CN116121213A - 一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用 - Google Patents

一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种偶联酶及应用，涉及药用植物基因工程领域，偶联酶StCYP80A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有偶联酶功能的氨基酸序列，或者与该氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有偶联形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的蛋白质；一种共表达StCYP80A和CYP450还原酶StCPR的重组微生物；StCYP80A在催化或者制备BBI的应用；一种重组表达载体、重组微生物以及在制备StCYP80A中的应用。本发明公开了一种偶联酶StCYP80A及其编码基因，既能催化乌药碱形成单偶联的BBI，又能生成双偶联的BBI。

Description

一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用
技术领域
本发明涉及药用植物基因工程领域，尤其涉及一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用。
背景技术
防己为防己科Menispermaceae植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，具有利水消肿、祛风止痛的功效。防己中富含苄基异喹啉型生物碱(BIAs)，尤其是双苄基异喹啉型生物碱(Bisbenzylisoquinoline，BBI)。BBI为防己中的主要活性成分类型，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗心律失常、抗肿瘤等生物活性，代表性成分有粉防己碱、防己诺林碱。但是，目前防己野生资源匮乏，人工种植规模小，种植周期长，活性BBI的含量低，人工合成难度大，难以实现工业化生产，限制了其开发与应用。阐明防己中BBI的生物合成途径及其关键酶，可为利用生物技术生产BBI或提高植物中的目标成分含量奠定基础，也可为药材品质的形成提供理论依据。
通常认为，BBI的生物合成始自L-酪氨酸代谢转化为多巴胺和4-羟基-苯乙醛，接着依次由去甲乌药碱合酶(NCS)催化形成S-去甲乌药碱((S)-norcoclaurine)，6-氧甲基转移酶(6OMT)催化形成S-乌药碱((S)-coclaurine)，氮甲基转移酶(CNMT)催化形成S-N-甲基乌药碱((S)-N-methylcoclaurine)，然后在细胞色素P450酶CYP80A的作用下偶联形成形成其二聚体。在上述合成过程中，CYP80A是合成BBI骨架结构的关键酶。
目前，粉防己中功能明确的CYP80A尚未见报道，其他植物中经功能验证的仅有小檗属植物匍匐小檗(Berberis stolonifera)中发现的BsCYP80A1，即大叶小檗碱合酶(Berbamunine synthase)。BsCYP80A1可以催化(R)-和(S)-N-甲基乌药碱分子间C-O芳基偶联反应生成BBI。BsCYP80A1催化形成的产物为单偶联BBI，不能形成双偶联BBI。而粉防己中多种具有显著生物活性的BBI为双偶联的，包括粉防己碱、千金藤素、小檗胺、防己诺林碱，其中前3种化合物已经开发成药物。因此，发现能催化单苄基异喹啉形成双偶联BBI的CYP80A对粉防己中活性BBI的合成尤为重要，对于其他植物中的BBI合成也有着重要的理论及实际意义。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种能催化单苄基异喹啉形成双偶联BBI的酶及其应用。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种能催化单苄基异喹啉形成双偶联BBI的酶及其生成双苄基异喹啉型生物碱中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了一种偶联酶StCYP80A，包括：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的偶联酶；
(a2)将(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有偶联酶功能的蛋白质；
(a3)与(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有偶联单苄基异喹啉类生物碱形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的蛋白质。
进一步地，本发明的偶联酶蛋白来源于粉防己Stephania tetrandra，命名为StCYP80A。
进一步地，上述(a3)为来源于粉防己且具有偶联单苄基异喹啉类生物碱形成BBI的蛋白质。
本发明还提供了一种偶联酶StCYP80A的基因，包括：
(b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
(b2)将(b1)的DNA序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；
(b3)与(b1)的DNA序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80A蛋白的DNA分子；
(b4)(b1)的DNA序列经密码子优化后的序列如序列SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
进一步地，上述(b3)为来源于粉防己且具且编码CYP80A蛋白的DNA分子。
本发明还提供了一种的偶联酶StCYP80A基因的重组表达载体。
本发明还提供了一种的偶联酶StCYP80A基因的重组微生物。
进一步地，重组载体包括亚克隆载体以及酵母等微生物细胞表达载体；
进一步地，重组微生物包括酵母等微生物细胞。
本发明还提供了一种共表达重组微生物，该共表达重组微生物共表达偶联酶StCYP80A和CYP450还原酶StCPR；共表达重组微生物包括酵母体系，StCPR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示，经密码子优化后的编码基因如SEQ IDNO.6所示。
进一步地，上述CYP450还原酶(CYP450 Reductase,CPR)来源于粉防己Stephaniatetrandra，命名为StCPR，共表达StCYP80A和StCPR的酵母体系对苄基异喹啉生物碱的偶联产物转化率显著高于仅表达StCYP80A体系的转化率。
本发明还提供了一种偶联酶StCYP80A在催化两个单苄基异喹啉类生物碱分子偶联形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的应用。
进一步地，偶联酶StCYP80A催化两个单苄基异喹啉类生物碱分子间的C-O芳基偶联形成双苄基异喹啉型生物碱。
本发明还提供了一种偶联酶StCYP80A基因的重组表达载体在制备偶联酶StCYP80A中的应用。
本发明还提供了一种偶联酶StCYP80A基因的重组微生物在制备偶联酶StCYP80A中的应用。
本发明还提供了一种偶联酶StCYP80A的蛋白在制备双苄基异喹啉类生物碱中的应用。
上述基因、重组载体或重组菌在体外合成双苄基异喹啉类化合物中的应用均属于本发明的保护范围。
在本发明的较佳实施方式1中，详细说明粉防己中一种双苄基异喹啉生物碱合成酶(StCYP80A)及其编码基因的发现过程；
在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明酿酒酵母体内验证粉防己来源StCYP80A的功能的过程；
在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明酿酒酵母体内验证密码子优化后StCYP80A的功能的过程；
在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明密码子优化后StCYP80A微粒体蛋白提取与体外催化过程；
本发明有益的技术效果如下：
本发明公开了一种偶联酶StCYP80A及其编码基因。StCYP80A能催化乌药碱形成单偶联的BBI，而且可以生成双偶联的BBI，而已报道的且明确功能的BsCYP80A只能形成单偶联BBI。StCYP80A的发现为偶联单苄基异喹啉类生物碱形成BBI骨架提供了一种有效的酶促工具，对BBI的合成十分重要，尤其对具有活性的双偶联BBI的合成有着重要意义。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例2的酵母体系中未进行密码子优化的StCYP80A-1催化(R,S)-coclaurine形成偶联产物的LC-UV-MS检测的谱图；
图2是实施例3酵母体系中密码子优化的StCYP80A-2催化(R,S)-coclaurine形成偶联产物的LC-UV-MS以及LC-MS/MS分析色谱图；
图3是实施例3的StCYP80A-2催化(R,S)-乌药碱所得单偶联产物P1的二级质谱裂解机制图；
图4为实施例3的StCYP80A-2催化(R,S)-乌药碱所得双偶联产物P2的二级质谱裂解机制图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1、粉防己中一种双苄基异喹啉生物碱合成酶(StCYP80A)及其编码基因的发现
通过对粉防己根、叶组织进行转录组测序，获得粉防己转录组数据库。经过与NCBI、KEGG等公共数据的序列进行Blast筛选、序列比对等分析，挖掘到19条CYP80A候选序列。经过酿酒酵母异源表达，底物饲喂后确定其中一条蛋白具有催化两分子单苄基异喹啉生物碱形成C-O偶联的作用。将该蛋白命名为StCYP80A，其氨基酸如序列表的SEQ ID NO.1所示，由496个氨基酸组成。将编码StCYP80A蛋白的基因命名为StCYP80A基因，其开放阅读框cDNA序列如序列表的SEQ ID NO.2所示。
通过相同的方法，挖掘到1条粉防己中CYP450还原酶，将其蛋白命名为StCPR，由690个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表3的SEQ ID NO.3所示。将编码StCPR蛋白的基因命名为StCPR，其开放阅读框cDNA序列如序列表的SEQ ID NO.4所示。
实施例2、酿酒酵母体内验证粉防己来源StCYP80A的功能
验证步骤如下：
步骤一、构建异源表达质粒
粉防己来源的StCYP80A编为StCYP80A-1。设计含有质粒两端同源臂的引物(StCYP80A-1-F1与R1)，从粉防己cDNA样品中PCR扩增得到带同源臂的StCYP80A基因，回收纯化PCR产物。酿酒酵母游离型质粒pESC-Leu使用限制型内切酶NotⅠ和SacⅠ进行双酶切，胶回收线性化质粒。
引物序列StCYP80A-1-F1如SEQ ID NO.1所示:TCACTAAAGGGCGGCCGCATGGATCCAATCACACTG；引物序列StCYP80A-1-R1如SEQ ID NO.8所示:CGAAGAATTGTTAATTAAGAGCTCTTAAACCGCAGTTGCTG。
采用同源重组法构建重组质粒pESC-Leu-StCYP80A-1，热激法转化大肠杆菌DH10B，挑取抗氨苄青霉素的转化子，LB培养基扩增，提取质粒后依次进行PCR、酶切以及测序验证，最终获得测序正确的重组质粒pESC-Leu-StCYP80A-1。
步骤二、酵母重组菌株获得
采用Frozen-EZ yeast Transformation II kit酵母转化试剂盒将步骤一得到的重组质粒pESC-Leu-StCYP80A-1转化至酿酒酵母YPH499菌株。菌液涂布至缺陷型培养基SD-Leu平板，30℃静置培养2d后可挑取单菌落。同时转化空质粒至YPH499菌株得到空白对照菌。
步骤三、酵母全细胞催化
挑取步骤二中Leu缺陷型培养基平板上生长的重组酵母单菌落至液体缺陷型，挑取缺陷型平板上生长的单克隆菌落至15ml SD-Leu液体培养基，30℃，220rpm震荡培养过夜。控制OD600至0.8-1.2，离心(3000rpm，5min)，去除SD-Leu，更换诱导培养基SG-Leu，诱导培养20h后离心，获得菌体细胞沉淀。以50mM PBS清洗沉淀一次并重悬至500μl终体积。投喂底物(R,S)-乌药碱，体系内底物终浓度0.25mM。30℃，220rpm全细胞催化24h。
步骤四、反应液处理与检测
取步骤三中的反应液加入等量甲醇终止反应，超声提取15min后，离心(12000rpm,5min)去除沉淀，经0.22μm有机滤膜过滤后，进行LC-UV-MS分析。
LC-UV-MS检测条件如下：液相系统为岛津LCMS-2020；色谱柱为Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm×75mm，1.6μm)；柱温为室温(约25℃)；流速0.2ml/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(甲醇)进行梯度洗脱，时间程序：0min，10％(v/v)B％；12min，100％(v/v)B％；13min，100％(v/v)B％；PDA检测，监测波长为282nm；质谱检测采用电喷雾电离离子源(ESI)采集正离子，扫描范围100-800m/z；接口电压4.5kv。
pESC-Leu-StCYP80A-1转化酵母催化(R,S)-乌药碱实验结果见图1。图1为酵母体系中未进行密码子优化的StCYP80A-1催化(R,S)-乌药碱形成偶联产物的LC-UV-MS。图中，1A部分为培养液空白对照和酶促反应液的LC-UV图谱，图1B部分为培养液空白对照和酶促反应液的LC-MS提取离子色谱图。培养液空白对照为加底物但不含StCYP80A-1的培养液，酶促反应液为表达StCYP80A-1的重组酿酒酵母全细胞催化底物的样品。结果表明，异源表达StCYP80A-1的酿酒酵母可以催化(R,S)-乌药碱产生质荷比为569.25的单偶联产物P1。
实施例3、酿酒酵母体内验证密码子优化后StCYP80A的功能
一、构建异源表达质粒
对实施例2中来源于粉防己的StCYP80A基因进行密码子优化后全合成，得到密码子优化后的基因片段，碱基序列如序列表的序列5所示，编为StCYP80A-2。设计含有质粒两端同源臂的目的基因引物(StCYP80A-2-F2与R2)。酿酒酵母游离型质粒pESC-Leu使用限制型内切酶NotⅠ和SacⅠ进行双酶切，胶回收线性化质粒。
引物序列StCYP80A-2-F2如SEQ ID NO.9所示:CCTCACTAAAGGGCGGCCGCATGGACCCAATCACTTTG；引物序列StCYP80A-2-R2如SEQ ID NO.10所示:AATTGTTAATTAAGAGCTCTTAAACAGCAGTAGCAGAAG。
同实施例2步骤一构建重组质粒pESC-Leu-StCYP80A-2。
pESC-Leu-StCYP80A-2重组质粒使用限制型内切酶XhoⅠ和NheⅠ进行双酶切，胶回收线性化质粒。对来源于粉防己的StCPR基因(序列4，编为StCPR-1)进行密码子优化后全合成，得到密码子优化后的基因片段(编为StCPR-2)，碱基序列如序列表SEQ ID NO.6所示，设计含有质粒两端同源臂的目的基因引物(StCPR-2-F与R)。
引物序列StCPR-2-F如SEQ ID NO.11所示:TTTCCGAAGAAGACCTCGAGATGGCTTCTAAATACGCTAA；引物序列StCPR-2-R如SEQ ID NO.12所示:TAGAGCGGATCTTAGCTAGCTTACCAAACATCTCTCAAAT。
同上实施例2步骤一构建重组质粒的方法步骤，得到测序正确的重组质粒pESC-Leu-StCYP80A-2-StCPR-2。
二、酵母重组菌株获得
采用同实施例2步骤二相同的酿酒酵母转化方法，获得转化重组质粒pESC-Leu-StCYP80A-2-StCPR-2的酿酒酵母YPH499菌株，同时转化空质粒作为空白对照菌。
三、酵母全细胞催化
酵母全细胞催化方法同实施例2步骤三。
四、反应液处理与检测
反应液处理方法同实施例2步骤四，处理好的供试品进行LC-UV-MS、LC-QTOF-MS以及LC-MS/MS分析。
LC-UV-MS检测条件如下：液相系统为岛津LCMS-2020；色谱柱为Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm×75mm，1.6μm)；柱温为室温(约25℃)；流速0.2ml/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(甲醇)进行梯度洗脱，时间程序：0min，5％(v/v)B％；10min，45％(v/v)B％；11min，95％(v/v)B％；12min，95％(v/v)B％；PDA检测，监测波长为282nm；质谱检测采用电喷雾电离离子源(ESI)采集正离子，扫描范围m/z 100-800；接口电压4.5kv。
LC-QTOF-MS检测条件如下：液相系统为Agilent 1290超高效液相色谱仪；质谱系统为AB 5600+QTOF；色谱柱为Venusil XBP PH(2.1×100mm，5μm)；柱温40℃；流速0.5ml/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(乙腈)，时间程序：0min，10％(v/v)B％；13min，75％(v/v)B％；13.01min，95％(v/v)B％；15min，95％(v/v)B％；MS检测采用ESI采集正离子，扫描范围为m/z 50-1000。
LC-MS/MS检测条件如下：液相系统为岛津LCMS-8060；色谱柱为Venusil XBP PH(2.1×100mm，5μm)；柱温40℃；流速0.5ml/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(乙腈)，时间程序：0min，5％(v/v)B％；5min，25％(v/v)B％；7min，95％(v/v)B％；9min，95％(v/v)B％；质谱检测采用ESI采集正离子，接口电压4.0kV；扫描模式：全扫描m/z 50-1000，多反应监测(MRM)选择以下离子对进行检测：底物乌药碱m/z 286.25→107.15，乌药碱单偶联产物P1 m/z 569.35→178.25；569.35→213.10，双偶联产物P2 m/z 567.35→178.25；567.35→194.25；567.35→213.10；567.35→354.25。
pESC-Leu-StCYP80A-2-StCPR转化酵母催化(R,S)-乌药碱实验结果见图2。图中2A部分为培养液空白对照和酶促反应液的LC-UV图谱，2B部分为培养液空白对照和酶促反应液的LC-MS提取离子色谱图，2C部分为培养液空白对照和酶促反应液的LC-MS/MS色谱图。培养液空白对照为加底物但不含StCYP80A-2和StCPR-2的培养液，酶促反应液为共表达StCYP80A-2和StCPR-2的重组酿酒酵母全细胞催化底物的样品。结果表明，共表达StCYP80A-2和StCPR-2的酿酒酵母可以催化(R,S)-乌药碱产生产物P1和P2。两个产物化学性质相似，保留时间差异小，在UV检测器上粘连近似单峰，在MS检测器提取离子色谱图中可见两个峰。这两个峰采用LC-QTOF-MS测得精确分子量并给出分子式：P1 HRESIMS m/z569.2626[M+H]+(计算值569.2646，C34H37N2O6 +)，P2 HRESIMS m/z 567.2472[M+H]+(计算值567.2490，C34H35N2O6 +)。
根据MS/MS信号推测产物P1和P2的质谱裂解机制分别见附图3与4。图3中，P1在一级质谱测得的母离子为[M+H]+m/z 569.25，具有二苯醚碎片m/z 213.10，说明其为两个单异喹啉以二醚键相连的单偶联产物，结合m/z 552.25[M+H-NH3]+、178.10、175.10、和143.10等特征离子，鉴定P1为单偶联产物黑壳楠碱(lindoldhamine)。图4中，P2的母离子为[M+H]+m/z 567.25，其双苄基断裂后形成二苯醚碎片m/z 213.25和异喹啉二聚体碎片m/z354.25，异喹啉二聚体进一步裂解形成单异喹啉碎片m/z 178.25和194.25，因此P2为二醚键相连且两个异喹啉基团相连的双偶联产物，鉴定为N,N′-去甲基黄皮树碱(N,N′-dimethylobamegine)。
通过酵母体内催化(R,S)-乌药碱活性比较共表达StCPR-2前后StCYP80A-2活性，发现StCYP80A-2共表达StCPR-2后，菌体转化率提升1-100倍，表明StCPR可显著提升StCYP80A在酵母体内的转化效率，增强酶活性。
与实施例2未经密码子优化的StCYP80A-1相比，经过密码子优化的StCYP80A-2催化(R,S)-乌药碱的活性提升了2-10倍。
实施例4、密码子优化后StCYP80A微粒体蛋白提取与体外催化
一、微粒体蛋白提取
取pESC-Leu-StCYP80A-2-StCPR-2转化酵母，以SD-Leu缺陷型培养基摇菌，培养24h，至OD6000.8-1.0，更换为含2％半乳糖的SD-Leu缺陷型培养基，诱导表达24h。
菌液离心去除培养基，每克菌体加入1ml TESB buffer，每管加入0.2ml玻璃珠，1ml菌液，震荡细胞破碎仪破碎菌体，震荡速度6m/s，时间10s/次，置于冰上3min，重复6次。离心(10,000g，4℃)20min，取上清。超速离心(100,000g，4℃)1h，得到微粒体沉淀，溶于适量TEG buffer。使用生工改良型Bradford蛋白测定试剂盒测定微粒体蛋白浓度。
二、反应体系配制
取微粒体沉淀，配制酶促反应体系。反应体系体积为0.5ml，含微粒体蛋白400μg，0.05mM FAD，0.05mM FMN，1mM NADPH，底物(R,S)-乌药碱0.05mM，TEG buffer(PH:7.5)至0.5ml。于30℃，220rpm反应12h，得酶促反应液。
三、反应液处理与检测
30℃，220rpm反应12h，加入等体积乙酸乙酯，震荡萃取30s，超声15min，离心(12000rpm，4℃，5min)，取上层乙酸乙酯相。挥干乙酸乙酯后，加入500μl色谱级甲醇溶解。离心(12000rpm，4℃，5min)，取上清进行LC-UV-MS检测。
LC-UV-MS检测条件同前实施例2步骤4的条件。结果表明，StCYP80A-2蛋白能催化(R,S)-乌药碱生成单偶联产物P1(R,S)-黑壳楠碱和双偶联产物P2(R,S)-N,N′-去甲基黄皮树碱。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种偶联酶StCYP80A，其特征在于，所述偶联酶StCYP80A包括：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的所述偶联酶；
(a2)将(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有偶联酶功能的蛋白质；
(a3)与(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有偶联单苄基异喹啉类生物碱形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的蛋白质。
2.如权利要求1所述的偶联酶StCYP80A的基因，其特征在于，所述基因包括：
(b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
(b2)将(b1)的DNA序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；
(b3)与(b1)的DNA序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80A蛋白的DNA分子；
(b4)所述(b1)的DNA序列经密码子优化后的序列如序列SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体。
4.含有权利要求2所述的基因的重组微生物。
5.一种共表达重组微生物，其特征在于，所述共表达重组微生物共表达偶联酶StCYP80A和CYP450还原酶StCPR；所述共表达重组微生物包括酵母体系，所述StCPR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示，经密码子优化后的编码基因如SEQ ID NO.6所示。
6.含有权利要求1所述的偶联酶StCYP80A在催化两个单苄基异喹啉类生物碱分子偶联形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述偶联酶StCYP80A催化两个所述单苄基异喹啉类生物碱分子间的C-O芳基偶联形成所述双苄基异喹啉型生物碱。
8.含有权利要求3所述的重组表达载体在制备偶联酶StCYP80A中的应用。
9.含有权利要求4所述的重组微生物在制备偶联酶StCYP80A中的应用。
10.权利要求1所述的偶联酶StCYP80A的蛋白在制备双苄基异喹啉类生物碱中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116536285A (zh) * 2023-05-26 2023-08-04 浙江中医药大学 一种粉防己乌药碱氮甲基转移酶cnmt及应用

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