JP2002533090A - 植物形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アグロバクテリウムによって形質転換し得る双子葉植物および単子葉植物に適用可能な、実生を利用するアグロバクテリウム介在型遺伝子形質転換法を見出した。この形質転換法は、減圧浸潤を利用して、目的の遺伝子を保有するアグロバクテリウムT-DNAを実生へ導入するものである。成熟した時点で、浸潤処理を行った実生から回収した種子を発芽させ、トランスジーンを保有する後代を選択する。この形質転換法では、体細胞胚形成や器官形成といった再生法を必要とすることなく、トランスジーンの安定な遺伝を示す後代が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景 バイオテクノロジーの多くのその他分野と同様に、高等植物の遺伝子形質転換
が作物の改良に対して大きなインパクトを与えることは確実である。遺伝子形質
転換は、ゲノムに安定に組み込まれた新しい遺伝物質を保持するトランスジェニ
ック植物の作出、および特定の形質を持つ「デザイナー（designer）」作物の操
作に用いることができる。遺伝子形質転換にはいろいろな方法が開発されてきて
おり、ますます多くの植物種に適用されている。しかし、遺伝子形質転換方法の
容易性と成功率は植物種間で大きく異なる[Mullerら, 1987. "High meiotic sta
bility of a foreign gene introduced into tobacco by Agrobacterium-mediat
ed transformation,” Mol Gen Genet 207: 171-175; Gasser, C. S. および Fr
aley, R. T. 1989. "Genetically engineering plants for crop improvement,
” Science 244: 1293-1299; Umbeckら, 1989, "Inheritance and expression o
f genes for kanamycin and chloramphenicol resistance in transgenic cotto
n plants," Crop Science 29: 196-201; Gordon-Kammら, 1990. "Transformatio
n of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants,” Plant
Cell 2: 603-618; Chabaudら, 1996, "Transformation of barrel medic (Medic
ago truncatula Gaertn.) by Agrobacterium tumefaciens and regeneration vi
a somatic embryogenesis of transgenic plants with MtENOD12 nodulin promo
ter fused to the gus reporter gene," Plant Cell Rep 15: 305-310; Karら,
1996. "Efficient transgenic plant regeneration through Agrobacterium-med
iated transformation of chickpea (Cicer arientinum L.), "Plant Cell Rep
16: 32-37; Kim, J. W. および Minamikawa, T. 1996. "Transformation and re
generation of French bean plants by the particle bombardment process,”
Plant Sci 117: 131-138; Trieu, A. T. および Harrison, M. J. 1996. "Rapid
transformation of Medicago truncatula: regeneration via shoot organogen
esis, "Plant Cell Rep 16: 6-11; Beanら, 1997. "A simple system for pea t
ransformation,” Plant Cell Rep 16: 513-519; Chengら, 1997. "Genetic tra
nsformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physi
ol 115: 971-980; Chengら, 1997. "Expression and inheritance of foreign g
enes in transgenic peanut plants generated by Agrobacterium-mediated tra
nsformation,” Plant Cell Rep 16: 541-544; および Tingayら, 1997. "Agrob
acterium tumefaciens-mediated barley transformation," Plant J 11: 1369-1
376]。

【０００２】 最も一般的で広く用いられる双子葉植物の形質転換方法では、遺伝子導入する
ために細菌であるアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）を使う。アグロバクテリウム ツメファシエンスは、グラム陰性の土
壌にすむ植物病原体であって、植物宿主に感染し、次いでその遺伝物質の一部を
植物ゲノム中に送り込んで組み入れる。導入されるDNA部分は、T-DNA断片と呼び
、T-DNAにまた別の遺伝物質を付加することができる。この追加の遺伝物質は、T
-DNAと共にゲノムに導入される。このように、アグロバクテリウムは新しい遺伝
子の植物ゲノムへの導入を促進するのに使うことができる（Fraleyら,1983, "Ex
pression of bacterial genes in plant cells," Proc Natl Acad Sci USA 80:
4803-4807）。

【０００３】 アグロバクテリウムを使った形質転換は、タバコやペチュニア等の数多くのモ
デル種で成功してきたが、この方法にも多くの制約がある。多数の単子葉植物種
を含むいくつかの植物種は、アグロバクテリウムの感染にたやすく感受性ではな
い（Potrykus, I. 1990. "Gene transfer to cereals: an assessment," Bio/Te
chnology 8: 535-542）。こうした場合は、パーティクルボンバードメント（par
ticle bombardment）、およびエレクトロポレーション、微量注入法、またはポ
リエチレングリコール仲介の取り込みによるプロトプラストへの直接的遺伝子導
入などの、別の方法が用いられてきた[Kleinら,1987. "High velocity micropro
jectiles for delivering nucleic acids into living cells," Nature 327: 70
-73; McCabeら,1988. "Stable transformation of soy bean (Glycine max) by
particle acceleration," Bio/Technology 6: 923-926; Bommineniら,1994. "Ex
pression of GUS in somatic embryo cultures of black spruce after micropr
ojectile bombardment," J Exp Bot 45: 491-495; Christou, P. 1995. "Strate
gies for variety-independent genetic transformation of important cereals
, legumes and woody species utilizing particle bombardment," Eupytica 85
: 13-27; Kim およびMinamikawa, 1996. Plant Sci 117: 131-138; Kleinら,199
8. "Stable genetic transformation in intact Nicotania cells by the parti
cle bombardment process," Proc Natl Acad Sci USA 85: 8502-8505]。

【０００４】 新しい遺伝物質の送達方法とは無関係に、形質転換した細胞から、稔性の完全
な植物体を再生する必要がある。安定に形質転換したトランスジェニック植物の
作出には、植物細胞の形質転換、およびこれに続く形質転換した細胞から完全な
植物体への再生という、二つの工程が含まれる。ほとんどの場合、植物の組織外
植片を、選択マーカー遺伝子と「目的遺伝子」とを含むT-DNAを保持するアグロ
バクテリウムとインキュベートする。組織外植片中の細胞の一部が転換されるよ
うになり、その後、これら細胞から体細胞胚形成または直接器官形成を介して完
全な植物体を再生する。形質転換体は、再生培地中に、適切な選択条件を含めて
選択する。組織外植片の選択は、植物種に依存する。うまく利用できるものとし
て、葉、子葉、胚軸、子葉分裂組織ならびに胚があげられる。

【０００５】 形質転換と再生のどちらも100%有効ではないために、形質転換した植物を取得
できるかどうかは、同じ細胞内で連続して起る二つの過程に依存する。ほとんど
の場合、トランスジェニック植物の作出は、形質転換に感受性の組織から植物へ
の再生能力の欠如により阻まれる。体細胞の胚形成が実行可能な植物の再生方法
である種にとっては、他にも制約がある。体細胞胚形成により再生された植物は
、著しい体細胞の変異、倍数性の変化、表現型異常や、稔性不全を示すことがあ
る（Beanら,1997, Plant Cell Rep 16: 513-519）。直接器官形成による再生に
おいては、こうした問題のいくつかは克服されているものの、この方法ですべて
の植物が再生できるわけではない。結局、多くの作物で形質転換は可能であるに
も関わらず、通常、高度に再生可能な系統または栽培品種、および優良で農業的
に重要な系統は、形質転換の影響を受け難い。従って、所望形質の優良系統への
導入は、親系統の形質転換後の伝統的な品種改良方法に限られてきた。

【０００６】 新しい形質を発現するトランスジェニック植物系統を開発するために、そこか
ら最もよく発現する系統を選択できる、多数のトランスジェニック植物の作出が
望ましい。多数の植物系統を要するのは、T-DNA断片の植物ゲノムへの組み込み
が無作為な事象であるという事実によるものであり、そのために、各トランスジ
ェニック植物は、そのゲノムの異なる部位に組み込まれた新しい遺伝子を含む。
「位置効果」と呼ばれるこの現象のために、各種トランスジェニック系統が、導
入遺伝子を様々なレベルで発現する（Ulianら、1994. "Expression and inherit
ance pattern of two foreign genes in petunia," Theor Appl Genet 88: 433-
440）。従って、導入遺伝子を高レベルで発現するものを選択するためには、多
数のトランスジェニック系統の作出が望ましいのである。

【０００７】 高度に容易かつ有効な形質転換に成功している唯一の植物は、シロイヌナズナ
（Arabidopsis thaliana）という、植物の発育過程の遺伝分析および分子分析に
広く使われるモデル植物である。形質転換の直接法はシロイヌナズナ用に開発さ
れたものである（Bechtoldら、1993. "In planta Agrobacterium mediated gene
transfer by infiltration of adult Arabidopsi thaliana plants," Comptes
Renus de l�Academie des Sciences Serie III Sciences de la vie 316）。
この形質転換法では、植物を（１）成熟するまで育成し、（２）アグロバクテリ
ウム細胞の懸濁液に浸漬し、（３）短時間、減圧下に保ち、（４）種子を形成さ
せる。一定割合の後代が形質転換される。最近のデータによれば、配偶子の前駆
細胞（gametophyte progenitor）、配偶子、または受精胚が対象となっている（
Bechtold, N.およびPelletier, G. 1998. "In planta Agrobacterium-mediated
transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltrati
on," Methods Mol Biol 82: 259-266）。Bechtoldの方法はその他の種、例えばB
rassica napusやBeta vulgarisにも試されているが、こうした試みは不成功に終
わっている（Siemens, J. Scheiler, O. 1996. "Transgenic plants: genetic t
ransformation-recent developments and the state of the art," Plant Tissu
e Culture and Biotechnology 2: 66-75）。

【０００８】 エンドウ豆、大豆、インゲン豆、アルファルファ、ピーナッツ、ヒヨコ豆、ハ
ト豆およびクローバーなどのマメ科の作物は、世界中の多くの地域で経済的な重
要性を有する。マメ科植物は、動物にとっては穀粒ならびに飼料作物とて、また
人間にとっては穀粒用マメ科植物として、重要なタンパク源である。例えば、大
豆（Glycine max）は動物ならびに人間の食物中の主なタンパク源であり、また
大豆油は世界で最も広く用いられる食用油である。例えば耐病性、除草剤耐性、
耐虫性、タンニンならびにリグニンレベルの低下（飼料マメ科植物）、およびタ
ンパク質ならびに脂質の品質向上などの形質を導入することによって、多様なマ
メ科作物の生産性、すなわちその価値を高めることができる。具体的には、大豆
シスト線虫（soybean cyst nematode）は、年間で最大10億USドルの損失をもた
らす。最近の、ビートシスト線虫（beet cyst nematode）耐性遺伝子およびポテ
トシスト線虫（potato cyst nematode）耐性遺伝子のクローニング（Williamson
, V. M. 1999. Curr Opin Plant Biol 2: 327-31）によって、現在、植物の遺伝
子操作耐性についていろいろな方法が開発されつつある。

【０００９】 遺伝子操作によりマメ科作物にこうした形質を導入する試みがいくつか成され
てきた一方で、組織培養を含む現在の形質転換方法は、極めて労働集約型であり
、非効率である。とりわけ、大きな種子の穀粒用マメ科植物、例えばエンドウ豆
、インゲン豆や大豆は、形質転換が非常に難しいこと、また形質転換に感受性の
組織を再生させることが大変に困難であることが立証されている[Binghamら、19
75. "Breeding alfalfa which regenerates from callus tissue in culture, "
Crop Science 15: 719-721; Hincheeら,1988. "Production of transgenic soyb
ean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer,” Bio/Technology 6
: 915-922; Schroederら、１９９３. "Transformation and regeneration of tw
o cultivars of pea (Pisum sativum L.)" Plant Physiol 101: 751-757; Chaba
udら、1996. Plant Cell Rep 15: 305-310; Karら、1996. Plant Cell Rep 16:
32-37; Kim およびMinamikawa. 1996. Plant Sci 117: 131-138; Trieu およびH
arrison, 1996. Plant Cell Rep 16: 6-11; Beanら、1997. Plant Cell Rep 16:
513-519; Chengら,1997. Plant Cell Rep 16: 541-544; およびDillenら、1997
. "Exploiting the presence of regeneration capacity in the Phaseolus gen
e pool for Agrobacterium-mediated gene transfer to the common bean. Med
edelingen-Faculteit-Landbouwkundige-en-Toegepaste-Biologische-Wetenschap
pen-Universiteit-Gent 62: 1397-1402]。

【００１０】 別の方法で、大豆の分裂組織内の細胞をパーティクルボンバードメント法によ
り形質転換できることが示された。しかし、これは形質転換セクターを持つキメ
ラ植物を生み出す。このセクターのいくつかは、最後には種子を形成し、この種
子が導入遺伝子を保持する（McCabeら、1988. Bio/Technology 6: 923-926; Cho
wriraら、1995. "Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal
meristems in planta: generating transgenic plants without in vitro tiss
ue culture," Molecular Biotechnology 3: 17-23; and Chowriraら、1996. "Tr
ansgenic grain legumes obtained by in planta electroporation-mediated ge
ne transfer," Molecular Biotechnology 5: 85-96）。この手法は、トランスジ
ェニック大豆の作出を可能にしたが、現実にトランスジェニック種子を取得する
機会を得るためには、多数の分裂組織に衝撃を与える必要があるため、非常に労
力を要する。

【００１１】 ウマゴヤシ（Medicago truncatula Gaertn. (barrel medic)）は、二倍体の自
殖性ウマゴヤシ属の一年草で、地中海地方、南アフリカおよびオーストラリアな
どの世界中の多くの地域で牧草用マメ科植物として育成されている（Crawfordら
、1989. "Breeding annual Medicago species for semiarid conditions in Sou
thern Australia," Adv Agron 42: 399-437）。オーストラリアでは、ウマゴヤ
シ属の一年草は、5千万ヘクタールにわたる農耕地において主要なマメ科植物で
あり、多様な種や生態型が開発されてきた。最初の商業用栽培品種はM. truncat
ulaであり、1938年に播種されたもので、この種は低降雨量ならびに高石灰の土
壌の両方に耐性である能力のために好んで用いられてきた（Crawfordら、1989.
Adv Agron 42: 399-437）。ウマゴヤシ（Medicago truncatula）は現在、窒素固
定化リゾビウム／マメ科植物の共生および樹枝状菌根共生研究用のマメ科植物モ
デルとして登場してきた[Cookら、1995. "Transient induction of a peroxidas
e gene in Medicago truncatula precedes infection by Rhizobium meliloti,"
Plant Cell 7: 43-55; van Buurenら、1998．"Novel genes induced during an
arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis between M. truncatula and G. vers
iforme," MPMI 12: 171-181]。M. truncatulaを分子ならびに遺伝分析に利用し
やすいモデル植物としている特徴としては、その小さなゲノム（Arabidopsisよ
り4.5倍大きい）、生活環の速さ、ならびに比較的小さな物理的サイズ、があげ
られる（Barkerら、1990. "Medicago truncatula、a model plant for studying
the molecular genetics of the Rhizobium-legume symbiosis," Plant Mol Bi
ol Rep 8: 40-49）。加えてこの植物は、アグロバクテリウムによって形質転換
され、また体細胞胚形成または直接器官形成によって再生させることができる（
Thomasら、1992. "Genetic transformation of Medicago truncatula using Agr
obacterium with genetically modified Ri and disarmed Ti plasmids, "Plant
Cell Rep 11: 113-117; Chabaudら、1996. Plant Cell Rep 15: 305-310; Trie
u およびHarrison. 1996. Plant Cell Rep 16: 6-11; Hoffmanら、1997. "A new
Medicago truncatula line with superior in vitro regeneration, transform
ation, and symbiotic properties isolated through cell culture selection,
" Mol Plant-Microbe Interact 10: 307-315）。

【００１２】 体細胞胚形成または直接器官形成を介する再生を伴うアグロバクテリウム仲介
による形質転換は実行可能な方法であるが、非常に労力を要するものであり、特
に有効でもなく、進行が遅すぎる場合もある。つまりこうした方法は少数のトラ
ンスジェニック植物の再生には適しているかもしれないが、例えばT-DNA突然変
異誘発または活性化標識法（activation tagging）等の、多くの遺伝的アプロー
チやハイスループットシステムに必要となる、多数の系統作出には利用できない
。

【００１３】 アグロバクテリウムによる形質転換法は現在、顕花植物類または組織外植片よ
りむしろ実生をアグロバクテリウム細胞に接触させるときに主体となる生物学的
材料として用いる場合に利用されてきている。また、処理をした植物の成熟や結
実後、トランスジェニック植物を各種の挿入事象（insertional event）を呈す
る後代群から直接、選択する。この実生の形質転換方法によって、高効率、低労
働力投入、ならびに多数のトランスジェニック植物が提供され、この方法には、
顕花植物または組織外植片の形質転換や体細胞胚形成または直接器官形成による
再生に関わるいかなる問題も伴わない。

【００１４】発明の概要 態様の１つでは、本発明は、実生およびアグロバクテリウムを利用する植物の
直接形質転換法であって、(a)少なくとも１つの実生と、少なくとも１つの遺伝
子または遺伝子断片を含むT-DNAをアグロバクテリウム細胞から該実生へ移入さ
せるベクターを保有するアグロバクテリウム細胞とを接触させ、(b)アグロバク
テリウム細胞と接触した実生にある時点で減圧をかけ、その際、該減圧は、アグ
ロバクテリウム細胞を実生へ密着させてT-DNAをアグロバクテリウム細胞から実
生の細胞へ第２の時点で移入させるのに十分な強さであり、最初の時点および第
２の時点は同一または異なる時点のいずれかである、ことを含んでなる方法であ
る。好適な方法では、該ベクターは選択マーカー遺伝子を含むものである。好適
な選択マーカー遺伝子は除草剤耐性遺伝子である。好適な除草剤耐性遺伝子はba
r遺伝子である。

【００１５】 別の態様では、本発明は、実生およびアグロバクテリウムを利用する植物の直
接形質転換法であって、(a)少なくとも１つの実生と、アグロバクテリウム細胞
の混合物とを接触させ、ここで該混合物は、第１のDNA断片を含むベクターを保
有するアグロバクテリウム株由来の細胞および第２のDNA断片を含むベクターを
保有するアグロバクテリウム株由来の細胞を含んでなり、該ベクターは、T-DNA
をアグロバクテリウム細胞から該実生の細胞へ移入させるものであり、(b)アグ
ロバクテリウム細胞の混合物と接触した実生に第１の時点で減圧をかけ、その際
、該減圧は、アグロバクテリウム細胞を実生へ密着させて少なくとも１つの遺伝
子をアグロバクテリウム細胞から実生の細胞へ第２の時点で移入させるのに十分
な強さであり、第１の時点および第２の時点は同一または異なる時点である、こ
とを含んでなる方法である。好適な方法では、該ベクターは選択マーカー遺伝子
を含むものである。好適な選択マーカー遺伝子は除草剤耐性遺伝子である。好適
な除草剤耐性遺伝子はbar遺伝子である。

【００１６】 別の態様では、本発明は、実生およびアグロバクテリウムを利用する植物の直
接形質転換法であって、(a)少なくとも１つの実生と、少なくとも１つの遺伝子
または遺伝子断片および選択マーカー遺伝子を含むT-DNAをアグロバクテリウム
細胞から該実生へ移入させるベクターを保有するアグロバクテリウム細胞とを接
触させ、(b)アグロバクテリウム細胞の混合物と接触した実生に第１の時点で減
圧をかけ、その際、該減圧は、アグロバクテリウム細胞を実生へ密着させてT-DN
Aをアグロバクテリウム細胞から実生の細胞へ第２の時点で移入させるのに十分
な強さであり、第１の時点および第２の時点は同一または異なる時点であり、(c
)形質転換された実生を成熟するまで育成して種子を形成させ、(d)種子を発芽さ
せて後代を得、(e)該後代を、選択マーカー遺伝子の発現を検出し得る薬剤と接
触させ、(f)選択マーカー遺伝子と少なくとも１つの遺伝子を発現している後代
を選択することを含んでなり、選択マーカー遺伝子と少なくとも１つの遺伝子の
発現が、遺伝子移入の指標となる方法である。好適な方法では、選択マーカー遺
伝子は除草剤耐性遺伝子である。好適な除草剤耐性遺伝子はbar遺伝子である。

【００１７】 さらに別の態様では、本発明は、上述の実生形質転換法に従って形質転換され
た植物である。

【００１８】 さらに別の態様では、本発明は、上述の実生形質転換法に従って形質転換され
た植物に由来する種子である。

【００１９】 さらに別の態様では、本発明は、上述の実生形質転換法に従って形質転換され
た植物から採取された種子に由来する後代植物である。

【００２０】詳細な説明 植物形質転換方法は現在、実生を減圧浸潤にかけて、選択マーカー遺伝子およ
び目的遺伝子を保持するアグロバクテリウムT-DNAを実生に導入する場合に用い
られている。本明細書で用いる実生は、大体、種子の発芽開始から本葉へ発育す
るまでの間の植物と定義される。本明細書に記載の形質転換方法は、どんな植物
の実生にも適用でき、そのような植物として例えばアグロバクテリウム仲介の遺
伝子導入によって首尾よく形質転換できる双子葉植物や単子葉植物があげられる
。特に、マメ科の植物は、高効率で形質転換される。

【００２１】 本明細書に記載の形質転換方法は、通常、目的遺伝子を保持するアグロバクテ
リウム株を液体培地中、選択的条件下で、指数増殖期に達するまで増殖させて行
う。その後、アグロバクテリウム細胞を遠心分離によってペレット状にし、減圧
浸潤用培地に再懸濁する。実生を、アグロバクテリウム細胞懸濁液に浸漬してか
ら、減圧浸潤にかけて、アグロバクテリウム細胞を実生に導入し、形質転換種子
を生成する浸潤植物を得る。この形質転換種子から、形質転換植物を得る。

【００２２】 実生の形質転換は、アグロバクテリウム仲介の遺伝子導入によって成される。
実生の形質転換に有用なアグロバクテリウム株には、形質転換可能な植物細胞と
の接触時に、T-DNAを、組み込み用細胞内の植物ゲノム中に導入できるものであ
れば、いかなる侵略的菌株でも含まれる。本明細書に記載の形質転換方法におけ
るアグロバクテリウム株は、複数の目的遺伝子を含む1つのプラスミドを保持で
きる。または、例えば特定のDNAライブラリから選択した断片などの、DNAの異な
る断片を複数保持するベクターを含むアグロバクテリウム細胞の混合物を使って
、形質転換を行う。所定の植物において最適な形質転換率を達成するには、最大
数の形質転換実生を提供するアグロバクテリウム株を選択する。マメ科の植物に
は、アグロバクテリウム ツメファシエンスEHA105、ASE1、およびGv3101株の使
用が好ましい。目的遺伝子のアグロバクテリウムへの転換は、当業者に公知のど
の方法によっても行うことができる。例えば、形質転換した状態を作るのに必要
な遺伝子をも含むアグロバクテリウムTiプラスミドのT-DNAへ、目的遺伝子を含
むように改変したDNA断片を挿入できる。

【００２３】 アグロバクテリウムプラスミドT-DNAに別の改変を施して、形質転換の過程を
補助することもできる。例えば、うまく形質転換された実生を識別するのに、選
択可能マーカー遺伝子をアグロバクテリウムプラスミドのT-DNAに組み込むこと
ができる。ここで述べる形質転換方法に有用な、選択可能マーカー遺伝子は、ア
グロバクテリウムT-DNAに組み込むことができ、かつ発現時に形質転換した後代
と非形質転換の後代とを識別可能であれば、いかなる選択可能マーカー遺伝子で
もよい。典型的な選択可能マーカーとしては、ネオマイシン移入酵素遺伝子また
はホスフィノトリシン（phosphinothricin）アセチル移入酵素（bar）遺伝子が
あげられる。例えば、好適な選択マーカーは、ホスフィノトリシンを主成分にし
た除草剤への耐性を付与する、ホスフィノトリシンアセチル移入酵素をコードす
るbar遺伝子があげられる。好ましくは、選択マーカー遺伝子および目的遺伝子
を、形質転換するアグロバクテリウム株との使用に適するベクターに組み込む。
例えば、35Ｓプロモーターおよびオクトピンシンターゼ3�配列の制御下で、
ホスフィノトリシンアセチル移入酵素（bar）遺伝子のコピーをＴ−ＤＮＡのＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位に挿入するように、バイナリベクター、ｐBI121ベクター（Clo
ntech, Palo Alto, CA）を改変できる。bar遺伝子は、IgniteÒ（AgroEvo,
Frankfurt, Germany）などのホスフィノトリシンを主成分とする除草剤への耐性
を付与するホスフィノトリシンアセチル移入酵素をコードする。この選択可能マ
ーカーによって、形質転換植物を簡単に選択することができる。具体的には、植
物にホスピノトリシン(phospinothricin、PPT)を含む除草剤を噴霧すると、bar遺
伝子を含有する形質転換植物だけがこの除草剤への暴露後にも生存できる。

【００２４】 実生の形質転換工程においては、スターターの種子を前処理して発芽を最適化
し、結果として得られる実生を形質転換用に調製できる。発芽する種子に感染し
て妨げとなるような微生物を全て除去するために、種子の表面殺菌をすると好ま
しい。種子に有害な影響を与えないものであれば、いかなる殺菌方法でも利用で
きる。典型的な方法として、20-30％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液または70％
エタノール水溶液の使用があげられる。好ましくは、種子を30％次亜塩素酸ナト
リウム水溶液と0.1％Tween20の溶液中でおよそ5分間殺菌した後、徹底的にすす
いで殺菌溶液を除去する。また好ましくは、滅菌再蒸留水もしくは脱イオン化水
、または逆浸透、イオン交換および／または活性炭処理後の酸化可能な還元炭素
を含む水を使って、種子をすすぐ。いくつかの種子、例えばM.truncatulaは、長
期の休眠を経験すると発芽が遅れる。こうした種子は、休眠をやめさせることの
できる種皮処理(scarification)工程で処理できる。具体的には、種皮を裂くか
、引っかき傷をつけるかし、この種子を浸漬して種皮を軟化させるか、または調
節的酸処理を利用できる。好ましくは、濃硫酸中でおよそ10分間処理をし、次い
で徹底的にすすいで酸を除去する。また好ましくは、滅菌再蒸留水もしくは脱イ
オン化水、または逆浸透、イオン交換および／または活性炭処理後の酸化可能な
還元炭素を含む水を使って、種子をすすぐ。

【００２５】 前処理後、発芽とこれに続く実生の生育を支援できる培地に置床する。例えば
、種子は滅菌濾紙またはペパータオル表面に置床できる。好ましくは、種子を、
ペトリ皿中の堅固な滅菌水アガー表面に播く。次に種子を、発芽を誘導し、これ
に続く実生の生育を支援できる環境条件下におく。M. truncatula等の特定の植
物には、好ましくは春化処理を施して顕花を促す。得られた実生のインキュベー
ションは、実生が、減圧浸透に適した発育段階に達するまで継続する。減圧浸透
の最適齢は、植物によって異なる。通常、根が生じて少なくともおよそ1cmに生
育した実生であれば、十分に成熟している。しかし、植物は異なる速度で発育す
るので、ここに開示する方法を用いて各種発育段階にある実生をスクリーニング
し、形質転換効率が最大になる段階を決定することによって、減圧浸潤を特定植
物用に最適化できる。インキュベーションの時間および温度も、特定品種に最適
の条件を提供するように調整できる。例えば、種子を発芽培地に置床してからお
よそ15日後であれば、M. truncatulaおよび大豆の実生は、減圧浸潤用に十分成
熟する。

【００２６】 減圧浸潤の数日前に、形質転換するアグロバクテリウムを、形質転換後のアグ
ロバクテリウム細胞を識別するために、好ましくは適切な抗生物質を含む通常の
平板増殖培地で継代培養する。例えば、bar遺伝子を保持するアグロバクテリウ
ムツメファシエンスEHA105およびGv1301を、好ましくは、リファンピシン（20mg
/l）およびカナマイシン（50mg/l）を含む、実施例１に定義するYEP培地で培養
する。アグロバクテリウムの培養物は、およぼ28℃で約２日から３日間、増殖さ
せる。

【００２７】 減圧浸潤の一日前、アグロバクテリウムの増殖に適した、通常の増殖培地中に
、適当な接種材料を無菌的に移し、アグロバクテリウム培養液を調製する。形質
転換したアグロバクテリウムを選択するために適当な抗生物質を含む、TY液体培
地およびYEP液体培地が、アグロバクテリウムEHA105およびGv1301には好ましい
。アグロバクテリウムが指数増殖に達するような条件下で、液体培養を行う。好
ましくは、液体培養物を、振とうインキュベーターで約28℃、およそ250rpmで一
晩、インキュベートする。形質転換を達成するために、必ず新鮮なアグロバクテ
リウムを使う。

【００２８】 形質転換に最適の条件を提供するために、指数増殖期にある形質転換するアグ
ロバクテリウム液体培養物（OD₆₀₀=1.6）を用いて、減圧浸潤を行うと好ましい
。液体培養物中のアグロバクテリウム細胞は、遠心分離によってペレット状にし
、2容量の減圧浸潤用培地（例えば、15mlの液体培地中に増殖したアグロバクテ
リウム細胞を、遠心分離によってペレット状にし、30mlの減圧浸潤用培地中に再
懸濁する）に再懸濁する。減圧浸潤用培地としては、浸潤工程、および植物の生
育と両立する形で植物内のアグロバクテリウムを支援できる植物成長培地であれ
ばどれでも使用できる。より好ましくは、減圧浸潤用培地は、アグロバクテリウ
ムのvir遺伝子を誘導するアセトシリンゴン（acetosyringone）から成る。マメ
科の植物用には、実施例１および２で定義する減圧浸潤用培地の使用が好ましい
。

【００２９】 減圧浸潤を行うためには、発芽／インキュベーション培地から実生を取り出し
、数個の実生ならびに1容量の減圧浸潤用培地を保持できる清潔な容器内に、実
生を部分的に覆うように置床する。このためには、ペトリ皿（シャーレ）が使い
やすく、プレート1枚につき、30個から40個の実生を使用する。減圧浸潤用培地
中のアグロバクテリウム懸濁液を、容器に加えて実生を湿らせ、これを部分的に
覆う。標準的なペトリ皿には、およそ10ｍｌの懸濁液で十分である。アグロバク
テリウムの懸濁液中に実生を含有するペトリ皿を、真空チャンバに入れる。形質
転換工程に使用される好ましい減圧量は、実生のアポプラスト空間内にアグロバ
クテリウムを入れるのに必要最低限の量である。およそ28mmHgであればM.trunca
tulaおよび大豆の形質転換に十分であった。実生に減圧をかける時間と方法は、
植物しだいであり、経験的に決定しなければならない。減圧をかけ、次いで放出
できる。あるいは、減圧をかけて、放出、再度かけて、再び放出することもでき
る。減圧持続時間はおよそ0.1分から5分、より好ましくは0.5分からおよそ2分、
最も好ましくはおよそ1分間である。M.truncatulaであれば、植物を減圧下に0.5
分間おき、次いで2分間おいてトランスジェニック植物を作出するが、最大形質
転換効率をだすには減圧下に1分間おく。

【００３０】 減圧浸潤後、アグロバクテリウム懸濁液を別容器に移し、実生を滅菌濾紙かま
たは吸い取り紙にブロットする。次に実生を、植物が完全に育ち、発達でき、種
子を生成できる、完全混合土壌（complete soil mix）に植え付ける。実生はそ
の後成熟させ、種子を形成させる。好ましくは、植物をその育成に適した湿度、
温度、光周期(photo period)の持続時間、光のスペクトルに保つ。形質転換植物
の生育力を増し、形質転換効率を高めるには、完全混合土壌に植え付ける2、３
日前に、任意に、共培養培地上でインキュベートする。実生の生育を支援する共
培養培地であればいかなるものでも使用できる。マメ科植物には、実施例１およ
び２に記載の共培養培地が好ましい。それから植物を成熟するまで発育させ、種
子を形成させる。種子の一部が、そのゲノム中にトランスジーンを保持する。種
子を発芽させ、トランスジーンの安定な遺伝形質を示す後代を選択する。

【００３１】 トランスジーンの安定な遺伝を示す後代の識別には、当業界で公知の方法をい
くつか使用できる。目的遺伝子が目に見える表現型の変化をもたらす、トランス
ジェニック植物は、後代の目視試験に基づいて選択できる。選択可能マーカー遺
伝子を含むプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いる植物の形質転換に
は、植物に適当な選択可能な剤を用いて形質転換体を選択できる。形質転換植物
のゲノム中に存在する形質転換遺伝子の存在確認には、任意でサザンブロット分
析またはPCR分析を利用できる。

【００３２】 本発明の実生の形質転換工程については、さらに下記の実施例において詳細を
説明する。これら実施例は本発明について記載するものであるが、特定の植物の
形質転換を最適化するためにこうした方法に変更が加えられること、ならびにこ
うした変更が本発明の範囲内に含まれることについては、当業者にはよく理解さ
れることであろう。

【００３３】実施例１： ウマゴヤシ(M. truncatula)実生の減圧浸潤による形質転換 本発明の形質転換法を使用し、ウマゴヤシ(M. truncatula)の実生を形質転換
し、bar遺伝子およびnptII遺伝子を同植物のゲノムに組み込んだ。

【００３４】予備実験 形質転換に先立って、35Sプロモーターおよびオクトピン合成酵素3�配列の
制御下で、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(bar)遺伝子のコピ
ーをT-DNAのHindIII部位に挿入しプラスミドpBI121-barを作成することによって
、バイナリーベクターの改良バージョンであるpBI121ベクター（クロンテック、
Palo Alto、CA）を作製した（図１）。構築物を制限分析およびPCR分析によって
確認し、次にアグロバクテリウム-ツメファシエンス株EHA105（Hoodら、1993年
、"New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants"、Trans
Res 2:208-218）に形質転換した。アグロバクテリウムには、表IIIに示すよう
に、付加構築物も得られた。以下の処置をアグロバクテリウム株EHA105中のpBI1
21-barに実施する一方で、プラスミドを維持するのに必要な特定の抗生物質を成
長媒体に追加したことを除いて同様の処置を他の構築物にも実施した。

【００３５】１日目： ウマゴヤシ(M. truncatula)の種子を以下のとおりに滅菌、発芽させた。種子
を濃H₂SO₄に約10分浸漬した。酸を除去し、種子を滅菌冷再蒸留水で十分に洗浄
した。この処理は、ウマゴヤシの休眠を中断させるために行なった。

【００３６】 次に種子を、30% Clorox/0.1% Tween 20溶液等の滅菌用溶液に、静かに撹拌し
ながら約５分間浸漬することによって表面滅菌を行なった。種子を滅菌冷再蒸留
水で十分に洗浄した。

【００３７】 続いて種子を、シャーレ中の堅固な水−寒天(例えば0.8%)（Sigma Chemical C
o.、 St. Louis、MO）上に播いた。種子を含む水−寒天入りのシャーレをアルミ
ニウムホイルで包装し、４℃で15日間放置した。この春化処理は、ウマゴヤシの
早期開花を促進するために行なった。

【００３８】約12日目： pBI121-barを有するアグロバクテリウム-ツメファシエンスEHA105を継代培養
し、リファンピシン(20mg/l)およびカナマイシン(50mg/l)を含有するYEP培地(1L
中、10gバクトペプトン(Difco、Detroit、MI)、10g酵母抽出物、5g NaClおよび1
5gバクトアガー(Difco、Detroit、MI)、無調整でpH6.8)を含む新鮮な寒天プレー
ト上に単離し、その継代培養物を約28℃で2〜3日程度インキュベートした。

【００３９】約14日目： １白金耳または大型のコロニー３つ程度のアグロバクテリウム継代培養物を、
リファンピシン(20mg/l)およびカナマイシン(50mg/l)を含有する約15mlのTY液体
培地（1L中、5gトリプトン、3g酵母抽出物、0.88g CaCl₂・2H₂O、pH7）に接種し
、28℃のシェーカで、250rpmで一晩インキュベートした。

【００４０】約15日目： アグロバクテリウム液体培養物を、指数増殖期(OD₆₀₀1.6)に達するまで増殖し
た。アグロバクテリウム細胞を遠心分離によってペレット化し、減圧浸潤培地(V
IM) [1L中、100X濃度の10mlPDM塩溶液（100X濃度400ml中、100g KNO₃、12g NH₄H ₂ PO₄、16g MgSO₄・7H₂O、0.4g MnSO₄・H₂O、0.2g H₃BO₃、0.008g CuSO₄・5H₂O、
0.04g KI、0.004g CoCl₂・6H₂O、0.04g ZnSO₄・7H₂Oおよび0.004g Na₂MoO₄・2H₂ O、ろ過滅菌し室温に保存された）、10ml PDM鉄およびビタミン（100X濃度1L中
、0.5gニコチン酸、0.05gピリドキシン・HCl、0.5gチアミン・HCl、100gミオイ
ノシトール、1.5g FeSO₄・7H₂Oおよび2g Na₂EDTA、ろ過滅菌、即時使用の場合4
℃保存、長期保存の場合-20℃保存）、0.2g CaCl₂・H₂O、1.5mlの10mMベンジル
アミノプリン(BAP、2N NaOH 0.15mlおよび再蒸留水24.85ml中に0.0565g、4℃保
存)、10mMα-ナフタレン酢酸 0.05ml（NAA、95%エタノール3mlおよび70％エタノ
ール22ml中に0.0465g、4℃保存）、10gショ糖、および0.1mlアセトシリンゴン(A
S；DMSO中１M、-20℃保存)、ここでPDM塩、PDM鉄およびビタミン、CaCl₂・H₂Oお
よびショ糖を合一にし、pHをKOHで5.8に調整し、液体循環にて20分間オートクレ
ーブする、また培地を50℃に冷却した際に、BAP、NAAおよびASを添加する]30ml
に再懸濁した。

【００４１】 実生を水寒天プレートから取り出し、清潔な標準シャーレに、１シャーレ当た
り約30〜40のウマゴヤシ(M. truncatula)実生を配置した。実生を湿潤し、部分
的に覆うのに十分な容量の減圧浸潤培地中の約10mlのアグロバクテリウム懸濁液
をシャーレに添加した。アグロバクテリウム懸濁液に湿潤した実生を含むシャー
レを真空チャンバーに配置した。３つの減圧浸潤法を試した。処理１では、約１
分間28mmHgに真空引きし、続いて急速に解放、再び約１分間28mmHgに真空引きし
、そして最後に急速に解放した。処理２では、約1.5分間28mmHgに真空引きし、
続いて急速に解放、再び約1.5分間28mmHgに真空引きし、そして最後に急速に解
放した。処理３では、約40秒間28mmHgに真空引きし、次に20秒間保持し、最後に
急速に解放した。これらすべての処理において、続いて実生を滅菌ろ紙または吸
取り紙上にブロットし、共培養培地(CM)[1L中、10X濃度の10mlのPDM塩溶液、10m
lのPDM鉄およびビタミン、0.2g CaCl₂・H₂O、10g ショ糖、7.5g寒天−寒天(Sigm
a Chemical Co.、St. Louis、MO)、および0.1ml AS、ここでPDM塩、PDM鉄および
ビタミン、CaCl₂・H₂O、寒天−寒天、およびショ糖を合一にし、pHをKOHで5.8に
調整し、液体循環にて20分間オートクレーブする、また培地を50℃に冷却した際
に、ASを添加する]を含むシャーレに播いた。実生を成長チャンバーにて、表Iの
とおりの条件下で、約2〜3日間インキュベートした。

【００４２】

【表１】

【００４３】約17日目： 実生を水で２度洗浄し、Metro-mix 200土壌混合物を含むポットに移植した。
植物を周囲湿度にゆっくりと適応させるために、以下のような手順に従った。実
生を含むポットをまずプラスチック製の蓋で覆い、１週間後、その蓋の一部を開
き、２、３日後に蓋を完全に取り去った。植物は、１日18時間、22〜25℃という
、植物の成育に最適な条件下で成熟することができた。

【００４４】約40日目： 土壌に移植してから約24日で植物は開花し始めた。得られた種子を採取し、発
芽に最適な条件下で発芽させた。すなわち、湿潤ろ紙上で４日間、短期間冷却処
理(short cold treatment)を行ない、室温で１〜２日放置し、次に土壌に移植し
た。実生から２、３枚の葉が発生した時点で（約15日齢）、これら実生に80mg/L
PPT（-20℃で保存した600mg/ml溶液の約1/7,000希釈液）を散布した。結果を以
下に示す。

【００４５】 本実験においては、120のウマゴヤシ(M. truncatula)実生を、上記のpBI121-b
arプラスミドを有するアグロバクテリウム-ツメファシエンス株EHA105で減圧浸
潤した。３つの異なる処理を使用し、１処理毎に40の実生を浸潤した。これらの
処理では、減圧浸潤処理の時間のみを変化させた。湿潤した植物を成熟させ、種
子を設けた。後代実生にイグナイト(PPT)を散布し、耐性の実生を、bar遺伝子、
nptII遺伝子およびB-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子が存在しているかどうかに関
してさらに分析した。結果を表IIに示す。図2A、2B、3Aおよび3Bは、表IIの実験
T84-1、T84-2およびT84-3で得られたデータを示す。これらの結果は、種々の形
質転換実験において形質転換効率が2.9％〜27.6％の範囲にわたることを示して
いる。

【００４６】

【表２】

【００４７】 ^a以下のような処理方法を使用した。T84-1、T87-1、T87-2、T87-3、T87-4、T8
7-7およびT88については１分間(2X)浸潤し、T84-2については1.5分間(2X)浸潤し
、T84-3については40秒間浸潤し、20秒間保持した。

【００４８】 ^b本実験においては、以下のアグロバクテリウム-ツメファシエンス株およびバ
イナリーベクターを使用した：バイナリーベクターpSLJ525（Jonesら、1992年、
"Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes,
and assaying transposon excision in transgenic plants," Trans. Res. 1:2
85-297）またはpSK1006 (http://www.salk.edu/LABS/pbio-w/)を有するアグロバ
クテリウム-ツメファシエンス株ASE1。pBI121-barもしくはPKYLX7-Gus (Frankli
nら、1993年、"Genetic transformation of green bean callus via Agrobacter
ium mediated DNA transfer," Plant Cell Rep 12:74-79)、pBINmgfp-ER-bar、
またはpGA482-barを有するアグロバクテリウム-ツメファシエンス株EHA105。pSK
I015(Kardailskyら、1999年、"A pair of related genes with antagonistic ro
les in floral induction," Science 286, 1962-1965)を有するアグロバクテリ
ウム-ツメファシエンス株Gv3101。いくつかのベクターへのbar遺伝子の付加は以
下のように行なった。ｐSLJ525から35S-bar-OCS 3� 配列カセットを含有する
HindIII/HpaI断片を切除し、pGA482のHindIII部位とHpaI部位の間に挿入し、pGA
482-barを作製した。同じHindIII/HpaI断片を使用してpBI121-barおよびpBINmgf
p-ER-barを作製した。これらのベクターのそれぞれに関して、HpaI-HindIIIリン
カーを付加することによってHpaI部位をHindIII部位に変換し、次にHindIII断片
をpBI121またはpBINmgfp-ERのHindIII部位に挿入し(Haseloffら、1997年、"Remo
val of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescen
t protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly,"
Proc. Natl. Acad. Sci, USA 94:2122-2127, 1997)、それぞれpBI121-barおよび
pBINmgfp-ER-barを作製した。 ^c ND= 測定せず

【００４９】 処理T84-1、T84-2およびT84-3により形質転換された植物をサザンブロット分
析によっても分析し、植物におけるトランスジーンの存在を証明した。22のトラ
ンスジェニック植物（処理T84-1から12植物、処理T84-2から6植物、および処理T
84-3から4植物）からDNAを単離し、制限酵素HindIIIで消化した。消化されたDNA
を電気泳動で分離し、ナイロン膜にブロットした。その膜を、³²P-dATPで標識し
たbar遺伝子の内部DNA断片(450bp)でプローブした。すべての形質転換植物が、b
arプローブにハイブリダイズしたDNA断片を含んでおり、この遺伝子がゲノムに
組み込まれていることを示した（図2Aおよび2B）。プラスミドpBI121-bar DNAを
陽性対照としてブロットに含ませ、形質転換されていないウマゴヤシ(M. trunca
tula)から採取したDNAサンプルを陰性対照として含ませた。予想したとおりbar
プローブは、プラスミドDNAにはハイブリダイズしたが、非形質転換体のウマゴ
ヤシ(M. truncatula)から採取したDNAにはハイブリダイズしなかった（図2Aおよ
び2B）。プラスミドから得られるハイブリダイズする断片の予想されるサイズは
1.6kbであったが、実際にはすべての断片はこのサイズよりも大きく、おそらく
これは左側境界方向の再配列(rearrangement)によるものと考えられる。ブロッ
トを取り除き、³²P-dATPで標識したnptII遺伝子(766bp)の内部断片で再度プロー
ブした。nptII遺伝子は、pBI121-barプラスミド上の、T-DNAの右側境界とbar遺
伝子の間に存在している（図１）。すべての形質転換植物が、nptIIプローブに
ハイブリダイズしたDNA断片を含んでおり、この遺伝子がゲノムに組み込まれて
いることも示した。この消化物とプローブの組み合わせで右側境界の分析を行な
い、独立した形質転換体の存在を証明した。例えば、形質転換体1.6、1.10、1.1
1、1.14、1.13および2.12で示されるユニークなbar-ハイブリダイジング断片は
、これらが独立形質転換体である証拠を提供した。さらにまた、非形質転換対照
植物は、このプローブにハイブリダイズ可能なDNAを含まない（図3Aおよび3B）
。pBI121-bar T-DNAもまた、bar遺伝子と左側境界の間にGUS遺伝子のコピーを含
むが（図１）、この遺伝子は形質転換植物では検出することができなかった。選
択マーカーと左側境界の間に位置する遺伝子の損失は従来から報告されているが
、形質転換植物におけるGUS遺伝子の損失はこうした知見を裏付けるものであっ
た。こうした結果は、barサザン分析と一致しており、barハイブリダイジング断
片が予想していたより大きかったことを説明した。このように、GUS遺伝子また
は任意の目的遺伝子がプラスミド中bar遺伝子と（nptII遺伝子の位置にある）右
側境界の間に挿入されており、確かに組み込まれていることが証明された。

【００５０】 トランスジェニック植物から種子を採取し発芽させ、得られた実生にPPT除草
剤を散布した。トランスジェニック植物の後代もまた、PPTに対して強い耐性を
有しており、トランスジーンが安定であり、次世代に受け継がれていることを示
した。表IIIに示すように、トランスジーンが安定したメンデルの法則で遺伝し
ていることを示すデータが得られた。結果は、T1世代を越えて系統が伝達するこ
とが可能であることを示す。

【００５１】

【表３】

【００５２】実施例２：ダイズ実生の減圧浸潤による形質転換 本発明の形質転換法を使用し、ダイズの実生を形質転換し、bar遺伝子を同植
物のゲノムに組み込んだ。

【００５３】１日目： ダイズの種子を次に20％次亜塩素酸ナトリウム溶液に、静かに撹拌しながら約
５分間浸漬することによって表面滅菌を行なった。種子を滅菌再蒸留水で８回洗
浄した。続いて種子を、大量の水中に入れ、室温にて３〜12時間吸水させた。

【００５４】 次に種子をシャーレ中の堅固な水−寒天(例えば0.8%)（Sigma Chemical Co.、
St. Louis、MO）上に播いた。種子を含む水−寒天入りのシャーレをアルミニウ
ムホイルで包み、18〜20℃で15日間放置した。

【００５５】約12日目： bar遺伝子のコピーを含むSKI015ベクターを保有するアグロバクテリウム-ツメ
ファシエンスGv3101を継代培養し、リファンピシン(10 mg/l)、カナマイシン(50
mg/l)、カルベニシリン(50mg/l)およびゲンタマイシン(20 mg/l)を含有するYEP
培地(1L中、10gバクトペプトン(Difco)、10g酵母抽出物、5g NaClおよび15gバク
トアガー(Difco)、無調整でpH6.8)を含む新鮮な寒天プレート上に単離し、その
継代培養物を約28℃で2〜3日程度インキュベートした。

【００５６】約14日目： １白金耳または大型のコロニー３つ程度のアグロバクテリウム継代培養物を、
リファンピシン(10mg/l)、カナマイシン(50mg/l)、カルベニシリン(50mg/l)およ
びゲンタマイシン(20 mg/l)を含有する約15mlのTY液体培地（1L中、5gトリプト
ン、3g酵母抽出物、0.88g CaCl₂・2H₂O、pH7）に接種し、28℃のシェーカで、25
0rpmで一晩インキュベートした。

【００５７】約15日目： アグロバクテリウム液体培養物を、指数増殖期(OD₆₀₀1.6)に達するまで増殖し
た。アグロバクテリウム細胞を遠心分離によってペレット化し、減圧浸潤培地(V
IM) [1L中、100X濃度の10mlPDM塩溶液、10ml PDM鉄およびビタミン、0.2g CaCl₂ ・H₂O、1.5mlの10mMベンジルアミノプリン(BAP、2N NaOH 0.15mlおよび再蒸留水
24.85ml中に0.0565g、4℃保存)、0.05mlの10mMα-ナフタレン酢酸 （NAA、95%エ
タノール3mlおよび70％エタノール22ml中に0.0465g、4℃保存）、10gショ糖、お
よび0.1mlアセトシリンゴン(AS；DMSO中１M、-20℃保存)、ここでPDM塩、PDM鉄
およびビタミン、CaCl₂・H₂Oおよびショ糖を合一し、pHをKOHで5.8に調整し、液
体循環にて20分間オートクレーブする、また培地を50℃に冷却した際に、BAP、N
AAおよびASを添加する]30mlに再懸濁した。

【００５８】 実生を水寒天プレートから取り出し、清潔な標準シャーレに、１シャーレ当た
り約10〜20のダイズ実生を配置した。実生を湿潤し、部分的に覆うのに十分な容
量の減圧浸潤培地中の約20mlのアグロバクテリウム懸濁液をシャーレに添加した
。アグロバクテリウム懸濁液に湿潤した実生を含むシャーレを真空チャンバーに
配置した。約２分間28mmHgに真空引きし、急速に解放、再び約２分間28mmHgに真
空引きし、そして最後に急速に解放した。続いて実生を滅菌ろ紙または吸取り紙
上にブロットし、共培養培地(CM)[1L中、10X濃度の10mlPDM塩溶液、10mlのPDM鉄
およびビタミン、0.2g CaCl₂・H₂O、10g ショ糖、7.5g寒天−寒天(Sigma Chemic
al Co.、St. Louis、MO)、および0.1ml AS、ここでPDM塩、PDM鉄およびビタミン
、CaCl₂・H₂O、寒天−寒天、およびショ糖を合一にし、pHをKOHで5.8に調整し、
液体循環にて20分間オートクレーブする、また培地を50℃に冷却した際に、ASを
添加する]を含むシャーレに播いた。実生を表IVのとおりの条件下で、成長チャ
ンバーにて約６〜７日間、培地上の実生の周辺でアグロバクテリウムの成育が観
察されるまでインキュベートした。

【００５９】

【表４】

【００６０】約17日目： 実生を水で２回洗浄し、Metro-mix 200土壌混合物を含むポットに移植した。
植物を周囲湿度にゆっくりと適応させるために、以下のような手順に従った。実
生を含むポットをまずプラスチック製の蓋で覆い、１週間後、その蓋の一部を開
き、２、３日後に蓋を完全に取り去った。温室内の最適成育条件下で植物を成熟
させた。

【００６１】約40日目： 植物が開花し始めた。得られた種子を採取し、３時間水に浸漬し発芽させた後
、ただちに土壌に移植した。実生から葉が１枚発生した時点で、これら実生に10
0ml/l PPT（-20℃で保存した0.1% Tween 20中の600mg/ml溶液の約1/6,000希釈液
）を散布した。結果を以下に示す。

【００６２】 本実験において、30個のダイズ実生を、上記のSKI015-barプラスミドを有する
アグロバクテリウム-ツメファシエンス株Gv3101で減圧浸潤した。浸潤した30個
のダイズ実生のうち生き残った14個をポットに移植し、成熟させ種子を得た。約
700個の後代種子を採取し、発芽させ、バーミキュライト中で成育させた。実生
が少なくとも１枚の本葉を有した後、PPT除草剤を散布した。PCR分析を実施し、
PPT除草剤から生き残った植物はそのゲノム内にbar遺伝子を有していることを確
認した。生き残った各々の植物からDNAを抽出し、bar特異的プライマーを使った
PCR反応で鋳型として使用した。少なくとも11個の形質転換植物由来DNAサンプル
から、予想されるサイズの断片を増幅したところ、これらの植物が形質転換され
ていることが確認された。形質転換の頻度は約1.57%であった。

【００６３】 総括すると、本明細書に記載の実生形質転換法は、従来から報告されている方
法よりも効果的であり、かつ労力が少なくてすむ。さらに、体細胞の変質が回避
され、精選された系統への遺伝物質の直接導入を可能にする。多種多様な組み込
み事象を表わす多くの形質転換植物をきわめて迅速にかつ効果的に作製すること
が可能であり、次の世代まで安定的にトランスジーンが遺伝される。組織培養に
よるアグロバクテリウム形質転換細胞の再生に関する主要な困難性は本発明の形
質転換法によって回避されることから、本発明の形質転換法はアグロバクテリウ
ム形質転換細胞の再生に問題があった、ダイズ、インゲン、エンドウ等のマメ科
植物において有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、バイナリベクター（binary vector）ｐBI121-barからのT−DNAのマッ
プを示す。

【図２ａ】 図２ａは、barプローブとハイブリダイズしたトランスジェニック植物（浸潤
させた植物の子孫）からのHindIII消化DNAのサザンブロットである。1.3から1.8
のサンプルは、処理１（1分間の減圧浸潤）から得たもの；2.2から2.7のサンプ
ルは、処理２（1.15分間の減圧浸潤）から得たもの；および3.1から3.5のサンプ
ルは、処理3（40秒間の減圧浸潤後、20秒間放置）から得たものである。ｐBI121
-barプラスミドDNAは、ブロットの左側に含まれる。この部分のブロットは、切
除し、残りのブロットよりもさらに短時間だけ暴露して、過剰な暴露を防ぐ。C
は、非形質転換対照M. truncatula植物からのDNAである。

【図２ｂ】 図２ｂは、barプローブとハイブリダイズしたトランスジェニック植物（浸潤
させた植物の子孫）からのHindIII消化DNAのサザンブロットである。1.3から1.8
のサンプルは、処理１（1分間の減圧浸潤）から得たもの；2.2から2.7のサンプ
ルは、処理２（1.5分間の減圧浸潤）から得たもの；および3.1から3.5のサンプ
ルは、処理3（40秒間の減圧浸潤後、20秒間放置）から得た。ｐBI121-barプラス
ミドDNAは、左側に含まれる。この部分のブロットは、切除し、残りのブロット
よりもさらに短時間だけ暴露して、過剰な暴露を防ぐ。Cは、非形質転換対照M.
truncatula植物からのDNAである。

【図３ａ】 図３ａは、npt IIプローブとハイブリダイズしたトランスジェニック植物（浸
潤させた植物の後代）からのHindIII消化DNAのサザンブロットである。1.6から1
.20のサンプルは、処理１（1分間の減圧浸潤）から得たもの；2.12から2.13のサ
ンプルは、処理２（1.15分間の減圧浸潤）から得たものである。Cは、非形質転
換対照M. truncatula植物からのDNAである。

【図３ｂ】 図３ｂは、barプローブとハイブリダイズしたトランスジェニック植物（浸潤
させた植物の後代）からのHindIII消化DNAのサザンブロットである。1.6から1.2
0のサンプルは、処理１（1分間の減圧浸潤）から得たもの；2.12から2.13のサン
プルは、処理２（1.5分間の減圧浸潤）から得たものである。Cは、非形質転換対
照M. truncatula植物からのDNAである。

【図４】 図４は、bar特異的プライマーを使ったPCRによって、トランスジェニック大豆
植物由来のDNAから増幅させたbar遺伝子の一部を示す、アガロースゲル。423bp
の増幅断片を矢印で示す。Mとしたレーンは、分子量マーカーを含む。500bpマー
カーを示す。6から27のサンプルは、除草剤処理後に生存した大豆形質転換体で
ある。形質転換体6、13、14、15、および16は、正確なサイズの増幅断片を示す
。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年２月１６日（２００１．２．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD10 CD21 4B024 AA08 CA02 DA01 EA04 FA10 GA11 GA16 4B065 AA11X AA11Y AA89X AB01 AC20 BA02 BA25 BA30 BD50 CA53

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 実生およびアグロバクテリウムを利用する植物の直接形質転
   換法であって、 (a)少なくとも１つの実生と、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子断片を含
   むT-DNAをアグロバクテリウム細胞から前記実生へ移入させるベクターを保有す
   るアグロバクテリウム細胞とを接触させ、 (b)前記アグロバクテリウム細胞と接触した前記実生に第１の時点で減圧をか
   け、その際、該減圧は、前記アグロバクテリウム細胞を前記実生へ密着させて前
   記T-DNAを前記アグロバクテリウム細胞から前記実生の細胞へ第２の時点で移入
   させるのに十分な強さであり、前記第１および第２の時点は同一または異なる時
   点である、 ことを含んでなる前記方法。 【請求項２】 (c)前記実生を成熟するまで育成して種子を形成させ、 (d)前記種子を発芽させて後代を得、 (e)移入した前記遺伝子を発現する後代を選択する ことをさらに含んでなる、請求項１記載の方法。 【請求項３】 前記ベクターが選択マーカー遺伝子を含んでなる、請求項１
   記載の方法。 【請求項４】 前記ベクターが選択マーカー遺伝子を含んでなる、請求項２
   記載の方法。 【請求項５】 前記選択マーカー遺伝子が除草剤耐性遺伝子を含んでなる、
   請求項３記載の方法。 【請求項６】 前記選択マーカー遺伝子が除草剤耐性遺伝子を含んでなる、
   請求項４記載の方法。 【請求項７】 前記除草剤耐性遺伝子がbar遺伝子を含んでなる、請求項５
   記載の方法。 【請求項８】 前記除草剤耐性遺伝子がbar遺伝子を含んでなる、請求項６
   記載の方法。 【請求項９】 実生およびアグロバクテリウムを利用する植物の直接形質転
   換法であって、 (a)少なくとも１つの実生と、アグロバクテリウム細胞の混合物とを接触させ
   、ここで該混合物は、DNA断片を含むベクターを保有するアグロバクテリウム株
   由来の細胞および第２のDNA断片を含むベクターを保有するアグロバクテリウム
   株由来の細胞を含んでなり、該ベクターは、T-DNAを前記アグロバクテリウム細
   胞から前記実生へ移入させるものであり、 (b)前記アグロバクテリウム細胞と接触した前記実生に第１の時点で減圧をか
   け、その際、該減圧は、前記アグロバクテリウム細胞を前記実生へ密着させてT-
   DNAを前記アグロバクテリウム細胞から前記実生の細胞へ第２の時点で移入させ
   るのに十分な強さであり、前記第１および第２の時点は同一または異なる時点で
   ある ことを含んでなる前記方法。 【請求項１０】 (c)前記実生を成熟するまで育成して種子を形成させ、 (d)前記種子を発芽させて後代を得、 (e)移入した前記遺伝子を発現する後代を選択する ことをさらに含んでなる、請求項９記載の方法。 【請求項１１】 前記ベクターが選択マーカー遺伝子を含んでなる、請求項
   ９記載の方法。 【請求項１２】 前記ベクターが選択マーカー遺伝子を含んでなる、請求項
   １０記載の方法。 【請求項１３】 前記選択マーカー遺伝子が除草剤耐性遺伝子を含んでなる
   、請求項１１記載の方法。 【請求項１４】 前記選択マーカー遺伝子が除草剤耐性遺伝子を含んでなる
   、請求項１２記載の方法。 【請求項１５】 前記除草剤耐性遺伝子がbar遺伝子を含んでなる、請求項
   １３記載の方法。 【請求項１６】 前記除草剤耐性遺伝子がbar遺伝子を含んでなる、請求項
   １４記載の方法。 【請求項１８】 実生およびアグロバクテリウムを利用する植物の直接形質
   転換法であって、 (a)少なくとも１つの実生と、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子断片およ
   び選択マーカー遺伝子を含むT-DNAをアグロバクテリウム細胞から前記実生へ移
   入させるベクターを保有するアグロバクテリウム細胞とを接触させ、 (b)前記アグロバクテリウム細胞と接触した前記実生に第１の時点で減圧をか
   け、その際、該減圧は、前記アグロバクテリウム細胞を前記実生へ密着させて前
   記T-DNAを前記アグロバクテリウム細胞から前記実生の細胞へ第２の時点で移入
   させるのに十分な強さであり、前記第１および第２の時点は同一または異なる時
   点であり、 (c)形質転換された前記実生を成熟するまで育成して種子を形成させ、 (d)前記種子を発芽させて後代を得、 (e)前記後代を、選択マーカー遺伝子の発現を検出し得る薬剤と接触させ、 (f)前記選択マーカー遺伝子と少なくとも１つの遺伝子を発現している後代を
   選択する ことを含んでなり、前記選択マーカー遺伝子と少なくとも１つの遺伝子の発現が
   、遺伝子移入の指標となる、前記方法。 【請求項１９】 前記選択マーカー遺伝子が除草剤耐性遺伝子を含んでなる
   、請求項１８記載の方法。 【請求項２０】 前記除草剤耐性遺伝子がbar遺伝子を含んでなる、請求項
   １９記載の方法。 【請求項２１】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
   、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の方法に従
   って形質転換された植物。 【請求項２２】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
   、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の方法に従
   って形質転換された植物に由来する種子。 【請求項２３】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
   、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の方法に従
   って形質転換された植物から採取した種子に由来する後代植物。