BR112014003037B1 - Hospedeiro recombinante e método para produzir um glicosídeo de esteviol - Google Patents

Hospedeiro recombinante e método para produzir um glicosídeo de esteviol Download PDF

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Abstract

PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE GLICOSÍDEOS DE ESTEVIOL. Trata-se de microorganismos recombinantes, plantas, e células vegetais que foram modificados por engenharia genética para expressar genes recombinantes que codificam UDP-glicosil transferases (UGTs). Esses microorganismos, plantas, ou células vegetais podem produzir glicosídeos de esteviol, por exemplo, Rebaudiosídeo A e/ou Rebaudiosídeo D,que podem ser usados como adoçantes naturais em produtos alimentícios e em suplementos alimentares.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS
[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido U.S. com Número de Série 61/521.084, depositado em 8 de agosto de 2011; ao Pedido U.S. com Número de Série 61/521.203, depositado em 8 de agosto de 2011; ao Pedido U.S. com Número de Série 61/521.051, depositado em 8 de agosto de 2011; ao Pedido U.S. com Número de Série 61/523.487, depositado em 15 de agosto de 2011; ao Pedido U.S. com Número de Série 61/567.929, depositado em 7 de dezembro de 2011; e ao Pedido U.S. com Número de Série 61/603.639, depositado em 27 de fevereiro de 2012, estando todos esses aqui incorporados em suas totalidades a título de referência.
CAMPO DA TÉCNICA
[002]Esta revelação refere-se à produção recombinante de glicosídeos de esteviol. Em particular, esta revelação se refere à produção de glicosídeos de esteviol, como rebaudiosídeo D por hospedeiros recombinantes, como microrganismos recombinantes, plantas, ou células vegetais. Esta revelação também proporciona composições contendo glicosídeos de esteviol. A revelação se refere, também, a ferramentas e métodos para produzir terpenóides modulando-se a biossíntese de precursores de terpenóide da trajetória de esqualeno.
FUNDAMENTOS
[003]Os adoçantes são bem conhecidos como ingredientes usados mais comumente nas indústrias alimentícias, de bebidas, ou de confeitaria. O adoçante pode ser incorporado em um produto alimentício final durante a produção ou para uso autônomo, quando apropriadamente diluído, como um adoçante de mesa ou uma substituição doméstica por açúcares em culinária. Os adoçantes incluem adoçantes naturais, tais como sacarose, xarope de milho com alto teor de frutose, melaços, xarope de bordo, e mel, e adoçantes artificiais, tais como aspartame, sacarina e sucralose. O extrato de estévia é um adoçante natural que pode ser isolado e extraído a partir de um arbusto perene, Stevia rebaudiana. A estévia é comumente cultivada na América do Sul e na Ásia para produção comercial de extrato de estévia. O extrato de estévia, purificado em vários graus, é usado comercialmente como um adoçante de alta intensidade em alimentos e em blendas ou sozinhos como um adoçante de mesa.
[004]Os extratos da planta Estévia contêm rebaudiosídeos e outros glicosídeos de esteviol que contribuem ao sabor adocicado, embora a quantidade de cada glicosídeo geralmente varie dentre os diferentes lotes de produção. Os produtos comerciais existentes consistem predominantemente em rebaudiosídeo A com quantidades menores de outros glicosídeos, como rebaudiosídeo C, D, e F. Os extratos de estévia também podem conter contaminantes, tais como compostos derivados de vegetais que contribuem para sabores estranhos. Esses sabores estranhos podem ser mais ou menos problemáticos dependendo do sistema ou aplicação de alimento de escolha. Os contaminantes potenciais incluem pigmentos, lipídeos, proteínas, fenólicos, sacarídeos, espatulenol e outros sesquiterpenos, diterpenos tipo labdano, monoterpenos, ácido decanóico, ácido 8,11,14- eicosatrienóico, 2-metil octadecano, pentacosana, octacosana, tetracosana, octadecanol, estigmasterol, β-sitosterol, α- e β-amirina, lupeol, acetato de β amrina, triterpenos pentacíclicos, centauredina, quercitina, epi-alfa-cadinol, carofilenos e derivados, beta-pineno, beta-sitosterol, e giberelina.
SUMÁRIO
[005]No presente documento, proporciona-se um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, uma planta, ou uma célula vegetal, que compreende um ou mais genes de biossíntese cuja expressão resulta na produção de glicosídeos de esteviol, como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, ou dulcosídeo A. Em particular, EUGT11, uma uridina 5'-difosfo (UDP) glicosiltransferase aqui descrita, pode ser usado sozinho ou em combinação com uma ou mais outras UDP glicosiltransferases, como UGT74G1, UGT76G1, UGT85C2, e UGT91D2e, para permitir a produção e o acúmulo de rebaudiosídeo D em hospedeiros recombinantes ou usar sistemas in vitro. Conforme descrito no presente documento, EUGT11 tem uma forte atividade de glicosilação de 1,2-19-O- glicose, que consiste em uma etapa importante para a produção de rebaudiosídeo D.
[006]Tipicamente, a esteviosídeo e a rebaudiosídeo A são os compostos primários em extratos de estévia comercialmente produzidos. A esteviosídeo é reportada como tendo um sabor mais amargo e menos doce do que a rebaudiosídeo A. A composição de extrato de estévia pode variar de lote para lote dependendo do solo e do clima nos quais as plantas são cultivadas. Dependendo da planta de origem, das condições climáticas, e do processo de extração, a quantidade de rebaudiosídeo A em preparações comerciais é reportada variando de 20 a 97% do teor de glicosídeo de esteviol total. Outros glicosídeos de esteviol estão presentes em quantidades variáveis em extratos de estévia. Por exemplo, a Rebaudiosídeo B está tipicamente presente em menos de 1 a 2%, enquanto a Rebaudiosídeo C pode estar presente em níveis tão altos quanto 7 a 15%. A Rebaudiosídeo D está tipicamente presente em níveis de 2% ou menor, e a Rebaudiosídeo F está tipicamente presente em composições em 3,5% ou menor para os glicosídeos de esteviol totais. A quantidade dos glicosídeos de esteviol mínimos afeta o perfil de sabor de um extrato de Estévia. Além disso, imagina-se que a Rebaudiosídeo D e outros glicosídeos de esteviol glicosilados superiores sejam adoçantes de qualidade superior à Rebaudiosídeo A. Como tal, os hospedeiros recombinantes e os métodos descritos no presente documento são particularmente úteis para produção de composições de glicosídeo de esteviol tendo uma quantidade aumentada de Rebaudiosídeo D para uso, por exemplo, como um adoçante não-calórico com propriedades funcionais e sensoriais superiores àquelas de muitos adoçantes de alto potencial.
[007]Em um aspecto, este documento retrata um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:152.
[008]Este documento também retrata um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo tendo a capacidade de transferir uma segunda porção de açúcar ao C-2' de um 19-O-glicose de rubusosídeo. Este documento também retrata um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo tendo a capacidade de transferir uma segunda porção de açúcar ao C-2' de um 19-O-glicose de esteviosídeo.
[009]Em outro aspecto, este documento retrata um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo tendo a capacidade de transferir uma segunda porção de açúcar ao C-2' do 19-O-glicose de rubusosídeo e ao C-2' do 13-O-glicose de rubusosídeo.
[0010]Este documento também retrata um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo tendo a capacidade de transferir uma segunda porção de açúcar ao C-2' de um 19-O-glicose de rebaudiosídeo A para produzir rebaudiosídeo D, em que a taxa de catálise do polipeptídeo é pelo menos 20 vezes mais rápida (por exemplo, 25 ou 30 vezes mais rápida) do que um 91D2e polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5 quando as reações forem realizadas sob condições correspondentes.
[0011]Em qualquer um dos hospedeiros recombinantes descritos no presente documento, o polipeptídeo pode ter pelo menos 85% de identidade de sequência (por exemplo, 90%, 95%, 98%, ou 99% de identidade de sequência) à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:152. O polipeptídeo pode ter a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 152.
[0012]Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode incluir, ainda, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C tendo pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3. O polipeptídeo UGT85C pode incluir uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, e 471 de SEQ ID NO:3.
[0013]Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode incluir, ainda, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G tendo pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:7. O polipeptídeo UGT76G pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346 de SEQ ID NO:7.
[0014]Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode incluir, ainda, um gene (por exemplo, um gene recombinante) que codifica um polipeptídeo UGT74G1.
[0015]Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode incluir, ainda, um gene (por exemplo, um gene recombinante) que codifica um polipeptídeo UGT91D2 funcional. O polipeptídeo UGT91D2 pode ter pelo menos 80% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:5. O polipeptídeo UGT91D2 pode ter uma mutação na posição 206, 207, ou 343 de SEQ ID NO:5.O polipeptídeo UGT91D2 também pode ter uma mutação nas posições 211 e 286 de SEQ ID NO:5 (por exemplo, L211M e V286A, referidos como UGT91D2e-b). O polipeptídeo UGT91D2 pode ter a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 5, 10, 12, 76, 78, ou 95.
[0016]Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode incluir, ainda, um ou mais entre um gene que codifica uma difosfato de geranilgeranil sintase; um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e uma sídeono sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; um gene que codifica uma caureno oxidase; e um gene que codifica uma esteviol sintetase. Cada um dos genes de (i), (ii), (iii), e (iv) pode ser um gene recombinante. Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode incluir, ainda, um ou mais entre (v) um gene que codifica um HMG-CoA truncado; (vi) um gene que codifica um CPR; (vii) um gene que codifica uma ramnose sintetase; (viii) um gene que codifica uma UDP-glicose desidrogenase; e (ix) um gene que codifica um ácido UDP-glicurônico descarboxilase. Pelo menos um dos genes de (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), ou (ix) pode ser um gene recombinante.
[0017]O difosfato de geranilgeranil sintase pode ter mais de 90% de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 121-128. A copalil difosfato sintase pode ter mais de 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 129-131. A caureno sintase pode ter mais de 90% de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 132-135. A caureno oxidase pode ter mais de 90% de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 138-141. A esteviol sintetase pode ter mais de 90% de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 142-146.
[0018]Qualquer um dos hospedeiros recombinantes pode produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol quando culturado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O glicosídeo de esteviol pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, esteviosídeo, esteviol-19-O-Glicosídeo, esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-1,2-biosídeo, esteviol- 1,3-biosídeo, 1,3-esteviosídeo, bem como outros intermediários ramnosilados ou xilosilados. O glicosídeo de esteviol (por exemplo, rebaudiosídeo D) pode acumular pelo menos 1 mg/litro (por exemplo, pelo menos 10 mg/litro, 20 mg/litro, 100 mg/litro, 200 mg/litro, 300 mg/litro, 400 mg/litro, 500 mg/litro, 600 mg/litro, ou 700 mg/litro, ou mais) de meio de cultura quando culturado sob as ditas condições.
[0019]Este documento também retrata um método para produzir um glicosídeo de esteviol. O método inclui cultivar qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento em um meio de cultura, sob condições nas quais os genes são expressos; e recuperar o glicosídeo de esteviol produzido pelo hospedeiro. A etapa de crescimento pode incluir induzir a expressão de um ou mais dos genes. O glicosídeo de esteviol pode ser um glicosídeo de esteviol 13-O-1,2-diglicosilado e/ou um 19-O-1,2-diglicosilado (por exemplo, esteviosídeo, esteviol 1,2 biosídeo, rebaudiosídeo D, ou rebaudiosídeo E). Por exemplo, o glicosídeo de esteviol pode ser rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo E. Outros exemplos de glicosídeos de esteviol podem incluir rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo F, e dulcosídeo A.
[0020]Este documento também retrata um hospedeiro recombinante. O hospedeiro inclui (i) um gene que codifica um UGT74G1; (ii) um gene que codifica um UGT85C2; (iii) um gene que codifica um UGT76G1; (iv) um gene que codifica uma glicosiltransferase tendo a capacidade de transferir uma segunda porção de açúcar ao C-2' de um 19-O-glicose de rubusosídeo ou esteviosídeo; e (v) opcionalmente um gene que codifica um UGT91D2e, em que pelo menos um dos genes é um gene recombinante. Em algumas modalidades, cada um dos genes é um gene recombinante. O hospedeiro pode produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol (por exemplo, rebaudiosídeo D) quando culturado sob condições nas quais cada um dos genes (por exemplo, genes recombinantes) é expresso. O hospedeiro pode incluir, ainda, (a) um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e uma caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; (b) um gene que codifica uma caureno oxidase; (c) um gene que codifica uma esteviol sintetase; (d) um gene que codifica um difosfato de geranilgeranil sintase.
[0021]Este documento também retrata uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento. A composição tem níveis reduzidos de contaminantes derivados da planta estévia em relação a um extrato de estévia.
[0022]Em outro aspecto, este documento retrata uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento. A composição tem uma composição de glicosídeo de esteviol enriquecida para rebaudiosídeo D em relação à composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de Estévia tipo selvagem.
[0023]Ainda em outro aspecto, este documento retrata um método para produzir uma composição de glicosídeo de esteviol. O método inclui cultivar um hospedeiro descrito no presente documento em um meio de cultura, sob condições nas quais cada um dos genes é expresso; e recuperar a composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo hospedeiro (por exemplo, um microrganismo). A composição é enriquecida para rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A em relação à composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de Estévia tipo selvagem. A composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo hospedeiro (por exemplo, microrganismo) pode ter um nível reduzido de contaminantes derivados de planta estévia em relação a um extrato de estévia.
[0024]Este documento também retrata um método para transferir uma segunda porção de açúcar ao C-2' de um 19-O-glicose ou ao C-2’ de um 13-O-glicose em um glicosídeo de esteviol. O método inclui colocar o glicosídeo de esteviol em contato com um polipeptídeo EUGT11 descrito no presente documento ou um polipeptídeo UGT91D2 descrito no presente documento (por exemplo, UGT91D2e-b) e um açúcar UDP sob as condições de reação adequadas para a transferência da segunda porção de açúcar ao glicosídeo de esteviol. O glicosídeo de esteviol pode ser uma rubusosídeo, em que a segunda porção de açúcar é glicose, e a esteviosídeo é produzida mediante a transferência da segunda porção de glicose. O glicosídeo de esteviol pode ser uma esteviosídeo, em que a segunda porção de açúcar é glicose, e a Rebaudiosídeo E é produzida mediante a transferência da segunda porção de glicose. O glicosídeo de esteviol pode ser Rebaudiosídeo A, e a Rebaudiosídeo D é produzida mediante a transferência da segunda porção de glicose.
[0025]Em outra modalidade de uma trajetória a jusante aperfeiçoada de glicosídeo de esteviol conforme revelado no presente documento, proporcionam-se materiais e métodos para a produção recombinante de sacarose sintase, e materiais e métodos para aumentar a produção de UDP-glicose em um hospedeiro, especificamente para aumentar a disponibilidade e UDP-glicose in vivo, com o propósito de promover reações de glicosilação nas células, e proporcionam-se métodos para reduzir concentrações de UDP nas células.
[0026]O documento também proporciona um hospedeiro recombinante que compreende um ou mais ácidos nucléicos exógenos que codificam um transportador de sacarose e uma sacarose sintase, em que a expressão de um ou mais ácidos nucléicos exógenos com uma glicosiltransferase resulta em níveis aumentados de UDP-glicose no hospedeiro. Opcionalmente, um ou mais ácidos nucléicos exógenos compreendem uma sequência SUS1. Opcionalmente, a sequência SUS1 é proveniente de Coffea arabica, ou codifica um homólogo funcional da sacarose sintase codificada pela sequência SUS1 de Coffea arabica, mas, igualmente, pode-se usar uma SUS de Arabidopsis thaliana ou Stevia rebaudiana conforme descrito no presente documento. No hospedeiro recombinante da invenção, um ou mais ácidos nucléicos exógenos podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:180, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 por cento idêntica a esta, e, opcionalmente, um ou mais ácidos nucléicos exógenos compreendem uma sequência SUC1. Em uma modalidade, a sequência SUC1 é proveniente de Arabidopsis thaliana, ou a sequência SUC1 codifica um homólogo funcional do transportador de sacarose codificado pela sequência SUC1 de Arabidopsis thaliana. No hospedeiro recombinante, um ou mais ácidos nucléicos exógenos podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:179, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 por cento idêntica à mesma. O hospedeiro recombinante tem uma capacidade reduzida de degradar sacarose externa, comparado a um hospedeiro correspondente que seja desprovido de um ou mais ácidos nucléicos exógenos.
[0027]O hospedeiro recombinante pode ser um microrganismo, tal como um Saccharomycete, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. Alternativamente, o microrganismo é Escherichia coli. Em uma modalidade alternativa, o hospedeiro recombinante é uma planta ou uma célula vegetal.
[0028]A invenção proporciona, também, um método para aumentar o nível de UDP-glicose e reduzir o nível de UDP em uma célula, sendo que o método compreende expressar na célula uma sequência de sacarose sintase recombinante e uma sequência de transportador de sacarose recombinante, em um meio que compreende sacarose, em que a célula é deficiente em degradação de sacarose.
[0029]A invenção proporciona, ainda, um método para promover uma reação de glicosilação em uma célula, que compreende expressar na célula uma sequência de sacarose sintase recombinante e uma sequência de transportador de sacarose recombinante, em um meio que compreende sacarose, em que a expressão resulta em um nível reduzido de UDP na célula e um nível aumentado de UDP-glicose na célula, de modo que a glicosilação na célula seja aumentada.
[0030]No método para aumentar o nível de UDP-glicose ou promover a glicosilação, a célula pode produzir glicosídeo de vanilina, resultando em uma produção aumentada de glicosídeo de vanilina pela célula, ou pode produzir glicosídeo de esteviol, resultando em uma produção aumentada de glicosídeo de esteviol pela célula. Opcionalmente, a sequência SUS1 é uma sequência SUS1 de A. thaliana, S. rebaudiana, ou Coffea arabica (vide, por exemplo, a Figura 17, SEQ ID NOs. 175-177), ou é uma sequência que codifica um homólogo funcional da sacarose sintase codificada pela sequência SUS1 de A. thaliana, S. rebaudiana, ou Coffea arabica. A sequência de sacarose sintase recombinante compreende, opcionalmente, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:180, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma, em que, opcionalmente, a sequência de transportador de sacarose recombinante é uma sequência SUC1, ou em que, opcionalmente, a sequência SUC1 é uma sequência SUC1 de Arabidopsis thaliana, ou é uma sequência que codifica um homólogo funcional do transportador de sacarose codificado pela sequência SUC1 de Arabidopsis thaliana, ou em que, opcionalmente, a sequência de transportador de sacarose recombinante compreende um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:179, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma. No método, o hospedeiro é um microrganismo, por exemplo, um Saccharomycete, opcionalmente, tal como Saccharomyces cerevisiae. Ou o hospedeiro pode ser Escherichia coli. Ou o hospedeiro pode ser uma célula vegetal.
[0031]No presente documento, proporciona-se, também, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, que compreende um ou mais genes de biossíntese cuja expressão resulta na produção de diterpenóides. Esses genes incluem um gene que codifica um difosfato de ent-copalil sintase (CDPS) (EC 5.5.1.13), um gene que codifica uma ent-caureno sintase, um gene que codifica uma ent-caureno oxidase; ou um gene que codifica uma esteviol sintetase. Pelo menos um dos genes é um gene recombinante. O hospedeiro também pode ser uma célula vegetal. A expressão desse(s) gene(s) em uma planta de Estévia resulta em níveis aumentados de glicosídeo de esteviol na planta. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante compreende, ainda, uma pluralidade de cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CDPS (EC 5.5.1.13) desprovido de uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto. O polipeptídeo CDPS pode ter pelo menos 90%, 95%, 99 %, ou 100% de identidade à sequência de aminoácidos CDPS truncada apresentada na Figura 14. O hospedeiro pode compreender, ainda, uma pluralidade de cópias de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KAH, por exemplo, um polipeptídeo KAH que tenha pelo menos 90%, 95%, 99 %, ou 100% de identidade à sequência de aminoácidos KAH apresentada na Figura 12. O hospedeiro pode compreender, ainda, um ou mais entre: (i) um gene que codifica um difosfato de geranilgeranil sintase; (ii) um gene que codifica uma ent-caureno oxidase; e (iii) um gene que codifica uma ent-caureno sintase. O hospedeiro pode compreender, ainda, um ou mais entre (iv) um gene que codifica um HMG-CoA truncado; (v) um gene que codifica um CPR; (vi) um gene que codifica uma ramnose sintetase; (vii) um gene que codifica uma UDP-glicose desidrogenase; e (viii) um gene que codifica um ácido UDP-glicurônico descarboxilase. Dois ou mais CPRs exógenos podem estar presentes, por exemplo. A expressão de um ou mais desses genes pode ser induzível. Pelo menos um dos genes (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), ou (viii) pode ser um gene recombinante, e, em alguns casos, cada um dos genes de (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), e (viii) é um gene recombinante. O difosfato de geranilgeranil sintase pode ter mais de 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:127; a caureno oxidase pode ter mais de 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:138; um CPR pode ter mais de 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:168; um CPR pode ter mais de 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:170, e uma caureno sintase pode ter mais de 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:156.
[0032]Em um aspecto, este documento retrata um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:5, em que o polipeptídeo contém substituições na posição 211 e 286 de SEQ ID NO:5. Por exemplo, o polipeptídeo pode incluir uma metionina na posição 211 e uma alanina na posição 286.
[0033]Em um aspecto, este documento retrata um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade) à sequência de aminoácidos apresentada na Figura 12C (SEQ ID NO:164). O polipeptídeo pode ter a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 12C.
[0034]Em outro aspecto, este documento retrata uma construção de ácido nucléico que inclui uma região regulatória operacionalmente ligada a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade) à sequência de aminoácidos apresentada na Figura 12C (SEQ ID NO:164). O polipeptídeo pode ter a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 12C.
[0035]Este documento também retrata um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante (por exemplo, uma pluralidade de cópias de um gene recombinante) que codifica um polipeptídeo KAH tendo pelo menos 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade) à sequência de aminoácidos apresentada na Figura 12C. O polipeptídeo pode ter a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 12C. O hospedeiro pode ser um microrganismo, tal como um Saccharomycete (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) ou Escherichia coli. O hospedeiro pode ser uma planta ou uma célula vegetal (por exemplo, uma planta Stevia, Physcomitrella, ou tobacco ou uma célula vegetal). A planta Stevia ou célula vegetal é uma planta Stevia rebaudiana ou uma célula vegetal. O hospedeiro recombinante pode produzir esteviol quando culturado sob condições nas quais cada um dos genes é expresso. O hospedeiro recombinante pode compreender, ainda, um gene que codifica um polipeptídeo UGT74G1; um gene que codifica um polipeptídeo UGT85C2; um gene que codifica um polipeptídeo UGT76G1; um gene que codifica um polipeptídeo UGT91D2; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo EUGT11. Esse hospedeiro pode produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol quando culturado sob condições nas quais cada um dos genes é expresso. O glicosídeo de esteviol pode ser esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, e/ou dulcosídeo A. O hospedeiro recombinante pode compreender, ainda, um ou mais entre: um gene que codifica uma desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS); um gene que codifica uma D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR); um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol sintase (CMS); um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK); um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato sintase (MCS); um gene que codifica uma 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS); e um gene que codifica uma 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato reductase (HDR). O hospedeiro recombinante pode compreender, ainda, um ou mais entre: um gene que codifica uma acetoacetil-CoA tiolase; um gene que codifica uma HMG-CoA reductase truncada; um gene que codifica uma mevalonato quinase; um gene que codifica uma fosfomevalonato quinase; e um gene que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase. Em outro aspecto, este documento retrata um hospedeiro recombinante que compreende, ainda, um gene que codifica uma ent-caureno sintase (EC 4.2.3.19) e/ou um gene que codifica uma giberelina 20- oxidase (EC 1.14.11.12). Esse hospedeiro produz giberelina GA3 quando culturado sob condições nas quais cada um dos genes é expresso.
[0036]Este documento também retrata um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo CPR tendo pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade de sequência) à sequência de aminoácidos CPR de S. rebaudiana apresentada na Figura 13. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos CPR de S. rebaudiana apresentada na Figura 13 (SEQ ID NOs: 169 e 170).
[0037]Em qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento, a expressão de um ou mais dos genes pode ser induzível.
[0038]Em qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento, um ou mais genes que codificam fosfatases endógenas podem ser excluídos ou interrompidos de modo que a atividade de fosfatase endógena seja reduzida. Por exemplo, o gene de levedura DPP1 e/ou LPP1 pode ser interrompido ou excluído de modo que a degradação de pirofosfato de farnesil (FPP) em farnesol seja reduzida e a degradação de pirofosfato de geranilgeranil (GGPP) em geranilgeraniol (GGOH) seja reduzida.
[0039]Em outro aspecto, conforme descrito no presente documento, ERG9 pode ser modificado conforme definido abaixo, resultando na produção reduzida de esqualeno sintase (SQS) e em um acúmulo de precursores de terpenóide. Os precursores podem ou não ser secretados no meio de cultura e podem, sucessivamente, ser usados como substratos às enzimas capazes de metabolizar os precursores de terpenóide em terpenóides desejados.
[0040]Portanto, um aspecto principal da presente invenção se refere a uma célula que compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a uma quadro de leitura aberta operacionalmente ligada a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga tem a fórmula geral (I): -X1-X2-X3-X4-X5- em que X2 compreende pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos sendo complementares a, e formando um elemento de estrutura secundária tipo hairpin com pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos de X4, e em que X3 é opcional, e, caso esteja presente, compreende nucleotídeos não- pareados envolvidos na formação de um hairpin loop entre X2 e X4, e em que X1 e X5 compreendem, individual e opcionalmente, um ou mais nucleotídeos, e em que o quadro de leitura aberta mediante uma expressão codifica uma sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade a uma esqualeno sintase (EC 2.5.1.21) ou um fragmento biologicamente ativo desta, sendo que o dito fragmento tem pelo menos 70% de identidade de sequência à dita esqualeno sintase em uma faixa de sobreposição de pelo menos 100 aminoácidos.
[0041]A célula da presente invenção é útil em acentuar o rendimento de terpenóides de interesse industrial. De modo correspondente, em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para produzir um composto de terpenóide sintetizado através da trajetória de esqualeno, em uma cultura de célula, sendo que o dito método compreende as etapas de proporcionar a célula conforme definido anteriormente, cultivar a célula de (a).recuperar o composto de produto de terpenóide.
[0042]Proporcionar a célula compreende a construção geneticamente modificada definida anteriormente, sendo que o acúmulo de precursores de terpenóide é acentuado (vide, por exemplo, a Figura 20).
[0043]Portanto, em outro aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um terpenóide derivado a partir de um precursor de terpenóide selecionado a partir do grupo que consiste em Farnesil-pirofosfato (FPP), Isopentenol-pirofosfato (IPP), Dimetilallil-pirofosfato (DMAPP), Geranil-pirofosfato (GPP) e/ou Geranilgeranil- pirofosfato (GGPP), sendo que o dito método compreende: colocar o dito precursor em contato com uma enzima da trajetória de esqualeno sintase, recuperar o produto de terpenóide.
[0044]A presente invenção pode operar, pelo menos parcialmente, impedindo- se estericamente a ligação do ribossomo ao RNA, reduzindo, assim, a translação de esqualeno sintase. De modo correspondente, em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para reduzir a taxa de translação de uma esqualeno sintase funcional (EC 2.5.1.21), sendo que o dito método compreende: proporcionar a célula definida anteriormente, cultivar a célula de (a).
[0045]De modo similar, a invenção em outro aspecto se refere a um método para deduzir o turnover de farnesil-pp em esqualeno, sendo que o dito método compreende: proporcionar a célula definida anteriormente, cultivar a célula de (a).
[0046]Conforme descrito na Figura 20, a redução de expressão do ERG9 resulta no acúmulo de precursores em esqualeno sintase. Portanto, em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para acentuar o acúmulo de um composto selecionado a partir do grupo que consiste em Farnesil-pirofosfato, Isopentenil- pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato e Geranilgeranil-pirofosfato, sendo que o dito método compreende as etapas de: proporcionar a célula definida anteriormente, e cultivar a célula de (a).
[0047]Em uma modalidade, a invenção se refere à produção de Geranilgeranil Pirofosfato (GGPP) bem como outros terpenóides, que podem ser preparados a partir de Geranilgeranil Pirofosfato (GGPP).
[0048]Nesta modalidade da invenção, a redução descrita anteriormente da produção de esqualeno sintase (SQS) pode ser combinada com um aumento na atividade de Geranilgeranil Pirofosfato Sintase (GGPPS), que converte FPP em Geranilgeranil Pirofosfato (GGPP), levando a uma produção aumentada de GGPP.
[0049]Portanto, em uma modalidade, a invenção se refere a uma célula microbiana que compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a a sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme definido anteriormente, em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucléico direcionando a expressão de GGPPS na dita célula.
[0050]Além disso, o documento se refere a um método para produzir esteviol ou um glicosídeo de esteviol, em que o método compreende o uso de qualquer uma das células microbianas supramencionadas.
[0051]Qualquer um dos hospedeiros descritos no presente documento pode ser um microrganismo (por exemplo, um Saccharomycete, tal como Saccharomyces cerevisiae, ou Escherichia coli), ou uma planta ou uma célula vegetal (por exemplo, uma Stevia, tal como uma planta Stevia rebaudiana, Physcomitrella, ou tobacco ou uma célula vegetal).
[0052]Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente compreendido por um indivíduo com conhecimento comum na técnica à qual a invenção pertence. Muito embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados para praticar a invenção, métodos e materiais adequados serão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporados a título de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não são destinados a serem limitantes. Outros recursos e vantagens da invenção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada a seguir. Os requerentes se reservam ao direito e alternativamente reivindicar qualquer invenção revelada usando a fase transicional “que compreende”, “que consiste essencialmente em”, ou “que consiste em”, de acordo com a prática padrão nas leis de patente.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0053]A Figura 1 é a estrutura química de vários glicosídeos de esteviol.
[0054]As Figuras 2A a D mostram trajetórias representativas para a biossíntese de glicosídeos de esteviol a partir de esteviol.
[0055]A Figura 3 é uma representação esquemática de reações de 19-O-1,2- diglicosilação por EUGT11 e UGT91D2e. Os números são a intensidade média de sinal para os substratos sobre os produtos da reação, a partir de cromatogramas de cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS)
[0056]A Figura 4 contém cromatogramas LC-MS que mostram a produção de rebaudiosídeo D (RebD) a partir de Rebaudiosídeo A (RebA) usando UGT91D2e (SEQ ID NO:5) (painel esquerdo) ou EUGT11 (SEQ ID NO:152) (painel direito) transcritos e transladados in vitro. O LC-MS foi ajustado para detectar determinadas massas correspondentes a esteviol + 5 glicoses (como RebD), esteviol + 4 glicoses (como RebA) etc. Cada ‘pista’ é escalonada de acordo com o pico mais alto.
[0057]A Figura 5 contém cromatogramas LC-MS que mostram a conversão de rubusosídeo em esteviosídeo e compostos '2' e '3' (RebE) por UGT91D2e (painel esquerdo) e EUGT11 (painel direito).
[0058]A Figura 6 é um alinhamento da sequência de aminoácidos de EUGT11 (SEQ ID NO:152, linha superior) com a sequência de aminoácidos de UGT91D2e (SEQ ID NO:5, linha inferior).
[0059]A Figura 7 contém a sequência de aminoácidos de EUGT11 (SEQ ID NO:152), a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:153) que codifica EUGT11, e a sequência de nucleotídeo que codifica EUGT11 que foi códon-otimizado para expressão em levedura (SEQ ID NO: 154).
[0060]A Figura 8 é um alinhamento das predições de estrutura secundária de UGT91D2e com UGT85H2 e UGT71G1. As predições de estrutura secundária foram feitas submetendo-se a sequência de aminoácidos dos três UGTs a NetSurfP ver. 1.1 - Protein Surface Accessibility and Secondary Structure Predictions, na World Wide Web em cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/. Este previu a presença e a localização de alfa hélices, beta folhas e espirais nas proteínas. Estas foram subsequentemente marcadas conforme mostrado para UGT91D2e. Por exemplo, a primeira beta-folha N- terminal foi marcada como Nβ1. O eixo geométrico y representa a certeza da predição, quanto maior mais confidente e o eixo geométrico representa a posição de aminoácido. Embora a identidade de sequência primária entre esses UGTs seja muito baixa, as estruturas secundárias mostram um grau muito alto de conservação.
[0061]A Figura 9 é um alinhamento da sequência de aminoácidos de UGT91D1 e UGT91D2e (SEQ ID NO: 5).
[0062]A Figura 10 é um gráfico de barras da atividade de mutantes de substituição de aminoácido duplo de UGT91D2e. As barras preenchidas representam a produção de esteviosídeo e as barras abertas representem a produção de 1,2- biosídeo.
[0063]A Figura 11 é uma representação esquemática de regeneração de UDP- glicose para a biossíntese de glicosídeos de esteviol. SUS = sacarose sintase; Esteviol = esteviol ou substrato de glicosídeo de esteviol; UGT = UDP glicosiltransferase.
[0064]A Figura 12A é a sequência de nucleotídeo que codifica o KAH de Stevia rebaudiana (SEQ ID NO:163), designado como SrKAHe1 no presente documento.
[0065]A Figura 12B é a sequência de nucleotídeo que codifica o KAHe1 de Stevia rebaudiana que foi códon-otimizado para expressão em levedura (SEQ ID NO:165).
[0066]A Figura 12C é a sequência de aminoácidos do KAHe1 de Stevia rebaudiana (SEQ ID NO:164).
[0067]A Figura 13A contém a sequência de aminoácidos de polipeptídeos CPR de S. cerevisiae (codificada pelo gene NCP1) (SEQ ID NO:166), A. thaliana (codificada por ATR1 e codificada por ATR2) ((SEQ ID NOs: 148 e 168), e S. rebaudiana (codificada por CPR7 e codificada por CPR8) (SEQ ID NOs: 169 e 170).
[0068]A Figura 13B contém uma sequência de nucleotídeo ATR1 (Número de Acesso CAA23011) que foi códon-otimizada para expressão em levedura (SEQ ID NO:171); a sequência de nucleotídeo ATR2 que foi códon-otimizada para expressão em levedura (SEQ ID NO:172); a sequência de nucleotídeo CPR7 de Stevia rebaudiana (SEQ ID NO:173); e a sequência de nucleotídeo CPR8 de Stevia rebaudiana (SEQ ID NO:174).
[0069]A Figura 14A contém a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:157) que codifica um polipeptídeo CDPS (SEQ ID NO:158) a partir de Zea mays. A sequência que está em negrito e sublinhada pode ser excluída para remover a sequência que codifica a sequência de trânsito de cloroplasto.
[0070]A Figura 14B contém a sequência de aminoácidos do polipeptídeo CDPS (SEQ ID NO:158) a partir de Zea mays. A sequência que está em negrito e sublinhada pode ser excluída para remover a sequência de trânsito de cloroplasto.
[0071]A Figura 15A contém uma sequência de nucleotídeo códon-otimizada (SEQ ID NO:161) que codifica um polipeptídeo CDPS-KS bifuncional (SEQ ID NO:162) a partir de Gibberella fujikuroi. A Figura 15B contém a sequência de aminoácidos do polipeptídeo CDPS-KS bifuncional (SEQ ID NO:162) a partir de Gibberella fujikuroi.
[0072]A Figura 16 é um gráfico do crescimento de duas cepas de S. cerevisiae, EFSC1972 acentuado (designado T2) e EFSC1972 acentuado com uma sobre-expressão adicional da caureno sintase de Arabidopsis thaliana (KS-5) (designada T7, quadrados). Os números no eixo geométrico y são os valores OD600 da cultura celular, enquanto os números no eixo geométrico x representem as horas de crescimento em um meio completo de base sintética a 30°C.
[0073]A Figura 17 contém as sequências de ácido nucléico que codificam as sacarose sintases de A. thaliana, S. rebaudiana (de contig10573 selection_ORF S11E, com a mutação que altera S11 em glutamato (E) em negrito, letras minúsculas), e café (Coffea arabica), SEQ ID NOs:175, 176, e 177, respectivamente.
[0074]A Figura 18 é um gráfico de barras da produção rebD em S. cerevisiae permeabilizada, que foi transformada com EUGT11 ou um plasmídeo vazio (“Vazio”). As células são desenvolvidas em fase de crescimento exponencial, lavadas em tampão PBS e subsequentemente tratadas com Triton X-100 (0,3% ou 0,5% em PBS) 30°C, 30 minutos. Após as células de permeabilização foram lavadas em PBS e re- suspensas na mistura de reação contendo 100 μM de RebA e 300 μM de UDP-glicose. As reações procederam durante 20 horas, 30°C.
[0075]A Figura 19A é a sequência de aminoácidos da UDP-glicosiltransferase UGT72E2 de A. thaliana (SEQ ID NO:178).
[0076]A Figura 19B é a sequência de aminoácidos do transportador de sacarose SUC1 de A. thaliana (SEQ ID NO:179).
[0077]A Figura 19C é a sequência de aminoácidos da sacarose sintase de café (SEQ ID NO:180).
[0078]A Figura 20 é uma vista esquemática da trajetória de isoprenóide em levedura, mostrando a posição de ERG9.
[0079]A Figura 21 contém a sequência de nucleotídeo do promotor Cyc1 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO:185) e do promotor Kex2 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO:186).
[0080]A Figura 22 é uma vista esquemática do produto PCR contendo duas regiões, HR1 e HR2, que são homólogas a partes da sequência de genoma dentro do promotor ERG9 ou na extremidade 5’ do quadro de leitura aberta ERG9 (ORF), respectivamente. Da mesma forma, no produto PCR se encontra um marcador de antibiótico, NatR, que pode ser incrustado entre sítios Lox (L) para excisão subsequente com recombinase Cre. O produto PCR pode incluir, ainda, um promotor, tal como ScKex2 tipo selvagem, ScCyc1 tipo selvagem, e o promotor pode incluir, ainda, uma inserção heteróloga, tal como um hairpin (SEQ ID NO: 181-184) em sua extremidade 3’ (vide a Figura 23).
[0081]A Figura 23 é uma vista esquemática do promotor e ORF com um hairpin stem-loop imediatamente a montante do sítio de início de translação (seta) e um alinhamento de uma porção da sequência promotora Cyc1 de S. cerevisiae tipo selvagem e ATG inicial do ERG9 POR sem uma inserção heteróloga (SEQ ID NO:187) e com quatro inserções heterólogas diferentes (SEQ ID NOs. 188-191). 75% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 184 (SEQ ID NO:191); 50% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 183 (SEQ ID NO:190); 20% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 182 (SEQ ID NO:189); 5% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 181 (SEQ ID NO:188).
[0082]A Figura 24 é um gráfico de barras que mostra um amorfadieno produzido em cepas de levedura com diferentes construções de promotor inseridas na frente do gene ERG9 do genoma hospedeiro. CTRL-ADS se refere à cepa de controle sem modificações; ERG9-CYC1-100% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 e sem inserções; ERG9-CYC1-50% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 183 (SEQ ID NO:190); ERG9-CYC1-20% se refere à construção que compreende do promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 182 (SEQ ID NO:189); ERG9-CYC1-5% se refere à construção que compreende o promotor ScCyc1 seguido por SEQ ID NO: 181 (SEQ ID NO:188); ERG9-KEX2-100% se refere à construção que compreende o promotor ScKex2.
[0083]A Figura 25 contém a sequência de aminoácidos de polipeptídeos de esqualeno sintase a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus, e Rattus norvegicus (SEQ ID NOs:192-202), e a sequência de aminoácidos de um difosfato de geranilgeranil sintase (GGPPS) a partir de Aspergilus nidulans e S. cerevisiae (SEQ ID NOs. 203 e 167).
[0084]A Figura 26 é um gráfico de barras do acúmulo de geranilgeraniol (GGOH) na cepa ERG9-CYC1-5% e uma cepa ERG9-KEX2 após 72 horas.
[0085]A Figura 27 é um cromatográfico representativo que mostra a conversão de rubusosídeo em intermediários xilosilados para produção de RebF por UGT91D2e e EUGT11.
[0086]Os símbolos de referência similares nos vários desenhos indicam elementos similares.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0087]Este documento se baseia na constatação que podem-se desenvolver hospedeiros recombinantes, tais como células vegetais, plantas, ou microrganismos que expressam polipeptídeos úteis para a biossíntese de glicosídeos de esteviol, como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, ou dulcosídeo A. Os hospedeiros recombinantes descritos no presente documento são particularmente úteis para produção de Rebaudiosídeo D. Esses hospedeiros podem expressar uma ou mais glicosiltransferases de Uridina 5'- difosfo (UDP) adequadas para produzir glicosídeos de esteviol. A expressão desses polipeptídeos biossintéticos em vários chassis microbiais permite que os glicosídeos de esteviol sejam produzidos de maneira consistente e reproduzível a partir de fontes de energia e carbono, como açúcares, glicerol, CO2, H2, e luz solar. A proporção de cada glicosídeo de esteviol produzida por um hospedeiro recombinante pode ser adaptada incorporando-se enzimas biossintéticas pré-selecionadas nos hospedeiros e expressando-os em níveis apropriados, para produzir uma composição de adoçante com um perfil de sabor consistente. Adicionalmente, espera-se que as concentrações de glicosídeos de esteviol produzidas por hospedeiros recombinantes sejam maiores que os níveis de glicosídeos de esteviol produzidos na planta Stevia, que aperfeiçoa a eficiência da purificação a jusante. Essas composições de adoçante contêm pouco ou nenhum contaminante à base de planta, em relação à quantidade de contaminantes presentes em extratos de Stevia.
[0088]Pelo menos um dos genes é um gene recombinante, sendo que o(s) gene(es) recombinante(s) particular(es) dependem da espécie ou da cepa selecionadas para uso. Genes ou módulos biossintéticos adicionais podem ser incluídos a fim de aumentar o rendimento de glicosídeo de esteviol, aperfeiçoar a eficiência com a qual as fontes de energia e carbono são convertidas em esteviol e seus glicosídeos, e/ou acentuar a produtividade da cultura celular ou planta. Esses módulos biossintéticos adicionais incluem genes envolvidos na síntese dos precursores de terpenóide, isopentenil difosfato e dimetilalil difosfato. Os módulos biossintéticos adicionais incluem genes de terpeno sintase e terpeno ciclase, tais como genes que codificam difosfato de geranilgeranil sintase e copalil difosfato sintase; esses genes podem ser genes endógenos ou genes recombinantes.
Esteviol e Polipeptídeos de Biossíntese de Glicosídeo de Esteviol Polipeptídeos de Biossíntese de Esteviol
[0089]As estruturas químicas para vários dos compostos encontrados em extratos de Stevia são mostradas na Figura 1, incluindo o diterpeno esteviol e vários glicosídeos de esteviol. Os números CAS são mostrados na Tabela A abaixo. Vide, também, Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, preparado por Harriet Wallin, Food Agric. Org. (2007).Tabela A.
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[0090]Constatou-se que a expressão de determinados genes em um hospedeiro, como um microrganismo confere a capacidade de sintetizar glicosídeos de esteviol mediante tal hospedeiro. Conforme discutido em maiores detalhes abaixo, um ou mais desses genes podem estar presentes naturalmente em um hospedeiro. Tipicamente, no entanto, um ou mais desses genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro que não os possui naturalmente.
[0091]A trajetória bioquímica para produzir esteviol envolve a formação de geranilgeranil difosfato, ciclização em (-) copalil difosfato, seguida pela oxidação e hidroxilação para formar esteviol. Portanto, a conversão de geranilgeranil difosfato em esteviol em um microrganismo recombinante envolve a expressão de um gene que codifica uma caureno sintase (KS), um gene que codifica uma caureno oxidase (KO), e um gene que codifica uma esteviol sintetase (KAH). A esteviol sintetase também é conhecida como ácido caurenóico 13-hidroxilase.
[0092]Os polipeptídeos KS adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas KS adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Zea mays, Populus trichocarpa, e Arabidopsis thaliana. Vide a Tabela 1 e SEQ ID NOs: 132-135 e 156. As sequências de nucleotídeo que codificam esses polipeptídeos são apresentadas em SEQ ID NOs: 40-47 e 155. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs:40-43 foram modificadas para expressão em levedura enquanto as sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 44-47 são de organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos KS foram identificados. Tabela 1. Clones KS
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[0093]Os polipeptídeos KO adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas KO adequadas são aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis thaliana, Gibberella fujikoroi e Trametes versicolor. Vide a Tabela 2 e SEQ ID NOs: 138-141. As sequências de nucleotídeo que codificam esses polipeptídeos são apresentadas em SEQ ID NOs: 52-59. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 52-55 foram modificadas para expressão em levedura. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 56-59 são de organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos KO foram identificados.Tabela 2. Clones KO
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[0094]Os polipeptídeos KAH adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas KAH adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis thaliana, Vitis vinifera e Medicago trunculata. Vide, por exemplo, a Tabela 3, SEQ ID NOs: 142-146; Publicação de Patente U.S. No. 2008-0271205; Publicação de Patente U.S. No. 2008-0064063 e Número de Acesso gi Genbank 189098312. A esteviol sintetase de Arabidopsis thaliana é classificada como uma CYP714A2. As sequências de nucleotídeo que codificam essas enzimas KAH são apresentadas em SEQ ID NOs: 60-69. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 60-64 foram modificadas para expressão em levedura enquanto as sequências de nucleotídeo de organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram identificados são apresentadas em SEQ ID NOs: 65-69.Tabela 3. Clones KAH
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= A sequência é mostrada na Publicação de Patente U.S. No. 2008-0064063.
[0095]Além disso, um polipeptídeo KAH de Stevia rebaudiana que foi identificado no presente documento como sendo particularmente útil em um hospedeiro recombinante. A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:163) que codifica o KAH de S. rebaudiana (SrKAHe1) (SEQ ID NO:164) é apresentada na Figura 12A. Uma sequência de nucleotídeo que codifica o KAH de S. rebaudiana que foi códon- otimizado para expressão em levedura (SEQ ID NO:165) é apresentada na Figura 12B. A sequência de aminoácidos do KAH de S. rebaudiana é apresentado na Figura 12C. O KAH de S. rebaudiana mostra uma atividade de esteviol sintase significativamente maior comparada ao ácido caurenóico hidroxilase de Arabidopsis thaliana descrito por Yamaguchi et al .(Publicação de Patente U.S. No. 2008/0271205 A1) quando expressado em S. cerevisiae. O polipeptídeo KAH de S. rebaudiana apresentado na Figura 12C tem menos de 20% de identidade ao KAH da Publicação de Patente U.S. No. 2008/0271205, e menos de 35% de identidade ao KAH da Publicação de Patente U.S. No.2008/0064063.
[0096]Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante contém um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KO e/ou um polipeptídeo KAH. Tipicamente, esses microrganismos também contêm um gene recombinante que codifica uma polipeptídeo de citocromo P450 reductase (CPR), visto que determinadas combinações de polipeptídeos KO e/ou KAH requerem a expressão de um polipeptídeo CPR exógeno. Em particular, a atividade de um polipeptídeo KO e/ou um polipeptídeo KAH de origem vegetal pode ser significativamente aumentada pela inclusão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CPR. Os polipeptídeos CPR exógenos adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas CPR adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana e Arabidopsis thaliana. Vide, por exemplo, a Tabela 4 e SEQ ID NOs: 147 e 148. As sequências de nucleotídeo que codificam esses polipeptídeos são apresentadas em SEQ ID NOs: 70, 71, 73, e 74. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 70-72 foram modificadas para expressão em levedura. As sequências de nucleotídeo de organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram identificados são apresentadas em SEQ ID NOs:73-75.
[0097]Tabela 4. Clones CPR
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[0098]Por exemplo, a esteviol sintase codificada por SrKAHe1 é ativada pelo CPR de S. cerevisiae codificado pelo gene NCP1 (YHR042W). Uma ativação ainda melhor de esteviol sintase codificada por SrKAHe1 é observada quando o CPR de Arabidopsis thaliana codificado pelo gene ATR2 ou o CPR de S. rebaudiana codificado pelo gene CPR8 forem co-expressados. A Figura 13A contém a sequência de aminoácidos dos polipeptídeos CPR de S. cerevisiae, A. thaliana (dos genes ATR1 e ATR2) e S. rebaudiana (dos genes CPR7 e CPR8) (SEQ ID NOs: 166-170). A Figura 13B contém a sequência de nucleotídeo que codifica os polipeptídeos CPR de A. thaliana e S. rebaudiana (SEQ ID NOs:171-174).
[0099]Por exemplo, o gene DPP1 de levedura e/ou o gene LPP1 de levedura podem ser interrompidos ou excluídos de modo que a degradação de farnesil pirofosfato (FPP) em farnesol seja reduzida e a degradação de geranilgeranil pirofosfato (GGPP)) em geranilgeraniol (GGOH) seja reduzida. Alternativamente, os elementos promotores ou acentuadores de um gene endógeno que codifica uma fosfatase podem ser alterados de modo que a expressão de suas proteínas codificadas seja alterada. A recombinação homóloga pode ser usada para interromper um gene endógeno. Por exemplo, um vetor de “substituição de gene” pode ser construído de modo a incluir um gene marcador selecionável. O gene marcador selecionável pode ser operacionalmente ligado, tanto na extremidade 5' como na extremidade 3', a porções do gene de comprimento suficiente para mediar uma recombinação homóloga. O marcador selecionável pode ser um entre qualquer número de genes que complemente a auxotrofia de célula hospedeira, proporcione resistência a antibiótico, ou resulte em uma alteração de cor. Os fragmentos de DNA linearizados do vetor de substituição de gene são, então, introduzidos nas células usando métodos bem conhecidos na técnica (vide abaixo). A integração dos fragmentos lineares no genoma e a interrupção do gene podem ser determinadas com base no marcador de seleção e podem ser verificados, por exemplo, através de uma análise Southern blot. Subsequente a seu uso em seleção, um marcador selecionável pode ser removido do genoma da célula hospedeira, por exemplo, através de sistemas Cre-loxP (vide, por exemplo, Gossen et al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 e Publicação de Pedido U.S. No. 20060014264). Alternativamente, um vetor de substituição de gene pode ser construído de modo a incluir uma porção do gene a ser interrompida, onde a porção é desprovida de qualquer sequência promotora de gene endógeno e codifica nenhum, ou um fragmento inativo da sequência de codificação do gene. Um “fragmento inativo” é um fragmento do gene que codifica uma proteína tendo, por exemplo, menos de cerca de 10% (por exemplo, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2%, menos de cerca de 1%, ou 0%) da atividade da proteína produzida a partir da sequência de codificação de comprimento total do gene. Essa porção do gene é inserida em um vetor de modo que nenhuma sequência promotora conhecida seja operacionalmente ligada à sequência de gene, mas que um códon de parada e uma sequência de terminação de transcrição sejam operacionalmente ligados à porção da sequência de gene. Este vetor pode ser subsequentemente linearizado na porção da sequência de gene e transformado em uma célula. Por meio de uma única recombinação homóloga, este vetor linearizado é, então, integrado na contraparte endógena do gene.
[00100]A expressão em um microrganismo recombinante desses genes resulta na conversão de geranilgeranil difosfato em esteviol.
B.Polipeptídeos de Blossíntese de Glicosídeo de Esteviol
[00101]Um hospedeiro recombinante descrito no presente documento pode converter esteviol em um glicosídeo de esteviol. Esse hospedeiro (por exemplo, microrganismo) contém genes que codificam uma ou mais UDP GlicosilTransferases, também conhecidas como UGTs. Os UGTs transferem uma unidade de monossacarídeo a partir de um açúcar de nucleotídeo ativado a uma porção aceptora, neste caso, uma porção -OH ou -COOH em esteviol ou derivado de esteviol. Os UGTs foram classificados em famílias e subfamílias com base na homologia de sequência. Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001).
B.1Polipeptídeos de Biossíntese de Rubusosídeo
[00102]A biossíntese de rubusosídeo envolve a glicosilação do 13-OH e do 19-COOH de esteviol. Vide a Figura 2A. A conversão de esteviol em rubusosídeo em um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, pode ser realizada pela expressão de gene(s) que codificam UGTs 85C2 e 74G1, que transferem uma unidade de glicose ao 13-OH ou ao 19-COOH, respectivamente, de esteviol.
[00103]Um UGT85C2 adequado funciona como uma uridina 5’-difosfo glicosil:esteviol 13-OH transferase, e uma uridina 5’-difosfo glicosil:esteviol-19-O- glicosídeo 13-OH transferase. Os polipeptídeos UGT85C2 funcionais também podem catalisar reações de glicosiltransferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol diferentes de esteviol e esteviol-19-O-glicosídeo.
[00104]Um polipeptídeo UGT74G1 adequado funciona como uma uridina 5’- difosfo glicosil:esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5’-difosfo glicosil:esteviol- 13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Os polipeptídeos UGT74G1 funcionais também podem catalisar reações de glicosiltransferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol diferentes de esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo, ou que transferem porções de açúcar a partir de doadores diferentes de uridina difosfato glicose.
[00105] Um microrganismo recombinante que expressa um UGT74G1 funcional e um UGT85C2 funcional pode produzir rubusosídeo e ambos monosídeos de esteviol (isto é, esteviol 13-O-monoglicosídeo e esteviol 19-O-monoglicosídeo) quando o esteviol for usado como uma matéria-prima no meio. Um ou mais desses genes podem estar presentes naturalmente no hospedeiro. Tipicamente, no entanto, esses genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro (por exemplo, microrganismo) que não os possua naturalmente.
[00106]Conforme o uso em questão, o termo hospedeiro recombinante é destinado a se referir a um hospedeiro, sendo que o genoma deste foi aumentado em pelo menos uma sequência de DNA incorporada. Essas sequências de DNA incluem, mas não se limitam a, genes que não estejam naturalmente presentes, sequências de DNA que não sejam normalmente transcritas em RNA ou transladadas em uma proteína (“expressadas”), e outros genes ou sequências de DNA que se deseje introduzir no hospedeiro não-recombinante. Avaliar-se-á que o genoma de um hospedeiro recombinante descrito no presente documento é aumentado através da introdução estável de um ou mais gene recombinantes. Em geral, o DNA introduzido não é originalmente residente no hospedeiro que seja o receptor do DNA, mas se encontra no escopo da invenção para isolar um segmento de DNA a partir de um dado hospedeiro, e para introduzir subsequentemente uma ou mais cópias adicionais de tal DNA no mesmo hospedeiro, por exemplo, para acentuar a produção do produto de um gene ou alterar o padrão de expressão de um gene. Em alguns casos, o DNA introduzido modificará ou até mesmo substituirá um gene endógeno ou uma sequência de DNA, por exemplo, por uma recombinação homóloga ou mutagênese sítio-direcionada. Os hospedeiros recombinantes adequados incluem microrganismos, células vegetais, e plantas.
[00107]O termo “gene recombinante” se refere a um gene ou sequência de DNA que seja introduzida em um hospedeiro receptor, independentemente de ser o mesmo gene ou sequência de DNA ou similares já puder estar presente em tal hospedeiro. “Introduzido” ou “aumentado” neste contexto, são conhecidos na técnica para significar introduzido ou aumentado pelo homem. Portanto, um gene recombinante pode ser uma sequência de DNA de outra espécie, ou pode ser uma sequência de DNA que se originou a partir ou está presente na mesma espécie, mas foi incorporada em um hospedeiro por métodos recombinantes para formar um hospedeiro recombinante. Avaliar-se-á que um gene recombinante que seja introduzido em um hospedeiro pode ser idêntico a uma sequência de DNA que esteja normalmente presente no hospedeiro sendo transformado, e seja introduzido para proporcionar uma ou mais cópias adicionais do DNA para permitir, assim, a sobre- expressão ou uma expressão modificada do produto de gene de tal DNA.
[00108]Os polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 adequados incluem aqueles feitos por Stevia rebaudiana. Os genes que codificam os polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 funcionais de Stevia são reportados em Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005). As sequências de aminoácido de S. rebaudiana polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 são apresentadas em SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente. As sequências de nucleotídeo que codificam UGT74G1 e UGT85C2 que foram otimizados para expressão em levedura são apresentadas em SEQ ID NOs: 2 e 4, respectivamente. As sequências códon-otimizadas de DNA 2.0 para UGTs 85C2, 91D2e, 74G1 e 76G1 são apresentadas em SEQ ID NOs: 82, 84, 83, e 85, respectivamente. Vide, também, as variantes UGT85C2 e UGT74G1 descritas abaixo na seção “Homólogo Funcional”. Por exemplo, um polipeptídeo UGT85C2 contendo substituições nas posições 65, 71, 270, 289, e 389 pode ser usado (por exemplo, A65S, E71Q, T270M, Q289H, e A389V).
[00109]Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é um microrganismo. O microrganismo recombinante pode ser desenvolvido em um meio contendo esteviol a fim de produzir rubusosídeo. Em outras modalidades, no entanto, o microrganismo recombinante expressa um ou mais genes recombinantes envolvidos na biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Os polipeptídeos CDPS adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas CDPS adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Streptomyces clavuligerus, Bradyrhizobium japonicum, Zea mays, e Arabidopsis. Vide, por exemplo, a Tabela 5 e SEQ ID NOs: 129-131, 158, e 160. As sequências de nucleotídeo que codificam esses polipeptídeos são apresentadas em SEQ ID NOs: 34-39, 157, e 159. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 3436 foram modificadas para expressão em levedura. As sequências de nucleotídeo provenientes dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram identificados são apresentadas em SEQ ID NOs:37-39.
[00110]Em algumas modalidades, podem-se usar os polipeptídeos CDPS desprovidos de um peptídeo de trânsito de cloroplasto na terminação amino do polipeptídeo não-modificado. Por exemplo, os primeiros 150 nucleotídeos da extremidade 5’ da sequência de codificação CDPS de Zea mays mostrada na Figura 14 (SEQ ID NO:157) podem ser removidos. Deste modo, remove-se os 50 resíduos amino terminais da sequência de aminoácidos mostrada na Figura 14 (SEQ ID NO:158), que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto. O gene CDPS truncado pode ser equipado com um novo sítio de partida de translação ATG e operacionalmente ligado a um promotor, tipicamente, um promotor constitutivo ou altamente expressivo. Quando uma pluralidade de cópias da sequência de codificação truncada for introduzida em um microrganismo, a expressão do polipeptídeo CDPS a partir do promotor resulta em um fluxo de carbono aumentado em direção à biossíntese de ent-caureno.Tabela 5. Clones CDPS
Figure img0009
[00111]As proteínas bifuncionais CDPS-KS (SEQ ID NOs: 136 e 137) também podem ser usadas. As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas bifuncionais CDPS-KS mostradas na Tabela 6 foram modificadas para expressão em levedura (vide SEQ ID NOs: 48 e 49). As sequências de nucleotídeo provenientes dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas em SEQ ID NOs: 50 e 51. Uma enzima bifuncional de Gibberella fujikuroi (SEQ ID NO:162) também pode ser usada. Uma sequência de nucleotídeo que codifica a enzima bifuncional CDPS-KS de Gibberella fujikuroi foi modificada para expressão em levedura (vide a Figura 15A, SEQ ID NO:161). Tabela 6. Clones CDPS-KS
Figure img0010
[00112]Portanto, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH além de um gene UGT74G1 e de um gene UGT85C2 é capaz de produzir tanto monosídeos de esteviol como rubusosídeo sem a necessidade de usar esteviol como uma matéria-prima.
[00113]Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante expressa, ainda, um gene recombinante que codifica um difosfato de geranilgeranil sintase (GGPPS). Os polipeptídeos GGPPS adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas GGPPS adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Gibberella fujikuroi, Mus musculus, Thalassiosira pseudonana, Streptomyces clavuligerus, Sulfulobus acidocaldarius, Synechococcus sp. e Arabidopsis thaliana. Vide a Tabela 7 e SEQ ID NOs: 121-128. As sequências de nucleotídeo que codificam esses polipeptídeos são apresentadas em SEQ ID NOs:18-33. As sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NOs: 18-25 foram modificadas para expressão em levedura enquanto a sequências de nucleotídeo provenientes dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram identificados são apresentadas em SEQ ID NOs: 26-33.Tabela 7. Clones GGPPS
Figure img0011
[00114]Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante pode expressar, ainda, genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou na produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes na trajetória de metileritritol 4-fosfato (MEP) ou genes na trajetória de mevalonato (MEV) discutidos abaixo, tem uma atividade de fosfatase reduzida, e/ou expressa uma sacarose sintase (SUS) conforme discutido no presente documento.
B. 2Polipeptídeos de Biossíntese de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D, e Rebaudiosídeo E
[00115]A biossíntese de rebaudiosídeo A envolve a glicosilação de aglicona esteviol. De modo específico, a rebaudiosídeo A pode ser formada pela glicosilação do 13-OH de esteviol que forma a 13-O-esteviol monosídeo, pela glicosilação do C-2’ da 13-O-glicose de esteviol monosídeo que forma esteviol-1,2-biosídeo, pela glicosilação do C-19 carboxil de esteviol-1,2-biosídeo que forma esteviosídeo, e pela glicosilação do C-3’ da C-13-O-glicose de esteviosídeo. A ordem na qual cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Vide a Figura 2A.
[00116]A biossíntese de rebaudiosídeo E e/ou rebaudiosídeo D envolve a glicosilação de aglicona esteviol. De modo específico, a rebaudiosídeo E pode ser formada pela glicosilação do 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O-glicosídeo, pela glicosilação do C-2’ da 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma a esteviol-1,2-biosídeo, pela glicosilação do C-19 carboxil da 1,2-biosídeo para formar 1,2-esteviosídeo, e pela glicosilação do C-2’ da 19-O-glicose da 1,2-esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E. A Rebaudiosídeo D pode ser formada pela glicosilação do C3’ da C-13-O-glicose de rebaudiosídeo E. A ordem na qual cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Por exemplo, a glicosilação do C-2’ da 19-O-glicose pode ser a última etapa na trajetória, em que a Rebaudiosídeo A é um intermediário na trajetória. Vide a Figura 2C.
[00117]Constatou-se que a conversão de esteviol em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, e/ou rebaudiosídeo E em um hospedeiro recombinante pode ser realizada expressando-se os UGTs funcionais a seguir: EUGT11, 74G1, 85C2, e 76G1, e opcionalmente 91D2. Portanto, um microrganismo recombinante que expressa combinações desses quatro ou cinco UGTs pode produzir rebaudiosídeo A e rebaudiosídeo D quando o esteviol for usado como uma matéria-prima. Tipicamente, um ou mais desses genes são genes recombinantes que foram transformados em um microrganismo que não os possui naturalmente. Constatou-se, também, que os UGTs aqui designados como SM12UGT podem ser substituídos por UGT91D2.
[00118]Em algumas modalidades, menos de cinco (por exemplo, um, dois, três ou quatro) UGTs são expressos em um hospedeiro. Por exemplo, um microrganismo recombinante que expressa um EUGT11 funcional pode produzir rebaudiosídeo D quando a rebaudiosídeo A for usada como uma matéria-prima. Um microrganismo recombinante que expressa dois UGTs funcionais, EUGT11 e 76G1, e opcionalmente um 91D12 funcional, pode produzir rebaudiosídeo D quando rubusosídeo ou 1,2-esteviosídeo for usada como uma matéria-prima. Como outra alternativa, um microrganismo recombinante que expressa três UGTs funcionais, EUGT11, 74G1, 76G1, e opcionalmente 91D2, pode produzir rebaudiosídeo D ao carregar a monosídeo, esteviol-13-O-glicosídeo, no meio. De modo similar, a conversão de esteviol-19-O-glicosídeo em rebaudiosídeo D em um microrganismo recombinante pode ser realizada pela expressão de genes que codificam UGTs EUGT11, 85C2, 76G1, e opcionalmente 91D2, ao carregar esteviol-19-O-glicosídeo. Tipicamente, um ou mais desses genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro que não os possui naturalmente.
[00119]Os polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 adequados incluem aqueles discutidos anteriormente. Um UGT76G1 adequado adiciona uma porção de glicose ao C-3’ da C-13-O-glicose da molécula aceptora, uma esteviol 1,2 glicosídeo. Portanto, UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol 13-O-1,2 glicosídeo C-3’ glicosiltransferase e uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol-19-O-glicose, 13-O-1,2 biosídeo C-3’ glicosiltransferase. Os polipeptídeos UGT76G1 funcionais também podem catalisar reações de glicosiltransferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que contêm açúcares diferentes de glicose, por exemplo, esteviol ramnosídeos e esteviol xilosídeos. Vide as Figuras 2A, 2B, 2C e 2D. Os polipeptídeos UGT76G1 adequados incluem aqueles feitos por S. rebaudiana e reportados em Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005). A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo UGT76G1 de S. rebaudiana é apresentada em SEQ ID NO:7. A sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo UGT76G1 de SEQ ID NO:7 foi otimizada para expressão em levedura e é apresentada em SEQ ID NO:8. Vide também as variantes UGT76G1 apresentadas na seção “Homólogo Funcional”.
[00120]Um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91D2 adequado funciona como uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase (também referida como esteviol-13-monoglicosídeo 1,2-glicosilase), transferindo uma porção de glicose ao C2’ da 13-O-glicose da molécula aceptora, esteviol-13-O-glicosídeo.
[00121]Um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91D2 adequado também funciona como uma uridina 5’-difosfo glicosil: rubusosídeo transferase que transfere uma porção de glicose ao C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceptora, rubusosídeo, para produzir esteviosídeo. Os polipeptídeos EUGT11 também podem transferir uma porção de glicose ao C-2’ da 19-O-glicose da molécula aceptora, rubusosídeo, para produzir uma rubusosídeo 19-O-1,2-diglicosilada (composto 2 na Figura 3).
[00122]Os polipeptídeos EUGT11 ou UGT91D2 funcionais também podem catalisar reações que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol diferentes de esteviol-13-O-glicosídeo e rubusosídeo. Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 funcional pode utilizar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma porção de glicose ao C-2’ do resíduo de 19-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo E (vide o composto 3 na Figura 3). Os polipeptídeos EUGT11 e UGT91D2 funcionais também podem utilizar Rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma porção de glicose ao C-2’ do resíduo de 19-O-glicose de Rebaudiosídeo A para produzir Rebaudiosídeo D. Conforme apresentado nos Exemplos, EUGT11 pode converter Rebaudiosídeo A em Rebaudiosídeo D em uma taxa que seja pelo menos de 20 vezes mais rápida (por exemplo, pelo menos 25 vezes ou pelo menos 30 vezes mais rápida) do que a taxa correspondente de UGT91D2e (SEQ ID NO: 5) quando as reações forem realizadas sob condições similares, isto é, tempo, temperatura, pureza e concentração de substrato similares. Como tal, EUGT11 produz quantidades maiores de RebD do que UGT91D2e quando incubado sob condições similares.
[00123]Além disso, um EUGT11 funcional exibe uma atividade significativa de C-2’ 19-O-diglicosilação com rubusosídeo ou esteviosídeo como substratos, enquanto UGT91D2e não tem uma atividade de diglicosilação detectável com esses substratos. Portanto, um EUGT11 funcional pode ser distinguido do UGT91D2e pelas diferenças em especificidade de substrato de glicosídeo de esteviol. A Figura 3 proporciona uma visão geral esquemática das reações de 19-O-1,2 diglicosilação que são realizadas por EUGT11 e UGT91D2e.
[00124]Um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91D2 funcional tipicamente não transfere uma porção de glicose aos compostos de esteviol tendo uma glicose 1,3- ligada na posição C-13, isto é, a transferência de uma porção de glicose a esteviol 1,3-biosídeo e 1,3-esteviosídeo não ocorre.
[00125]Os polipeptídeos EUGT11 e UGT91D2 funcionais podem transferir porções de açúcar a partir de doadores diferentes de uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91D2 funcional pode agir como uma uridina 5’-difosfo D-xilosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de xilose ao C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceptora, esteviol-13-O- glicosídeo. Como outro exemplo, um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91D2 funcional pode agir como uma uridina 5’-difosfo L-ramnosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de ramnose ao C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceptora, esteviol-13-O-glicosídeo
[00126]Os polipeptídeos EUGT11 adequados são descritos no presente documento e podem incluir o polipeptídeo EUGT11 de Oryza sativa (Número de Acesso GenBank AC133334). Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência) à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 152 (vide a Figura 7). A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 é apresentada em SEQ ID NO: 153. SEQ ID NO: 154 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 152 que foi códon-otimizado para expressão em levedura.
[00127]Os polipeptídeos UGT91D2 funcionais adequados incluem aqueles descritos no presente documento, por exemplo, os polipeptídeos designados como UGT91D2e e UGT91D2m. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo UGT91D2e exemplificador de Stevia rebaudiana é apresentada em SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO:6 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:5 que foi códon-otimizado para expressão em levedura. A sequência de nucleotídeo de S. rebaudiana que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:5 é apresentada em SEQ ID NO:9. As sequências de aminoácido de polipeptídeos UGT91D2m exemplificadores de S. rebaudiana são apresentadas em SEQ ID NOs: 10 e 12, e são codificadas pelas sequências de ácido nucléico apresentadas em SEQ ID NOs: 11 e 13, respectivamente. Além disso, as variantes UGT91D2 contendo uma substituição nos resíduos de aminoácido 206, 207, e 343 de SEQ ID NO: 5 podem ser usadas. Por exemplo, pode-se usar a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:95 e tendo as mutações a seguir em relação a UGT92D2e tipo selvagem (SEQ ID NO:5) G206R, Y207C, e W343R. Além disso, uma variante UGT91D2 contendo substituições nos resíduos de aminoácido 211 e 286 pode ser usada. Por exemplo, uma variante UGT91D2 pode incluir uma substituição de uma metionina por leucina na posição 211 e uma substituição de uma alanina por valina na posição 286 de SEQ ID NO:5 (UGT91D2e-b).
[00128]Conforme indicado anteriormente, UGTs designados no presente documento como SM12UGT podem ser substituídos por UGT91D2. Os polipeptídeos SM12UGT funcionais adequados incluem aqueles feitos por Ipomoea purpurea (glória-da-manhã japonesa) e descritos em Morita et al. Plant J. 42, 353-363 (2005). A sequência de aminoácidos que codifica o polipeptídeo IP3GGT de I. purpurea é apresentada em SEQ ID NO:76. SEQ ID NO:77 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:76 que foi códon-otimizado para expressão em levedura. Outro polipeptídeo SM12UGT adequado é um polipeptídeo Bp94B1 tendo uma mutação R25S. Vide Osmani et al. Plant Phys. 148: 1295-1308 (2008) e Sawada et al. J. Biol. Chem. 280:899-906 (2005). A sequência de aminoácidos do polipeptídeo UGT94B1 de Bellis perennis (margarida vermelha) é apresentada em SEQ ID NO:78. SEQ ID NO:79 é a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO:78 que foi códon-otimizado para expressão em levedura.
[00129]Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é desenvolvido em um meio contendo esteviol-13-O-glicosídeo ou esteviol-19-O- glicosídeo a fim de produzir rebaudiosídeo A e/ou rebaudiosídeo D. Nessas modalidades, o microrganismo contém e expressa genes que codificam um EUGT11 funcional, um UGT74G1 funcional, um UGT85C2 funcional, um UGT76G1 funcional, e um UGT91D2 funcional opcional, e seja capaz de acumular rebaudiosídeo A e rebaudiosídeo D quando esteviol, uma ou ambas entre esteviolmonosídeos, ou rubusosídeo for usado como matéria-prima.
[00130]Em outras modalidades, o microrganismo recombinante é desenvolvido em um meio contendo rubusosídeo a fim de produzir rebaudiosídeo A e/ou rebaudiosídeo D. Nessas modalidades, o microrganismo contém e expressa genes que codificam um EUGT11 funcional, um UGT76G1 funcional, e um UGT91D2 funcional opcional, e seja capaz de produzir rebaudiosídeo A e/ou rebaudiosídeo D quando rubusosídeo for usada como matéria-prima.
[00131]Em outras modalidades, o microrganismo recombinante expressa um ou mais genes envolvidos em biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Portanto, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um EUGT11, um UGT74G1, um UGT85C2, um UGT76G1, e opcionalmente um UGT91D2 funcional (por exemplo, UGT91D2e), é capaz de produzir rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, e/ou rebaudiosídeo E sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura.
[00132]Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém e expressa, ainda, um gene GGPPS recombinante a fim de proporcionar níveis aumentados do geranilgeranil difosfato de precursor de diperteno, para um fluxo aumentado através da trajetória biossintética de esteviol. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém, ainda, uma construção para silenciar a expressão de trajetórias sem esteviol que consomem geranilgeranil difosfato, ácido ent- caurenóico ou farnesil pirofosfato, proporcionando, assim, um fluxo aumentado através de trajetórias biossintéticas de esteviol e glicosídeos de esteviol. Por exemplo, o fluxo às trajetórias de produção de esterol, como ergosterol, pode ser reduzido regulando-se descendentemente o gene ERG9. Vide, a seção ERG9 abaixo e os Exemplos 24 e 25. Em células que produzem giberelinas, a síntese de giberelina pode ser regulada descendentemente para aumentar o fluxo de ácido ent-caurenóico em esteviol. Em organismos produtores de carotenóide, o fluxo em esteviol pode ser aumentado regulando-se descendentemente um ou mais genes biossintéticos de carotenóide. Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante pode expressar, ainda, genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou na produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes nas trajetórias de MEP ou MEV discutidas abaixo, tem atividade de fosfatase reduzida, e/ou expressa um SUS conforme discutido no presente documento.
[00133]Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que modulando-se níveis de expressão relativos de diferentes genes UGT, um hospedeiro recombinante pode ser adaptado para produzir especificamente produtos de glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. A regulação transcricional de genes de biossíntese de esteviol e genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol pode ser alcançada por uma combinação de ativação e repressão transcricional usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Para reações in vitro, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que a adição de diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que confiram as atividades relativas dos diferentes UGTS em combinação direcionará a síntese a uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que uma proporção maior de rebaudiosídeo D ou E ou uma conversão mais eficiente em rebaudiosídeo D ou E pode ser obtida com uma enzima de diglicosilação que tenha uma atividade maior para a reação de 19-O-glicosídeo comparada à reação de 13-O-glicosídeo (substratos de rebaudiosídeo A e esteviosídeo).
[00134]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas com rebaudiosídeo D que tenham mais de pelo menos 3% de rebaudiosídeo D em peso total de glicosídeos de esteviol, por exemplo, pelo menos 4% de rebaudiosídeo D pelo menos 5% de rebaudiosídeo D, 10 a 20% de rebaudiosídeo D, 20 a 30% de rebaudiosídeo D, 30 a 40% de rebaudiosídeo D, 40 a 50% de rebaudiosídeo D, 50 a 60% de rebaudiosídeo D, 60 a 70% de rebaudiosídeo D, 70 a 80% de rebaudiosídeo D. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol que tenham pelo menos 90% de rebaudiosídeo D,por exemplo, 90 a 99% de rebaudiosídeo D. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos na Figura 2C, tais como monosídeos de esteviol, glicobiosídeos de esteviol, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo E, e esteviosídeo. Em algumas modalidades, a composição enriquecida com rebaudiosídeo D produzida pelo hospedeiro (por exemplo, microrganismo) pode ser adicionalmente purificada e a rebaudiosídeo D ou a rebaudiosídeo E purificada pode, então, ser misturada com outros glicosídeos de esteviol, sabores, ou adoçantes para obter um sistema de sabor ou composição adoçante desejados. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D produzida por um hospedeiro recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com rebaudiosídeo A, C, ou F produzida por um hospedeiro recombinante diferente, com rebaudiosídeo A, F, ou C purificada a partir de um Extrato de estévia, ou com rebaudiosídeo A, F, ou C produzida in vitro.
[00135]Em algumas modalidades, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, monoglicosídeos de esteviol, esteviol-1,2-biosídeo, rubusosídeo, esteviosídeo, ou rebaudiosídeo E podem ser produzidas usando métodos in vitro enquanto fornece o açúcar UDP apropriado e/ou um sistema isento de células para regeneração de açúcares UDP. Vide, por exemplo, Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, artigo 220 (2008); Masada S et al. FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007). Em algumas modalidades, sacarose e uma sacarose sintase podem ser proporcionadas no recipiente de reação a fim de regenera UDP-glicose a partir de UDP gerada durante reações de glicosilação. Vide a Figura 11. A sacarose sintase pode ser proveniente de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência de codificação de sacarose sintase de Arabidopsis thaliana, Stevia rebaudiana, ou Coffea arabica pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob o controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro, tal como um microrganismo ou uma planta.
[00136]As conversões requerem que múltiplas reações possam ser realizadas juntas, ou em etapas. Por exemplo, a rebaudiosídeo D pode ser produzida a partir da rebaudiosídeo A que se encontra comercialmente disponível como um extrato enriquecido ou produzida através de biossíntese, com a adição de quantidades estequiométricas ou em excesso de UDP-glicose e EUGT11. Como uma alternativa, a rebaudiosídeo D pode ser produzida a partir de extratos de glicosídeo de esteviol que são enriquecidos para esteviosídeo e rebaudiosídeo A, usando EUGT11 e uma enzima UGT76G1 adequada. Em algumas modalidades, as fosfatases são usadas para remover produtos secundários e aperfeiçoar os rendimentos de reação. UGTs e outras enzimas para reações in vitro podem ser proporcionadas em formas solúveis ou em formas imobilizadas.
[00137]Em algumas modalidades, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, ou rebaudiosídeo E podem ser produzidas usando células completas que sejam matérias-primas carregadas que contenham moléculas precursoras, como esteviol e/ou glicosídeos de esteviol, incluindo misturas de glicosídeos de esteviol derivadas a partir de extratos vegetais. As matérias-primas podem ser carregadas durante o crescimento da célula ou após o crescimento da célula. As células completas podem estar em suspensão ou imobilizadas. As células completas podem ficar aprisionadas em microesferas, por exemplo, microesferas de alginato de cálcio ou sódio. As células completas podem ser ligadas a um sistema de reator de tubo de fibra vazada. As células completas podem ser concentradas e aprisionadas dentro de um sistema de reator de membrana. As células completas podem estar em um caldo de fermentação ou em um tampão de reação. Em algumas modalidades, um agente permeabilizante é utilizado para uma transferência eficiente do substrato nas células. Em algumas modalidades, as células são permeabilizadas com um solvente, tal como tolueno, ou com um detergente, como Triton-X ou Tween. Em algumas modalidades, as células são permeabilizadas com um tensoativo, por exemplo, um tensoativo catiônico, como brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB). Em algumas modalidades, as células são permeabilizadas com choque mecânico periódico, tal como eletroporação ou um choque osmótico leve. As células podem conter um UGT recombinante ou UGTs recombinantes múltiplos. Por exemplo, as células podem conter UGT 76G1 e EUGT11 de modo que as misturas de esteviosídeo e RebA sejam eficientemente convertidas em RebD. Em algumas modalidades, as células completas são as células hospedeiras descritas na seção III A. Em algumas modalidades, as células completas são uma bactéria Gram-negativa, como E. coli. Em algumas modalidades, a célula inteira é uma bateria Gram-positiva, como Bacillus. Em algumas modalidades, a célula inteira é uma espécie fúngica, como Aspergillus, ou uma levedura, como Saccharomyces. Em algumas modalidades, o termo “biocatálise de célula inteira” é usado para se referir ao processo no qual as células completas são desenvolvidas conforme descrito anteriormente (por exemplo, em um meio e, opcionalmente, permeabilizado) e um substrato, como rebA ou esteviosídeo é proporcionado e convertido ao produto final usando as enzimas das células. As células podem ou não ser viáveis, e podem ou não estar se desenvolvendo durante as reações de bioconversão. Em contrapartida, em fermentação, as células são culturadas em um meio de crescimento e carregam uma fonte de carbono e energia, como glicose e o produto final é produzido com células viáveis.
B. 3Polipeptídeos de Biossíntese de Dulcosídeo A e Rebaudiosideo C
[00138]A biossíntese de rebaudiosídeo C e/ou dulcosídeo A envolve a glicosilação e a ramnosilação de aglicona esteviol. De modo específico, dulcosídeo A pode ser formada pela glicosilação de 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O- glicosídeo, pela ramnosilação de C-2’ da 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma a 1,2 ramnobiosídeo, e pela glicosilação do C-19 carboxil da 1,2 ramnobiosídeo. Rebaudiosídeo C pode ser formada pela glicosilação de C-3’ da C-13-O-glicose de dulcosídeo A. A ordem na qual cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Vide a Figura 2B.
[00139]Constatou-se que a conversão de esteviol em dulcosídeo A em um hospedeiro recombinante pode ser realizada pela expressão de gene(s) que codifica(m) os UGTs funcionais a seguir: 85C2, EUGT11 e/ou 91D2e, e 74G1. Portanto, um microrganismo recombinante que expressa esses três ou quatro UGTs e uma ramnose sintetase pode produzir dulcosídeo A ao carregar esteviol em um meio. Alternativamente, um microrganismo recombinante que expressa dois UGTs, EUGT11 e 74G1, e ramnose sintetase pode produzir dulcosídeo A ao carregar monosídeo, esteviol-13-O-glicosídeo ou esteviol-19-O-glicosídeo, no meio. De modo similar, a conversão de esteviol em rebaudiosídeo C em um microrganismo recombinante pode ser realizada pela expressão de gene(s) que codifica(m) UGTs 85C2, EUGT11, 74G1, 76G1, opcionalmente, 91D2e, e ramnose sintetase ao carregar esteviol, pela expressão de genes que codificam UGTs EUGT11 e/ou 91D2e, 74G1, e 76G1, e ramnose sintetase ao carregar esteviol-13-O-glicosídeo, pela expressão de genes que codificam UGTs 85C2, EUGT11 e/ou 91D2e, 76G1, e ramnose sintetase ao carregar esteviol-19-O-glicosídeo, ou pela expressão de genes que codificam UGTs EUGT11 e/ou 91D2e, 76G1, e ramnose sintetase ao carregar rubusosídeo. Tipicamente, um ou mais desses genes são genes recombinantes que foram transformados em um microrganismo que não os possui naturalmente.
[00140]Os polipeptídeos EUGT11, UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2 adequados incluem os polipeptídeos UGT funcionais discutidos no presente documento. A ramnose sintetase proporciona quantidades aumentadas de doador de UDP-ramnose para ramnosilação do aceptor de composto de esteviol. As ramnose sintetases adequadas incluem aquelas feitas por Arabidopsis thaliana, tal como o produto do gene RHM2 de A. thaliana.
[00141]Em algumas modalidades, um polipeptídeo UGT79B3 é substituído por um polipeptídeo UGT91D2. Os polipeptídeos UGT79B3 adequados incluem aqueles feitos por Arabidopsis thaliana, que são capazes de ramnosilar esteviol 13-O- monosídeo in vitro. UGT79B3 de A. thaliana pode ramnosilar compostos glicolisados para formar 1,2-ramnosídeos. A sequência de aminoácidos de um UGT79B3 de Arabidopsis thaliana é apresentada em SEQ ID NO:150. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:150 é apresentada em SEQ ID NO:151.
[00142]Em algumas modalidades, rebaudiosídeo C pode ser produzida usando métodos in vitro enquanto fornece o açúcar de UDP apropriado e/ou um sistema isento de células para regeneração de açúcares de UDP. Vide, por exemplo, “An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology” por Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ e Swartz JR em Molecular Systems Biology, 4, artigo 220 (2008); Masada S et al. FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007). Em algumas modalidades, pode-se proporcionar sacarose e sacarose sintase no recipiente de reação a fim de regenerar UDP-glicose a partir de UDP durante as reações de glicosilação. Vide a Figura 11. A sacarose sintase pode ser proveniente de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência de codificação de sacarose sintase de Arabidopsis thaliana, Stevia rebaudiana, ou Coffea arabica pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob o controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro (por exemplo, um microrganismo ou uma planta). Em algumas modalidades, uma enzima RHM2 (Ramnose sintase) também pode ser proporcionada, com NADPH, para gerar UDP-ramnose a partir de UDP-glicose.
[00143]As reações podem ser realizadas juntas, ou em etapas. Por exemplo, rebaudiosídeo C pode ser produzida a partir de rubusosídeo com a adição de quantidades estequiométricas de UDP-ramnose e EUGT11, seguida pela adição de UGT76G1 e um excesso ou suprimento estequiométrico de UDP-glicose. Em algumas modalidades, as fosfatases são usadas para remover produtos secundários e aperfeiçoar os rendimentos de reação. UGTs e outras enzimas para reações in vitro podem ser proporcionadas em formas solúveis ou em formas imobilizadas. Em algumas modalidades, rebaudiosídeo C, Dulcosídeo A, ou outras esteviol ramnosídeos podem ser produzidas usando células completas conforme discutido anteriormente. As células podem conter um UGT recombinante ou múltiplos UGTs recombinantes. Por exemplo, as células podem conter UGT 76G1 e EUGT11 de modo que as misturas de esteviosídeo e RebA sejam eficientemente convertidas em RebD. Em algumas modalidades, as células completas são as células hospedeiras descritas na seção III A.
[00144]Em outras modalidades, o hospedeiro recombinante expressa um ou mais genes envolvidos em biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Portanto, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, Além de um gene UGT85C2, um gene UGT74G1, um gene EUGT11, opcionalmente, um gene UGT91D2e, e um gene UGT76G1, é capaz de produzir rebaudiosídeo C sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura. Além disso, o hospedeiro recombinante expressa tipicamente um gene endógeno ou um gene recombinante que codifica uma ramnose sintetase. Esse gene é útil a fim de proporcionar quantidades aumentadas do doador de UDP-ramnose para ramnosilação do aceptor de composto de esteviol. As ramnose sintetases adequadas incluem aquelas feitas por Arabidopsis thaliana, tal como o produto do gene RHM2 de A. thaliana.
[00145]Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que modulando-se níveis de expressão relativos de diferentes genes UGT bem como modulando-se a disponibilidade de UDP-ramnose, um hospedeiro recombinante pode ser adaptado para produzir especificamente produtos de esteviol e glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. A regulação transcricional de genes de biossíntese de esteviol, e genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol pode ser alcançada por uma combinação de técnicas de ativação e repressão transcricional usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Para reações in vitro, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que além dos diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que influenciam nas atividades relativas dos diferentes UGTS em combinação direcionará a síntese em direção a uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol.
[00146]Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém e expressa, ainda, um gene GGPPS recombinante a fim de proporcionar níveis aumentados do geranilgeranil difosfato de precursor de diterpeno, para um fluxo aumentado através da trajetória biossintética de rebaudiosídeo A. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém, ainda, uma construção para silenciar ou reduzir a expressão de trajetórias sem esteviol que consomem geranilgeranil difosfato, ácido ent-caurenóico ou farnesil pirofosfato, proporcionando, assim, um fluxo aumentado através de trajetórias biossintéticas de esteviol e glicosídeos de esteviol. Por exemplo, o fluxo para trajetórias de produção de esterol, como ergosterol, pode ser reduzido regulando-se descendentemente o gene ERG9. Vide a seção ERG9 abaixo e os Exemplos 24 e 25. Nas células que produzem giberelinas, a síntese de giberelina pode ser regulada descendentemente para aumentar o fluxo de ácido ent-caurenóico em esteviol. Em organismos produtores de carotenóide, o fluxo em esteviol pode ser aumentado regulando-se descendentemente um ou mais dos genes biossintéticos de carotenóide.
[00147]Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém e expressa, ainda, genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou na produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes na trajetória de MEP ou MEV, tem uma atividade de fosfatase reduzida, e/ou expressa um SUS conforme discutido no presente documento.
[00148]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, como um microrganismo produz composições de glicosídeo de esteviol tendo mais de pelo menos 15% de rebaudiosídeo C dos glicosídeos de esteviol totais, por exemplo, pelo menos 20% de rebaudiosídeo C, 30 a 40% de rebaudiosídeo C, 40 a 50% de rebaudiosídeo C, 50 a 60% de rebaudiosídeo C, 60 a 70% de rebaudiosídeo C, 70 a 80% de rebaudiosídeo C, 80 a 90% de rebaudiosídeo C. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, como um microrganismo produz composições de glicosídeo de esteviol tendo mais de pelo menos 90% de rebaudiosídeo C, por exemplo, 90 a 99% de rebaudiosídeo C. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos nas Figuras 2A e 2B, tais como esteviol monosídeos, esteviol glicobiosídeos, esteviol ramnobiosídeos, rebaudiosídeo A, e Dulcosídeo A. Em algumas modalidades, a composição enriquecida com rebaudiosídeo C produzida pelo hospedeiro pode ser adicionalmente purificada e a rebaudiosídeo C ou Dulcosídeo A purificadas podem, então, ser misturadas a outros glicosídeos de esteviol, sabores, ou adoçantes para obter um sistema de sabor desejado ou composição adoçante. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo C produzida por um microrganismo recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com rebaudiosídeo A, F, ou D produzida por um microrganismo recombinante diferente, com rebaudiosídeo A, F, ou D purificada a partir de um Extrato de estévia, ou com rebaudiosídeo A, F, ou D produzida in vitro.
B. 4Polipeptídeos de Biossíntese de Rebaudiosídeo F
[00149]A biossíntese de rebaudiosídeo F envolve a glicosilação e a xilosilação da aglicona esteviol. De modo específico, a rebaudiosídeo F pode ser formada pela glicosilação do 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O-glicosídeo, pela xilosilação do C-2’ da 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma esteviol-1,2- xilobiosídeo, pela glicosilação do C-19 carboxil da 1,2-xilobiosídeo para formar 1,2- estevioxilosídeo, e pela glicosilação do C-3’ da C-13-O-glicose de 1,2-estevioxilosídeo para formar rebaudiosídeo F. A ordem na qual cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Vide a Figura 2D.
[00150]Constatou-se que a conversão de esteviol em rebaudiosídeo F em um hospedeiro recombinante pode ser realizada pela expressão de genes que codificam os UGTs funcionais a seguir: 85C2, EUGT11 e/ou 91D2e, 74G1, e 76G1, junto com UDP-glicose desidrogenase e ácido UDP-glicurônico descarboxilase endógenos ou recombinantemente expressados. Portanto, um microrganismo recombinante que expressa esses quatro ou cinco UGTs junto a UDP-glicose desidrogenase e ácido UDP-glicurônico descarboxilase endógenos ou recombinantes pode produzir rebaudiosídeo F ao carregar esteviol no meio. Alternativamente, um microrganismo recombinante que expressa dois UGTs funcionais, EUGT11 ou 91D2e, e 76G1, pode produzir rebaudiosídeo F ao carregar rubusosídeo no meio. Como outra alternativa, um microrganismo recombinante que expressa um UGT 76G1 funcional pode produzir rebaudiosídeo F ao carregar 1,2 estevioramnosídeo. Como outra alternativa, um microrganismo recombinante que expressa 74G1, EUGT11 e/ou 91D2e, 76G1, e pode produzir rebaudiosídeo F ao carregar a monosídeo, esteviol-13-O-glicosídeo, no meio. De modo similar, a conversão de esteviol-19-O-glicosídeo em rebaudiosídeo F em um microrganismo recombinante pode ser realizada pela expressão de genes que codificam UGTs 85C2, EUGT11 e/ou 91D2e, e 76G1, ao carregar esteviol-19-O- glicosídeo. Tipicamente, um ou mais desses genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro que não os possui naturalmente.
[00151]Os polipeptídeos EUGT11, UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2 adequados incluem os polipeptídeos UGT funcionais discutidos no presente documento. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UGT79B3 é substituído por um UGT91, conforme discutido anteriormente. UDP-glicose desidrogenase e ácido UDP-glicurônico descarboxilase proporcionam uma quantidade aumentada do doador de UDP-xilose para xilosilação do aceptor de composto de esteviol. As UDP-glicose desidrogenases e ácido UDP-glicurônico descarboxilases adequadas incluem aquelas feitas por Arabidopsis thaliana ou Cryptococcus neoformans. Por exemplo, os polipeptídeos de UDP-glicose desidrogenase e ácido UDP-glicurônico descarboxilases podem ser codificados pelo gene UGD1 de A. thaliana gene e pelo gene UXS3, respectivamente. Vide, Oka e Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006).
[00152]Em algumas modalidades, a rebaudiosídeo F pode ser produzida usando métodos in vitro enquanto fornece o açúcar de UDP apropriado e/ou um sistema isento de célula para regeneração de açúcares de UDP. Vide, por exemplo, Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, artigo 220 (2008); Masada S et al. FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007). Em algumas modalidades, proporcionam-se sacarose e uma sacarose sintase no recipiente de reação a fim de regenerar UDP-glicose a partir de UDP durante as reações de glicosilação. Vide a Figura 11. A sacarose sintase pode ser proveniente de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência de codificação de sacarose sintase de Arabidopsis thaliana, Stevia rebaudiana, ou Coffea arabica pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob o controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro, por exemplo, um microrganismo ou uma planta. Em algumas modalidades, a UDP-xilose pode ser produzida a partir de UDP-glicose fornecendo- se enzimas adequadas, por exemplo, as enzimas UGD1 de Arabidopsis thaliana (UDP-glicose desidrogenase) e UXS3 (ácido UDP-glicurônico descarboxilase) junto ao co-fator NAD+.
[00153]As reações podem ser realizadas juntas, ou em etapas. Por exemplo, rebaudiosídeo F pode ser produzida a partir de rubusosídeo com a adição de quantidades estequiométricas de UDP-xilose e EUGT11, seguida pela adição de UGT76G1 e um excesso ou suprimento estequiométrico de UDP-glicose. Em algumas modalidades, as fosfatases são usadas para remover produtos secundários e aperfeiçoar os rendimentos de reação. UGTs e outras enzimas para reações in vitro podem ser proporcionadas em formas solúveis ou em formas imobilizadas. Em algumas modalidades, a rebaudiosídeo F ou outras esteviol xilosídeos podem ser produzidas usando células completas conforme discutido anteriormente. Por exemplo, as células podem conter UGT 76G1 e EUGT11 de modo que as misturas de esteviosídeo e RebA sejam eficientemente convertidas em RebD. Em algumas modalidades, as células completas são as células hospedeiras descritas na seção III A.
[00154]Em outras modalidades, o hospedeiro recombinante expressa um ou mais genes envolvidos em biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Portanto, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um gene UGT85C2, um gene UGT74G1, um gene EUGT11, opcionalmente, um gene UGT91D2e, e um gene UGT76G1, é capaz de produzir rebaudiosídeo F sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura. Além disso, o hospedeiro recombinante expressa tipicamente um gene endógeno ou um gene recombinante que codifica uma UDP-glicose desidrogenase e um ácido UDP-glicurônico descarboxilase. Esses genes são úteis a fim de proporcionar quantidades aumentadas do doador de UDP-xilose para xilosilação do aceptor de composto de esteviol. As UDP-glicose desidrogenases e ácido UDP-glicurônico descarboxilases adequadas incluem aquelas feitas de Arabidopsis thaliana ou Cryptococcus neoformans. Por exemplo, os polipeptídeos de UDP-glicose desidrogenase e ácido UDP-glicurônico descarboxilase adequados podem ser codificados pelo gene UGD1 de A. thaliana gene e pelo gene UXS3, respectivamente. Vide Oka e Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006).
[00155]Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que se modulando níveis de expressão relativos de diferentes genes UGT bem como modulando-se a disponibilidade de UDP-xilose, um microrganismo recombinante pode ser adaptado para produzir especificamente produtos de esteviol e glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. A regulação transcricional de genes de biossíntese de esteviol, e genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol pode ser alcançada por uma combinação de técnicas de ativação e repressão transcricional usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Para reações in vitro, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que além dos diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que influenciam nas atividades relativas dos diferentes UGTS em combinação direcionará a síntese em direção a uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol.
[00156]Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém e expressa, ainda, um gene GGPPS recombinante a fim de proporcionar níveis aumentados do geranilgeranil difosfato de precursor de diterpeno, para um fluxo aumentado através da trajetória biossintética de esteviol. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém, ainda, uma construção para silenciar ou reduzir a expressão de trajetórias sem esteviol que consomem geranilgeranil difosfato, ácido ent-caurenóico ou farnesil pirofosfato, proporcionando, assim, um fluxo aumentado através de trajetórias biossintéticas de esteviol e glicosídeos de esteviol. Por exemplo, o fluxo para trajetórias de produção de esterol, como ergosterol, pode ser reduzido regulando-se descendentemente o gene ERG9. Vide a seção ERG9 abaixo e os Exemplos 24 e 25. Nas células que produzem giberelinas, a síntese de giberelina pode ser regulada descendentemente para aumentar o fluxo de ácido ent-caurenóico em esteviol. Em organismos produtores de carotenóide, o fluxo em esteviol pode ser aumentado regulando-se descendentemente um ou mais dos genes biossintéticos de carotenóide. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante contém e expressa, ainda, genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno, por exemplo, genes na trajetória de MEP discutida abaixo.
[00157]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, como um microrganismo produz composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas com rebaudiosídeo F tendo mais de pelo menos 4% de rebaudiosídeo F em peso total de glicosídeos de esteviol, por exemplo, pelo menos 5% de rebaudiosídeo F, pelo menos 6% de rebaudiosídeo F, 10 a 20% de rebaudiosídeo F, 20 a 30% de rebaudiosídeo F, 30 a 40% de rebaudiosídeo F, 40 a 50% de rebaudiosídeo F, 50 a 60% de rebaudiosídeo F, 60 a 70% de rebaudiosídeo F, 70 a 80% de rebaudiosídeo F. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, como um microrganismo produz composições de glicosídeo de esteviol tendo pelo menos 90% de rebaudiosídeo F, por exemplo, 90 a 99% de rebaudiosídeo F. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos nas Figuras 2A e 2D, como esteviol monosídeos, esteviol glicobiosídeos, esteviol xilobiosídeos, rebaudiosídeo A, estevioxilosídeo, rubusosídeo e esteviosídeo. Em algumas modalidades, a composição enriquecida com rebaudiosídeo F produzida pelo hospedeiro pode ser misturada com outros glicosídeos de esteviol, sabores, ou adoçantes para obter um sistema de sabor desejado ou uma composição adoçante. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo F produzida por um microrganismo recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com rebaudiosídeo A, C, ou D produzida por um microrganismo recombinante diferente, com rebaudiosídeo A, C, ou D purificada a partir de um Extrato de estévia, ou com rebaudiosídeo A, C, ou D produzida in vitro.
C.Outros Polipeptídeos
[00158]Os genes para polipeptídeos adicionais cuja expressão facilita uma produção mais eficiente e em maior escala de esteviol ou de um glicosídeo de esteviol também podem ser introduzidos em um hospedeiro recombinante. Por exemplo, um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal também podem conter um ou mais genes que codificam um difosfato de geranilgeranil sintase (GGPPS, também referida como GGDPS). Como outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma ramnose sintetase, ou um ou mais genes que codifica uma UDP-glicose desidrogenase e/ou um ácido UDP-glicurônico descarboxilase. Como outro exemplo, um hospedeiro recombinante também pode conter um ou mais genes que codificam uma citocroma P450 reductase (CPR). A expressão de um CPR recombinante facilita a ciclagem de NADP+ para regenerar NADPH, que é utilizado como um co-fator para biossíntese de terpenóide. Outros métodos também podem ser usados para regenerar níveis de NADHP. Em circunstâncias onde NADPH se torna limitante; as cepas podem ser adicionalmente modificadas para incluir genes de transidrogenase exógenos. Vide, por exemplo, Sauer et al., J. Biol. Chem.279: 6613-6619 (2004). Outros métodos são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica para reduzir ou, de outro modo, modificar a razão de NADH/NADPH de modo que o nível de co-fator desejado seja aumentado.
[00159]Como outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas na trajetória MEP ou na trajetória de mevalonato. Esses genes são úteis porque eles podem aumentar o fluxo de carbono na trajetória de biossíntese de diterpeno, produzir geranilgeranil difosfato a partir de isopentenil difosfato e dimetilalil difosfato gerados pela trajetória. O geranilgeranil difosfato produzido pode ser direcionado à biossíntese de esteviol e glicosídeo de esteviol devido à expressão de polipeptídeos de biossíntese de esteviol e de polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol.
[00160]Como outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma sacarose sintase, e, adicionalmente, pode conter genes de absorção de sacarose, caso seja desejado. A reação de sacarose sintase pode ser usada para aumentar o pool de UDP-glicose em um hospedeiro de fermentação, ou em um processo de bioconversão de célula inteira. Isto regenera UDP-glicose a partir de UDP produzido durante a glicosilação e sacarose, permitindo uma glicosilação eficiente. Em alguns organismos, a interrupção da invertase endógena é vantajosa para evitar a degradação de sacarose. Por exemplo, a SUC2 invertase de S. cerevisiae pode ser interrompida. A sacarose sintase (SUS) pode ser proveniente de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência de codificação de sacarose sintase, sem limitação, proveniente de Arabidopsis thaliana, Stevia rebaudiana, ou Coffea arabica pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob o controle de um promotor adequado, e expressado em um hospedeiro (por exemplo, um microrganismo ou uma planta). A sacarose sintase pode ser expressada em tal cepa em combinação com um transportador de sacarose (por exemplo, o transportador SUC1 de A. thaliana ou um homólogo funcional deste) e um ou mais UGTs (por exemplo, um ou mais entre UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, e UGT91D2e, EUGT11 ou homólogos funcionais destes). Cultivar o hospedeiro em um meio que contenha sacarose pode promover a produção de UDP-glicose, bem como um ou mais glicosídeos (por exemplo, glicosídeos de esteviol).
[00161]Além disso, um hospedeiro recombinante pode ter uma atividade de fosfatase reduzida conforme discutido no presente documento.
C. 1Polipeptídeos de Biossíntese MEP
[00162]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante contém um ou mais genes que codificam as enzimas envolvidas na trajetória de metileritritol 4- fosfato (MEP) para biossíntese de isoprenóide. As enzimas na trajetória de MEP incluem desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR),4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4- difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS) e 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato reductase (HDR). Um ou mais genes DXS, genes DXR, genes CMS, genes CMK, genes MCS, genes HDS e/ou genes HDR podem ser incorporados em um microrganismo recombinante. Vide Rodríguez- Concepción e Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002).
[00163]Os genes adequados que codificam os polipeptídeos DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS e/ou HDR incluem aqueles feitos por E. coli, Arabidopsis thaliana e Synechococcus leopoliensis. As sequências de nucleotídeo que codificam os polipeptídeos DXR são descrias, por exemplo, na Patente U.S. No. 7.335.815.
C. 2Polipeptídeos de Biossíntese de Mevalonato
[00164]Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante contém um ou mais genes que codificam as enzimas envolvidas na trajetória de mevalonato para biossíntese de isoprenóide. Os genes adequados para transformação em um hospedeiro codificam as enzimas na trajetória de mevalonato, tal como um 3-hidróxi- 3-metil-glutaril (HMG)-CoA reductase (tHMG) truncado, e/ou um gene que codifica uma mevalonato quinase (MK), e/ou um gene que codifica uma fosfomevalonato quinase (PMK), e/ou um gene que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPPD). Portanto, um ou mais genes de HMG-CoA reductase, genes MK, genes PMK, e/ou genes MPPD podem ser incorporados em um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo.
[00165]Os genes adequados que codificam polipeptídeos de trajetória de mevalonato são conhecidos. Por exemplo, os polipeptídeos adequados incluem aqueles feitos por E. coli, Paracoccus denitrificans, Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Kitasatospora griseola, Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Gallus gallus, Streptomyces sp. KO-3988, Nicotiana attenuata, Kitasatospora griseola, Hevea brasiliensis, Enterococcus faecium e Haematococcus pluvialis. Vide, por exemplo, a Tabela 8 e as Patentes U.S. Nos. 7.183.089, 5.460.949, e 5.306.862.Tabela 8. Fontes de HMG CoA Reductases e outros Genes de Mevalonato
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C.3 Polipeptídeos de Sacarose Sintase
[00166]A sacarose sintase (SUS) pode ser usada como uma ferramenta para gerar açúcar de UDP. SUS (EC 2.4.1.13) catalisa a formação de UDP-glicose e frutose a partir de sacarose e UDP (Figura 11). UDP gerado pela reação de UGTs pode ser convertido em UDP-glicose na presença de sacarose. Vide, por exemplo, Chen et al. (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:8866-8867; Shao et al. (2003) Appl. Env. Microbiol. 69:5238-5242; Masada et al. (2007) FEBS Lett. 581:2562-2566; e Son et al. (2009) J. Microbiol. Biotechnol. 19:709-712.
[00167]As sacaroses sintases podem ser usadas para gerar UDP-glicose e remover UDP, facilitando uma glicosilação eficiente de compostos em vários sistemas. Por exemplo, a levedura deficiente na capacidade de utilizar sacarose pode ser induzida a se desenvolver em sacarose introduzindo-se um transportador de sacarose e uma SUS. Por exemplo, Saccharomyces cerevisiae não tem um sistema de absorção de sacarose eficiente, e depende de SUC2 extracelular para utilizar sacarose. A combinação de interromper a SUC2 invertase de S. cerevisiae endógena e expressar uma SUS recombinante resultou em uma cepa de levedura que era capaz de metabolizar sacarose intracelular, mas não extracelular (Riesmeier et al. ((1992) EMBO J. 11:4705-4713). A cepa foi usada para isolar os transportadores de sacarose pela transformação com uma biblioteca de expressão de cDNA e pela seleção de transformantes que ganharam a capacidade de absorver sacarose.
[00168]Conforme descrito no presente documento, a expressão combinada de sacarose sintase recombinante e um transportador de sacarose in vivo pode levar a uma disponibilidade de UDP-glicose aumentada e na remoção de UDP indesejado. Por exemplo, a expressão funcional de uma sacarose sintase recombinante, um transportador de sacarose, e uma glicosiltransferase, em combinação com nocaute do sistema de degradação de sacarose natural (SUC2 no caso de S. cerevisiae) pode ser usada para gerar uma célula que seja capaz de produzir quantidades aumentadas de compostos glicosilados, como glicosídeos de esteviol. Esta capacidade de glicosilação maior ocorre devido a pelo menos (a) uma capacidade maior para produzir UDP-glicose de maneira mais eficiente em termos de energia, e (b) remoção de UDP a partir do meio de crescimento, visto que o UDP pode iniciar reações de glicosilação.
[00169]A sacarose sintase pode ser proveniente de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência de codificação de sacarose sintase, sem limitação, proveniente de Arabidopsis thaliana, Stevia rebaudiana, ou Coffea arábica (vide, por exemplo, as Figuras 19A-19C, SEQ ID NOs:178, 179, e 180) pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob o controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro (por exemplo, um microrganismo ou uma planta). Conforme descrito nos Exemplos, uma sequência de codificação SUS pode ser expressada em uma cepa SUC2 (sacarose que hidrolisa enzima) deficiente de S. cerevisiae, a fim de evitar a degradação de sacarose extracelular pela levedura. A sacarose sintase pode ser expressada em tal cepa em combinação com um transportador de sacarose (por exemplo, o transportador SUC1 de A. thaliana ou um homólogo funcional deste) e um ou mais UGTs (por exemplo, um ou mais entre UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, EUGT11, e UGT91D2e, ou homólogos funcionais destes). Cultivar o hospedeiro em um meio que contenha sacarose pode promover a produção de UDP-glicose, bem como um ou mais glicosídeos (por exemplo, glicosídeo de esteviol). Deve-se notar que em alguns casos, uma sacarose sintase e um transportador de sacarose podem ser expressados junto a um UGT em uma célula hospedeira que também seja recombinante para produção de um composto particular (por exemplo, esteviol).
C. 4Modulação da atividade de ERG9
[00170]Um objetivo da revelação consiste em produzir terpenóides com base no conceito de aumentar o acúmulo de precursores de terpenóide da trajetória de esqualeno. Exemplos não-limitantes de terpenóides incluem Hemiterpenóides, 1 unidade de isopreno (5 carbonos); Monoterpenóides, 2 unidades de isopreno (10C); Sesquiterpenóides, 3 unidades de isopreno (15C); Diterpenóides, 4 unidades de isopreno (20C) (por exemplo, ginkgolidas); Triterpenóides, 6 unidades de isopreno (30C); Tetraterpenóides, 8 unidades de isopreno (40C) (por exemplo, carotenóides); e politerpenóide com um número maior de unidades de isopreno.
[00171]Os hemiterpenóides incluem isopreno, prenol e ácido isovalérico.
[00172]Os monoterpenóides incluem Geranil pirofosfato, Eucaliptol, Limoneno e Pineno. Os sesquiterpenóides incluem Farnesil pirofosfato, Artemisinina e Bisabolol. Os diterpenóides incluem Geranilgeranil pirofosfato, esteviol, Retinol, Retinal, Fitol, Taxol, Forskolina e Afidicolina. Os triterpenóides incluem Esqualeno e Lanosterol. Os tetraterpenóides incluem Locopeno e Caroteno.
[00173]Os terpenos são hidrocarbonetos resultantes a partir da combinação de várias unidades de isopreno. Os terpenóides podem ser imaginados como derivados de terpeno. O termo terpeno é algumas vezes usado amplamente para incluir os terpenóides. Assim como os terpenos, os terpenóides podem ser classificados de acordo com o número de unidades de isopreno usadas. A presente invenção se concentra em terpenóides e, em particular, terpenóides derivados através da trajetória de esqualeno a partir dos precursores de Farnesil-pirofosfato (FPP), Isopentenil-pirofosfato (IPP), Dimetilalil-pirofosfato (DMAPP), Geranil-pirofosfato (GPP) e/ou Geranilgeranil-pirofosfato (GGPP).
[00174]Compreende-se que os terpenóides sejam terpenóides da classe de hemiterpenóides, como, mas sem limitarem-se a, isopreno, prenol e ácido isovalérico; terpenóides da classe de monoterpenóides, como, mas sem limitarem-se a, geranil pirofosfato, eucaliptol, limoneno e pineno; terpenóides da classe de sesquiterpenóides, como, mas sem limitarem-se a, farnesil piro-fosfato, artemisinina e bisabolol; terpenóides da classe de diterpenóides, como, mas sem limitarem-se a, geranilgeranil pirofosfato, esteviol, retinol, retinal, fitol, taxol, forskolina e afidicolina; terpenóides da classe de triterpenóides, como, mas sem limitarem-se a, lanosterol; terpenóides da classe de tetraterpenóides, como, mas sem limitarem-se a, licopeno e caroteno.
[00175]Em uma modalidade, a invenção se refere à produção de terpenóides, que sejam biossintetizados a partir de Geranilgeranil-pirofosfato (GGPP). Em particular, esses terpenóides podem ser esteviol.
[00176]Em uma modalidade, a invenção se refere à produção de terpenóides, que são biossintetizados a partir de Geranilgeranil-pirofosfato (GGPP). Em particular, tais terpenóides podem ser esteviol.
A célula
[00177]A presente invenção se refere a uma célula, tal como qualquer um dos hospedeiros descritos na seção III, modificada para compreender a construção descrita na Figura 22. De modo correspondente, em um aspecto principal, a presente invenção se refere a uma célula que compreende um ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga tem a fórmula geral (I): -X1-X2-X3-X4-X5- em que X2 compreende pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos sendo complementares, e forma um elemento de estrutura secundária tipo hairpin com pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos de X4, e em que X3 é opcional e, caso esteja presente, compreende nucleotídeos envolvidos na formação de um hairpin loop entre X2 e X4, e em que X1 e X5 compreendem, individual e opcionalmente, um ou mais nucleotídeos, e em que o quadro de leitura aberta mediante uma expressão codifica uma esqualeno sintase (EC 2.5.1.21), por exemplo, uma sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade a uma esqualeno sintase (EC 2.5.1.21) ou um fragmento biologicamente ativo desta, sendo que o dito fragmento tem pelo menos 70% de identidade de sequência à dita esqualeno sintase em uma faixa de sobreposição de pelo menos 100 aminoácidos.
[00178]Além do ácido nucléico supramencionado que compreende uma sequência de inserção heteróloga, a célula também pode compreender uma ou mais sequências de ácido nucléico heterólogas adicionais (por exemplo, ácidos nucléicos que codificam qualquer um entre os polipeptídeos de biossíntese de esteviol e glicosídeo de esteviol da seção I). Em uma modalidade preferencial, a célula compreende um ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula.
Sequência de inserção heteróloga
[00179]A sequência de inserção heteróloga pode se adaptar ao elemento de estrutura secundário de um hairpin com um hairpin loop. A parte de hairpin compreende as seções X2 e X4 que são complementares e se hibridizam entre si. As seções X2 e X4 flanqueiam a seção X3, que compreende nucleotídeos que formam um loop - o hairpin loop. Um indivíduo versado na técnica compreende que o termo complementar significa duas sequências comparadas entre si, nucleotídeo por nucleotídeo contando a partir da extremidade 5’ até a extremidade 3’, ou vice-versa.
[00180]A sequência de inserção heteróloga é longa o suficiente para permitir que um hairpin seja completado, mas curta o suficiente para permitir uma translação limitada de um ORF que está presente no quadro e imediatamente 3’ à sequência de inserção heteróloga. Portanto, em uma modalidade, a sequência de inserção heteróloga compreende de 10 a 50 nucleotídeos, de preferência, de 10 a 30 nucleotídeos, com mais preferência, de 15 a 25 nucleotídeos, com mais preferência, de 17 a 22 nucleotídeos, com mais preferência, de 18 a 21 nucleotídeos, com mais preferência, de 18 a 20 nucleotídeos, com mais preferência, 19 nucleotídeos.
[00181]X2 e X4 podem consistir individualmente em qualquer número adequado de nucleotídeos, contanto que uma sequência consecutiva de pelo menos 4 nucleotídeos de X2 seja complementar a uma sequência consecutiva de pelo menos 4 nucleotídeos de X4. Em uma modalidade preferencial, X2 e X4 consistem no mesmo número de nucleotídeos.
[00182]X2 pode consistir, por exemplo, na faixa de 4 a 25, tal como na faixa de 4 a 20, por exemplo, na faixa de 4 a 15, tal como na faixa de 6 a 12, por exemplo, na faixa de 8 a 12, tal como na faixa de 9 a 11 nucleotídeos.
[00183]X4 pode consistir, por exemplo, na faixa de 4 a 25, tal como na faixa de 4 a 20, por exemplo, na faixa de 4 a 15, tal como na faixa de 6 a 12, por exemplo, na faixa de 8 a 12, tal como na faixa de 9 a 11 nucleotídeos.
[00184]Em uma modalidade preferencial, X2 consiste em uma sequência de nucleotídeo, que seja complementar à sequência de nucleotídeo de X4, isto é, prefere- se que todos os nucleotídeos de X2 sejam complementares à sequência de nucleotídeo de X4.
[00185]Em uma modalidade preferencial, X4 consiste em uma sequência de nucleotídeo, que seja complementar à sequência de nucleotídeo de X2, isto é, prefere- se que todos os nucleotídeos de X4 sejam complementares à sequência de nucleotídeo de X2. Com mais preferência, X2 e X4 consistem no mesmo número de nucleotídeos, em que X2 é complementar a X4 ao longo de todo o comprimento de X2 e X4.
[00186]X3 pode estar ausente, isto é, X3 pode consistir em zero nucleotídeos. Também é possível que X3 consista na faixa de 1 a 5, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.
[00187]X1 pode estar ausente, isto é, X1 pode consistir em zero nucleotídeos. Também é possível que X1 consista na faixa de 1 a 25, tal como na faixa de 1 to 20, por exemplo, na faixa de 1 a 15, tal como na faixa de 1 a 10, por exemplo, na faixa de 1 a 5, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.
[00188]X5 pode estar ausente, isto é, X5 pode consistir em zero nucleotídeos. Também é possível que X5 possa consistir na faixa de 1 a 5, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.
[00189]A sequência pode ser qualquer sequência adequada que satisfaça os requerimentos definidos anteriormente. Portanto, a sequência de inserção heteróloga pode compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, e SEQ ID NO:184. Em uma modalidade preferencial, a sequência de inserção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, e SEQ ID NO:184.
Esqualeno sintase
[00190]A esqualeno sintase (SQS) é a primeira enzima comprometida da trajetória de biossíntese que leva à produção de esteróis. Esta catalisa a síntese de esqualeno a partir de farnesil pirofosfato através do presqualeno pirofosfato intermediário. Esta enzima é uma enzima de ponto de ramificação crítico na biossíntese de terpenóides/isoprenóides e imagina-se que regule o fluxo de intermediários de isopreno através da trajetória de esterol. Algumas vezes, a enzima é referida como farnesil-difosfato farnesil transferase (FDFT1).
[00191]O mecanismo de SQS consiste em converter duas unidades de farnesil pirofosfato em esqualeno.
[00192]SQS é considerado como sendo uma enzima de eucariontes ou organismos avançados, embora pelo menos um procarionte tenha sido mostrado possuindo uma enzima com funcionalidade similar.
[00193]Em termos de estrutura e mecânica, a esqualeno sintase se assemelha mais intimamente à fitoeno sintase, que serve um papel similar em muitas plantas na elaboração de fitoeno, um precursor de muitos compostos carotenóides.
[00194]Um alto nível de identidade de sequência indica a probabilidade que a primeira sequência é derivada a partir da segunda sequência. A identidade de sequência de aminoácidos requer sequências de aminoácidos idênticas entre duas sequências alinhadas. Portanto, uma sequência candidata que compartilhe 70% de identidade de aminoácido com uma sequência de referência requer que, após o alinhamento, 70% dos aminoácidos na sequência candidata sejam idênticos aos aminoácidos correspondentes na sequência de referência. A identidade pode ser determinada pelo auxílio de uma análise computacional, tal como, sem limitações, o programa de alinhamento computacional ClustalW conforme descrito na seção D. Utilizando-se este programa com seus ajustes padrão, a parte madura (bioativa) de uma consulta e um polipeptídeo de referência são alinhados. O número de resíduos completamente conservados é contado e dividido pelo comprimento do polipeptídeo de referência. O algoritmo ClustalW pode ser similarmente usado para alinhar sequências de nucleotídeo. As identidades de sequência podem ser calculadas de forma similar conforme indicado para a sequência de aminoácidos.
[00195]Em uma modalidade importante, a célula da presente invenção compreende uma codificação de sequência de ácido nucléico, conforme definido no presente documento, mediante a expressão para uma esqualeno sintase em que a esqualeno sintase é pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 99,7%, tal como pelo menos 99,8%, tal como pelo menos 99,9%, tal como 100% idêntica a uma esqualeno sintase em que a esqualeno sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199,SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, e SEQ ID NO:202.
Promotor
[00196]Um promotor é uma região de DNA que facilita a transcrição de um gene particular. Os promotores ficam localizados próximos aos genes que eles regulam, no mesmo filamento e, tipicamente, a montante (em direção à região 5' do filamento de captação). A fim de que a transcrição ocorra, a enzima que sintetiza RNA, conhecida como RNA polimerase, deve se ligar ao DNA próximo a um gene. Os promotores contêm sequências de DNA específicas e elementos de resposta que proporcionam um sítio de ligação inicial seguro para RNA polimerase e para proteínas denominadas como fatores de transcrição que recrutam RNA polimerase. Esses fatores de transcrição têm sequências ativadoras ou repressoras específicas de nucleotídeos correspondentes que se ligam a promotores específicos e regulam as expressões genéticas.
[00197]Em bactérias, o promotor é reconhecido por RNA polimerase e por um fator sigma associado, que são sucessivamente trazidos ao DNA promotor por uma proteína ativadora que se liga a seu próprio sítio de ligação de DNA. Em eucariontes, o processo é mais complicado, e pelo menos sete fatores diferentes são necessários para a ligação de uma RNA polimerase II ao promotor. Os promotores representam elementos fundamentais que podem funcionar conjuntamente com outras regiões regulatórias (acentuadores, silenciadores, elementos/isolantes de limite) para direcionar o nível de transcrição de um dado gene.
[00198]Visto que os promotores são promoters normalmente imediatamente adjacentes ao quadro de leitura aberta (ORF) em questão, as posições no promotor são designadas em relação ao sítio de partida transcricional, onde a transcrição de RNA começa um gene particular (isto é, posições a montante são números negativos contando de trás para frente a partir de -1, por exemplo -100 é uma posição de 100 pares de base a montante). Elementos promotores Promotor de núcleo - a porção mínima do promotor necessária para iniciar apropriadamente a transcrição o Sítio de Partida de Transcrição (TSS) o Aproximadamente -35 bp a montante e/ou a jusante do sítio de partida o Um sítio de ligação para RNA polimerase RNA polimerase I: transcreve genes que codificam RNA ribossômico RNA polimerase II: transcreve genes que codificam RNA mensageiro e determinados RNAs nucleares pequenos RNA polimerase III: transcreve genes que codificam tRNAs e outros RNAs pequenos o Sítios de ligação de fator de transcrição geral Promotor proximal - a sequência proximal a montante do gene que tende a conter elementos regulatórios primários O Aproximadamente -250 bp a montante do sítio de partida o Sítios de ligação de fator de transcrição específico Promotor distal - a sequência distal a montante do gene que pode conter elementos regulatórios adicionais, geralmente com uma influência mais fraca do que o promotor proximal o Qualquer coisa adicionalmente a montante (mas não um acentuador ou outra região regulatória cuja influência é independente de posição/orientação) o Sítios de ligação de fator de transcrição específico
Promotores procarióticos
[00199]Em procariontes, o promotor consiste em duas sequências curtas nas posições -10 e -35 a montante a partir do sítio de partida de transcrição. Os fatores sigma não ajudam somente em acentuar a ligação RNAP ao promotor, mas também ajudam genes alto-específicos RNAP a se transcreverem.
[00200]A sequência em -10 é denominada como caixa Pribnow, ou o elemento -10, e geralmente consiste em seis nucleotídeos TATAAT. A caixa Pribnow é essencial para iniciar a transcrição em procariontes.
[00201]A outra sequência em -35 (o elemento -35) geralmente consiste em sete nucleotídeos TTGACAT. Sua presença permite uma taxa de transcrição bastante alta.
[00202]Ambas as sequências consenso anteriores, enquanto conservadas em média, não são encontradas intactas na maioria dos promotores. Em média, somente 3 dos 6 pares de base em cada sequência consenso são encontrados em qualquer dado promotor. Até o presente, não se identificou nenhum promotor que tenha sequências consensos intactas tanto em -10 como em -35; constatou-se que promotores artificiais com conservação completa dos hexâmeros -10/-35 promovem a iniciação de cadeia de RNA em eficiências bastante altas.
[00203]Alguns promotores contêm um elemento UP (sequência consenso 5'- AAAWWTWTTTTNNNAAANNN-3'; W = A ou T; N = qualquer base) centralizado em - 50; a presença do elemento -35 aparenta não ser importante para transcrição a partir dos promotores contendo elemento UP.
Promotores eucarióticos
[00204]Os promotores eucarióticos ficam tipicamente localizados a montante do gene (ORF) e podem ter elementos regulatórios várias quilobases (kb) afastados do sítio de partida transcricional. Em eucariontes, o complexo transcricional pode fazer com que o DNA se dobre sobre ele mesmo, o que permite a colocação de sequências regulatórias afastadas do sítio real de transcrição. Muitos promotores eucarióticos contêm uma caixa TATA (sequência TATAAA), que, sucessivamente, se liga a uma proteína de ligação TATA que auxilia na formação do complexo transcricional de RNA polimerase. A caixa TATA tipicamente se encontra bastante próxima ao sítio de partida transcricional (geralmente dentro de 50 bases).
[00205]A célula da presente invenção compreende uma sequência de ácido nucléico que compreende uma sequência promotora. A sequência promotora não é limitante da invenção e pode ser qualquer promotor adequado para a célula hospedeira de escolha.
[00206]Em uma modalidade da presente invenção, o promotor é um promotor constitutivo ou induzível.
[00207]Em uma modalidade adicional da invenção, o promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em um promotor endógeno, PGK-1, GPD1, PGK1, ADH1, ADH2, PYK1, TPI1, PDC1, TEF1, TEF2, FBA1, GAL1-10, CUP1, MET2, MET14, MET25, CYC1, GAL1-S, GAL1-L, TEF1, ADH1, CAG, CMV, UbiC humano, RSV, EF-1alpha, SV40, Mt1, Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mx1, progesterono, RU486 e promotor induzível de Rapamicina.
Regulação pós-transcricional
[00208]A regulação pós-transcricional é o controle da expressão genética no nível de RNA, portanto, entre a transcrição e a translação do gene.
[00209]O primeiro caso de regulação é uma transcrição (regulação transcricional) onde devido à disposição de cromatina e devido à atividade de fatores de transcrição, os genes são diferencialmente transcritos.
[00210]Após ser produzida, a estabilidade e a distribuição das diferentes transcrições são reguladas (regulação pós-transcricional) por meio de uma proteína de ligação de RNA (RBP) que controla as várias etapas e taxas das transcrições: eventos, como splicing alternativo, degradação nuclear (exossoma), processamento, exportação nuclear (três trajetórias alternativas), sequestro em corpos DCP2 para armazenamento ou degradação, e, ultimamente, translação. Essas proteínas alcançam esses eventos graças a um motivo de reconhecimento de RNA (RRM) que liga uma sequência específica ou estrutura secundária das transcrições, tipicamente, no 5’ e 3’ UTR da transcrição.
[00211]A modulação de capping, splicing, a adição de uma cauda Poli(A), as taxas de exportação nuclear especificas à sequência e em vários contextos a sequestro da transcrição de RNA ocorrem em eucariontes, mas não em procariontes. Esta modulação é um resultado de uma proteína ou transcrição que é sucessivamente regulada e pode ter uma afinidade por determinadas sequências.
Capping
[00212]O capping altera a extremidade 5’ do mRNA para uma extremidade 3’ pela ligação 5'-5', que protege o mRNA entre exonuclease 5', que degrada o RNA estranho. O cap também ajuda na ligação ribossômica.
Splicing
[00213]O splicing remove os intrões, regiões de não-codificação que são transcritas em RNA, a fim de tornar o mRNA capaz de criar proteínas. As células fazem isto por spliceossomas que se ligam em qualquer lado de um intrão, laceando o intrão em um círculo e, então, clivando-o. As duas extremidades dos exões são, então, unidas entre si.
Poliadenilação
[00214]A poliadenilação é a adição de uma cauda poli(A) à extremidade 3', isto é, a cauda poli(A) consiste em múltiplos monofosfatos de adenosina. A sequência poli-A atua como um tampão à exonuclease 3' e, portanto, aumenta a meia-vida do mRNA. Além disso, uma cauda poli(A) longa pode aumentar a translação. Portanto, a cauda poli-A pode ser usada para modular a translação da construção da presente invenção, a fim de chegar a uma taxa de translação ótima.
[00215]Em eucariontes, a poliadenilação é parte do processo que produz um RNA mensageiro maduro (mRNA) para translação.
[00216]A cauda poli(A) também é importante para a exportação nuclear, translação, e estabilidade de mRNA.
[00217]Em uma modalidade, a sequência de ácido nucléico da célula da presente invenção, conforme definido anteriormente, compreende, ainda, uma sequência de poliadenil/poliadenilação, de preferência, a extremidade 5’ da dita sequência de poliadenil/poliadenilação é operacionalmente ligada à extremidade 3’ do quadro de leitura aberta, tal como ao quadro de leitura aberta que codifica esqualeno sintase.
Edição de RNA
[00218]A edição de RNA é um processo que resulta na variação de sequência na molécula de RNA, e é catalisada por enzimas. Essas enzimas incluem as enzimas de Adenosina Deaminasa Agindo em RNA (ADAR), que convertem resíduos de adenosina específicos em inosina em uma molécula de mRNA por desaminação hidrolítica. Três enzimas ADAR foram clonadas, ADAR1, ADAR2 e ADAR3, embora somente os primeiros dois subtipos tenham sido mostrados tendo uma atividade de edição de RNA. Muitos mRNAs são vulneráveis aos efeitos de edição de RNA, incluindo as subunidades de receptor de glutamato GluR2, GluR3, GluR4, GluR5 e GluR6 (que são componentes dos receptores de AMPA e cainato), o receptor serotonin2C, a subunidade de receptor GABA-alpha3, a enzima de hidroxilase de triptofano TPH2, o vírus delta da hepatite e mais de 16% de microRNAs. Além das enzimas ADAR, as enzimas CDAR são presentes e convertem citosinas em moléculas de RNA específicas, em uracila. Essas enzimas são denominadas como 'APOBEC' e têm locais genéticos em 22q13, uma região próxima à exclusão cromossômica que ocorre na síndrome velocardiofacial (22q11) e que é ligada à psicose. A edição de RNA é extensivamente estudada em relação a doenças infecciosas, porque o processo de edição altera a função viral.
Elementos regulatórios pós-transcricionais
[00219]Geralmente, o uso de elementos regulatórios pós-transcricionais (PRE) é necessário para obter vetores com um desempenho suficiente para determinadas aplicações. Schambach et al em Gene Ther. (2006) 13(7):641-5 reporta que a introdução de um elemento regulatório pós-transcricional (PRE) do vírus da hepatite de marmotas (WHV) na região não-transladada 3' de vetores de transferência genética retroviral e lentiviral acentua tanto o título como a expressão transgenética. A acentuação da atividade de PRE depende da configuração precisa de sua sequência e do contexto do vetor e da célula na qual este é introduzido.
[00220]Portanto, o uso de um PRE, tais como elementos regulatórios pós- transcricionais do vírus da hepatite de marmotas (WPRE) pode ser útil na preparação da célula da presente invenção ao usar uma abordagem terapêutica genética.
[00221]De modo correspondente, em uma modalidade, a sequência de ácido nucléico da célula aqui definida compreende, ainda, um elemento regulatório pós- transcricional.
[00222]Em uma modalidade adicional, o elemento regulatório pós- transcricional é um elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite de marmotas (WPRE).
Repetições de terminal
[00223]Para inserir sequências genéticas em DNA hospedeiro, os vírus geralmente usam sequências de DNA que se repetem até milhares de vezes, autodenominadas repetições, ou repetições terminais incluindo repetições terminais longas (LTR) e repetições terminais invertidas (ITR), em que as ditas sequências de repetição podem ser repetições terminais 5’ e 3’. ITRs auxiliam na formação de concatâmero no núcleo após o DNA de vetor com filamento único ser convertido por complexos de DNA polimerase de célula hospedeira em DNA de filamento duplo. As sequências ITR podem ser derivadas a partir de vetores virais, como AAV, por exemplo, AAV2.
[00224]Em uma modalidade, a sequência de ácido nucléico ou o vetor da célula definida no presente documento compreende uma repetição terminal 5’ terminal e uma repetição terminal 3’.
[00225]E uma modalidade, as ditas repetições terminais 5’ e 3’ são selecionadas a partir de Repetições Terminais Invertidas [ITR] e de Repetições Terminais Longas [LTR].
[00226]Em uma modalidade, as ditas repetições terminais 5’ e 3’ são Repetições Terminais Invertidas AAV [ITR].
Geranilgeranil Pirofosfato Sintase
[00227]As células microbianas da presente invenção podem, em modalidades preferenciais, conter uma sequência heteróloga de ácido nucléico que codifica Geranilgeranil Pirofosfato Sintase (GGPPS). Vide, por exemplo, a Tabela 7. GGPPS é uma enzima, que catalisa a reação química que transformar uma molécula de farnesil pirofosfato (FPP) em uma molécula de Geranilgeranil Pirofosfato (GGPP). Os genes que codificam GGPPS podem ser encontrados, por exemplo, em organismos que contenham a trajetória de mevalonato.
[00228]A GGPPS a ser usada com a presente invenção pode ser qualquer enzima útil, que seja capaz de catalisar a conversão de uma molécula de farnesil pirofosfato (FPP) em uma molécula de Geranilgeranil Pirofosfato (GGPP). Em particular, a GGPPS a ser usada com a presente invenção pode ser qualquer enzima capaz de catalisar a reação a seguir:
[00229](2E,6E)-farnesil difosfato + isopentenil difosfato -> difosfato + geranilgeranil difosfato.
[00230]Prefere-se que a GGPPS usada com a presente invenção seja uma enzima categorizada sob EC 2.5.1.29.
[00231]A GGPPS pode ser uma GGPPS a partir de uma variedade de fontes, tal como a partir de bactérias, fungos ou mamíferos. A GGPPS pode ser qualquer tipo de GGPPS, por exemplo, GGPPS-1, GGPPS-2, GGPPS-3 ou GGPPS-4. A GGPPS pode ser uma GGPPS tipo selvagem ou um homólogo funcional desta.
[00232]Por exemplo, a GGPPS pode ser GGPPS-1 de S. acidicaldarius (SEQ ID NO: 126), GGPPS-2 de A.nidulans (SEQ ID NO: 203), GGPPS-3 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 167) ou GGPPS-4 de M. musculus (SEQ ID NO:123) ou um homólogo funcional de qualquer uma dessas supramencionadas.
[00233]O ácido nucléico heterólogo que codifica a dita GGPPS pode ser qualquer sequência de ácido nucléico que codifica a dita GGPPS. Portanto, nas modalidades da invenção onde a GGPPS é uma proteína tipo selvagem, a sequência de ácido nucléico pode, por exemplo, ser uma sequência de cDNA tipo selvagem que codifica a dita proteína. No entanto, este é frequentemente o caso onde o ácido nucléico heterólogo é uma sequência de ácido nucléico que codifica qualquer GGPPS particular, onde o dito ácido nucléico foi códon-otimizado para a célula microbiana particular. Portanto, a título de exemplo, se a célula microbiana for S. cerevisiae, então, o ácido nucléico que codifica GGPPS foi, de preferência, códon-otimizado para uma expressão ótima em S. cerevisiae.
[00234]Os homólogos funcionais de GGPPS são, de preferência, uma proteína tendo a atividade supramencionada e compartilhando pelo menos 70% de identidade de aminoácido com a sequência de uma GGPPS de referência. Os métodos para determinar a identidade de sequência são descritos anteriormente na seção “Esqualeno sintase” e na seção D.
[00235]Em uma modalidade, a célula, tal como a célula microbiana da presente invenção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma GGPPS ou um homólogo funcional desta, sendo que o dito homólogo funcional é pelo menos 99%, tal como pelo menos 99,5%, tal como pelo menos 99,6%, tal como pelo menos 99,7%, tal como pelo menos 99,8%, tal como pelo menos 99,9%, tal como 100% idêntico a uma GGPPS selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:167 e SEQ ID NO:203.
[00236]Em geral, a dita sequência de ácido nucléico heterólogo que codifica uma GGPPS é operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na célula microbiana. A sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na célula microbiana pode ser uma sequência promotora, e, de preferência, a dita sequência promotora é selecionada de acordo com a célula microbiana particular. O promotor pode ser, por exemplo, qualquer um dos promotores descritos anteriormente na seção “Promotor”
Vetores
[00237]Um vetor é uma molécula de DNA usada como um veículo para transferir um material genético estranho em outra célula. Os principais tipos de vetores são plasmídeos, vírus, cosmídeos, e cromossomos artificiais. Comuns a todos os vetores modificados por engenharia genética são aqueles de origem de replicação, um sítio de multiclonagem, e um marcador selecionável.
[00238]Em geral, o próprio vetor consiste em uma sequência de DNA que consiste em um elemento de inserção (transgene) e uma sequência maior que serve como a “cadeia principal” do vetor. O propósito de um vetor que transfere informações genéticas à outra célula é tipicamente isolar, multiplicar, ou expressar o elemento de inserção na célula alvo. Os vetores denominados como vetores de expressão (construções de expressão) servem especificamente para a expressão do transgene na célula alvo, e têm, genericamente, uma sequência promotora que conduz a expressão do transgene. Vetores mais simples denominados como vetores de transcrição são somente capazes de ser transcritos, mas não transladados: eles podem ser replicados em uma célula alvo, mas não expressados, diferentemente dos vetores de expressão. Os vetores de transcrição são usados para amplificar seu elemento de inserção.
[00239]O elemento de inserção de um vetor na célula alvo é geralmente denominado como a transformação para células bacterianas, transfecção para células eucarióticas, embora o elemento de inserção de um vetor viral seja geralmente denominado como transdução.
Plasmídeos
[00240]Os vetores de plasmídeo são sequências de DNA circulares genericamente de filamento duplo que sejam capazes de se replicarem automaticamente em uma célula hospedeira. Os vetores de plasmídeo consistem, de modo minimalístico, em uma origem de replicação que permite uma replicação semi- independente do plasmídeo no hospedeiro e também do elemento de inserção de transgene. Em geral, os plasmídeos modernos têm muito mais recursos, incluindo notavelmente um “sítio de clonagem múltipla” que inclui protuberâncias de nucleotídeo para inserção em um elemento de inserção, e múltiplos sítios de consenso de enzima de restrição em qualquer lado do elemento de inserção. No caso de plasmídeos utilizados como vetores de transcrição, incubar a bactéria com plasmídeos gera centenas ou milhares de cópias do vetor dentro da bactéria em horas, e os vetores podem ser extraídos a partir da bactéria, e o sítio de clonagem múltipla pode ser cortado por enzimas de restrição para excisar o elemento de inserção amplificado centenas ou milhares de vezes. Esses vetores de transcrição de plasmídeo são caracteristicamente desprovidos de sequências cruciais que codificam sequências de poliadenilação e sequências de terminação de translação em mRNAs transladados, tornando a expressão de proteína a partir de vetores de transcrição impossível. Os plasmídeos podem ser conjugativos/transmissíveis e não-conjugativos:conjugativos: mediam a transferência de DNA através da conjugação e, portanto, se espalham rapidamente dentre as células bacterianas de uma população; por exemplo, plasmídeo F, muitos plasmídeos R e alguns plasmídeos col.não-conjugativos- não mediam o DNA através de conjugação, por exemplo, muitos plasmídeos R e col.
Vetores virais
[00241]Em geral, os vetores virais são vírus geneticamente modificados que transportam um DNA viral modificado ou RNA que tenha sido tornado não-infeccioso, mas ainda contenha promotores viras e também o transgene, permitindo, assim, a translação do transgene através de um promotor viral. No entanto, devido ao fato de os vetores virais frequentemente são desprovidos de sequências infecciosas, eles requerem vírus auxiliares ou linhas de empacotamento para transfecção em larga escala. Os vetores virais são geralmente designados para incorporação permanente do elemento de inserção no genoma hospedeiro, e, logo, deixa marcadores genéticos distintos no genoma hospedeiro após incorporar o transgene. Por exemplo, os retrovírus deixam um padrão de integração retroviral característico após a inserção que é detectável e indica que o vetor viral incorporou o genoma hospedeiro.
[00242]Em uma modalidade, a invenção se refere a um vetor viral capaz de transfectar uma célula hospedeira, tal como uma célula que possa ser cultivada, por exemplo, uma célula de levedura ou qualquer outra célula eucariótica desejada. O vetor é, então, capaz de transfectar a dita célula com um ácido nucléico que inclua a sequência de inserção heteróloga conforme descrito no presente documento.
[00243]O vetor viral pode ser qualquer vetor viral adequado, tal como um vetor viral selecionado a partir do grupo que consiste em vetores derivados a partir da família Retroviridae incluindo lentivírus, HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV.
[00244]O vetor viral também pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em alfavírus, adenovírus, vírus adeno associado, baculovírus, HSV, coronavírus, vírus do papiloma Bovino, Mo-MLV e vírus adeno associado.
[00245]Em modalidades da invenção em que a célula microbiana compreende um ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS, então, o dito ácido nucléico heterólogo pode ser posicionado no vetor também contendo o ácido nucléico que codifica esqualeno sintase, ou o ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS pode ser posicionado em um vetor diferente. O dito ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS pode estar contido em qualquer um dos vetores descritos anteriormente.
[00246]Em modalidades da invenção em que a célula microbiana compreende um ácido nucléico heterólogo que codifica HMCR, então, o dito ácido nucléico heterólogo pode ser posicionado no vetor também contendo o ácido nucléico que codifica esqualeno sintase, ou o ácido nucléico heterólogo que codifica HMCR pode ser posicionado em um vetor diferente. O dito ácido nucléico heterólogo que codifica HMCR pode estar contido em qualquer um dos vetores descritos anteriormente. A invenção também se refere ao ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS e o ácido nucléico heterólogo que codifica HMCR pode ser posicionado nos mesmos vetores ou em vetores individuais.
Transcrição
[00247]A transcrição é um componente necessário em todos os vetores: a premissa de um vetor consiste em multiplicar o elemento de inserção (embora os vetores de expressão posteriores também conduzam a translação do elemento de inserção multiplicado). Portanto, até mesmo uma expressão estável é determinada pela transcrição estável, que depende genericamente nos promotores no vetor. No entanto, os vetores de expressão têm uma variedade de padrões de expressão: constitutivos (expressão consistente) ou induzíveis (expressão somente sob determinadas condições ou produtos químicos). Esta expressão se baseia em atividades de promotor diferentes, atividades não pós-transcricionais. Portanto, esses dois tipos diferentes de vetores de expressão dependem de tipos diferentes de promotores.
[00248]Os promotores virais são geralmente usados para expressão constitutiva em plasmídeos e em vetores virais porque eles normalmente forçam, de modo confiável, uma transcrição constante em muitas linhas e tipos de células.
[00249]A expressão induzível depende de promotores que respondem a condições de indução: por exemplo, o promotor de vírus tumoral de mamíferos murinos inicia somente a transcrição após a aplicação de dexametassona e o promotor de choque térmico de Drosofilia inicia somente após altas temperaturas. A transcrição é a síntese de mRNA. As informações genéticas são copiadas a partir do DNA ao RNA
Expressão
[00250]Os vetores de expressão requerem sequências que codifiquem, por exemplo, uma cauda de poliadenilação (vide anteriormente): Cria uma cauda de poliadenilação no fim da pré-mRNA transcrita que protege o mRNA contra exonucleases e garante uma terminação transcricional e translacional: estabiliza a produção de mRNA.
[00251]Comprimento de UTR mínimo: UTRs contêm características específicas que podem impedir a transcrição ou a translação, e, portanto, os UTRs mais curtos ou nenhum são codificados em vetores de expressão ótimos.
[00252]Sequência de Kozak: Os vetores devem codificar uma sequência de Kozak no mRNA, que se assemelha ao ribossomo para translação do mRNA.
[00253]As condições acima são necessárias para vetores de expressão em eucariontes, mas não em procariontes.
[00254]Os vetores modernos podem abranger recursos adicionais além do elemento de inserção de transgene e uma cadeia principal, tal como um promotor (discutido anteriormente), marcadores genéticos para permitir, por exemplo, a confirmação que o vetor se integrou ao DNA genômico hospedeiro, genes resistentes a antibióticos para seleção de antibiótico, e tags de afinidade para purificação.
[00255]Em uma modalidade, a célula da presente invenção compreende uma sequência de ácido nucléico integrada a um vetor, tal como um vetor de expressão.
[00256]Em uma modalidade, o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em vetores de plasmídeo, cosmídeos, cromossomos artificiais e vetores virais.
[00257]O vetor de plasmídeo deveria ser capaz de ser mantido e replicado em bactérias, fungos e leveduras.
[00258]A presente invenção também se refere a células que compreendem vetores de plasmídeo e cosmídeo, bem como vetores de cromossomo artificial.
[00259]O fator importante é que o vetor é funcional e que o vetor compreende pelo menos a sequência de ácido nucléico que compreende a sequência de inserção heteróloga conforme descrito no presente documento.
[00260]Em uma modalidade, o vetor é funcional em fungos e em células de mamíferos.
[00261]Em uma modalidade, a invenção se refere a uma célula transformada ou transduzida com o vetor conforme definido anteriormente.
Métodos para produzir terpenóides
[00262]Conforme mencionado anteriormente, a célula da presente invenção (por exemplo, células de hospedeiro recombinante) é útil em acentuar o rendimento de terpenóides industrialmente relevantes.
[00263]Portanto, a célula da invenção pode ser usada em várias disposições a fim de aumentar o acúmulo de precursores de terpenóide e, logo, aumentar o rendimento de produtos de terpenóide resultando a partir da conversão enzimática dos ditos precursores de terpenóide (a montante).
[00264]De modo correspondente, em um aspecto, apresente invenção se refere a um método para produzir um composto de terpenóide sintetizado através da trajetória de esqualeno, em uma cultura celular, sendo que o dito método compreende as etapas de Proporcionar as células conforme definido anteriormente, cultivar a célula de (a) recuperar o composto de produto de terpenóide.
[00265]Proporcionando-se a célula que compreende a construção geneticamente modificada definida anteriormente, acentua-se o acúmulo de precursores de terpenóide é (Figura 20).
[00266]Portanto, em outro aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um terpenóide derivado a partir de um precursor de terpenóide selecionado a partir do grupo que consiste em Farnesil-pirofosfato (FPP), Isopentenil-pirofosfato (IPP), Dimetilalil-pirofosfato (DMAPP), Geranil-pirofosfato (GPP) e/ou Geranilgeranil- pirofosfato (GGPP), sendo que o dito método compreende: colocar o dito precursor em contato com uma enzima da trajetória de esqualeno sintase, recuperar o produto de terpenóide.
[00267]Em uma modalidade, o (produto) de terpenóide do método da presente invenção, conforme definido anteriormente, é selecionado a partir do grupo que consiste em hemiterpenóides, monoterpenos, sesquiterpenóides, diterpenóides, sesterpenos, triterpenóides, tetraterpenóides e politerpenóides.
[00268]Em uma modalidade adicional, o terpenóide é selecionado a partir do grupo que consiste em farnesil fosfato, farnesol, geranilgeranil, geranilgeraniol, isopreno, prenol, ácido isovalérico, geranil pirofosfato, eucaliptol, limoneno, pineno, farnesil pirofosfato, artemisinina, bisabolol, geranilgeranil pirofosfato, retinol, retinal, fitol, taxol, forscolina, afidicolina, lanosterol, locopeno e caroteno.
[00269]O produto de terpenóide pode ser usado como um ponto de partida em um processo de refinação adicional. Portanto, em uma modalidade, o dito método compreende, ainda, desfosforilar o farnesil fosfato para produzir farnesol.
[00270]A enzima ou enzimas usadas no processo de preparação do composto de terpenóide de produto alto consistem preferencialmente em uma enzima “localizada a jusante” dos precursores de terpenóide Farnesil-pirofosfato, Isopentenil- pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato e Geranilgeranil-pirofosfato, tal como uma enzima localizada a jusante dos precursores de terpenóide Farnesil- pirofosfato, Isopentenil-pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato e Geranilgeranil-pirofosfato descritos na trajetória de esqualeno da Figura 20. A enzima usada no processo de preparar o terpenóide de produto alvo, com base no acúmulo de precursores alcançado através da presente invenção, pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em Dimetilaliltransferase (EC 2.5.1.1), Isopreno sintase (EC 4.2.3.27) e Geraniltranstransferase (EC 2.5.1.10).
[00271]A presente invenção pode operar, pelo menos parcialmente, impedindo-se estericamente a ligação do ribossomo ao RNA, reduzindo, assim, a translação de esqualeno sintase. De modo correspondente, em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para reduzir a taxa de translação de uma esqualeno sintase funcional (EC 2.5.1.21), sendo que o dito método compreende: proporcionar a célula definida anteriormente,cultivar a célula de (a).
[00272]De modo similar, a invenção em outro aspecto se refere a um método para deduzir o turnover de farnesil-pp em esqualeno, sendo que o dito método compreende:proporcionar a célula definida anteriormente,cultivar a célula de (a).
[00273]Conforme descrito na Figura 20, a redução de expressão do ERG9 resulta no acúmulo de precursores em esqualeno sintase. Portanto, em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para acentuar o acúmulo de um composto selecionado a partir do grupo que consiste em Farnesil-pirofosfato, Isopentenil- pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato e Geranilgeranil-pirofosfato, sendo que o dito método compreende as etapas de:proporcionar a célula definida anteriormente, e cultivar a célula de (a).
[00274]Em uma modalidade, o método da invenção conforme definido anteriormente compreende, ainda, recuperar o composto de Farnesil-pirofosfato, Isopentenil-pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato ou Geranilgeranil- pirofosfato. O composto recuperado pode ser usado em processos adicionais para produzir o composto de produto de terpenóide desejado. O processo adicional pode ocorrer na mesma cultura celular que o processo realizado e definido anteriormente, tal como o acúmulo dos precursores de terpenóide pela célula da presente invenção. Alternativamente, os precursores recuperados podem ser adicionados à outra cultura celular, ou a um sistema isento de células, para produzir os produtos desejados.
[00275]Visto que os precursores são intermediários, entretanto intermediários principalmente estáveis, uma determinada produção endógena de produtos de terpenóide pode ocorrer com base nos substratos de precursor de terpenóide. Da mesma forma, as células da invenção podem ter modificações genéticas adicionais de modo que sejam capazes de realizar tanto um acúmulo de precursores de terpenóide (construção da célula da invenção) como um processo de biossíntese subsequente total ou substancialmente total ao produto de terpenóide desejado.
[00276]Portanto, em uma modalidade, o método da invenção compreende, ainda, recuperar um composto sintetizado através da trajetória de esqualeno, sendo que o dito composto é derivado a partir do dito Farnesil-pirofosfato, Isopentenil- pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato e/ou Geranilgeranil-pirofosfato. Ocasionalmente, pode ser vantajoso incluir um inibidor de esqualeno sintase ao cultivar a célula da presente invenção. A inibição química de esqualeno sintase, por exemplo, por lapaquistato, é conhecida na técnica e se encontra sob investigação, por exemplo, como um a método para reduzir níveis de colesterol na prevenção de doenças cardiovasculares. Sugeriu-se, também, que as variantes nesta enzima podem ser parte de uma associação genética com hipercolesterolemia. Outros inibidores de esqualeno sintase incluem ácido Zaragózico e RPR 107393.
[00277]Portanto, em uma modalidade, a etapa de cultura do(s) método(s) definido(s) anteriormente é realizada na presença de um inibidor de esqualeno sintase.
[00278]Adicionalmente, a célula da invenção pode ser geneticamente modificada para acentuar a produção de determinados precursores de terpenóide principais. Em uma modalidade, a célula é geneticamente modificada para acentuar a atividade e/ou sobre-expressar uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em Fosfomevalonato quinase (EC 2.7.4.2), Difosfomevalonato descarboxilase (EC 4.1.1.33), 4-hidróxi-3-metil but-2-en-1-il difosfato sintase (EC 1.17.7.1), 4-hidróxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductase (EC 1.17.1.2), Isopentenil- difosfato Delta-isomerase 1 (EC 5.3.3.2), Z-isoprenil difosfato sintase de cadeia curta (EC 2.5.1.68), Dimetilaliltransferase (EC 2.5.1.1), Geraniltranstransferase (EC 2.5.1.10) e Geranilgeranil pirofosfato sintetase (EC 2.5.1.29).
[00279]Conforme descrito no presente documento em uma modalidade da invenção, a célula microbiana compreende tanto um ácido nucléico que codifica um esqualeno sintase conforme descrito no presente documento bem como um heterólogo de ácido nucléico que codifica um GGPPS. Essas células microbianas são particularmente úteis para a preparação de GGPP bem como terpenóides, em que GGPP é um intermediário em sua biossíntese.
[00280]De modo correspondente, em um aspecto, a invenção se refere a um método para preparar GGPP, em que o método compreende as etapas de
[00281]Proporcionar uma célula microbiana que compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme definidos anteriormente, em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula; Cultivar a célula microbiana; Recuperar o GGPP.
[00282]Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para preparar um terpenóide do qual GGPP é um intermediário na trajetória de biossíntese, em que o método compreende as etapas de
[00283]Proporcionar uma célula microbiana, em que a dita célula microbiana compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme definidos anteriormente, em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula; Cultivar a célula microbiana; e Recuperar o terpenóide, em que o dito terpenóide pode ser qualquer terpenóide descrito anteriormente na seção “Terpenóides” tendo GGPP como intermediário em sua biossíntese; e a dita célula microbiana pode ser qualquer uma das células microbianas descritas anteriormente na seção “A célula”; e o dito promotor pode ser qualquer promotor, tal como qualquer um dos promotores descritos anteriormente na seção “Promotor”; e a dita sequência de inserção heteróloga pode ser qualquer uma das sequências de inserção heterólogas descritas anteriormente na seção “Sequência de inserção heteróloga”; e o dito quadro de leitura aberta codifica uma esqualeno sintase, que pode ser qualquer uma das esqualeno sintases descritas anteriormente na seção “Esqualeno sintase”; e o dito GGPPS pode ser qualquer um dos GGPPS descritos anteriormente na seção “Geranilgeranil Pirofosfato Sintase”.
[00284]Nesta modalidade, a dita célula microbiana também pode opcionalmente conter um ou mais ácidos nucléicos heterólogos adicionais que codificam uma ou mais enzimas envolvidas na trajetória de biossíntese do dito terpenóide.
[00285]Em um aspecto particular, a invenção se refere a um método para preparar esteviol, sendo que o método compreende as etapas de
[00286]Proporcionar uma célula microbiana, em que a dita célula microbiana compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme definidos anteriormente, em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um a ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula; Cultivar a célula microbiana; Recuperar o esteviol, em que a dita célula microbiana pode ser qualquer uma das células microbianas descritas anteriormente na seção “A célula”; e o dito promotor pode ser qualquer promotor, tal como qualquer um dos promotores descritos anteriormente na seção “Promotor”; e a dita sequência de inserção heteróloga pode ser qualquer uma das sequências de inserção heterólogas descritas anteriormente na seção “Sequência de inserção heteróloga”; e o dito quadro de leitura aberta codifica uma esqualeno sintase, que pode ser qualquer uma das esqualeno sintases descritas anteriormente na seção “Esqualeno sintase”; e o dito GGPPS pode ser qualquer um dos GGPPS descritos anteriormente na seção “Geranilgeranil Pirofosfato Sintase”.
[00287]Nesta modalidade, a dita célula microbiana também pode conter opcionalmente um ou mais ácidos nucléicos heterólogos adicionais que codificam uma ou mais enzimas envolvidas na trajetória de biossíntese de esteviol.
[00288]Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para preparar um terpenóide do qual o GGPP é um intermediário na trajetória de biossíntese, sendo que o método compreende as etapas de
[00289]Proporcionar uma célula microbiana, em que a dita célula microbiana compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme definidos anteriormente, em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica o GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula e em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica HMCR operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de HMCR na dita célula; Cultivar a célula microbiana; Recuperar o terpenóide, em que o dito terpenóide pode ser qualquer terpenóide descrito anteriormente na seção “Terpenóides” tendo o GGPP como intermediário em sua biossíntese; e a dita célula microbiana pode ser qualquer uma das células microbianas descritas anteriormente na seção “A célula”; e o dito promotor pode ser qualquer promotor, tal como qualquer um dos promotores descritos anteriormente na seção “Promotor”; e a dita sequência de inserção heteróloga pode ser qualquer uma das sequências de inserção heterólogas descritas anteriormente na seção “Sequência de inserção de heteróloga”; e o dito quadro de leitura aberta codifica uma esqualeno sintase, que pode ser qualquer uma das esqualeno sintases descritas anteriormente na seção “Esqualeno sintase”; e o dito GGPPS pode ser qualquer um dos GGPPS descritos anteriormente na seção “Geranilgeranil Pirofosfato Sintase”; e o dito HMCR pode ser qualquer um dos HMCR descritos anteriormente na seção “HMCR”.
[00290]Nesta modalidade, a dita célula microbiana também pode opcionalmente conter um ou mais ácidos nucléicos heterólogos adicionais que codificam uma ou mais enzimas envolvidas na trajetória de biossíntese do dito terpenóide.
[00291]Em um aspecto particular, a invenção se refere a um método para preparar esteviol, sendo que o método compreende as etapas de
[00292]Proporcionar uma célula microbiana, em que a dita célula microbiana compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme descritos anteriormente, em que a dita célula microbiana compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica o GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula; Cultivar a célula microbiana; Recuperar o esteviol, em que a dita célula microbiana pode ser qualquer uma das células microbianas descritas anteriormente na seção “A célula”; e o dito promotor pode ser qualquer promotor, tal como qualquer um dos promotores descritos anteriormente na seção “Promotor”; e a dita sequência de inserção heteróloga pode ser qualquer uma das sequências de inserção heterólogas descritas anteriormente na seção “Sequência de inserção heteróloga”; e o dito quadro de leitura aberta codifica uma esqualeno sintase, que pode ser qualquer uma das esqualeno sintases descritas anteriormente na seção “Esqualeno sintase”; e o dito GGPPS pode ser qualquer um dos GGPPS descritos anteriormente na seção “Geranilgeranil Pirofosfato Sintase”e o dito HMCR pode ser qualquer um dos HMCR descritos anteriormente na seção “HMCR”.
[00293]Nesta modalidade, a dita célula microbiana também pode opcionalmente conter um ou mais ácidos nucléicos heterólogos adicionais que codifica uma ou mais enzimas envolvidas na trajetória de biossíntese de esteviol.
[00294]Em uma modalidade, a célula é, ainda, geneticamente modificada para acentuar a atividade e/ou sobre-expressar uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em acetoacetil CoA tiolose, HMG-CoA reductase ou o domínio catalítico destas, HMG-CoA sintase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, fosfomevalonato descarboxilase, isopentenil pirofosfato isomerase, farnesil pirofosfato sintase, D-1-desoxixilulose 5-fosfato sintase, e 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase e farnesil pirofosfato sintase.
[00295]Em uma modalidade do método da presente invenção, a célula compreende uma mutação no quadro de leitura aberta ERG9.
[00296]Em outra modalidade do método da presente invenção, a célula compreende um alelo de exclusão/inserção ERG9[Delta]::HIS3.
[00297]Ainda em outra modalidade, a etapa de recuperar o composto no método da presente invenção compreende, ainda, a purificação do dito composto a partir do meio de cultura celular.
D.Homólogos funcionais
[00298]Os homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos anteriormente também são adequados para uso na produção de esteviol ou glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante. Um homólogo funcional é um polipeptídeo que tem uma similaridade de sequência a um polipeptídeo de referência, e que realiza uma ou mais funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos de ocorrência natural, e a similaridade de sequência pode ocorrer devido a eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tais, os homólogos funcionais são algumas vezes designados na literatura como homólogos, ou ortólogos, ou parólogos. As variantes de um homólogo funcional de ocorrência natural, tais como polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência de codificação tipo selvagem, podem ser homólogos funcionais. Os homólogos funcionais também podem ser criados através de mutagênese sítio-direcionada da sequência de codificação para um polipeptídeo, ou combinando-se domínios das sequências de codificação para diferentes polipeptídeos de ocorrência natural (“troca de domínio”). As técnicas para modificar genes que codificam polipeptídeos UGT funcionais descritos no presente documento são conhecidas e incluem, inter alia, técnicas de evolução direcionada, técnicas de mutagênese sítio-direcionada e técnicas de mutagênese aleatória, e podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, alterar os níveis de expressão, alterar a localização subcelular, ou modificar as interações polipeptídeo:polipeptídeo de maneira desejada. Esses polipeptídeos modificados são considerados homólogos funcionais. Algumas vezes, o termo “homólogo funcional” é aplicado ao ácido nucléico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homólogo.
[00299]Os homólogos funcionais podem ser identificados por análise de alinhamentos de sequência de nucleotídeos e polipeptídeos. Por exemplo, realizar uma consulta em um banco de dados de sequência de nucleotídeos e polipeptídeos pode identificar os homólogos polipeptídeos de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. A análise de sequência pode envolver análise BLAST, BLAST Recíproco, ou PSI-BLAST de banco de dados não-redundantes usando uma sequência de aminoácidos GGPPS, CDPS, KS, KO ou KAH como a sequência de referência. Em alguns casos, a sequência de aminoácidos é deduzida a partir da sequência de nucleotídeo. Estes polipeptídeos no banco de dados tendo mais de 40% de identidade de sequência são candidatos para uma avaliação adicional para adequabilidade como um polipeptídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. A similaridade de sequência de aminoácidos permite substituições de aminoácido conservativas, como uma substituição de um resíduo hidrofóbico por outro ou uma substituição de um resíduo polar por outro. Caso seja desejado, pode-se realizar uma inspeção manual de tais candidatos a fim de estreitar o número de candidatos a serem avaliados. A inspeção manual pode ser realizada selecionando-se aqueles candidatos que aparentam ter domínios presentes em polipeptídeos de biossíntese de esteviol, por exemplo, domínios funcionais conservados.
[00300]As regiões conservadas podem ser identificadas localizando-se uma região dentro da sequência de aminoácidos primária de um polipeptídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol que seja uma sequência repetida, forma alguma estrutura secundária (por exemplo, hélices e beta folhas), estabelece domínios de positiva e negativamente carregados, ou representa um motivo ou domínio de proteína. Vide, por exemplo, o site da web Pfam que descreve sequências consenso para uma variedade de motivos e domínios de proteína na World Wide Web em sanger.ac.uk/Software/Pfam/ e pfam.janelia.org/. As informações incluídas no banco de dados Pfam são descritas em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999). As regiões conservadas também podem ser determinadas alinhando-se as sequências dos mesmos polipeptídeos ou de polipeptídeos relacionados de espécies intimamente relacionadas. De preferência, as espécies intimamente relacionadas são da mesma família. Em algumas modalidades, o alinhamento de sequências de duas espécies diferentes é adequado.
[00301]Tipicamente, os polipeptídeos que exibem pelo menos cerca de 40% de identidade de sequência de aminoácidos são úteis para identificar regiões conservadas. As regiões conservadas de polipeptídeos relacionados exibem pelo menos 45% de identidade de sequência de aminoácidos (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos). Em algumas modalidades, uma região conservada exibe pelo menos 92%, 94%, 96%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos.
[00302]Por exemplo, os polipeptídeos adequados para produzir glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante incluem homólogos funcionais de EUGT11, UGT91D2e, UGT91D2m, UGT85C e UGT76G. Esses homólogos têm mais de 90% (por exemplo, pelo menos 95% ou 99%) de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de EUGT11 (SEQ ID NO: 152), UGT91D2e (SEQ ID NO:5), UGT91D2m (SEQ ID NO:10), UGT85C (SEQ ID NO:3), ou UGT76G (SEQ ID NO:7). As variantes de polipeptídeos EUGT11, UGT91D2, UGT85C, e UGT76G têm, tipicamente, 10 ou menos substituições de aminoácido dentro da sequência de aminoácidos primária, por exemplo, 7 ou menos substituições de aminoácido, 5 ou substituições de aminoácido conservativas, ou entre 1 e 5 substituições. No entanto, em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeos EUGT11, UGT91D2, UGT85C, e UGT76G podem ter 10 ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 10 a 20, 10 a 35, 20 a 30, ou 25 a 35 substituições de aminoácido). As substituições podem ser conservativas, ou, em algumas modalidades, não-conservativas. Exemplos não-limitantes de alterações não- conservativas em polipeptídeos UGT91D2e incluem glicina a arginina e triptofano a arginina. Exemplos não-limitantes de substituições não-conservativas em polipeptídeos UGT76G incluem valina a ácido glutâmico, glicina a ácido glutâmico, glutamina a alanina, e serina a prolina. Exemplos não-limitantes de alterações em polipeptídeos UGT85C incluem histidina a ácido aspártico, prolina a serina, lisina a treonina, e treonina a arginina.
[00303]Em algumas modalidades, um homólogo UGT91D2 útil pode ter substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas) em regiões do polipeptídeo que estejam fora de loops preditos, por exemplo, os resíduos 20-26, 39-43, 88-95, 121-124, 142-158, 185-198, e 203-214 são loops preditos no domínio N-terminal e os resíduos 381-386 são preditos no domínio C-terminal de SEQ ID NO:5. Por exemplo, um homólogo UGT91D2 útil pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido nos resíduos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, ou 387-473 de SEQ ID NO:5. Em algumas modalidades, um homólogo UGT91D2 pode ter uma substituição de aminoácido em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em resíduos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, e 438 de SEQ ID NO:5. Por exemplo, um homólogo funcional UGT91D2 pode ter uma substituição de aminoácido em um ou mais dos resíduos 206, 207, e 343, como uma arginina no resíduo 206, uma cisteína no resíduo 207, e uma arginina no resíduo 343 de SEQ ID NO:5. Vide, SEQ ID NO:95. Outros homólogos funcionais de UGT91D2 podem ter um ou mais dos seguintes: uma tirosina ou fenilalanina no resíduo 30, uma prolina ou glutamina no resíduo 93, uma serina ou valina no resíduo 99, uma tirosina ou uma fenilalanina no resíduo 122, uma histidina ou tirosina no resíduo 140, uma serina ou cisteína no resíduo 142, uma alanina ou treonina no resíduo 148, uma metionina no resíduo 152, uma alanina no resíduo 153, uma alanina ou serina no resíduo 156, uma glicina no resíduo 162, uma leucina ou metionina no resíduo 195, um ácido glutâmico no resíduo 196, uma lisina ou ácido glutâmico no resíduo 199, uma leucina ou metionina no resíduo 211, uma leucina no resíduo 213, uma serina ou fenilalanina no resíduo 221, uma valina ou isoleucina no resíduo 253, uma valina ou alanina no resíduo 286, uma lisina ou asparagina no resíduo 427, uma alanina no resíduo 438, e uma alanina ou treonina no resíduo 462 de SEQ ID NO:5. Em outra modalidade, um homólogo funcional UGT91D2 contém uma metionina no resíduo 211 e uma alanina no resíduo 286.
[00304]Em algumas modalidades, um homólogo UGT85C útil pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, e 471 de SEQ ID NO:3. Exemplos não-limitantes de homólogos UGT85C úteis incluem polipeptídeos tendo substituições (em relação a SEQ ID NO:3) no resíduo 65 (por exemplo, uma serina no resíduo 65), no resíduo 65 em combinação com o resíduo 15 (uma leucina no resíduo 15), 270 (por exemplo, uma metionina, arginina, ou alanina no resíduo 270), 418 (por exemplo, uma valina no resíduo 418), 440 (por exemplo, um ácido aspártico no resíduo no resíduo 440), ou 441 (por exemplo, uma asparagina no resíduo 441); resíduos 13 (por exemplo, uma fenilalanina no resíduo 13), 15, 60 (por exemplo, um ácido aspártico no resíduo 60), 270, 289 (por exemplo, uma histidina no resíduo 289), e 418; substituições nos resíduos 13, 60, e 270; substituições nos resíduos 60 e 87 (por exemplo, uma fenilalanina no resíduo 87); substituições nos resíduos 65, 71 (por exemplo, uma glutamina no resíduo 71), 220 (por exemplo, uma treonina no resíduo 220), 243 (por exemplo, um triptofano no resíduo 243), e 270; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 243, 270, e 441; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 389 (por exemplo, uma valina no resíduo 389), e 394 (por exemplo, uma valina no resíduo 394); substituições nos resíduos 65, 71, 270, e 289; substituições nos resíduos 220, 243, 270, e 334 (por exemplo, uma serina no resíduo 334); ou substituições nos resíduos 270 e 289. As mutações de aminoácido a seguir não resultaram em uma perda de atividade nos polipeptídeos 85C2: V13F, F15L, H60D, A65S, E71Q, I87F, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, L334S, A389V, I394V, P397S, E418V, G440D, e H441N. Mutações adicionais que foram observadas em clones ativos incluem K9E, K10R, Q21H, M27V, L91P, Y298C, K350T, H368R, G420R, L431P, R444G, e M471T. Em algumas modalidades, um UGT85C2 contém substituições nas posições 65 (por exemplo, uma serina), 71 (uma glutamina), 270 (uma metionina), 289 (uma histidina), e 389 (uma valina).
[00305]A sequência de aminoácidos de UGTs 74G1,76G1 e 91D2e de Stevia rebaudiana com fusões em quadro N-terminais dos primeiros 158 aminoácidos de proteína MDM2 humana, e UGT85C2 de Stevia rebaudiana com uma fusão em quadro N-terminal de 4 repetições do peptídeo PMI sintético (4 X TSFAEYWNLLSP, SEQ ID NO:86) são apresentados em SEQ ID NOs: 90,88,94, e 92, respectivamente; vide SEQ ID NOs: 89, 92, 93, e 95 para as sequências de nucleotídeo que codificam as proteínas de fusão.
[00306]Em algumas modalidades, um homólogo UGT76G útil pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346 de SEQ ID NO:7. Exemplos não-limitantes de homólogos UGT76G úteis incluem polipeptídeos tendo substituições (em relação a SEQ ID NO:7) nos resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, e 291; resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, e 291; ou resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346. Vide a Tabela 9. Tabela 9
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[00307]Os métodos para modificar a especificidade de substrato, por exemplo, de EUGT11 ou UGT91D2e, são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, e incluem sem limitação abordagens de mutagênese sítio- direcionada/racional, abordagens de evolução direcionada aleatória e combinações em que as técnicas de mutagênese/saturação aleatória são realizadas próximas ao sítio ativo da enzima. Por exemplo, vide Sarah A. Osmani, et al.Phytochemistry 70 (2009) 325-347.
[00308]Tipicamente, uma sequência candidata tem um comprimento que tenha de 80 por cento a 200 por cento do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 por cento do comprimento da sequência de referência. Tipicamente, um polipeptídeo homólogo funcional tem um comprimento que tenha de 95 por cento a 105 por cento do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, ou 120 por cento do comprimento da sequência de referência, ou qualquer fixa entre. Uma identidade percentual para qualquer ácido nucléico candidato ou polipeptídeo em relação a um ácido nucléico ou polipeptídeo de referência pode ser determinada da seguinte forma. Uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de ácido nucléico ou uma sequência de aminoácidos) é alinhada a uma ou mais sequências candidatas usando o programa computacional ClustalW (versão 1.83, parâmetros padrão), que permite que alinhamentos de sequências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos sejam realizados ao longo de todo seu comprimento (alinhamento global). Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003).
[00309]ClustalW calcula a melhor correspondência entre uma sequência de referência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinha de modo que as identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. Podem-se inserir lacunas de um ou mais resíduos em uma sequência de referência, uma sequência candidata, ou ambas, para maximizar os alinhamentos de sequência. Para um alinhamento rápido em pares de sequências de ácidos nucléicos, utilizam-se os parâmetros padrão a seguir: tamanho de fonte: 2; tamanho de janela: 4; método pontuação: porcentagem; número de diagonais superiores: 4; e penalidade de lacuna: 5. Para múltiplos alinhamentos de sequências de ácidos nucléicos, utilizam-se os parâmetros a seguir: penalidade de abertura de lacuna: 10.0; penalidade de extensão de lacuna: 5.0; e transições de peso: sim. Para um alinhamento rápido em pares de sequências protéicas, utilizam-se os parâmetros a seguir: tamanho de fonte: 1; tamanho de janela: 5; método de pontuação: porcentagem; número de diagonais superiores: 5; penalidade de lacuna: 3. Para múltiplos alinhamentos de sequências protéicas, utilizam-se os parâmetros a seguir: matriz de peso: blosum; penalidade de abertura de lacuna: 10.0; penalidade de extensão de lacuna: 0.05; lacunas hidrofílicas: sim; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, e Lys; penalidades de lacuna específicas a resíduo: sim. A saída de ClustalW é um alinhamento de sequência que reflete a relação entre as sequências. ClustalW pode ser executado, por exemplo, no site da Baylor College of Medicine Search Launcher na World Wide Web (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) e no site do European Bioinformatics Institute na World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).
[00310]Para determinar a identidade percentual de uma sequência de ácido nucléico ou aminoácido candidato a uma sequência de referência, as sequências são alinhadas usando ClustalW, o número de correspondências idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência, e o resultado é multiplicado por 100. Nota-se que o valor de identidade percentual pode ser arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 são arredondados para 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e 78,19 são arredondados para 78,2.
[00311]Avaliar-se-á que os UGTs funcionais podem incluir aminoácidos adicionais que não são envolvidos na glicosilação ou outras atividades enzimáticas realizadas pela enzima, portanto, tal polipeptídeo pode ser mais longo do que seria o caso. Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 pode incluir um tag de purificação (por exemplo, tag HIS ou tag GST), um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo de sinal, ou um tag de secreção adicionados à terminação amino ou carbóxi. Em algumas modalidades, um polipeptídeo EUGT11 inclui uma sequência de aminoácidos que funciona como um repórter, por exemplo, uma proteína verde fluorescente ou uma proteína amarelo fluorescente.
II. Ácidos Nucléicos de Biossíntese de Esteviol e Esteviol Glicosídeo
[00312]Um gene recombinante que codifica um polipeptídeo descrito no presente documento compreende a sequência de codificação para tal polipeptídeo, operacionalmente ligado em orientação de captação a uma ou mais regiões regulatórias adequadas para expressar o polipeptídeo. Devido ao fato de muitos microrganismos serem capazes de expressar múltiplos produtos de gene a partir de um mRNA policistrônico, múltiplos polipeptídeos podem ser expressos sob o controle de uma única região regulatória para aqueles microrganismos, caso seja desejado. Uma sequência de codificação e uma região regulatória são consideradas como sendo operacionalmente ligadas quando a região regulatória e a sequência de codificação estão posicionadas de modo que a região regulatória seja eficaz para regular a transcrição ou a translação da sequência. Tipicamente, o sítio de iniciação de translação do quatro de leitura translacional da sequência de codificação é posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região regulatória para um gene monocistrônico.
[00313]Em muitos casos, a sequência de codificação para um polipeptídeo descrito no presente documento é identificada em uma espécie diferente do hospedeiro recombinante, isto é, é um ácido nucléico heterólogo. Portanto, se o hospedeiro recombinante for um microrganismo, a sequência de codificação pode ser proveniente de outros microrganismos procarióticos ou eucarióticos, provenientes de plantas ou de animais. Em alguns casos, no entanto, a sequência de codificação é uma sequência que seja nativa ao hospedeiro e esteja sendo reintroduzida em tal organismo. Uma sequência nativa pode geralmente ser distinguida da sequência de ocorrência natural pela presença de sequências não-naturais ligadas ao ácido nucléico exógeno, por exemplo, sequências regulatórias não-nativas flanqueando uma sequência nativa em uma construção de ácido nucléico recombinante. Além disso, ácidos nucléicos exógenos estavelmente transformados são tipicamente integrados em posições diferentes da posição onde a sequência nativa é encontrada.
[00314]“Região regulatória” se refere a um ácido nucléico tendo sequências de nucleotídeo que influenciam na iniciação de taxa de transcrição ou translação, e estabilidade e/ou mobilidade de um produto de transcrição ou translação. As regiões regulatórias incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências acentuadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências de ligação de proteína, regiões não-transladadas 5' e 3' (UTRs), sítios de partida transcricional, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, intrões, e combinações destes. Tipicamente, uma região regulatória compreende pelo menos um promotor de núcleo (basal). Uma região regulatória também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência acentuadora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Uma região regulatória é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação posicionando-se a região regulatória e a sequência de codificação de modo que a região regulatória seja efetiva para regular a transcrição ou a translação da sequência. Por exemplo, para ligar operacionalmente uma sequência de codificação e uma sequência promotora, o sítio de iniciação de translação do quadro de leitura translacional da sequência de codificação é tipicamente posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante do promotor. Uma região regulatória pode, no entanto, ser posicionada até cerca de 5.000 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação de translação, ou cerca de 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de partida de transcrição.
[00315]A escolha das regiões regulatórias a serem incluídas depende de vários fatores, que incluem, mas não se limitam a, eficiência, capacidade de seleção, capacidade de indução, nível de expressão desejado, e expressão preferencial durante determinados estágios de cultura. É uma questão rotineira a um indivíduo versado na técnica modular a expressão de uma sequência de codificação selecionando-se e posicionando-se apropriadamente as regiões regulatórias em relação à sequência de codificação. Compreender-se-á que mais de uma região regulatória pode estar presente, por exemplo, intrões, acentuadores, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição, e elementos induzíveis.
[00316]Um ou mais genes podem ser combinados em uma construção de ácido nucléico recombinante em “módulos” úteis para um aspecto discreto da produção de esteviol e/ou glicosídeo de esteviol. Combinar uma pluralidade de genes em um módulo, particularmente um módulo policistrônico, facilita o uso do módulo em uma variedade de espécies. Por exemplo, um cluster de gene de biossíntese de esteviol, ou um cluster de gene UGT, podem ser combinados em um módulo policistrônico de modo que, após a inserção de uma região regulatória adequada, o módulo possa ser introduzido em uma ampla variedade de espécies. Como outro exemplo, um cluster de gene UGT pode ser combinado de modo que cada sequência de codificação UGT seja operacionalmente ligada a uma região regulatória separada, para formar um módulo UGT. Esse módulo pode ser usado nessas espécies para as quais uma expressão monocistrônica é necessária ou desejável. Além dos genes úteis para produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, uma construção recombinante também contém, tipicamente, uma origem de replicação, e um ou mais marcadores selecionáveis para manutenção da construção em espécies apropriadas.
[00317]Avaliar-se-á que por causa da degeneração do código genético, uma série de ácidos nucléicos pode codificar um polipeptídeo particular; isto é, para muitos aminoácidos, existe mais de um tripleto de nucleotídeo que serve como o códon para o aminoácido. Portanto, os códons na sequência de codificação para um dado polipeptídeo podem ser modificados de modo que a expressão ótima em um hospedeiro particular seja obtida, usando tabelas de viés de códon apropriadas para tal hospedeiro (por exemplo, microrganismo). SEQ ID NOs:18-25, 34-36, 40-43, 4849, 52-55, 60-64, 70-72, e 154 apresentam sequências de nucleotídeo que codificam determinadas enzimas para biossíntese de esteviol e glicosídeo de esteviol, modificadas para uma expressão em levedura aumentada. Assim como os ácidos nucléicos isolados, essas sequências modificadas estão presentes como moléculas purificadas e podem ser incorporadas em um vetor ou em um vírus para uso na construção de módulos para construções de ácido nucléico recombinante.
[00318]Em alguns casos, é desejável inibir uma ou mais funções de um polipeptídeo endógeno a fim de desviar intermediários metabólicos em direção à biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. Por exemplo, pode ser desejável regular descendentemente a síntese de esteróis em uma cepa de levedura a fim de aumentar adicionalmente a produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, por exemplo, regulando-se descendentemente esqualeno epoxidase. Como outro exemplo, pode ser desejável inibir as funções degradativas de determinados produtos de gene endógeno, por exemplo, glicoidrolases que removem as porções de glicose dos metabólitos secundários ou fosfatases conforme discutido no presente documento. Como outro exemplo, a expressão de transportadores de membrana envolvida no transporte de glicosídeos de esteviol pode ser inibida, de modo que secreção de esteviosídeos glicosiladas seja inibida. Essa regulação pode ser benéfica pelo fato de que a secreção de glicosídeos de esteviol pode ser inibida durante um período de tempo desejado durante a cultura do microrganismo, aumentando, assim, o rendimento de produto(s) de glicosídeo em colheita. Nesses casos, um ácido nucléico que inibe a expressão do produto de polipeptídeo ou gene pode ser incluído em uma construção recombinante que é transformada na cepa. Alternativamente, a mutagênese pode ser usada para gerar mutantes em genes aos quais se deseja inibir a função.
III .Hospedeiros Microrganismos
[00319]Uma série de procariontes e eucariontes é adequada para uso na construção de microrganismos recombinantes descritos no presente documento, por exemplo, bactérias gram-negativas, leveduras e fungos. Uma espécie e cepa selecionada para uso como uma cepa de produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol é primeiramente analisada para determinar quais genes de produção são endógenos e quais genes não estão presentes. Os genes aos quais uma contraparte endógena não está presente na cepa são reunidos em uma ou mais construções recombinantes, que são, então, transformadas na cepa a fim de fornecer as funções faltantes.
[00320]Descrevem-se espécies procarióticas e eucarióticas exemplificadoras em maiores detalhes abaixo. No entanto, avaliar-se-á que outras espécies podem ser adequadas. Por exemplo, as espécies adequadas podem estar em um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium, Escherichia, Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomycesand Yarrowia. As espécies exemplificadoras de tais gêneros incluem Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis 32, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma UBV- AX, Xanthophyllomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi, Candida utilis e Yarrowia lipolytica. Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um Ascomiceto, como Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillusniger, ou Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um procarionte, como Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, ou Rhodobacter capsulatus. Avaliar-se-á que determinados microrganismos podem ser usados para triar e testar genes de interesse em um modo de alto rendimento, enquanto outros microrganismos com características desejadas de produtividade ou crescimento podem ser usados para produção em larga escala de glicosídeos de esteviol.
Saccharomyces cerevisiae
[00321]Saccharomyces cerevisiae é um organismo chassi amplamente usado na biologia sintética, e pode ser usado como uma plataforma de microrganismo recombinante. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos computacionais detalhados de metabolismo e outras informações disponíveis para S. cerevisiae, permitindo um design racional de vários módulos para acentuar o rendimento de produção. Conhecem-se métodos para produzir microrganismos recombinantes.
[00322]Um cluster de gene de biossíntese de esteviol pode ser expressado em levedura usando qualquer um entre uma série de promotores conhecidos. As cepas que produzem excessivamente terpenos são conhecidas e podem ser usadas para aumentar a quantidade de geranilgeranil difosfato disponível para produção de esteviol e glicosídeo de esteviol.
Aspergillus spp.
[00323]As espécies Aspergillus, como A. oryzae, A. niger e A. sojae são microrganismos amplamente usados na produção de alimentos, e também podem ser usados como a plataforma de microrganismo recombinante. As sequências de nucleotídeo estão disponíveis para genomas de A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A. flavus, A. niger, e A. terreus, permitindo um design racional e uma modificação de trajetórias endógenas para acentuar o fluxo e aumentar o rendimento de produção. Desenvolveram-se modelos metabólicos para Aspergillus, bem como estudos transcriptômicos e estudos proteômicos. A. niger é culturado para a produção industrial de uma série de ingredientes alimentícios, como ácido cítrico e ácido glicônico, e, portanto, espécies, como A. nigerare geralmente adequadas para a produção de ingredientes alimentícios, como esteviol e glicosídeos de esteviol.
Escherichia coli
[00324]Escherichia coli, outro organismo de plataforma amplamente usado na biologia sintética, também pode ser usado como a plataforma de microrganismo recombinante. Similar a Saccharomyces, existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos computacionais detalhados de metabolismo e outras informações disponíveis para E. coli, permitindo um design racional de vários módulos para acentuar o rendimento de produção. Podem-se usar métodos similares àqueles descritos anteriormente para Saccharomyces para produzir microrganismos E. coli recombinantes.
Agaricus, Gibberella, e Phanerochaete spp.
[00325]Agaricus, Gibberella, e Phanerochaete spp. podem ser úteis porque eles são conhecidos por produzirem grandes quantidades de giberelina em cultura. Portanto, os precursores de terpeno para produzir grandes quantidades de esteviol e glicosídeos de esteviol já são produzidos por genes endógenos. Portanto, os módulos contendo genes recombinantes para polipeptídeos de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol podem ser introduzidos em espécies desses gêneros sem a necessidade de introduzir mevalonato ou genes de trajetória de MEP.
Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)
[00326]Arxula adeninivorans é uma levedura dimórfica (cresce como uma levedura de gemulação como levedura de confeitaria até uma temperatura de 42 °C, acima deste limite, ela cresce em uma forma filamentosa) com características bioquímicas não-usuais. Esta pode crescer em uma ampla faixa de substratos e pode assimilar nitrato. A mesma foi aplicada com sucesso à geração de cepas que podem produzir plásticos naturais ou ao desenvolvimento de um biossensor para estrogênios em amostras ambientais.
Yarrowia lipolytica
[00327]Yarrowia lipolytica é uma levedura dimórfica (vide Arxula adeninivorans) que pode crescer em uma ampla faixa de substratos. Esta tem um alto potencial para aplicações industriais, mas ainda não existem produtos recombinantes comercialmente disponíveis.
Rhodobacter spp.
[00328]Rhodobacter pode ser usado como a plataforma de microrganismo recombinante. Similar a E. coli, existem bibliotecas de mutantes disponíveis, bem como vetores de plasmídeo adequados, permitindo um design racional de vários módulos para acentuar o rendimento de produção. As trajetórias de isoprenóides foi modificada por engenharia genética em espécies bacterianas membranosas de Rhodobacter para uma produção aumentada de carotenóides e CoQ10. Vide as Publicações de Patente U.S. Nos. 20050003474 e 20040078846. Podem-se usar métodos similares àqueles descritos anteriormente para E. coli para produzir microrganismos recombinantes de Rhodobacter.
Candida boidinii
[00329]Candida boidinii é uma levedura metilotrófica (pode crescer em metanol). Assim como outras espécies metilotróficas, como Hansenula polymorpha e Pichia pastoris, esta proporciona uma excelente plataforma par a produção de proteínas heterólogas. Os rendimentos em uma faixa de multigrama de uma proteína estranha secretada foram reportados. Um método computacional, IPRO, previu recentemente mutações que comutaram experimentalmente a especificidade de co- fator de Candida boidinii xilose reductase de NADPH para NADH.
Hansenula polymorpha (Pichia angusta)
[00330]Hansenula polymorpha é outra levedura metilotrófica (vide Candida boidinii). Esta pode crescer em uma ampla faixa de outros substratos; é termo- tolerante e pode assimilar nitrato (vide também Kluyveromyces lactis). A mesma foi aplicada à produção de vacinas contra hepatite B, insulina e interferón alfa-2a para o tratamento d hepatite C, adicionalmente, em uma faixa de enzimas técnicas.
Kluyveromyces lactis
[00331]Kluyveromyces lactis é uma levedura regularmente aplicada à produção de kefir. A mesma pode crescer em vários açúcares, com maior importância, em lactose que está presente no leite e no soro do leite. A mesma foi aplicada com sucesso dentre outras à produção de quimosina (uma enzima que está geralmente presente no estomago de bezerros) para a produção de queijo. A produção ocorre em fermentadores em uma escala de 40.000 L.
Pichia pastoris
[00332]Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica (vide Candida boidinii e Hansenula polymorpha). Esta proporciona uma plataforma eficiente para a produção de proteínas estranhas. Os elementos de plataforma estão disponíveis como um kit é mundialmente usado em instituições de ensino para a produção de proteínas. Modificaram-se por engenharia genética as cepas que podem produzir N-glicano humano complexo (glicanos de levedura são similar, mas não idênticos àqueles encontrados em humanos).
Physcomitrella spp.
[00333]Os musgos Physcomitrella, quando desenvolvidos em cultura de suspensão, têm características similares à levedura ou outras culturas fúngicas. Este gênero está se tornando um tipo importante de célula para produção de metabólitos secundários de plantas, que pode ser difícil de produzir em outros tipos de células.
Células Vegetais ou Plantas
[00334]Em algumas modalidades, os ácidos nucléicos e polipeptídeos descritos no presente documento são introduzidos em plantas ou em células vegetais para aumentar a produção geral de glicosídeo de esteviol ou enriquecer a produção de glicosídeos de esteviol específicos em proporção a outros. Portanto, um hospedeiro pode ser uma planta ou uma célula vegetal que inclui pelo menos um gene recombinante descrito no presente documento. Uma planta ou uma célula vegetal pode ser transformada tendo um gene recombinante integrado em seu genoma, isto é, pode ser estavelmente transformada. As células estavelmente transformadas tipicamente retêm o ácido nucléico introduzido com cada divisão celular. Uma planta ou célula vegetal também pode ser transientemente transformada de modo que o gene recombinante não seja integrado em seu genoma. As células transientemente transformadas tipicamente perdem todo ou alguma porção do ácido nucléico introduzido com cada divisão celular de modo que o nucléico introduzido não possa ser detectado em células-filhas após um número suficiente de divisões celulares. As plantas e células vegetais transgênicas transientemente transformadas e as plantas e células vegetais transgênicas estavelmente transformadas podem ser úteis nos métodos descritos no presente documento.
[00335]As células vegetais transgênicas usadas nos métodos descritos no presente documento podem constituir parte ou toda a planta. Essas plantas podem ser desenvolvidas de maneira adequada para a espécie em consideração, seja em uma câmara de crescimento, em uma estufa, ou em um campo. As plantas transgênicas podem ser geradas conforme desejado para um propósito particular, por exemplo, introduzir um ácido nucléico recombinante em outras linhagens, transferir um ácido nucléico recombinante a outras espécies, ou para uma seleção adicional de outros traços desejáveis. Alternativamente, as plantas transgênicas podem ser propagadas vegetativamente para estas espécies receptivas a tais técnicas. Conforme o uso em questão, uma planta transgênica também se refere à progenitura de uma planta transgênica inicial desde que a progenitura herde o transgene. As sementes produzidas por uma planta transgênica podem ser desenvolvidas e, então, auto-fecundadas (ou cruzada e auto-fecundada) para obter homozigotos de sementes para a construção de ácido nucléico.
[00336]As plantas transgênicas podem ser desenvolvidas em uma cultura de suspensão, ou cultura de tecidos ou órgãos. Para os propósitos desta invenção, podem-se usar técnicas de cultura de tecido sólido e/ou líquido. Ao utilizar um meio sólido, as células vegetais transgênicas podem ser colocadas diretamente sobre o meio ou podem ser colocadas sobre um filtro que é, então, colocado em contato com o meio. Ao utilizar um meio líquido, as células vegetais transgênicas podem ser colocadas sobre um dispositivo de flutuação, por exemplo, uma membrana porosa que fique em contato com o meio líquido.
[00337]Quando as células vegetais transientemente transformadas forem usadas, uma sequência repórter que codifica um polipeptídeo repórter tendo uma atividade repórter pode ser incluída no procedimento de transformação e um ensaio para atividade ou expressão repórter pode ser realizado em um momento adequado após a transformação. Um momento adequado para conduzir o ensaio é tipicamente 1 a 21 dias após a transformação, por exemplo, cerca de 1 a 14 dias, cerca de 1 a 7 dias, ou cerca de 1 a 3 dias. O uso de ensaios transientes é particularmente conveniente para uma análise rápida em espécies diferentes, ou para confirmar a expressão de um polipeptídeo heterólogo cuja expressão não foi previamente confirmada em células receptoras particulares.
[00338]As técnicas para introduzir ácidos nucléicos em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas são conhecidas na técnica, e incluem, sem limitação, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetor viral, eletroporação e transformação por bombardeamento de partículas, nas Patentes U.S. Nos 5.538.880; 5.204.253; 6.329.571; e 6.013.863. Se uma célula ou tecido culturado for usado como o tecido receptor para transformação, as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas transformadas, caso seja desejado, através de técnicas conhecidas por indivíduos versados na técnica.
[00339]Uma população de plantas transgênicas pode ser triada e/ou selecionada para determinação desses membros da população que apresentam um traço ou um fenótipo conferido pela expressão do transgene. Por exemplo, uma população de progenitura de um único evento de transformação pode ser triada para determinação daquelas plantas tendo um nível de expressão desejado de um polipeptídeo ou ácido nucléico de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. Os métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar os níveis de expressão. Estes incluem uma análise Southern ou uma amplificação PCR para detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção S1 RNase, extensão de iniciador, ou amplificação de RT-PCR para detectar as transcrições de RNA; ensaios enzimáticos para detectar a atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese de proteína em gel, Western blots, imunoprecipitação, e imunoensaios ligados a enzimas para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, como hibridização in situ, tingimento de enzima, e imunotingimento também podem ser usadas para detectar a presença ou a expressão de polipeptídeos e/ou ácidos nucléicos. Conhecem-se métodos para realizar todas as técnicas referenciadas. Como uma alternativa, uma população de plantas que compreende eventos de transformação independentes pode ser triada para determinação daquelas plantas tendo um traço desejado, tal como a produção de um glicosídeo de esteviol ou biossíntese modulada de um glicosídeo de esteviol. A seleção e/ou triagem podem ser realizadas por uma ou mais gerações, e/ou em maios de uma localização geográfica. Em alguns casos, as plantas transgênicas podem ser desenvolvidas e selecionadas sob condições que induzam um fenótipo desejado ou sejam, de outro modo, necessárias para produzir um fenótipo desejado em uma planta transgênica. Além disso, a seleção e/ou a triagem podem ser aplicadas durante um estágio desenvolvimento particular no qual se espera que o fenótipo seja exibido pela planta. A seleção e/ou a triagem podem ser realizadas para escolher essas plantas transgênicas tendo uma diferença estatisticamente significante em um nível de glicosídeo de esteviol em relação a uma planta de controle que seja desprovida de transgene.
[00340]Os ácidos nucléicos, genes recombinantes, e construções descritos no presente documento podem ser usados para transformar uma série sistemas de plantas e células vegetais monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos não- limitantes de monocotiledôneas adequadas incluem, por exemplo, colheitas de cereais, como arroz, centeio, sorgo, painço, trigo, maiz e cevada. A planta pode ser uma monocotiledônea diferente de cereal, como aspargo, banana ou cebola. A planta também pode ser uma dicotiledônea, como estévia (Stevia rebaudiana), soja, algodão, girassol, ervilha, gerânio, espinafre ou tabaco. Em alguns casos, a planta pode conter as trajetórias precursoras para produção de fosfato de fenila, como a trajetória de mevalonato, tipicamente encontrada no citoplasma e nas mitocôndrias. A trajetória diferente de mevalonato é encontrada mais frequentemente em plastídeos vegetais [Dubey, et al., 2003 J. Biosci. 28 637-646]. Um indivíduo versado na técnica pode direcionar a expressão de polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol à organela apropriada através do uso de sequências líder, de modo que a biossíntese de glicosídeo de esteviol ocorra na localização desejada da célula vegetal. Um indivíduo versado na técnica utilizará promotores apropriados para direcionar a síntese, por exemplo, às folhas de uma planta, caso seja desejado. A expressão também pode ocorrer em culturas de tecidos, como uma cultura de calo ou uma cultura de raiz cabeluda, caso deseja desejado.
[00341]Em uma modalidade, um ou mais ácidos nucléicos ou polipeptídeos descritos no presente documento são introduzidos em Stevia (por exemplo, Stevia rebaudiana) de modo que a biossíntese geral de glicosídeo de esteviol aumente ou que as composições gerais de glicosídeo de esteviol enriqueçam seletivamente um ou mais glicosídeos de esteviol específicos (por exemplo, rebaudiosídeo D). Por exemplo, um ou mais genes recombinantes podem ser introduzidos em Stevia de modo que uma enzima EUGT11 (por exemplo, SEQ ID NO: 152 ou um homólogo funcional desta) seja expressada sozinha ou em combinação com uma ou mais entre: uma enzima UGT91D, como UGT91D2e (por exemplo, SEQ ID NO:5 ou um homólogo funcional desta), UGT91D2m (por exemplo, SEQ ID NO:10); uma enzima UGT85C, como uma variante descrita na seção “Homólogo Funcional”, uma enzima UGT76G1, como uma variante descrita na seção “Homólogo Funcional”, ou uma enzima UGT74G1. Tipicamente, as construções de ácido nucléico incluem um promotor adequado (por exemplo, promotores 35S, e35S ou ssRUBISCO) operacionalmente ligados a um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo UGT. Os ácidos nucléicos podem ser introduzidos em Stevia por transformação mediada por Agrobacterium; transferência de genes mediada por eletroporação a protoplastos; ou por bombardemento de partículas. Vide, por exemplo, Singh, et al., Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic Sugar, Tuber e Fiber, Editado por Chittaranjan Kole e Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd. (2008), pp. 97-115. Para um bombardeamento de partículas de calo derivado da folha de estévia, os parâmetros podem ser os seguintes: 6 cm de distância, 1100 psi de pressão de He, partículas de ouro, e um bombardeamento.
[00342]As plantas de estévia podem ser regeneradas por embriogênese somática conforme descrito por Singh et al., 2008, supra. Em particular, os segmentos de folha (aproximadamente 1 a 2 cm de comprimento) podem ser removidos de plantas crescidas in vitro com 5 a 6 semanas de idade e incubadas (lado adaxial para baixo) em um meio MS suplementado com vitaminas B5, 30 g de sacarose e 3 g de Gelrita. Pode-se usar ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D) em combinação com 6- benzil adenina (BA), quinetina (KN), ou zeatina. As massas proembriogênicas aparecem após 8 semanas de subcultura. Dentro de 2 a 3 semanas de subculturas, os embriões somáticos aparecerão sobre a superfície de culturas. Os embriões podem ser amadurecidos em um meio contendo BA em combinação com ácido 2,4-D, a- naftalenoacético (NAA), ou ácido indolbutírico (IBA). Os embriões somáticos maduros que germinam e formam plântulas podem ser excisados dos calos. Após as plântulas alcançarem 3 a 4 semanas, as plântulas podem ser transferidas para vasos com vermiculita e desenvolvidas durante 6 a 8 semanas em câmaras de crescimento para aclimatização e transferidas para estufas.
[00343]Em uma modalidade, os glicosídeos de esteviol são produzidos no arroz. Arroz e maiz são prontamente transformáveis usando técnicas, como transformação mediada por Agrobacterium. Comumente, utilizam-se sistemas de vetor binário para introdução de gene exógeno de Agrobacterium em monocotiledôneas. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.215.051 e 6.329.571. Em um sistema de vetor binário, um vetor contém a região de T-DNA, que inclui um gene de interesse (por exemplo, um UGT descrito no presente documento) e o outro vetor é um plasmídeo Ti desarmado contendo a região vir. Os vetores co-integrados e os vetores mobilizáveis também podem ser usados. Os tipos e o pré-tratamento de tecidos a serem transformados, a cepa de Agrobacterium usada, a duração da inoculação, a prevenção de crescimento exagerado e necrose pela Agrobacterium, podem ser prontamente ajustados por um indivíduo versado na técnica. As células embrionárias imaturas de arroz podem ser preparadas para transformação com Agrobacterium usando vetores binários. O meio de cultura usado é suplementado com compostos fenólicos. Alternativamente, a transformação pode ser realizada in plant usando infiltração a vácuo. Vide, por exemplo, WO 2000037663, WO 2000063400, e WO 2001012828.
IV .Métodos de Produção de Glicosídeos de Esteviol
[00344]Os hospedeiros recombinantes descritos no presente documento podem ser usados nos métodos para produzir esteviol ou glicosídeos de esteviol. Por exemplo, se o hospedeiro recombinante for um microrganismo, o método pode incluir desenvolver o microrganismo recombinante em um meio de cultura sob condições nas quais os genes de biossíntese de esteviol e/ou glicosídeo de esteviol são expressos. O microrganismo recombinante pode ser desenvolvido em um processo descontínuo de alimentação ou em um processo contínuo. Tipicamente, o microrganismo recombinante é desenvolvido em um fermentador a uma temperatura definida durante um período de tempo desejado. Dependendo do microrganismo particular usado no método, outros genes recombinantes, como genes de biossíntese de isopentenil e genes de terpeno sintase e ciclase também podem estar presentes e expressados. Os níveis de substratos e intermediários, por exemplo, isopentenil difosfato, dimetilallil difosfato, geranilgeranil difosfato, caureno e ácido caurenóico, podem ser determinados extraindo-se amostras do meio de cultura para análise de acordo com os métodos publicados.
[00345]Após o microrganismo recombinante ter sido desenvolvido em cultura durante o período de tempo desejado, esteviol e/ou um ou mais glicosídeos de esteviol podem, então, ser recuperados a partir da cultura usando várias técnicas conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, um agente permeabilizante pode ser adicionado para auxiliar a matéria-prima a entrar no hospedeiro e o produto a sair. Se o hospedeiro recombinante for uma planta ou células vegetais, o esteviol ou glicosídeos de esteviol podem ser extraídos do tecido vegetal usando várias técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, um lisato bruto do microrganismo culturado ou tecido vegetal pode ser centrifugado para obter um sobrenadante. O sobrenadante resultante pode, então, ser aplicado a uma coluna de cromatografia, por exemplo, uma coluna C-18, e lavado com água para remover os compostos hidrofílicos, seguido pela eluição do(s) composto(s) de interesse com um solvente, como metanol. O(s) composto(s) pode(m), então, ser adicionalmente purificados por HPLC preparativa. Vide também o documento WO 2009/140394.
[00346]A quantidade de glicosídeo de esteviol (por exemplo, rebaudiosídeo D) produzida pode ser de cerca de 1 mg/L a cerca de 1500 mg/L, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 mg/L, de cerca de 3 a cerca de 10 mg/L, de cerca de 5 a cerca de 20 mg/L, de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L, de cerca de 10 a cerca de 100 mg/L, de cerca de 25 a cerca de 500 mg/L, de cerca de 100 a cerca de 1,500 mg/L, ou de cerca de 200 a cerca de 1,000 mg/L. Em geral, tempos de cultura mais longos levarão a quantidades maiores de produto. Portanto, o microrganismo recombinante pode ser culturado durante 1 a 7 dias, de 1 dia a 5 dias, de 3 dias a 5 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, ou cerca de 5 dias.
[00347]Avaliar-se-á que os vários genes e módulos discutidos no presente documento podem estar presentes em dois ou mais microrganismos recombinantes ao invés de um único microrganismo. Quando uma pluralidade de microrganismos recombinantes for usada, estes podem ser desenvolvidos em uma cultura misturada para produzir esteviol e/ou glicosídeos de esteviol. Por exemplo, um primeiro microrganismo pode compreender um ou mais genes de biossíntese para produzir esteviol enquanto um segundo microrganismo compreende genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol. Alternativamente, os dois ou mais microrganismos podem ser desenvolvidos em um meio de cultura separado e o produto do primeiro meio de cultura, por exemplo, esteviol, pode ser introduzido no segundo meio de cultura a ser convertido em um intermediário subsequente, ou em um produto final, como rebaudiosídeo A. O produto produzido pelo segundo microrganismo ou microrganismo final é, então, recuperado. Avaliar-se-á, também, que em algumas modalidades, um microrganismo recombinante é desenvolvido utilizando-se fontes de nutrientes ao invés de um meio de cultura e utilizando-se um sistema diferente de um fermentador.
[00348]Os glicosídeos de esteviol não têm necessariamente um desempenho equivalente em diferentes sistemas alimentícios. Portanto, é desejável que tenham a capacidade de direcionar a síntese a composições de glicosídeo de esteviol de escolha. Os hospedeiros recombinantes descritos no presente documento podem produzir composições que sejam seletivamente enriquecidas para glicosídeos de esteviol específicos (por exemplo, rebaudiosídeo D) e tenham um perfil de sabor consistente. Portanto, os microrganismos recombinantes, plantas, e células vegetais descritos no presente documento podem facilitar a produção de composições que sejam adaptadas para satisfazer o perfil adoçante desejado para um determinado produto alimentício e que tenha uma proporção de cada glicosídeo de esteviol que seja consistente de lote para lote. Os microrganismos descritos no presente documento não produzem subprodutos vegetais indesejados encontrados em Extratos de estévia. Portanto, as composições de glicosídeo de esteviol produzidas pelos microrganismos recombinantes descritos no presente documento são distinguíveis das composições derivadas a partir de plantas de Estévia.
V .Produtos Alimentícios
[00349]Os glicosídeos de esteviol obtidos pelos métodos descritos no presente documento podem ser usados para produzir produtos alimentícios, suplementos alimentares e composições adoçantes. Por exemplo, esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puros, como rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo D podem ser incluídos em produtos alimentícios, tais como sorvete, bebidas carbonatada, sucos de frutas, iogurtes, produtos de panificação, gomas de mascar, balas duras e macias, e molhos. Esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puros também podem ser incluídos em produtos não-alimentícios, tais como produtos farmacêuticos, produtos medicinais, suplementos alimentares e suplementos nutricionais. Esteviol ou glicosídeos de esteviol substancialmente puros também podem ser incluídos em rações animais tanto para a indústria agrícola como para a indústria de animais de estimação. Alternativamente, uma mistura de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol pode ser feita culturando-se microrganismos recombinantes separadamente ou desenvolvendo-se diferentes plantas/células vegetais, cada uma produzindo um esteviol ou glicosídeo de esteviol específico, recuperando-se o esteviol ou glicosídeo de esteviol sob uma forma substancialmente pura a partir de cada microrganismo ou planta/células vegetais e, então, combinando- se os compostos para obter uma mistura contendo cada composto na proporção desejada. Os microrganismos recombinantes, plantas, e células vegetais descritos no presente documento permitem que misturas mais precisas e consistentes sejam obtidas comparadas a produtos de Estévia atuais. Em outra alternativa, um esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro pode ser incorporado em um produto alimentício junto a outros adoçantes, por exemplo, sacarina, dextrose, sacarose, frutose, eritritol, aspartame, sucralose, monatina, ou acesulfama de potássio. A razão de peso de esteviol ou glicosídeo de esteviol em relação a outros adoçantes pode ser variada conforme desejado para alcançar um sabor satisfatório no produto alimentício final. Vide, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 2007/0128311. Em algumas modalidades, o esteviol ou glicosídeo de esteviol podem ser dotados de um sabor (por exemplo, cítrico) como um modulador de sabor. Por exemplo, Rebaudiosídeo C pode ser usada como um acentuador de doçura ou como um modulador de doçura, em particular, para adoçantes à base de carboidratos, de modo que a quantidade de açúcar possa ser reduzida no produto alimentício.
[00350]As composições produzidas por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal descritos no presente documento podem ser incorporadas em produtos alimentícios. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto alimentício em uma quantidade variando de cerca de 20 mg glicosídeo de esteviol/kg de produto alimentício a cerca de 1800 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto alimentício em uma base de peso seco, dependendo do tipo de glicosídeo de esteviol e produto alimentício. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em uma sobremesa, doce gelado (por exemplo, sorvete), laticínio (por exemplo, iogurte), ou bebida (por exemplo, uma bebida carbonatada) de modo que o produto alimentício tenha um máximo de 500 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto de confeitaria (por exemplo, um biscoito) de modo que o produto alimentício tenha um máximo de 300 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um molho (por exemplo, calda de chocolate) ou produto vegetal (por exemplo, picles) de modo que o produto alimentício tenha um máximo de 1000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um pão de modo que o produto alimentício tenha um máximo de 160 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada e uma bala dura ou macia de modo que o produto alimentício tenha um máximo de 1600 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto à base de fruta processada (por exemplo, sucos de frutas, recheio de frutas, compotas, geleias) de modo que o produto alimentício tenha um máximo de 1000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco.
[00351]Por exemplo, essa composição de glicosídeo de esteviol pode ter de 90 a 99% de rebaudiosídeo A e uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia, e ser incorporada em um produto alimentício de 25 a 1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 250 a 1000 mg/kg, 50 a 500 mg/kg ou 500 a 1000 mg/kg em uma base de peso seco.
[00352]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo B tendo mais de 3% de rebaudiosídeo B e incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de rebaudiosídeo B no produto seja de 25 a 1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 250 a 1000 mg/kg, 50 a 500 mg/kg ou 500 a 1000 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo B tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00353]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo C tendo mais de 15% de rebaudiosídeo C e incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de rebaudiosídeo C no produto seja de 20 a 600 mg/kg, por exemplo, 100 a 600 mg/kg, 20 a 100 mg/kg, 20 a 95 mg/kg, 20 a 250 mg/kg, 50 a 75 mg/kg ou 50 a 95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo C tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00354]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D tendo mais de 3% de rebaudiosídeo D e incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de rebaudiosídeo D no produto seja de 25 a 1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 250 a 1000 mg/kg, 50 a 500 mg/kg ou 500 a 1000 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo D tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00355]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo E tendo mais de 3% de rebaudiosídeo E e incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de rebaudiosídeo E no produto seja de 25 a 1600 mg/kg, por exemplo, 100 a 500 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 250 a 1000 mg/kg, 50 a 500 mg/kg ou 500 a 1000 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo E tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00356]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo F tendo mais de 4% de rebaudiosídeo F e incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de rebaudiosídeo F no produto seja de 25 a 1000 mg/kg, por exemplo, 100 a 600 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 25 a 95 mg/kg, 50 a 75 mg/kg ou 50 a 95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo F tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00357]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com dulcosídeo A tendo mais de 4% dulcosídeo A e incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de dulcosídeo A no produto seja de 25 a 1000 mg/kg, por exemplo, 100 a 600 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 25 a 95 mg/kg, 50 a 75 mg/kg ou 50 a 95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com dulcosídeo A tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00358]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida para rubusosídeo xilosilada em uma das duas posições -- 13-O-glicose ou 19-O-glicose. Essa composição pode ter mais de 4% do composto de rubusosídeo xilosilada, e pode ser incorporada no produto alimentício de modo que a quantidade de composto de rubusosídeo xilosilada no produto seja de 25 a 1000 mg/kg, por exemplo, 100 a 600 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 25 a 95 mg/kg, 50 a 75 mg/kg ou 50 a 95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, o composto enriquecido com rubusosídeo xilosilada tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00359]Essa composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida para compostos ramnosilados em uma das duas posições -- 13-O-glicose ou 19-O-glicose, ou compostos contendo uma ramnose e múltiplas glicoses (por exemplo, esteviol 13-O-1,3-diglicosídeo-1,2-ramnosídeo). Essa composição pode ter mais de 4% do composto ramnosilado, e pode ser incorporado no produto alimentício de modo que a quantidade de composto ramnosilado no produto seja de 25 a 1000 mg/kg, por exemplo, 100 a 600 mg/kg, 25 a 100 mg/kg, 25 a 95 mg/kg, 50 a 75 mg/kg ou 50 a 95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida para compostos ramnosilados tem uma quantidade indetectável de contaminantes derivados da planta de estévia.
[00360]Em algumas modalidades, um esteviol ou um glicosídeo de esteviol substancialmente puro é incorporado em um adoçante de mesa ou produto ”xícara- para-xícara”. Tipicamente, esses produtos são diluídos ao nível de doçura apropriado com um ou mais agentes avolumadores, por exemplo, maltodextrinas, conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. As composições de esteviol glicosídeo enriquecidas para rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, ou compostos ramnosilados ou xilosilados, podem ser embaladas em um sachê, por exemplo, de 10.000 a 30.000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto em uma base de peso seco, para uso de mesa.
[00361]Em algumas modalidades, esta revelação se refere aos itens a seguir:
[00362]Célula de hospedeiro recombinante que compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta, em que a sequência de inserção heteróloga tem a fórmula geral (I): -X1-X2-X3-X4-X5- em que X2 compreende pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos complementares a pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos de X4, em que X3 compreende zero nucleotídeos, ou um ou mais nucleotídeos que formam um hairpin loop, em que X1 e X5 consistem individualmente em zero nucleotídeos, ou um ou mais nucleotídeos, em que o quadro de leitura aberta codifica uma esqualeno sintase (EC 2.5.1.21).
[00363]Célula recombinante, de acordo com o item 1, sendo que o dito ácido nucléico compreende na ordem 5’ a 3’, uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta, em que a sequência de inserção heteróloga e o quadro de leitura aberta são conforme definidos no item 1.
[00364]Célula, que compreende uma sequência de ácido nucléico, sendo que o dito ácido nucléico compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência de inserção heteróloga operacionalmente ligada a um quadro de leitura aberta operacionalmente ligado a um sinal de terminação de transcrição, em que a sequência de inserção heteróloga tem a fórmula geral (I): -X1-X2-X3-X4-X5- em que X2 compreende pelo menos 4 ácidos nucléicos consecutivos sendo complementares, e forma um elemento de estrutura secundária tipo hairpin com pelo menos 4 ácidos nucléicos consecutivos de X4, e em que X3 compreende ácidos nucléicos não-pareados, formando, assim, um hairpin loop entre X2 e X4, e em que X1 e X5 compreendem, individual e opcionalmente, um ou mais ácidos nucléicos, e em que o quadro de leitura aberta mediante a expressão codifica uma sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade a uma esqualeno sintase (EC 2.5.1.21) ou um fragmento biologicamente ativo desta, sendo que o dito fragmento tem pelo menos 70% de identidade de sequência à dita esqualeno sintase em uma faixa de sobreposição de pelo menos 100 aminoácidos.
[00365]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, em que a sequência de inserção heteróloga compreende de 10 a 50 nucleotídeos, de preferência, de 10 a 30 nucleotídeos, com mais preferência, de 15 a 25 nucleotídeos, com mais preferência, de 17 a 22 nucleotídeos, com mais preferência, de 18 a 21 nucleotídeos, com mais preferência, de 18 a 20 nucleotídeos, com mais preferência, 19 nucleotídeos.
[00366]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, em que X2 e X4 consistem no mesmo número de nucleotídeos.
[00367]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, em que todos os X2 consistem na faixa de 4 a 25, tal como na faixa de 4 a 20, por exemplo, na faixa de 4 a 15, tal como na faixa de 6 a 12, por exemplo, ma faixa de 8 a 12, tal como na faixa de 9 a 11 nucleotídeos.
[00368]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6, em que todos os X4 consistem na faixa de 4 a 25, tal como na faixa de 4 a 20, por exemplo, na faixa de 4 a 15, tal como na faixa de 6 a 12, por exemplo, na faixa de 8 a 12, tal como na faixa de 9 a 11 nucleotídeos.
[00369]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 7, em que X2 consiste em uma sequência de nucleotídeo, que seja complementar à sequência de nucleotídeo de X4.
[00370]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, em que X4 consiste em uma sequência de nucleotídeo, que seja complementar à sequência de nucleotídeo de X2.
[00371]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 9, em que X3 está ausente, isto é, X3 consiste em zero nucleotídeos.
[00372]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 9, em que X3 consiste na faixa de 1 a 5, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.
[00373]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, em que X1 está ausente, isto é, X1 consiste em zero nucleotídeos.
[00374]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, em que X1 consiste na faixa de 1 to 25, tal como na faixa de 1 a 20, por exemplo, na faixa de 1 a 15, tal como na faixa de 1 a 10, por exemplo, na faixa de 1 a 5, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.
[00375]Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que X5 está ausente, isto é X5 consiste em zero nucleotídeos.
[00376]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, em que X5 consiste na faixa de 1 a 5, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.
[00377]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 15, em que a sequência de inserção heteróloga compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 e SEQ ID NO: 184.
[00378]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 16, em que a sequência de inserção heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 e SEQ ID NO: 184.
[00379]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 17, em que a esqualeno sintase é pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como 100% idêntica a uma esqualeno sintase selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, e SEQ ID NO:202.
[00380]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 18, em que o dito promotor é um promotor constitutivo ou induzível.
[00381]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 19, em que o dito promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em um promotor endógeno, GPD1, PGK1, ADH1, ADH2, PYK1, TPI1, PDC1, TEF1, TEF2, FBA1, GAL1-10, CUP1, MET2, MET14, MET25, CYC1, GAL1-S, GAL1-L, TEF1, ADH1, CAG, CMV, UbiC humano, RSV, EF-1alpha, SV40, Mt1, Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mx1, progesterona, RU486 e promotor induzível por Rapamicina.
[00382]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 20, em que a sequência de ácido nucléico compreende, ainda, uma sequência de poliadenil.
[00383]22.Célula, de acordo com o item 21, em que a extremidade 5’ da dita sequência de poliadenila é operacionalmente ligada à extremidade 3’ do ácido nucléico do item 1.
[00384]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 22, em que a sequência de ácido nucléico compreende, ainda, um elemento regulatório pós- transcricional.
[00385]Célula, de acordo com o item 23, em que o dito elemento regulatório pós-transcricional é um elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite de Woodchuck (WPRE).
[00386]Célula, de acordo com os itens 1 a 24, em que o ácido nucléico compreende uma repetição terminal 5’ e uma repetição terminal 3’.
[00387]Célula, de acordo com o item 25, em que as repetições terminais 5’ e 3’ são selecionadas a partir de Repetições Terminais Invertidas [ITR] e Repetições Terminais Longas [LTR].
[00388]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 26, em que a sequência de ácido nucléico é integrada em um vetor.
[00389]Célula, de acordo com o item 27, em que o vetor é um vetor de expressão.
[00390]Célula, de acordo com o item 27, em que o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em vetores plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais e vetores virais.
[00391]Célula, de acordo com o item 29, em que o vetor de plasmídeo pode ser mantido e replicado em bactérias, fungos e levedura.
[00392]Célula, de acordo com o item 29, em que o vetor viral é selecionado a partir do grupo que consiste em vetores derivados a partir da família Retroviridae incluindo lentivírus, HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV.
[00393]Célula, de acordo com o item 31, em que o vetor viral é selecionado a partir do grupo que consiste em alfavírus, adenovírus, vírus adeno-associado, baculovírus, HSV, coronavírus, vírus do papiloma Bovino, Mo-MLV e vírus adeno- associado.
[00394]Célula, de qualquer um dos itens 27 a 32, em que o dito vetor é funcional em células de mamíferos.
[00395]Célula, de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que uma célula é transformada ou transduzida com o vetor, de acordo com qualquer um dos itens 27 a 33.
[00396]Célula, de qualquer um dos itens 1 a 34, em que a dita célula é uma célula eucariótica.
[00397]Célula, de qualquer um dos itens 1 a 34, em que a dita célula é uma célula procariótica.
[00398]Célula, de acordo com o item 35, em que a dita célula é selecionada a partir do grupo que consiste em células de fungos, tal como levedura e aspérgilo; microalgas, como Chlorella e Prototheca; células vegetais; e células de mamíferos, tais como células de humanos, felinos, porcinos, símios, caninos, murinos, ratos, camundongos e coelhos.
[00399]Célula, de acordo com o item 37, em que a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, e Candida albicans.
[00400]Célula, de acordo com o item 37, em que a célula é selecionada a partir do grupo que consiste em células CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, BHK.
[00401]Célula, de acordo com o item 36, em que a dita célula é E. coli, Corynebacterium, Bacillus, Pseudomonas ou Streptomyces.
[00402]Célula, de qualquer dos itens 35 a 40, em que a dita célula procariótica, ou a dita célula de fungo, foi geneticamente modificada para expressar pelo menos uma porção das enzimas da trajetória independente de mevalonato.
[00403]Célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 41, em que a célula compreende, ainda, um ácido nucléico heterólogo que codifica GGPPS operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucléico que direciona a expressão de GGPPS na dita célula.
[00404]Célula, de acordo com o item 42, em que o dito GGPPS é selecionado a partir dos grupos que consistem em SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:167, e homólogos funcionais destes que compartilham pelo menos 75% de identidade de sequência com qualquer uma das supramencionadas.
[00405]Método para produzir um composto terpenóide sintetizado através da trajetória de esqualeno, em uma cultura celular, sendo que o dito método compreende as etapas de proporcionar a célula de acordo com qualquer um dos itens 1 a 42, cultivar uma célula de (a). recuperar o composto de produto de terpenóide.
[00406]Método para produzir um terpenóide derivado a partir de um precursor terpenóide selecionado a partir do grupo que consiste em Farnesil-pirofosfato (FPP), Isopentenil-pirofosfato (IPP), Dimetilalil-pirofosfato (DMAPP), Geranil-pirofosfato (GPP) e/ou Geranilgeranil-pirofosfato (GGPP), sendo que o dito método compreende: colocar o dito precursor em contato com a enzima da trajetória de esqualeno sintase,recuperar o produto de terpenóide.
[00407]Método, de acordo com qualquer um dos itens 44 e 45, em que o produto de terpenóide é selecionado a partir do grupo que consiste em hemiterpenóides, monoterpenos, sesquiterpenóides, diterpenóides, sesterpenos, triterpenóides, tetraterpenóides e politerpenóides.
[00408]Método, de acordo com o item 44, em que o terpenóide é selecionado a partir do grupo que consiste em farnesil fosfato, farnesol, geranilgeranil, geranilgeraniol, isopreno, prenol, ácido isovalérico, geranil pirofosfato, eucaliptol, limoneno, pineno, farnesil pirofosfato, artemisinina, bisabolol, geranilgeranil pirofosfato, retinol, retinal, fitol, taxol, forscolina, afidicolina, lanosterol, licopeno e caroteno.
[00409]Método, de acordo com o item 46, em que o dito método compreende, ainda, desfosforilar o farnesil fosfato para produzir farnesol.
[00410]Método, de acordo com o item 44, em que a enzima da de esqualeno sintase é selecionada a partir do grupo que consiste em Dimetilalil transferase (EC 2.5.1.1), Isopreno sintase (EC 4.2.3.27) e Geraniltranstransferase (EC 2.5.1.10).
[00411]Método para reduzir a taxa de translação de uma esqualeno sintase funcional (EC 2.5.1.21), sendo que o dito método compreende: proporcionar a célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 42, cultivar a célula de (a). Método para reduzir o turnover de farnesil-pp em esqualeno, sendo que o dito método compreende: proporcionar a célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 42, cultivar a célula de (a). Método para acentuar o acúmulo de um composto selecionado a partir do grupo que consiste em Farnesil-pirofosfato, Isopentenil-pirofosfato, Dimetilalil- pirofosfato, Geranil-pirofosfato e Geranilgeranil-pirofosfato, sendo que o dito método compreende as etapas de: proporcionar a célula, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 42, e cultivar a célula de (a).
[00412]Método, de acordo com o item 51, que compreende, ainda, recuperar o composto de Farnesil-pirofosfato, Isopentenil-pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato ou Geranilgeranil-pirofosfato.
[00413]Método, de acordo com qualquer um dos itens 51 e 52, que compreende, ainda, recuperar um composto sintetizado através da trajetória de esqualeno, sendo que o dito composto é derivado a partir do dito Farnesil-pirofosfato, Isopentenil-pirofosfato, Dimetilalil-pirofosfato, Geranil-pirofosfato e/ou Geranilgeranil- pirofosfato.
[00414]Método, de acordo com qualquer um dos itens 43 a 53, em que a etapa de cultivar a célula é realizada na presença de um inibidor de esqualeno sintase.
[00415]Método, de acordo com qualquer um dos itens 43 a 54, em que a célula é, ainda, genericamente modificada para acentuar a atividade e/ou sobre-expressar uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em Fosfomevalonato quinase (EC 2.7.4.2), Difosfomevalonato descarboxilase (EC 4.1.1.33), 4-hidróxi-3-metil but-2-en-1-il difosfato sintase (EC 1.17.7.1), 4-hidróxi-3- metil but-2-enil difosfato reductase (EC 1.17.1.2), Isopentenil-difosfato Delta- isomerase 1 (EC 5.3.3.2), Z-isoprenil difosfato sintase de cadeia curta (EC 2.5.1.68), Dimetilalil transferase (EC 2.5.1.1), Geraniltranstransferase (EC 2.5.1.10) e Geranilgeranil pirofosfato sintetase (EC 2.5.1.29).
[00416]Método, de acordo com qualquer um dos itens 43 a 55, em que a célula é, ainda, geneticamente modificada para acentuar a atividade e/ou sobre-expressar uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em acetoacetil CoA tiolose, HMG-CoA reductase ou o domínio catalítico desta, HMG-CoA sintase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, fosfomevalonato descarboxilase, isopentenil pirofosfato isomerase, farnesil pirofosfato sintase, D-1-desoxixilulose 5- fosfato sintase, e 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase e farnesil pirofosfato sintase.
[00417]Método, de acordo com qualquer um dos itens 43 a 56, em que a célula compreende uma mutação no quadro de leitura aberta ERG9.
[00418]Método, de acordo com qualquer um dos itens 43 a 57, em que a célula compreende um alelo de exclusão/inserção de ERG9[Delta]::HIS3.
[00419]Método, de acordo com qualquer um dos itens 43 a 58, em que a etapa de recuperar o composto compreende a purificação do dito composto a partir do meio de cultura celular.
VI . Exemplos
[00420]A invenção será adicionalmente descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações. Nos exemplos descritos no presente documento, utilizou-se a metodologia LC-MS a seguir para analisar os intermediários de trajetória de glicosídeos de esteviol e esteviol, exceto onde indicado em contrário.
Análise de glicosídeos de esteviol
[00421]As análises LC-MS foram realizadas utilizando-se um sistema HPLC Agilent Série 1200 (Agilent Technologies, Wilmington, DE, EUA) equipado com uma coluna C18 de kinetex Phenomenex® (partículas de 150 x 2,1 mm, 2,6 μm, tamanho de poro de 100 A) conectado a um espectrômetro de massa quadripolar triplo TSQ Quantum Access (ThermoFisher Scientific) com uma fonte de íons de eletroaspersão aquecida (HESI). A eluição foi realizada utilizando-se uma fase móvel do Eluente B (MeCN com ácido fórmico a 0,1%) e do Eluente A (água com ácido fórmico a 0,1%) aumentando-se o gradiente de 10->40% B a partir do minuto 0,0 ao 1,0, aumentando- se 40 -> 50% B no minuto 1,0 ao 6,5, 50->100% B a partir do minuto 6,5 ao 7,0 e finalmente lavagem e reequilíbrio. A taxa de fluxo foi de 0,4 ml/min e a temperatura da coluna de 30°C. Os glicosídeos de esteviol foram detectados usando SIM (Monitoramento de Íon Único) em modo positivo com os traços m/z a seguir.
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[00422]Os níveis de glicosídeo de esteviol foram quantificados comparando- se com curvas de calibração obtidas por padrões autênticos junto a LGC Standards. Por exemplo, as soluções padrão de 0,5 a 100 μM de Rebaudiosídeo A foram tipicamente utilizadas para construir uma curva de calibração.
Análise de Esteviol e ácido ent-caurenóico
[00423]As análises LC-MS de esteviol e ácido ent-caurenóico foram realizadas no sistema descrito anteriormente. Para a separação, utilizou-se uma coluna Thermo Science Hypersil Gold (C-18, 3μm, 100x2,1mm) e uma solução aquosa de acetato de amônia a 20mM foi usada como o Eluente A e acetonitrila como o Eluente B. As condições de gradiente foram: 20->55% B no minuto 0,0 to 1,0, 55->100 no minuto 1,0 a 7,0 e finalmente lavagem e reequilíbrio. A taxa de fluxo foi de 0,5 mL/min e a temperatura de coluna de 30°C. O esteviol e o ácido ent-caurenóico foram detectados usando SIM (Monitoramento de Íon Único) em modo negativo nos traços m/z a seguir.
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Quantificação de HPLC de UDP-Glicose
[00424]Para a quantificação de UDP-glicose, utilizou-se um sistema HPLC Agilent Série 1200, com uma coluna de amido de BEH Waters XBridge (2,5 μm, 3,0x50 mm). O Eluente A era uma solução aquosa de acetato de amônia a 10 mM (pH 9,0) e o Eluente B acetonitrila. As condições de gradiente foram: 95% B mantendo a partir do minuto 0,0 ao 0,5, diminuindo de 95 a 50% B no minuto 0,5 ao 4,5, mantendo 50% B a partir do minuto 4,5 a 6,8 e finalmente reequilíbrio a 95% B. A taxa de fluxo foi de 0,9 mL/min e a temperatura de coluna de 20°C. Detectou-se UDP-glicose por absorbância UV262nm.
[00425]A quantidade de UDP-glicose foi quantificada comparando-se com uma curva de calibração com um padrão comercialmente disponível (por exemplo, junto a Sigma Aldrich).
Exemplo 1 - Identificação de EUGT11
[00426]Testaram-se quinze genes para atividade de glicosilação de RebA 1,2. Vide a Tabela 10. Tabela 10
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[00427]Realizaram-se uma transcrição e uma translação in vitro desses genes, e os UGTs resultantes incubados com RebA e UDP-glicose. Após a incubação, as reações foram analisadas por LC-MS. A mistura de reação contendo EUGT11 (Rice, AC133334, SEQ ID NO:152) foi mostrada convertendo quantidades significativas de RebA em RebD. Vide os cromatogramas LC-MS na Figura 4. Conforme mostrado no painel esquerdo da Figura 4, UGT91D2e produziu uma quantidade residual de RebD quando RebA foi usado como a matéria-prima. Conforme mostrado no painel direito da Figura 4, EUGT11 produziu uma quantidade significativa de RebD quando RebA foi usado como a matéria-prima. A quantificação preliminar da quantidade de RebD que foi produzida indicou que EUGT11 era aproximadamente 30 vezes mais eficiente que UGT91D2e em converter RebA em RebD.
[00428]Para caracterizar adicionalmente EUGT11 e para comparação quantitativa com UGT91D2e, a sequência de nucleotídeo que codifica EUGT11 (SEQ ID NO: 153, não códon-otimizada, Figura 7) foi clonada em dois vetores de expressão E. coli, um contendo um tag HIS N-terminal e um contendo um tag GST N-terminal. EUGT11 foi expressado usando ambos os sistemas e purificado. Quando as enzimas purificadas forem incubadas com UDP-glicose e RebA, produz-se RebD.
Exemplo 2 - Identificação de Reações EUGT11
[00429]EUGT11 foi produzido por transcrição e translação in vitro, e incubado com vários substratos na trajetória de RebD. Realizara-se experimentos similares usando UGT91D2e transcrito e transladado in vitro. A Figura 3 mostra uma visão geral esquemática de reações de 19-O-1,2-diglicosilação realizadas por EUGT11 e UGT91D2e. Os compostos 1 a 3 foram identificados somente por massa e tempo de retenção esperado. Os números mostrados na Figura 3 são a altura de pico média do glicosídeo de esteviol indicado obtido a partir de um cromatograma LC-MS, e, embora não quantitativo, pode ser usado para comparar a atividade das duas enzimas. EUGT11 e UGT91D2e não foram capazes de usar esteviol como um substrato. Ambas as enzimas foram capazes de converter esteviol 19-O-monoglicosídeo (SMG) em composto 1, com EUGT11 sendo cerca de dez vezes mais eficiente que UGT91D2e em converter 19-SMG em composto 1.
[00430]Ambas as enzimas foram capazes de converter rubusosídeo em esteviosídeo com atividade comparável, mas somente EUGT11 foi capaz de converter rubusosídeo em composto 2 e composto 3 (RebE). Vide a Figura 5. O painel esquerdo da Figura 5 contém cromatogramas LC-MS da conversão de rubusosídeo em esteviosídeo. O painel direito da Figura 5 contém cromatogramas da conversão de rubusosídeo em esteviosídeo, em composto 2, e em composto 3 (RebE). A conversão de rubusosídeo em composto 3 requer duas 1, 2-O-glicosilações consecutivas nas posições 19 e 13 de esteviol. UGT91D2e foi capaz de produzir uma quantidade residual de composto 3 (RebE) em um experimento enquanto EUGT11 produziu uma quantidade significativa de composto 3.
[00431]Ambas as enzimas foram capazes de converter RebA em RebD. No entanto, EUGT11 era aproximadamente 30 vezes melhor em converter RebA em RebD. Em geral, parece que EUGT11 produz mais produto do que UGT91D2e em todas as reações (com tempo, concentrações, temperatura e pureza similares de enzima) exceto pela conversão de rubusosídeo em esteviosídeo.
Exemplo 3 - Expressão de EUGT11 em Levedura
[00432]A sequência de nucleotídeo que codifica EUGT11 foi códon-otimizada (SEQ ID NO:154) e transformada em levedura junto aos ácidos nucléicos que codificam todos os quatro UGTs (UGT91D2e, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2). A cepa de levedura resultante foi desenvolvida em um meio contendo esteviol e glicosídeos de esteviol que acumulados foram analisados por LC-MS. EUGT11 foi necessário para a produção de RebD. Em outros experimentos, a produção de RebD foi observada com UGT91D2e, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2.
Exemplo 4 - Atividade UGT em glicosídeos de esteviol 19-O-1,2-diglicosilados
[00433]Os glicosídeos de esteviol 19-O-1,2-diglicosilados produzidos por EUGT11 precisam de uma glicosilação adicional para serem convertidos em RebD. Os experimentos a seguir foram realizados para determinar se outros UGTs poderiam usar esses intermediários como substratos.
[00434]Em um experimento, o composto 1 foi produzido in vitro a partir de 19- SMG por EUGT11 ou UGT91D2e na presença de UDP-glicose. Após ferver a amostra, adicionaram-se UGT85C2 e UDP-glicose. A amostra foi analisada por LC-MS e o composto 2 foi detectado. Este experimento indicou que UGT85C2 pode usar o composto 1 como um substrato.
[00435]Em outro experimento, o composto 2 foi incubado com UGT91D2e e UDP-glicose. A reação foi analisada por LC-MS. UGT91D2e não foi capaz de converter o composto 2 em composto 3 (RebE). A incubação do composto 2 com EUGT11 e UDP-glicose resulta na produção de composto 3. UGT76G1 foi capaz de usar RebE como um substrato para produzir RebD.
[00436]Isto mostra que a 19-O-1,2-diglicosilação dos glicosídeos de esteviol é capaz de ocorrer em qualquer momento durante a produção de RebD visto que as enzimas a jusante são capazes de metabolizar os intermediários 19-O-1,2- diglicosilados.
Exemplo 5 - Comparação entre as sequências de EUGT11 e UGT91D2e
[00437]A sequência de aminoácidos de EUGT11 (SEQ ID NO:152, Figura 7) e a sequência de aminoácidos de UGT91D2e (SEQ ID NO:5) foram alinhadas usando o algoritmo FASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448 (1998)). Vide a Figura 6. EUGT11 e UGT91D2e são 42,7% idênticos em 457 aminoácidos.
Exemplo 6 - Modificação da atividade de 19-1,2-diglicosilação de UGT91 D2e
[00438]As estruturas cristalinas estão disponíveis para uma série de UGTs. Em geral, a metade N-terminal de um UGT está primariamente envolvida na ligação de substrato enquanto a metade C-terminal está envolvida na ligação do doador de açúcar UDP.
[00439]A modelagem da estrutura secundária de UGT91D2e sobre a estrutura secundária dos UGTs que foram cristalizados revelou um padrão conversado de estrutura secundária, apesar de uma sequência primária altamente divergida conforme mostrado na Figura 8. As estruturas cristalinas de UGT71G1 e UGT85H2 (vide, por exemplo H. Shao et al, The Plant Cell Novembro de 2005 vol. 17 no 11 31413154 e L. Li et al., J Mol Biol. 2007 370(5):951-63) foram reportadas. Loops, alfa hélices e beta folhas conhecidos são indicados em UGT91D2e na Figura 8. Embora a homologia no nível de estrutura primária desses UGTs seja claramente baixa, a estrutura secundária aparenta ser conservada, permitindo predições referentes às localizações dos aminoácidos envolvidos na ligação de substrato em UGT91D2e com base na localização de tais aminoácidos em UGT85H2 e UGT71G1.
[00440]As regiões comumente envolvidas em ligação de substrato foram superpostas em UGT91D2e e amplamente mostradas coincidindo com as 22 diferenças de aminoácido de UGT91D1 (Número de Acesso GenBank, Número de Acesso de Proteína AAR06918, GI:37993665). UGT91D1 é altamente expressado em Stevia e imagina-se que seja um UGT funcional. No entanto, seu substrato não é um glicosídeo de esteviol. Isto sugere que UGT91D1 tem um substrato diferente, que pode ser definido pelos 22 aminoácidos com os quais este difere de UGT91D2e. A Figura 9 é um alinhamento da sequência de aminoácidos de UGT91D1 e UGT91D2e. As caixas representam as áreas que são reportadas como estando envolvidas na ligação de substrato. Os aminoácidos destacados em cinza escuro mostram as 22 diferenças de aminoácido entre UGT91D1 e UGT91D2e. As estrelas denotam aminoácidos que foram mostrados como estando envolvidos na ligação de substrato em UGTs que tiveram sua estrutura cristalina resolvida (mais estrelas sob um aminoácido particular significam que a ligação de substrato foi mostrada com mais de um UGT com estrutura resolvida). Há uma forte correlação entre as 22 diferenças de aminoácido entre os dois UGT91s, as regiões conhecidas como estando envolvidas na ligação de substrato, e os aminoácidos reais envolvidos na ligação de substrato nos UGTs com estrutura cristalina resolvida. Isto sugere que as 22 diferenças de aminoácido entre os dois UGT91s estão envolvidas na ligação de substrato.
[00441]Todos os 22 91D2es alterados foram expressados em uma cepa E. coli XJb Autolysis de um vetor pGEX-4T1. A fim de avaliar a atividade das enzimas, realizaram-se dois experimentos de alimentação de substrato - in vivo e in vitro. A maioria dos mutantes tinha uma atividade menor que o tipo selvagem, no entanto, 5 mutantes mostram uma atividade aumentada. Isto foi reproduzido por transcrição e translação in vitro (IVT) e mostraram que C583A, C631A e T857C têm aproximadamente uma atividade de formação de esteviosídeo 3 vezes maior do que o UGT91D2e tipo selvagem, enquanto C662t e A1313C tinham aproximadamente o dobro da atividade de formação de esteviosídeo (numeração de nucleotídeo). Essas alterações resultam em mutações de aminoácido correspondentes a L195M, L211M, V286A; e S221F e E438A, respectivamente. A atividade aumentada diferiu dependendo do substrato, com C583A e C631A mostrando quase um aumento de 10 vezes usando 13-SMG como substrato e um aumento de cerca de 3 vezes usando rubusosídeo como o substrato, enquanto T857C mostrou um aumento de 3 vezes ao usar 13-SMG ou rubusosídeo como o substrato.
[00442]Para investigar se essas mutações foram aditivas, uma faixa de mutantes duplos foi feita e analisar para determinação da atividade (Figura 10). Neste experimento particular, observou-se um nível tipo selvagem de atividade maior do que os quatro experimentos anteriores; no entanto, as atividades relativas das mutações permanecem as mesmas. À medida que a rubusosídeo se acumula em muitas das cepas de S. cerevisiae que expressam os 4 UGTs (UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1 e UGT91D2e), a atividade de formação de esteviosídeo pode ser mais importante para aumentar a produção de glicosídeo de esteviol. Como tal, o C631A/T857C mutante duplo (numeração de nucleotídeo) pode ser útil. Este mutante foi nomeado como UGT91D2e-b, que contém as modificações de aminoácido L211M e V286A. Os experimentos foram reproduzidos in vitro usando mutantes UGT91D2e expressados em S. cerevisiae.
[00443]Para aperfeiçoar a atividade de 19-1,2-diglicosilação de UGT91D2e, realizou-se uma triagem mutagênica saturada direcionada de UGT91D2e das 22 diferenças de aminoácido entre UGT91D2e e UGT91D1. Utilizou-se a mutagênese de sítio-saturação GeneArt’s® (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) para obter uma biblioteca contendo cada uma das mutações. A biblioteca foi clonada nos sítios BamHI e NotI de plasmídeo de expressão bacteriana pGEX4T1 que expressa as versões mutadas de 91D2e como proteínas de fusão GST, resultando em uma nova biblioteca (Lib#116). Lib#116 foi transformada em uma cepa de E. coli XJbAutolysis (ZymoResearch, Orange, CA, EUA) para produzir aproximadamente 1600 clones contendo as 418 mutações esperadas (isto é, 22 posições com 19 aminoácidos diferentes em cada posição). Outros plasmídeos que expressam as versões marcadas com GST de 91D2e (EPCS1314), 91D2e-b (EPSC1888) ou EUGT11 (EPSC1744) bem como o pGEX4T1 vazio (PSB12) também foram transformadas.
Triagem por LC-MS
[00444]Para analisar aproximadamente 1600 clones mutantes de UGT91D2e, os transformantes de E. coli foram desenvolvidos de um dia para o outro a 30°C em 1 ml de NZCYM contendo ampicilina (100 mg/l) e cloranfenicol (33 mg/l), em um formato de 96 poços. No dia seguinte, 150 μl de cada cultura foram inoculados em 3 ml de NZCYM contendo ampicilina (100 mg/l), cloranfenicol (33 mg/l), arabinose a 3 mM, IPTG a 0,1 mM e etanol a 2% v/v, em um formato de 24 poços, e incubados a 20°C e 200 rpm durante ~20 horas. No dia seguinte, as células foram giradas descendentemente e os péletes foram ressuspensos em 100 μl de tampão de lise contendo 10mM de Tris-HCl com pH 8, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 e inibidor de mini protease completo isento de EDTA (3 tabletes/100 ml) (Hoffmann-La Roche, Basiléia, Suíça) e congelados a -80°C durante pelo menos 15 minutos para promover a lise celular. Os péletes foram descongelados em temperatura ambiente e 50 μl de DNase mix (1 μl de 1,4 mg/ml de DNase em H2O (~80000u/ml), 1,2 μl de MgCl2 a 500 mM e 47,8 μl de solução tampão 4x PBS) foram adicionados a cada poço. As placas foram agitadas em 500 rpm durante 5 minutos em temperatura ambiente para permitir a degradação do DNA genômico. As placas foram giradas descendentemente em 4000 rpm durante 30 minutos a 4°C e 6 μl dos lisatos foram usados em reações in vitro de UGT conforme descrito para GST-91D2e-b, usando rubusosídeo ou rebaudiosídeo A como substratos. Em cada caso, os compostos resultantes, esteviosídeo ou rebaudiosídeo D (rebD), foram medidos por LC-MS. Os resultados foram analisados em comparação à esteviosídeo ou rebD produzidos pelos lisatos que expressam os controles correspondentes (91D2e, 91D2e-b, EUGT11 e o plasmídeo vazio). Os clones que mostram uma atividade similar ou maior que aqueles que expressam 91D2e-b foram selecionados como as escolhas primárias.
[00445]Metade dos 1600 clones e dos controles correspondentes foram ensaiados para determinação de sua capacidade em glicosilar rubusosídeo e rebaudiosídeo A. Esteviosídeo e RebD foram quantificadas por LC-MS. Sob as condições usadas, os lisatos dos clones que expressam o UGT91D2e nativo mostram uma atividade em torno dos fundamentos com ambos os substratos (aproximadamente 0,5 μM de esteviosídeo e 1 μM de RebD), embora os clones que expressam UGT91D2e-b mostrem uma formação de produto consistentemente aperfeiçoada (>10 μM de Esteviosídeo; > 1,5 μM de RebD). Os clones que expressam EUGT11 exibem consistentemente um nível de atividade maior, especialmente usando RebA como substrato. O corte para considerar os clones como escolhas primárias na triagem foi genericamente ajustado em 1,5 μM para ambos os produtos, mas em alguns casos, foi ajustado para cada ensaio independente.
Exemplo 7 - Homólogos EUGT11
[00446]Uma busca Blastp do banco de dados NCBI nr usando a sequência de proteína EUGT11 revelou aproximadamente 79 homólogos UGT potenciais a partir de 14 espécies vegetais (sendo que uma delas é a Estévia UGT91D1, aproximadamente 67% idênticas a EUGT11 em regiões UGT conservadas, mas menos de 45% no geral). Os homólogos com mais de 90% de identidade em regiões conversadas foram identificados a partir de milho, soja, Arabidopsis, uva e Sorghum. A homologia geral dos homólogos EUGT11 de comprimento completo, no nível de aminoácido, foi somente de 28 a 68%.
[00447]O RNA foi extraído a partir do material vegetal pelo método descrito por Iandolino et al. (Iandolino et al., Plant Mol Biol Reporter 22, 269-278, 2004), do mini kit RNeasy Plant (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, ou usando um kit Fast RNA Pro Green (MP Biomedicals) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi produzido pelo kit de Síntese de cDNA AffinityScript QPCR (Agilent) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA genômico foi extraído usando o kit FastDNA (MP biomedicals) de acordo com as instruções do fabricante. PCR foi realizada em cDNA usando Dream Taq polimerase (Fermentas) ou Phusion polimerase (New England Biolabs) e uma série de iniciadores designados para amplificar os homólogos.
[00448]As reações de PCR foram analisadas por eletroforese em géis agarose-TAE contendo SyberSafe. O DNA foi visualizado por radiação UV em um transiluminador. Cortaram-se faixas do tamanho correto, purificadas através de colunas de giro de acordo com as especificações do fabricante, e clonadas em TOPOZero blunt (para produtos gerados por Phusion polimerase) ou TOPO-TA (para produtos gerados por Dream Taq). Os vetores TOPO contendo os produtos PCR foram transformados em DH5Bα de E. coli e colocados em placas de LB-agar contendo os antibióticos seletivos apropriados. O DNA foi extraído das colônias sobreviventes e seqüenciado. Os genes com a sequência correta foram cortados por digestão de restrição com SbfI e AscI, clonados em um vetor IVT8 similarmente digerido e transformados em E. coli. As PCRs foram realizadas em todos os genes clonados para amplificar o gene e as regiões de flanqueamento necessárias para transcrição e translação in vitro. As proteínas foram produzidas a partir de produtos PCR por transcrição e translação in vitro usando o kit Promega L5540, TNT T7 Quick para PCR DNA de acordo com as instruções do fabricante. A produção de proteínas foi avaliada pela incorporação de 35S-metionina seguida pela separação por SDS- PAGE e visualização em um Typhoon Phosphorimager.
[00449]Os ensaios de atividade foram ajustados totalizando 20% (em volume) de reação in vitro, 0,1 mM de rubusosídeo ou RebA, DMSO a 5%, 100 mM de Tris- HCl com pH 7,0, 0,01 unidades de fosfatase alcalina Fast (Fermentas), e 0,3 mM de UDP-glicose (concentrações finais). Após uma incubação a 30°C durante uma hora, as amostras foram analisadas por LC-MS para produção de esteviosídeo e RebD conforme descrito anteriormente. UGT91D2e e UGT91D2e-b (mutante duplo descrito no Exemplo 6) foram usados como controles positivos, junto com EUGT11. Sob as condições de ensaio iniciais, o clone P 64B (vide a Tabela 11) produziu uma quantidade residual de produto usando rubusosídeo e RebA. A Tabela 11 lista a identidade percentual no nível de aminoácido comparado a EUGT11 para todo o comprimento dos UGTs, que varia de 28 a 58%. Observaram-se altos graus de homologia (96 a 100%) em trechos mais curtos de sequência, que pode indicar domínios altamente conservados de UGTs vegetais.Tabela 11.
[00450]Lista de homólogos EUGT11 clonados e sua identidade percentual de aminoácido a EUGT11.UGT Acesso % de identidade a EUGT11
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Exemplo 8 - Produção Biocatalítica Isenta de Células de Reb-D
[00451]A abordagem isenta de células é um sistema in vitro onde uma mistura de RebA, esteviosídeo ou glicosídeo de esteviol é enzimaticamente convertida em RebD. O sistema requer quantidades estequiométricas de UDP-glicose e, portanto, pode-se usar uma regeneração de UDP-glicose a partir de UDP e sacarose usando sacarose sintase. Adicionalmente, a sacarose sintase remove o UDP produzido durante a reação, que aperfeiçoa a conversão em produtos glicosilados pela inibição de produto aliviada observada para reações de glicosilação. Vide o documento WO 2011/153378.
Expressão e purificação de enzima
[00452]UGT91D2e-b (descrito no Exemplo 6) e EUGT11 são enzimas fundamentais que catalisam a glicosilação de RebA produzindo RebD. Essas UGTs foram expressadas em bactéria (E. coli), mas um indivíduo versado na técnica avaliará que tais proteínas também podem ser preparadas usando diferentes métodos e hospedeiros (por exemplo, outra bactéria, como Bacillus sp., levedura, como Pichia sp. ou Saccharomyces sp., outro fungo (por exemplo, Aspergillus), ou outros organismos). Por exemplo, as proteínas podem ser produzidas por transcrição e translação in vitro ou por síntese protéica.
[00453]Os genes UGT91D2e-b e EUGT11 foram clonados em plasmídeos pET30a ou pGEX4T1. Os vetores resultantes foram transformados em uma cepa de E. coli XJb (DE3) Autolysis (ZymoResearch, Orange, CA, EUA). Inicialmente, os transformantes de E. coli foram desenvolvidos de um dia para o outro a 30°C em um meio de NZCYM, seguido pela indução com 3 mM de arabinose e 0,1 mM de IPTG, e uma incubação adicional de um dia para o outro a 30°C. As proteínas de fusão correspondentes foram purificadas por cromatografia de afinidade usando os tags 6HIS ou GST incluídos e métodos padrão. Um indivíduo versado na técnica avaliará que outros métodos de purificação de proteínas, como filtração em gel ou outras técnicas de cromatografia também podem ser usados, junto à precipitação/cristalização ou fracionamento com, por exemplo, sulfato de amônia. Embora EUGT11 tenha sido expressado bem usado as condições iniciais, UGT91D2e-b necessitou de várias modificações ao protocolo base para aumentar a solubilidade de proteína, incluindo reduzir a temperatura da expressão de um dia para o outro de 30°C para 20°C e adicionar etanol a 2% ao meio de expressão. Em geral, 2 a 4 mg/L de GST-EUGT11 solúvel e 400-800 μg/l de GST-UGT91D2e-b foram purificados através deste método.
Estabilidade de EUGT11
[00454]As reações foram conduzidas para explorar a estabilidade de EUGT11 sob várias condições de reação RebA a RebD. Omitindo o substrato da mistura de reação, EUGT11 foi pré-incubado durante vários períodos de tempo antes de o substrato ter sido adicionado. Após uma pré-incubação da enzima em 100 mM de tampão Tris-HCl, o substrato (100 μM RebA) e outros componentes de reação (300 μM de UDP-glicose, e 10 U/mL de Fosfatase Alcalina (Fermentas/Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA)) foram adicionados (0, 1, 4 ou 24 horas após a incubação ter sido iniciada). A reação foi, então, deixada proceder durante 20 horas, após as quais as reações foram interrompidas e a formação de produto RebD medida. Os experimentos foram repetidos em diferentes temperaturas: 30°C, 32.7°C, 35.8°C e 37°C.
[00455]A atividade de EUGT11 foi reduzida rapidamente quando a enzima foi pré-incubada a 37°C, alcançando aproximadamente metade da atividade após 1 hora, e tendo quase nenhuma atividade após 4 horas. A 30°C, a atividade não foi significativamente reduzida após 4 horas e após 24 horas, aproximadamente um terço da atividade restante. Isto sugere que EUGT11 é sensível ao calor.
[00456]Para avaliar a estabilidade térmica de EUGT11 e compará-la com outros UGTs na trajetória de glicosilação de esteviol, as temperaturas de desnaturação das proteínas foram determinadas usando calorimetria de varredura diferencial (DSC). Descreve-se o uso de termogramas de DSC para estimar as temperaturas de desnaturação, TD, por exemplo, por E. Freire em Methods in Molecular Biology 1995, Vol. 40 191-218. DSC foi realizada (usando EUGT116HIS-purificado, produzindo uma TD aparente de 39°C; enquanto quando um 91D2e-b GST-purificado foi usado, a TD medida foi de 79°C. Para referência, a TD medida ao usar UGT74G16HIS-purificado, UGT76G1 e UGT85C2 foi de 86°C em todos os casos. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que a imobilização de enzima ou a adição de protetores térmicos podem ser adicionadas às reações para aperfeiçoar a estabilidade da proteína. Exemplos não-limitantes de protetores térmicos incluem trealose, glicerol, sulfato de amônia, betaína, óxido de trimetilamina, e proteínas.
Cinética enzimática
[00457]Realizou-se uma série de experimentos para determinar os parâmetros cinéticos de EUGT11 e 91D2e-b. Para ambas as enzimas, 100 μM de RebA, 300 μM de UDP-glicose, e 10 U/mL de Fosfatase Alcalina (Fermentas/Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) foram usados nas reações. Para EUGT11, as reações foram realizadas a 37°C usando 100 mM de Tris-HCl, pH 7, e enzima a 2%. Para 91D2e-b, as reações foram realizadas a 30°C usando 20 mM de Hepes-NaOH, pH 7,6, enzima a 20% (em volume). As velocidades iniciais (V0) foram calculadas na faixa linear de gráfico de produto versus tempo.
[00458]Para investigar primeiramente os intervalos de linearidade, realizaram- se os cursos de tempo iniciais para cada enzima. EUGT11 foi ensaiado a 37°C durante 48 horas em concentrações iniciais de 100 μM de RebA e 300 μM de UDP-glicose. UGT91 D2e-b foi ensaiado a 37°C durante 24 horas em concentrações iniciais de 200 μM de RebA e 600 μM de UDP-glicose. Com base nesta faixa de estudos e constatações, determinou-se que os 10 minutos iniciais no caso de EUGT11, e os 20 minutos iniciais em UGT91D2e-b estariam na faixa linear em relação à formação de produto, e, portanto, as velocidades iniciais de cada reação foram calculadas nesses intervalos. No caso de EUGT11, as concentrações de RebA ensaiadas foram 30 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM e 500 μM. A concentração de UDP-glicose foi sempre três vezes a concentração de RebA e a incubação foi realizada a 37°C. Representando-se graficamente a V0 calculada como uma função das concentrações de substrato, geraram-se curvas de Michaelis-Menten. Representando-se graficamente o recíproco de V0 e o recíproco de [S], obteve-se um gráfico de Lineweaver-Burk, com y = 339,85x +1,8644; R2 = 0,9759.
[00459]Os parâmetros Vmax e KM foram determinados a partir dos dados de ajuste de curva de Lineweaver-Burk, calculados a partir das interseções x- e y (x=0, y=1/ Vmax ) e (y=0, x= -1/ KM). Adicionalmente, os mesmos parâmetros também foram calculados por uma regressão dos mínimos quadrados não-linear, usando a função SOLVER no Excel. Os resultados obtidos com ambos os métodos para EUGT11 e RebA são apresentados na Tabela 12, junto com todos os parâmetros cinéticos deste exemplo. Os resultados do método de Ajuste dos Mínimos Quadrados Não-Linear e do gráfico de Lineweaver-Burk são apresentados na Tabela 12. Kcat é calculado com base em Vmax dividido pela quantidade aproximada de proteína no ensaio. Tabela 12
[00460]Comparação dos parâmetros cinéticos para EUGT11 e UGT 91D2e-b, com RebA ou UDP-glicose como substrato.
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[00461]A fim de investigar a influência da concentração de UDP-glicose na reação de glicosilação, bem como a afinidade de EUGT11 por UDP-glicose, realizaram-se análises cinéticas similares. EUGT11 foi incubado com quantidades crescentes de UDP-glicose (20 μM, 50 μM, 100 μM, e 200 μM), mantendo um excesso de RebA (500 μM). Os parâmetros cinéticos foram calculados conforme descrito anteriormente, e mostrado na Tabela 12.
[00462]No caso de UGT91D2e-b, as concentrações de RebA ensaiadas foram 50 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM e 500 μM. A concentração de UDP-glicose foi sempre três vezes a concentração de RebA e a incubação foi realizada a 30°C, nas condições de reação descritas anteriormente para UGT91D2e-b. Os parâmetros cinéticos foram calculados conforme descrito previamente; e os parâmetros cinéticos resultantes são mostrados na Tabela 12. Adicionalmente, determinaram-se os parâmetros cinéticos de UGT91D2e-b em direção à UDP-glicose. UGT91D2e-b foi incubado com quantidades crescentes de UDP-glicose (30 μM, 50 μM, 100 μM, e 200 μM), mantendo um excesso de RebA (1500 μM). A incubação foi realizada a 30°C, em condições ótimas para UGT91D2e-b. Os parâmetros cinéticos foram calculados conforme descrito previamente e os resultados são apresentados na Tabela 12.
[00463]Comparando-se os parâmetros cinéticos para EUGT11 e 91D2e-b, conclui-se que 91D2e-b tem um Kcat inferior e tem uma afinidade menor por RebA (KM maior) embora o KM para UDP-glicose de 91D2e-b seja menor que EUGT11. UGT91D2e-b tem um Kcat/KM inferior que é uma medição da eficiência catalítica, combinando as informações sobre a taxa de catálise com um substrato particular (Kcat) e a resistência da ligação de enzima-substrato (KM).
Determinação do fator de limite em reações
[00464]Sob as condições descritas anteriormente para EUGT11, aproximadamente 25% da RebA administrada oram convertidos em RebD. O fator de limite nessas condições podem ser a enzima, UDP-glicose ou RebA. Os experimentos foram ajustados para distinguir entre essas possibilidades. Permitiu-se que um ensaio padrão fosse conduzido em seu curso durante 4 horas. Isto foi seguido pela adição de substrato RebA adicional, enzima adicional, UDP-glicose adicional ou enzima e UDP- glicose adicionais. A adição de enzima adicional resultou em um aumento relativo da conversão de cerca de 50%, adicionar RebA adicional ou UDP-glicose sozinha não aumentou a conversão significativamente, mas a adição simultânea de enzima e UDP- glicose aumentou a conversão aproximadamente 2 vezes.
[00465]Os experimentos foram conduzidos para examinar o limite a seu benefício de adicionar qualidades de bolus de UDP-glicose e enzima fresca na conversão de reação de RebA em RebD. Adicionaram-se enzima ou enzima e UDP- glicose adicionais após 1, 6, 24 e 28 horas. No caso da adição de EUGT11 adicional e UDP-glicose adicional, obteve-se uma conversão maior que 70%. Nenhum outro componente apresentou um efeito significativo sobre a conversão. Isto indica que EUGT11 é um fator de limite primário para a reação, mas UDP-glicose também é limitante. Visto que UDP-glicose está presente em uma concentração 3 vezes maior que RebA, isto indica que a UDP-glicose pode ser de alguma forma instável na mistura de reação, pelo menos na presença de EUGT11. Alternativamente, conforme explicado abaixo, EUGT11 pode estar metabolizando a UDP-glicose.
Estudos de inibição
[00466]Conduziram-se experimentos para determinar se fatores, como sacarose, frutose, UDP, produto (RebD) e impurezas em matérias-primas de Extratos de estévia menos puros inibiram a extensão da conversão de substratos de glicosídeo de esteviol em RebD. Em uma mistura de reação padrão, adicionou-se o excesso dos inibidores potenciais (sacarose, frutose, UDP, RebD, ou uma blenda comercial de glicosídeos de esteviol (Steviva, Steviva Brands, Inc., Portland, OR, EUA)). Após a incubação, quantificou-se a produção de RebD. A adição de 500 μg/ml da mistura de Steviva comercial (aproximadamente 60% de 1,2-esteviosídeo, 30% de RebA, 5% de Rubusosídeo, 2% de 1,2-biosídeo, menos de 1% de RebD, RebC e outros, conforme avaliado por LC-MS) não foi constatada como sendo inibitória, mas ao invés disso aumentou a produção RebD geral (para cerca de 60 μM a partir de cerca de 30 μM sem qualquer adição) bem além da RebD originalmente adicionada com a blenda (cerca de 5 μM). A partir das moléculas testadas, somente UDP foi mostrado como tendo um efeito inibitório sobre a produção de RebD na concentração usada (500μM), conforme medido por LC-MS. A RebD que foi produzida tinha menos de 7 μM. Esta inibição pode ser aliviada nas reações in vivo ou in vitro para produção de RebD, incluindo-se um sistema de reciclagem de UDP à UDP-glicose, seja por levedura ou por uma SUS adicionada (enzima de sacarose sintase) em conjunto com sacarose. Ademais, ao trabalhar com quantidades inferiores de UDP-glicose (300μM), a adição de fosfatase alcalina para remover UDP-G não aumentou a quantidade de RebD produzido nas glicosilações in vitro substancialmente, sugerindo que a UDP produzida não pode ser inibitória nessas concentrações.
Mistura de RebA vs glicosídeo de esteviol bruto
[00467]Em alguns experimentos, uma mistura bruta de glicosídeo de esteviol foi usada como uma fonte de RebA ao invés de RebA purificado. Como tal, uma mistura bruta de glicosídeo de esteviol contém uma alta porcentagem de esteviosídeo junto com RebA, UGT76G1 foi incluído nas reações. Realizaram-se reações in vitro conforme descrito anteriormente usando 0,5 g/l da mistura de Steviva® como substrato e enzima (UGT76G1 e/ou EUGT11) e incubado a 30°C. A presença de glicosídeos de esteviol foi analisada por LC-MS.
[00468]Quando somente UGT76G1 foi adicionado às reações, a esteviosídeo foi convertida em RebA de modo bastante eficiente. Detectou-se, também, uma penta- glicosídeo desconhecida (com um pico de tempo de retenção em 4,02 minutos). Quando somente EUTG11 foi adicionada à reação, encontraram-se grandes quantidades de RebE, RebA, RebD e uma esteviol-pentaglicosídeo desconhecida (com um pico de tempo de retenção em 3,15 minutos). Quando tanto EUGT11 como UGT76G1 foram adicionados às reações, o pico de esteviosídeo foi reduzido, e quase totalmente convertido em RebA e RebD. Haviam quantidades residuais da esteviol- pentaglicosídeo desconhecida (pico em 4,02 minutos). Não se detectou nenhum RebE nem a segunda esteviol-pentaglicosídeo desconhecida (pico em 3,15 minutos). Este resultado indicou que o uso de extratos de estévia como um substrato para produzir RebD in vitro é possível quando EUGT11 e UGT76G1 forem usados em combinação.
Metabolismo de UDP-glicose não-específico
[00469]Para determinar se EUGT11 pode metabolizar UDP-glicose independentemente da conversão de RebA em RebD, EUGT11 GST-purificado foi incubado na presença ou na ausência de substrato de RebA, e a utilização de UDP- glicose foi medida como uma liberação de UDP, usando o kit TR-FRET Transcreener® (BellBrook Labs). O kit Transcreener® se baseia em uma molécula traçadora ligada a um anticorpo. A molécula traçadora é deslocada por UDP ou ADP de maneira altamente sensitiva e quantitativa. O kit FP inclui um traçador Alexa633 ligado a um anticorpo. O traçador é deslocado por UDP/ADP. O traçador deslocado gira livremente levando a uma redução na polarização de fluorescência. Portanto, a produção de UDP é proporcional a uma redução na polarização. O kit FI inclui um Traçador Alexa594 extinto ligado a um anticorpo, que é conjugado a um extintor IRDye® QC-1. O traçador é deslocado por UDP/ADP, desse modo, o traçador deslocado não é extinto, levando a um aumento positivo em intensidade de fluorescência. Portanto, a produção de UDP é proporcional a um aumento na fluorescência. Um kit TR-FRET inclui um Traçador HiLyte647 ligado a um conjugado de anticorpo-Tb. A excitação do complexo de térbio na faixa de UV (ca. 330 nm) resulta na transferência de energia ao traçador e na emissão em um comprimento de onda maior (665nm) após um retardo de tempo. O traçador é deslocado por UDP/ADP causando uma redução em TR-FRET.
[00470]Observou-se que a UDP-glicose medida foi igual independente da presença de substrato RebA. A liberação de UDP não foi detectável na ausência de enzima. Isto indica uma degradação não-específica de UDP-glicose por EUGT11. Independentemente, RebD ainda foi produzido quando RebA foi adicionado, sugerindo que EUGT11 catalisaria preferencialmente a glicosilação de RebA pela degradação de UDP-glicose não-específica.
[00471]Os experimentos foram ajustados para descobrir o destino da molécula de glicose na ausência de RebA ou outros substratos de glicosilação óbvios. Um fator comum em todas as reações anteriores foi a presença de tampão Tris e/ou quantidades residuais de glutationa, sendo que ambos contêm sítios de glicosilação potencial. O efeito dessas moléculas sobre o consumo de UDP-glicose não-específica foi ensaiado usando EUGT11 GST-purificado (com glutationa) e enzima HIS- purificada (sem glutationa) em reações in vitro, na presença ou na ausência de RebA. A utilização de UDP-glicose foi medida como uma liberação de UDP, usando o kit TR- FRET Transcreener®. A liberação de UDP ocorreu em todos os casos e foi independente da presença de RebA. A liberação de UDP foi mais lenta quando a enzima HIS-purificada foi usada, mas a atividade catalítica geral da enzima na conversão de RebA em RebD também foi inferior, sugerindo uma quantidade menor de enzima solúvel ativa presente no ensaio. Portanto, aparenta que o metabolismo de UDP-glicose por EUGT11 é independente da presença de substrato e independente da presença de glutationa na reação, sob as condições testadas.
[00472]Para testar o efeito de Tris sobre o metabolismo de UDP-glicose por EUGT11, GST-EUGT11 foi purificado usando um tampão à base de Tris ou PBS para a eluição, obtendo quantidades similares de proteína em ambos os casos. As enzimas Tris- e PBS-purificadas foram usadas em reações in vitro usando Tris e HEPES com tampões, respectivamente, na presença ou ausência de RebA de maneira similar conforme anteriormente. Em ambas as condições, a UDP release foi a mesma nas reações se RebA foi adicionada ou não, indicando que o metabolismo de UDP-glicose por EUGT11 é independente da presença de RebA e Tris na reação. Isto sugere que a liberação de UDP detectada pode de alguma forma ser um artefato causado por uma propriedade de EUGT11 ou, alternativamente, EUGT11 pode estar hidrolisando UDP-glicose. EUGT11 ainda é eficiente na conversão de RebA em RebD preferencialmente e a perda de UDP-G pode ser compensada pela adição do sistema de reciclagem de sacarose sintase descrito abaixo.
Solubilidade de RebA
[00473]A solubilidade de RebA determina a concentração que pode ser usada tanto para a abordagem de célula inteira como para a abordagem isenta de células. Várias soluções diferentes de RebA em água foram produzidas e deixadas em temperatura ambiente durante vários dias. Após 24 horas de armazenamento, RebA se precipitou em concentrações de 50 mM ou maiores. Vinte e cinco mM de RebA começaram a se precipitar após 4 a 5 dias, enquanto concentrações de 10 mM ou menores permaneceram em solução, mesmo quando armazenadas a 4°C.
Solubilidade de RebD
[00474]A solubilidade de RebD foi avaliada produzindo-se várias soluções diferentes de RebD em água e incubadas a 30°C durante 72 horas. Constatou-se que RebD é solúvel em água inicialmente em concentrações de 1 mM ou menores, enquanto constatou-se que concentrações de 0,5 mM ou menores são estáveis por períodos de tempo mais longos. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que a solubilidade pode ser influenciada por qualquer número de condições, como pH, temperatura, ou diferentes matrizes.
Sacarose sintase
[00475]A sacarose sintase (SUS) foi usada para regenerar UDP-glicose a partir de UDP e sacarose (Figura 11) para outras glicosilações de molécula pequena (Masada Sayakaet al. FEBS Letters 581 (2007) 2562-2566.). Três genes SUS1 de A. thaliana, S. rebaudiana e café (Coffea arabica) foram clonados em vetores de expressão pGEX4T1 de E. coli (vide a Figura 17 para as sequências). Utilizando-se métodos similares àqueles descritos para EUGT11, purificou-se cerca de 0,8 mg/l de GST-AtSUS1 (SUS1 de A. thaliana). A expressão inicial de CaSUS1 (SUS1 de Coffea arabica) e SrSUS1 (SUS1 de S. rebaudiana) seguida pela purificação de GST não produziu quantidades significativas de proteína, embora, quando analisadas por western blot, a presença de GST-SrSUS1 seja verificada. Quando GST-SrSUS1 for expressado a 20°C na presença de etanol a 2%, produz-se aproximadamente 50 μg/l de enzima.
[00476]Os experimentos foram realizados para avaliar a atividade de regeneração de UDP-glicose do GST-AtSUS1 e do GST-SrSUS1 purificados. Conduziram-se ensaios in vitro em 100mM de Tris-HCl pH=7,5 e 1mM de UDP (concentração final). ~2,4 μg de GST-AtSUS1 purificado, ~0,15 μg de GST-SrSUS1, ou ~1,5 μg de BSA comercial (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) também foram adicionados. As reações foram produzidas na presença ou na ausência de ~200 mM de sacarose e incubadas a 37°C durante 24 horas. O produto de UDP-glicose foi medido por HPLC conforme descrito na seção analítica. AtSUS1 produziu ~0,8 mM de UDP-glicose quando a sacarose estava presente. Não se observou nenhuma UDP- glicose quando SrSUS1 ou o controle negativo (BSA) foram usados. A falta de atividade observada para SrSUS1 poderia ser explicada pela baixa qualidade e concentração da enzima purificada. A produção de UDP-glicose por AtSUS1 foi sacarose dependente e, portanto, conclui-se que AtSUS1 pode ser usada em uma reação acoplada para regenerar a UDP-glicose usada por EUGT1 ou outros UGTs para glicosilação de molécula pequena (Figura 11, acima).
[00477]A SUS catalisa a formação de UDP-glicose e frutose a partir de sacarose e a partir de UDP conforme descrito na Figura 11. Então, esta UDP-glicose pode ser usada por EUGT11 para glicosilação de RebA para produzir RebD. Realizaram-se ensaios in vitro conforme descrito anteriormente, adicionando ~200 mM de sacarose, 1 mM de UDP, 100 μM de RebA, ~1,6 μg de GST-AtSUS1 purificado e ~0,8 μg de GST-EUGT11. A formação de produto, RebD, foi avaliada por LC-MS. Quando AtSUS, EUGT11, sacarose e UDP foram misturados com RebA, formaram- se 81±5 μM de RebD. A reação foi dependente da presença de AtSUS, EUGT11 e sacarose. A taxa de conversão foi similar àquela observada previamente usando UDP- glicose irrelevantemente proporcionada. Isto mostra que AtSUS pode ser usada para regenerar UDP-glicose para formação de RebD por EUGT11.
Exemplo 9: Produção Biocatalítica de Célula inteira de RebD
[00478]Neste exemplo, estudaram-se vários parâmetros que são fatores para usar sistemas biocatalíticos de célula inteira na produção de RebD a partir de RebA ou outros glicosídeos de esteviol. A capacidade de matérias-primas cruzarem a membrana celular e a disponibilidade de UDP-glicose são dois desses fatores. Estudaram-se agentes permeabilizantes, bem como diferentes tipos de célula para certificar que os sistemas podem ser os mais benéficos para a produção de RebD.
Agentes permeabilizantes
[00479]Vários agentes de permeabilização diferentes foram previamente mostrados permitindo uma conversão enzimática intracelular de vários compostos que normalmente não são capazes de cruzar uma membrana celular (Chow e Palecek, Biotechnol Prog. 2004 Mar-Apr;20(2):449-56). Em vários casos, as abordagens se assemelham a uma lise parcial das células e, em levedura, geralmente dependem da remoção da membrana celular por um detergente e da encapsulação das enzimas dentro da parede celular restante, que é permeável a moléculas menores. Comum a esses métodos é a exposição do agente permeabilizante seguido por uma etapa de centrifugação a células de pélete antes da adição do substrato. Vide, por exemplo, Flores et al., Enzima Microb. Technol., 16, pp. 340-346(1994); Presecki & Vasic- Racki,Biotechnology Letters, 27, pp. 1835-1839 (2005); .Yu et al., J Ind Microbiol Biotechnol, 34, 151-156(2007); Chow e Palecek, Cells. Biotechol. Prog., 20, pp. 449- 456 (2004); Fernandez et al.,Journal of Bacteriology, 152, pp. 1255-1264 (1982); Kondo et al., Enzyme and microbial technology, 27, pp. 806-811(2000); Abraham e Bhat,J Ind Microbiol Biotechnol, 35, pp. 799-804(2008); Liu et al.,: Journal of bioscience and bioengineering, 89, pp. 554-558(2000); e Gietz e Schiestl, Nature Protocols, 2, pp. 31-34 (2007) considerando a permeabilização de levedura. Vide Naglak e Wang, Biotechnology and Bioengineering, 39, pp. 732-740 (1991); Alakomi et al., Applied and environmental Microbiology, 66, pp. 2001-2005(2000); e Fowler e Zabin, Journal of bacteriology, 92, pp. 353-357(1966) considerando a permeabilização de bactérias. Conforme descrito neste exemplo, determinou-se se as células poderiam permanecer viáveis e, portanto, poderiam reter de novo a biossíntese de UDP-glicose.
[00480]Os experimentos foram realizados para estabelecer condições para permeabilização em E. coli e em levedura. Células em desenvolvimento (S. cerevisiae ou E. coli) foram tratadas com diferentes concentrações/combinações de agentes de permeabilização: tolueno, clorofórmio e etanol para permeabilização de S. cerevisiae, e guanidina, ácido lático, DMSO e/ou Triton X-100 para permeabilização de E. coli. A tolerância de ambos os organismos modelo a altas concentrações de RebA e outros substratos potenciais também foi avaliada. A permeabilização foi medida pela quantidade de RebD produzida a partir de um organismo de expressão de EUGT11 após uma incubação em um meio contendo RebA (experimento de alimentação). A atividade enzimática foi monitorada antes e após a exposição aos agentes permeabilizantes lisando-se as células e analisando-se a atividade dos UGTs liberados em um ensaio in vitro.
[00481]Em levedura, nenhuma das condições de permeabilização resultou em um aumento de RebD acima dos fundamentos detectados (isto é, contaminando os níveis de RebD presentes no estoque de RebA usado para alimentação). Isto indica que, sob as condições testadas, as células de levedura permanecem impermeáveis a RebA e/ou a viabilidade de célula reduzida causada pelos solventes também resulta em uma redução da atividade de EUGT11.
[00482]Em E.coli, nenhuma das condições testadas resultou em uma permeabilização das células e em uma produção subsequente de RebD acima dos níveis fundamentais. Os níveis detectáveis de RebD foram medidos quando os lisatos de cepas que expressam EUGT11 foram usadas nas reações in vitro (dados não mostrados), indicando que a enzima EUGT11 está presente e ativa mesmo após todos os tratamentos de permeabilização (apesar de o nível de atividade variar). Os tratamentos de permeabilização apresentaram pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade celular, exceto pelas culturas de tratamento com 0,2 M de guanidina e TritonX-100 a 0,5%, o que reduziu severamente a viabilidade.
[00483]S. cerevisiae também foi submetida a ensaios de permeabilização não permitindo um crescimento adicional das células usando Triton X-100, N-lauril sarcosina (LS), ou acetato de lítio + polietileno glicol (LiAc+PEG). Ou seja, sob essas condições, a permeabilização torna as células inviáveis removendo-se a membrana celular de uma vez enquanto retém a parede celular como uma barreira para manter as enzimas e gDNA no interior. Nesses métodos, UDP-glicose pode ser suplementar ou reciclada conforme descrito anteriormente. A vantagem de permeabilização versus a abordagem puramente in vitro é que as enzimas individuais não precisam ser produzidas e isoladas separadamente.
[00484]O tratamento de N-lauril sarcosina resultou na inativação de EUGT11 e somente um aumento mínimo em RebD foi detectado quando LiAc/PEG foi aplicado (dados não mostrados). O tratamento com Triton X-100 a 0,3% ou 0,5%, no entanto, aumentou a quantidade de RebD acima dos níveis fundamentais (vide Figura 18) enquanto sustenta a atividade de EUGT11. Para ensaios Triton X-100, culturas de um dia para o outro foram lavadas três vezes em um tampão de PBS. As células correspondentes a 6 unidades OD600 foram ressuspensas em PBS contendo Triton X100 a 0,3% ou 0,5%, respectivamente. As células tratadas foram centrifugadas e incubadas 30 minutos a 30°C. Após o tratamento, as células foram lavadas em um tampão de PBS. As células correspondentes a 5 unidades OD600 foram usadas em um ensaio in vitro, conforme descrito para GST-EUGT11 e 0,6 unidades OD600 foram ressuspensas em um tampão de reação e incubadas de um dia para o outro a 30°C conforme descrito para as amostras tratadas com LS. As amostras não-tratadas foram usadas como controles.
[00485]Os lisatos de transformantes que expressam EUGT11 foram capazes de converter parte de RebA em RebD (8 a 50 μM foram medidos nas reações) quando as células não foram tratadas ou após o tratamento com LiAC/PEG ou Triton X100. No entanto, nenhum RebD foi medido em lisatos de péletes de célula tratados com LS. AS células permeabilizadas, porém, não-lisadas foram capazes de produzir algum RebD (1,4 a 1,5 μM medidos) quando tratadas com Triton X100 a 0,3% ou 0,5% (Figura 18) enquanto nenhum RebD foi encontrado nas amostras tratadas com LS ou LiAC/PEG. Esses resultados mostram que RebD pode ser produzida a partir de RebA usando, de modo biocatalítico, células completas e usando Triton X100 como o agente permeabilizante.
Exemplo 10 - Avaliação de sequências UGT códon-otimizadas
[00486]Aas sequências de codificação ótimas para UGT 91d2e, 74G1, 76G1, e 85C2 foram projetadas e sintetizadas para expressão de levedura usando duas metodologias, fornecidas por GeneArt (Regensburg, Alemanha) (SEQ ID NOs: 6, 2, 8, e 4, respectivamente) ou DNA 2.0 (Menlo Park, CA, EUA) (SEQ ID NOs: 84, 83, 85, e 82, respectivamente). As sequências de aminoácido de UGT 91d2e, 74G1, 76G1, e 85C2 (SEQ ID NOs: 5, 1, 7, e 3, respectivamente) não foram alteradas.
[00487]As sequências tipo selvagem, DNA 2.0, e GeneArt foram ensaiadas para atividade in vitro para comparar a reatividade em substratos nas trajetórias de glicosídeos de esteviol. UGTs foram inseridos em vetores multicópias (2μ) e expressados a partir de um constitutivo forte (GPD1) (vetores P423-GPD, P424-GPD, P425-GPD, e P426-GPD). Os plasmídeos foram transformados individualmente em uma cepa Watchmaker universal, EFSC301 (descrita no Exemplo 3 do documento WO2011/153378) e os ensaios foram realizados usando lisatos celulares preparados a partir de uma quantidade igual de células (8 unidades OD). Para as reações enzimáticas, 6 μL de cada lisato celular foram incubados em uma reação de 30 μL com 0,25 mM de esteviol (concentração final) para testar os clones UGT74G1 e UGT85C2, e com 0,25 mM de 13-SMG (13SMG) (concentração final) para testar os UGTs 76G1 e 91 D2e. Os ensaios foram realizados durante 24 horas a 30°C. Antes da análise LC-MS, um volume de DMSO a 100% foi adicionado a cada reação, as amostras foram centrifugadas em 16000g, e os sobrenadantes analisados.
[00488]Os lisatos que expressam os genes otimizados GeneArt proporcionaram níveis maiores de atividade UGT sob as condições testadas. Expressados como uma porcentagem da enzima tipo selvagem, os lisatos GeneArt mostraram uma atividade equivalente ao tipo selvagem para UGT74G1, 170% de atividade para UGT76G1, 340% de atividade para UGT85C2 e 130% de atividade para UGT91D2e. A utilização de UGT85C2 pode aperfeiçoar o fluxo geral e a produtividade de células para produção de Reb-A e Reb-D quando expressados em S. cerevisiae.
[00489]Conduziram-se experimentos adicionais para determinar se o UGT85C2 códon-otimizado poderia reduzir o acúmulo de 19-SMG e aumentar a produção de rubusosídeo e de glicosídeos de esteviol glicosilados superiores. A produção de 19-SMG e rubusosídeo foi analisada em um experimento de alimentação de esteviol da cepa BY4741 de S. cerevisiae que expressa o UGT74G1 tipo selvagem, bem como o UGT85C2 códon-otimizado a partir de vetores multicópias (2μ) sob um promotor constitutivo forte (GPD1) (vetores P426-GPD e P423-GPD, respectivamente). As amostras de cultura completa (sem remoção de célula) foram tomadas e fervidas em um volume igual de DMSO para níveis de glicosídeos totais. As concentrações intracelulares reportadas foram obtidas peletizando-se células, e ressuspendendo-se em DMSO a 50% ao volume da amostra de cultura original tomada, segunda por fervura. Então, o nível de glicosídeos “total” e o nível intracelular normalizado foram medidos usando LC-MS. Utilizando-se UGT74G1 tipo selvagem e UGT85C2 tipo selvagem, produziram-se aproximadamente 13,5 μM de rubusosídeo no total com uma concentração intracelular normalizada máxima de cerca de 7 μM. Em contrapartida, quando UGT74G1 tipo selvagem e UGT85C2 códon-otimizado foram usados, produziu-se um máximo de 26 μM de rubusosídeo, ou aproximadamente o dobro do que foi produzido utilizando-se o UGT85C2 tipo selvagem. Adicionalmente, a concentração intracelular normalizada máxima de rubusosídeo foi de 13 μM, novamente uma duplicação aproximada daquela produzida usando UGT85C2 tipo selvagem. A concentração intracelular de 19-SMG foi significativamente reduzida a partir de um máximo de 35 μM usando o UGT85C2 tipo selvagem a 19 μM usando o UGT85C2 códon-otimizado. Consequentemente, cerca de 10 μM a menos que o 19-SMG total foram medidos para o UGT85C2 códon- otimizado. Isto mostra que mais 19-SMG é convertido em rubusosídeo e confirma que o UGT85C2 tipo selvagem é um gargalo.
[00490]Durante a triagem de diversidade, outro homólogo de UGT85C2 foi constatado durante a clonagem cDNA de Stevia rebaudiana. O homólogo tem a combinação a seguir de polimorfismos de aminoácido conservados (em relação à numeração de aminoácido da sequência de codificação UGT85C de S. rebaudiana tipo selvagem apresentada no Número de Acesso AY345978.1): A65S, E71Q, T270M, Q289H e A389V. Este clone, denominado como UGT85C2 D37, foi expressado através de transcrição-translação in vitro acoplada de produtos PCR (kit TNT®T7 Quick para PCR DNA, Promega). O produto de expressão foi ensaiado para atividade de glicosilação usando esteviol (0,5 mM) como o aceptor de açúcar, conforme descrito no documento WO/2011/153378 com a exceção que os ensaios foram deixados incubar durante 24 horas. Conforme comparado ao ensaio de controle UGT85C2 tipo selvagem, a enzima D37 aparenta ter aproximadamente 30% a mais de atividade de glicosilação.
Exemplo 11 - Identificação de um KAH de S. rebaudiana inovador
[00491]Uma sequência parcial (Número de Acesso GenBank BG521726) foi identificada no banco de dados EST de Stevia rebaudiana como tendo certa homologia a um KAH de Stevia. A sequência parcial foi analisada por BLAST em relação a leituras de pirossequenciamento de Stevia rebaudiana brutas usando um software workbench principal CLC. As leituras que se sobrepõem parcialmente às extremidades da sequência parcial foram identificadas e usadas para aumentar o comprimento da sequência parcial. Isto foi realizado várias vezes até que a sequência abrangesse tantos os códons de partida como os códons de parada. A sequência completa foi analisada para mutações frameshift e substituições nucleotídicas que podem ter sido introduzidas analisando-se por BLAST a sequência completa em relação às leituras de pirossenquaneciamento brutas. A sequência resultante foi designada como SrKAHe1. Vide a Figura 12.
[00492]A atividade do KAH codificado por SrKAHe1 foi avaliada in vivo em uma cepa CEN.PK 111-61A fundamental de S. cerevisiae, que expressa os genes que codificam as enzimas que constituem toda a trajetória biossintética a partir dos metabólitos secundários de levedura de isopentenil pirofosfato (IPP) e farnesil pirofosfato (FPP) até esteviol-19-O-monosídeo, exceto pela enzima de esteviol sintase que converte ácido ent-caurenóico em esteviol.
[00493]Em resumo, a cepa CEN.PK 111-61A de S. cerevisiae foi modificada para expressar um GGPPS de Aspergillus nidulans, um CDPS 150nt de Zea mays truncado (com um novo códon de partida, vide abaixo), um KS de S. rebaudiana, um KO de S. rebaudiana e o UGT74G1 de S. rebaudiana a partir de cópias de gene cromossomicamente integradas, com promotores de levedura de TPI1 e GPD1 conduzindo a transcrição. A cepa de levedura CEN.PK 111-61A que expressa todos esses genes foi designada como EFSC2386. Portanto, AA cepa EFSC2386 continha os seguintes genes integrados: Geranil pirofosfato sintase (GGPPS) de Aspergillus nidulans; difosfato de ent-copalil sintase (CDPS) de Zea mays; caureno sintase (KS) de Stevia rebaudiana; caureno oxidase (KO) de Stevia rebaudiana; e UGT74G1 de Stevia rebaudiana; em combinação com a trajetória de IPP e FPP até esteviol-19-O- monosídeo, sendo uma esteviol sintase (KAH).
[00494]A expressão de diferentes esteviol sintases (a partir de plasmídeos de expressão epissomal) foi testada na cepa EFSC2386 em combinação com a expressão de vários CPRs (a partir de plasmídeos de expressão epissomal), e a produção de esteviol-19-O-monosídeo foi detectada pela análise LC-MS de extratos de amostra de cultura. Os ácidos nucléicos que codificam os CPRs foram inseridos no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo básico p426 GPD enquanto os ácidos nucléicos que codificam as esteviol sintases foram inseridos no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo básico p415 TEF (série de plasmídeo básico p4XX por Mumberg et al., Gene 156 (1995), 119-122). A produção de esteviol-19-O-monosídeo ocorre quando uma enzima de esteviol sintase funcional estiver presente.
[00495]Os KAHs que foram expressados a partir de plasmídeos de expressão epissomal na cepa EFSC2386 foram “indKAH” (Kumar et al, Número de Acesso DQ398871; Reeja et al., Número de Acesso EU722415); “KAH1” (esteviol sintase de S. rebaudiana de Brandle et al., Publicação de Patente U.S. No. 2008/0064063 A1); “KAH3” (esteviol sintase de A. thaliana de Yamaguchi et al., Publicação de Patente U.S. No.2008/0271205 A1); “SrKAHe1” (esteviol sintase S. rebaudiana clonada a partir do cDNA de S. rebaudiana conforme descrito anteriormente); e “DNA2.0.SrKAHe1” (sequência códon-otimizada (DNA2.0) que codifica esteviol sintase de S. rebaudiana, vide a Figura 12B).
[00496]Os CPRs que foram expressados a partir de plasmídeos de expressão epissomal na cepa EFSC2386 foram “CPR1” (citocroma P450 reductase dependente de NADPH de S. rebaudiana (Kumar et al., Número de Acesso DQ269454); “ATR1” (CPR de A. thaliana, Número de Acesso CAA23011, vide também a Figura 13); “ATR2” (CPR de A. thaliana, Número de Acesso CAA46815, vide também a Figura 13); “CPR7” (CPR de S. rebaudiana, vide a Figura 13, CPR7 é similar a “CPR1”); “CPR8” (CPR de S. rebaudiana, similar a CPR de Artemisia annua, vide a Figura 13); e “CPR4” (NCP1 de S. cerevisiae (Número de Acesso YHR042W, vide também a Figura 13).
[00497]A Tabela 13 proporciona os níveis de esteviol-19-O-monosídeo (μM) na cepa EFSC2386 com as várias combinações de esteviol sintases e CPRs.Tabela 13 Produção de 19-SMG
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[00498]Somente KAH3 e a esteviol sintase codificada por SrKAHe1 apresentaram uma atividade quando expressados em S. cerevisiae. A sequência SrKAHe1 códon-otimizada DNA2.0 que codifica esteviol sintase resultou em um nível de acúmulo de esteviol-19-O-monosídeo que tinha aproximadamente uma ordem de magnitude maior comparada a um KAH3 códon-otimizado quando foram co- expressados com CPRs ótimos. Nos experimentos apresentados neste exemplo, a combinação de CPR KAH1 e ATR2 não resultou na produção de esteviol-19-O- monosídeo.
Exemplo 12 - Pareamentos de CPRs e KO
[00499]A cepa EFSC2386 CEN.PK de S. Cerevisiae e os CPRs referidos neste Exemplo são descritos no Exemplo 11 (“Identificação de KAH de S. rebaudiana”). EFSC2386 continha os seguintes genes integrados: Geranil geranil pirofosfato sintase (GGPPS) de Aspergillus nidulans; difosfato de ent-copalil sintase (CDPS) de Zea mays; ent-caureno sintase (KS) de Stevia rebaudiana; e ent-caureno oxidase (KO) de Stevia rebaudiana. Esta cepa produz ácido ent-caurenóico que foi detectado pela análise LC-MS.
[00500]Uma coleção de citocroma P450 reductases (CPRs) foi expressada e testada na cepa EFSC2386; “CPR1” (citocroma P450 reductase dependente de NADPH de S. rebaudiana, Kumar et al., Número de Acesso DQ269454); “ATR1” (CPR de A. thaliana, Número de Acesso CAA23011); “ATR2” (CPR de A. thaliana, Número de Acesso CAA46815); “CPR7” (CPR de S. rebaudiana, CPR7 é similar a “CPR1”); “CPR8” (CPR de S. rebaudiana, similar a CPR de Artemisia annua; e “CPR4” (NCP1 de S. cerevisiae, Número de Acesso YHR042W).
[00501]A sobre-expressão do CPR nativo endógeno de S. cerevisiae (referido como CPR4 na Tabela 14), e, especialmente, a sobre-expressão de um dos CPRs de A. thaliana, isto é, ATR2, fornece uma boa ativação da caureno oxidase de Stevia rebaudiana (o último denominado como KO1 na Tabela 14) e resulta em um acúmulo aumento de ácido ent-caurenóico. Vide a Tabela 14, que apresenta a área sob a curva (AUC) do pico de ácido ent-caurenóico nos cromatogramas de LC-MS. KO1 é uma cepa de controle de levedura produtora de ácido ent-caurenóico sem uma sobre- expressão adicional de CPRs.Tabela 14 - Efeito de Diferentes Enzimas de Citocroma P450 Reductase com KO-1
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Exemplo 13 - Avaliação de KS-5 e KS-1 em trajetórias de esteviol
[00502]A cepa EFSC1972 de levedura é uma cepa CEN.PK 111-61A de S. cerevisiae que tem a trajetória biossintética a partir de IPP/FPP até rubusosídeo expressada por cópias de gene integradas que codificam GGPPS de Aspergillus nidulans (nome interno GGPPS-10), KS de Stevia rebaudiana (KS1, SEQ ID NO:133), KAH de Arabidopsis thaliana (KAH-3, SEQ ID NO:144), KO de Stevia rebaudiana (KO1, SEQ ID NO:138), CPR de Stevia rebaudiana (CPR-1, SEQ ID NO:147), CDPS de Zea mays de comprimento completo (CDPS-5, SEQ ID NO:158), UGT74G1 de Stevia rebaudiana (SEQ ID NO:1) e UGT85C2 de Stevia rebaudiana (SEQ ID NO:3). Adicionalmente, EFSC1972 tem uma regulação descendente da expressão genética ERG9 pelo deslocamento do promotor endógeno com o promotor CUP1 induzível por cobre.
[00503]Quando EFSC1972 for transformado com um plasmídeo à base de CEN/ARS que expressa o SrKAHe1 de Stevia rebaudiana a partir de um promotor TEF1, e simultaneamente transformado com plasmídeos à base de 2μ que expressa o GGPPS de Synechococcus sp (GGPPS-7) e uma versão truncada do CDPS de Zea mays (CDPS-5 truncado) a partir de um promotor GPD, o resultado é um produtor de S. cerevisiae com deficiência de crescimento de rubusosídeo (e 19-SMG). Esta cepa é referida como o “EFSC1972 aprimorado” no texto a seguir. Para determinar se a taxa de crescimento lenta é causada pelo acúmulo da trajetória tóxica do intermediário de difosfato de ent-copalil, uma coleção de genes de caureno sintase (KS) foi expressada na cepa “EFSC1972 aprimorado”, então, desenvolvida e a produção de glicosídeo de esteviol foi avaliada.
[00504]A expressão do KS de A. thaliana (KS5) resulta em um crescimento aperfeiçoado e na produção de glicosídeo de esteviol da cepa “EFSC1972 aprimorada”. Vide a Figura 16. O mesmo efeito positivo sobre o crescimento não pode ser alcançado por uma sobre-expressão adicional da caureno sintase de Stevia rebaudiana (KS-1) no EFSC1972 aprimorado (dados não mostrados).
Exemplo 14 - Cepa EFSC1859 de Levedura
[00505]A cepa EFSC1859 de Saccharomyces cerevisiae contém sequências de codificação GGPPS-10, CDPS-5, KS-1, KO-1, KAH-3, CPR-1 e UGT74G1 integradas no genoma e expressadas a partir de promotores GPD1 e TPI constitutivos fortes. Vide a Tabela 15. Além disso, o promotor endógeno para o gene ERG9 de levedura foi substituído pelo promotor CUP1 induzível por cobre para regulação descendente da esqualeno sintase ERG9. Em um meio de crescimento de levedura padrão, o gene ERG9 é transcrito em níveis muito baixos, visto que a concentração de cobre nesse meio é baixa. A redução na produção de ergosterol nesta cepa resulta em quantidades aumentadas de unidades de isopreno disponíveis para biossíntese de isoprenóide. Além disso, a cepa EFSC1859 também expressa UGT85C2 a partir de um vetor multicópia de 2 mícrons usando um promotor GPD1. EFSC1859 produz rubusosídeo e esteviol 19-O-glicosídeo.
[00506]O DNA CDPS de Zea mays, com e sem o peptídeo de sinal de cloroplasto, foi expressado a partir de um plasmídeo multicópia de 2 mícrons usando o promotor GPD. A sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácidos do CDPS de Zea mays são apresentadas na Figura 14. O peptídeo de sinal de cloroplasto é codificado pelos 1-150 e corresponde aos resíduos 1 a 50 da sequência de aminoácidos.Tabela 15
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[00507]O plasmídeo CDPS de comprimento completo EFSC1859 + maiz, e o plasmídeo CDPS truncado EFSC + maiz foram desenvolvidos em um meio de levedura seletivo com glicose a 4%. A produção de rubusosídeo e 19-SMG foi medida por LC-MS para estimar o nível de produção. A remoção da sequência líder de plastídeo não aparentou aumentar a produção de glicosídeo de esteviol comparada à sequência tipo selvagem, e demonstra que o peptídeo de trânsito de CDPS pode ser removido sem causar uma perda de biossíntese de glicosídeo de esteviol.
Exemplo 15 - Cepa EFSC1923 de Levedura
[00508]A cepa CEN.PK 111-61A de Saccharomyces cerevisiae foi modificada para produzir glicosídeos de esteviol pela introdução de enzimas de trajetória de glicosídeo de esteviol a partir de vários organismos. A cepa modificada foi designada como EFSC1923.
[00509]A cepa EFSC1923 contém um cassete de expressão genética sintase GGPP de Aspergillus nidulans na região intergênica PRP5-YBR238C de S. cerevisiae, um cassete de expressão genética CDPS de comprimento completo de Zea mays e um cassete de expressão genética CPR de Stevia rebaudiana na região intergênica MPT5-YGL176C, um cassete de expressão genética de caureno sintase e CDPS-de 1 de Stevia rebaudiana na região intergênica ECM3-YOR093C, um cassete de expressão genética KAH de Arabidopsis thaliana e KO de Stevia rebaudiana na região intergênica KIN1-INO2, um cassete de expressão genética UGT74G1 de Stevia rebaudiana na região intergênica MGA1-YGR250C e um cassete de expressão genética UGT85C2 de Stevia rebaudiana integrado deslocando-se o gene ORF TRP1. Vide a Tabela 15. Além disso, o promotor endógeno para o gene ERG9 de levedura foi substituído pelo promotor CUP1 induzível por cobre.
[00510]A cepa EFSC1923 produziu aproximadamente 5μM do glicosídeo de esteviol, esteviol 19-O-monosídeo, em um meio de levedura seletivo com glicose a 4%.
Exemplo 16 - Expressão de um CDPS truncado de maiz na cepa EFSC1923 de levedura
[00511]Os 150 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de codificação de CDP sintase de Zea mays na Tabela 15 (SEQ ID NO:157, vide a Figura 14) foram excluídos, o restante da sequência de codificação foi dotado de um novo ATG de partida de translação, e a sequência truncada foi operacionalmente ligada ao promotor GPD1 no plasmídeo multicópia p423GPD em EFSC1923 de Saccharomyces cerevisiae. O plasmídeo p423GPD é descrito em Mumberg, D et al, Gene, 156: 119122 (1995). EFSC1923 e EFSC1923 mais p423GPD-Z.m.tCDPS foram desenvolvidos durante 96 horas em um meio de levedura seletivo contendo glicose a 4%. A quantidade de esteviol 19-O-monosídeo produzida por EFSC1923 + p423GPD- Z.m.tCDPS (CDPS truncado de Zea mays) sob essas condições foi de aproximadamente 2,5 vezes maior que aquela produzida por EFSC1923 sem o plasmídeo.
[00512]A sequência de codificação KAH de Arabidopsis thaliana da Tabela 15 foi inserida em um plasmídeo multicópia designado como p426GPD, sob o controle do promotor GPD1. O plasmídeo p426GPD é descrito em Mumberg, D et al, Gene, 156: 119-122 (1995). Nenhuma diferença significativa foi observada entre a quantidade de esteviol 19-O-monosídeo produzida por EFSC1923 + p426GPD- A.t.KAH, e EFSC1923 sem o plasmídeo.
[00513]EFSC1923 foi transformado com p423GPD-Z.m.tCDPS e p426 p426GPD-A.t.KAH. De modo surpreendente, a quantidade de esteviol 19-O- monosídeo produzida sob essas condições por EFSC1923 abrigando ambos os plasmídeos (isto é, CDPS truncado de Zea mays e KAH de Arabidopsis) foi mais de 6 vezes maior que a quantidade produzida por EFSC1923 sozinho.
[00514]Um CDPS-KS bifuncional de Gibberella fujikuroi (Número de Acesso NCBI: Q9UVY5.1, Figura 15) foi clonado e comparado ao CDPS-5 truncado. O CDPS- KS de Gibberella bifuncional foi clonado em um plasmídeo 2μ com um promotor GPD e transformado com um plasmídeo que expressa o KAH-3 de Arabidopsis thaliana a partir de um plasmídeo à base de 2 μ de um promotor GPD no EFSC1923. Em estudos de agitação de frasco, o CDPS-KS bifuncional foi cerca de 5,8 vezes mais ativo na produção de esteviol 19-O-monosídeo do que a cepa EFSC1923 com o KAH-3 sozinho. No entanto, constatou-se que este é menos ótimo do que a combinação de KAH-3 e CDPS truncado sob as condições testadas. Portanto, construíram-se cepas adicionais com KS-5 e CDPS truncado.
Exemplo 17 - Toxicidade de intermediários
[00515]O efeito na vitalidade de S. cerevisiae da produção de geranil geranil pirofosfato (GGPP), difosfato de ent-copalil (CDP) ou ent-caureno foi investigado pela expressão de GGPPS de Synechococcus sp sozinho (produção de GGPP), o GGPPS e os 50 aminoácidos CDPS N-terminalmente truncados de Zea mays (vide o Exemplo 16) juntos (produção de CDP), ou o GGPPS, CDPS truncado e a caureno sintase (KS5) de Arabidopsis thaliana juntos (produção de ent caureno) nos fundamentos laboratoriais de cepa CEN.PK de S. cerevisiae. Os genes foram expressados a partir de plasmídeos 2μ com promotores GPD conduzindo a transcrição de CDPS truncado e KS5, enquanto a transcrição do GGPPS foi conduzida pelo promotor ADH1. Observou-se o crescimento de CEN.PK de S. cerevisiae transformado com várias combinações desses plasmídeos (GGPPS sozinho; GGPPS + CDPS truncado; ou GGPPS + CDPS truncado + KS5) ou plasmídeos sem elementos de inserção de gene. A produção de GGPP, e, especialmente, a produção de CDP, era tóxica a S. cerevisiae quando produzida como produtos finais. Curiosamente, ent-caureno aparentou não ser tóxico à levedura nas quantidades produzidas neste experimento.
Exemplo 18 - Interrupção da atividade de fosfatase endógena
[00516]Os genes DPP1 e LPP1 de levedura codificam as fosfatadas que podem degradar FPP e GGPP em farnesol e geranilgeraniol, respectivamente. O gene que codifica DPP1 foi excluído na cepa EFSC1923 (descrita no Exemplo 15) para determinar se houve um efeito sobre a produção de glicosídeo de esteviol. Quando esta cepa mutante dpp1 for adicionalmente transformada com um plasmídeo que expressa o CDPS de Z. mays desprovido de uma sequência de trânsito de cloroplasto (Exemplo 16), surgem transformantes pequenos e grandes. As cepas do tipo “colônia grande” produziram ~40% mais 19-SMG comparado ao tipo de “colônia pequena” e à cepa excluída não-DPP1, sob as condições testadas. Estes resultados indicam que a exclusão de DPP1 pode ter um efeito positivo sobre a produção de glicosídeo de esteviol e que a degradação de prenil pirofosfatos em levedura poderia influenciar negativamente a produção de glicosídeo de esteviol.
Exemplo 19 - Construção de uma cepa repórter de levedura geneticamente estável que produz glicosídeo de vanilina a partir de glicose com um gene SUC2 interrompido
[00517]Uma cepa de levedura que produz glicosídeo de vanilina a partir de glicose foi criada basicamente conforme descrito em Brochado et al. ((2010) Microbial Cell Factories 9:84-98) (cepa VG4), mas com uma integração adicional na região interlocus ECM3 no genoma de levedura de um cassete de expressão com EntD PPTase de E.coli controlado pelo promotor TPI1 de levedura (conforme descrito em Hansen et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75(9):2765-2774), interrupção de SUC2 substituindo-se a sequência de codificação por um cassete de expressão MET15, e interrupção de LEU2 substituindo-se a sequência de codificação por um cassete de expressão Tn5ble conferindo resistência à fleomicina. A cepa de levedura resultante foi denominada como V28. Esta cepa também codifica uma UDP-glicosiltransferase de A. thaliana recombinante (UGT72E2, Número de Acesso GenBank Q9LVR1) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 19 (SEQ ID NO:178).
Exemplo 20 - Expressão de transportador de sacarose e sacarose sintase em levedura que biossintetiza glicosídeo de vanilina
[00518]Um transportador de sacarose SUC1 de Arabidopsis thaliana foi isolado por amplificação PCR do cDNA preparado a partir de A. thaliana, usando uma polimerase PCR à prova de leitura. O fragmento PCR resultante foi transferido por digestão de restrição com SpeI e EcoRI e inserido na posição correspondente no vetor de expressão p416-TEF de levedura com número de cópia baixo (um vetor à base de CEN-ARS), a partir do qual o gene pode ser expressado a partir do promotor TEF forte. O plasmídeo resultante foi nomeado como pVAN192. A sequência do transportador de sacarose codificado é apresentada na Figura 19B (Número de Acesso GenBank AEE35247, SEQ ID NO:179).
[00519]Uma sacarose sintase SUS1 de Coffea arabica (Número de Acesso CAJ32596) foi isolada por amplificação PCR de cDNA preparado a partir de C. arabica, usando uma polimerase PCR à prova de leitura. O fragmento PCR foi transferido por digestão de restrição com SpeI e SalI e inserido na posição correspondente no vetor de expressão p425-GPD de levedura com número de cópia alto (um vetor à base de 2μm), a partir do qual o gene pode ser expressado a partir do promotor GPD forte. O plasmídeo resultante foi nomeado como pMUS55. A sequência do transportador de sacarose codificado é apresentada na Figura 19C (Número de Acesso GenBank CAJ32596; SEQ ID NO:180).
[00520]pVAN192 e pMUS55 foram introduzidos na cepa V28 de levedura por transformação genética, usando um protocolo de transformação de acetato de lítio, criando a cepa V28::pVAN192::pMUS55 de levedura. Uma cepa de controle foi produzida transformando-se V28 com os plasmídeos vazios P146-TEF e P425-GPD.
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[00521]Essas duas cepas de levedura foram desenvolvidas em culturas de 200 ml em frascos de agitação Erlenmeyer com 500 ml usando um meio de crescimento SC (Synthetic Complete) sem aminoácidos aromáticos suplementados com glicose a 2% e sacarose a 2% e ajustadas para um pH 5,0. As culturas foram incubadas em revolução moderada (150 rpm), a 30°C durante horas. Coletaram-se amostras em 72 horas, e o conteúdo de glicosídeo de vanilina determinado. Conforme se pode observar a partir da tabela abaixo, a produção de VG na cepa de controle (contendo plasmídeos vazios p416-TEF e p425-GPD) foi de 330 mg/L de VG, enquanto a cepa V28::pVAN192::pMUS55 de levedura que expressa sacarose sintase e o transportador de sacarose produziram 445 mg/l de VG, correspondente a um aumento de 34,8% na produção de VG.
[00522]Isto indica que a co-expressão de uma sacarose sintase e um transportador de sacarose com uma glicosiltransferase aumentou a capacidade de glicosilar um aglicon de molécula pequena, e a concentração do aglicon glicosilado foi significativamente aumentada. Neste caso, um aperfeiçoamento significativo em glicosilação de vanilina foi alcançado, resultando em um aumento significativo no título do produto final, vanilina-O-β-glicosideo.
Exemplo 21 - Cepas de Produção de Esteviol Glicosídeo Aperfeiçoadas Construção de Cepa de EFSC2763 de Saccharomyces cerevisiae
[00523]A cepa EFSC2763 de levedura é derivada de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae tipo selvagem contendo três modificações auxotróficas, isto é, as exclusões de URA3, LEU2 e HIS3. As genéticas da cepa foram estabilizadas e podem ser usadas como uma cepa de levedura diplóide ou haplóide regular. EFSC2763 foi convertido em um glicosídeo de esteviol produzindo levedura por integração genômica de quatro construções de DNA. Cada construção contém múltiplos genes que foram introduzidos no genoma de levedura por recombinação homóloga. Adicionalmente, as construções um e dois foram montadas por recombinação homóloga.
[00524]A primeira construção contém oito genes e é inserida no locus de DPP1 e interrompe e exclui parcialmente DPP1 (vide o Exemplo 18). O DNA inserido contém: o promotor TEF de A. gossypii que expressa o gene NatMX (marcador selecionável) seguido pelo terminador TEF de A. gossypii; UGT85C2 de S. rebaudiana códon-otimizado Gene Art (vide o Exemplo 10) expresso a partir do promotor GPD1 de levedura nativa e seguido pelo terminador CYC1 de levedura nativa; CPR-8 de S. rebaudiana (vide a Figura 13) expressada usando o promotor TPI1 seguido pelo terminador TDH1 de levedura nativa; caureno sintase de A. thaliana (KS-5, vide o Exemplo 13, SEQ ID NO:156) expressado a partir do promotor PDC1 e seguido pelo terminador FBA1 de levedura nativa; GGPPS de Synechococcus sp. (GGPPS-7) expressado usando o promotor TEF2 e seguido pelo terminador PFI1 de levedura nativa; KAHe1 de S. rebaudiana códon-otimizado DNA2.0 (vide o Exemplo 11, SEQ ID NO:165), expressado a partir do promotor TEF1 e seguido pelo terminador ENO2; KO-1 de S. rebaudiana expressado usando o promotor FBA1 e seguido pelo terminador TDH2 de levedura nativa; e CDPS truncado de Zea mays (vide o Exemplo 14) expressado usando o promotor PGK1 e seguido pelo terminador ADH2 de levedura nativa.
[00525]A segunda construção foi inserida no locus YPRCΔ15 e contém o promotor TEF de levedura nativa de A. gossypii na expressão dianteira do gene KanMX (marcador selecionável) seguido pelo terminador TEF de A. gossypii, o ATR2 de A. thaliana códon-otimizado Gene Art (vide a Figura 13B) expressada a partir do promotor PGK1 seguindo pelo terminador ADH2 de levedura, UGT74G1 de S. rebaudiana expressado a partir do promotor TPI1 seguido pelo terminador TDH1 de levedura, UGT76G1 de S. rebaudiana códon-otimizado Gene Art expressado a partir do promotor TEF1 seguido pelo terminador ENO2 de levedura, e UGT91D2e-b de S. rebaudiana códon-otimizado Gene Art (vide o Exemplo 6) expressado a partir do promotor GPD1 e seguido pelo terminador CYC1 de levedura.
[00526]A primeira e a segunda construções foram combinadas no mesmo clone de esporo por acasalamento e dissecção. Esta cepa de levedura foi subsequentemente transformada pelas construções três e quatro em dois eventos sucessivos.
[00527]A construção três foi integrada entre os genes PRP5 e YBR238C e continha o promotor TEF de A. gossypii na expressão do gene LEU2 de K. lactis seguido pelo terminador TEF de A. gossypii, o promotor GPD1 que expressa o KAHe1 S. rebaudiana DNA2.0-otimizado seguido pelo terminador CYC1, e o promotor TPI1 que expressa o CDPS truncado de Zea mays. A construção quatro foi integrada no genoma entre os a genes ECM3 e YOR093C com um cassete de expressão contendo o promotor TEF de A. gossypii que expressa o gene hph K. pneumoniae seguido pelo terminador TEF de A. gossypii, GGPPS de Synechococcus sp. expressado a partir do promotor GPD1 seguido pelo terminador CYC1, e o promotor TPI1 que expressa a caureno sintase de A. thaliana. Os quatro marcadores genéticos utilizados foram subsequentemente removidos.
[00528]Conforme analisado por LC-MS seguindo a extração de DMSO de glicosídeos de esteviol totais provenientes de células e caldo, EFSC2772 produz entre 40-50μM ou 2-3μM/OD600 de Rebaudiosídeo A, após um crescimento durante quatro dias em 3 ml de um meio SC (Synthetic Complete) a 30°C com agitação a 320 RPM em placas de poços profundos.
Construção de cepa de EFSC2772 de Saccharomyces cerevisiae
[00529]EFSC2772 é bastante similar à cepa 2763 com a exceção de que os marcadores genéticos não foram removidos, e a cepa for tornada prototrófica pela introdução dos dois plasmídeos p413TEF (plasmídeo transportador CEN/ARS de domínio público com um marcador HIS3) e p416-TEF (plasmídeo transportador CEN/ARS de domínio público com um marcador URA3) por transformação, e designado como EFSC2772.
[00530]Conforme analisado por LC-MS após a extração DMSO de glicosídeos de esteviol totais a partir de células e caldos, EFSC2772 produz níveis similares de Rebaudiosídeo A como 2763, após o crescimento em placas com poços mais profundos. Densidades ópticas maiores e títulos maiores foram obtidos através de um crescimento em processo descontínuo alimentado aeróbico em fermentadores de 2L (volume de trabalho) que incluíam uma fase de crescimento de ~16 horas no meio básico (meio Synthetic Complete) seguido por ~100 horas de alimentação com glicose utilizada como a fonte de carbono e energia combinada com metais residuais, vitaminas, sais, e Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) e/ou suplementação de aminoácido. O pH foi mantido mais próximo a 5 e o ponto de ajuste de temperatura foi de 30°C. Conforme evidenciado por LC-MS, as concentrações de produto celular e extracelular combinadas estavam entre 920 a 1660 mg/L de Reb-A e aproximadamente 300 a 320 mg/L de Reb-D nos dois experimentos diferentes, aproximadamente 700 mg/L de Reb-A foram detectados no caldo quando os resultados de título maior foram obtidos. Adicionalmente, observou-se um grande pico para Reb-B, e um indivíduo versado na técnica reconhecerá que cópias adicionais de UGT74G1 ou a regulação ascendente de UGT74G1 aumentarão ainda mais a conversão de RebB em RebA.
[00531]A cepa EFSC2743 foi produzida de maneira similar conforme anteriormente, mas sem os dois plasmídeos conferindo prototrofia e com a adição de um plasmídeo à base de p416 (CEN/ARS) que expressa EUGT11 a partir do promotor TEF. Esta cepa foi desenvolvida em uma fermentação de processo descontínuo alimentado conforme anteriormente. A cepa produziu uma quantidade total de RebD de 920 mg/L e, observou-se uma razão de aproximadamente 9:1 entre RebD e RebA. Aproximadamente 360 mg/L de RebD foram encontrados no caldo.
Exemplo 22 - Capacidade de UDP-glicose
[00532]No Exemplo 21, mostrou-se que a levedura pode se glicolisar completamente a 1 mM de esteviol, por exemplo, em RebD, RebB, e RebA. De modo similar, as cepas de Saccharomyces são capazes de se glicosilarem até 60 mM de outros produtos de molécula pequena (dados não mostrados). No entanto, o limite de glicosilação do sistema de regeneração de UDP-glicose nativo de levedura é desconhecido, ou a taxa na qual este preenche o pool de UDP-glicose necessário para a síntese de parede celular. Portanto, experimentos foram projetados para investigar se um aumento na produção de UDP-glicose aumentaria a taxa de glicosilação em levedura. Um mutante de exclusão suc2 foi transformado com plasmídeos abrigando o gene de A. thalianasuc1 que codifica um transportador de sacarose, UGT74G1 e SUS de A. thaliana. UGT74G1 pode se glicosilar rapidamente em esteviol 19-O-monoglicosídeo (19-SMG). Os transformantes foram pré- desenvolvidos de um dia para o outro em tubos de cultura de 13-ml contendo 4 ml de meio SC desprovido de leucina, histidina e uracila. No dia seguinte, as células correspondentes a 2 unidades OD600 foram giradas descendentemente e ressuspensas em 2 ml de meio fresco continham sacarose a 2% e ou 100 μM de esteviol. As culturas foram agitadas a 30°C durante 3 dias em tubos de cultura. Após 1, 3, 6, 21 e 46 horas, coletaram-se alíquotas. As alíquotas de 100 μl de cultura foram giradas descendentemente e um volume igual de DMSO foi adicionado. As amostras foram centrifugadas, aquecidas a 80°C durante 15 minutos, centrifugadas, e o conteúdo de 19-SMG analisado por LC-MS. Nenhuma diferença na taxa de glicosilação de esteviol foi observada entre as cepas tipo selvagem e aumentadas por SUS1 nos pontos de tempo testados. Isto sugere que a glicosilação de esteviol por UGT74G1 procede em uma taxa menor em que a UDP-glicose é regenerada pela levedura e que a UDP-glicose adicional pode não ser necessária para alcançar altos títulos de glicosilação de molécula pequena in vivo. Todavia, o uso de um SUS para reciclar UDP-glicose in vitro é mostrado no Exemplo 8 e, portanto, espera-se que seu uso em um sistema in vivo aumente a taxa de produção de glicosídeos de esteviol, se a UDP-glicose dever se tornar limitante.
Exemplo 23 - Produção de Reb-C e Reb-F in vivo a partir de glicose Produção de RebC a partir de esteviol
[00533]Os experimentos anteriores (Publicação No. WO/2011/153378) mostraram que RHM2 de Arabidopsis thaliana recombinantemente expressado (ramnose sintetase, tag locus AT1G53500) é capaz de converter UDP-glicose em UDP-ramnose. Esta UDP-ramnose pode ser usada para produzir esteviol-13-O- glicopiranosil-1,2-ramnosídeo, quando incubado com UGT91D2e e esteviol-13-O- monoglicosídeo in vitro.
[00534]Conduziram-se experimentos adicionais para confirmar a produção de RebC a partir de esteviol expressando-se todos os 4 UGTs e o RHM2 em levedura in vivo, seguido pela alimentação de esteviol. A cepa EFSC301 (MAT alfa, lys2ADE8 his3ura3leu2trp1) foi transformada com os plasmídeos a seguir que expressam sequências genéticas tipo selvagem: p424GPD que expressam UGT74G1 tipo selvagem (Número de Acesso: AY345982); p423GPD que expressam 85C2 tipo selvagem (Número de Acesso: AY345978.1); e um plasmídeo derivado de p426GPD que expressa UGT76G1 tipo selvagem (Número de Acesso: AY345974) e UGT91D2e sob os promotores GPD. O plasmídeo p425GPD que expressa RHM2 ou um plasmídeo de controle p425GPD vazio foi co-transformado com os UGTs. Os transformantes foram pré-desenvolvidos de um dia para o outro em tubos de cultura de 13 mL contendo 2 a 3 ml de meio SC desprovido de leucina, histidina, triptofano e uracila. No dia seguinte, após o crescimento ter alcançado 0,4 unidade OD600, as células foram giradas descendentemente, ressuspensas em um meio fresco contendo 25 μM de esteviol e agitadas a 30°C durante 3 dias em tubos de cultura. Uma alíquota de 100 μl de cultura foi girada descendentemente. Um volume igual de DMSO foi adicionado ao sobrenadante desta amostra enquanto 200 μl de DMSO a 50% foram adicionados ao pélete. As amostras foram centrifugadas, aquecidas a 80°C durante 15 minutos, centrifugadas, e o teor de glicosídeo de esteviol analisado por LC-MS. RebC foi detectado em um meio de crescimento e extratos celulares somente quando o gene RHM2 foi co-expressado com os UGTs. A quantificação mostrou que quantidades aproximadamente iguais de RebA e RebC foram produzidas. Isto mostra que RHM2 é capaz de produzir quantidades significativas de UDP-ramnose in vivo e que UGT91D2e é capaz de uma ramnosilação eficiente in vivo. Dois outros compostos foram observados através de LC-MS com tempos de retenção de 5,64 e 5,33 minutos e razões m/z correspondentes a esteviol com 1 glicose- e 1 ramnose (esteviol-1,2 ramnobiosídeo), e 2 glicoses- e 1 ramnose (Dulcosídeo A), respectivamente. Isto sugere que os UGTs restantes na trajetória de glicosídeo de esteviol sejam capazes de aceitar intermediários ramnosilados, isto é, a etapa de ramnosilação não precisa ocorrer por último.
[00535]Além disso, conduziu-se uma série de experimentos in vitro sequenciais para determinar se alguma reação terminal ocorreu na trajetória de rebaudiosídeo C. Vide a Figura 2B. Por exemplo, a atividade de ramnosilação de UGT91D2e em rubusosídeo e a conversão subsequente do produto em RebC por UGT76G1 foi demonstrada usando reações in vitro. Neste experimento, UGT91D2e e RHM2 recombinantemente expressados em E. coli e purificados foram incubados de um dia para o outro com rubusosídeo, NADPH, NAD+ e UDP-glicose. A mistura de reação foi subsequentemente fervida para desnaturar as enzimas. Uma alíquota da reação foi adicionada a uma preparação de enzima de UGT76G1 com UDP-glicose. A rubusosídeo foi convertida na presença de UGT91D2e e RHM2 em um composto com m/z correspondente a esteviol com 2-glicoses e 1-ramnose. De modo subsequente, este composto foi convertido na presença de UGT76G1 em RebC, o que indica que o intermediário é Dulcosídeo A. Portanto, este experimento demonstra que UGT91D2e é capaz de ramnosilar rubusosídeo e que UGT76G1 é capaz de converter o produto em RebC.
[00536]De modo similar, mostrou-se através de reações in vitro a ramnosilação de 13-SMG por UGT91D2e (formando um composto de esteviol com uma glicose e uma ramnose) e a formação subsequente de um composto com 2 glicoses e 1 ramnose por UGT76G1. Este composto tem um tempo de retenção exclusivo (4,56 minutos) e imagina-se que seja esteviol 13-O-1,3-diglicosídeo-1,2- ramnosídeo. Este composto também foi observado quando esteviol foi alimentado à levedura que expressa os quatro UGTs e RHM2.
[00537]A partir dos dados atuais, mostra-se que UGT91D2e é capaz de ramnosilar 13-SMG e rubusosídeo. Mostrou-se, também, que UGT74G1 e UGT76G1 são capazes de metabolizar o composto ramnosilado produzido por UGT91D2e a partir de 13-SMG. Quando esses compostos forem incubados com o UGT restante (UGT74G1 ou UGT76G1 dependendo de qual UGT foi usado para a etapa anterior), forma-se RebC. Isto indica que a ordem de glicosilação é de pouca importância como UGT74G1 e UGT76G1 são capazes de glicosilar substratos ramnosilados.
Produção de RebC a partir de glicose
[00538]Os plasmídeos que expressam RHM2 e UGTs 76G1 e 91D2e foram transformados em um produtor de rubusosídeo estável, a cepa EFSC1923 (vide o Exemplo 15). Esta levedura é um derivado de CEN.PK 111-61A de Saccharomyces cerevisiae com os UGTs 85C2 (Número de Acesso: AY345978.1) e 74G1 (Número de Acesso: AY345982) integrados ao genoma, bem como modificações auxotróficas. Na cepa EFSC1923 (vide o Exemplo 15), a expressão de esqualeno sintase, que é codificada por ERG9, foi regulada descendentemente pelo deslocamento do promotor endógeno com o promotor CUP1 induzível por cobre. A cepa EFSC1923 também contém um cassete de expressão de GGPP sintase de Aspergillus nidulans (GGPPS- 10) na região intergênica de PRP5-YBR238C de S. cerevisiae, um cassete de expressão genética de CDPS de Zea mays de comprimento completo (CDPS-5) e CPR de Stevia rebaudiana (CPR-1) na região intergênica MPT5-YGL176C, um cassete de expressão genética de caureno sintase e CDPS de Stevia rebaudiana (KS- 1/CDPS-1) na região intergênica ECM3-YOR093C, um cassete de expressão genética KAH de Arabidopsis thaliana (KAH-3) e KO de Stevia rebaudiana (KO-1) na região intergênica KIN1-INO2, um cassete de expressão genética de UGT74G1 de Stevia rebaudiana na região intergênica MGA1-YGR250C e um cassete de expressão genética de UGT85C2 de Stevia rebaudiana integrado deslocando-se o gene TRP1 ORF20. Os genes de trajetória de esteviol inseridos são descritos na Tabela 11 do documento PCT publicado WO/2011/153378.
[00539]A cepa EFSC1923 foi transformada com um plasmídeo derivado de p423GPD que expressa as sequências UGT74G1 e UGT85C2 tipo selvagem usando promotores GPD e um plasmídeo derivado de p426GPD que expressa UGT76G1 tipo selvagem (Número de Acesso: AY345974) e UGT91D2e (vide SEQ ID NO:5) sob o controle de promotores GPD. O plasmídeo p425GPD que expressa RHM2 de Arabidopsis thaliana (tag locus de enzima AT1G53500) ou um plasmídeo de controle p425GPD vazio foi co-transformado. Os transformantes foram pré-desenvolvidos de um dia para o outro em tubos de cultura de 13-ml contendo 2-3 ml de um meio SC desprovido de leucina, histidina e uracila. No dia seguinte, quando a cultura alcançou um OD600 de 0,4 unidade, a mesma foi centrifugada, ressuspensa em um meio fresco, e agitada a 30°C durante 3 dias em tubos de cultura. 100 μl de cultura foram girados descendentemente; a volume equivalente de DMSO foi adicionado a um sobrenadante enquanto 200 μl de DMSO a 50% foram adicionados ao pélete. As amostras foram centrifugadas, aquecidas a 80°C durante 15 minutos, giradas descendentemente e o teor de glicosídeo de esteviol analisado por LC-MS.
[00540]As análises do meio e o teor intracelular normalizado desta cepa mostraram a produção de RebC. Aproximadamente 8 μM de RebC e 4 μM de RebA foram produzidos conforme determinado por LC-MS. Adicionalmente, os intermediários produzidos após a alimentação de esteviol não foram detectados neste experimento. O acúmulo de RebC foi estritamente dependente da expressão de RHM2. Este exemplo demonstra de novo uma biossíntese de RebC a partir de glicose.
Produção de glicosídeos de esteviol adicionais a partir de esteviol e glucose
[00541]Utilizando-se os mesmos plasmídeos à base de GPD descritos anteriormente, a cepa de produção de esteviol estável EFSC1923 contendo UGT74G1 e UGT85C2 foi transformada com os UGTs necessários para produzir RebB (UGT76G1 e UGT91D2e/EUGT11), RebE (UGT91D2e/EUGT11) e dulcosídeo A (RHM2, UGT91D2e/EUGT11). EUGT11 tipo selvagem (NCBI: NP_001051007), que se constatou ter uma atividade de diglicosilação maior, foi clonado em p424GPD para este experimento. Os transformantes foram pré-desenvolvidos de um dia para o outro em tubos de cultura de 13-ml contendo 2-3 ml de um meio SC desprovido de leucina, histidina, triptofano e uracila. No dia seguinte, após o crescimento ter alcançado 0,4 unidade OD600, as células giradas descendentemente, ressuspensas em um meio fresco contendo 25 μM de esteviol (exceto para os experimentos de glicose) e agitadas a 30°C durante 3 dias em tubos de cultura. Uma alíquota de 100 μL de cultura foi girada descendentemente. Um volume igual de DMSO foi adicionado ao sobrenadante desta amostra enquanto 200 μL de DMSO a 50% foram adicionados ao pélete. As amostras foram centrifugadas, aquecidas a 80°C durante 15 minutos, centrifugadas, e o teor de glicosídeo de esteviol analisado por LC-MS. As análises LC- MS confirmaram a produção in vivo de RebB, RebE, e Dulcosídeo A em S. cerevisiae a partir de glicose ou esteviol. Vide, por exemplo, as Figuras 2A e 2B. Uma concentração maior de glicosídeos de esteviol foi observada após a alimentação de esteviol (conforme julgado por cromatogramas).
Caracterização de intermediários de trajetória de RebF usando EUGT11.
[00542]As propriedades de xilosilação de UGT91D2e e EUGT11 foram comparadas in vitro. Utilizando-se UDP-xilose como o doador de açúcar, UGT91D2e foi previamente mostrado xilosilando esteviol-13-O-monoglicosídeo formando um intermediário fundamental em biossíntese de RebF (Publicação número WO/2011/153378). Experimentos in vitro similares que usam EUGT11 e UGT91D2e mostraram que esses UGTs são capazes de xilosilar rubusosídeo. Quando UGT91D2e for usado, a análise LC-MS mostra um novo pico com uma razão m/z correspondente a esteviol com 2 moléculas de glicose e 1 de xilose. Vide a Figura 26. Devido ao deslocamento no tempo de retenção, imagina-se que este pico corresponda à rubusosídeo xilosilada na 13-O-glicose. Quando EUGT11 for usado, a análise LC- MS mostra dois novos picos similarmente dimensionados no tempo de retenção 3,99 e 4,39 minutos com razões m/z correspondentes a esteviol com 2 glicoses e 1 xilose. Esses produtos correspondem mais provavelmente à rubusosídeo xilosilada em uma das duas posições -- 13-O-glicose ou 19-O-glicose.
Produção de RebF a partir de glicose
[00543]A produção in vivo de RebF requer a clonagem de UGD1 (UDP-glicose desidrogenase) e USX3 (ácido UDP-glicorônico descarboxilase) a partir de Arabidopsis para produção de UDP-xilose. UGD1 e UXS3 foram inseridos em um vetor multicópia (2μ), derivado de P425-GPD, contendo dois cassetes de expressão, e expressados a partir de promotores constitutivos fortes (TPI1 e GPD1, respectivamente). O plasmídeo foi transformado em uma cepa EFSC2763 produtora de RebA (descrita no Exemplo 21) e cultivado durante 3 dias em um meio de seleção (SC -leu). Os resultados de LC-MS mostram claramente a aparência de um novo pico no tempo de retenção 4,13 minutos com razões m/z correspondentes a esteviol com 3 glicoses e 1 xilose e identificados como RebF (com base em um padrão RebF comercial), bem como outros picos novos com razões m/z correspondentes a esteviol com 2 glicoses e 1 xilose (conforme anteriormente), indicando que UGT91D2e foi capaz de realizar xilosilação in vivo. Esses picos não foram observados nos controles negativos.
Exemplo 24 - Efeito da regulação descendente de esqualeno sintase (ERG9) usando um elemento de inserção heterólogo
[00544]Em uma levedura, como Saccharomyces cerevisiae, a trajetória de mevalonato produz uma série de intermediários de fosfato de isoprenóide na trajetória biossintética ao esqualeno (vide a Figura 20). A esqualeno sintase em levedura é ERG9. Vide o Número de Acesso GenBank P29704.2 para a esqualeno sintase de Saccharomyces cerevisiae; P36596 para a esqualeno sintase de Schizosaccharomyces pombe; Q9Y753 para a esqualeno sintase de Yarrowia lipolytica; Q9HGZ6 para a esqualeno sintase Candida glabrata; Q752X9 para a esqualeno sintase Ashbya gossypii; O74165 para a esqualeno sintase de Cyberlindnera jadinii; P78589 para a esqualeno sintase de Candida albicans; P38604 para a lanosterol sintase Saccharomyces cerevisiae; P37268 para a esqualeno sintase de Homo sapiens; P53798 para a esqualeno sintase de Mus musculus; e Q02769 para a esqualeno sintase de Rattus norvegicus. Vide a Figura 25 (SEQ ID NOs:192-202).
Introdução de uma estrutura stem-loop em 5’UTR do gene ERG9
[00545]A região promotora de ERG9 tipo selvagem foi substituída pela sequência promotora CYC1 e por uma sequência 5’UTR através de recombinação homóloga. A região 5’UTR contém uma sequência que pode formar uma estrutura também pode ser usada.
[00546]SEQ ID NO: 181 (elemento de inserção heterólogo 1): TGAATTCGTTAACGAATTC
[00547]SEQ ID NO: 182 (elemento de inserção heterólogo 2): TGAATTCGTTAACGAACTC
[00548]SEQ ID NO: 183 (elemento de inserção heterólogo 3): TGAATTCGTTAACGAAGTC
[00549]SEQ ID NO: 184 (elemento de inserção heterólogo 4): TGAATTCGTTAACGAAATT
[00550]Sem se ater a um mecanismo particular, o stem-loop pode bloquear parcialmente a varredura ribossômica direcionada 5’-3’ para AUG e reduzir a translação da transcrição. Os stem-loops com diferentes graus de pareamento de base foram testados para encontrar os stem-loops que reduziram a translação de transcrição ERG9 suficientemente para regular os níveis FPP sem afetar o crescimento da cepa de levedura.
[00551]Os fragmentos de DNA que abrangem uma sequência promotora ERG9 a montante (para recombinação homóloga), um cassete de expressão para o gene (NatR) que confere resistência à Nourseotricina, um promotor CYC1 (SEQ ID NO: 185, Figura 21), uma sequência 5’ UTR com uma estrutura stem-loop, e uma sequência ERG9 ORF (para recombinação homóloga) foram gerados por PCR. Os fragmentos de DNA que continham o promotor CYC1 ou o promotor KEX2 (SEQ ID NO: 186), mas não stem-loops também foram gerados como controles. As sequências ERG9 de flanqueamento para recombinação, bem como a estrutura stem-loop foram introduzidas através de PCR oligos. Uma visão geral da construção para recombinação homóloga é mostrada na Figura 22. Os fragmentos de DNA foram transformados em uma cepa de hospedeiro de S. cerevisiae que foi subsequentemente selecionada placas de crescimento contendo nourseotricina. Os clones com uma troca bem sucedida do promotor ERG9 nativo pelo promotor CYC1 e uma sequência 5’UTR contendo stem-loop foram identificados. A visão geral e a sequência da região de stem-loop são proporcionadas na Figura 23. A sequência identificada como 5% corresponde ao elemento de inserção heterólogo tendo SEQ ID NO:181; a sequência identificada como 20% corresponde ao elemento de inserção heterólogo tendo SEQ ID NO:182; e a sequência identificada como 50% corresponde ao elemento de inserção heterólogo tendo SEQ ID NO:183.
Avaliação do acúmulo de FPP (efeito de regulação)
[00552]O gene Amorfa-4,11-dieno Sintase (ADS) gene catalisa a reação química que transforma uma molécula FPP em Amorfa-4,11-dieno na planta Artemisia annua. O gene é funcional e eficiente em S. cerevisiae e pode ser usado para avaliar indiretamente o acúmulo de FPP nas cepas com a estrutura stem-loop introduzida no 5’UTR heterólogo do gene ERG9. Um ácido nucléico códon-otimizado de S. cerevisiae que codifica ADS (Número de Acesso GenBank AAF61439) foi clonado em um plasmídeo multicópia (2μ) sob o controle do promotor PGK1 e transformado em cepas de S. cerevisiae tipo selvagem e modificadas por engenharia genética. A produção de amorfa-4,11-dieno foi medida e comparada ao composto padrão cariofileno, conforme descrito por (Ro et al. 2006. Nature 440(7086):940-943; Paradise et al. Biotechnol Bioeng. 2008 Jun 1;100(2):371-8; Newman et al. Biotechnol Bioeng 95(4):684-691).
Produtos Químicos
[00553]Dodecano e cariofileno foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA). As Misturas Suplementares Completas para formulação de um meio Synthetic Complete (SC) foram adquiridas junto a Formedium (UK). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich.
Cultivo de levedura
[00554]As cepas de levedura modificadas por engenharia genética foram desenvolvidas em um SC com glicose a 2% com uracila removida. As culturas foram desenvolvidas a 30°C de um dia para o outro e, então, usadas para inocular as culturas principais em frascos de agitação de 250 mL contendo 25 mL de um meio SC, e desenvolvidas até uma densidade óptica de 0,1 a 600 nm. As culturas principais foram desenvolvidas durante 72 horas a 30°C. Devido ao fato de o amorfadieno em concentrações muito baixas ser volátil a partir de culturas aquosa, adicionaram-se 2,5 mL de dodecano a cada frasco de cultura para aprisionar e reter o amorfadieno produzido. 10 μl da camada de dodecano foram amostrados e diluídos 100 vezes em acetato de etila para quantificação por GC-MS.
Análise GC-MS de amorfadieno
[00555]GC-MS foi usado para medir a produção de amorfadieno a partir de culturas de levedura. As amostras foram analisadas usando o método a seguir: O programa de temperatura de forno GC usou 80°C durante 2 minutos, seguido por uma elevação de 30°C/min até 160°C, então, 3°C/min até 170°C, e, finalmente, 30°C/min até 300°C com uma permanência final de 2 minutos. As temperaturas do injetor e do detector quadripolar MS foram de 250°C e 150°C, respectivamente. Injetou-se 1μL em um modo sem divisão. MS foi operado em um modo de varredura completa. A concentração de amorfadieno foi calculada em equivalentes de (-)-tran-cariofileno usando uma curva padrão de cariofileno usando os íons totais.
[00556]A análise das diferentes cepas, incluindo as diferentes construções de promotor, mostrou uma produção aumentada de amorfadieno ((2,5 x) ao usar o elemento de inserção heterólogo tendo a sequência nucleotídica apresentada em SEQ ID NO: 181 comparada a nenhum elemento de inserção ou a elementos de inserção tendo as sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO:182 e 183. Vide a Figura 24. O elemento de inserção heterólogo apresentado em SEQ ID NO:181 tem a estrutura secundária mais estável. Por motivos de comparação, a levedura tipo selvagem, com ERG9 não-modificado, também foi analisada (Figura 24: CTRL-ADS) e esta cepa mostrou uma produção ainda menor de amorfadieno. Em contrapartida, a construção que compreende o promotor ScKex2 muito fraco mostrou um nível de amorfadieno ainda maior (6 x).
Exemplo 25 - Análise do efeito de regulação descendente de Esqualeno Sintase (ERG9) e sobre-expressão de GGPPS na produção de GGPP. Avaliação do acúmulo de GGPP
[00557]S. cerevisiae contém um GGPPS (BTS1). Além do BTS1, existem várias enzimas GGPPS heterólogas que são funcionais e eficientes em S. cerevisiae. Quando um GGPPS funcional for sobre-expressado em S. cerevisiae, isto leva ao acúmulo de GGPP, que pode ser convertido em geranilgeraniol (GGOH) pelas enzimas DPP1 e LPP1 de S. cerevisiae. GGOH é parcialmente exportado ao meio de cultura de levedura. GGOH pode ser medido por GC-MS e seu acúmulo pode ser indiretamente usado para avaliar o pool potência de GGPP que está disponível para enzimas que usam GGPP como substrato.
[00558]Avaliaram-se quatro diferentes GGPPSs (GGPPS-1 (S.acidicaldarius, vide a Tabela 7), GGPPS-2 (A.nidulans, Figura 25, SEQ ID NO:203), GGPPS-3 (S. cerevisiae, BTS1, Figura 25, SEQ ID NO:167), e GGPPS-4 (M.musculus, vide a Tabela 7)). As sequências de nucleotídeo que codificam GGPPS-1, GGPPS-2, e GGPPS-4 foram códon-otimizadas em S. cerevisiae. Todos os ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos GGPPS foram clonados em um plasmídeo multicópia (2μ) sob o controle do promotor PGK1 e transformados em duas cepas ERG9 reguladas descendentemente diferentes: KEX2-ERG9 e CYC1(5%)-ERG9 (vide o Exemplo 24).
[00559]As cepas de levedura modificadas por engenharia genética foram desenvolvidas em um SC com glicose a 2% com uracila removida. As Misturas Suplementares Completas para formulação de um meio Synthetic Complete (SC) foram adquiridas junto a Formedium (UK). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA). Todas as medições de densidade óptica foram realizadas em OD 600nm. As culturas foram desenvolvidas a 30°C de um dia para o outro e, então, usadas para inocular 250 ml de frascos não- aletados contendo 25 ml de um meio SC em um OD600 de 0,1. As culturas principais foram desenvolvidas durante 72 horas a 30°C.
[00560]Para medir o acúmulo de GGOH, as cepas de levedura (pélete) e o meio de cultura de levedura (sobrenadante) foram extraídos separadamente e, então, combinados antes da análise por GC-MS. O sobrenadante foi extraído com Hexano em uma razão 1:1. O pélete foi primeiramente submetido a uma saponificação em solução contendo KOH a 20%e Etanol a 50%e as células lisadas foram finalmente extraídas com Hexano em uma razão 1:1. O programa de temperatura de forno GC foi de 80°C durante 2 minutos, seguido por uma elevação até 160°C a 30°C/min, então, até 170°C a 3°C/min e, finalmente, até 300°C a 30°C/min com uma permanência de 2 minutos. As temperaturas do injetor e do detector quadripolar MS foram de 250°C e 150°C, respectivamente. Injetaram-se 2μL em um modo sem divisão. MS foi operado em um modo de varredura completa.
[00561]Quando o GGPPS foi sobre-expressado na cepa CYC1(5%)-ERG9 ou na cepa KEX2-ERG9, houve um aumento significativo na produção de GGOH (GGPP) observado com todos os quatro polipeptídeos GGPPS comparados ao controle onde nenhum GGPPS foi expressado. De modo notável, a cepa CYC1(5%)-ERG9 mostrou um acúmulo de GGOH (GGPP) de 2 a 4 vezes maior do que a cepa KEX2-ERG9. Os resultados são mostrados na Figura 26.
OUTRAS MODALIDADES
[00562]Deve-se compreender que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior é destinada a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens, e modificações se encontram no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (6)

1. Hospedeiro recombinante CARACTERIZADO pelo fato de que expressa um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 152; o dito hospedeiro expressando ainda um ou mais dentre: (a) um polipeptídeo UGT85C tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3; (b) um polipeptídeo UGT76G tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7; (c) um polipeptídeo UGT74G1 tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; (d) um homólogo funcional de UGT91D2 tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5; (e) um polipeptídeo esteviol sintase (KAH) tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 142 a 146 ou 164; (f) um polipeptídeo difosfato de ent-copalil sintase (CDPS) tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 129 a 131 ou 158; (g) um polipeptídeo caureno oxidase (KO) tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 138 a 141; (h) um polipeptídeo caureno sintetase (KS) tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 132 a 135 ou 156; ou (i) um polipeptídeo difosfato de geranilgeranil sintetase (GGPPS) tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 121 a 128, em que o hospedeiro é capaz de produzir um ou mais glicosídeos de esteviol e, em que o hospedeiro recombinante é um microrganismo recombinante, tal como uma bactéria ou levedura.
2. Hospedeiro recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo CDPS é desprovido de um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
3. Hospedeiro recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito hospedeiro recombinante expressa ainda uma CDPS e KS bifuncional tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 162.
4. Hospedeiro recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o hospedeiro é um microrganismo consistindo em um Saccharomyces cerevisiae ou Escherichia coli.
5. Método para produzir um glicosídeo de esteviol CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) cultivar o hospedeiro recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em um meio de cultura, sob condições nas quais os polipeptídeos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, são expressos; e (b) recuperar o dito glicosídeo de esteviol produzido pelo dito hospedeiro recombinante do dito meio de cultura; em que o glicosídeo de esteviol compreende esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-1,2-biosídeo, esteviol-1,3-biosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, esteviosídeo, 1,3-esteviosídeo, rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A; em que o rebaudiosídeo D é produzido mediante a transferência de uma parte de glicose de um doador de açúcar para o rebaudiosídeo A.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o glicosídeo de esteviol produzido no hospedeiro recombinante acumula até pelo menos 1 mg/litro de meio de cultura, quando cultivado sob as ditas condições.
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