CN106754993B - 一种基因、重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，本发明筛选获得一株高产7‑脱氢胆固醇的重组酿酒酵母菌株，其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SYBE_Sc01250009，简称SYBE_Sc01250009，保藏号(CGMCC No.13442)。本发明的利用重组酿酒酵母菌株生产7‑脱氢胆固醇的方法相对于植物提取、化学合成成本更为低廉，且对环境友好，极显著提高了7‑脱氢胆固醇的产量，为7‑脱氢胆固醇的生产提供了一种切实可行的方法。

Description

一种基因、重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基因及重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用，尤其是一种高产7-脱氢胆固醇的基因、重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

固醇是真核细胞膜上的必要组成部分，动物、植物和真菌代谢的固醇终产物有所不同。动物的终产物为胆固醇，真菌为麦角固醇，而植物的固醇类终产物较为多样，包括谷甾醇、豆甾醇、和菜油甾醇。固醇大量存在由于动物、植物或真菌的细胞膜、内质网和脂质体内，并在不同细胞器上保持动态平衡。固醇能改变膜双分子层的流动性和细胞膜的渗透性。此外，一些固醇可以和膜上蛋白相互作用从而影响蛋白的稳定性和功能。

7-脱氢胆固醇是动物甾醇的一种，为胆固醇前体，存在于动物血清中，其在动物皮肤中经紫外照射可转化为维生素D3。7-脱氢胆固醇也存在于一些哺乳动物的乳汁中。在昆虫体内，7-脱氢胆固醇还是蜕化素的前体，为促使昆虫幼虫变为成虫的不可或缺的物质。

7-脱氢胆固醇为维生素D3的前体，而维生素D3是人与动物生长、发育、繁殖、维持生命和保持健康必不可少的脂溶性维生素。其不仅能够调节钙磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化而且可以维持血钙和血磷的平衡，在临床上可治疗佝偻病、老年骨质疏松、甲状腺机能减退症等。

7-脱氢胆固醇为诺贝尔奖获得者有机化学家Adolf Windaus首次发现，是以环戊烷多氢菲为母核的四环脂肪烃。2006年Diane Dugas等首次用钯催化合成同环共轭二烯的方法化学合成7-脱氢胆固醇，其收率为21％-52％。但是，化学合成存在明显的缺点，如工艺流程长、反应步骤多、反应条件不温和、收率低、副产物去除过程复杂、能耗高、污染环境严重。而生物合成7-脱氢胆固醇很好地避免了如上问题。Donald Lewis曾以鲨烯为底物，使其在37℃水浴摇床中与从动物细胞中提取出的微粒酶共孵育得到7-脱氢胆固醇。利用微生物合成7-脱氢胆固醇之前已有报道：Christin等人于2009年在酿酒酵母细胞中敲除ERG5、ERG6、ERG4，并导入內源的tHMGR、ERG1、ERG2、人源Sc5d、ERG9、ERG11、鼠源DHCR24，成功合成了7-脱氢胆固醇。2010 年Hans-Peter Hohman将小鼠和斑马鱼的DHCR24基因导入酵母细胞同样得到了可以产7-脱氢胆固醇的酵母菌株。2015年天津大学的苏皖将强乙酰辅酶 A产出的模块基因ACL、ACS、ADH2、ALD6以及NADH与NADPH的调控模块插入到组成型启动子表达盒中以质粒的形式导入到酿酒酵母中，使7- 脱氢胆固醇的摇瓶产量提高到8mg/L。但是产量仍相对较低。因此，亟待开发高产7-脱氢胆固醇的重组酿酒酵母。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种生产7-脱氢胆固醇的重组酿酒酵母菌株及其构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基因为来源于小鼠(Musmusculus)、斑马鱼(zebra fishDaniorerio)、马(Equuscaballus)、原鸡属(Gallus gallus)、非洲扎蛙蟾蜍(Xenopus(Silurana)tropicalis)、牛源(Bos taurus)或人源(Homo sapiens)，经密码子优化的固醇类物质C24位还原酶DHCR24基因。

其中，所述密码子优化优选为基因内部避免BsaⅠ酶切位点。

在一些实施方案中所述基因，具有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7～SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。

即所述基因为小鼠(Musmusculus)来源的DHCR24，其序列如SEQ ID NO:3 所示；

所述基因为斑马鱼(zebra fish Daniorerio)来源的DHCR24，其序列如SEQ IDNO:5所示；

所述基因为马(Equuscaballus)来源的DHCR24，其序列如SEQ ID NO:7所示；

所述基因为原鸡属(Gallus gallus)来源的DHCR24，其序列如SEQ ID NO:8 所示；

所述基因为非洲扎蛙蟾蜍(Xenopus(Silurana)tropicalis)来源的DHCR24，其序列如SEQ ID NO:9所示；

所述基因为牛源(Bos taurus)来源的DHCR24，其序列如SEQ ID NO:10 所示；

所述基因为人源(Homo sapiens)来源的DHCR24，其序列如SEQ ID NO:11 所示。

本发明还提供了上述基因在生产7-脱氢胆固醇中的应用。

本发明还提供了上述基因整合宿主获得的微生物。

其中所述宿主可以选自酵母、藻类、霉菌或细菌。

在一些实施方案中，所述宿主为酵母。优选的，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。

进一步的，所述酿酒酵母可以为CEN.PK系列或BY系列。

在一些实施方案中，所述宿主为霉菌。优选的，所述霉菌为链霉菌。

在一些实施方案中，所述宿主为细菌。优选的，所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了上述微生物在生产7-脱氢胆固醇中的应用。

本发明还提供了一种重组酿酒酵母菌株的构建方法，将上述基因整合到酿酒酵母gal80基因上。

在一些实施方案中，所述的构建方法具体包括如下步骤：

步骤1、将固醇类物质C24位还原酶基因DHCR24两端引入BsaI酶切位点，连入pUC57-Kan载体，获得pUC57-Kan-DHCR24；用限制性内切酶BsaⅠ酶切pUC57-Kan-DHCR24，与经限制性内切酶BsaⅠ酶切的 PRS425k-FBA1t-gal7p-PGK1t表达盒质粒连接，获得PRS425k-FBA1t-gal7p-DHCR24-PGK1t重组载体；

步骤2、以酿酒酵母BY4741基因组为模板PCR扩增gal80L、FBA1t、 PGK1t、gal80R，以PRS425k为模板PCR扩增LEU2，然后通过OE-PCR方式拼接，得到两端带有PstI、BamHI酶切位点的左臂gal80L-LEU2-FBA1t片段，和右臂PGK1t-gal80R片段，然后用限制性内切酶PstI、BamHI酶切消化后连接到PEASY-Blunt载体上，获得PEASY-gal80L-LEU2-FBA1t重组载体和 PEASY-PGK1t-gal80R重组载体；

步骤3、用限制性内切酶notⅠ分别酶切PRS425k-FBA1t-gal7p-DHCR24- PGK1t、PEASY-gal80L-LEU2-FBA1t和PEASY-PGK1t-gal80R重组载体，回收FBA1t-gal7p-DHCR24-PGK1t、gal80L-LEU2-FBA1t和PGK1t-gal80R片段；

步骤4、采用醋酸锂法将上述三个片段转化酿酒酵母菌株，sc-leu缺陷型固体培养基筛选转化子。

在一些优选实施方案中，本发明所述重组酿酒酵母菌株的构建方法中所述酿酒酵母菌株为敲除ERG5基因的酿酒酵母CEN.PK株。

本发明还提供了所述构建方法构建得到的重组酿酒酵母菌株。

优选的，一株重组酿酒酵母菌株，其保藏编号为CGMCC No.13442。该重组酿酒酵母菌株中基因DHCR24来源于原鸡属，序列如SEQ ID NO:9所示；所述宿主为敲除ERG5基因的CEN.PK2-1D重组酿酒酵母。

本发明还提供了一种生产7-脱氢胆固醇的方法，将上述微生物或上述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基活化；将活化后的微生物或重组酿酒酵母菌株接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取7-脱氢胆固醇。

在一些实施方案中，生产7-脱氢胆固醇的方法具体为将保藏编号为 CGMCCNo.13442的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基在30℃、250rpm下进行一级种子活化，12h后转接至新鲜的种子培养基，在30℃、250rpm下进行二级种子活化；待二级种子培养基OD达到7时，以种子体积与罐内发酵液体积1:10的比例接种于发酵罐，发酵初糖为40g/L，之后用HPLC检测糖耗，流加补糖，使糖浓度不高于10g/L，待发酵罐中菌体OD达到50时停止补糖，继续检测乙醇代谢，补加乙醇使其不超过20g/L，120h收集菌体提取7-脱氢胆固醇。

其中，所述种子培养基为40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，余量为水；所述发酵培养基为40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉， 10g/L D-半乳糖，余量为水。

实验结果表明，以保藏编号为CGMCC No.13442的重组酿酒酵母菌株发酵生产7-脱氢胆固醇，7-脱氢胆固醇产量可高达17.765mg/L，远高于现有方法。

本发明的利用重组酿酒酵母菌株生产7-脱氢胆固醇的方法相对于植物提取、化学合成成本更为低廉，且对环境友好，极显著提高了7-脱氢胆固醇的产量，为7-脱氢胆固醇的生产提供了一种切实可行的方法。

生物保藏说明

菌株SYBE_Sc01250009：分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 于2016年12月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13442。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示PRS425k-FBA1t-gal7p-PGK1t表达盒质粒图谱；

图2示酿酒酵母中7-脱氢胆固醇代谢路径图；

图3示不同来源DHCR24表达质粒的构建示意图；

图4示整合左右臂与不同来源DHCR24表达质粒通过酵母同源重组整合到酵母基因组上的示意图；

图5示ERG5敲除质粒PCRCT-ERG5图谱；

图6示整合不同来源DHCR24后各菌株产量图；

图7示发酵罐发酵菌体生长曲线图；

图8示发酵罐发酵过程葡萄糖浓度变化图；

图9示发酵罐发酵两个不同转化子SYBE_Sc01250009A和 SYBE_Sc01250009B的产量图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供生产7-脱氢胆固醇的重组酿酒酵母菌株。

为实现本发明的目的，本发明筛选了11中不同来源的酿酒酵母产7-脱氢胆固醇的唯一外源基因DHCR24，其中包括两个原核生物源、两个植物源、七个动物源的DHCR24，经密码子优化，将其整合到敲除ERG5基因的高产 FPP的酿酒酵母基因组上，利用诱导型启动子表达，通过摇瓶发酵筛选合成 7-脱氢胆固醇最优的外源功能基因DHCR24。试验发现原核生物源及植物源 DHCR24整合到酵母后均无7-脱氢胆固醇产生，而动物源则产量不一。

本发明筛选获得一株高产7-脱氢胆固醇的重组酿酒酵母菌株，产量可达17.765mg/L，其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) SYBE_Sc01250009，简称SYBE_Sc01250009，保藏号(CGMCC No.13442)。

本发明的利用重组酿酒酵母菌株生产7-脱氢胆固醇的方法相对于植物提取、化学合成成本更为低廉，且对环境友好，极显著提高了7-脱氢胆固醇的产量，为7-脱氢胆固醇的生产提供了一种切实可行的方法。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述。其中，如无特殊说明，本发明实施例中所用涉及的原料及试剂均可由市场购得。在本发明中所涉及的一些质粒载体、菌株均可由市场购得，PRS425k-FBA1t-gal 7p-PGK1t表达盒保存于天津大学元英进实验室，其基因连入的切口为BsaⅠ标准切口，质粒图谱如图1所示。高产FPP酵母菌株系天津大学合成生物学元英进课题组曾薄轩由CENPK-2空白菌改造而来，存菌号为SyBE_Sc01130 007，具体为Leu2△::BieR_ERG19-Pgal1，10-ERG8；Ade1△::tHMG1-Pgal1， 10-IDI1_ADE1；His3△::His3_ERG12-Pgal1，10-ERG10；Ura3△::MG1-Pgal1， 10-ERG13_URA3；Trp1△::tHMG1-Pgal1，10-ERG20_TPR1；gal7，gal1，gal 10△::HphR。

实施例1不同来源固醇类物质C24位还原酶DHCR24的获得

在NCBI Genbank中查得隐球菌、锥体虫、小鼠(Musmusculus)、拟南芥、斑马鱼、棉花、马、原鸡属、非洲扎蛙蟾蜍、牛源、人源等来源的相应的固醇类物质C24位还原酶DHCR24的氨基酸序列，并对密码子进行优化，基因内部避免BsaⅠ酶切位点，两端添加已构建表达盒PRS425k-FBA1t-gal7p-PGK1t所对应的BsaⅠ酶切位点标准化切口，终止子全部为TAA。连入pUC57-Kan载体。

其中所述隐球菌(Cryptococcus gattii WM276)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:1所示，锥体虫(Trypanosomagrayi)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:2 所示，小鼠(Musmusculus)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:3所示，拟南芥 (Arabidopsis thaliana)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:4所示，斑马鱼(Zebra fish Daniorerio)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:5所示，棉花(cotton Gossypiumhirsulum)来源的DHCR24序列如SEQ IDNO:6所示，马 (Equuscaballus)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:7所示，原鸡属(Gallusgallus)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:8所示，非洲扎蛙蟾蜍(Xenopus (Silurana)tropicalis)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:9所示，牛源(Bos taurus)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:10所示，人源(Homo sapiens)来源的DHCR24序列如SEQ ID NO:11所示。

实施例2 DHCR24基因表达模块及整合模块左右臂的构建

用限制性内切酶BsaⅠ-HF(NEB)同时酶切含有不同来源DHCR24基因的质粒和PRS425k-FBA1t-gal7p-PGK1t表达盒质粒，胶回收并用golden gate 程序将基因连入到表达盒中。在kan^r抗性LB板上筛选得到基因重组子，经菌落PCR验证，15％甘油保存正确的转化子，即PRS425k-FBA1t-gal7p-DHCR2 4-PGK1t重组载体。具体构建过程如图3所示。

设计将基因表达盒整合到酵母染色体上所需要的左右臂：整合位点设计为酿酒酵母gal80基因，整合同源区选取gal80基因ORF框上下游各700bp。整合片段分别为左臂gal80L-LEU2-FBA1t、基因表达盒FBA1t-gal7p-PGK1t 和右臂PGK1t-gal80R，三个整合片段上下游均设计有PstⅠ和BamHⅠ酶切位点。LEU2标签从PRS425k上PCR获得。左臂、基因和右臂三个整合片断之间的同源区为终止子FBA1t、PGK1t。用高保真酶phusion从酿酒酵母基因组上PCR获得左右同源臂及终止子并用OE pcr将左臂的三个短片断和右臂的两个短片断拼接得到左臂和右臂，并将其分别连入PEASY-Blunt载体，蓝白斑筛选并经菌落PCR及酶切验证得到正确转化子。

实施例3敲除ERG5基因的重组酿酒酵母的构建

ERG5基因为野生酿酒酵母合成其固醇类物质终产物麦角固醇路径上固醇侧链C22为脱氢酶，敲除该基因可以截断麦角固醇的生成，从而使得代谢流流向目标产物7-脱氢胆固醇。

申请人运用CRISPR技术敲除ERG5构建获得ERG5敲除质粒 PCRCT-ERG5，该质粒包含有CRISPR敲除所需的TEF1p-icas9、tracrRNA及与ERG5基因同源互补的donorDNA等模块。ERG5敲除质粒PCRCT-ERG5 具体图谱如5所示。

以高产FPP酵母菌株SyBE_Sc01130007为出发菌株，构建敲除菌株。将 ERG5敲除质粒PCRCT-ERG5质粒用化学转化的方法转入酵母菌株 SyBE_Sc01130007中，传代三次纯化不同的转化子6个，送测验证突变。保存正确敲除的菌株。

实施例4将不同来源的DHCR24基因表达盒整合到酵母底盘

将11个不同来源的DHCR24表达盒分别从构建好的重组载体 PRS425k-FBA1t-gal7p-DHCR24-PGK1t上用限制性内切酶notⅠ切下，胶回收，并保证胶回收产物浓度不小于50ng/μL。

重组左、右臂片断也分别用限制性内切酶notⅠ从构建好的载体上切下，胶回收。

醋酸锂转化法制备高产FPP酵母菌(存菌号为SyBE_Sc01130007)感受态。

分别将200ng不同来源的DHCR24表达盒片段，加入到转化体系中，同时分别按与表达盒片断摩尔比1:1的比例将重组左臂片断、右臂片断加入到转化体系中。30℃孵育30min，热击30min，之后将菌体涂于SC-Leu缺陷型固体培养基上。

所述SC-Leu缺陷型固体培养基配方为合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖 20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，另外补入色氨酸、组氨酸、尿嘧啶母液使该三种氨基酸终浓度为0.02g/L，2％的琼脂粉。

实施例5筛选表达模块正确重组到基因组上的转化子

将实施例3获得的转化子在SC-Leu缺陷型固体培养基上划线两次，得到纯的转化子。菌落PCR方法进行初步验证后，从中挑选出正确的转化子并提基因组进行再次验证，将两轮验证均条带正确的转化子以15％甘油存菌。存菌号如下：

SYBE_Sc01250001：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Cryptoc occusgattii WM276)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250002：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Trypano somagrayi)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250003：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Musmusc ulus)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250004：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Arabido psisthaliana)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250006：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(zebra fi shDaniorerio)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250007：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(cottonGossypiumhirsulum)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250008：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Equusc aballus)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250009：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Gallus gallus)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250010ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Xenopus (Silurana)tropicalis)-PGK1t_Leu2；

SYBE_Sc01250011：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Bos tau rus)-PGK1t_Leu2

SYBE_Sc01250050：ERG5△GAL80△::FBA1t-GAL7p-DHCR24(Homo s apiens)-PGK1t_Leu2。

实施例6摇瓶发酵培养

种子培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

发酵培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D- 半乳糖。

将实施例4筛选获得的菌株挑单菌落接种于5mL种子培养基中，在30℃、 250rpm培养14-16h，以初始菌体终浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养96h，监测发酵过程中的菌体密度(OD600) 并测定发酵完成后7-脱氢胆固醇产量。

发酵完将50mL培养基离心取菌体，液氮研磨，在研磨好的细胞中加入 3M NaOH甲醇溶液80℃衍生化两小时，用正己烷萃取，吸出正己烷相冻干。将冻干的样品用MSTFA衍生化试剂30℃衍生化两小时，并用正己烷稀释上样，用气质联用测得样品中7-脱氢胆固醇含量。结果见图6。

其中GC-MS方法具体为：硅胶毛细管柱为30m×0.25mm×0.25μm DB-5MS，J&WScientific，Folsom。电离方式为电子轰击电离EI+，电子束能量70eV，离子化电流40μA。质谱扫描范围在50～800m/z，离子源温度为 250℃，进样口温度为280℃，氦气(99.9995％)用作载气，91KPa恒压模式下操作。分流比为40:1。柱温在70℃保持1min，以20℃·min^-1的速度升至250℃，在250℃维持2min，然后以15℃·min^-1的速度升到280℃，在 280℃维持15min。

图6结果显示，两个原核生物Cryptococcus gattii WM276、 Trypanosomagrayi及两个植物Arabidopsis thaliana、cotton Gossypiumhirsulum 来源的DHCR24酶整合到酵母基因组上后7-脱氢胆固醇均无产量，而七个动物来源的DHCR24整合后产量各异。马源产量最低而原鸡属产量最高，产量接近18mg/L。

实施例7发酵罐发酵培养

选取上述构建菌株SYBE_Sc01250009的两个不同转化子 SYBE_Sc01250009A和SYBE_Sc01250009B进行发酵罐发酵。发酵体积两升，培养基为YPD。挑单菌落在试管中接一级种子，12h后在摇瓶中转接二级种子，待其OD达到7时，以种子体积与罐内发酵液体积1:10的比例接种于发酵罐。发酵初糖为40g/L，之后用HPLC检测糖耗，流加补糖，使糖浓度不高于10g/L。待发酵罐中菌体OD达到50时停止补糖。继续检测乙醇代谢，补加乙醇使其不超过20g/L。120h收集菌体，液氮研磨，测定7-脱氢胆固醇产量。其中转化子SYBE_Sc01250009A的产量为61.4mg/L，转化子 SYBE_Sc01250009B的产量为96.83mg/L。结果见图7-9。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 一种基因、重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用

<130> MP1608835

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> Cryptococcus gattii WM276

<400> 1

atggctgtta ctcaagataa tttgagacaa agaaaagctg caaacttaca atctgatgac 60

atagcaaatg gtaactcaac agccttgtta aaaatcaatg ctgttccaac cgaacatggt 120

caagaaagag ataaggaatt ggacgaacac caagaatatg aatttggtgg tccaataggt 180

gtattggcta tgatgttagg tttccctgtt ttgatgtact acttatggat ctgtttgtgg 240

tactaccaag gttcctttgt atatccaact agtgttgatg acattagacc atttttccat 300

agaatgtggg aacacatcta tgatggtgca tacccaacaa aatttgcctt cattacttat 360

tggggtttaa cagctataca attggtcttt gccgctgtaa tgccaggcat gtaccaaaat 420

ggtttaccag ttccttcctt gaactacaag acattgcctt acaagtgcaa cgcattgtac 480

agttggtact ctactttgat cttagttggt gtcttgcata aaacaggtat ctatagattg 540

ccatggatca tcgaaaactt cggtcacata atgaccgttt caatcattac ttcttactca 600

gtctccataa tcattgatgt ttttgctaga gtcttcaagt atggtggtgg tcctttgaga 660

atgtccggta atatctttta cgatcatttc atgggtgtca gtttaaaccc aagattgggt 720

atcgtagact taaagatgtt cgcagaagta agagttcctt gggttttgtt atttttgttc 780

gcattatcag ccactgttaa gcaatatgaa gaagcaggta gagtcaccta caatatgata 840

catttcttgt tagccactgg tttgtatatc aacgcatgtg ccaaagctga acaaatgatt 900

ccacaaacct gggatatgtt tcacgaaaag ttcggttgga tgttaatttt ctggaatatg 960

tctggtgtcc caatgacata tgtataccct gctatctata tgtcaagagc acctattgaa 1020

tcatacgaat tctccagatt gggtagtttt gccttattct ctacattgat gttgtgttac 1080

tacatcttcg actgctctat ggcacaaaaa tcagttttca agatgcaaca acagggtgaa 1140

tataaaccaa gaaaggcctt tccacaattg ccttgggctg aattgaaaaa tcctacctac 1200

atccaaacta agcatggtaa caagttgttg acatctggtt tttggagatt cgctagaaag 1260

ccaaattata ccgccgattg gattcaagct tgtacatggg gtttgaccgc tggttttaac 1320

actatcatca caatgtggta ccctatattt ttcttggcag ttttaatcca cagatgtgaa 1380

agagattttg ctaaatgcgc aagaaagtat ggtgacgact gggacgaata ctgcaaaact 1440

gttaaatgga agttcattcc aggtatctat taa 1473

<210> 2

<211> 1464

<212> DNA

<213> Trypanosomagrayi

<400> 2

atgactacaa aatccagaag agcatcttca agatccagaa gtaaaacccc agataatggt 60

agtagacaag ctaagagatt ggcacctgaa gaattgtaca acttaacagt tgaaagaaag 120

tttactccag aaaaggatac ttgggacggt cattacgaat tctgtggttg gatgggtgct 180

ttgggtatta tgttagcatc tcacgtcttg atctattact tttgggtatg catcgaaaac 240

ttccaaggta cattgatcta tccaggtcat cctttgttac aaggcgaatc aatgataacc 300

gtttttggta actacttaag agctcacgct gcaccaacat ggggtacctt cggcatgttc 360

actgctttct tgttggttga atacacattg gcagttgtct taccttctgt agaagttaaa 420

ggtttgccaa taccttcaga aaacggttac agacaattgt acaagtgtaa cgcagttcaa 480

gcctggtatt gcatgttgtt aatcgtcggt gtattccatt acactgaaat cttcccattg 540

tggaaattaa gagccgattt tggtagatat ttgactgtcg ctacaatttg ggccgacgct 600

atatcattgg gtgtatacgt agttggttta agaaagcaaa tcagaatgtc tcacaacatc 660

atctatgact ttttcatggg ttcagcattg aactacagat tacctggtgg tgttgatgtc 720

aaattgtttg ccgaatgtag aaactcctgg gtattgttga tgatcttgac cttgagtaac 780

gccgctgcaa tgcaacatga aatcggttac gttactggta acatgtggtt catcgtcgta 840

gcccaatctt tgtacgtaaa cgctatccaa aagggtgaag aatgtgttat caccacttgg 900

gatttgtttt atgaaaagtt cggttggatg ttagcttact ggaatacttg cggtgttcca 960

tttttgtact ctttacaagg tttctacata caaacagtct tgaaagacag agaacataag 1020

ccttggcaat tggccttgat gtacgctgta ttgatcgttg catactacat ctgggataat 1080

gccaactccc aaaagaatag attcagaatg aagagaaacg gtacaccaca atccatcttg 1140

agaagaaaaa gtttcccaca attaccttgg ggttatattg aaaatcctag agttgtcaag 1200

tcagaacgtg gtgaattgtt tgtcgatggt tggtacagat acgcaagaaa gttgcattac 1260

acagcagaca tcataatggc caccttatgg ggtgtttctt gtggtttcga ttcattcata 1320

ccatttttct acgtttgctt tttcttttct cacttagtcg atagagaagc tagagacgaa 1380

tacagatgta gaagaaagta cggtgaattg tgggatagat acatcgaatt ggttccatac 1440

aagtttatac ctggtatcta ttaa 1464

<210> 3

<211> 1551

<212> DNA

<213> Musmusculus

<400> 3

atggaaccag ctgtttcttt agcagtctgt gccttgttat ttttgttgtg ggtcagagta 60

aagggtttgg aattcgtttt gatccatcaa agatgggttt tcgtctgctt gttcttgtta 120

ccattgtctt tgatattcga tatctattac tatgttagag catgggttgt cttcaaatta 180

tcttcagccc ctagattgca tgaacaaaga gttagagata ttcaaaagca agtcagagaa 240

tggaaagaac aaggtagtaa gacttttatg tgtacaggta gaccaggttg gttgacagta 300

tctttgagag ttggtaaata caaaaagacc cataagaaca tcatgatcaa cttgatggat 360

atcttggaag ttgacactaa aaagcaaatc gtaagagttg aacctttagt ctcaatgggt 420

caagtaaccg cattgttaaa ttccattggt tggactttgc cagtcttacc tgaattggat 480

gacttaactg taggtggttt aatcatgggt acaggtattg aatccagttc tcataagtac 540

ggtttgttcc aacacatctg tactgcttac gaattgatct tggcagatgg ttcattcgtt 600

agatgcacac catcagaaaa ctccgacttg ttctacgcag taccttggtc ctgtggtaca 660

ttgggtttct tggttgctgc tgaaataaga atcatcccag ctaaaaagta cgtaaagttg 720

agattcgaac ctgttagagg tttggaagca atatgtgaaa agtttaccag agaatcacaa 780

agattggaaa accatttcgt tgaaggtttg ttgtactcct tggatgaagc cgttatcatg 840

accggtgtca tgactgatga cgtagaacca tcaaagttga acagtatcgg ttcttactac 900

aagccttggt ttttcaagca tgttgaaaac tacttgaaga ccaacagaga aggtttagaa 960

tacatcccat tgagacacta ctaccataga cacactagat caatcttttg ggaattacaa 1020

gatatcatac cattcggtaa caaccctatt tttagatact tattcggttg gatggttcca 1080

cctaaaatat ccttgttaaa gttgacacaa ggtgaaacct tgagaaaatt gtacgaacaa 1140

catcacgtag ttcaagatat gttagttcct atgaagtgta tgagtcaagc tttgcataca 1200

ttccaaaatg atatacacgt ctatccaatc tggttatgcc cttttatatt gccatctcaa 1260

cctggtttag ttcatccaaa aggtgacgaa gccgaattgt acgttgacat cggtgcttat 1320

ggtgaaccta gagtcaaaca tttcgaagcc agaagttgta tgagacaatt ggaaaagttc 1380

gtcagatctg tacacggttt ccaaatgttg tacgctgatt gctacatgaa cagagaagaa 1440

ttctgggaaa tgttcgacgg ttctttgtac cataagttga gaaagcaatt gggttgtcaa 1500

gatgcattcc cagaagttta cgacaagatc tgcaaggccg ctagacacta a 1551

<210> 4

<211> 1686

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

atgagtgatt tgcaaactcc attagttaga cctaagagaa agaaaacttg ggtagactac 60

tttgttaagt tcagatggat catcgtcatc tttattgtat tgccattctc tgctaccttc 120

tatttcttga tatatttggg tgacatgtgg tccgagagta agtctttcga aaagagacaa 180

aaggaacatg acgaaaacgt caaaaaggta atcaagagat tgaaaggtag agatgcctca 240

aaggacggtt tagtttgtac tgcaagaaaa ccttggattg ccgtcggtat gagaaacgta 300

gattataaaa gagctagaca ctttgaagtt gacttgggtg aattcagaaa catcttggaa 360

atcaacaagg aaaagatgac cgcaagagtt gaaccattag tcaatatggg tcaaatttca 420

agagccactg ttcctatgaa cttgtcctta gcagttgtcg ccgaattgga tgacttaaca 480

gtcggtggtt tgataaatgg ttatggtatc gaaggttctt cacatatcta cggtttattt 540

gcagatacag tagaagccta cgaaattgtt ttggctggtg gtgaattagt tagagcaacc 600

agagataacg aatatagtga cttgtattac gcaataccat ggtcacaagg tactttaggt 660

ttgttagttg ctgctgaaat aagattgata aaggtcaagg aatacatgag attgacatac 720

atccctgtta agggtgactt gcaagcctta gctcaaggtt atatagactc atttgctcca 780

aaggatggtg acaagtccaa aatccctgat ttcgtagagg gtatggttta taatccaacc 840

gaaggtgtta tgatggtcgg tacttacgct tcaaaggaag aagctaaaaa gaaaggcaac 900

aaaattaata acgttggttg gtggtttaag ccatggttct atcaacatgc tcaaacagca 960

ttgaagaaag gtcaattcgt tgaatacatc cctacaagag aatactacca tagacacacc 1020

agatgtttgt actgggaggg taaattgatc ttaccattcg gtgaccaatt ttggttcaga 1080

tatttgttag gttggttgat gccacctaag gtttccttgt taaaagccac tcaaggtgaa 1140

gctatcagaa actactacca tgatatgcac gttatccaag acatgttggt tccattatac 1200

aaagtcggtg acgcattaga atgggtccat agagaaatgg aagtatatcc aatttggttg 1260

tgtcctcaca agttgtttaa acaacctatc aaaggtcaaa tctatccaga acctggtttc 1320

gaatacgaaa atagacaagg tgacactgaa gacgcccaaa tgtacacaga tgtaggtgtt 1380

tattacgctc caggttgcgt attgagaggt gaagaatttg atggttctga agctgttaga 1440

agaatggaaa agtggttgat agaaaatcat ggtttccaac ctcaatatgc agttagtgaa 1500

ttggatgaaa agtctttttg gagaatgttc aacggtgaat tgtacgaaga atgcagaaag 1560

aaatacagag ctataggtac ctttatgtca gtctactaca agtccaagaa aggtagaaag 1620

actgaaaaag aagtaagaga agccgaacaa gctcacttgg aaacagcata tgccgaagct 1680

gattaa 1686

<210> 5

<211> 1551

<212> DNA

<213> Zebra fish Daniorerio

<400> 5

atggacccat tgttatactt gggtggttta gctgttttgt ttttaatctg gatcaaagta 60

aagggtttag aatacgttat aatacatcaa agatggattt ttgtttgttt attcttgtta 120

ccattgtcag ttgtctttga tgtctattac catttgagag catggatcat tttcaaaatg 180

tgctccgccc ctaagcaaca cgatcaaaga gtcagagaca ttcaaagaca agtaagagaa 240

tggagaaaag atggtggtaa aaagtacatg tgtactggta gaccaggttg gttgacagtc 300

tcattaagag ttggtaaata caaaaagact cataagaaca tcatgatcaa catgatggat 360

atcttggaag tagacacaaa gagaaaggta gttagagttg aacctttggc caatatgggt 420

caagtcacag ctttgttaaa ctccataggt tggaccttgc cagttttacc tgaattggat 480

gacttaaccg ttggtggttt agtcatgggt actggtatcg aatcttcatc ccatatctat 540

ggtttgtttc aacacatttg tgtagctttc gaattggttt tagcagatgg ttctttagtt 600

agatgcaccg aaaaagaaaa ttcagacttg ttttacgccg tcccatggtc ctgtggtaca 660

ttgggtttct tagtagctgc tgaaatcaga atcatcccag ctcaaaaatg ggttaagtta 720

cattatgaac ctgtcagagg tttggatgca atctgcaaaa agtttgcaga agaaagtgcc 780

aataaggaaa accaattcgt tgaaggttta caatactcta gagacgaagc tgtcatcatg 840

accggtgtaa tgactgatca tgcagaacca gacaagacta actgtatcgg ttactactac 900

aagccttggt ttttcagaca tgttgaatca tttttgaagc aaaacagagt tgcagtcgaa 960

tacataccat tgagacacta ctaccataga cacacaagat ctatattttg ggaattacaa 1020

gatatcatcc cattcggtaa caaccctttg tttagatacg ttttcggttg gatggtccca 1080

cctaagatct ctttgttgaa gttgacacaa ggtgaaacca tcagaaaatt gtatgaacaa 1140

catcacgtcg tacaagatat gttggttcct atgaaggaca taaaggccgc tatccaaaga 1200

ttccatgaag atatccacgt ttacccattg tggttatgcc ctttcttgtt accaaatcaa 1260

cctggtatgg ttcatccaaa aggtgacgaa gacgaattgt acgtagatat tggtgcctat 1320

ggtgaaccta aagttaagca ttttgaagct actagttcta caagacaatt ggaaaagttt 1380

gtaagagatg ttcacggttt ccaaatgttg tacgctgacg tttacatgga aagaaaggaa 1440

ttctgggaaa tgttcgatgg tactttgtac cataagttga gagaagaatt gggttgtaag 1500

gatgcatttc cagaagtttt cgacaaaatt tgcaagtcag ccagacacta a 1551

<210> 6

<211> 1692

<212> DNA

<213> cotton Gossypiumhirsulum

<400> 6

atgtctgact tgcaagcacc attaagacct aagagaaaga aaggtttggt agatttcttg 60

gttcaattca gatggatctt cgtcatattt ttcgtattgc cattctcaac tttgtactac 120

tttttgatat atttgggtga cgttagatcc gaaatgaaga gttacaagca aagacaaaag 180

gaacatgatg aaaacgtttt gaaggttgtc aagagattga agcaaagaaa cccaaagaaa 240

gatggtttgg tctgtacagc tagaaagcct tggatagcag tcggtatgag aaatgtagac 300

tataaaagag ctagacacta cgaagttgat ttgtccgctt ttagaaacat cttggaaata 360

gataagcaaa gaatgattgc tagagttgaa ccattggtca atatgggtca aataaccaga 420

gtcactgtac ctatgaactt gtccttagca gtagttgccg aattggatga cttaacagtt 480

ggtggtttaa tcaatggtta tggtattgaa ggttcttcac atatctacgg tttgtttagt 540

gacacagtcg tagcctatga aattgtttta gctgatggta gagttgtcag agcaaccaag 600

gacaacgaat actctgattt gttttatgcc atcccatggt cacaaggtac tttgggtttc 660

ttggttgctg ctgaaattaa attgatccca gtcaaggaat acatgagatt aacttacaca 720

cctgtagttg gtaatttgca agacttagca caaggttata tggattcatt tgccccaaga 780

gatggtgacc aagataaccc agaaaaagta cctgatttcg ttgagggtat ggtctattct 840

cctacagaag gtgtttttat gaccggtaga tacgcatcaa aggaagaagc caaaaagaaa 900

ggtaataaga ttaataacgt tggttggtgg ttcaaaccat ggttttatca acatgctcaa 960

acagcattga agaaaggcga attcgttgaa tacataccta ccagagaata ctaccataga 1020

cacactagat gtttgtactg ggagggtaaa ttgatcttac catttggtga ccaatggtgg 1080

tttagattct tgttaggttg gttgatgcca cctaaagttt ccttgttaaa ggcaacccaa 1140

ggtgaaagta tcagaaacta ctaccatgaa atgcacgtaa tccaagacat gttggttcct 1200

ttatacaaag tcggtgacgc tttggaatgg gttcatcacg aaatggaaat ctatccaata 1260

tggttatgcc ctcatagatt gttcaaattg ccagtaaaga ctatggttta cccagaacct 1320

ggttttgaac aacacagaag acaaggtgac actccttatg cccaaatgtt cacagatgtt 1380

ggtgtctatt acgctccagg tcctgtattg agaggtgaag tttttgatgg tgccgaagct 1440

gtcagaaagt tggaacaatg gttaattaag aatcattcct tccaaccaca atacgctgtt 1500

agtgaattga acgaaaaaga tttctggaga atgtttgacg cagatttgta tgaacacgtt 1560

agaagaaagt acggtgctgt cggtactttt atgtctgtat actacaagtc aaagaaaggt 1620

agaaagaccg aaaaggaagt tcaagaagcc gaacaagctc atttggaaac tgcatatgcc 1680

gaagctgatt aa 1692

<210> 7

<211> 1551

<212> DNA

<213> Equuscaballus

<400> 7

atggaaccag ctgtctcttt agcagtatgt gccttgttat ttttgttgtg gattagagtc 60

aagggtttag aattcgtaat catccatcaa agatgggtct tcgtatgctt gttcttgtta 120

ccattgtcat tgatcttcga tatctattac tatgttagag catgggttgt cttcaaatta 180

aattccgccc ctagattgca tgaacaaaga gttagaaaca ttcaaaagca agtcagagaa 240

tggaaagaac aaggtagtaa gacttttatg tgtacaggta gaccaggttg gttgacagtt 300

tctttgagag tcggtaaata caaaaagacc cataagaaca tcatgatcaa cttgatggat 360

atcttggaag ttgacactaa gaaacaaatc gttagagtcg aacctttagt aactatgggt 420

caagttacag ccttgttaaa ttcaattggt tggaccttgc cagttttacc tgaattggat 480

gacttaaccg tcggtggttt aattatgggt actggtatag aatcttcatc ccataagtac 540

ggtttgttcc aacacatctg tactgcctat gaattggtat tagctgatgg tagttttgtt 600

agatgcacac caagtgaaaa ttctgacttg ttctacgcag tcccttggtc ttgtggtact 660

ttgggtttct tggtagctgc tgaaatcaga atcatcccag ctaagaaata cgtcaagttg 720

agattcgaac ctgtaagagg tttggaagcc atctgtgata agtttgcttt agaagcacaa 780

agaccagaaa acgacttcgt tgaaggtttg ttatacagtt tggaagaagc tgtcatcatg 840

accggttcta tgactgataa agcagaacca tcaaagttga actccatcgg taactactac 900

aagccttggt ttttcaagca tgttgaaaac tacttgaaga ccaaccaaga aggtttagaa 960

tacatccctt tgagacacta ctaccataga cacactagat caatattttg ggaattgcaa 1020

gatatcatcc cattcggtaa caaccctgta ttcagatact ttttcggttg gatggttcca 1080

cctaagatct ccttgttgaa gttgacacaa ggtgaaacct tgagaaaatt gtacgaacaa 1140

catcacgtag ttcaagatat gttggttcca atgaagtgtt tgcaacaagc tttgcatact 1200

ttccaaaacg atatccacgt ttacccaata tggttgtgcc cttttatttt gccatcacaa 1260

cctggtttag ttcatccaaa aggtgacgaa acagaattgt acatcgacat tggtgcctat 1320

ggtgaaccta gagttaaaca tttcgaagct agatcatgta tgagacaatt ggaaaagttc 1380

gtaagatccg ttcacggttt ccaaatgttg tacgctgatt gctatatgaa cagagaagaa 1440

ttttgggaaa tgttcgacgg ttctttgtac cataagttga gaaagcaatt gggttgtgaa 1500

gatgcattcc cagaagttta cgacaagatc tgcaaggccg ctagacacta a 1551

<210> 8

<211> 1551

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 8

atgagtgccg tttggtcttt aggtgctggt ttgttgttgt tgttgttgtg ggttagacat 60

agaggtttag aagctgtttt ggtccatcac agatggatct tcgtttgttt ctttttgatg 120

ccattgtcta tcttgttcga tgtatactac caattaagag catgggccgt tagaagaatg 180

cattcagcac ctagattgca cggtcaaaga gtcagacata ttcaagaaca agtaagagaa 240

tggaaagaag aaggtggtag aagatatatg tgcacaggta gaccaggttg gttaaccgtt 300

tccttgagag tcggtaaata caaaaagact cataagaaca tcatgataaa cttaatggat 360

gtattggaag ttgactctga aagacaagtt gtcagagtag aaccattggt taccatgggt 420

caattaactg cttatttgaa tcctatgggt tggacaattc cagtagttcc tgaattagat 480

gacttgactg ttggtggttt aataatgggt acaggtatcg aatcttcatc ccacatctat 540

ggtttgtttc aacatacctg tatggcatac gaattggttt tagccgatgg ttcattagtc 600

agatgctccc caacagaaaa cagtgacttg ttttatgccg ttccttggtc ttgtggtacc 660

ttaggtttct tggtcgctgc tgaaattaaa atgatcccag ctaaaaagta catcagattg 720

cattacgaac ctgttagagg tttgagatca atctgcgaaa agtttactga agaatctaaa 780

aataaggaaa actcattcgt cgaaggttta gtatactcct tggaagaagc tgtaattatg 840

actggtgttt taacagatga agcagaacct agtaagatta atagaatcgg taactactac 900

aagccttggt ttttcaagca cgttgaaaag tatttgaagg ccaataagac tggtatcgaa 960

tacattccat ccagacatta ctaccataga cacacaagaa gtattttctg ggaattacaa 1020

gatatcatcc cattcggtaa caaccctgtc tttagatatt tgttcggttg gatggtacca 1080

cctaagatct ctttgttgaa gttgacccaa ggtgaagcaa ttagaaaatt gtacgaacaa 1140

catcacgtcg tacaagatat gttagttcct atgaagtcat tggaaaaatc catccaaact 1200

tttcacgttg acttaaacgt ctatccattg tggttatgtc ctttcttgtt accaaataac 1260

cctggtatgg ttcatccaaa gggtgacgaa accgaattgt atgttgacat aggtgcttac 1320

ggtgaaccta aaactaagca atttgaagct agagcatcta tgagacaaat ggaaaaattt 1380

gtcagatcag tacatggttt ccaaatgttg tacgcagatt gttatatgac tagagaagaa 1440

ttttgggata tgttcgacgg tagtttatac cactctttga gagaacaaat gaactgtaag 1500

gatgcctttc cagaagttta cgacaagatt tgcaaagccg ctagacatta a 1551

<210> 9

<211> 1551

<212> DNA

<213> Xenopus (Silurana) tropicalis

<400> 9

atggaattgt tattgtacgt tggtggttta ttgattttct tgttgttgtg gatgagagct 60

aaaggtttcg aatatgttat cgtccatcac agatggatct tcgtttgttt attcttgttg 120

ccattgtcag tcatattcga tgtatactac tacgcaagag cctggttggt tttcaagatg 180

tgctccgctc ctaagcaaca tgatagaaga gtcaaggata ttcaagacca agtaagacaa 240

tggaaggcag aaggtggtaa aaattttatg tgtactggta gaccaggttg gttgacagtt 300

agtttgagag tcggtaaata taaaaacacc cacaagaaca tcatgataaa tttgatggat 360

atcttggaag tagacactaa aagacaagtt gtcagagtag aacctttggt taacatgggt 420

caagttacag ctttgttgaa ctctataggt tggaccttac cagtagttcc tgaattggat 480

gacttaaccg ttggtggttt gattatgggt actggtatag aatcttcatc ccataacttc 540

ggtttattcc aacacatatg tttggcttac gaattggttt tagcagatgg ttcattagtc 600

agatgcactc caacagaaaa tagtgacttg ttttatgccg tcccttggtc ttgtggtaca 660

ttgggtttct tagtagctgc tgaaattaaa atcgtaccag ctaagaaata cgttaagttg 720

cattacaccc ctgttaaggg tttggaaaag atttgcgaaa aattttctag agaatctaaa 780

aataaggaaa actacttcgt cgaaggttta gtatattctg ccgatgaagc tgttattatg 840

accggtgtct tgactgacga agctcaagca ggtcaagtta acagaatagg tcaatactgg 900

aagccatggt ttttcagaca tgtcgaaagt tatttgaaaa ataacagaga tggtactgaa 960

tacatccctt tgagacacta ctaccataga cacacaaagt ctatcttttg ggaattacaa 1020

gatatcatcc cattcggtaa ccatcctgta ttcagatact ttttcggttg gatggttcca 1080

cctaagatct cattgttgaa gttgacacaa ggtgaaacca tcagaaagtt gtacgaacaa 1140

catcacgtcg tacaagatat gttagtccca atgaagtgtt tgcaaaaagc aataactgcc 1200

tttcattcag aaatctccgt ttatccattg tggttatgcc ctttcatttt accatcccat 1260

cctggtatga tacacccaaa gggtaacgaa gccgaattgt acgttgatat tggtgcttat 1320

ggtgaaccta aaacaaagca ttttgacgct aagggttcaa tgagaagatt ggaaaagttc 1380

gtaagagatg ttcacggttt ccaaatgttg tacgcagact gttatatgtc cagagaagaa 1440

ttttgggata tgttcgacgg tgcattgtac caaaagttgc gtggtaaatt gaactgtaac 1500

aacgccttcc cagaagttta cgataagata tgcaaggccg ctagacatta a 1551

<210> 10

<211> 1551

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 10

atggaaccag ctgtttcatt ggcagtctgt gccttgttat ttttgttgtg ggtcagagta 60

aagggtttgg aattcgtttt gatccatcaa agatgggttt tcgtctgctt attcttgtta 120

ccattgtcct tgatattcga tatctattac tacgttagag catgggttgt cttcaaatta 180

tcttcagccc ctagattgca tgaacaaaga gtaagagata tccaaaagca agttagagaa 240

tggaaagaac aaggttcaaa gacttttatg tgtacaggta gaccaggttg gttgacagta 300

tccttgagag ttggtaaata caaaaagacc cataagaaca tcatgatcaa cttgatggat 360

atcttggaag ttgacactaa aaagcaaatc gtaagagttg aacctttggt cacaatgggt 420

caagtaaccg ctttgttaac ttcaattggt tggactttgc cagttttacc tgaattggat 480

gacttaaccg tcggtggttt aatcatgggt actggtattg aatccagttc tcatagatac 540

ggtttgtttc aacacatatg taccgcttat gaattggtct tagcagatgg ttcttttgta 600

agatgcactc caatggaaaa tagtgactta ttctacgcag tcccttggtc ttgtggtact 660

ttgggtttct tggtagctgc tgaaatcaga attataccag ccaaaaagta cataaagttg 720

agattcgaac ctgttagagg tttggaagct atctgtgata agtttacaca tgaaagtcaa 780

caaccagaaa accacttcgt tgaaggtttg ttgtactctt tgcatgaagc tgttatcatg 840

acaggtgtca tgaccgatga agcagaacca tcaaagttga actccattgg taactactac 900

aaaccttggt ttttcaagca tgttgaaaac tacttaaaga caaacagaga aggtttagaa 960

tacatcccat tgagacacta ctaccataga cacaccagaa gtatcttttg ggaattgcaa 1020

gatatcattc cattcggtaa caaccctatt tttagatact tattcggttg gatggttcca 1080

cctaagatct ctttgttgaa gttgactcaa ggtgaaacat tgagaaaatt gtacgaacaa 1140

catcacgtag ttcaagatat gttagttcca atgaagtgtt tgcctcaagc tttacataca 1200

ttccacaatg acatacatgt ttatccaatc tggttatgcc cttttatatt gccatctcaa 1260

cctggtttag tccacccaaa aggtgacgaa gccgaattgt acgtagacat cggtgcttat 1320

ggtgaaccta gagttaaaca tttcgaagca agatcatgta tgagacaatt ggaaaagttc 1380

gtcagatccg tacacggttt ccaaatgttg tacgccgatt gctatatgga cagagaagaa 1440

ttttgggaaa tgttcgatgg ttcattgtac catagattga gaaagcaatt gggttgtcaa 1500

gatgcattcc cagaagttta cgacaagatc tgcaaggccg ctagacacta a 1551

<210> 11

<211> 1551

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

atggagcccg ctgtttctct ggctgtttgt gctctgctgt tcctgctgtg ggttcgactg 60

aagggtctgg agttcgttct gatccaccag cgatgggttt tcgtttgtct gttcctgctg 120

cccctgtctc tgatcttcga catctactac tacgttcgag cttgggttgt tttcaagctg 180

tcttctgctc cccgactgca cgagcagcga gttcgagaca tccagaagca ggttcgagag 240

tggaaggagc agggttctaa gaccttcatg tgtaccggtc gacccggttg gctgaccgtt 300

tctctgcgag ttggtaagta caagaagacc cacaagaaca tcatgatcaa cctgatggac 360

atcctggagg ttgacaccaa gaagcagatc gttcgagttg agcccctggt taccatgggt 420

caggttaccg ctctgctgac ctctatcggt tggaccctgc ccgttctgcc cgagctggac 480

gacctgaccg ttggtggtct gatcatgggt accggtatcg agtcttcttc tcacaagtac 540

ggtctgttcc agcacatctg taccgcttac gagctggttc tggctgacgg ttctttcgtt 600

cgatgtaccc cctctgagaa ctctgacctg ttctacgctg ttccctggtc ttgtggtacc 660

ctgggtttcc tggttgctgc tgagatccga atcatccccg ctaagaagta cgttaagctg 720

cgattcgagc ccgttcgagg tctggaggct atctgtgcta agttcaccca cgagtctcag 780

cgacaggaga accacttcgt tgagggtctg ctgtactctc tggacgaggc tgttatcatg 840

accggtgtta tgaccgacga ggctgagccc tctaagctga actctatcgg taactactac 900

aagccctggt tcttcaagca cgttgagaac tacctgaaga ccaaccgaga gggtctggag 960

tacatccccc tgcgacacta ctaccaccga cacacccgat ctatcttctg ggagctgcag 1020

gacatcatcc ccttcggtaa caaccccatc ttccgatacc tgttcggttg gatggttccc 1080

cccaagatct ctctgctgaa gctgacccag ggtgaaaccc tgcgaaagct gtacgagcag 1140

caccacgttg ttcaggacat gctggttccc atgaagtgtc tgcagcaggc tctgcacacc 1200

ttccagaacg acatccacgt ttaccccatc tggctgtgtc ccttcatcct gccctctcag 1260

cccggtctgg ttcaccccaa gggtaacgag gctgagctgt acatcgacat cggtgcttac 1320

ggtgagcccc gagttaagca cttcgaggct cgatcttgta tgcgacagct ggagaagttc 1380

gttcgatctg ttcacggttt ccagatgctg tacgctgact gttacatgaa ccgagaggag 1440

ttctgggaga tgttcgacgg ttctctgtac cacaagctgc gagagaagct gggttgtcag 1500

gacgctttcc ccgaggttta cgacaagatc tgtaaggctg ctcgacacta a 1551

Claims (7)

1.一种重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，将SEQIDNo.8所示核苷酸序列的的基因整合到酿酒酵母gal80基因上；所述酿酒酵母菌株为敲除ERG5基因的酿酒酵母CEN.PK株。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1、将固醇类物质C24位还原酶基因DHCR24两端引入BsaI酶切位点，连入pUC57-Kan载体，获得pUC57-Kan-DHCR24；用限制性内切酶BsaⅠ酶切pUC57-Kan-DHCR24，与经限制性内切酶BsaⅠ酶切的PRS425k-FBA1t-gal7p-PGK1t表达盒质粒连接，获得PRS425k-FBA1t-gal7p-DHCR24-PGK1t重组载体；

步骤2、以酿酒酵母BY4741基因组为模板PCR扩增gal80L、FBA1t、PGK1t、gal80R，以PRS425k为模板PCR扩增LEU2，然后通过OE-PCR方式拼接，得到两端带有PstI、BamHI酶切位点的左臂gal80L-LEU2-FBA1t片段，和右臂PGK1t-gal80R片段，然后用限制性内切酶PstI、BamHI酶切消化后连接到PEASY-Blunt载体上，获得PEASY-gal80L-LEU2-FBA1t重组载体和PEASY-PGK1t-gal80R重组载体；

步骤3、用限制性内切酶notⅠ分别酶切PRS425k-FBA1t -gal7p-DHCR24-PGK1t、PEASY-gal80L-LEU2-FBA1t和PEASY -PGK1t-gal80R重组载体，回收FBA1t-gal7p-DHCR24-PGK1t、gal80L -LEU2-FBA1t和PGK1t-gal80R片段；

步骤4、采用醋酸锂法将上述三个片段转化酿酒酵母菌株，SC-Leu缺陷型固体培养基筛选转化子。

3.权利要求1-2任一项所述构建方法构建得到的重组酿酒酵母菌株。

4.根据权利要求3所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.13442。

5.一种生产7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，将权利要求1-2任一项所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基活化；将活化后的微生物或重组酿酒酵母菌株接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取7-脱氢胆固醇。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，具体为将保藏编号为CGMCCNo.13442的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基在30℃、250rpm下进行一级种子活化，12h后转接至新鲜的种子培养基，在30℃、250rpm下进行二级种子活化；待二级种子培养基OD达到7时，以种子体积与罐内发酵液体积1:10的比例接种于发酵罐，发酵初糖为40g/L，之后用HPLC检测糖耗，流加补糖，使糖浓度不高于10g/L，待发酵罐中菌体OD达到50时停止补糖，继续检测乙醇代谢，补加乙醇使其不超过20g/L，120h收集菌体提取7-脱氢胆固醇。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述种子培养基为40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，余量为水；所述发酵培养基为40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/LD-半乳糖，余量为水。

Images