用30％的甘油封片而后显微镜下观察并拍照。

T₁代转P-C2H201水稻的半薄切片的结果如图4所示：其中，u:种子背侧，放大20倍；v,w:种子背侧，放大40倍；NP:nucellar projection珠心凸；AL:aleurone layer糊粉层。从图中可以看出，T₁代转P-C2H201水稻的GUS基因在种子的背侧糊粉层中具有表达活性(蓝色)，而在种子的其他部分不表达。

上述实验证明：P-C2H201启动子可以驱动目的基因如GUS报告基因在种子的背侧糊粉层特异表达。

Claims (5)

1.DNA片段，为序列表中序列1所示的DNA分子。

2.与权利要求1所述的DNA分子相关的生物材料，为下述A1)至A19)中的任一种：

A1)含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒；

A2)含有权利要求1所述的DNA分子的重组载体；

A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；

A4)含有权利要求1所述的DNA分子的重组微生物；

A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；

A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物细胞系；

A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.扩增权利要求1所述的DNA片段的引物对，其特征在于：所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。

4.权利要求1所述的DNA片段在启动目的基因在水稻种子背侧糊粉层中表达中的应用。

5.权利要求1所述的DNA片段在水稻的遗传育种中的应用。