CN110268973B

CN110268973B - 水稻杂交种的生产方法

Info

Publication number: CN110268973B
Application number: CN201910316052.2A
Authority: CN
Inventors: 宋书锋; 李莉; 王天抗; 李懿星; 邱牡丹; 许娜
Original assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Current assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN110268973A

Abstract

本发明公开了一种水稻杂交种的生产方法，包括：步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；步骤二、将转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，用于生产。本发明打破不育基因和恢复基因的思想禁锢，使得雄性败育稳定彻底，不受环境条件影响，异交结实率高，是进行轮回选择的理想材料，使种质创新流程更加方便。

Description

水稻杂交种的生产方法

技术领域

本发明属于水稻生产技术领域，涉及一种水稻杂交种的生产方法。

背景技术

水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。“三系法”杂交水稻受恢保关系限制对种质资源利用率低以及“两系法”杂交水稻受环境条件影响存在杂交制种安全是影响杂交水稻种植推广面积进一步扩大的重要因素。发明新的育种技术，开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。

一般认为，雄性不育系和恢复系的获得是杂种优势利用的关键。玉米和水稻杂交种生产技术体系都包括稳定的不育系和恢复系。相比较于“三系”“两系”等杂交种生产方法，以去雄为基础的杂交种生产更复杂一些。主要包括人工去雄和化学杀雄。人工去雄存在以下问题：劳动强度大，作业效率低，多次重复作业容易使抽雄人员疲劳。另外人工去雄作业成本高，对水稻商业化杂交种制种来说没有现实意义。化学杀雄成功的关键在于去雄的彻底性以保证杂交种的纯度以及提高异交授粉的效率以增加杂交种的产量。如果化学杀雄期间，天气不好，遇到下雨情况，就会严重影响去雄的效果；相反，化学杀雄期间，天气良好，温湿度适宜，父母本花期相遇且伴有轻微的风速就会促进开花和异花授粉，提高制种的产量。另外一个关键的时间点，就是化学杀雄试剂喷洒所对应的作物发育阶段，要在花药发育最敏感的时期，一般是指花粉母细胞减数分裂时期。在实际生产中，由于不能保证化学试剂喷洒的均匀性以及每株及不同分蘖之间发育时期的差异，即使喷洒多次，化学杀雄的彻底性也并不是很好，制种的纯度不能很好的保证。因此急需一种新的去雄方法，解决水稻等作物的杂交种生产技术瓶颈。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种水稻杂交种的生产方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种水稻杂交种的生产方法，包括：

步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，其中，所述WA352基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达；

步骤二、将所述转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有所述外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，可用于生产。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述线粒体信号肽的碱基序列如SEQID NO:2所示。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述线粒体信号肽的碱基序列和WA352基因序列采用pUDT1序列调控，pUDT1启动子序列的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述外源报告基因由糊粉层特异启动子Ltp2调控表达，所述启动子Ltp2的的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，还包括：如SEQ ID NO:7所示的碱基序列，其包含所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的碱基序列，且两端分别有BglII和XhoI酶切位点。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，步骤一中，将如SEQ ID NO:7所示的碱基序列构建到pCAMBIA1300载体上，得到pCAMBIA1300-WA352表达载体，然后将pCAMBIA1300-WA352表达载体通过农杆菌介导方法侵染水稻愈伤组织转化入野生型水稻的染色体上，以将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述步骤二中，所述恢复系为发育正常的水稻常规品种，为水稻9311、华占或R900，用恢复系的花粉授给不育系后，所产生的杂交种子育性恢复正常，能自交结实，如果该杂交种有优势的话，经过一系列的试验示范程序，待品种审定后，就可用于生产。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，所述外源报告基因为红色荧光标记基因。

优选的是，所述的水稻杂交种的生产方法中，通过PCR方法鉴定转基因T0代植株，PCR方法中采用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过合成生物学方法，利用绒毡层特异表达启动子pUTD1结合线粒体信号肽融合表达细胞质不育基因WA352，使线粒体基因WA352表达盒整合到核基因组上，利用其花粉败育功能实现生物去雄的效果。并连锁表达由糊粉层特异启动子Ltp2调控的荧光报告基因DsRed，利用其标记功能实现非转基因种子与转基因种子的精准色选。以转基因不育材料为母本，以优质恢复系为父本进行杂交，F1种子包含两种，带荧光的不育种子和非转基因的杂交种，通过色选可把两种种子分开，杂交种不含转基因成分，可用于生产。本发明为杂交种的生产提供了新的技术手段，并可推广到其他作物上去。

本发明对杂交种生产技术进行创新的核心是打破不育基因和恢复基因的思想禁锢。通过细胞质不育基因WA352的精准调控，实现生物去雄的效果，利用荧光标记基因可把杂交种和不育种子分开，杂交种可用于生产，整个技术流程简单；在常规育种中，不育种子作为中间材料，雄性败育稳定彻底，不受环境条件影响，异交结实率高，是进行轮回选择的理想材料，使种质创新流程更加方便。本发明所创制的杂交种不含有转基因成分，可以避免现有的GMO(genetic modified organism)可能存在的应用风险，更容易为公众所接受。本发明新的育种技术为生产上作物杂交种生产提供新的思路，为作物杂种优势的利用揭开新的篇章。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中的载体pUC57图谱；

图2为本发明其中一个实施例中植物表达载体pCAMBIA1300图谱

图3为本发明其中一个实施例中生产杂交水稻的流程示意图；

图4为本发明其中一个实施例中PCR鉴定转基因不育株系的流程图；

图5为本发明其中一个实施例中PCR鉴定转基因不育株系的凝胶图；

图6为本发明其中一个实施例中转基因T0代株系的表型图；

图7为本发明其中一个实施例中种子照片：7A转基因株系上收获的杂交种子(脱壳前)，7B为转基因株系上收获的杂交种子(脱壳后)，7C为转基因株系收获的杂交种子中的正常杂交种，7D为转基因株系收获的杂交种子中的带荧光种子，7E为正常杂交种植株花药的碘染结果，7F为带荧光种子植株花药的碘染结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本发明提供一种水稻杂交种的生产方法，包括：

一种水稻杂交种的生产方法，包括：

步骤二、将所述转基因不育株系作为母本，以恢复系作为父本，进行杂交，获得F1代种子，带有所述外源报告基因的F1代种子为不育种子，剩余F1代种子为正常杂交水稻种子，以生产杂交水稻。

本发明构建植物表达载体，利用绒毡层特异表达启动子加上线粒体信号肽调控WA352，把WA352的表达盒整合到核基因组上，然后转录翻译成蛋白，通过信号肽把蛋白定位到线粒体，发挥功能，引起不育，实现生物去雄的效果。然后再以转基因不育株系为母本，以恢复系为父本进行杂交，F1种子包含两种，带外源报告基因的不育种子和非转基因的杂交种，通过色选可把两种种子分开，杂交种用于生产。本发明为杂交种的生产提供了新的技术手段，并可推广到其他作物上去。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述线粒体信号肽的碱基序列如SEQID NO:2所示。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述线粒体信号肽的碱基序列和WA352基因序列采用pUDT1启动子序列，所述pUDT1启动子序列的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述外源报告基因由糊粉层特异启动子Ltp2调控表达，所述启动子Ltp2的的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括：如SEQ ID NO:7所示的碱基序列，其包含所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的碱基序列，且两端分别有BglII和XhoI酶切位点。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤一中，将如SEQ ID NO:7所示的碱基序列构建到pCAMBIA1300载体上，得到pCAMBIA1300-WA352表达载体，然后将pCAMBIA1300-WA352表达载体通过农杆菌介导方法侵染水稻愈伤组织转化入野生型水稻的染色体上，以将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，所述恢复系为发育正常的水稻常规品种，为水稻9311、华占或R900，用恢复系的花粉授给不育系后，所产生的杂交种子育性恢复正常，能自交结实，如果该杂交种有优势的话，经过一系列的试验示范程序，待品种审定后，就可用于生产。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述外源报告基因为红色荧光标记基因。本发明连锁表达由糊粉层特异启动子Ltp2调控的荧光报告基因DsRed，利用其标记功能实现非转基因种子与转基因种子的精准色选。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，通过PCR方法鉴定所述转基因T0代植株，PCR方法中采用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

1、序列合成

合成该申请中所需要的各元件，并在两端分别添加BglII和XhoI酶切位点(BglII和XhoI分别是BamhI和SalI的同尾酶)。

2、载体构建

载体pUC57-WA352(图1，擎科生物技术公司合成后提供)用BglI I和XhoI双酶切，回收WA352片段，pCAMBIA1300(图2，实验室保存)用BamhI和Sal I双酶切，回收载体片段，与WA352片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆，即获得表达载体pCAMBIA1300-WA352。表达载体转化农杆菌可用于后续水稻愈伤组织侵染转化。

双酶切反应体系：参考宝生物实验试剂目录

BglII和XhoI双酶切1×H buffer

pUC57-WA352	6μl
		BglII	1μl
XhoI	1μl
		1×H buffer	4μl
ddH<sub>2</sub>O	28μl
			40μl

BamhI和SalI双酶切1.5×T buffer

pCAMBIA1300	6μl
		BamhI	1μl
SalI	1μl
		1.5×T buffer	6μl
ddH<sub>2</sub>O	26μl
			40μl

LB培养基：

胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，加入去离子水至总体积为1L摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，121℃湿热灭菌20min。固体LB培养基在高压灭菌前加入琼脂粉15g/L。

大肠杆菌感受态细胞制备和转化方法：

从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于4mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜；取1mL菌液转接到一个含有50mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2-3小时，至OD600＝0.4-0.6；菌液转入无菌离心管，冰上放置30分钟后，4500rpm离心8min，去上清液；加入预冷的无菌0.1M的CaCl₂10ml，置于冰上重悬，放置8-10分钟，4500rpm离心8min，去上清；加入灭菌的0.1M的CaCl₂3.2ml和0.8ml无菌的50％的甘油，冰上细胞重悬，放置3分钟；将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷)中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或-70℃储存。

新鲜制备的或-70℃下保存的100μL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮；然后在超净台上加入1μL载体质粒或连接产物，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀，然后冰上放置30分钟；接着42℃水浴热激90秒；再在冰上放置2分钟；随后加入900μL LB培养液，37℃250转/分振荡培养60分钟，然后室温下4000rpm离心1分钟，用枪头吸掉800μL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮，均匀涂布在加入相应抗生素的琼脂平板上；平皿在37℃下正向放置10分钟，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，37℃培养过夜。

农杆菌感受态制备和转化方法：

取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml利福平/氯霉素平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。加入10ml预冷的0.02M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。加入4ml预冷的含15％甘油的0.02M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃备用。

取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰上放置10分钟。然后液氮中放置1min，再在37℃水浴5min。加入800ml LB液体培养基，28℃，200rpm摇培3hr。室温下4000rpm离心1分钟，用枪头吸掉800μL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。将细菌涂在含50μg/ml卡那霉素/利福平/氯霉素的LB平板上。28℃培养48-72hr后形成单菌落。

3、水稻遗传转化方法：

各种水稻组织培养基配方

诱导培养基NB：

N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA0.1mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0

继代培养基J3：

MS大量盐分，10倍B₅微量盐分，J3铁盐FeSO₄·7H₂O 41.8mg/L，Na₂EDTA 55.9mg/L，DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。

共培养基NBM：

N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH5.6。

筛选培养基J3S：

继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L。

预分化培养基Y：

N6大量，CuSO₄ 3mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。

分化培养基D：

N6大量盐分，10倍B₅微量盐分，D铁盐(FeSO₄·7H₂O)55.9mg/L，Na₂EDTA 74.5mg/L，DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA 2mg/L，IAA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L

生根培养基R：

MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH6.0。

水稻愈伤组织的诱导和遗传转化

分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。

划LB平板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50ml液体的共培养基(NBM+As 0.1mM)中，调OD600＝0.5；从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。无菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天；3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S；结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

4、转基因水稻分子鉴定

水稻DNA提取

取水稻幼嫩叶片，剪碎，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5ml Eppendorf管中；加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB缓冲液在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；小心吸取上清液，加入0.7倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl去离子水(含RNase)中，于37℃处理15min，-20℃或者-70℃下保存备用。

PCR鉴定转基因植株(使用红色荧光蛋白基因的扩增引物)

提取再生苗水稻叶片DNA，利用PCR技术鉴定阳性植株，根据表达载体上红色荧光蛋白基因序列设计特异性引物：

DsRed-F:5’-ATGGCCTCCTCCGAGAACGT-3’(SEQ ID NO:5)

DsRed-R:5’-CTACAGGAACAGGTGGTGGC-3’(SEQ ID NO:6)

对转基因植株进行PCR验证。PCR扩增体系及程序如下：

反应程序：94℃预变性5min；PCR扩增：然后以94℃变性，40s；53℃退火，40s；72℃延伸，1min；共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR结果。如，从图4中可以看出，在转化成功的转基因植株中可以扩增出红色荧光蛋白基因。

5、转基因表型

如图5和图6所示，转基因T0代表现为不育，以正常植株为父本与转基因植株杂交，获得杂交种子，杂交种子含两种类型(图7A、7B、7C、7D、7E、7F所示)，一种带荧光，为不育种子，一种为正常种子，不含转基因成分。

6、杂交制种

以转基因植株为母本，以优异恢复系为父本，进行杂交，获得F1种子含有两种类型，一种为带荧光的不育种子，种下去为不育单株；另外的为正常的杂交种，不含转基因成分，可用于粮食生产。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的水稻杂交种的生产方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，本发明通过构建植物表达载体，利用绒毡层特异表达启动子pUDT1加上线粒体信号肽调控WA352，把WA352的表达盒整合到核基因组上，然后转录翻译成蛋白，通过信号肽把蛋白定位到线粒体，发挥功能，引起不育，实现了生物去雄，并通过连锁表达由糊粉层特异启动子Ltp2调控的荧光报告基因DsRed，利用其标记功能实现非转基因种子与转基因种子的精准色选。为杂交种的生产提供了新的技术手段，并可推广到其他作物上去。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110>湖南杂交水稻研究中心

<120>水稻杂交种的生产方法

<130> 2018

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacgagag atagaatgag acaaagcata aaggggagag cgctttgccg agcatttagt 60

agtcgttcgg ctgggggggt tatctttaaa gtagtgctta aatcactaca ggagcgaaaa 120

aaaaggataa gtagcgaaat ttcgtcgact atttattttt atatgttatg tattccatat 180

ttgatcttct ttttgaagat ttccatttta gtttttctag tcttttatcg gatagtcctc 240

cccatagtac agatgttttc ccttctaact tgttgctcct ttcttattct tattcttctt 300

ttttgcctta ttttgacctg tttgattctt ttccgtttaa agaagaagga ggattttgcc 360

tcccctcctg aaagtataat ctccattttt tcaagtattt tcgctatttt gatggcagta 420

ttagcatcgg gcccttcagt tgcttacgct atggagaacc ctgggcctag tgaagcgggt 480

cctgaaggat ccgctgcacc gccctcgtcc tcctttcaag aaagcacggg ggaaatggac 540

gcgctgatgg catcaacgac tccttccgcg ccgcggacac cctccggggg ggaaccttcg 600

gtcaatcaac cgcttccagg ggagcaagct atgcctcccg ctcttcccgt tatgcaggaa 660

gctgctaatc ggtctccgcc ctacgcgccc tacccgtatc cagttgacga gataatagga 720

ggggatagcg tgcaatccat tcaaagaaga cttttgggga ctaattggaa tccttccgcc 780

catgacatgc aaatgtcccg gattcaagcg gaggatctat ttgaactgaa agtggaaatc 840

ataagaaaga tggcgggcct gcatccaagt ggcgattgga tgggatgggg cgcgcgggcc 900

ttggacaacc cccgtacggc cactggcgag gaagacttgg ctaggttgca ccaaatgctc 960

gacgacctac agagccggaa tgagcaatca gctaccttct ggcgcttggt cgaaagagtc 1020

cgcttacggg cggatgagga tcaaaactca gcctcctag 1059

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcacgcc gcgtcgctgc ccgcgcccgc gcccgcgccg gcggcgtccc gcgctcggag 60

ggtacgatcc aagaccgagc acgcgttggg agcggtggcg ccgaggacgc actcgacgtg 120

ttcgacgaat tgctccggcg aggcatcggc gccccgatcc gcagcttgaa cggcgctctc 180

gccgacgtcg cgcgcgacaa ccccgcggcc gctgtgtccc gcttcaaccg catggcacga 240

gctggtgcca gcatggtaac tcccaccgtg cacacctatg gcatcctcat cggctgctgc 300

tgcagt 306

<210> 3

<211> 2460

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgcagtaca tgattgatat cttcagttat tcttcatgat ctccctccaa taactaacaa 60

taggagtatt gatagaagat aaggaaaata gctttcttcc tctgtttttt cactttctct 120

ctctagcata tctctatctt tactacctaa ggctgtgttc ttccctaagg ctgcgttcgg 180

atgagggggt tcccaacccc tctctctcgt attccgcacg cacgcttttc aaactattaa 240

acggtgtgtt ttttgcaaaa agtttctata tgaaagttgc ttaaaaaatc atattaatcc 300

attttttttt aaaaaaatag ctaatactta attaatcacg cgctaatgga ccgctctgtt 360

ttccgtgtat gggagatggg ttcccaactc ccacctccga acacaacctt agtttcccaa 420

ctcacttctt tcgtttttcg tgcacacgct tttaaaactg ctaaacggtg tgtttttttt 480

aaaaaaaaat ctataagaaa gttgtttaaa aaaatcatat taatctattt ttttaaaaaa 540

attagttaat acttaattaa tcatgcaata atacgtactt cgttttgcgt gccggggagg 600

aagggttccc aacccctcct cccgaacgta gcctaaaaag agaatcgttc ttctccacag 660

acatgtaaaa acatattttc ccttataaaa aacgtccacc cttaaaacat agatttctaa 720

acaaaaccaa ccattataaa gaaaaccgaa tatcttacta tacgtaaatc ctctcactaa 780

attgaataaa aacagtttgc aaggcacatg catatagccg gaagatggaa gctccatacc 840

acaccggtca tatcgatata atttccttcc tttactatta gttgaaacat gtgcgggttt 900

cgagaggtag tagttttttt ttaatgaaac tatatacaca aagtttttct tttcaaagtt 960

tatagagact ggtgtggcgt gctatgagta aatttaaatt tcatataatt tttatatagt 1020

aaaattaaac tcaaatactg tttaaagcag agctattaat attaatgagg ccatacacac 1080

tgcatgaagg aatcacaatt gcacagttta ttttcacaat tgcacaatca caatacacac 1140

tgcacgtaga ttttcaccga atatttctga tggagactta gtaatagact tgagttaagt 1200

tatttatttt ctttggttag tattggtgtc tcatcttttt tttatggtta tatagcttta 1260

gtcgaagcaa atgctaggtt tttatttatt attagaaaaa tctttgttta attctgttat 1320

actcagattt cgagtaacag tggttgtagg cttatggctg tgtttaattc aatttttttt 1380

ctttaaactt taaacttttc cgtcacatca aatgtttgga taaatacatg gagcactaaa 1440

tgtggacgaa aaaaagcaaa ttgcactgtt tgcatgtaaa tcacgagacg aatcatttga 1500

gcctaattac gccatgattt gacaatgtga tgctacagta aacatttgtt aatgatggat 1560

taattaggct taataaattc gtctcgcggt ttataggcgg aatctataat ttgttttgtt 1620

attattctat gtttaatact tcaaatatgt gtccgtatat ttcaaaaaaa atttggcaca 1680

caaactaaac acaacctata tagctttagt tgagcaaatg tcttgttcat gtcaactaaa 1740

aagtgtaatc gtcctccttc ccgtgtgtaa cacgattaca cgtgtagcgc acataagcac 1800

caaattaaat gttcatcatt taaatcgtat ttatagtcca ttcttactta tatgggccta 1860

gcgcattata acgtagggat atattatgca agttaaatta aacttatgat aatctttttt 1920

tttctctttt ttttccgtag cagtagtttc ttttttttgg tcctttttag cgtgttgtta 1980

atctctctgc aatagcctct gatcgttgca ttgtataact ctagtactct actttgtttt 2040

aatatattaa cgtatataat acttttacgt gttggtgaaa aaaaaactaa caataatctt 2100

ctcctctccg tcaaacggcg gcacgacgcg gcgcagtgca accaacaaac cggggcgggc 2160

ggggcatcca caaccaacca actccccacc cccgggaagg gaaacaaacc cacccaagca 2220

gagcatctcg cctcctctcc tctccccttg cgttcagccc cttccttgca ttgctttctc 2280

catgagattc ctcctcctcc tccatcctta taagccaccc gcaaccgcaa ccccgggaag 2340

gaacaggaag gaagcaagtg ccatcgagtg tggttgagag agtttgagac ttgaggctgc 2400

gctgcgctga acctgtcgtt cggtgggagg caagaagaag gtggtggtgg tggtgcagca 2460

<210> 4

<211> 830

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc taaaaataag ccgatgagga taaataaaat 60

gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact catcaagagg atgcttttcc gatgagctct 120

agtagtacat cggacctcac atacctccat tgtggtgaaa tattttgtgc tcatttagtg 180

atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg ttttgacatt tcagttttgc cactcttagg 240

ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa aagcaaaaca attttatttt acttttacca 300

ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc cactctagaa attctgttta tgccacagaa 360

tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc caaggtgttc atggcatgga aatgtgacat 420

aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg tactcctcgt aacaagagac ggaaacatca 480

tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat cacctttgga tgatgcgcat gaatggagtc 540

gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca ctgagtccgg gcggcaacta ccatcggcga 600

acgacccagc tgacctatac cgaccggact tgaatgcgct accttcgtca gcgacgatgg 660

ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg catggcggca catggcgagc tcagaccgtg 720

cgtggcttgc tacaaatacg taccccgtga gtgccctagc tagaaactta cacctgcaac 780

tgcgagagcg agcgtgtgag tgtagccgag tagatccacc ggtcgccacc 830

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcctcct ccgagaacgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctacaggaac aggtggtggc 20

<210> 7

<211> 6035

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agatcttcgc agtacatgat tgatatcttc agttattctt catgatctcc ctccaataac 60

taacaatagg agtattgata gaagataagg aaaatagctt tcttcctctg ttttttcact 120

ttctctctct agcatatctc tatctttact acctaaggct gtgttcttcc ctaaggctgc 180

gttcggatga gggggttccc aacccctctc tctcgtattc cgcacgcacg cttttcaaac 240

tattaaacgg tgtgtttttt gcaaaaagtt tctatatgaa agttgcttaa aaaatcatat 300

taatccattt ttttttaaaa aaatagctaa tacttaatta atcacgcgct aatggaccgc 360

tctgttttcc gtgtatggga gatgggttcc caactcccac ctccgaacac aaccttagtt 420

tcccaactca cttctttcgt ttttcgtgca cacgctttta aaactgctaa acggtgtgtt 480

ttttttaaaa aaaaatctat aagaaagttg tttaaaaaaa tcatattaat ctattttttt 540

aaaaaaatta gttaatactt aattaatcat gcaataatac gtacttcgtt ttgcgtgccg 600

gggaggaagg gttcccaacc cctcctcccg aacgtagcct aaaaagagaa tcgttcttct 660

ccacagacat gtaaaaacat attttccctt ataaaaaacg tccaccctta aaacatagat 720

ttctaaacaa aaccaaccat tataaagaaa accgaatatc ttactatacg taaatcctct 780

cactaaattg aataaaaaca gtttgcaagg cacatgcata tagccggaag atggaagctc 840

cataccacac cggtcatatc gatataattt ccttccttta ctattagttg aaacatgtgc 900

gggtttcgag aggtagtagt ttttttttaa tgaaactata tacacaaagt ttttcttttc 960

aaagtttata gagactggtg tggcgtgcta tgagtaaatt taaatttcat ataattttta 1020

tatagtaaaa ttaaactcaa atactgttta aagcagagct attaatatta atgaggccat 1080

acacactgca tgaaggaatc acaattgcac agtttatttt cacaattgca caatcacaat 1140

acacactgca cgtagatttt caccgaatat ttctgatgga gacttagtaa tagacttgag 1200

ttaagttatt tattttcttt ggttagtatt ggtgtctcat ctttttttta tggttatata 1260

gctttagtcg aagcaaatgc taggttttta tttattatta gaaaaatctt tgtttaattc 1320

tgttatactc agatttcgag taacagtggt tgtaggctta tggctgtgtt taattcaatt 1380

ttttttcttt aaactttaaa cttttccgtc acatcaaatg tttggataaa tacatggagc 1440

actaaatgtg gacgaaaaaa agcaaattgc actgtttgca tgtaaatcac gagacgaatc 1500

atttgagcct aattacgcca tgatttgaca atgtgatgct acagtaaaca tttgttaatg 1560

atggattaat taggcttaat aaattcgtct cgcggtttat aggcggaatc tataatttgt 1620

tttgttatta ttctatgttt aatacttcaa atatgtgtcc gtatatttca aaaaaaattt 1680

ggcacacaaa ctaaacacaa cctatatagc tttagttgag caaatgtctt gttcatgtca 1740

actaaaaagt gtaatcgtcc tccttcccgt gtgtaacacg attacacgtg tagcgcacat 1800

aagcaccaaa ttaaatgttc atcatttaaa tcgtatttat agtccattct tacttatatg 1860

ggcctagcgc attataacgt agggatatat tatgcaagtt aaattaaact tatgataatc 1920

tttttttttc tctttttttt ccgtagcagt agtttctttt ttttggtcct ttttagcgtg 1980

ttgttaatct ctctgcaata gcctctgatc gttgcattgt ataactctag tactctactt 2040

tgttttaata tattaacgta tataatactt ttacgtgttg gtgaaaaaaa aactaacaat 2100

aatcttctcc tctccgtcaa acggcggcac gacgcggcgc agtgcaacca acaaaccggg 2160

gcgggcgggg catccacaac caaccaactc cccacccccg ggaagggaaa caaacccacc 2220

caagcagagc atctcgcctc ctctcctctc cccttgcgtt cagccccttc cttgcattgc 2280

tttctccatg agattcctcc tcctcctcca tccttataag ccacccgcaa ccgcaacccc 2340

gggaaggaac aggaaggaag caagtgccat cgagtgtggt tgagagagtt tgagacttga 2400

ggctgcgctg cgctgaacct gtcgttcggt gggaggcaag aagaaggtgg tggtggtggt 2460

gcagcaatgg cacgccgcgt cgctgcccgc gcccgcgccc gcgccggcgg cgtcccgcgc 2520

tcggagggta cgatccaaga ccgagcacgc gttgggagcg gtggcgccga ggacgcactc 2580

gacgtgttcg acgaattgct ccggcgaggc atcggcgccc cgatccgcag cttgaacggc 2640

gctctcgccg acgtcgcgcg cgacaacccc gcggccgctg tgtcccgctt caaccgcatg 2700

gcacgagctg gtgccagcat ggtaactccc accgtgcaca cctatggcat cctcatcggc 2760

tgctgctgca gtatgacgag agatagaatg agacaaagca taaaggggag agcgctttgc 2820

cgagcattta gtagtcgttc ggctgggggg gttatcttta aagtagtgct taaatcacta 2880

caggagcgaa aaaaaaggat aagtagcgaa atttcgtcga ctatttattt ttatatgtta 2940

tgtattccat atttgatctt ctttttgaag atttccattt tagtttttct agtcttttat 3000

cggatagtcc tccccatagt acagatgttt tcccttctaa cttgttgctc ctttcttatt 3060

cttattcttc ttttttgcct tattttgacc tgtttgattc ttttccgttt aaagaagaag 3120

gaggattttg cctcccctcc tgaaagtata atctccattt tttcaagtat tttcgctatt 3180

ttgatggcag tattagcatc gggcccttca gttgcttacg ctatggagaa ccctgggcct 3240

agtgaagcgg gtcctgaagg atccgctgca ccgccctcgt cctcctttca agaaagcacg 3300

ggggaaatgg acgcgctgat ggcatcaacg actccttccg cgccgcggac accctccggg 3360

ggggaacctt cggtcaatca accgcttcca ggggagcaag ctatgcctcc cgctcttccc 3420

gttatgcagg aagctgctaa tcggtctccg ccctacgcgc cctacccgta tccagttgac 3480

gagataatag gaggggatag cgtgcaatcc attcaaagaa gacttttggg gactaattgg 3540

aatccttccg cccatgacat gcaaatgtcc cggattcaag cggaggatct atttgaactg 3600

aaagtggaaa tcataagaaa gatggcgggc ctgcatccaa gtggcgattg gatgggatgg 3660

ggcgcgcggg ccttggacaa cccccgtacg gccactggcg aggaagactt ggctaggttg 3720

caccaaatgc tcgacgacct acagagccgg aatgagcaat cagctacctt ctggcgcttg 3780

gtcgaaagag tccgcttacg ggcggatgag gatcaaaact cagcctccta ggatctgaca 3840

aagcagcatt agtccgttga tcggtggaag accactcgtc agtgttgagt tgaatgtttg 3900

atcaataaaa tacggcaatg ctgtaagggt tgttttttat gccattgata atacactgta 3960

ctgttcagtt gttgaactct atttcttagc catgccaagt gcttttctta ttttgaataa 4020

cattacagca aaaagttgaa agacaaaaaa aaaaaccccc gaacagagtg ctttgggtcc 4080

caagctactt tagactgtgt tcggcgttcc ccctaaattt ctccccctat atctcactca 4140

cttgtcacat cagcgttctc tttcccctat atctccacga accgtctctt cgtgagaata 4200

accgtggcct aaaaataagc cgatgaggat aaataaaatg tggtggtaca gtacttcaag 4260

aggtttactc atcaagagga tgcttttccg atgagctcta gtagtacatc ggacctcaca 4320

tacctccatt gtggtgaaat attttgtgct catttagtga tgggtaaatt ttgtttatgt 4380

cactctaggt tttgacattt cagttttgcc actcttaggt tttgacaaat aatttccatt 4440

ccgcggcaaa agcaaaacaa ttttatttta cttttaccac tcttagcttt cacaatgtat 4500

cacaaatgcc actctagaaa ttctgtttat gccacagaat gtgaaaaaaa acactcactt 4560

atttgaagcc aaggtgttca tggcatggaa atgtgacata aagtaacgtt cgtgtataag 4620

aaaaaattgt actcctcgta acaagagacg gaaacatcat gagacaatcg cgtttggaag 4680

gctttgcatc acctttggat gatgcgcatg aatggagtcg tctgcttgct agccttcgcc 4740

taccgcccac tgagtccggg cggcaactac catcggcgaa cgacccagct gacctatacc 4800

gaccggactt gaatgcgcta ccttcgtcag cgacgatggc cgcgtacgct ggcgacgtgc 4860

ccccgcatgc atggcggcac atggcgagct cagaccgtgc gtggcttgct acaaatacgt 4920

accccgtgag tgccctagct agaaacttac acctgcaact gcgagagcga gcgtgtgagt 4980

gtagccgagt agatccaccg gtcgccacca tggcctcctc cgagaacgtc atcaccgagt 5040

tcatgcgctt caaggtgcgc atggagggca ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg 5100

gcgagggcga gggccgcccc tacgagggcc acaacaccgt gaagctgaag gtgacgaagg 5160

gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg 5220

tgtacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct 5280

tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggcgaccgtg acccaggact 5340

cctccctgca ggacggctgc ttcatctaca aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct 5400

ccgacggccc cgtgatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt 5460

acccccgcga cggcgtgctg aagggcgaga cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg 5520

gccactacct ggtggagttc aagtccatct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg 5580

gctactacta cgtggacgcc aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg 5640

tggagcagta cgagcgcacc gagggccgcc accacctgtt cctgtagcgg cccatggata 5700

ttcgaacgcg tagacttgtc catcttctgg attggccaac ttaattaatg tatgaaataa 5760

aaggatgcac acatagtgac atgctaatca ctataatgtg ggcatcaaag ttgtgtgtta 5820

tgtgtaatta ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc atccatattt cttatcctaa 5880

atgaatgtca cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga tgcatttcat taaccaaatc 5940

catatacata taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc 6000

tagtctaggt gtgttttgcg aatgcggccc tcgag 6035

Claims

1.一种水稻杂交种的生产方法，其特征在于，包括：

步骤一、将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上，得到含有线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的转基因不育株系，其中，所述WA352基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述线粒体信号肽的碱基序列和WA352基因序列由绒毡层特异表达启动子pUTD1序列调控，pUTD1启动子序列的碱基序列如SEQ ID NO:3所示，所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因连锁表达，如SEQ ID NO:7所示的碱基序列包含所述线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因的碱基序列，且两端分别有BglII和XhoI酶切位点；

2.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述线粒体信号肽的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述外源报告基因由糊粉层特异启动子Ltp2调控表达，所述启动子Ltp2的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

4.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，步骤一中，将如SEQ IDNO:7所示的碱基序列构建到pCAMBIA1300载体上，得到pCAMBIA1300-WA352表达载体，然后将pCAMBIA1300-WA352表达载体通过农杆菌介导方法侵染水稻愈伤组织转化入野生型水稻的染色体上，以将线粒体信号肽的碱基序列、WA352基因序列和外源报告基因共同整合到野生型水稻染色体上。

5.如权利要求1所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述恢复系为发育正常的水稻常规品种，为水稻9311、华占或R900。

6.如权利要求1所述水稻杂交种的生产方法，其特征在于，所述外源报告基因为红色荧光标记基因。

7.如权利要求6所述的水稻杂交种的生产方法，其特征在于，通过PCR方法转基因T0代植株，PCR方法中采用的引物对如SEQ ID NO:5和6所示。