CN115851567B - 一种生产s-雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用黄浆水生产S‑雌马酚工程菌及应用，所述基因工程菌的构建方法为：通过过表达糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和磷酸化β‑葡萄糖苷酶bglB基因，将黄浆水中的大豆苷转化为大豆苷元；导入编码大豆苷元到S‑雌马酚转化酶基因dznr、ifcA、ddr和tdr；导入编码β‑呋喃果糖苷酶的sacC基因；敲除大肠杆菌底盘细胞中的葡萄糖跨膜转运基因ptsG，获得基因工程菌。本发明所获得基因工程菌可以以豆制品生产过程中的副产物黄浆水为原料，利用黄浆水中的蔗糖为碳源，将黄浆水中的大豆苷转化为S‑雌马酚，不仅节约了S‑雌马酚生物合成成本，而且实现了黄浆水的资源化利用，具有广阔的应用前景。

Description

一种生产S-雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用黄浆水为原料生产S-雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
雌马酚属于非甾体雌激素组，具有S-雌马酚和R-雌马酚两种构型。S-雌马酚构象上更接近于雌二醇，因此对雌激素受体具有高亲和力，而R-雌马酚相对活性较低，值得注意的是在生物体内经过微生物转化产生的全部为S-雌马酚。与前体大豆苷元相比，S-雌马酚具有更强的抗氧化活性，并被证明具有血管舒张作用、神经保护作用以及防治骨质疏松。S-雌马酚独特的生理活性使其可广泛应用于预防更年期综合征、神经退行性疾病防治等健康食品领域。
S-雌马酚来源是肠道中特定的菌群转化大豆苷元得到，但是在亚洲只有不到50％，西方国家仅有小于30％的人可将大豆苷元转化为S-雌马酚。目前雌马酚的生产主要通过化学合成和以大豆苷元为前体物质的细菌转化两种途径。化学法生产的是S-雌马酚和R-雌马酚的混合物且最高得率仅约31％，同时该路线需要使用昂贵的催化剂，并且反应过程步骤繁琐、易产生较多的副产物，分离纯化困难，导致化学合成的S-雌马酚售价较高，且极易造成环境污染。而利用天然细菌发酵产生S-雌马酚需要严格的厌氧环境，并且目前我国缺乏商业化的专利菌株。
与高成本的化学合成以及包含低效、高成本的植物提取和长周期的厌氧微生物转化两个过程的分离微生物转化相比，利用微生物细胞工厂合成S-雌马酚具有绿色、低成本、代时短、外源基因表达量高和耐受氧的突出优势，是微生物合成S-雌马酚的研究热点。以大肠杆菌为宿主的S-雌马酚合成途径异源重构是目前合成S-雌马酚的最有效的方式。然而，目前微生物合成S-雌马酚所需的前体物质均为大豆苷元，其主要来源于豆科作物，自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，在大豆中的含量约为0.1％-0.5％。提取的异黄酮大部分以糖苷形式存在，苷元型异黄酮含量小于5％，且异黄酮糖苷水解释放苷元配基需要酶解或强酸高温环境，成本高且容易造成环境污染。另外植物提取法还有两个重要的制约因素：(1)原料来源和产量上受季节性因素影响较大，同时我国大豆的对外依存度较高；(2)大豆中存在多种结构类似物，高纯度产品的提取成本较高。因此探索更丰富的大豆异黄酮原料来源对推广异黄酮及其活性衍生物的应用具有重要意义。
在豆腐压制成型过程中产生的副产物黄浆水中含有丰富的大豆异黄酮，每加工1吨大豆可排放出2～5吨黄浆水，大豆中大豆异黄酮的含量为0.05％～0.4％，约45％～50％的异黄酮流失到黄浆水中，同时黄浆水中还含有大量的蛋白质和碳水化合物。因此，黄浆水的大量排放一方面可造成大豆异黄酮等功能性物质的流失，另一方面由于其化学需氧量BOD和生物需氧量COD高，直接排放容易造成严重的环境污染。而黄浆水中98％的大豆异黄酮都是以糖苷型大豆异黄酮存在，而生物转化多以大豆苷元为底物合成S-雌马酚。虽然糖苷类化合物可通过酶、微生物以及酸类物质进行转化，然而植物来源的β-葡萄糖苷酶提取纯化成本高、容易造成环境污染，同时具有高产β-葡萄糖苷酶的野生型菌株不易获取。因此，常用基因工程菌表达外源β-葡萄糖苷酶，但目前基因工程菌表达的β-葡萄糖苷酶多是胞质酶，难以与胞外的大豆苷结合从而进行水解为大豆苷元。因此，难以通过在目前常用的大肠杆菌底盘细胞中表达β-葡萄糖苷酶的方法将黄浆水中的大豆苷转化为大豆苷元进而通过S-雌马酚合成途径转化为S-雌马酚。黄浆水的主要碳源为蔗糖，葡萄糖和果糖含量极低，而常用的大肠杆菌底盘细胞对蔗糖的利用能力极低，无法在黄浆水中正常生长，如不赋予大肠杆菌利用蔗糖的能力，则需要额外添加葡萄糖等碳源，这又会增加S-雌马酚的生产成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，即针对目前生物学方法生产S-雌马酚的局限性，提供一种可将大豆苷高效转化为S-雌马酚的S-雌马酚基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述S-雌马酚基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述S-雌马酚基因工程菌在利用黄浆水制备S-雌马酚中的应用。
本发明的思路为：针对大肠杆菌底盘细胞无法将黄浆水中的大豆苷转化为大豆苷元，进而通过S-雌马酚转化系统转化为S-雌马酚的问题，以及大肠杆菌底盘细胞无法利用黄浆水中的蔗糖作为碳源的情况，通过挖掘并筛选来自于多个物种的糖苷转运系统，选择大豆苷高效转运蛋白，将大豆苷转运至大肠杆菌内，并进一步转化为大豆苷元；同时，在大肠杆菌中表达蔗糖酶，赋予大肠杆菌蔗糖利用能力，实现该工程菌在无需添加任何额外碳源的情况下，以黄浆水为原料的S-雌马酚合成。而在大肠杆菌底盘细胞中导入可以降解蔗糖为葡萄糖的蔗糖酶后，其产生的葡萄糖由于存在葡萄糖抑制而影响大豆苷转运的情况，通过利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌葡萄糖转运蛋白，解除葡萄糖对大豆苷转运的抑制，以此来构建一种利用黄浆水为原料的S-雌马酚基因工程菌，并在实际中应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种生产S-雌马酚的基因工程菌，以大肠杆菌BL21为宿主，导入了编码大豆苷元到S-雌马酚转化酶基因dznr、ifcA、ddr和tdr，过表达了糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和磷酸化β-葡萄糖苷酶bglB基因，导入了编码β-呋喃果糖苷酶的sacC基因，敲除了葡萄糖跨膜转运基因ptsG。
其中，所述的dznr基因来源于乳酸菌Lactococcus strain 20-92，编码大豆苷元还原酶(DZNR)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的ifcA、ddr和tdr基因来源于Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006，其中，所述的ifcA基因编码二氢大豆苷元消旋酶(DDRC)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的ddr基因编码二氢大豆苷元还原酶(DHDR)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的tdr基因编码四氢大豆苷元还原酶(THDR)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
具体的，乳酸菌Lactococcus strain 20-92的大豆苷元到二氢大豆苷元转化酶的编码基因dznr和Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006的二氢大豆苷元到S-雌马酚转化酶的编码基因ifcA、ddr、tdr被选为合成S-雌马酚的途径基因，通过将4个基因组合表达，可以得到一株可高效转化大豆苷元为S-雌马酚的重组菌株。
其中，所述的糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和所述的磷酸化β-葡萄糖苷酶bglB基因来源于大肠杆菌Escherichia coli JM109，其中，所述的糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的磷酸化β-葡萄糖苷酶bglB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
具体的，Bgl系统属于PTS转运系统，负责β-葡萄糖苷的转运与转化。BglF的基因bglF和BglB的基因bglB属于bgl操纵子，其中bglF编码一种PTS通透酶，可催化β-葡萄糖苷的转运和磷酸化。bglB编码一种磷酸葡萄糖苷酶，它能分解磷酸化的β-葡萄糖苷。
其中，所述的β-呋喃果糖苷酶的编码基因sacC来源于产琥珀酸曼氏杆菌Mannheimia succiniciproducens，菌株号KCTC 0769BP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述的葡萄糖跨膜转运基因ptsG，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8。
具体的，β-呋喃果糖苷酶又称蔗糖酶，广泛存在于自然界中且种类繁多，它能识别β-呋喃果糖残基并通过共价果糖基酶中间体水解蔗糖。大多数的β-呋喃果糖苷酶能够催化水解蔗糖为葡萄糖和果糖。
具体的，当大肠杆菌处于混合碳源的环境中时，通常优先使用容易代谢的葡萄糖，而对其他碳源利用造成阻遏，这种现象成为葡萄糖效应。葡萄糖的转运会抑制大豆苷的转运，通过敲除PTS系统中与葡萄糖转运的关键基因ptsG，限制了大肠杆菌以PTS系统为主要的葡萄糖转运途径，可有效解除对大豆苷转运的抑制作用。
本发明还提供了上述生产S-雌马酚的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)大豆苷元到S-雌马酚重组质粒的构建：通过将dznr和ifcA、ddr和tdr基因分别克隆到pCDFDuet-1、pETDuet-1表达载体上，分别构建pCDFDuet-1-dznr-ifcA和pETDuet-1-ddr-tdr重组质粒；
(2)糖苷PTS转运系统重组质粒的构建：通过将bglF和bglB基因克隆到pACYCDuet-1表达载体上，构建pACYCDuet-1-bglF-bglB重组质粒；
(3)蔗糖水解系统重组质粒的构建：将基因sacC组装到组成型启动子pCOLADuet-1-Trc(lost O)下进行表达，构建pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC重组质粒；
(4)大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG缺失株E.coliΔptsG菌株的构建：通过敲除葡萄糖跨膜转运基因ptsG，获得E.coliΔptsG菌株；
(5)利用蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株的构建：将步骤(1)～(3)中获得的重组质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA、pETDuet-1-ddr-tdr、pACYCDuet-1-bglF-bglB以及pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC同时转化入步骤(4)E.coliΔptsG菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌，通过抗性筛选获得利用蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株。
其中，步骤(1)中，所述的大豆苷元到S-雌马酚重组质粒的构建，具体操作过程如下：
使用双酶切将通过全基因人工合成的来源于乳酸菌Lactococcus strain 20-92的dznr(SEQ ID NO：1)基因以及Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006的ifcA(SEQID NO：2)基因克隆到大肠杆菌兼性表达载体pCDFDuet-1上，获得重组质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA。
使用双酶切将通过全基因人工合成的来源于Slackia isoflavoniconvertensDSM22006的ddr基因(SEQ ID NO：3)和tdr(SEQ ID NO：4)基因克隆到大肠杆菌兼性表达载体pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-ddr-tdr。
其中，步骤(2)中，所述的糖苷PTS转运系统重组质粒的构建，具体操作过程如下：
提取大肠杆菌E.coli MG1655的基因组DNA，设计引物将bglF和bglB两个基因用PCR法扩增下来，在基因bglF的N端和C端分别加上NcoI和HindIII酶切位点，在基因bglB的N端和C端分别加上NdeI和XhoIII酶切位点，用NdeI和XhoIII对质粒pACYCDuet-1分别进行双酶切，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pACYCDuet-1-bglF和pACYCDuet-1-bglB。用NdeI和XhoIII对质粒pACYCDuet-1-bglF和质粒pACYCDuet-1-bglB分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pACYCDuet-1-bglF-bglB。
其中，步骤(3)中，所述的蔗糖水解系统重组质粒的构建，具体操作过程如下：
通过查阅文献，选择来自Mannheimia succiniciproducensβ-呋喃果糖苷酶基因sacC，由上海生工公司合成蔗糖酶基因sacC，经人工合成后置于组成型启动子下进行表达，从而赋予后续工程菌蔗糖利用能力。
具体的，通过引物Pf_Trc(FseI)和Pr_Trc(EcoNI)，以pTrc His2B(由上海生工公司合成得到)为模板来扩增Trc启动子、多克隆位点以及rrnB终止子，将得到的基因片段和质粒pCOLADuet-1用EcoNI和FseI进行双酶切，将目的片段和酶切后的质粒进行连接得到质粒pCOLADuet-1-Trc。
通过引物pf_Trc(lost O)和pr_Trc(lost O)扩增不含lacO的质粒pCOLADuet-1-Trc，一步克隆产生pCOLADuet-1-Trc(lost O)。使用NdeI和KpnI对人工合成的质粒pUC57-SacC进行双酶切获得sacC目的基因，将其连接到pCOLADuet-1-Trc(lost O)的NdeI/KpnI位点得到质粒pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC。
其中，步骤(4)中，所述的大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG缺失株E.coliΔptsG菌株的构建，具体操作过程如下：
通过在线sgRNA设计网站(http://crisprera.stanford.edu/index.jsp)设计sgRNA靶点序列，以p-target(购自Addgene)全质粒为模板，通过引物Pf_ptsG(knock)和Pr_ptsG(knock)进行全质粒PCR取代原来20bp的N20序列，构建靶向ptsG的sgRNA表达载体pTarget-ptsG。
对上述体系进行1％Agrose凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段，通过MutanBEST试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)进行Blunting Kination反应磷酸化后，16℃条件下连接16h。将连接液转化至E.coli JM109感受态，取平板上转化子接入含有100μg/mL壮观霉素的5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养12h。重组子测序成功即得改造过的p-target(ptsG)。
根据大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)基因组序列，在待敲除ptsG基因的上下游各选择500bp通过引物Pf_ptsG(up)、Pr_ptsG(up)和Pf_ptsG(down)、Pr_ptsG(down)PCR获得同源臂。将胶回收纯化后得到的PCR产物通过引物Pf_ptsG(同源臂)和Pr_ptsG(同源臂)进行融合PCR，得到包含ptsG的融合片段，将其连入T载体中得到T-融合(ptsG)质粒。
(4)接种BL21(pcas)(购自Addgene)于5mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗性溶液，于30℃、200rpm下培养12h。以1％接种量接种于50mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗性溶液，于30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.2时加入终浓度为10mM的阿拉伯糖，于30℃，200rpm下培养至OD600＝0.6。将菌液转移至50mL离心管中置于冰上冷却15min。4℃条件下，4000rpm离心10min，使用25mL冷却的无菌水和25mL冷却的10％甘油各洗涤菌体2次。加入400μL预冷的10％甘油重悬菌体，50μL分装后-80℃保存。
将BL21(pcas)感受态细胞冰浴融化，测序成功的p-target(ptsG)质粒、T-融合(ptsG)质粒回收片段以3：7的比例加入BL21(pcas)感受态细胞中，轻柔地吸打混匀后冰浴10min，将其转移到预冷的2mm电击杯中，2.5kV电击，迅速加入1mL LB培养基后转移到1.5mLEP管中于30℃，200rpm振荡培养2h。将菌液涂布到50ug/mL kana抗性、100ug/mL壮观霉素平板上，30℃倒置培养12-16h，挑取单克隆做菌落PCR进行全长PCR验证，挑取阳性克隆接种于含有40μg/mL的kana抗性溶液以及终浓度1mM IPTG的5mL LB培养基中消除pTarget质粒，30℃、200rpm下振荡培养12h后，用基因组试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取敲除ptsG基因菌株的基因组，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
将消除pTarget质粒的菌株接种于5mL LB培养基中，42℃、200rpm下振荡培养12h，吸取10μL稀释至10-6倍均匀涂布平板上，37℃培养16h，挑取30个单菌落点于无抗性平板和同时含有50ug/mL Kana平板的同一位置，37℃培养16h后若在同一位置无抗性平板上长出菌落而Kana平板上未长出菌落则获得pCas消除的菌株。得到E.coliΔptsG菌株，制备E.coliΔptsG感受态细胞，于-80℃冰箱冷冻保藏。
其中，步骤(5)中，所述的利用蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株的构建，具体操作过程如下：
将步骤(1)～(3)中获得的重组质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA、pETDuet-1-ddr-tdr、pACYCDuet-1-bglF-bglB以及pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC同时转化入步骤(4)E.coliΔptsG菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌。将重组工程菌接种至含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素、终浓度50μg/mL链霉素、终浓度50μg/mL氯霉素以及终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，37℃、200rpm培养24h，筛选同时具有氨苄青霉素、链霉素、氯霉素以及卡那霉素抗性的克隆，获得高效利用黄浆水中蔗糖的大豆苷到S-雌马酚合成菌株。
一种生产S-雌马酚的基因工程菌在利用黄浆水制备S-雌马酚中的应用也在本发明保护的范围之内。
其中，在利用黄浆水制备S-雌马酚中的应用，包括如下步骤：
(a)黄浆水的收集与灭菌；
(b)种子液的制备：将基因工程菌按2-4％v/v接种于LB培养基中进行培养，获得种子液；
(c)将步骤(b)中获得的种子液按体积浓度10％的接种量接种于黄浆水中发酵生产S-雌马酚。
具体的，步骤(a)中，所述的黄浆水为豆制品生产过程中经压榨产生的黄色浆液或其浓缩液；所述的黄浆水中，大豆苷浓度范围为65-75mg/L，蔗糖浓度范围8-11g/L。
具体的，步骤(b)中，所述的基因工程菌按2-4％v/v接种于LB培养基中进行培养，优选的接种量为2％v/v。
具体的，步骤(b)中，所述的种子液的制备，其培养条件为：摇床转速150-200rpm，37℃下培养8-24h，优选的摇床转速200rpm，37℃下培养24h。
具体的，步骤(c)中，所述的发酵，其发酵条件为：以初始工程菌OD600＝0.05-0.15接种于初始pH值为6.5-8.5的黄浆水中，37℃条件下培养至OD600＝0.5-0.8后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含S-雌马酚的黄浆水发酵液。优选的，以初始工程菌OD600＝0.1接种于初始pH值为7.5的黄浆水中，37℃条件下培养至OD600＝0.6后，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，30℃条件下发酵48h，获得含S-雌马酚的黄浆水发酵液。
对发酵结束后得到的发酵液进行分离纯化，方法如下：先用乙酸乙酯萃取黄浆水发酵液中的S-雌马酚，然后用大孔树脂对S-雌马酚进行富集，最后采用Acquity Qda制备型高效液相色谱(美国Waters公司)纯化收集S-雌马酚。
其中，所述的大孔树脂(购自上海源叶生物科技有限公司)包括AB-8、D101、D4006、HP-20、30-60目聚酰胺树脂、60-100目聚酰胺树脂、100-200目聚酰胺树脂中的任意一种。优选的为大孔树脂D4006。
有益效果：
(1)本发明提供了一种不依赖于农业资源的S-雌马酚生产方法，所述的S-雌马酚产生工程菌将黄浆水中大豆苷转化为S-雌马酚，黄浆水中S-雌马酚产量提升至48.6mg/L，黄浆水中大豆苷到S-雌马酚转化率达到83.0％。
(2)本发明构建的大豆苷到大豆苷元的转运-水解系统，解决了大肠杆菌无法利用糖苷型大豆苷合成S-雌马酚的问题。
(3)本发明通过在大肠杆菌底盘细胞引入编码β-呋喃果糖苷酶的sacC基因并利用CRISPR-Cas9技术敲除编码葡萄糖转运的关键基因ptsG解除葡萄糖效应，构建高效利用黄浆水中碳源系统，实现无需添加任何碳源的S-雌马酚合成。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是大豆苷元到S-雌马酚重组质粒的构建示意图。
图2是PTS糖苷转运系统重组质粒的构建示意图。
图3是蔗糖水解系统工程菌重组质粒的构建示意图。
图4是CRISPR-Cas9双质粒系统的构建示意图。
图5为高效利用黄浆水合成S-雌马酚工程菌的黄浆水发酵液中糖类物质的变化(A：对照菌株，B：工程菌)。
图6为高效利用黄浆水合成S-雌马酚工程菌在黄浆水中的生长曲线。
图7是液质联用(LC-MS)检测工程菌转化生产中间产物二氢大豆苷元(A)及S-雌马酚(B)的图谱。
图8为高效利用黄浆水合成S-雌马酚工程菌的S-雌马酚产量及转化率。
图9为S-雌马酚的HPLC色谱图
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中，大豆苷元还原酶(DZNR)与大豆苷元到二氢大豆苷元转化酶所表述的意思相同。
本发明中，二氢大豆苷元到S-雌马酚转化酶指二氢大豆苷元消旋酶(DDRC)、二氢大豆苷元还原酶(DHDR)和四氢大豆苷元还原酶(THDR)。
本发明中，质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA与质粒pCDF-dznr-ifcA所表述的意思相同；质粒pETDuet-1-ddr-tdr与质粒pET-ddr-tdr所表述的意思相同；质粒pACYCDuet-1-bglF-bglB与pACYC-bglF-bglB所表述的意思相同；质粒pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC与pCOLA-Trc(lost O)-sacC所表述的意思相同。
主要实验仪器：
表1主要实验仪器
试剂、酶及相关试剂盒：
各种化学试剂均为分析纯，购于国药集团药业股份有限公司。
氯霉素等抗性霉素购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
各种限制性内切酶和DNA连接酶购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司。
DL5000 DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
大豆苷、大豆苷元、二氢大豆苷元以及S-雌马酚标准品、大孔树脂AB-8、大孔树脂D101、大孔树脂HP-20、大孔树脂D4006、聚酰胺树脂30-60目、聚酰胺树脂60-100目、聚酰胺树脂100-200目均购自于上海源叶生物科技有限公司。
菌株和质粒：
质粒pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pCOLADuet-1均购自于Novagen公司(达姆施塔特，德国)。
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)JM109、BL21(DE3)、质粒pUC57购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
培养基：
LB液体基础培养基：称取10g胰蛋白胨、5g氯化钠以及10g酵母浸粉溶于1L去离子水中，121℃灭菌20min。
LB固体基础培养基：称取10g胰蛋白胨、5g氯化钠以及10g酵母浸粉溶于1L去离子水中，量取100mL于10个100mL的锥形瓶中，加入2g琼脂粉，121℃灭菌20min。
黄浆水培养基：新鲜黄浆水从南京豆制品企业获得，将新鲜的黄浆水经5000rpm离心15min去除不溶物后，于108℃灭菌20min即得黄浆水培养基。
实施例1：大豆苷元到S-雌马酚重组质粒的构建
使用双酶切将通过全基因人工合成的来源于乳酸菌Lactococcus strain 20–92的dznr(SEQ ID NO：1)以及Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006的ifcA(SEQ IDNO：2)基因克隆到大肠杆菌兼性表达载体pCDFDuet-1上，获得质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA。
使用双酶切将通过全基因人工合成的来源于Slackia isoflavoniconvertensDSM 22006的ddr(SEQ ID NO：3)和tdr(SEQ ID NO：4)基因克隆到大肠杆菌兼性表达载体pETDuet-1上，获得质粒pETDuet-1-ddr-tdr。具体操作步骤如下：
在dznr基因N端和C端分别加上NcoI和HindIII酶切位点，在ifcA基因的N端和C端分别加上NdeI和XhoI酶切位点，在ddr基因的N端和C端分别加上NdeI和XhoI酶切位点，在tdr基因的N端和C端分别加上NcoI和HindIII酶切位点，利用人工全基因合成的方法合成以上基因，得到质粒pUC57-dznr、pUC57-ifcA、pUC57-ddr、pUC57-tdr。
用NcoI和HindIII对质粒pUC57-dznr和pCDFDuet-1分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pCDFDuet-1-dznr；用NdeI和XhoI对质粒pUC57-ifcA和pCDFDuet-1分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pCDFDuet-1-ifcA；用NdeI和XhoI对质粒pUC57-ddr和pETDuet-1分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pETDuet-1-ddr；用NcoI和HindIII对质粒pUC57-tdr和pETDuet-1分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pETDuet-1-tdr。
用质粒NcoI/HindIII对上述构建好的质粒pCDFDuet-1-dznr和质粒pCDFDuet-1-ifcA分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA。
用质粒NdeI和XhoI对上述构建好的质粒pETDuet-1-ddr和质粒pETDuet-1-tdr分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pETDuet-1-ddr-tdr。
重组质粒pCDFDuet-1-dznr和pETDuet-1-ddr-tdr的质粒构建图如图1所示。所用引物见表2。
表2实施例1所用引物序列
*下划线代表相应的酶切位点
PCR反应体系：2×prime star Buffer 25μl；dNTPs Mix 4μl；Permer-F 2μl；Permer-R2μl；模版5μl；Prime Star 1μl；ddH2O补足至50μl。
PCR条件：98℃预变性5min，95℃变性30s，30个循环，55℃退火30s，72℃延伸2min，延伸速度1kb/min。
实施例2：糖苷PTS转运系统重组质粒的构建
提取大肠杆菌E.coli MG1655的基因组DNA，设计引物将bglF和bglB两个基因用PCR法扩增下来，在基因bglF的N端和C端分别加上NcoI和HindIII酶切位点，在基因bglB的N端和C端分别加上NdeI和XhoIII酶切位点，用NdeI和XhoIII对质粒pACYCDuet-1分别进行双酶切，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pACYCDuet-1-bglF和pACYCDuet-1-bglB。用NdeI和XhoIII对质粒pACYCDuet-1-bglF和质粒pACYCDuet-1-bglB分别进行双酶切后，胶回收酶切产物，然后利用连接试剂盒将胶回收产物连接成一个环状质粒pACYCDuet-1-bglF-bglB，质粒构建图如图2所示。所用引物见表3。
表3实施例2所用引物序列
PCR反应体系：：2×prime star Buffer 25μl；dNTPs Mix 4μl；Permer-F 2μl；Permer-R2μl；模版5μl；Prime Star 1μl；ddH2O补足至50μl。
PCR条件：98℃预变性5min，95℃变性30s，30个循环，55℃退火30s，72℃延伸2min，延伸速度1kb/min。
实施例3：蔗糖水解系统重组质粒的构建
通过引物Pf_Trc(FseI)和Pr_Trc(EcoNI)，以pTrc His2B(由上海生工公司合成得到)为模板来扩增Trc启动子、多克隆位点以及rrnB终止子，将得到的基因片段和质粒pCOLADuet-1用EcoNI和FseI进行双酶切，将目的片段和酶切后的质粒进行连接得到质粒pCOLADuet-1-Trc。
通过引物pf_Trc(lost O)和pr_Trc(lost O)扩增不含lacO的质粒pCOLADuet-1-Trc，一步克隆产生pCOLADuet-1-Trc(lost O)。使用NdeI和KpnI对人工合成的质粒pUC57-SacC进行双酶切获得sacC目的基因，将其连接到pCOLADuet-1-Trc(lost O)的NdeI/KpnI位点得到质粒pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC，质粒构建图如图3所示。所用引物见表4。
表4实施例3所用引物序列
*下划线代表相应的酶切位点
PCR反应体系：2×prime star Buffer 25μl；dNTPs Mix 4μl；Permer-F 2μl；Permer-R2μl；模版5μl；Prime Star 1μl；ddH2O补足至50μl。
PCR条件：98℃预变性5min，95℃变性30s，30个循环，55℃退火30s，72℃延伸2min，延伸速度1kb/min。
实施例4：CRISPR/Cas9技术敲除ptsG基因
(1)通过在线sgRNA设计网站(http://crisprera.stanford.edu/index.jsp)设计sgRNA靶点序列，以p-target(图4，购自Addgene)全质粒为模板，通过引物Pf_ptsG(knock)和Pr_ptsG(knock)进行全质粒PCR取代原来20bp的N20序列，构建靶向ptsG的sgRNA表达载体pTarget-ptsG。所用引物见表5。
表5实施例4所用引物序列-1
PCR反应体系：2×prime star Buffer 25μl；dNTPs Mix 4μl；Permer-F 2μl；Permer-R2μl；模版5μl；Prime Star 1μl；ddH2O补足至50μl。
PCR条件：98℃预变性5min，95℃变性30s，30个循环，55℃退火30s，72℃延伸2min，延伸速度1kb/min。
(2)对上述体系进行1％Agrose凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段，通过向回收液中加入1μl DpnI，37℃保持30min降解PCR模版。通过MutanBEST试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)进行Blunting Kination反应磷酸化后，16℃条件下连接16h。将连接液转化至E.coli JM109感受态，取平板上转化子接入含有100μg/mL壮观霉素的5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养12h。重组子测序成功即得改造过的p-target(ptsG)。
(3)根据大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组序列，在待敲除ptsG基因的上下游各选择500bp通过引物Pf_ptsG(up)、Pr_ptsG(up)和Pf_ptsG(down)、Pr_ptsG(down)PCR获得同源臂。将胶回收纯化后得到的PCR产物通过引物Pf_ptsG(同源臂)和Pr_ptsG(同源臂)进行融合PCR，得到包含ptsG的融合片段，将其连入T载体中得到T-融合(ptsG)质粒。所用引物见表6。
表6实施例4所用引物序列-2
(4)接种BL21(pcas)于5mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗性溶液，于30℃、200rpm下培养12h。以1％接种量接种于50mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗性溶液，于30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.2时加入终浓度为10mM的阿拉伯糖，于30℃，200rpm下培养至OD600＝0.6。将菌液转移至50mL离心管中置于冰上冷却15min。4℃条件下，4000rpm离心10min，使用25mL冷却的无菌水和25mL冷却的10％甘油各洗涤菌体2次。加入400μL预冷的10％甘油重悬菌体，50μL分装后-80℃保存。
(5)将BL21(pcas)感受态细胞冰浴融化，测序成功的p-target(ptsG)质粒、T-融合(ptsG)质粒回收片段以3：7的比例加入BL21(pcas)感受态细胞中，轻柔地吸打混匀后冰浴10min，将其转移到预冷的2mm电击杯中，2.5kV电击，迅速加入1mL LB培养基后转移到1.5mLEP管中于30℃，200rpm振荡培养2h。将菌液涂布到50ug/mL kana抗性、100μg/mL壮观霉素平板上，30℃倒置培养12-16h，挑取单克隆做菌落PCR进行全长PCR验证，挑取阳性克隆接种于含有40μg/mL的kana抗性溶液以及终浓度1mM IPTG的5mL LB培养基中消除pTarget质粒，30℃、200rpm下振荡培养12h后，用基因组试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取敲除ptsG基因菌株的基因组，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(6)将消除pTarget质粒的菌株接种于5mL LB培养基中，42℃、200rpm下振荡培养12h，吸取10μL稀释至10-6倍均匀涂布平板上，37℃培养16h，挑取30个单菌落点于无抗性平板和同时含有50μg/mL Kana平板的同一位置，37℃培养16h后若在同一位置无抗性平板上长出菌落而Kana平板上未长出菌落则获得pCas消除的菌株。最终得到E.coliΔptsG菌株，制备E.coliΔptsG感受态细胞，于-80℃冰箱冷冻保藏。
实施例5：高效利用黄浆水蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株的构建
将实施例1-3构建的质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA、pETDuet-1-ddr-tdr、pACYCDuet-1-bglF-bglB以及pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC同时转化入实施例4制备的大肠杆菌E.coliΔptsG感受态细胞，获得重组工程菌。将重组工程菌接种至含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素、终浓度50μg/mL链霉素、终浓度50μg/mL氯霉素以及终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，37℃、200rpm培养24h，筛选同时具有氨苄青霉素、链霉素、氯霉素以及卡那霉素抗性的克隆，获得高效利用黄浆水蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株。
实施例6：高效利用黄浆水中蔗糖的S-雌马酚合成菌株的功能验证
本发明通过使用液-质联用和HPLC对工程菌生产S-雌马酚的能力进行功能验证，S-雌马酚产生工程菌的功能验证主要包括以下步骤：
(1)S-雌马酚基因工程菌的准备
从-80℃冰箱中将50μL工程菌保藏液取出，将工程菌按2％v/v接种于5mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)、链霉素(50μg/mL)、氯霉素(50μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基，37℃、200rpm培养24h，获得种子液。
LB培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0。
(2)工程菌发酵条件
将工程菌在37℃，200rpm摇床活化约12h，以初始OD600＝0.1接种于50mL初始pH值为7.5的黄浆水培养基中，加入50μL相应的抗生素，37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.6后，加入终浓度1mM的IPTG进行诱导，30℃，100rpm发酵48h，获得含S-雌马酚的黄浆水发酵液。
(3)工程菌发酵液中的糖类物质的变化及生长曲线
对步骤(2)中发酵48h的前12h每隔3h进行取样，后36h每隔6h进行取样，测定其OD600值及发酵液中蔗糖、水苏糖、棉籽糖、葡萄糖、果糖、半乳糖中含量变化。
从图5中检测结果可以看出，与野生型菌株相比，工程菌在发酵前12h能将蔗糖快速水解为葡萄糖和果糖，且从图6中可以看出工程菌的生长状况明显好于野生型菌株，说明工程菌能够有效的将黄浆水中的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，为菌株的生长提供大量的可用碳源。
(4)工程菌黄浆水发酵液中S-雌马酚及二氢大豆苷元含量的LC-MS检测
吸取750μL发酵液于2mL EP管中，加入750μL乙酸乙酯进行萃取，重复两次，小心吸取上清液于干净的EP管中。使用0.22μm的有机滤膜过滤后，吸取200μL处理后的样液于高效液相进样小瓶中，用液-质联用方法测定样液中S-雌马酚、二氢大豆苷元的浓度(图7)。
仪器型号：Agilent6460三重串联四级杆高效液相色谱质谱联用仪(安捷伦科技有限公司,Infinity LC Clinical Edition/K6460液相色谱串联质谱系统)
HPLC色谱条件：
1)色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18
2)柱温：30℃
3)进样量：10μL
4)流速：0.8mL/min
5)检测波长：254nm
6)流动相：流动相A是体积分数为0.1％的甲酸-水溶液。流动相B是纯甲醇溶液。
7)洗脱程序：0-5min，80％-50％流动相A；5-16min，50％-20％流动相A；16-17min，20％流动相A；17-19min，20％-80％流动相A；19-22min，保持80％流动相A。
质谱条件：ESI离子源，正或负离子扫描，扫描范围为100-1000amu，干燥气温度：325℃；干燥气流量：5L/min；雾化器压力：45Psi；鞘流气温度：350℃；鞘流气流量：11L/min；毛细管电压：3000V(+)，3500(-)；雾化气压力电压：0(+)，500(-)；裂解电压：135V。
使用S-雌马酚、二氢大豆苷元标准品分别配制1mg/mL的母液，溶剂为色谱级甲醇。分别吸取100μL母液，加入600μL纯甲醇溶液稀释至100mg/L，后依次稀释至75mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L和1mg/L。根据上述液相检测方法，绘制标准曲线。
由图7可知，确认发酵液中产生S-雌马酚及其中间产物二氢大豆苷元。
(5)工程菌黄浆水发酵液中S-雌马酚及二氢大豆苷元含量的HPLC检测
HPLC色谱条件同上。
从图8可以看出，工程菌在黄浆水中发酵48h时S-雌马酚含量达到最大，为48.6mg/L，转化率达到最大值83.0％，因此表明本发明所构建的工程菌能够有效将黄浆水中的大豆苷转化为S-雌马酚和部分二氢大豆苷元。
实施例7：S-雌马酚的分离纯化
对发酵结束后得到的发酵液进行分离纯化，方法如下：先用乙酸乙酯萃取黄浆水发酵液中的S-雌马酚，然后用大孔树脂D4006对S-雌马酚进行富集，最后采用Acquity Qda制备型高效液相色谱(美国Waters公司)纯化收集S-雌马酚。
采用HPLC测定初始发酵液、粗提物以及经大孔树脂纯化后的S-雌马酚浓度，结果如表7。发酵液中S-雌马酚含量为0.125％，经乙酸乙酯提取后，S-雌马酚粗提物中S-雌马酚含量为0.741g/100g，是发酵液中S-雌马酚含量的5.93倍，粗提物经大孔树脂D4006进一步纯化富集后，S-雌马酚含量达到7.966g/100g，是乙酸乙酯粗提液中含量的10.75倍，是黄浆水发酵液中S-雌马酚含量的62.7倍。结果表明大孔树脂D4006能够对S-雌马酚起到富集的作用。
表7大孔树脂D4006的纯化效果
为了进一步提高S-雌马酚的纯度，采用制备型高效液相色谱法(Preparativehigh performance liquid chromatography，PHPLC)对经过大孔树脂D4006纯化的S-雌马酚提取物进行进一步分离纯化。以281nm为检测波长，流动相1‰甲酸水(流动相A)、纯乙腈(流动相B)进行线性梯度洗脱0～15min，流动相A 80％～50％；15～20min，流动相A 50％～80％；20～21min，流动相A 80％，21～24min，流动相A 80％～100％；流速为15mL/min，进样量为0.9mL，在此洗脱条件下具有良好的分离效果。图9显示了在281nm处分离S-雌马酚的分析HPLC色谱图，组分4为S-雌马酚，其特征吸收峰于图9右上角所示。使用自动馏分收集器收集10.8-11.6min馏分，重复收集10次，合并馏分，经浓缩干燥后使用HPLC分析其纯度，S-雌马酚纯度达到98.35％。
本发明提供了一种生产S-雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种生产S-雌马酚的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，导入了编码大豆苷元到S-雌马酚转化酶基因dznr、ifcA、ddr和tdr，过表达了糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和磷酸化β-葡萄糖苷酶bglB基因，导入了编码β-呋喃果糖苷酶的sacC基因，敲除了葡萄糖跨膜转运基因ptsG；
其中，所述的转化酶基因dznrr、ifcA、ddr和tdr，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述的糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述的磷酸化β-葡萄糖苷酶bglB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的β-呋喃果糖苷酶的编码基因sacC，其核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示；所述的葡萄糖跨膜转运基因ptsG，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的dznr基因来源于乳酸菌Lactococcus strain 20-92，编码大豆苷元还原酶DZNR；所述的ifcA、ddr和tdr基因来源于Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006，其中，所述的ifcA基因编码二氢大豆苷元消旋酶DDRC，所述的ddr基因编码二氢大豆苷元还原酶DHDR，所述的tdr基因编码四氢大豆苷元还原酶THDR。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和所述的磷酸化β-葡萄糖苷酶bglB基因来源于大肠杆菌Escherichia coliJM109。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的β-呋喃果糖苷酶的编码基因sacC来源于产琥珀酸曼氏杆菌Mannheimia succiniciproducens，菌株号KCTC 0769BP。
5.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)大豆苷元到S-雌马酚重组质粒的构建：通过将dznr和ifcA、ddr和tdr基因分别克隆到pCDFDuet-1、pETDuet-1表达载体上，分别构建pCDFDuet-1-dznr-ifcA和pETDuet-1-ddr-tdr重组质粒；
(2)糖苷PTS转运系统重组质粒的构建：通过将bglF和bglB基因克隆到pACYCDuet-1表达载体上，构建pACYCDuet-1-bglF-bglB重组质粒；
(3)蔗糖水解系统重组质粒的构建：将基因sacC组装到组成型启动子pCOLADuet-1-Trc(lost O)下进行表达，构建pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC重组质粒；
(4)大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG缺失株E.coliΔptsG菌株的构建：通过敲除葡萄糖跨膜转运基因ptsG，获得E.coliΔptsG菌株；
(5)利用蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株的构建：将步骤(1)～(3)中获得的重组质粒pCDFDuet-1-dznr-ifcA、pETDuet-1-ddr-tdr、pACYCDuet-1-bglF-bglB以及pCOLADuet-1-Trc(lost O)-sacC同时转化入步骤(4)E.coliΔptsG菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌，通过抗性筛选获得利用蔗糖的大豆苷到S-雌马酚转化菌株。
6.权利要求1-4任意一项所述的基因工程菌在利用黄浆水制备S-雌马酚中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(a)黄浆水的收集与灭菌；
(b)种子液的制备：将基因工程菌按2-4％v/v接种于LB培养基中进行培养，获得种子液；
(c)将步骤(b)中获得的种子液按体积浓度10％的接种量接种于黄浆水中发酵生产S-雌马酚。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，所述的黄浆水为豆制品生产过程中经压榨产生的黄色浆液或其浓缩液；所述的黄浆水中，大豆苷浓度范围为65-75mg/L，蔗糖浓度范围8-11g/L。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(c)中，所述的发酵，其发酵条件为：以初始工程菌OD600＝0.05-0.15接种于初始pH值为6.5-8.5的黄浆水中，37℃条件下培养至OD600＝0.5-0.8后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含S-雌马酚的黄浆水发酵液。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵结束后得到的发酵液进行分离纯化，先用乙酸乙酯萃取黄浆水发酵液中的S-雌马酚，然后用大孔树脂对S-雌马酚进行富集，最后采用制备型高效液相色谱纯化收集S-雌马酚。
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一株转化大豆苷元为S-雌马酚菌株的筛选和鉴定;郭远洋;黄雅燕;叶静;张学勤;肖美添;;微生物学报;20120604;第52卷(第06期);696-702 *
产雌马酚菌株发酵豆粕及产物提取工艺研究;孙小燕;张逊;姚文;;畜牧与兽医;20100610;第42卷(第06期);31-36 *

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