CN110106200A - 玉米bbm1基因在提高植物遗传转化效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用。本发明首次发现玉米BBM1基因能够促进植物(如玉米)的遗传转化效率，为遗传育种提供宝贵的基因资源。该基因不仅提高易转化玉米品种综31等的遗传转化效率，而且还提高了玉米品种B73等的转化效率，能够有效解决玉米转化基因型限制，拓宽玉米转化的受体品种种类。

Description

玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用。

背景技术

玉米是世界三大粮食作物之一，在世界粮食生产中占有重要地位。转基因作物是未来农业发展方向之一，转基因玉米在改善玉米品质，增加玉米产量，提高玉米抗逆性，减少农药和化肥使用和农药残留方面具有很大的发展前景，因此致力于转基因玉米的研究意义重大，而培育转基因玉米需要高效的玉米遗传转化方法。目前,玉米遗传转化技术日益成熟，但仍然存在基因型限制严重、转化效率偏低等问题，不能满足基因功能研究及新材料创制的需求，迫切需要建立一套高效、稳定、适用基因型广泛的玉米转化体系。

Baby boom(BBM)属于AP2/EREBP家族转录因子，AP2/EREBP家族转录因子含有1-2个由60-70个氨基酸残基组成的保守的AP2/ERE结构域。AP2/EREBP转录因子分为两个亚族，一个是EREBP亚族，具有一个AP2/ERE结构域，主要功能是调节植物对激素(乙烯和ABA等)、病原和胁迫(低温、干旱及高盐)等的应答反应；另一个是AP2亚族，具有2个AP2/ERF结构域，主要调控花、胚珠和种子发育。Horstman等(2017)研究发现Baby boom转录因子可通过激活LEC1-ABI3-FUS3-LEC2调控途径来诱导拟南芥胚状体的发生，BBM、LEC1和LEC2这类转录因子是植物细胞具有全能性的关键基因，过表达其中任何一个基因都可以在没有外源激素刺激下诱导拟南芥小苗形成胚状体。

发明内容

本发明的目的是提供玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用。

本发明中，玉米BBM1基因的CDS序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明中，所述植物包括但不限于玉米、水稻、小麦、高粱。

第二方面，本发明提供一种提高玉米遗传转化效率的方法，将玉米BBM1基因通过质粒导入玉米中或通过基因工程手段整合到玉米染色体上。

优选地，在玉米中过表达BBM1基因，以提高外源或内源目的基因的遗传转化效率。

优选地，将玉米BBM1基因构建到植物双元表达载体上，然后通过农杆菌介导法转化玉米，以提高玉米的遗传转化效率。

优选地，所述植物双元表达载体为pCAMBIA3301。

更优选地，将玉米BBM1基因构建到载体pCAMBIA3301的NcoI和BstEII酶切位点之间。

前述的方法，所述玉米包括玉米自交系综31。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现玉米BBM1基因能够促进植物(如玉米)的遗传转化效率，玉米BBM1基因不仅提高了易转化玉米品种综31等的遗传转化效率，而且还提高了玉米品种B73等的转化效率，能够有效解决玉米转化基因型限制，拓宽了玉米转化的受体品种种类。本发明为植物遗传育种提供宝贵的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中玉米ZmBBM1基因扩增电泳图。其中，M：D2000Plus Marker；1：目的基因ZmBBM1。

图2为本发明实施例2中重组质粒p3301-35S-ZmBBM1结构示意图。

图3为本发明实施例5中转ZmBBM1基因玉米BAR试纸条检测结果。

图4为本发明实施例6中ZmBBM1转化玉米自交系Z31在不同培养阶段的愈伤状态。

图5为本发明实施例6中ZmBBM1基因对玉米自交系Z31转化效率的影响。

图6为本发明实施例7中ZmBBM1转化玉米自交系B73在不同培养阶段的愈伤状态。

图7为本发明实施例7中ZmBBM1基因对玉米自交系B73转化效率的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1玉米ZmBBM1基因的克隆

根据MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)预测玉米ZmBBM1的基因表达模式，分别提取V3、V5期的茎尖分生组织(SAM)、根、授粉后16-20天的胚以及胚乳RNA，反转录成cDNA，以cDNA和基因组DNA作为模板，扩增ZmBBM1基因(图1)，该基因CDS区全长2040bp。扩增体系如下：

引物序列如下(5′-3′)：

BM-F:AGAACACGGGGGACTCTTGACCATGGCTTCAGCGAACAACTGGCTG

BM-R:CGATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCACCCCATGCCGTTGTTGAAAG

PCR反应程序如下：95℃预变性5min；98℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸2min30s，28个循环；68℃延伸10min，16℃保温。

所得PCR产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段(图1)。

实施例2 p3301-35S-ZmBBM1载体的构建

用NcoI和BstEII酶切实施例1制备的目的BBM1片段和pCAMBIA3301植物表达载体，利用PCR产物纯化试剂盒(购自天根生化科技有限公司)按照说明书步骤，分别回收片段。两个片段用Infusion酶连接，构建重组质粒p3301-35S-ZmBBM1(图2)。

连接体系：

50℃条件下连接反应15min。

实施例3重组质粒转入农杆菌LBA4404

重组质粒p3301-35S-ZmBBM1转入农杆菌LBA4404的步骤如下：

(1)取5μL质粒加入到200μL农杆菌感受态细胞中；

(2)冰浴30min；

(3)从冰上取出，迅速置于液氮中速冻5min；

(4)从液氮中取出，在37℃水浴中温育5min；

(5)取出后再放置冰上5min；

(6)加入800μL空白YEB培养基，在28℃摇床200rpm恢复4-5h；

(7)4000rpm常温离心5min；

(8)弃部分上清，余下约200μL上清将沉淀悬浮，涂在含相应抗性的YEB固体培养板上，28℃倒置暗培养36h；

(9)挑取平板上长出的单菌落，接种于含相应抗性的YEB液体培养液中，28℃200rpm振荡培养过夜；以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

实施例4农杆菌转化玉米

挑取单菌落接种到5-10mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡培养8h；再以1:100的比例将震荡培养后的菌液接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡过夜。第二天，将震荡培养过夜的菌液分装到2mL离心管中，于5000rpm、离心5min；用含200μM乙酰丁香酮的侵染培养基重悬，调整OD₆₀₀＝0.3，备用。

将受体材料玉米的未成熟幼胚(1.0-1.2mm)放到含1mL侵染培养基溶液的1.5mL离心管中，1h后用移液器吸去侵染培养基并加入1mL新的侵染培养基，颠倒混匀1min，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培养基溶液，加入0.2mL新的侵染培养基溶液。将装有玉米幼胚的离心管放置在加热器(杭州博日科技有限公司,型号CHB-100)上，45℃热激5min；用移液器吸去侵染培养基溶液，加入1mL含40mg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液，并放置5min；取出用灭菌滤纸吸干，放到添加300mg/L半胱氨酸的共培养培养基上，在23℃黑暗条件下共培养3天。共培养完后的幼胚转移到恢复培养基中，黑暗条件下培养7天。

筛选两轮后，获得抗性愈伤，将此愈伤转移到再生培养基，强光照下使植株再生。培养条件为28℃，光照16h，很快就会有再生小苗出现。再生的幼苗长到3片叶时，可将幼苗移植到生根培养基中，并在室内培养。待幼苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3，体积比)的小花盆中。当幼苗又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。

本实施例中使用的侵染培养基、共培养培养基、再生培养基、生根培养基可参照CN201710090814.2。

实施例5转基因植株检测

取约0.05g左右新鲜幼嫩叶片放在1.5mL的Eppendorf管中，用研磨棒研磨成液体状，向管中加入200μL水。取出Bar蛋白检测条(北京乐士宁科技有限公司货号：AQ014BG)，手持检测条顶端，保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管,插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。1-3分钟内出现质控线。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现(图3)。

实施例6 ZmBBM1基因转化玉米受体材料B73，并提高其遗传转化效率

用农杆菌LBA4404(包含p3301载体)转化玉米自交系Z31，转化效率为3-5％。而转入重组质粒p3301-35S-ZmBBM1后，Z31的转化效率可提高到20.58％。将含重组质粒p3301-35S-ZmBBM1的菌液和含重组质粒p3301-35S-GFP的菌液等体积混合，转化玉米幼胚，共转化的效率也可达13.06％，且愈伤状态和质量也明显好于对照(图4和图5)。

实施例7基因ZmBBM1转化不同玉米受体材料，并提高其遗传转化效率

B73对于农杆菌侵染很不敏感，基本上没有用B73作为转化的受体。用农杆菌LBA4404(包含p3301载体)转化玉米自交系B73，遗传转化效率很低。当将p3301-35S-ZmBBM1载体转化玉米自交系B73时，发现ZmBBM1也能明显促进B73的愈伤发生，统计发现ZmBBM1可将B73的转化效率提高到2.07％，与GFP共转化的效率可达4.41％(图6和图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用

<130> KHP191111790.0

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2040

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atggcttcag cgaacaactg gctgggcttc tcgctctcgg gccaggataa cccgcagcct 60

aaccaggata gctcgcctgc cgccggtatc gacatctccg gcgccagcga cttctatggc 120

ctgcccacgc agcagggctc cgacgggcat ctcggcgtgc cgggcctgcg ggacgatcac 180

gcttcttatg gtatcatgga ggcctacaac agggttcctc aagaaaccca agattggaac 240

atgaggggct tggactacaa cggcggtggc tcggagctct cgatgcttgt ggggtccagc 300

ggcggcggcg ggggcaacgg caagagggcc gtggaagaca gcgagcccaa gctcgaagat 360

ttcctcggcg gcaactcgtt cgtctccgat caagatcagt ccggcggtta cctgttctct 420

ggagtcccga tagccagcag cgccaatagc aacagcggga gcaacaccat ggagctctcc 480

atgatcaaga cctggctacg gaacaaccag gtggcccagc cccagccgcc agctccacat 540

cagccgcagc ctgaggaaat gagcaccgac gccagcggca gcagctttgg atgctcggat 600

tcgatgggaa ggaacagcat ggtggcggct ggtgggagct cgcagagcct ggcgctctcg 660

atgagcacgg gctcgcacct gcccatggtt gtgcccagcg gcgccgccag cggagcggcc 720

tcggagagca catcgtcgga gaacaagcga gcgagcggtg ccatggattc gcccggcagc 780

gcggtagaag ccgtaccgag gaagtccatc gacacgttcg ggcaaaggac ctctatatat 840

cgaggtgtaa caaggcatag atggacaggg cggtatgagg ctcatctatg ggataatagt 900

tgtagaaggg aagggcagag tcgcaagggt aggcaagttt accttggtgg ctatgacaag 960

gaggacaagg cagcaagggc ttatgatttg gcagctctca agtattgggg cactacgaca 1020

acaacaaatt tccctataag caactacgaa aaggagctag aagaaatgaa acatatgact 1080

agacaggagt acattgcata cctaagaaga aatagcagtg gattttctcg tggggcgtca 1140

aagtatcgtg gagtaactag acatcatcag catgggagat ggcaagcaag gatagggaga 1200

gttgcaggaa acaaggatct ctacttgggc acattcagca ccgaggagga ggcggcggag 1260

gcctacgaca tcgccgcgat caagttccgc ggtctcaacg ccgtcaccaa cttcgacatg 1320

agccgctacg acgtgaagag catcctcgag agcagcacac tgcctgtcgg cggtgcggcc 1380

aggcgcctca aggacgccgt ggaccacgtg gaggccggcg ccaccatctg gcgcgccgac 1440

atggacggcg ccgtgatctc ccagctggcc gaagccggga tgggcggcta cgcctcgtac 1500

ggccaccacg gctggccgac catcgcgttc cagcagccgt cgccgctctc cgtccactac 1560

ccgtacggcc agccgtcccg cgggtggtgc aaacccgagc aggacgcggc cgccgccgcg 1620

gcgcacagcc tgcaggacct ccagcagctg cacctcggca gcgcggccca caacttcttc 1680

caggcgtcgt cgagctccac agtctacaac ggcggcgccg gcgccagtgg tgggtaccag 1740

ggcctcggtg gtggcagctc tttcctcatg ccgtcgagca ctgtcgtggc ggcggccgac 1800

caggggcaca gcagcacggc caaccagggg agcacgtgca gctacgggga cgaccaccag 1860

gaggggaagc tcatcggtta cgacgccgcc atggtggcga ccgcagctgg tggagacccg 1920

tacgctgcgg cgaggaacgg gtaccagttc tcgcagggct cgggatccac ggtgagcatc 1980

gcgagggcga acgggtacgc taacaactgg agctctcctt tcaacaacgg catggggtga 2040

Claims (7)

1.玉米BBM1基因在提高植物遗传转化效率中的应用，其特征在于，玉米BBM1基因的CDS序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物选自玉米、水稻、小麦、高粱。

3.一种提高玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，将玉米BBM1基因通过质粒导入玉米中或通过基因工程手段整合到玉米染色体上；

其中，玉米BBM1基因的定义同权利要求1中所述。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将玉米BBM1基因构建到植物双元表达载体上，然后通过农杆菌介导法转化玉米，以提高玉米的遗传转化效率。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物双元表达载体为pCAMBIA3301。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将玉米BBM1基因构建到载体pCAMBIA3301的NcoI和BstEII酶切位点之间。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，所述玉米包括玉米自交系综31。