CN114072511B - 具有固醇生产能力的重组酵母菌株、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有固醇生产能力的重组酵母菌株、其制备方法及用途，更详细地，涉及如下的重组酵母菌株和其制备方法及用途，即，使ERG5及ERG6基因缺陷，以多重或密码子上下文方式对DHCR24及DHCR7基因进行密码子最优化并导入，由此以高收率生产胆固醇及胆固醇前体。并且，涉及如下的重组酵母菌株制备方法及用途，即，向所制备的上述重组酵母菌株追加导入tHM G1、ERG2、ERG3、ERG27或UPC2‑1基因，使得胆固醇及胆固醇前体生产收率增加。

Description

具有固醇生产能力的重组酵母菌株、其制备方法及用途
技术领域
本申请要求2018年7月26日提交的韩国专利申请第10-2018-0087372号的优先权，该专利申请在此被完全引入作为参考。
本发明涉及具有固醇生产能力的重组酵母菌株、其制备方法及用途，更详细地，涉及如下的重组酵母菌株和其制备方法及用途，即，使ERG5及ERG6基因缺陷，以多重或密码子上下文方式对DHCR24及DHCR7基因进行密码子最优化并导入，由此以高收率生产胆固醇及胆固醇前体。进而，涉及如下的重组酵母菌株制备方法及用途，即，向所制备的上述重组酵母菌株追加导入tHM G1、ERG2、ERG3、ERG27或UPC2-1基因等，使得胆固醇及胆固醇前体生产收率增加。
背景技术
酵母以可导入并表达多种次级代谢产物生物合成途径的宿主而备受关注。多种生物体生产的次级代谢产物为高附加价值化学化合物的主要供应处，在许多情况下，具有重要的医药特性。尤其，植物的代谢产物通过抗氧化剂或抗生素功能预防细菌、病毒、真菌等的感染，并且，作为有益于人体健康的功能性物质，其作为治疗剂的利用率高，由此，对于利用微生物的大量生产技术的需求高。次级代谢生物合成途径受到自身限制的酵母不妨碍通过基因工程导入的外源代谢途径或与其竞争，尤其，很好地建立了多种组学分析系统，由此具有可通过转录组和代谢组分析确保对于酵母宿主的生理状态的全面信息的优点。并且，研发了对于代谢过程的详细模型，并构建了可预测修饰的代谢网络行为的电子(insilico)酵母，具有利用其的人造细胞设计及制备更容易的优点。进而，作为单细胞真核微生物，酵母为适合于仅在如内质网及线粒体的细胞器官表达才能具有活性的如细胞色素(cytochrome)P450的外源酶表达的宿主，相比于原核微生物宿主具有如下的优先，即，进行对于源自植物及动物的酶活性必须的蛋白质翻译后具有修饰能力。另一方面，胆固醇为在哺乳动物中非常重要的生物构成物质，参与细胞分裂、生长、发育及分化的调节，以各种必须代谢物质(例，激素、胆汁酸等)的前体而周知，其前体以在发生初期及老化过程中起到重要作用而周知。由此，本发明提供能够以高收率生产胆固醇及其前体的重组酵母菌株。
现有技术文献
专利文献
韩国授权专利第10-0418187号。
发明内容
技术问题
本发明提供具有固醇(胆固醇及胆固醇前体)生产能力的重组酵母菌株。
并且，本发明提供上述具有固醇(胆固醇及胆固醇前体)生产能力的重组酵母菌株的制备方法和其用途。
技术方案
本发明提供ERG5及ERG6基因缺陷并导入DHCR24及DHCR7基因的具有固醇生产能力的重组酵母菌株。
能够以多重导入上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因的拷贝数(copy number)，或者能够以一拷贝以上导入进行密码子最优化的DH CR24和DHCR7合成基因。其中，在以多重导入上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因的拷贝数的情况下，DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因拷贝数可以为2～10。更优先为4～7。在基因拷贝数小于2的情况下，难以实现预期效果，当大于10时，效果的变化甚微。
向上述重组酵母菌株可追加导入选自由tHMG1、ERG3、ERG2、ERG27及UPC2-1基因组成的组中的一个以上的基因。
向上述重组酵母菌株可追加导入对ERG27-ERG2融合蛋白进行编码的合成基因。
上述DHCR24基因可向ERG6基因位置导入，上述DHCR7基因可向ERG5基因位置导入。如上所述，在构成基因导入位置的情况下，具有如下的效果，即，能够以更高的收率生产胆固醇和胆固醇前体，不会使如乙醇(ethanol)和乙酸盐(acetate)的副产物累积。
上述固醇可包含胆固醇前体或胆固醇两种中的一种以上。
上述胆固醇前体可包含选自由霉菌甾醇、脱氢胆固醇、烯胆甾烷醇、脱氢链甾醇及链甾醇组成的组中的一种以上。
上述重组菌株可利用基因多插入盒来制备，上述基因多插入盒依次包含酿酒酵母(Sacchoromyces cerevisiae)核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区(ribosomal DNAnontranscribed spacer；rDNA NTS)的N末端片段基因、插入目的基因、包含启动子区域的营养需求性选择标记基因及酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的C末端片段基因。
上述基因多插入盒的核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的N末端片段基因可由序列1(cacaagaggt aggtcgaaac agaacatgaa agttggtcgg taggtgc)表示，上述核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的C末端片段基因可由序列2(ggttttgcac catatcttca taacctgtcaccttgaaact acctctggc)表示。
上述营养需求性选择标记基因可以为包含由序列3(gaaacgaaga taaatc)表示的启动子区域的URA3基因、包含由序列4(ttacctttta catttcagcaa)表示的启动子区域的LEU2基因、包含由序列5(cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag)表示的启动子区域的HIS3基因或包含由序列6(tattgagcac gtgagtatac gtgattaagcacacaaaggc agcttggagt)表示的启动子区域的TRP1基因。
上述DHCR24基因及DHCR7基因能够以密码子适应指数(Codon Adaptation Index)方式或密码子上下文(codon context)方式进行密码子最优化。
以上述密码子适应指数方式最优化的DHCR7基因可由序列9构成，DHC R24基因可由序列10构成。
以密码子上下文方式进行密码子最优化的DHCR24基因可由序列17构成，DHCR7基因可由序列18构成。
上述重组酵母菌株可追加导入tHMG1基因
并且，本发明提供具有固醇生产能力的重组酵母菌株的制备方法，其特征在于，包括使酵母菌株的ERG5及ERG6基因缺陷后导入DHCR24及DHCR7基因的步骤，以多重导入上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因的拷贝数。
上述酵母菌株可以为酿酒酵母。
上述DHCR24及DHCR7基因导入可利用基因多插入盒执行，上述基因多插入盒依次包含酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的N末端片段基因、插入目的基因、包含启动子区域的营养需求性选择标记基因及酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的C末端片段基因。具体内容如在上文中所说明的内容。
并且，本发明提供在培养基培养上述重组酵母菌株来生产固醇的方法。
上述培养可在25℃～35℃的温度下执行2天～10天。
发明的效果
根据本发明，可通过ERG5及ERG6基因缺陷并以多重导入DHCR24及D HCR7基因的重组菌株或者ERG5及ERG6基因缺陷并导入通过密码子上下文方式进行密码子最优化的DHCR24及DHCR7基因的重组菌株以高收率生产胆固醇和其前体。进而，还包括如下的重组酵母菌株制备方法及用途，即，向所制备的上述重组酵母菌株追加导入tHMG1、ERG2、ERG3、ERG27或UPC2-1基因，使得胆固醇及胆固醇前体生产收率增加。
附图说明
图1示出本发明一实施例的重组酵母菌株的胆固醇生物合成途径。
图2示出本发明一实施例的重组酵母菌株的制备过程。图2a为重组酵母菌株#19(erg5::D24/erg6::D7)和#S1(erg6::D24/erg5::D7)制备及追加地多重插入DHCR24的重组酵母菌株制备示意图。图2b为向重组酵母菌株#19(erg5::D24/erg6::D7)和#S1(erg6::D24/erg5::D7)追加地多重插入或超表达DHCR24、HCR7及追加导入ERG3、ERG2、ERG27-2融合蛋白(fusion)、UPC2-1的重组酵母菌株制备示意图。
图3示出本发明一实施例的重组酵母菌株的制备过程。图3a为向酿酒酵母野生型菌株多重插入导入DHCR24、DHCR7的重组酵母菌株制备及导入追加的ERG3、ERG2、ERG27-2融合蛋白、UPC2-1的重组酵母菌株制备及在erg6缺陷的同时多重插入导入DHCR24的重组酵母菌株制备示意图。图3b为利用以密码子上下文方式进行密码子最优化的DHCR24(cc)、DHCR7(cc)的重组酵母菌株#cc19(erg5::ccD24/erg6::ccD7)和#ccS1(erg6::ccD24/erg5::ccD7)制备及追加地多重插入去除N-末端的一部分的tHMG1的重组酵母菌株制备示意图。
图4示出当制备本发明一实施例的重组酵母菌株时使用的载体。
图5为通过高效液相色谱-紫外/可见光(HPLC-UV/Vis)分析色谱图分析本发明一实施例的重组酵母菌株#19(erg5::D24/erg6::D7)和#S1(erg6::D24/er g5::D7)的胆固醇及其前体的生产量的结果。(*：未知峰值(unknown peak)，DD：脱氢链甾醇(dehydrodesmosterol)，D：链甾醇(desmosterol)，Z：霉菌甾醇(zymosterol)，C：胆固醇(cholesterol))。
图6为通过高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图分析本发明一实施例的重组酵母菌株NTSD24/#19(NTSD24/erg5::D24/erg6::D7)及NTSD24/#S1(NTSD24/erg6::D24/erg5::D7)的胆固醇及其前体的生产量的结果(DD：脱氢链甾醇，D：链甾醇，Z：霉菌甾醇，C：胆固醇)。
图7为比较分析本发明一实施例的重组酵母菌株的特性的图。图7a为根据重组菌株NTSD24D7/#19(NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7)的插入盒数的结果分析(实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析)。图7b为重组菌株#19和NTS D24D7/#19的胆固醇及其前体生产量分析结果(高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图)。图7c为重组菌株2uD24D7/#S1菌株的胆固醇及其前体生产量分析结果(高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图)。(DD：脱氢链甾醇，D：链甾醇，Z：霉菌甾醇，C：胆固醇)。
图8为通过高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图分析本发明一实施例的重组酵母菌株E3E2/NTSD24D7/#19、E3E27-2/NTSD24D7/#19、UPC2-1/NTSD24D7/#19的胆固醇及其前体生产量的结果(DD：脱氢链甾醇，D：链甾醇，Z：霉菌甾醇，C：胆固醇)。
图9为基于新构建的采用高效液相色谱电雾式检测器法(HPLC-CAD)的LC色谱图分析结果，分析了本发明一实施例的重组酵母菌株的胆固醇及其前体的生产量。(A)部分为对于三种标准产品(1：霉菌甾醇，2：麦角固醇，3：胆固醇)的LC色谱图，(B)部分为对于四种标准产品(4：7-脱氢链甾醇，5：链甾醇，6：7-脱氢胆固醇，7：烯胆甾烷醇)的LC色谱图，(C)部分为野生型菌株(CEN.PK)，(D)部分为重组菌株#19(erg5::D24/erg6::D7)。
图10为分析根据本发明一实施例制备的ARE2缺陷菌株的固醇谱的结果。图10a为基于同源重组技术的ARE2缺陷菌株制备示意图，图10b为基于高效液相色谱-紫外/可见光分析的以其他固醇提取方法确保的总固醇(total sterol)(氢氧化钾/乙醇(KOH/EtOH))和游离固醇(free sterol)(三氯甲烷/甲醇(Chloroform/MeOH))色谱图，图10c为基于高效液相色谱-紫外/可见光分析的are2/NTSD24D7/#19重组菌株的总固醇色谱图。(DD：脱氢链甾醇，D：链甾醇，Z：霉菌甾醇，C：胆固醇)。
图11a至11c分析了根据本发明的一实施例制备的重组酵母菌株的拷贝数与固醇生产量关系。图11d为通过高效液相色谱-紫外/可见光分析erg6::D7/UP C2-1/NTSD24D7菌株的固醇谱的结果。*：未知峰值，DD：脱氢链甾醇，D：链甾醇，Z：霉菌甾醇，C：胆固醇。
图12比较分析了本发明一实施例的重组酵母菌株的特性。图12a为包含在重组菌株NTSD7/NTSD24/#S1的制备中使用的盒的载体。图12b为根据重组菌株NTSD7/NTSD24/#S1的插入盒数的结果分析(实时荧光定量多聚核苷酸链式反应分析)。图12c为重组菌株NTSD7/NTSD24/#S1的胆固醇及其前体生产量分析结果(高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图)。
图13比较分析了本发明一实施例的重组酵母菌株的特性。图13a～图13d为包含在重组菌株#cc19、#ccS1的制备中使用的盒的载体。图13e为重组菌株#cc19、#ccS1的胆固醇及其前体生产量分析结果(高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图)。
图14比较分析了本发明一实施例的重组酵母菌株的特性。图14a为包含在重组菌株tHMG1/#cc19、tHMG1/#ccS1的制备中使用的tHMG1多插入盒的载体。图14b为根据多重插入重组菌株tHMG1/#cc19、tHMG1/#ccS1的tHMG1盒数的结果分析(实时荧光定量多聚核苷酸链式反应分析)。图14c为重组菌株tHMG1/#cc19、tHMG1/#ccS1的胆固醇及其前体生产量分析结果(高效液相色谱-紫外/可见光分析色谱图)。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。可通过以下实施例容易理解本发明的目的、特征、优点。本发明并不限定于在此说明的实施例，还能够以其他实施方式具体化。在此介绍的实施例为了向本发明所属技术领域的普通技术人员充分传递本发明的思想而提供。因此，本发明不应局限于以下的实施例。
本实施例以重组酵母菌株制备为目的来执行，上述重组酵母菌株代替作为酵母特异性固醇(sterol)的麦角固醇(ergosterol)且生产动物细胞的胆固醇(c holesterol)和胆固醇的前体。为此，以传统发酵酵母酿酒酵母为对象，通过阻隔麦角固醇最终生物合成阶段并导入胆固醇生物合成相关的外源基因来制备了具有胆固醇生物合成途径的重组酵母菌株(图1)。作为本实施例的具体策略，将参与麦角固醇特异性结构22-碳双键(22-carbonedouble bond)形成的C-22固醇去饱和酶(C-22sterol desaturase)基因ERG5和参与24-甲基碳(24-carb one methylation)的δ(24)-固醇C-甲基转移酶(Delta(24)-sterol C-methyl tra nsferase)基因ERG6破坏，向酵母宿主导入生成胆固醇所需的源自动物细胞的7-脱氢胆固醇还原酶(7-dehydrocholesterol reductase)基因DHCR7和24-脱氢胆固醇还原酶(24-dehydrocholesterol reductase)基因DHCR24，由此制备了以多种实施方式导入的重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(图2a)。并且，进而，为了使麦角固醇生物合成途径更有效地转换为胆固醇前体生物合成途径，所要制备追加导入ERG3(Delta(7)-sterol 5(6)-desaturase)、ERG2(C-8sterol isome rase)、ERG27(3-keto-steroid reductase)和作为麦角固醇生物合成途径调节转录因子的UPC2-1(Uptake Control Protein 2-1)的重组菌株(图2b)。作为另一方法，先向野生型菌株背景以多重插入DHCR7和DHCR24基因后，追加导入ERG3、ERG2、ERG27和作为麦角固醇生物合成途径调节转录因子的UPC2-1后，破坏ERG6来制备了胆固醇生产菌株(图3a)。进而，为了扩增作为麦角固醇生物合成途径的前体生物合成途径的甲羟戊酸生物合成途径(Mevalonat e pathway)，向宿主染色体以多重追加导入tHMG1基因(图3b)。
上述ERG5、ERG6、DHCR7、DHCR24、ERG3、ERG2、ERG27、ARE2、ERG27-ERG2、UPC2-1、tHMG1分别可由序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列19表示的序列构成。
ERG27-ERG2融合基因序列(序列15，下划线：ERG2部分)
ttgaaactagaacccccattccaaccaattacatgttcgatccaaaaactttgaacgaaatatgtaac tcggtgattagcaaacacaacgcagcagaaggtttatccactgaagacctgttacaggatgtcagagacgcacttg cctctcattacggggacgaatacatcaacaggtacgtcaaagaagaatgggtcttcaacaatgctggtggtgcgat gggccaaatgatcatcctacacgcttccgtatccgagtacttaattctattcggaaccgctgttggtactgaaggg cacacaggtgttcactttgctgacgactattttaccatcttacatggtacgcaaatcgcagcattgccatatgcca ctgaagccgaagtttacactcctggtatgactcatcacttgaagaagggatacgccaagcaatacagcatgccagg tggttcctttgcccttgaattggctcaaggctggattccatgtatgttgccattcgggtttttggacactttctcc agtactcttgatttatacactctatatagaactgtctacctgactgccagggacatgggtaagaacttgttgcaaa acaaaaagttctaa
UPC2-1序列(序列16，大写的下划线：G888D点突变位点(point mutati on site)(GGT to GAT))
attattaagagaagctgttttagaaatatctgagaataacaccgatgcgctagttgccagcgccctgatactaatcatggactcgttagcaaatgctagtggtaacggcactgtaggaaaccaaagtttgaatagcatgtcaccaagcgcttggatctttcatgtcaaaggtgctgcaacaattttaaccgctgtgtggcctttgagtgaaagatctaaatttcataacattatatctgttgatcttagcgatttaggcgatgtcattaaccctgatgttggaacaattactgaattggtatgttttgatgaaagtattgccgatttgtatcctgtcggcttagattcgccatatttgataacactagcttatttagataaattgcaccgtgaaaaaaaccagggtgattttattctgcgggtatttacatttccagcattgctagacaagacattcctggcattactgatgacaggtgatttaggtgcaatgagaattatgagatcatattataaactacttcgaggatttgccacagaggtcaaggataaagtctggtttctcgaaggagtcacgcaggtgctgcctcaagatgttgacgaatacagtggaggtggtGATatgcatatgatgctagatttcctcggtggcggattaccatcgatgacaacaacaaatttctctgatttttcgtta
以下，通过更具体的实施例更加详细地说明本发明。
<实施例>
材料
在本实施例中使用的引物、表达载体、酵母菌株整理在表1、表2、表3。在本实施例中制备的表达载体示意性地整理在图4，所使用的培养基及试剂如下。
-完全合成(SC)培养基(Synthetic Complete medium)：0.67％的不含氨基酸的酵母氮基(yeast nitrogen base without amino acids)(BD，291940)，2％的葡萄糖(glucose)(JUNSEI，64220S0650)，0.77g/L的补充所有必须氨基酸的脱落氨基酸混合物(drop-out amino acid mixture supplemented with all required amino acids)(CLONTECH，630425)
-融合克隆试剂盒(In fusion cloning kit)(TAKARA 121416)
-氢氧化钾(KOH)(JUNSEI，39040-0350/Sigma，P1767)
-乙醇(Ethanol)(MERCK，1.00983.1011)
-甲醇(Methanol)(B&J，AH230-4)
-庚烷(Heptane)(SIGMA，246654)
-石油醚(Petroleum ether)(B&J，317-4)
-焦棓酸(Pyrogallol)(TCI，P0570)
-丙酮(Acetone)(SIGMA，650501)
-Cosmosil C18-PAQ(4.6mm*250mm)柱(column)
-高效液相色谱乙腈(HPLC acetonitrile)(FISHER，A998-4)
-高效液相色谱水(HPLC water)(FISHER，W5-4)
-高效液相色谱分析用标准胆固醇前体
：羊毛甾醇(Lanosterol)(SIGMA，L5768)
：麦角固醇(Ergosterol)(SIGMA，45480-10g-f)
：霉菌甾醇(Zymosterol)(AVANTI，700068P)
：链甾醇(Desmosterol)(SIGMA，D6513)
：胆固醇(Cholesterol)(SIGMA，C8667)
：烯胆甾烷醇(Lathosterol)(SIGMA，C3652)
：7-脱氢链甾醇(7-Dehydrodesmosterol)(AVANTI，700138P)
：7-脱氢胆固醇(7-Dehydrocholesterol)(SIGMA，30800)
：葡萄糖生物(Glucose Bio)(Roche，06343732001)
：乙酸盐V2生物(Acetate V2 Bio)(COWIE，7395442001)
：乙醇生物(Ethanol bio)(Roche，8055645001)
设备
-高效液相色谱(HPLC)(Waters Separations Module 2695，Waters Du alλAbsorbance Detector 2487)
-聚合酶链式反应循环(PCR cycler)(Eppendorf，AG 22331)
-串珠机(Beadbeator)(BERTIN TECHNOLOGY，PrecellysR24)
-水浴(Water bath)(TAITEC，SDN-B)
-离心分离器(Centrifuge)(Eppendorf，5424R)
-旋转真空浓缩器(Rotational vacuum concentrator)(CHRIST，RVC 2-25CDplus)
-采用高效液相色谱电雾式检测器法系统(Thermo scientific，Dionex Ultimate 3000-Corona Veo RS)
-生物处理分析仪(Bioprocess analyzer)(Roche，Cedex Bio)
表1
在本实验中使用的引物
表2
在本实验中使用的质粒
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表3
在本实验中使用的酵母菌株
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酵母转化(乙酸锂/聚乙二醇(LiAc/PEG)方式)
为了利用所制备的上述载体或盒来执行转化，在酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)(2％(w/v)的细菌蛋白胨(Bacto-peptone)、1％(w/v)的酵母提取物(Bacto-YeastExtract)、2％(w/v)的D-葡萄糖(Glucose))液体培养基预培养菌株后，在500mL的三角烧瓶(baffled flask)中，将初始OD 600值设置为0.2，并在30℃的振荡培养箱中以180rpm的条件培养50mL的上述预培养的菌株。6～7小时后，培养至OD 600值达到1.0为止后，在4℃、4000r pm的条件下离心分离10分钟。去除上清液，添加1mL的乙酸锂/TE(LiAc/T E)缓冲溶液(0.01M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1M的乙酸锂(LiAc)，pH值为7.5)，利用移液(pipet ting)悬浮后，在13000rpm的条件下离心分离1分钟来获取了沉淀物。再次悬浮在500μL的乙酸锂/TE缓冲溶液来制备了感应细胞(competentcell)。分为5个来接种，每个为100μL，向每个试管(tube)混合2μL的重组载体或盒、10μL的鲑鱼精(salmon sperm)脱氧核糖核酸(DNA)、600μL的聚乙二醇/乙酸锂(PEG/LiAc)缓冲溶液(50％的聚乙二醇(polyethylene glycol)，0.01M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1mM的乙二胺四乙酸，0.1M的乙酸锂，pH值为7.5)后，小心移液3次～4次。在30℃的温度下放置30分钟后，添加70μL的二甲基亚砜(DMSO)来移液后，在42℃的温度下热处理15分钟。在冰上放置3分钟后，利用灭菌的蒸馏水悬浮在13000rpm的条件下离心分离1分钟来获取的沉淀物，并涂抹在缺乏特定氨基酸(LEU or TRP or HIS)或碱基(UR A)的基于完全合成的选择培养基SC-LEU、SC-URA、SC-LUE-URA-TRP、S C-LUE-URA-TRP-HIS(0.67％的不含氨基酸的酵母氮碱基(yeastnitrogen base without amino acids)，2％的葡萄糖，0.77g/L的不含亮氨酸、色氨酸、组氨酸或尿嘧啶的组合的脱落氨基酸混合物(drop-out amino acid mixturesupplement ed without leucine,tryptophan,histidine,or uracil incombination))，在30℃的温度下培养48小时后获取了基因转移生物(Hill Jet.al.1991)。
实施例1：通过ERG5、ERG6缺陷和同时插入DHCR24、DHCR7来制备固醇生产菌株
首先，在为了ERG5、ERG6缺陷而所要进行同源重组(homologous recombination)的N片段和C片段中，利用在表1所示的erg5 dN fw、erg5 dN rv、erg5 dC fw、erg5 dC rv、erg6 dN fw、erg6 dN rv、erg6 dC fw、erg6 dC rv引物来分别获取N、C两个聚合酶链式反应(PCR)片段后，利用其片段执行融合聚合酶链式反应(Fusion-PCR)来获取了pT-ERG5dNC、pT-ERG6dNC。在以酵母用密码子适应指数方式进行密码子最优化的克隆有源自斑马鱼的DHCR24和DHCR7基因的pMKRQ-DrDHCR24、p MKRQ-DrDHCR7中，通过聚合酶链式反应回收DHCR7、DHCR24脱氧核糖核酸切片，并且，与通过聚合酶链式反应获取的411bp TEF1启动子(promoter)和314bp GAL7终止子(terminator)一同连接(ligation)来制备pT-DHCR24、pT-DHCR7载体后，从该载体取出TEF1p-DHCR7-GAL7t、TEF1p-DHCR24-GA L7t片段并向pT-ERG5dNC、pT-ERG6dNC载体的N、C片段中心BamHI/XbaI位置插入，从pUG73、pUG72载体取出KlURA3、KlLEU2并向NotI位置插入，从而获取了最终载体pT-erg5::DHCR24-LEU2、pT-erg6::DHCR7-URA3、pT-er g6::DHCR24-LEU2、pT-erg5::DHCR7-URA3(图4a、图4b、图4c、图4d)。对最终载体进行SphI/MluI处理来回收erg5::DHCR24-LEU2、erg6::DHCR7-UR A3、erg6::DHCR24-LEU2、erg5::DHCR7-URA3盒后，以乙酸锂/聚乙二醇方式向CENPK菌株转化，在SC-LEU、SC-URA、SC-LEU-URA培养基筛选来制备了erg5::D24、erg6::D7、erg6::D24、erg5::D7、erg5::24/erg6::D7、erg6::D24/erg5::D7重组菌株(图2，步骤1，表3)。
实施例2：DHCR24多重插入盒制备及重组酵母筛选
为了以多重插入胆固醇生物合成基因，利用本研究组研发的基于rDNA-NTS的多重插入盒系统(Moon et al.,2016)制备了NTS-DHCR24-86TRP1盒。向pT-NTS-86TRP1载体的BamHI位置插入从pT-erg6::DHCR24-LEU2取出的TEF1p-DHCR24-GALt7片段来制备pT-NTS-DHCR24-86TRP1(图4e)，并对其进行SphI/NsiI处理来回收NTS-DHCR24-86TRP1盒后，向erg5::D24/er g6::D7(#19，保藏号：KCTC 13889BP)、erg6::D24/erg5::D7(#S1，保藏号：KCTC 13888BP)重组菌株导入，并在SC-LEU-URA-TRP培养基筛选来制备了NTSD24/#19及NTSD24/#S1重组菌株(图2，步骤2)。
实施例3：DHCR24/DHCR7多重插入制备及重组酵母筛选
通过下述方式制备一同包含DCHR24和DHCR7表达盒的pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1载体(图4f)，即，利用ACT1p fw和ACT1p rv引物扩增837bp大小的ScACT1启动子，利用DHCR7 fw2和DHCR7 rv2引物扩增1458bp大小的DHCR7基因，利用CYC1t fw和CYC1t rv引物扩增252bp大小的CYC1终止子部位，通过融合聚合酶链式反应将其制备为一个片段后，向现有的pT-NTS-DHCR24-86TRP1载体的KpnI位置插入来制备。对通过上述方式制备的pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1进行SphI/NsiI处理来回收NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1盒后，向erg5::D24/erg6::D7(#19)重组菌株转化，并在SC-LEU-URA-TRP培养基筛选来制备了NTSD24D7/#19重组菌株(保藏号：KCTC 13884BP)(图2，步骤3，右侧部分)。
并且，对pT-NTS-86TRP1-DHCR24-DHCR7载体进行BamHI处理来去除了DHCR24，由此制备了pT-NTS-86TRP1-DHCR7载体。之后，对pT-NTS-86TRP1-DHCR7载体进行SmaI/NotI处理来去除86TRP1后，利用引物101HIS3fw、101HIS3 rv，插入通过聚合酶链式反应获取的101bp大小的具有启动子的HIS3片段，由此制备了pT-NTS-101HIS3-DHCR7(图12a)。进行SpeI/XbaI处理来获取NTS-101HIS3-DHCR7盒后，以乙酸锂/聚乙二醇方式向NTSD24/#S1菌株转化，在SC-HIS培养基筛选来获取了NTSD7/NTSD24/#S1菌株(保藏号：K CTC 13885BP)。为了确认向所制备的菌株NTSD7/NTSD24/#S1基因组中导入的盒数，通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析相应菌株的导入拷贝数的结果，可确认，DHCR7的基因导入约4个盒，DHCR24的基因导入约2个盒(图12b)。
实施例4：基于附加体质粒(Episomal plasmid)的DHCR24/DHCR7表达载体制备
利用2微酵母附加体质粒(micro yeast episomal plasmids)的Y2pH-DHC R7-DHCR24载体(图4g)通过向Y2pH载体的BamHI/XhoI位置插入从pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1取出的DHCR24-DHCR7来制备，以乙酸锂/聚乙二醇方式向erg6::D24/erg5::D7(#S1)重组菌株转化后，在SC-LEU-URA-HIS培养基筛选，由此获取了2uD24D7/#S1重组菌株(图2，步骤3，左侧部分)。
实施例5：ERG27-ERG2融合基因(fusion gene)、ERG3超表达菌株制备
为了ERG2、ERG3表达，通过下述方式制备Y2pH-ERG3-ERG2载体(图4f)，即，利用TDH3p fw和TDH3p rv引物扩增714bp大小的ScTDH3启动子，利用ERG3 fw和ERG3 rv引物扩增1098bp大小的ScERG3基因，利用TEF1t fw和TEF1t rv引物扩增367bp大小的ScTEF1终止子部位，通过融合聚合酶链式反应将其制备为一个片段，利用TEF2p fw和TEF2p rv引物扩增836bp大小的ScTEF2启动子，利用ERG2 fw和REF2 rv引物扩增666bp大小的ScERG2基因，利用TDH3t fw和TDH3t rv引物扩增484bp大小的ScTDH3终止子部位，通过融合聚合酶链式反应将其制备为一个片段后，向现有的Y2pH载体的BamHI/XhoI位置插入来制备。通过下述方式制备Y2pH-ERG3-ERG27-2融合载体(图4g)，即，对于ERG27和ERG2，通过融合聚合酶链式反应，利用ER G27-2fw1和ERG27-2 rv1获取第一聚合酶链式反应生成物(product)，利用ERG27-2 fw2和ERG27-2 rv2获取第二聚合酶链式反应生成物，之后，利用Sp hI位点，代替ERG2向Y2pH-ERG3-ERG2载体插入来制备。将所制备的Y2pH-ERG3-ERG2、Y2pH-ERG3-ERG27-2融合载体向NTSD24D7/#19菌株转化后，在SC-LEU-URA-TRP-HIS培养基筛选，由此制备了E3E2/NTSD24D7/#19、E3E27-2/NTSD24D7/#19重组菌株。
实施例6：UPC2-1导入菌株制备
在本研究组中，向2uD24D7/#19菌株转化利用480bp大小的UPC2启动子和酵母中心粒质粒(YCp，yeast centromere plasmids)来制备的YCpH-np-UPC2后，在SC-LEU-URA-TRP-HIS培养基筛选来制备了UPC2-1/NTSD24D7/#19重组菌株(图2，步骤4，左侧部分)。
实施例7：erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7菌株制备
向CEN.PK野生型菌株转化之前制备的NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1盒后，在SC-TRP培养基筛选来获取了NTSD24D7/WT重组菌株。之后，导入所制备的上述Y2pH-ERG3-ERG2、Y2pH-ERG3-ERG27-2、YCpH-np-UPC2来制备了E3E2/NTSD24D7/WT、E3E27-2/NTSD24D7/WT、UPC2-1/NTSD24D7/WT菌株。其中，选择UPC2-1/NTSD24D7/WT菌株并利用erg6::DHCR7-URA3盒来使ERG6基因缺陷，由此制备了erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7菌株(图3)。
实施例8：固醇酯(Sterol ester)化主要基因ARE2缺陷菌株制备
为了利用同源重组的ARE2缺陷，利用ARE2 dN fw、ARE2 dN fw、ARE2 dC fw、ARE2dC fw引物分别通过聚合酶链式反应获取N片段和C片段后，利用其片段执行融合聚合酶链式反应来获取了pT-ARE2dNC。之后，向两个片段之间的XhoI/EcoRV位点插入ScHIS3来获取了最终载体pT-ARE2dNC-HIS，通过SphI/MluI处理获取ARE2dNC-HIS盒后，通过乙酸锂/聚乙二醇方式向NTSD24D7/#19菌株转化后，在SC-LEU-URA-TRP-HIS培养基筛选，由此制备了are2Δ/NTSD24D7/#19重组菌株。
实施例9：利用以密码子上下文(Codon context)方式进行密码子最优化的ccDHCR24、ccDHCR7的ERG5、ERG6缺陷和DHCR24/DHCR7同时插入制备及重组酵母筛选
对以往制备的pT-ERG5dNC-DrDHCR7、pT-ERG5dNC-DrDHCR24、pT-E RG6dNC-DrDHCR7、pT-ERG6dNC-DrDHCR7载体进行PstI/SalI处理来准备主链(backbone)，通过密码子上下文方式，在将ccDHCR24、ccDHCR7基因合成的pMKRQ-sDrDHCR7(cc)、pMKRQ-sDrDHCR24(cc)载体中，利用引物ccD7 fw、ccD7 rv、ccD24 fw、ccD24 rv对通过聚合酶链式反应获取的cc DHCR24、ccDHCR7片段进行KpnI/SalI处理来获取了嵌入物(insert)，通过连接上述嵌入物来获取了载体pT-ERG5dNC-ccDHCR7、pT-ERG5dNC-ccDHCR24、pT-ERG6dNC-ccDHCR7、pT-ERG6dNC-ccDHCR24。之后，从pUG73、p UG72载体取出KlURA3、KlLEU2并向NotI位置插入，由此获取了最终载体p T-erg5::ccDHCR24-LEU2、pT-erg6::ccDHCR7-URA3、pT-erg6::ccDHCR24-LEU2、pT-erg5::ccDHCR7-URA3(图13a～图13d)。对最终载体进行SphI/MluI处理来回收erg5::ccDHCR24-LEU2、erg6::ccDHCR7-URA3、erg6::ccDHCR24-LEU2、erg5::ccDHCR7-URA3盒后，通过乙酸锂/聚乙二醇方式向CEN.PK菌株转化，并在SC-LEU、SC-URA、SC-LEU-URA培养基筛选，从而制备了erg5::ccD24、erg6::ccD7、erg6::ccD24、erg5::ccD7、erg5::ccD24/erg6::ccD7(＝#cc19，保藏号：KCTC 13886BP)、erg6::ccD24/erg5::ccD7(＝#ccS1，保藏号：KCTC13882BP)重组菌株(表3)。
实施例10：通过多重插入tHMG1来增加重组#cc19、#ccS1菌株的胆固醇生产量
能够多重插入的pT-NTS-86TRP1-tHMG1载体利用在表1记述的引物tHMG1-fw和tHMG1-rv向pT-NTS-86TRP1的EcoRI/SalI插入扩增的N-末端552氨基酸(amino acid)被去除的HMG1基因，由此制备了pT-NTS-86TRP1-tHMG1载体(图14a)。对所制备的pT-NTS-86TRP1-tHMG1载体进行SpeI/NsiI处理来获取NTS-86TRP1-tHMG1盒后，通过乙酸锂/聚乙二醇方式向erg5::ccD24/er g6::ccD7(＝#cc19)、erg6::ccD24/erg5::ccD7(＝#ccS1)菌株转化，并在SC-TR P培养基筛选，由此获取了tHMG1/erg5::ccD24/erg6::ccD7(＝tHMG1/#cc19，保藏号：KCTC 13887BP)、tHMG1/erg6::ccD24/erg5::ccD7(＝tHMG1/#ccS1，保藏号：KCTC 13883BP)重组菌株(表3)。为了确认向所制备的菌株tHMG1/#cc19、tHMG1/#ccS1基因组中导入的盒数，通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析相应菌株的导入拷贝数的结果，可确认，导入了约3个～4个的盒(图14b)。
<实验例>
分析利用实时荧光定量聚合酶链式反应的插入拷贝数
为了确认所制备的重组菌株的所插入的靶基因表达盒拷贝数，回收染色体(chromosome)脱氧核糖核酸后，将该染色体脱氧核糖核酸作为模板(templat e)来执行了实时荧光定量聚合酶链式反应。
分析代谢副产物及残留碳源
最终培养后，测定了累积在上清液中的代谢副产物(例：乙醇、乙酸盐)和作为培养时添加的碳源的葡萄糖残留量。用于分析的试样利用了本培养最终培养液，对其进行离心分离(12000rpm，10分钟)来分析了上清液。利用生物过程分析仪(Bio process analyzer)来进行分析，并利用相应设备的乙醇、乙酸盐、葡萄糖测定专用试剂盒(Roche/COWIE)来进行分析。
基于高效液相色谱-紫外/可见光分析胆固醇及前体
在高效液相色谱分析中，向完全合成培养基[Synthetic Complete medium(0.67％的不含氨基酸的酵母氮碱基(yeast nitrogen base without amino acids)，2％的葡萄糖，0.77g/L的补充所有必须氨基酸的脱落氨基酸混合物(drop-out amino acidmixture supplemented with all required amino acids))]接种菌株1～2菌落(colony)来执行种菌培养后，进行初始接种，使得OD600＝0.3～0.5，之后，在完全合成培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基中培养。为了提取总固醇(Total sterol)，培养3天至6天(28℃，220rpm)并回收10m L的样品后，将0.05g/wet的重量颗粒(weight pellet)悬浮在1mL的氢氧化钾/乙醇(KOH/EtOH)(3∶2)(4.5M的氢氧化钾最终浓度(KOH final concentration))混合液后，在85℃的温度下培养1小时，添加0.5mL的庚烷(hepta ne)(sigma)后，利用串珠机(beadbeator)(6000rpm，15秒钟，反复3次)混合。对于混合的样品，通过离心分离(12000rpm，10分钟，25℃)回收作为上清液的0.5mL的庚烷(heptane)层(12000rpm，10分钟，25℃)后进行干燥，对于添加200μL的丙酮(acetone)并溶化的样品执行了高效液相色谱分析。为了提取游离固醇(Free sterol)，向0.5mL的三氯甲烷(chloroform)∶甲醇(MeOH)(2∶1)混合物(mixture)添加颗粒(pellet)后，利用串珠机(6000rpm，15秒钟，反复3次)来进行混合。对于混合的样品，通过离心分离(12000rpm，10分钟，25℃)回收有机溶剂层后进行干燥，向干燥颗粒添加250μL的己烷(hexane)来溶化后再次进行干燥。完全干燥后，对于添加200μL的丙酮(acetone)来融化的样品执行了高效液相色谱分析。当进行高效液相色谱分析时，柱使用Cosmosil C18-PAQ(4.6mm*250mm)，流量(flow rate)为1mL/min，分析溶剂为90％的乙腈(Acetonitrile)，分析时间为50分钟(min)。使用紫外/可见光(UV/Vis)检测仪在203nm的波长分析与胆固醇及前体相应的峰值(peak)。
基于采用高效液相色谱电雾式检测器法分析胆固醇及前体生产性
为了确认所制备的菌株中的胆固醇及前体生产性而用于采用高效液相色谱电雾式检测器法分析的细胞培养与基于上述高效液相色谱分析内容相同。为了提取胆固醇及前体，回收50mL的培养3天至6天(28℃，220rpm)的样品后，在20mL的再悬浮(resuspension)溶液(15％的氢氧化钾(w/v)，0.125％的焦棓酸(w/v)，71％的甲醇(v/v))进行再悬浮。将其在85℃的温度下反应2小时后，在常温条件下冷却，添加5mL的石油醚后，进行5分钟的涡流(vortexing)来混合。对混合的样品进行离心分离(3000g，5分钟)并回收上清液。之后，反复2次添加石油醚并提取的过程，以3mL进行来回收所有上清液。利用旋转真空浓缩器干燥所回收的上清液，对于向干燥的试样添加1mL的甲醇来溶化的样品执行了采用高效液相色谱电雾式检测器法分析。当进行采用高效液相色谱电雾式检测器法分析时，柱使用了Capcellpak(C18，4.6mm×250mm，5μm)，将甲醇用作流动相，流量及条件如下述表。分析时间为45分钟(min)。
通过上述分析法分析7种标准产品(霉菌甾醇、麦角固醇、烯胆甾烷醇、7-脱氢胆固醇、7-脱氢链甾醇、链甾醇、胆固醇)的结果(参照图9)，麦角固醇和链甾醇的停留在高效液相色谱峰值(HPLC peak)的时间分别为30.7分钟和30.4分钟，相重叠，但是，在野生型酵母菌株中，仅生产麦角固醇，在以能够生产胆固醇及前体的方式制备的重组酵母菌株的情况下，仅生产链甾醇，因此，通过相应分析法执行了最终生产性分析。
实验例1：对于通过erg5、erg6缺陷及DHCR24、DHCR7表达制备的固醇生产菌株的高效液相色谱分析
高效液相色谱-紫外/可见光分析结果，在erg5::D24/erg6::D7、erg6::D24/erg5::D7菌株可确认胆固醇峰值(cholesterol peak)，erg5::D24/erg6::D7(#19)菌株示出3.1ppm、erg6::D24/erg5::D7(#S1)菌株示出了7.5ppm的胆固醇生产量(表4)。但是，作为胆固醇前体的霉菌甾醇、脱氢链甾醇、链甾醇的含量非常高(图5)。
实验例2：对于通过DHCR24多重插入制备的固醇生产菌株的高效液相色谱分析
为了研究所生产的胆固醇生产量增加，利用本研究组研发的基于rDNA-NT S的多插入盒系统对追加导入NTS-DHCR24-86TRP1盒的菌株进行高效液相色谱分析结果，相比于#19菌株，在NTSD24/#19重组菌株中，可确认约高于2.4倍的7.4ppm的胆固醇生成峰值(图6，表4)。并且，相比于#S1菌株，在NT SD24/#S1重组菌株中，可确认约高于1.5倍的11.5ppm的胆固醇生成峰值(图6，表4)。
实验例3：对于通过DHCR24、DHCR7多重插入制备的重组菌株的实时荧光定量聚合酶链式反应及高效液相色谱分析
通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析多重插入NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1盒来获取的NTSD24D7/#19重组菌株的所插入的盒数的结果，上述NTS-D HCR24-DHCR7-86TRP1盒同时包含DHCR24、DHCR7两个基因表达盒，获取了插入3～4个为止的菌株(图7a)。进行高效液相色谱分析结果，相比于erg5::D24/erg6::D7(#19)菌株，在NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7(NTSD24D7/#19)重组菌株中，可确认约高于2.9倍的9.0ppm的胆固醇生成峰值(图7b)。并且，进行高效液相色谱分析结果，相比于#S1菌株，在2uD24D7/#S1重组菌株中，也可确认约高于1.5倍的11.1ppm的胆固醇生成峰值(图7c，表4)。
实验例4：对于通过ERG27-ERG2融合基因(fusion gene)、ERG3及UPC2-1超表达制备的重组菌株的高效液相色谱分析
为了所制备的NTSD24D7/#19重组菌株的更佳的胆固醇生产效率增加，对在霉菌甾醇中参与胆固醇生产的追加表达ERG27、ERG2、ERG3基因的菌株进行高效液相色谱分析结果，相比于NTSD24D7/#19，在E3E2/NTSD24D7/#19、E3E27-2/NTSD24D7/#19、UPC2-1/NTSD24D7/#19重组菌株中，固醇生产量差异不大(表4，图8)。但是，在导入ERG3、ERG27-2或UPC2-1的重组菌株的情况下，胆固醇前体生产量呈显著增加的趋势。
实验例5：基于采用高效液相色谱电雾式检测器法的重组菌株的胆固醇及前体生产量分析
通过基于采用高效液相色谱电雾式检测器法的分析法分析胆固醇及前体生产性，并在图9示出其结果。经确认，相对于野生型菌株，重组菌株#19(erg5::D24/erg6::D7)以高收率生产7-脱氢链甾醇、霉菌甾醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇及胆固醇。
在表4整理了通过如上所述的方法制备的重组菌株地胆固醇及胆固醇前体的生产量。
表4
基于采用高效液相色谱电雾式检测器法的重组菌株的胆固醇及前体生产量比较分析
(E：麦角固醇，Z：霉菌甾醇，7-dc：7-脱氢胆固醇，7-dm：7-脱氢链甾醇，D：链甾醇，C：链甾醇)
(菌株(Strains)：CEN.PK(WT)、#19、#S1、NTSD7/#19、NTSD7/#S1、NTSD24/#19、NTSD24/#S1、NTSD24D7/#19、2μD24D7/#S1、E3E2/NTSD24D7/#19、E3E27-2/NTSD24D7/#19、UPC2-1/NTSD24D7/#19)
实验例6：对于固醇酯(Sterol ester)化主要基因ARE2缺陷重组菌株的高效液相色谱-紫外/可见光分析
为了储存在酵母细胞中过量的固醇(sterol)，在参与酯(ester)化及脂滴(lipiddroplet)保存的ARE1、ARE2基因(Hohmann H-P et.al.2017)中，通过同源重组的基因破坏方法在NTSD24D7/#19菌株尝试ARE2的缺陷，上述ARE2负责有氧生长中的主要功能(图10a)。在通过维持游离胆固醇(Free cholesterol)形态的提取法准备的样品的情况下，在野生型菌株背景中，胆固醇的量没有大变化，相反，观察到前体中的脱氢链甾醇的量大大减少(图10b)。这教示，在脱氢链甾醇的情况下，大部分以酯化的状态存在，但是，大部分胆固醇以游离的形态存在。所制备的are2Δ/NTSD24D7/#19菌株的高效液相色谱分析结果，胆固醇量没有打差异，大量累积的脱氢链甾醇的量有所减少。从这种结果可推测，从NTSD24D7/#19菌株生产的大部分胆固醇处于游离固醇(free st erol)状态。
实验例7：以野生型菌株为对象分析作为固醇生产重组酵母的酿酒酵母
在之前尝试的策略中，作为利用多插入盒系统来增加染色体(chromosome)中的NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1盒的插入数的方法，先向野生型菌株多重插入NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1盒后尝试ERG6缺陷，通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析通过第一步骤制备的NTSD24D7/WT重组菌株的所插入的盒的结果，可获取插入4个～10个为止的各种候选菌株(图11a)。之后，在效液相色谱-紫外/可见光分析中，插入7个的候选组(NTSD24D7/WT#8)中的麦角固醇的峰值大大减少，相反，经推测，菜油甾醇(campesterol)示出峰值的最高值(图11b)。因此，在之后的实验中，使用插入7个的候选组(NTSD24D7/WT#8)来制备了E3E2/NTSD24D7/WT、E3E27-2/NTSD24D7/WT菌株，但是，进行高效液相色谱-紫外/可见光分析的结果，与NTSD24D7/WT菌株没有大差异。另一方面，在UPC2-1/NTSD24D7/WT重组菌株的情况下，由于整体麦角固醇生物合成途径(ergosterol pathway)活性化，反而使麦角固醇生产增加(图11c)。之后，对所制备的erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7菌株进行高效液相色谱-紫外/可见光分析的结果，相比于以往制备的示出最高胆固醇生产量的NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7(NTSD24D7/#19)重组菌株，胆固醇生产量并没有更优秀(图11d)。
实验例8：固醇生产重组菌株#S1及#19的生产量及副产物累积量分析
确认所制备的菌株的代谢副产物累积量的结果，在#19(erg5::D24/erg6::D7)菌株中，最终培养后，累积如乙醇和乙酸盐的副产物，相反，在#S1(erg6::D24/erg5::D7)菌株的情况下，少量累积乙酸盐，但是，未确认到作为主要代谢副产物的乙醇的累积，因此，可确认，与野生型相同的形态。并且，分析细胞生长量的结果，在#19(erg5::D24/erg6::D7)菌株的OD600值约为14.8，相比于野生型菌株(WT)及#S1(erg6::D24/erg5::D7)菌株约46.5、约57.3的各自的OD600值，可确认，生长被抑制(表5)。
表5
重组菌株#S1及#19的生长量及副产物累积量比较分析
实验例9：在完全合成培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基中分析源自#S1的菌株和DHCR基因密码子最优化菌株的胆固醇及胆固醇前体生产量生产量
细胞生长量及副产物累积量分析结果教示，相比于#19(erg5::D24/erg6::D7)菌株，生长佳且几乎没有副产物累积的#S1(erg6::D24/erg5::D7)菌株更适作为工业业菌株。由此，在完全合成培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基进行培养，并利用基于采用高效液相色谱电雾式检测器法的LC色谱图详细比较源自#S1的重组菌株的胆固醇及前体生产量(表6)。当在酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基培养时，相比于利用完全合成培养基，细胞生长高，使得总胆固醇生产量高，相反，在完全合成培养基中培养的情况下，确认了在每个菌体生产的胆固醇量高。
表6
利用基于采用高效液相色谱电雾式检测器法的高效液相色谱分析在完全合成培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基中培养的源自#S1(erg6::D24/erg5::D7)的重组菌株的胆固醇及前体生产量
(E：麦角固醇，Z：霉菌甾醇，7-dc：7-脱氢胆固醇，7-dm：7-脱氢链甾醇，D：链甾醇，C：链甾醇)
(菌株(Strains)：CEN.PK(WT)、#S1、NTSD7/#S1、NTSD24/#S1、2μD24D7/#S1)
并且，对NTSD7/NTSD24/#S1重组菌株进行高效液相色谱分析的结果，相比于#S1菌株，可确认约高于1.7倍的9.3ppm的胆固醇生成峰值(图12c，表7)。并且，对erg5::ccD24/erg6::ccD7(＝#cc19)、erg6::ccD24/erg5::ccD7(＝#ccS1)进行高效液相色谱分析的结果，经确认，生产了30.1ppm、29.4ppm的胆固醇和6.1ppm、6.0ppm的霉菌甾醇，这是相对于#S1菌株，胆固醇生产量约增加5倍以上的结果(图13e，表7)。
表7
利用基于采用高效液相色谱电雾式检测器法的高效液相色谱分析重组菌株的胆固醇及前体生产量
(7-dm：7-脱氢链甾醇，7-dc：7-脱氢胆固醇，Z：霉菌甾醇，D：链甾醇，E：麦角固醇，L：烯胆甾烷醇，C：胆固醇，D7/D24/S1：NTSD7/NTSD24/#S1)
并且，进行高效液相色谱分析的结果，相比于#cc19、#ccS1菌株，tHMG1/#cc19、tHMG1/#ccS1菌株示出鲨烯(squalene)、氧鲨烯(oxidosqualene)、羊毛甾醇、霉菌甾醇均累积的模式，在胆固醇的情况下，相比于#cc19、#ccS1菌株，当比较高效液相色谱峰值面积(peak area)时，示出生产量约增加1.3倍～1.5倍的倾向(图14c)。
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序列表
<110> 株式会社大熊制药, 中央大学校产学协力团
<120> 具有固醇生产能力的重组酵母菌株、其制备方法及用途
<130> SOP115588US
<150> KR 10-2018-0087372
<151> 2018-07-26
<160> 69
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 1
cacaagaggt aggtcgaaac agaacatgaa agttggtcgg taggtgc 47
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 2
ggttttgcac catatcttca taacctgtca ccttgaaact acctctggc 49
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 3
gaaacgaaga taaatc 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 4
ttacctttta catttcagca a 21
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 5
cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 6
tattgagcac gtgagtatac gtgattaagc acacaaaggc agcttggagt 50
<210> 7
<211> 1617
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 7
atgagttctg tcgcagaaaa tataatacaa catgccactc ataattctac gctacaccaa 60
ttggctaaag accagccctc tgtaggcgtc actactgcct tcagtatcct ggatacactt 120
aagtctatgt catatttgaa aatatttgct actttaatct gtattctttt ggtttgggac 180
caagttgcat atcaaatcaa gaaaggttcc atcgcaggtc caaagtttaa gttctggccc 240
atcatcggtc catttttgga atccttagat ccaaagtttg aagaatataa ggctaagtgg 300
gcatccggtc cactttcatg tgtttctatt ttccataaat ttgttgttat cgcatctact 360
agagacttgg caagaaagat cttgcaatct tccaaattcg tcaaaccttg cgttgtcgat 420
gttgctgtga agatcttaag accttgcaat tgggtttttt tggacggtaa agctcatact 480
gattacagaa aatcattaaa cggtcttttc actaaacaag ctttggctca atacttacct 540
tcattggaac aaatcatgga taagtacatg gataagtttg ttcgtttatc taaggagaat 600
aactacgagc cccaggtctt tttccatgaa atgagagaaa ttctttgcgc cttatcattg 660
aactctttct gtggtaacta tattaccgaa gatcaagtca gaaagattgc tgatgattac 720
tatttggtta cagcagcatt ggaattagtc aacttcccaa ttattatccc ttacactaaa 780
acatggtatg gtaagaaaac tgcagacatg gccatgaaga ttttcgaaaa ctgtgctcaa 840
atggctaagg atcatattgc tgcaggtggt aagccagttt gtgttatgga tgcttggtgt 900
aagttgatgc acgatgcaaa gaatagtaac gatgatgatt ctagaatcta ccacagagag 960
tttactaaca aggaaatctc cgaagctgtt ttcactttct tatttgcttc tcaagatgcc 1020
tcttcttctt tagcttgttg gttgttccaa attgttgctg accgtccaga tgtcttagct 1080
aagatcagag aagaacaatt ggctgttcgt aacaatgaca tgtctaccga attgaacttg 1140
gatttgattg agaaaatgaa gtacaccaat atggtcataa aagaaacttt gcgttacaga 1200
cctcctgtct tgatggttcc atatgttgtt aagaagaatt tcccagtttc ccctaactat 1260
accgcaccaa agggcgctat gttaattcca accttatacc cagctttaca tgatcctgaa 1320
gtttacgaaa atcctgatga gttcatccct gaaagatggg tagaaggctc taaggctagt 1380
gaagcaaaga agaattggtt ggtttttggt tgtggtccac acgtttgctt aggtcaaaca 1440
tatgtcatga ttaccttcgc cgctttgttg ggtaaatttg cactatatac tgatttccat 1500
catacagtga ctccattaag tgaaaaaatc aaggttttcg ctacaatttt cccaaaagat 1560
gatttgttac tgactttcaa aaagagagac ccaattactg gagaagtctt cgaataa 1617
<210> 8
<211> 1152
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 8
atgagtgaaa cagaattgag aaaaagacag gcccaattca ctagggagtt acatggtgat 60
gatattggta aaaagacagg tttgagtgca ttgatgtcga agaacaactc tgcccaaaag 120
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gctgcctcga tagcaagaca tgaacattat ttagcttaca aggctggtat tcaaagaggc 360
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accggttgta acgtcatcgg tctaaacaat aacgattacc aaattgccaa ggcaaaatat 480
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gctaatttgg ccacattttt cagaacttct tacttgggta gacaatttac tacagcaatg 960
gttactgtaa tggaaaaatt aggtctagcc ccagaaggtt ccaaggaagt tactgctgct 1020
ctagaaaatg ctgcggttgg tttagttgcc ggtggtaagt ccaagttatt cactccaatg 1080
atgcttttcg tcgctaggaa gccagaaaac gccgaaaccc cctcccaaac ttcccaagaa 1140
gcaactcaat aa 1152
<210> 9
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR7 DNA 序列
<400> 9
atgatggcct ccgatagagt tagaaagaga cataagggtt ctgctaatgg tgctcaaacc 60
gttgaaaaag aaccatctaa agaaccagct caatggggta gagcttggga agttgattgg 120
ttttctttgt ccggtgttat cttgttgttg tgttttgctc cattcttggt ttctttcttc 180
attatggctt gcgaccaata ccaatgctct atttctcatc cattattgga cttgtacaac 240
ggtgatgcta ctttgttcac tatttggaat agagccccat cttttacttg ggctgctgct 300
aaaatctatg ctatttgggt tactttccaa gtcgtcttgt atatgtgtgt tccagatttc 360
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aagcaacaag aattatacgg ttacgttacc aactccatga tcttggttaa cgttttacaa 840
gccgtttacg tcgttgattt cttttggaat gaagcctggt acttgaaaac catcgatatc 900
tgccatgatc atttcggttg gtatttgggt tggggtgatt gtgtttggtt gccattcttg 960
tataccttac aaggcttgta cttggtctac aacccaatcc aattgtctac tccacatgct 1020
gctggtgttt tgattttggg tttggttggt tactacatct tcagagttac caaccaccaa 1080
aaggacttgt tcagaagaac tgaaggtaac tgttctatct ggggtaagaa gccaactttc 1140
attgaatgct cttaccaatc tgctgatggt gccattcata agtctaagtt gatgacttct 1200
ggtttctggg gtgttgctag acatatgaat tataccggtg atttgatggg ttctttggct 1260
tactgtttgg cttgtggtgg taatcatttg ttgccatact tctacatcat ctacatgacc 1320
atcttgttgg tccacagatg tatcagagat gaacatagat gctctaacaa gtacggtaag 1380
gattgggaaa gatatactgc tgctgtctcc tatagattat tgccaaacat cttttaa 1437
<210> 10
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR24 DNA 序列
<400> 10
atggaccctt tgttgtattt gggtggtttg gctgttttgt tcttgatttg gattaaggtc 60
aagggtttgg aatacgtcat catccatcaa agatggatct tcgtttgctt gttcttgttg 120
ccattgtccg ttgttttcga tgtttactac catttgagag cctggatcat tttcaagatg 180
tgttctgctc caaagcaaca cgatcaaaga gttagagata tccaaagaca agttagagaa 240
tggcgtaagg acggtggtaa aaagtatatg tgtactggta gaccaggttg gttgactgtt 300
tctttgagag tcggtaagta caaaaagacc cacaagaaca ttatgatcaa catgatggac 360
atcttggaag ttgacaccaa gagaaaggtt gttagagttg aaccattggc taacatgggt 420
caagttactg ctttgttgaa ttctattggt tggaccttgc cagttttgcc agaattggat 480
gatttgactg ttggtggttt ggttatgggt actggtattg aatcttcctc tcatatctac 540
ggtttgttcc aacatatttg cgttgccttc gaattggttt tggctgatgg ttctttggtt 600
agatgcaccg aaaaagaaaa ctccgatttg ttttatgccg ttccatggtc ttgtggtact 660
ttgggttttt tggttgctgc cgaaattaga attattccag cacaaaagtg ggtcaagttg 720
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aacaaagaaa atcaattcgt tgaaggttta caatactcca gagatgaagc cgttattatg 840
actggtgtta tgactgatca tgccgaacca gataagacta actgtattgg ttactactac 900
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tatatcccat tgagacatta ttaccacaga cacaccagat ccattttctg ggaattgcaa 1020
gatattatcc cattcggtaa caaccctttg ttcagatatg ttttcggttg gatggttcca 1080
ccaaagatca gtttgttgaa attgactcaa ggtgaaacca tcagaaagtt gtacgaacaa 1140
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ttccatgaag atattcatgt ctacccattg tggttgtgtc cattcttgtt accaaatcaa 1260
ccaggtatgg ttcatccaaa gggtgacgaa gatgaattat acgttgatat tggtgcttac 1320
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gatgctttcc cagaagtttt cgacaaaatc tgtaaatccg ccagacacta a 1551
<210> 11
<211> 1098
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 11
atggatttgg tcttagaagt cgctgaccat tatgtcttag acgacttgta cgctaaagtt 60
ctgcccgctt cgttggcagc taatattcct gtcaagtggc agaaattgct agggttgaac 120
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<210> 12
<211> 669
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 12
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aagttctaa 669
<210> 13
<211> 1044
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 13
atgaacagga aagtagctat cgtaacgggt actaatagta atcttggtct gaacattgtg 60
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gttgaaacta gaacccccat ttaa 1044
<210> 14
<211> 1929
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 14
atggacaaga agaaggatct actggagaac gaacaatttc tccgcatcca aaagctcaac 60
gctgccgatg cgggcaaaag acaatctata acagtggacg acgagggcga actatatggg 120
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<210> 15
<211> 1635
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 15
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<210> 16
<211> 2739
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 16
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attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900
caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960
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agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160
aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220
acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280
gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340
gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400
ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460
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<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
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attatggctt gtgaccaata ccaatgttct atttctcatc cattattgga tttatacaac 240
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ttcttcaatg gtagaccagg tattgttgca tggactttga ttaacttgtc ctacgctgct 780
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aacaaggaaa atcaatttgt cgaaggttta caatactcca gagacgaagc tgttattatg 840
acaggtgtta tgactgatca tgctgaacca gataagacca actgtattgg ttactattac 900
aagccatggt tcttccgtca tgtcgagtct ttcttgaaac aaaacagagt tgccgttgaa 960
tatattcctt taagacacta ctaccacaga cacactagat ccattttctg ggaattgcaa 1020
gacattattc catttggtaa caacccatta ttcagatatg ttttcggttg gatggttcca 1080
ccaaaaattt ctttattgaa gttgactcaa ggtgaaacta tcagaaagtt atacgaacaa 1140
catcacgttg ttcaagatat gttagttcca atgaaggaca ttaaggctgc tattcaaaga 1200
ttccacgaag acatccatgt ttacccatta tggttatgtc cattcttatt accaaaccaa 1260
ccaggtatgg tccatccaaa aggtgatgaa gatgaattgt acgtcgatat tggtgcttac 1320
ggtgagccaa aggttaagca tttcgaagcc acttcttcta ccagacaatt ggaaaagttc 1380
gttcgtgacg ttcacggttt ccaaatgttg tatgctgatg tttatatgga aagaaaggaa 1440
ttttgggaaa tgtttgatgg tactttatat cataaattac gtgaagagtt gggttgtaaa 1500
gatgctttcc cagaagtctt tgacaagatt tgcaaatctg ccagacatta g 1551
<210> 19
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tHMG1
<400> 19
atgccagttt taaccaataa aacagtcatt tctggatcga aagtcaaaag tttatcatct 60
gcgcaatcga gctcatcagg accttcatca tctagtgagg aagatgattc ccgcgatatt 120
gaaagcttgg ataagaaaat acgtccttta gaagaattag aagcattatt aagtagtgga 180
aatacaaaac aattgaagaa caaagaggtc gctgccttgg ttattcacgg taagttacct 240
ttgtacgctt tggagaaaaa attaggtgat actacgagag cggttgcggt acgtaggaag 300
gctctttcaa ttttggcaga agctcctgta ttagcatctg atcgtttacc atataaaaat 360
tatgactacg accgcgtatt tggcgcttgt tgtgaaaatg ttataggtta catgcctttg 420
cccgttggtg ttataggccc cttggttatc gatggtacat cttatcatat accaatggca 480
actacagagg gttgtttggt agcttctgcc atgcgtggct gtaaggcaat caatgctggc 540
ggtggtgcaa caactgtttt aactaaggat ggtatgacaa gaggcccagt agtccgtttc 600
ccaactttga aaagatctgg tgcctgtaag atatggttag actcagaaga gggacaaaac 660
gcaattaaaa aagcttttaa ctctacatca agatttgcac gtctgcaaca tattcaaact 720
tgtctagcag gagatttact cttcatgaga tttagaacaa ctactggtga cgcaatgggt 780
atgaatatga tttctaaagg tgtcgaatac tcattaaagc aaatggtaga agagtatggc 840
tgggaagata tggaggttgt ctccgtttct ggtaactact gtaccgacaa aaaaccagct 900
gccatcaact ggatcgaagg tcgtggtaag agtgtcgtcg cagaagctac tattcctggt 960
gatgttgtca gaaaagtgtt aaaaagtgat gtttccgcat tggttgagtt gaacattgct 1020
aagaatttgg ttggatctgc aatggctggg tctgttggtg gatttaacgc acatgcagct 1080
aatttagtga cagctgtttt cttggcatta ggacaagatc ctgcacaaaa tgttgaaagt 1140
tccaactgta taacattgat gaaagaagtg gacggtgatt tgagaatttc cgtatccatg 1200
ccatccatcg aagtaggtac catcggtggt ggtactgttc tagaaccaca aggtgccatg 1260
ttggacttat taggtgtaag aggcccgcat gctaccgctc ctggtaccaa cgcacgtcaa 1320
ttagcaagaa tagttgcctg tgccgtcttg gcaggtgaat tatccttatg tgctgcccta 1380
gcagccggcc atttggttca aagtcatatg acccacaaca ggaaacctgc tgaaccaaca 1440
aaacctaaca atttggacgc cactgatata aatcgtttga aagatgggtc cgtcacctgc 1500
attaaatcct aa 1512
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg5 dN fw
<400> 20
acatgcatgc cgctattgaa gagagctcat g 31
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg5 dN rv
<400> 21
gcggccgcgg gtctagaggg ggatccccag gatactgaag gcagtag 47
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg5 dC fw
<400> 22
ggatccccct ctagacccgc ggccgccatg attaccttcg ccgctttg 48
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg5 dC rv
<400> 23
cgacgcgtgc tggcagggtg agtatttg 28
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg6 dN fw
<400> 24
acgtgcatgc gctgttgccg ataacttctt c 31
<210> 25
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg6 dN rv
<400> 25
gcggccgcgg gtctagaggg ctcgaggggg gatccctcaa ttctgtttca ctcatc 56
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg6 dC fw
<400> 26
ggatcccccc tcgagccctc tagacccgcg gccgccctcc caaacttccc aag 53
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> erg6 dC rv
<400> 27
cgacgcgtct tgccgctgta gacaatag 28
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR7 fw
<400> 28
aactgcagat gatggcctcc gatagagtta g 31
<210> 29
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR7 rv
<400> 29
gcgtcgactt acttgtcgtc atcgtctttg tagtcaaaga tgtttggcaa taatctatag 60
g 61
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR24 fw
<400> 30
aactgcagat ggaccctttg ttgtatttgg g 31
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR24 rv
<400> 31
gcgtcgactt acgcatagtc aggaacatcg tatgggtagt gtctggcgga tttacag 57
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEF1p fw
<400> 32
ccgctcgaga gctcatagct tcaaaatgtt tc 32
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEF1p rv
<400> 33
gctctagagg ggaaacttaa agaaattc 28
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAL7t fw
<400> 34
acgcgtcgac ttgaacgaaa cttgaacgga g 31
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAL7t rv
<400> 35
gctctagagg ggaaacttaa agaaattc 28
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACT1p fw
<400> 36
cgaagttatt agggcggccg ctttggactc caccaacgtc 40
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACT1p rv
<400> 37
atcggaggcc atcattgtta attcagtaaa ttttcgatct tggg 44
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR7 fw2
<400> 38
tgaattaaca atgatggcct ccgatagagt tag 33
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DHCR7 rv2
<400> 39
ctttaatttg cggccttact tgtcgtcatc gtctttg 37
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CYC1t fw
<400> 40
gatgacgaca agtaaggccg caaattaaag ccttc 35
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CYC1t rv
<400> 41
acctctggcg cggcctcatg taattagtta tgtcacgc 38
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TDH3p fw
<400> 42
cgcggatccg tagaatcatt ttgaataaaa aacacgc 37
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TDH3p rv
<400> 43
acttctaaga ccaaatccat gaattctgtt tatgtgtgtt tattcgaaac 50
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG3 fw
<400> 44
acttctaaga ccaaatccat gaattctgtt tatgtgtgtt tattcgaaac 50
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG3 rv
<400> 45
agaaaagtct tatcaatctc cgtcgactca gttgttcttc ttggtatttg 50
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEF1t fw
<400> 46
caaataccaa gaagaacaac tgagtcgacg gagattgata agacttttct 50
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEF1t rv
<400> 47
ccgctcgagg taaaaaatac gcccgtaacg atg 33
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEF2p fw
<400> 48
ccgctcgagt gccattaaag gcgaattttt g 31
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEF2p rv
<400> 49
aaggagtggg aaaaacttca tgcatgcgtt tagttaatta tagttcgttg 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG2 fw
<400> 50
caacgaacta taattaacta aacgcatgca tgaagttttt cccactcctt 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG2 rv
<400> 51
agatttaaag taaattcacg catgcttaga actttttgtt ttgcaacaag 50
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TDH3t fw
<400> 52
cttgttgcaa aacaaaaagt tctaagcatg cgtgaattta ctttaaatct 50
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TDH3t rv
<400> 53
ccgctcgagt ctagatatat gttatcttat cttgg 35
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG27-2 fw1
<400> 54
cgaacatgta attggttgga atgggggttc tagtttcaac aatttg 46
<210> 55
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG27-2 rv1
<400> 55
ctataattaa ctaaacgcat gcatgaacag gaaagtagct atcgtaac 48
<210> 56
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG27-2 fw2
<400> 56
aagatttaaa gtaaattcac gcatgcttag aactttttgt tttgcaacaa gttc 54
<210> 57
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ERG27-2 rv2
<400> 57
gttgaaacta gaacccccat tccaaccaat tacatgttcg atcc 44
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARE2 dN fw1
<400> 58
acatgcatgc caagtcgtaa acctcgtcgg 30
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARE2 dN rv1
<400> 59
gatatcgcgc tcgaggttct ccagtagatc cttcttc 37
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARE2 dN fw2
<400> 60
ctcgagcgcg atatcggacc aagtgtcatg tgtacg 36
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARE2 dN rv2
<400> 61
ccgacgcgtg gcaaatagat tggttaaatc tgaag 35
<210> 62
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 101HIS fw
<400> 62
gctatacgaa gttattaggc ccggggattg gcattatcac ataatgaatt atac 54
<210> 63
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 101HIS rv
<400> 63
caccttgaaa ctacctctgg cgcggccgct cgagttcaag agaaaaaaaa agaaaaagca 60
aaaag 65
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ccD7 fw
<400> 64
ctaatctaag ttttctagct gcagatgatg gcctctgaca gagtc 45
<210> 65
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ccD7 rv
<400> 65
gtcactccgt tcaagtcgac ttagaaaatg tttggtagca atctgtaag 49
<210> 66
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ccD24 fw
<400> 66
ctaagttttc taactgcaga tggacccatt gctatactta ggtg 44
<210> 67
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ccD24 rv
<400> 67
caagtttcgt tcaagtcgac ctaatgtctg gcagatttgc aaatcttg 48
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tHMG1-fw
<400> 68
ggaattcatg ccagttttaa ccaataa 27
<210> 69
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tHMG1-rv
<400> 69
gcgtcgactt acgcatagtc aggaacatcg tatgggtagg atttaatgca ggtgacgg 58

Claims (13)

1.一种具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其中，ERG5及ERG6基因缺陷，导入有DHCR24及DHCR7基因，
其特征在于，以多重导入上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因的拷贝数，或者以一拷贝以上导入进行密码子最优化的DHCR24和DH CR7合成基因，
其中，上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因拷贝数为4～10，
其中，上述DHCR24基因导入ERG6基因位置且上述DHCR7基因导入ER G5基因位置，或者上述DHCR24基因导入ERG5基因位置且上述DHCR7基因导入ERG6基因位置，额外导入的上述DHCR24或DHCR7基因导入酵母菌株的核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区，
其中，上述固醇包含胆固醇前体或胆固醇两种中的一种以上，
其中，上述胆固醇前体包含选自由霉菌甾醇、脱氢胆固醇、烯胆甾烷醇、脱氢链甾醇及链甾醇组成的组中的一种以上。
2.根据权利要求1所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，向上述重组酵母菌株追加导入选自由ERG3、ERG2、ERG27及UPC2-1基因组成的组中的一个以上的基因。
3.根据权利要求1所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，向上述重组酵母菌株追加导入对ERG27-ERG2融合蛋白进行编码的合成基因。
4.根据权利要求1所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，
上述DHCR24基因向ERG6基因位置导入，
上述DHCR7基因向ERG5基因位置导入。
5.根据权利要求1所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，上述重组菌株利用基因多插入盒来制备，上述基因多插入盒依次包含酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的N末端片段基因、插入目的基因、包含启动子区域的营养需求性选择标记基因及酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的C末端片段基因。
6.根据权利要求5所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，上述基因多插入盒的核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的N末端片段基因由S EQ ID NO:1表示，上述核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的C末端片段基因由SEQ ID NO:2表示。
7.根据权利要求1所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，进行密码子最优化的上述DHCR24合成基因由SEQ ID NO:17构成，上述DHCR7合成基因由SEQ ID NO:18构成。
8.根据权利要求1所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株，其特征在于，在上述重组酵母菌株中，向宿主的染色体上追加导入tHMG1基因。
9.一种具有固醇生产能力的重组酵母菌株的制备方法，其特征在于，包括：
使酵母菌株的ERG5及ERG6基因缺陷后导入DHCR24及DHCR7基因，
以多重导入上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因的拷贝数，
其中，上述DHCR24和DHCR7基因两个中的一个以上的基因拷贝数为4～10，
其中，上述DHCR24基因导入ERG6基因位置且上述DHCR7基因导入ER G5基因位置，或者上述DHCR24基因导入ERG5基因位置且上述DHCR7基因导入ERG6基因位置，额外导入的上述DHCR24或DHCR7基因导入酵母菌株的核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区，
其中，上述固醇包含胆固醇前体或胆固醇两种中的一种以上，
其中，上述胆固醇前体包含选自由霉菌甾醇、脱氢胆固醇、烯胆甾烷醇、脱氢链甾醇及链甾醇组成的组中的一种以上。
10.根据权利要求9所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株的制备方法，其特征在于，上述酵母菌株为酿酒酵母。
11.根据权利要求9所述的具有固醇生产能力的重组酵母菌株的制备方法，其特征在于，上述DHCR24及DHCR7基因导入利用基因多插入盒来执行，上述基因多插入盒依次包含酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的N末端片段基因、插入目的基因、包含启动子区域的营养需求性选择标记基因及酿酒酵母核糖体脱氧核糖核酸非转录间隔区的C末端片段基因。
12.一种固醇生产方法，其特征在于，在培养基培养权利要求1所述的重组酵母菌株来生产固醇。
13.根据权利要求12所述的固醇生产方法，其特征在于，上述培养在25℃～35℃的温度下执行2天～10天。
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