CN111269914A - Dna分子及有效防止转基因植物花粉逃逸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA分子、一种重组载体、一种细胞和一种植物。本发明还公开了一种有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，包括如下步骤：步骤一、将DNA分子构建到表达载体上得到带有DNA分子的重组载体；步骤二、将重组载体转化到植物细胞中，筛选、培养得到含有DNA分子的转基因植株。本发明通过分子育种设计，利用花粉形成后期特异启动子驱动水稻细胞质雄性不育基因，在花粉中特异表达，并通过线粒体信号肽把编码蛋白定位在线粒体内，利用其毒肽功能将携带有转基因成分的花粉致死，防止转基因花粉逃逸。

Description

DNA分子及有效防止转基因植物花粉逃逸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA分子，还涉及一种有效防止转基因植物花粉逃逸的方法。

背景技术

近年来，转基因植物种类和种植面积迅猛增加，转基因作物的大规模环境释放及其可能带来的环境生物安全问题己经日益成为目前全球最受关注和争议的领域之一。转基因植物中的外源基因通过花粉逃逸转移到环境中的非转基因品种或其野生近缘种(包括杂草种类)中，并通过遗传渐渗在野生近缘种的群体中保留或进一步扩散，从而带来环境生物安全问题。虽然转基因生物对生物多样性或生态平衡有上述这些可能的负面影响。但是，并不是说大量使用转基因生物一定就会破坏生物多样性或生态平衡。关键如何对其使用进行严格的审批和有效的监管，并通过行之有效的技术手段把负面影响降至最低。

目前己经发现一些降低花粉中外源基因扩散的方法，常见的如叶绿体转化、含外源基因花粉的致死效应等。

大多数植物的叶绿体是母性遗传的，如果外源基因整合到叶绿体基因组上，就不能通过花粉向其它植物扩散，因此可以避免外源基因的扩散。然而叶绿体转化只在少数植物中利用基因枪法获得了成功。另外，叶绿体转化载体包含有叶绿体同源片段，以保证外源基因的定点组合，而大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚，因此，无法确定用于载体构建的同源片段和外源基因括入位点，对未知序列叶绿体基因组只能通过保守序列来完成。另外一个关键的问题是，大多数植物细胞含有10-100个叶绿体，每个叶绿体又含有高达100个质体基因组拷贝，而只有少数的质体基因组能够转化成功，使外源基因完全整合到叶绿体每个DNA拷贝中需要有效的组织培养方法以及筛选技术，而对于大多数单子叶植物来说目前还没有建立起来有效的转化和筛选系统。

雄性不育是一种广泛应用于商业化转基因植物中避免花粉逃逸的方法。Mariani等利用Barnases基因创造了烟草和油菜的雄性不育系，雄性不育株系做母本，野生型株系做父本，获得的杂交种借助Barstar基因恢复育性。然而，其负效应表现在，与对照相比，以花粉为食物的昆虫如油菜花露尾甲长成成虫的数量明显减少。而且，有证据表明，barnase对动物和人类细胞具有毒性，因此需要植物特异表达barnase的部位不是被食用的部分。另外，Barnase在应用方面还存在着很多问题，例如:雄性不育性状具有温度敏感性，容易受环境影响而不稳定、即使在花粉特异启动子下，barnase的毒性也有可能会泄露表达在植物体其它部位，从而引起各种重要农艺性状的变化、barnase在后代分离中也存在不稳定性等。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种DNA分子、一种重组载体、一种细胞和一种植物。

本发明另有一个目的是提供一种有效防止转基因植物花粉逃逸的方法。

本发明提供的技术方案为：

一种DNA分子，包含从上游到下游依次连接的花粉形成后期特异启动子序列、线粒体信号肽序列和如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

优选的是，所述的DNA分子，所述花粉形成后期特异启动子序列为如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

优选的是，所述的DNA分子，所述线粒体信号肽序列为如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。

一种重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子。

一种细胞，所述细胞含有所述的DNA分子或所述的重组载体。

一种植物，其包含所述的细胞。

一种有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，包括如下步骤：

步骤一、将所述的DNA分子构建到表达载体上得到带有所述DNA分子的重组载体；

步骤二、将待转基因和所述重组载体转化到植物细胞中，筛选、培养得到含有所述待转基因和所述DNA分子的转基因植株，其中，所述待转基因和所述DNA分子连锁。

优选的是，所述的有效防止转基因植物花粉逃逸的方法中，所述的DNA分子的上游和下游分别设置有Sma I和Hind III酶切位点。

优选的是，所述的有效防止转基因植物花粉逃逸的方法中，所述待转基因和所述表达载体同时构建于一个表达载体上，以能够连锁表达。

优选的是，所述的有效防止转基因植物花粉逃逸的方法中，所述表达载体为pCAMBIA1300；所述待转基因为红色荧光蛋白基因；所述红色荧光蛋白基因也同时构建于pCAMBIA1300载体；

步骤二中，筛选时，利用如SEQ ID NO:4和5所示的引物对通过PCR技术检测所述转基因植株的DNA中是否含有所述DNA分子。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过转基因技术把水稻线粒体基因ORFH79整合到核基因组上，并通过花粉特异启动子调控ORFH79基因在花粉中的特异表达。既可以避开恢复基因在线粒体内对ORFH79转录本的切割，又通过信号肽实现核编码蛋白ORFH79在线粒体的定位，发挥其毒素肽的功能，实现对花粉细胞的致死功能。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中表达载体pCAMBIA1300-DsRed2-ORFH79的连接位点示意图；

图2为本发明其中一个实施例中转基因愈伤组织照片，A为在显微镜明场视野下的愈伤组织观察情况，B为在显微镜红色荧光通道下愈伤组织的观察情况；

图3为本发明其中一个实施例中转基因再生植株的红色荧光基因分子检测照片，Marker为DL 2000；

图4为本发明其中一个实施例中对转基因阳性植株花粉的碘染结果照片，其中AB图为不同单株的碘染结果；

图5为本发明其中一个实施例中转基因种子在荧光显微镜下的表型观察图，其中，A、B、D为红色荧光通道下的种子观察图，C为明场视野下的种子观察图，WT为野生型，T0为转基因T0代种子；

图6为本发明其中一个实施例中ORFH79表达框组成的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种DNA分子，包含从上游到下游依次连接的花粉形成后期特异启动子序列、线粒体信号肽序列和如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述花粉形成后期特异启动子序列为如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述线粒体信号肽序列为如SEQ IDNO:3所示的碱基序列。

本发明还提供一种重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子。

本发明还提供一种细胞，所述细胞含有所述的DNA分子或所述的重组载体。

本发明还提供一种植物，其包含所述的细胞。

本发明还提供一种有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，包括如下步骤：

步骤一、将所述的DNA分子构建到表达载体上得到带有所述DNA分子的重组载体；

步骤二、将待转基因和所述重组载体转化到植物细胞中，筛选、培养得到含有所述待转基因和所述DNA分子的转基因植株，其中，所述待转基因和所述DNA分子连锁。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的DNA分子的上游和下游分别设置有Sma I和Hind III酶切位点。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述待转基因和所述表达载体同时构建于一个表达载体上，以能够连锁表达。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述表达载体为pCAMBIA1300；所述待转基因为红色荧光蛋白基因；所述红色荧光蛋白基因也同时构建于pCAMBIA1300载体；

步骤二中，筛选时，利用如SEQ ID NO:4和5所示的引物对通过PCR技术检测所述转基因植株的DNA中是否含有所述DNA分子。

本发明可有效阻止转基因植物通过花粉传播至其它水稻品种、野生近缘种、野草以及其它植物。本发明通过分子育种设计，利用花粉形成后期特异启动子驱动水稻细胞质雄性不育基因ORFH79，在花粉中特异表达，并通过线粒体信号肽把编码蛋白定位在线粒体内，利用其毒肽功能将携带有转基因成分的花粉致死，防止转基因花粉逃逸，而不带转基因的花粉仍然能够正常发挥功能。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

RF6为恢复基因，核编码基因。

ORFH79(ORF79)线粒体基因，如SEQ ID NO:1所示。

正常可育植株：RF6基因翻译成蛋白后，进入线粒体，切割ORFH79的转录本。不能翻译出毒性蛋白，所以育性正常。

不育植株：rf6为无效恢复基因，不能切割ORFH79的转录本，然后ORFH79基因翻译成毒素肽，使花粉表现不育。

序列合成

合成该申请中ORFH79的表达框元件，如图6所示，序列如SEQ ID NO:6所示，花粉后期形成特异启动子的序列如SEQ ID NO:2所示，线粒体信号肽的序列如SEQ ID NO:3所示，并在两端添加Sma I和Hind III酶切位点。

载体构建

通过EcoR I和KpnI双酶切pMD-18T-DsRed2载体(本实验室保存)和pCAMBIA1300(实验室保存)，回收DsRED2，连接到pCAMBIA1300，获得pCAMBIA1300-DsRed2；

载体pUC57-ORFH79(擎科生物技术公司合成后提供)用Sma I和Hind III双酶切，回收ORFH79片段；pCAMBIA1300-DsRed2用Sma I和Hind III双酶切，回收载体片段，与ORFH79片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆，即获得表达载体pCAMBIA1300-DsRed2-ORFH79。表达载体转化农杆菌可用于后续水稻愈伤组织侵染转化。ORFH79与DsRed2连锁表达载体如图1所示。

EcoR I和KpnI双酶切反应体系和条件

37度水浴保温2h。

Sma I和Hind III双酶切反应体系和条件

37度水浴保温2hLB培养基：

胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，加入去离子水至总体积为1L摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，121℃湿热灭菌20min。固体LB培养基在高压灭菌前加入琼脂粉15g/L。

大肠杆菌感受态细胞制备和转化方法：

从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于4mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜；取1mL菌液转接到一个含有50mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2-3小时，至OD₆₀₀＝0.4-0.6；菌液转入无菌离心管，冰上放置30分钟后，4500rpm离心8min，去上清液；加入预冷的无菌0.1M的CaCl₂ 10mL，置于冰上重悬，放置8-10分钟，4500rpm离心8min，去上清；加入灭菌的0.1M的CaCl₂ 3.2mL和0.8mL无菌的50％的甘油，冰上细胞重悬，放置3分钟；将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷)中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或-70℃储存。

新鲜制备的或-70℃下保存的100μL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮；然后在超净台上加入1μL载体质粒或连接产物，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀，然后冰上放置30分钟；接着42℃水浴热激90秒；再在冰上放置2分钟；随后加入900μL LB培养液，37℃250转/分振荡培养60分钟，然后室温下4000rpm离心1分钟，用枪头吸掉800μL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮，均匀涂布在加入相应抗生素的琼脂平板上；平皿在37℃下正向放置10分钟，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，37℃培养过夜。

农杆菌感受态制备和转化方法：

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/mL利福平/氯霉素平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2mL菌液转接于100mL LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。加入10mL预冷的0.02M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。加入4mL预冷的含15％甘油的0.02M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃备用。

取1μg左右的质粒DNA加入到200mL EHA105感受态细胞中，混匀后，冰上放置10分钟。然后液氮中放置1min，再在37℃水浴5min。加入800mL LB液体培养基，28℃，200rpm摇培3hr。室温下4000rpm离心1分钟，用枪头吸掉800μL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。将细菌涂在含50μg/mL卡那霉素/利福平/氯霉素的LB平板上。28℃培养48-72hr后形成单菌落。

水稻遗传转化方法：

各种水稻组织培养基配方

诱导培养基NB：

N6大量盐分，B₅微量盐分，N6铁盐，B₅维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA0.1mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。

继代培养基J3：

MS大量盐分，10倍B₅微量盐分，J3铁盐FeSO₄·7H₂O 41.8mg/L，Na₂EDTA 55.9mg/L，DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。

共培养基NBM：

N6大量盐分，B₅微量盐分，N6铁盐，B₅维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH5.6。

筛选培养基J3S：

继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L。

预分化培养基Y：

N6大量，CuSO₄3mg/L，N6铁盐，B₅维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。

分化培养基D：

N6大量盐分，10倍B₅微量盐分，D铁盐(FeSO₄·7H₂O)55.9mg/L，Na₂EDTA 74.5mg/L，DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA 2mg/L，IAA0.2mg/L，NAA0.2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。

生根培养基R：

MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH6.0。

水稻愈伤组织的诱导和遗传转化

分别挑选野生型健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。

划LB平板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL34mg/L+RIF 50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50mL液体的共培养基(NBM+As0.1mM)中，调OD600＝0.5；从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。无菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天；3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。如图2所示。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S；结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

转基因水稻分子鉴定

水稻DNA提取

取水稻幼嫩叶片，剪碎，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中；加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB缓冲液在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min；小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；小心吸取上清液，加入0.7倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl去离子水(含RNase)中，于37℃处理15min，-20℃或者-70℃下保存备用。

PCR鉴定转基因植株(使用红色荧光蛋白基因的扩增引物)

提取再生苗水稻叶片DNA，利用PCR技术鉴定阳性植株，根据表达载体上红色荧光蛋白基因序列设计特异性引物：

DsRed-F:5’-ATGGCCTCCTCCGAGAACGT-3’(SEQ ID NO:4)

DsRed-R:5’-CTACAGGAACAGGTGGTGGC-3’(SEQ ID NO:5)

对转基因植株进行PCR验证。PCR扩增体系及程序如下：

10×Buffer溶液5μl

dNTP 4μl

Tap DNA聚合酶0.5μl

primer-F(10pmol)2μl

primer-R(10pmol)2μl

模板1μl

ddH₂O 35.5μl，总反应体积50μl。

反应程序：94℃预变性5min；PCR扩增：然后以94℃变性，40s；53℃退火，40s；72℃延伸，1min；共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR结果。如，从图3中可以看出，在转化成功的转基因植株中可以扩增出红色荧光蛋白基因。观察转基因水稻表型，如图5所示，带荧光的种子为转基因种子，不带荧光的为野生型种子

对转基因水稻花粉进行碘染，均显示半不育，如图4所示，有活性的花粉都是野生型花粉，以本发明的转基因水稻为父本，以野生型不育系为母本，杂交获得F1种子，经检测全部不含荧光，对F1植株进行分子检测，未检测出载体片段，表明含转基因的花粉无法逃逸。

对本发明的DNA分子及有效防止转基因植物花粉逃逸的方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，本发明通过分子育种设计，利用花粉形成后期特异启动子PG47驱动水稻细胞质雄性不育基因ORFH79，在花粉中特异表达，并通过线粒体信号肽把编码蛋白定位在线粒体内，利用其毒肽功能将携带有转基因成分的花粉致死，防止转基因花粉逃逸，而不带转基因的花粉仍然能够正常发挥功能，有效防止转基因花粉的逃逸。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> DNA分子及有效防止转基因植物花粉逃逸的方法

<130> 2019

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggcaaatc tggtccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat 60

ttcatcttcg gtgtcgttgt aggaggcgcc ctgttgtttg ctttgctaaa gtatcaggcc 120

cctctgtacg acccggcttt aatggaaaaa atcatagatc ataatataaa agccgggcac 180

cctatagagg ttgactattc gtggtggggc acctctattc gtgtagtctt tcctaagtaa 240

<210> 2

<211> 2771

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatctgcacc ggacactgtc tggtggcata 60

ccagacagtc cggtgtgcca gatcagggca cccttcggtt cctttgctcc tttgcttttg 120

aaccctaact ttgatcgttt attggtttgt gttgaacctt tatgcacctg tggaatatat 180

aatctagaac aaactagtta gtccaatcat ttgtgttggg cattcaacca ccaaaattat 240

ttataggaaa aggttaaacc ttatttccct ttcaatctcc ccctttttgg tgattgatgc 300

caacacaaac caaagaaaat atataagtgc agaattgaac tagtttgcat aaggtaagtg 360

cataggttac ttagaattaa atcaatttat acttttactt gatatgcatg gttgctttct 420

tttattttaa cattttggac cacatttgca ccacttgttt tgttttttgc aaatcttttt 480

ggaaattctt tttcaaagtc ttttgcaaat agtcaaaggt atatgaataa gattgtaaga 540

agcattttca agatttgaaa tttctccccc tgtttcaaat gcttttcctt tgactaaaca 600

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ttggaaatat atttagatgc taattttgaa aatataccaa ttgaaaatca acataccaat 720

ttgaaattaa acataccaat ttaaaaaatt tcaaaaagtg gtggtgcggt ccttttgctt 780

tgggcttaat atttctcccc ctttggcatt aatcgccaaa aacggagact ttgtgagcca 840

tttatacttt ctccccattg gtaaatgaaa tatgagtgaa agattatacc aaatttggac 900

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cttcgccgaa gactccattt ccctttcaat ctacgactta gcatagaaat acacttgaaa 1020

acacattagt cgtagccacg aaagagatat gatcaaaggt atacaaatga gctatgtgtg 1080

taatgtttca atcaaagttt cgagaatcaa gaatatttag ctcattccta agtttgctaa 1140

aggttttatc atataatggt ttggtaaaga tatcgactaa ttgttctttg gtgctaacat 1200

aagcaatctc gatatcaccc ctttgttggt gatccctcaa aaagtgatac cgaatgtcta 1260

tgtgcttagt gcggctgtgt tcaacgggat tatccgccat gcagatagca ctctcattgt 1320

cacataggag agggactttg ctcaatttgt agccatagtc cctaaggttt tgcctcatcc 1380

aaagtaattg cacacaacaa tgtcctgcgg caatatactt ggcttcggcg gtagaaagag 1440

ctattgagtt ttgtttcttt gaagtccaag acaccaggga tctccctaga aactgacaag 1500

tccctgatgt gctcttccta tcaattttac accctgccca atcggcatct gaatatccta 1560

ttaaatcaaa ggtggatccc ttggggtacc aaagaccaaa tttaggagtg taaactaaat 1620

atctcatgat tcttttcacg gccctaaggt gaacttcctt aggatcggct tggaatcttg 1680

cacacatgca tatagaaagc atactatctg gtcgagatgc acataaatag agtaaagatc 1740

ctatcatcga ccggtatacc ttttggtcta cggatttacc tcccgtgtcg aggtcgagat 1800

gcccattagt tcccatgggt gtcctgatgg gcttggcatc cttcattcca aacttgttga 1860

gtatgtcttg aatgtacttt gtttggctga tgaaggtgcc atcttggagt tgcttgactt 1920

gaaatcctag aaaatatttc aacttcccca tcatagacat ctcgaatttc ggaatcatga 1980

tcctactaaa ctcttcacaa gtagatttgt tagtagaccc aaatataata tcatcaacat 2040

aaatttggca tacaaacaaa acttttgaaa tggttttagt aaagagagta ggatcggctt 2100

tactgactct gaagccatta gtgataagaa aatctcttag gcattcatac catgctgttg 2160

gggcttgctt gagcccataa agcgcctttg agagtttata aacatggtta gggtactcac 2220

tatcttcaaa gccgagaggt tgctcaacat agacctattc accccatttg atcacttttt 2280

tggtccttca ggatctaata gttatgtata atttagagtc tcttgtttaa tggccagata 2340

tttctaatta atctaagaat ttatgatatt ttttaatttt ttatcatgtc tgatgagaat 2400

taacataaag gctcaattgg gtcctgaatt aataatagag tgaaaattaa tccagaggct 2460

ctattagaac cttcaattag taataccaag atatatataa gatagtagag tatagtttaa 2520

atgttggcat tgttcattct ttcttttgtt atttaattta tgctttccac ggtggttagt 2580

ggttacttct gaagggtcca aataatgcat gaagagtttg aggacaagaa gtctgcccta 2640

aaaatagcga tgcaaaggca tggtgtccaa gccatacata tagcgcacta attttatcag 2700

cagaacaatg gtatttatag gtcctagtgc ccaggcaaca agagacacga ataaagcatc 2760

gatcacgaca c 2771

<210> 3

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggcacgcc gcgtcgctgc ccgcgcccgc gcccgcgccg gcggcgtccc gcgctcggag 60

ggtacgatcc aagaccgagc acgcgttggg agcggtggcg ccgaggacgc actcgacgtg 120

ttcgacgaat tgctccggcg aggcatcggc gccccgatcc gcagcttgaa cggcgctctc 180

gccgacgtcg cgcgcgacaa ccccgcggcc gctgtgtccc gcttcaaccg catggcacga 240

gctggtgcca gcatggtaac tcccaccgtg cacacctatg gcatcctcat cggctgctgc 300

tgcagt 306

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atggcctcct ccgagaacgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctacaggaac aggtggtggc 20

<210> 6

<211> 3677

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cccgggagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc tgcaccggac actgtctggt 60

ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct tcggttcctt tgctcctttg 120

cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg aacctttatg cacctgtgga 180

atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt gttgggcatt caaccaccaa 240

aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca atctccccct ttttggtgat 300

tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa ttgaactagt ttgcataagg 360

taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt ttacttgata tgcatggttg 420

ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac ttgttttgtt ttttgcaaat 480

ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc aaaggtatat gaataagatt 540

gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt tcaaatgctt ttcctttgac 600

taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt tcaagagggt tttaaataga 660

tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata taccaattga aaatcaacat 720

accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa aaagtggtgg tgcggtcctt 780

ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc gccaaaaacg gagactttgt 840

gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg agtgaaagat tataccaaat 900

ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata ccgttagagt ggagtggaag 960

ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac gacttagcat agaaatacac 1020

ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc aaaggtatac aaatgagcta 1080

tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat atttagctca ttcctaagtt 1140

tgctaaaggt tttatcatat aatggtttgg taaagatatc gactaattgt tctttggtgc 1200

taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc cctcaaaaag tgataccgaa 1260

tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc cgccatgcag atagcactct 1320

cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc atagtcccta aggttttgcc 1380

tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat atacttggct tcggcggtag 1440

aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac cagggatctc cctagaaact 1500

gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc tgcccaatcg gcatctgaat 1560

atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag accaaattta ggagtgtaaa 1620

ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac ttccttagga tcggcttgga 1680

atcttgcaca catgcatata gaaagcatac tatctggtcg agatgcacat aaatagagta 1740

aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga tttacctccc gtgtcgaggt 1800

cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt ggcatccttc attccaaact 1860

tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa ggtgccatct tggagttgct 1920

tgacttgaaa tcctagaaaa tatttcaact tccccatcat agacatctcg aatttcggaa 1980

tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt agacccaaat ataatatcat 2040

caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt tttagtaaag agagtaggat 2100

cggctttact gactctgaag ccattagtga taagaaaatc tcttaggcat tcataccatg 2160

ctgttggggc ttgcttgagc ccataaagcg cctttgagag tttataaaca tggttagggt 2220

actcactatc ttcaaagccg agaggttgct caacatagac ctattcaccc catttgatca 2280

cttttttggt ccttcaggat ctaatagtta tgtataattt agagtctctt gtttaatggc 2340

cagatatttc taattaatct aagaatttat gatatttttt aattttttat catgtctgat 2400

gagaattaac ataaaggctc aattgggtcc tgaattaata atagagtgaa aattaatcca 2460

gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat atataagata gtagagtata 2520

gtttaaatgt tggcattgtt cattctttct tttgttattt aatttatgct ttccacggtg 2580

gttagtggtt acttctgaag ggtccaaata atgcatgaag agtttgagga caagaagtct 2640

gccctaaaaa tagcgatgca aaggcatggt gtccaagcca tacatatagc gcactaattt 2700

tatcagcaga acaatggtat ttataggtcc tagtgcccag gcaacaagag acacgaataa 2760

agcatcgatc acgacacatg gcacgccgcg tcgctgcccg cgcccgcgcc cgcgccggcg 2820

gcgtcccgcg ctcggagggt acgatccaag accgagcacg cgttgggagc ggtggcgccg 2880

aggacgcact cgacgtgttc gacgaattgc tccggcgagg catcggcgcc ccgatccgca 2940

gcttgaacgg cgctctcgcc gacgtcgcgc gcgacaaccc cgcggccgct gtgtcccgct 3000

tcaaccgcat ggcacgagct ggtgccagca tggtaactcc caccgtgcac acctatggca 3060

tcctcatcgg ctgctgctgc agtatggcaa atctggtccg atggctcttc tccactaccc 3120

gagggactaa cggtcttcca tatttcatct tcggtgtcgt tgtaggaggc gccctgttgt 3180

ttgctttgct aaagtatcag gcccctctgt acgacccggc tttaatggaa aaaatcatag 3240

atcataatat aaaagccggg caccctatag aggttgacta ttcgtggtgg ggcacctcta 3300

ttcgtgtagt ctttcctaag taagatctga caaagcagca ttagtccgtt gatcggtgga 3360

agaccactcg tcagtgttga gttgaatgtt tgatcaataa aatacggcaa tgctgtaagg 3420

gttgtttttt atgccattga taatacactg tactgttcag ttgttgaact ctatttctta 3480

gccatgccaa gtgcttttct tattttgaat aacattacag caaaaagttg aaagacaaaa 3540

aaaaaaaccc ccgaacagag tgctttgggt cccaagctac tttagactgt gttcggcgtt 3600

ccccctaaat ttctccccct atatctcact cacttgtcac atcagcgttc tctttcccct 3660

atatctccac gaagctt 3677

Claims (10)

1.一种DNA分子，其特征在于，包含从上游到下游依次连接的花粉形成后期特异启动子序列、线粒体信号肽序列和如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述花粉形成后期特异启动子序列为如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述线粒体信号肽序列为如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的DNA分子。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1所述的DNA分子或权利要求4所述的重组载体。

6.一种植物，其特征在于，其包含权利要求5所述的细胞。

7.一种有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将如权利要求1所述的DNA分子构建到表达载体上得到带有所述DNA分子的重组载体；

步骤二、将待转基因和所述重组载体转化到植物细胞中，筛选、培养得到含有所述待转基因和所述DNA分子的转基因植株，其中，所述待转基因和所述DNA分子连锁。

8.如权利要求7所述的有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，其特征在于，所述的DNA分子的上游和下游分别设置有Sma I和Hind III酶切位点。

9.如权利要求7所述的有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，其特征在于，所述待转基因和所述表达载体同时构建于一个表达载体上，以能够连锁表达。

10.如权利要求7所述的有效防止转基因植物花粉逃逸的方法，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1300；所述待转基因为红色荧光蛋白基因；所述红色荧光蛋白基因也同时构建于pCAMBIA1300载体；

步骤二中，筛选时，利用如SEQ ID NO:4和5所示的引物对通过PCR技术检测所述转基因植株的DNA中是否含有所述DNA分子。

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