JP4284562B2 - Ｕｄｐ−キシロースの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、UDP-キシロースの合成に関与するするＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ（UDP-glucose dehydrogenase ）遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、該組み換えベクター及びＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）遺伝子を有する組換えベクターにより、形質転換された形質転換体、ならびに該形質転換体を利用したUDP-キシロース及びUDP-グルクロン酸の製造方法に関する。
糖タンパク質などの糖鎖は生体において、非常に重要な働きをしていることが明らかとなっており、このことから糖鎖の構造を自在に変換する糖鎖工学が重要技術となってきている。現在糖鎖を改変する技術としては、化学合成により目的の糖鎖を合成したものをタンパク質に結合させる化学的手法や、細胞が本来持つ内在性の糖鎖合成機能を遺伝子工学の手法を用いて目的の糖鎖に改変する、あるいは糖転移酵素そのものをタンパク質と反応させることで目的の糖タンパク質を得る生物学的手法などがある。化学的手法では、大量合成の手法に道が開けてきてはいるが、糖鎖の複雑性から、いまだに全ての種類の糖鎖を簡単に供給するには至ってはいない、また化学合成した糖鎖を効率良くかつ大量にタンパク質に結合させるのは困難である。一方、生物学的手法は、遺伝子工学の発展により、糖鎖合成関連遺伝子の発現及び機能を制御することが可能となったため、生物の細胞を用いた生体内での糖鎖改変が可能となってきている。また、糖鎖合成酵素を用いた生体外の糖鎖合成も非常に有用であり、均一で、大量の糖鎖の生産が可能となる。一方、生物学的手法を用いた生体内外での糖鎖合成では、糖ヌクレオチドが糖転移酵素の糖供与体として必須となるが、この糖ヌクレオチドは非常に高価であるので、大量生産に用いることは困難となっている。糖ヌクレオチドは、生体内に微量存在するものであり、かつ、高エネルギー結合で結ばれた非常に反応性に富む不安定な物質であるので、各生物においてその産生量はあまり多くないため大量に生産することは困難であるのが原因である。
近年、バクテリアを用いた生産系により、比較的多種類の糖ヌクレオチドの大量生産系が実用的なものへ近づいてきており、その供給は安定する方向へ向かっている。しかしながら、このバクテリアを用いる系では、２種の微生物を混合して、なおかつ、細胞中に含まれる一方の原料を他方の細胞中に送り込むために細胞を破壊した状況で生産を行うことから、ある程度反応過程の長いものでは生産量はそれほど多くなく、新たな手法の開発が求められている。また、バクテリアを用いた生産系によるUDP-キシロースの大量生産系に関する報告は無い。
糖ヌクレオチドのうち、UDP-キシロースはキシロース転移酵素の糖供与体としてキシロースを含んだ糖鎖合成を行う際には必須のものである。キシロースを含んだ糖鎖にはプロテオグリカンに代表されるように機能的に重要な役割を果たすことが多いことから、糖供与体の大量で安価な供給が望まれている。また、キシロースを含んだO-結合型糖鎖やある種の植物ホルモンにはキシロースが結合しているものがあり、これらの生合成にもUDP-キシロースが糖供与体として用いられる。よって今後、これらのキシロース含有物質の研究開発が進み重要な機能が明らかになることで新たな需要の拡大が見込まれる。このUDP-キシロースはUDP-グルコースから2段階の反応を2つの酵素で触媒し合成されることが報告されている（1, 2；(図１)）。 この２段階の反応を触媒する酵素は、最初の１段階目の反応であるUDP-グルコースから脱水反応を起こしてUDP-グルクロン酸に変換する反応を触媒するUDP-glucose dehydrogenaseと、UDP-グルクロン酸から脱カルボン酸反応を起こしてUDP-キシロースに変換する反応を触媒するUDP-glucuronic acid decarboxylaseの２つである。
これらの酵素は植物や、真核生物では線虫からヒトなどの高等哺乳類まで、UDP-キシロースを使用する生物であればもっている普遍的な酵素である。ただし、このような生物は合成したUDP-キシロースを使用していくため、細胞内にUDP-キシロースが蓄積していくことはない。このため、生物体からUDP-キシロースを単離する場合、その生産量は極めて低くかつ高価である。また、遺伝子工学的手法を用いてUDP-キシロースを合成した例は見あたらない。
1, Tenhaken R, Thulke O (1996) Cloning of an enzyme that synthesizes a key nucleotide sugar precursor of hemicellulose biosynthesis from soybean: UDP-glucose dehydrogenase. Plant Physiol 112:1127-1134
2, Harper AD, Bar-Peled M (2002) Biosynthesis of UDP-xylose. Cloning and characterization of a novel Arabidopsis gene familiy, UXS, encoding soluble and putative membrane-bound UDP-glucuronic acid decarboxylase isoforms. Plant Physiol 130:2188-219
これらの酵素は植物や、真核生物では線虫からヒトなどの高等哺乳類まで、UDP-キシロースを使用する生物であればもっている普遍的な酵素である。ただし、このような生物は合成したUDP-キシロースを使用していくため、細胞内にUDP-キシロースが蓄積していくことはない。このため、生物体からUDP-キシロースを単離する場合、その生産量は極めて低くかつ高価である。また、遺伝子工学的手法を用いてUDP-キシロースを合成した例は見あたらない。
1, Tenhaken R, Thulke O (1996) Cloning of an enzyme that synthesizes a key nucleotide sugar precursor of hemicellulose biosynthesis from soybean: UDP-glucose dehydrogenase. Plant Physiol 112:1127-1134
2, Harper AD, Bar-Peled M (2002) Biosynthesis of UDP-xylose. Cloning and characterization of a novel Arabidopsis gene familiy, UXS, encoding soluble and putative membrane-bound UDP-glucuronic acid decarboxylase isoforms. Plant Physiol 130:2188-219
本発明の課題は、多機能なキシロース付加糖鎖を合成するために必要なUDP-キシロースの効率のよい生産方法を確立し、より大量に供給することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のUDP-キシロース合成の際に前半の反応を触媒するUDP-glucose
dehydrogenase をコードする遺伝子(UGD1遺伝子)を初めて単離し、この遺伝子の構造を明らかにするとともに、この遺伝子を同じくシロイヌナズナのUDP-キシロース合成の後半の反応を触媒するUXS3遺伝子とともに共発現することによって、生体内および生体外で効率よくUDP-キシロースが合成されることを見いだし、本発明を完成させるに到った。
dehydrogenase をコードする遺伝子(UGD1遺伝子)を初めて単離し、この遺伝子の構造を明らかにするとともに、この遺伝子を同じくシロイヌナズナのUDP-キシロース合成の後半の反応を触媒するUXS3遺伝子とともに共発現することによって、生体内および生体外で効率よくUDP-キシロースが合成されることを見いだし、本発明を完成させるに到った。
すなわち、本発明は以下に示されるとおりである。
（１） 宿主細胞が、以下のＡ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組換えベクターと以下のＢ）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組み換えベクターとにより形質転換されている形質転換体であって、宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする、上記形質転換体。
Ａ）（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
Ｂ）（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（２） 請求項１（ａ）に記載のＤＮＡが配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする、上記（1）に記載の形質転換体。
（３） 上記（１）又は（２）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からＵＤＰ-キシロースを採取することを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（４） 上記（１）又は（２）に記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素をＵＤＰ-グルコースと接触させることにより、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（５） 上記（４）に記載の形質転換体の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ生産細胞の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とを同時に、ＵＤＰ-グルコースに作用させ、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（１） 宿主細胞が、以下のＡ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組換えベクターと以下のＢ）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組み換えベクターとにより形質転換されている形質転換体であって、宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする、上記形質転換体。
Ａ）（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
Ｂ）（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（２） 請求項１（ａ）に記載のＤＮＡが配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする、上記（1）に記載の形質転換体。
（３） 上記（１）又は（２）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からＵＤＰ-キシロースを採取することを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（４） 上記（１）又は（２）に記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素をＵＤＰ-グルコースと接触させることにより、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（５） 上記（４）に記載の形質転換体の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ生産細胞の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とを同時に、ＵＤＰ-グルコースに作用させ、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
本発明によれば、糖鎖において非常に重要な機能をもつキシロースの付加を行うために必須なUDP-キシロースを多量に効率よく生産することができる。現時点において糖タンパク質糖鎖を均一に合成する技術は確立されておらず、最終的には生体外での糖鎖の修飾を行うことで糖鎖の均一な合成を行うことが考えられるが、この際、糖供与体として糖ヌクレオチドは必須なものである。特に、キシロースにおいてはUDP-キシロースが非常に高価なため、生体外での修飾反応を大量に行うことは現在非現実的であるが、本発明により、多量のUDP-キシロースの供給が可能となれば、キシロースが付加された高機能な糖鎖の合成を生体外で行うことができる。したがって、本発明は糖タンパク質の糖鎖の研究において多大な貢献をするものである。
本発明における、シロイヌナズナのＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。また、本発明のシロイヌナズナのUGD1遺伝子は、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。具体的な塩基配列は、配列番号１に示されるが、これのみでなく、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであっても、ＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、本発明において使用できる。
本発明においては、上記シロイヌナズナのUGD1遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によりＵＤＰ-キシロースを効率よく生産可能であるが、この製造法には大別して生体内で生産する方法と生体外で生産する方法の２つがある。
本発明においては、上記シロイヌナズナのUGD1遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によりＵＤＰ-キシロースを効率よく生産可能であるが、この製造法には大別して生体内で生産する方法と生体外で生産する方法の２つがある。
このうち、UDP-キシロースを生体内で製造方法の概要は、下記の行程よりなる。
（１）シロイヌナズナのＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ（UDP-glucose dehydrogenase）遺伝子(以下、UGD1遺伝子という場合がある。)を取得する。
（２）シロイヌナズナUGD1遺伝子を発現用プラスミド等のベクターに導入し、UGD1遺伝子を発現するベクターを構築する。
（３）上記発現ベクターを、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）産生能を有する宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
上記ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ産生能を有する宿主細胞としては、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞でもよいし、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換された細胞でもよい。すなわち、該細胞内で、UGD1遺伝子産物（ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ）を発現させると共にUXS3遺伝子産物（ＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ）を活性を保ったまま発現させ、UDP-グルコースよりUDP-キシロースに変換する。UXS3遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ由来の遺伝子が挙げられ、該遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、具体的には配列番号３に示される塩基配列を有するが、これのみでなく、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含される。
（４）上記（３）の組換え体を培地に培養し、得られた培養物あるいは細胞破砕物等の培養処理物から抽出によりUDP-キシロースを採取し、さらに単離・精製する。
（１）シロイヌナズナのＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ（UDP-glucose dehydrogenase）遺伝子(以下、UGD1遺伝子という場合がある。)を取得する。
（２）シロイヌナズナUGD1遺伝子を発現用プラスミド等のベクターに導入し、UGD1遺伝子を発現するベクターを構築する。
（３）上記発現ベクターを、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）産生能を有する宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
上記ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ産生能を有する宿主細胞としては、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞でもよいし、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換された細胞でもよい。すなわち、該細胞内で、UGD1遺伝子産物（ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ）を発現させると共にUXS3遺伝子産物（ＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ）を活性を保ったまま発現させ、UDP-グルコースよりUDP-キシロースに変換する。UXS3遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ由来の遺伝子が挙げられ、該遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、具体的には配列番号３に示される塩基配列を有するが、これのみでなく、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含される。
（４）上記（３）の組換え体を培地に培養し、得られた培養物あるいは細胞破砕物等の培養処理物から抽出によりUDP-キシロースを採取し、さらに単離・精製する。
本発明において、UDP-キシロースを生体外で製造する方法は、下記の工程よりなる。
（１）シロイヌナズナのUDP-glucose dehydrogenase遺伝子(UGD1遺伝子)を取得する；
（２）シロイヌナズナUGD1遺伝子を発現用プラスミド等のベクターに導入し、UGD1遺伝子を発現するベクターを構築する；
（３）上記発現ベクターを、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）産生能を有する宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
上記ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ産生能を有する宿主細胞としては、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞でもよいし、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換された細胞でもよい。
すなわち、該細胞内で、UGD1遺伝子産物（ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ）を発現させると共にUXS3遺伝子産物（ＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ）を活性を保ったまま発現させる。
（４）上記の形質転換体の培養物、細胞破砕物等の培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素を酵素源とし、UDP-グルコースおよびNADHを添加することによりUDP-グルコースをUDP-キシロースに変換し、単離・精製を行う。該UDP-キシロースはキシロース含有糖鎖の合成の際に糖供与体として必須なものであるので、機能的に重要と思われる糖鎖へのキシロース付加の際に有用なものである。
（１）シロイヌナズナのUDP-glucose dehydrogenase遺伝子(UGD1遺伝子)を取得する；
（２）シロイヌナズナUGD1遺伝子を発現用プラスミド等のベクターに導入し、UGD1遺伝子を発現するベクターを構築する；
（３）上記発現ベクターを、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）産生能を有する宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
上記ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ産生能を有する宿主細胞としては、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞でもよいし、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換された細胞でもよい。
すなわち、該細胞内で、UGD1遺伝子産物（ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ）を発現させると共にUXS3遺伝子産物（ＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ）を活性を保ったまま発現させる。
（４）上記の形質転換体の培養物、細胞破砕物等の培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素を酵素源とし、UDP-グルコースおよびNADHを添加することによりUDP-グルコースをUDP-キシロースに変換し、単離・精製を行う。該UDP-キシロースはキシロース含有糖鎖の合成の際に糖供与体として必須なものであるので、機能的に重要と思われる糖鎖へのキシロース付加の際に有用なものである。
また別法として、シロイヌナズナUGD1遺伝子を含む発現用ベクターにより形質転換した形質転換体の培養物、培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素と、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞あるいはＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換体された細胞の培養物、培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素を、各々別途に調整し、これらを順次あるいは同時にＵＤＰ-グルコースに作用させて、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることにより、ＵＤＰ-キシロースを製造してもよい。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定および当該分野における通称または慣行に従うものとする。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定および当該分野における通称または慣行に従うものとする。
１．ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子（UGD1遺伝子）の単離
本発明のUGD1遺伝子の取得は、一般的手法に従ってシロイヌナズナから調製したcDNAライブラリを鋳型とし、PCR法により単離することができる。
本発明のUGD1遺伝子の取得は、一般的手法に従ってシロイヌナズナから調製したcDNAライブラリを鋳型とし、PCR法により単離することができる。
シロイヌナズナのcDNAライブラリは、通常用いられているプラスミドベクターまたはλファージ由来のベクターを用い、通常の方法に従い作成することができる。
PCR法は、生体外でDNAの特殊な領域を、そのセンス・アンチセンスプライマー、耐熱性のDNAポリメラーゼ、DNA増幅システム糖の組み合わせを用いて、約2-3時間で10-100万倍に特異的に増幅することができる技術であり、本発明遺伝子およびその断片は、他種の酵素との塩基配列の相同性等をもとに、このPCR法での増幅が可能である。
DNAを組み込むベクタターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用することができる。例えば大腸菌由来のプラスミドベクターpBR322やpUC19などを挙げることができる。
ベクターを組み込む方法としては、例えばT.Maniatisらの方法[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982)]に従うことができる。
ベクターを組み込む方法としては、例えばT.Maniatisらの方法[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982)]に従うことができる。
クローン化された遺伝子は、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結して発現ベクターを得ることができる。ベクターとしては、酵母由来のプラスミドYEp352GAP、YEp51、pSH19、などが挙げられる。
該遺伝子はその5'末端に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また、3'末端には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有してよい。また、5'末端あるいは3'末端に例えばヘマグルチニンタンパク質の一部分である標識抗原遺伝子やGSTタンパク質などの標識タンパク質遺伝子を結合させて発現させてもよい。さらに該遺伝子を発現させるためには、その上流にプロモータを接続するが、本発明で用いられるプロモーターとしては遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであれば、いかなるものでもよい。
また、形質転換する宿主が酵母である場合、ENO1プロモーター、GAL10プロモーター、GAPDHプロモーター、ADHプロモーターなどが挙げられる。
また、形質転換する宿主が酵母である場合、ENO1プロモーター、GAL10プロモーター、GAPDHプロモーター、ADHプロモーターなどが挙げられる。
このように構築されたUGD1遺伝子を有する組換えDNAを含むベクターを用いて、該ベクターを保持する形質転換体を作成する。
宿主としては、UDP-キシロースを生体内で消費しない出芽酵母(Saccharomyces
cerevisia)などが挙げられるが、この他UDP-キシロースを消費しない他の酵母(Pichia pastorisなど)などでもよい。また、酵母以外でも、UDP-キシロースの消費する酵素系を持たない宿主であればいかなるものでもよい。
また、細胞破砕物、酵素抽出物等を用い、生体外でUDP-キシロースを生産する場合、細胞質内で該遺伝子産物を生産することが可能な宿主であれば、いかなるものでも用いることができる。
上記形質転換体の作成は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。または一般的ではなくても適用可能な方法ならばよい。例として、宿主が酵母であれば、リチウム法あるいはエレクトロポレーション法により組み換えDNAを含むベクターを導入する。
また、例えば、ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼとＵＤＰ-グルクロン酸でカルボキシラーゼを共に産生する形質転換体を得る場合、UGD1遺伝子により形質転換される宿主は、あらかじめシロイヌナズナのUXS3遺伝子を有する組み換えDNAを含むベクターで形質転換されているか、あるいは本来的にUXS3遺伝子産物を発現しているものである必要がある。
宿主としては、UDP-キシロースを生体内で消費しない出芽酵母(Saccharomyces
cerevisia)などが挙げられるが、この他UDP-キシロースを消費しない他の酵母(Pichia pastorisなど)などでもよい。また、酵母以外でも、UDP-キシロースの消費する酵素系を持たない宿主であればいかなるものでもよい。
また、細胞破砕物、酵素抽出物等を用い、生体外でUDP-キシロースを生産する場合、細胞質内で該遺伝子産物を生産することが可能な宿主であれば、いかなるものでも用いることができる。
上記形質転換体の作成は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。または一般的ではなくても適用可能な方法ならばよい。例として、宿主が酵母であれば、リチウム法あるいはエレクトロポレーション法により組み換えDNAを含むベクターを導入する。
また、例えば、ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼとＵＤＰ-グルクロン酸でカルボキシラーゼを共に産生する形質転換体を得る場合、UGD1遺伝子により形質転換される宿主は、あらかじめシロイヌナズナのUXS3遺伝子を有する組み換えDNAを含むベクターで形質転換されているか、あるいは本来的にUXS3遺伝子産物を発現しているものである必要がある。
このようにして、UXS3遺伝子が発現され、なおかつUGD1遺伝子を有する組み換えDNAを含むベクターを保持する形質転換体が得られ、該形質転換体を培養することにより、主に該形質転換体の細胞内においてUDP-キシロースとUDP-キシロース製造に必要な酵素が産生、蓄積する。
形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は、それぞれの宿主について一般的に用いられているものを使用する。または、一般的でなくとも適用可能な培地ならばよい。例としては、宿主が酵母であればYPD培地、SD培地などを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。また、一般的でなくとも適用可能な条件であればよい。例としては、宿主が酵母であれば約25-37℃で、約12時間-5日間行い、必要により通気や撹拌を行うことができる。
例えば、上記培養物からUDP-キシロースあるいは酵素を抽出する際は、宿主細胞を遠心分離によって培地と分け、宿主細胞を破砕してUDP-キシロースあるいは酵素を抽出する。宿主が酵母の場合、例えばグラスビーズによって細胞を破壊し、遠心分離する。この際、酵素及びＵＤＰ-キシロースは、上清画分に存在する。
上記の遠心分離によって分離された上清画分からUDP-キシロースを分離する場合は、ゲルろ過法等により低分子量の画分を集め、さらにHPLCによる分離を行うことにより、精製単離する。
また、生体外で酵素変換反応を行い、ＵＤＰ-キシロースを製造する場合においては、上清画分に硫酸アンモニウムを75%の濃度に溶かし、これにより沈殿してくるタンパク質画分を集め、透析等により脱塩したものを酵素源として使用することができる。
上記の遠心分離によって分離された上清画分からUDP-キシロースを分離する場合は、ゲルろ過法等により低分子量の画分を集め、さらにHPLCによる分離を行うことにより、精製単離する。
また、生体外で酵素変換反応を行い、ＵＤＰ-キシロースを製造する場合においては、上清画分に硫酸アンモニウムを75%の濃度に溶かし、これにより沈殿してくるタンパク質画分を集め、透析等により脱塩したものを酵素源として使用することができる。
上記酵素源を用いて、基質となるUDP-glucoseもしくはUDP-glucuronic acidおよびNADHを加え反応させた後、HPLCでUDP-キシロースを単離精製することにより、UDP-キシロースを得ることができる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。
〔実施例１〕UGD1遺伝子の単離
シロイヌナズナのcDNAライブラリを用いてPCR法により遺伝子のクローニングを行った。cDNAライブラリはCLONTECH社のQUICK-Clone cDNAを用いた。プライマーの設計においては、制限酵素でタンパク質をコードしている部分が容易に切り出せるようにN-末端Eco RIサイト、C-末端部分にSal Iサイトに位置させ、また、N-末端には、あらかじめ標識抗原をコードするvsv-g配列を付加せしめた。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
AGAATTCATGTATACTGATATTGAAATGAATAGATTGGGTAAAATGGTGAAGATATGCTGCATAGGAG（配列番号５）
AAAAAAAGTCGACTCATGCCACAGCAGGCATATCCTTGAGCC（配列番号６）
PCRの条件は以下の通り。
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 2分
30サイクル
この条件で得られた約1.5 kbpのDNA増幅断片をアガロース電気泳動で分離した後、TAクローニングキットを用いてpGEM-5Z f(+)ベクターに挿入した。このクローニングされた遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認し、配列番号２に示した塩基配列であることを確認した。
シロイヌナズナのcDNAライブラリを用いてPCR法により遺伝子のクローニングを行った。cDNAライブラリはCLONTECH社のQUICK-Clone cDNAを用いた。プライマーの設計においては、制限酵素でタンパク質をコードしている部分が容易に切り出せるようにN-末端Eco RIサイト、C-末端部分にSal Iサイトに位置させ、また、N-末端には、あらかじめ標識抗原をコードするvsv-g配列を付加せしめた。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
AGAATTCATGTATACTGATATTGAAATGAATAGATTGGGTAAAATGGTGAAGATATGCTGCATAGGAG（配列番号５）
AAAAAAAGTCGACTCATGCCACAGCAGGCATATCCTTGAGCC（配列番号６）
PCRの条件は以下の通り。
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 2分
30サイクル
この条件で得られた約1.5 kbpのDNA増幅断片をアガロース電気泳動で分離した後、TAクローニングキットを用いてpGEM-5Z f(+)ベクターに挿入した。このクローニングされた遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認し、配列番号２に示した塩基配列であることを確認した。
〔実施例２〕UGD1遺伝子発現ベクターおよびUXS3遺伝子発現ベクターの作成およびこのプラスミドを含む酵母形質転換体の作成
pGEM-5Z f(+)ベクターに挿入されているUGD1遺伝子をEco RI及びSal Iで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターであるGAPDHとそのターミネーターの間にpUC18のマルチクローニングサイトのうちEco RIからSal Iまでの部分を持つ発現用ベクターYEp352GAP-IIのEco RI 及びSal Iサイトに挿入した。さらにこのベクターからGAPDHプロモーター、UGD1-vsv-g、GAPDHターミネーターの３つの部分を含む断片をBam HIを用いて切り出し、酵母の染色体組み込み型ベクターでありLUE2マーカーを持つpRS-305のBamHIサイトに挿入しpONJ-UGD1-vsv-gを構築した。UXS3遺伝子もUGD1と同様にPCRを用いてクローニングしたあとYEp352GAP-IIのEco RI 及びSal Iサイトに挿入した。さらにこのベクターからGAPDHプロモーター、pONJ-UXS3-c-myc、GAPDHターミネーターの３つの部分を含む断片をBam HIを用いて切り出し、酵母の染色体組み込み型ベクターでありTRP1マーカーを持つpRS-304のBamHIサイトに挿入しpONJ-UXS3-c-mycを構築した。また、C-末端にはあらかじめc-myc標識抗原遺伝子をプライマーに付加しておいた。これらの発現ベクターは、それぞれ単独あるいは２つ一緒に酵母のW303-1A株(ura3, lue2, his3, trp1,ade2)に導入し、３種の形質転換体、すなわち、UGD1遺伝子導入株（W303/pONJ-UGD1-vsv-g株）、UXS3遺伝子導入株（W303/pONJ-UXS3-c-myc株）並びにUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）を得た。なお、このうちUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに 受託日：２００６年２月２４日 受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５３８として寄託されている。
pGEM-5Z f(+)ベクターに挿入されているUGD1遺伝子をEco RI及びSal Iで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターであるGAPDHとそのターミネーターの間にpUC18のマルチクローニングサイトのうちEco RIからSal Iまでの部分を持つ発現用ベクターYEp352GAP-IIのEco RI 及びSal Iサイトに挿入した。さらにこのベクターからGAPDHプロモーター、UGD1-vsv-g、GAPDHターミネーターの３つの部分を含む断片をBam HIを用いて切り出し、酵母の染色体組み込み型ベクターでありLUE2マーカーを持つpRS-305のBamHIサイトに挿入しpONJ-UGD1-vsv-gを構築した。UXS3遺伝子もUGD1と同様にPCRを用いてクローニングしたあとYEp352GAP-IIのEco RI 及びSal Iサイトに挿入した。さらにこのベクターからGAPDHプロモーター、pONJ-UXS3-c-myc、GAPDHターミネーターの３つの部分を含む断片をBam HIを用いて切り出し、酵母の染色体組み込み型ベクターでありTRP1マーカーを持つpRS-304のBamHIサイトに挿入しpONJ-UXS3-c-mycを構築した。また、C-末端にはあらかじめc-myc標識抗原遺伝子をプライマーに付加しておいた。これらの発現ベクターは、それぞれ単独あるいは２つ一緒に酵母のW303-1A株(ura3, lue2, his3, trp1,ade2)に導入し、３種の形質転換体、すなわち、UGD1遺伝子導入株（W303/pONJ-UGD1-vsv-g株）、UXS3遺伝子導入株（W303/pONJ-UXS3-c-myc株）並びにUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）を得た。なお、このうちUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに 受託日：２００６年２月２４日 受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５３８として寄託されている。
〔実施例３〕UGD1タンパク質、UXS3タンパク質の酵母内での発現の確認
〔実施例２〕で得られた形質転換体について、それぞれの細胞内でタンパク質が発現されているかどうかをウエスタンブロッティングを用いて確認した。まず、上記３種の形質転換体〔W303/pONJ-UGD1-vsv-g株、W303/pONJ-UXS3-c-myc株、W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）およびW303株をSD培地で24時間30℃で培養し、得られた酵母細胞をガラスビーズで破砕した。得られた破砕物を遠心操作を用いて細胞壁画分及びミクロソーム画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。このタンパク質を含む細胞質画分を20mM Tris-HCl pH7.4に溶かし、タンパク質定量をBCAキットを用いて行った。それぞれ100μgのタンパク質をとってSDS-PAGEを行った後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、抗-vsv-g抗体もしくは抗c-myc抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図２)。その結果、UGD1遺伝子導入株（W303/pONJ-UGD1-vsv-g株）及びUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）ではUGD1タンパク質が、及びUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）ではUXS3タンパク質が発現していることが確かめられた。すなわちUGD1遺伝子とUXS3遺伝子が導入された形質転換体は、UGD1タンパク質とUXS3タンパク質と共発現していることが分かる
〔実施例２〕で得られた形質転換体について、それぞれの細胞内でタンパク質が発現されているかどうかをウエスタンブロッティングを用いて確認した。まず、上記３種の形質転換体〔W303/pONJ-UGD1-vsv-g株、W303/pONJ-UXS3-c-myc株、W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）およびW303株をSD培地で24時間30℃で培養し、得られた酵母細胞をガラスビーズで破砕した。得られた破砕物を遠心操作を用いて細胞壁画分及びミクロソーム画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。このタンパク質を含む細胞質画分を20mM Tris-HCl pH7.4に溶かし、タンパク質定量をBCAキットを用いて行った。それぞれ100μgのタンパク質をとってSDS-PAGEを行った後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、抗-vsv-g抗体もしくは抗c-myc抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図２)。その結果、UGD1遺伝子導入株（W303/pONJ-UGD1-vsv-g株）及びUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）ではUGD1タンパク質が、及びUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）ではUXS3タンパク質が発現していることが確かめられた。すなわちUGD1遺伝子とUXS3遺伝子が導入された形質転換体は、UGD1タンパク質とUXS3タンパク質と共発現していることが分かる
〔実施例４〕UDP-キシロース合成活性測定
UDP-キシロース活性測定は基質としてUDP-グルコースを、補助因子として5 mM NADHを用い、100 mM Tris-HCl、pH 7.4という条件で30℃、2時間反応を行い、フェノール：クロロホルム溶液 (24: 1) を加え撹拌した後、遠心分離を行い、上清を回収した。上清を0.2 マイクロメートルポアサイズのフィルターに通し、HPLCによりUDP-キシロースとUDP-グルコースの測定を行った。HPLCはC18カラムを用いて1%アセトニトリルを含む20 mMトリエチルアミン(pH 5.8) 溶液を1 ml/minで流して分離を行い、さらに、各分画についてＥＳＩ−ＭＳ測定を行った（図４）。その結果、UXS3タンパク質とUGD1タンパク質を共発現させたW303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-mycのみでUDP-キシロース合成活性を検出した(図３、４)。また、UGD1タンパク質のみを発現させたW303/pONJ-UGD1-vsv-g株では、UDP-グルクロン酸合成活性が検出された。なお、UXS3遺伝子のみ発現させたW303/pONJ-UXS3-c-myc株ではUDP-グルクロン酸を基質として用いた場合にのみＵＤＰ-キシロース合成活性が検出された。
UDP-キシロース活性測定は基質としてUDP-グルコースを、補助因子として5 mM NADHを用い、100 mM Tris-HCl、pH 7.4という条件で30℃、2時間反応を行い、フェノール：クロロホルム溶液 (24: 1) を加え撹拌した後、遠心分離を行い、上清を回収した。上清を0.2 マイクロメートルポアサイズのフィルターに通し、HPLCによりUDP-キシロースとUDP-グルコースの測定を行った。HPLCはC18カラムを用いて1%アセトニトリルを含む20 mMトリエチルアミン(pH 5.8) 溶液を1 ml/minで流して分離を行い、さらに、各分画についてＥＳＩ−ＭＳ測定を行った（図４）。その結果、UXS3タンパク質とUGD1タンパク質を共発現させたW303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-mycのみでUDP-キシロース合成活性を検出した(図３、４)。また、UGD1タンパク質のみを発現させたW303/pONJ-UGD1-vsv-g株では、UDP-グルクロン酸合成活性が検出された。なお、UXS3遺伝子のみ発現させたW303/pONJ-UXS3-c-myc株ではUDP-グルクロン酸を基質として用いた場合にのみＵＤＰ-キシロース合成活性が検出された。
Claims (5)
- 宿主細胞が、以下のＡ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組換えベクターと以下のＢ）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組み換えベクターとにより形質転換されている形質転換体であって、宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする、上記形質転換体。
Ａ）（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
Ｂ）（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項１（ａ）に記載のＤＮＡが配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の形質転換体。
- 請求項１又は２に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からＵＤＰ-キシロースを採取することを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
- 請求項１又は２に記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素をＵＤＰ-グルコースと接触させることにより、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
- 請求項４に記載の形質転換体の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ生産細胞の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とを同時に、ＵＤＰ-グルコースに作用させ、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、ＵＤＰ-キシロースの製造方法。
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