CN116445517A - 一种分泌型糖蛋白及其在甾体激素细胞工厂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌型糖蛋白及其在甾体激素细胞工厂中的应用。本发明提供了一种重组菌，为在含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌中进行如下1)或1)和2)的改造，得到的重组菌：1)调控所述底盘酿酒酵母中甾醇‑C24位甲基转移酶ERG6基因的表达；2)提高所述底盘酿酒酵母中脂结合蛋白PRY1基因的表达或该基因编码蛋白的含量；所述含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌为在YSBYT30中过表达StDWF5、GgDHCR24、DGCYP90G、VcCYP94N，SvvCPR以及VcCYP90B27得到的重组菌。本发明发现了一种CAP/SCP蛋白超家族成员蛋白PRY1可以将异源合成的、疏水性较强的、大量积累于细胞膜上甾体激素分泌至细胞外部，缓解细胞工厂的代谢压力。

Description

一种分泌型糖蛋白及其在甾体激素细胞工厂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种分泌型糖蛋白及其在甾体激素细胞工厂中的应用。

背景技术

甾体激素又称类固醇激素，是人体内源性药物，对维持人体健康有着不可替代的作用。据统计，2011年甾体激素药物销售额就已高于280亿美元，约占全球医药总销售额的6％；2016年甾体激素药物销售额就已高于1000亿美元，成为仅次于抗生素的第二大类药物受成本压力等因素影响，一种高效、清洁、稳定的甾体化合物生物合成的生产方式被迫切期待。

薯蓣皂素是生产甾体激素类药物的核心原料且在黄姜及穿地龙等野生植物中含量丰富。因此，历经几十年的发展，我国已经成功建立的完整的甾体激素合成上下游产业链。但由于多年来对野生薯蓣皂素资源的过度开采且人工种植品种含量较低，使近些年薯蓣皂素的价格一路攀升，给甾体激素产业的稳定发展带来一定的冲击。为此，伴随着合成生物学的快速发展，依托于酵母平台发展新型的薯蓣皂素从头合成的绿色生产工艺具有重要的学术和市场价值。但由于薯蓣皂素及其他甾体激素类化合物具有较强的疏水性且结构与细胞膜上的固醇结构太过相似，导致大量合成的甾体激素产物堆积在细胞膜上，影响宿主细胞的正常生长，这可能是限制甾体激素类化合物产量的重要因素。

一些用于解毒的方法已经应用在微生物细胞工厂中，如开发酿酒酵母脂滴工程，将过量生产的番茄红素储存其中减轻其对工程菌株的毒性。实际上酿酒酵母的脂滴作为储能和解毒的细胞器也会存储超过需求量类固醇脂，待细胞需要时再游离出来合成目标类固醇。除此之外，还有研究者在设计目标产物合成路径时就考虑到合成产物的毒性问题，从而将整合反应放到封闭的小室中发生。如在过氧化物酶体或线粒体中过表达鲨烯合成路径，减缓细胞膜储存过量鲨烯的压力。但是对于疏水性较大、易于在细胞膜上积累且难以脂化的薯蓣皂素的相关解毒方法尚未见报导。

发明内容

本发明提供了一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为在含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌中进行如下1)或1)和2)的改造，得到的重组菌：

1)调控所述底盘酿酒酵母中ERG6(甾醇-C24位甲基转移酶)基因的表达；

2)提高所述底盘酿酒酵母中PRY1(脂结合蛋白)基因的表达或该基因编码蛋白的含量；

所述含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌为在过表达乙酰辅酶A到鲨烯合成路径基因的YSBYT30中过表达StDWF5(土豆来源甾醇C-7位还原酶)、GgDHCR24(原鸡来源甾醇C-24位还原酶)、DGCYP90G(盾叶薯蓣来源甾醇C-16，22双羟氧化酶)、VcCYP94N(山藜芦来源甾醇C-26位羟化酶)，SvvCPR(葡萄来源烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素P450还原酶)以及VcCYP90B27(山藜芦来源甾醇C-22位羟化酶)得到的重组菌。在本发明的实施例中，含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌为菌株LP104。

上述重组菌中，所述调控所述底盘酿酒酵母中ERG6(甾醇-C24位甲基转移酶)基因的表达为将底盘酿酒酵母中ERG6(甾醇-C24位甲基转移酶)基因的启动子替换为pHXT1启动子或pERG7启动子。

上述重组菌中，所述提高所述底盘酿酒酵母中PRY1(脂结合蛋白)基因的表达或该基因编码蛋白的含量为将所述PRY1(脂结合蛋白)基因导入所述底盘酿酒酵母中。

本发明还提供了一种制备上述重组菌的方法。

本发明提供的方法，按照上述重组菌中的改造方法制备。

由上述方法得到的重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组菌或上述重组菌在生产薯蓣皂素或提高薯蓣皂素产量中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还有一个目的是提供一种生产薯蓣皂素的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵培养上述重组菌或上述重组菌，得到薯蓣皂素。

本发明发现了一种CAP/SCP蛋白超家族成员蛋白PRY1可以将异源合成的、疏水性较强的、大量积累于细胞膜上甾体激素分泌至细胞外部，缓解细胞工厂的代谢压力。在酿酒酵母中过表达该菌株可以提高薯蓣皂素产量。这一发明可应用于甾体激素类化合物的微生物细胞工厂中，为缓解甾体激素过量积累造成的细胞毒性提供新的解决思路。

本发明发现利用pERG7下调ERG6基因表达相较于阻断ERG6基因表达具有明显优势，菌株生长恢复，薯蓣皂素产量提高。除此之外，发现过量生产的薯蓣皂素会被酿酒酵母排出细胞外，转录组数据显示伴随着薯蓣皂素产量的增加分泌型糖蛋白PRY1表达量随之增加。在生长状态较好的LP104菌株中过表达PRY1可使薯蓣皂素产量有一定提高。说明PRY1对薯蓣皂素的异源合成具有重要作用，至此，为解除疏水类化合物的过量积累而产生的的毒性提供了一种新的解毒思路。

附图说明

图1为酿酒酵母中薯蓣皂素异源合成路径图。

图2为几株菌株的生长情况及胆固醇和薯蓣皂素合成情况。

图3为PRY1蛋白在不同菌株、不同时期的表达丰度。

图4为LP118高密度发酵菌株生长及薯蓣皂素产量图。

图5为敲除PRY1基因对LP118菌株生长和薯蓣皂素生产的影响。

图6为过表达PRY1基因对LP118、LP104-17菌株生长和薯蓣皂素生产的影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中菌株LP104为YSBYT30菌株(过表达乙酰辅酶A到鲨烯合成路径的11个基因)中通过整合在基因组的方式过表达土豆来源的StDWF5(土豆来源甾醇C-7位还原酶)和原鸡来源GgDHCR24(原鸡来源甾醇C-24位还原酶)，用于合成薯蓣皂素合成前体胆固醇；且过表达DGCYP90G(盾叶薯蓣来源甾醇C-16，22双羟氧化酶)、VcCYP94N(山藜芦来源甾醇C-26位羟化酶)，SvvCPR(葡萄来源烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素P450还原酶)以及VcCYP90B27(山藜芦来源甾醇C-22位羟化酶请补充中文名称)，用于合成薯蓣皂素，得到的重组菌，具体制备方法如下：

LP-104为将Leu2-pPGK1-VcCYP90B27-tADH1-pTDH3-DGCYP90G-tTPI1-pTEF1-VcCYP94N-tCYC1(核苷酸序列为序列1)替换LP-085-Vc菌株基因组中的rDNA(中国专利201210453416.X)得到的重组菌，实现将VcCYP90B27、DGCYP90G及VcCYP94N基因片段整合于酿酒酵母LP-085-Vc的rDNA位点；

菌株LP-085-Vc为将pPGK1-SvvCPR-tADH1-pTEF1-VcCYP90B27-tCYC1(核苷酸序列为序列2)替换LP-074菌基因组中的Gal80基因(Gene ID:854954,updated on 14-Jan-2021)，得到的重组菌。

菌株LP-074为将His-pPGK1-StDWF5-tADH1-pTEF1-GgDHCR24-tCYC1(核苷酸序列为序列3)换酿酒酵母LP-034的TRP1基因(Gene ID:851570,updated on 10-Oct-2020)得到的重组菌，即StDWF5及GgDHCR24基因片段整合于LP-034的TRP1位点得到的重组菌。

菌株LP-034为将BYT-30基因组中的ATF2基因(Gene ID:853088,updated on 21-Mar-2020)替换为pPGK1-VcCYP94N-tADH1-pTDH3-SvvCPR-tTPI1-pTEF1-DGCYP90G-tCYC1片段(核苷酸序列序列4)，得到的重组菌。

YSBYT30记载在如下文献中：Shi,Y.；Wang,D.；Li,R.；Huang,L.；Dai,Z.；Zhang,X.,Engineering yeast subcellular compartments for increased production of thelipophilic natural products ginsenosides.Metab Eng 2021,67,104-111。

实施例1、调控酿酒酵母内源ERG6基因来调控酿酒酵母薯蓣皂素产量

一、通过启动子替换调控酿酒酵母内源ERG6基因表达的重组菌的构建

薯蓣皂素酿酒酵母细胞工厂的合成路径如图1所示，内源基因ERG6(甾醇-C24位甲基转移酶)消耗了合成薯蓣皂素的前体，限制薯蓣皂素的产量。而ERG6基因是催化合成麦角固醇及其类似物的关键基因，故通过阻断ERG6表达的方式增加薯蓣皂素合成路径的代谢流是不科学的。为了平衡菌株生长和产物生产，利用CRISPR-Cas9技术调控菌株ERG6基因表达。

1、酿酒酵母内源ERG6基因启动子gRNA质粒的构建

首先以质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN.Y-SUP4t(#43803购买自Addgene)为模板，使用引物43803-up和43803-pERG6gRNA-down1(见表1)进行PCR扩增，得到环形扩增产物，扩增产物与原大小一致，仅替换识别ERG6基因启动子的N20。

上述扩增体系为TAKARAHS DNA聚合酶5×Buffer 10μl，Dntp mix 4μl，引物(见表1)各1μl，模板0.5μl，PrimerSTAR HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。

上述扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸5分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。

再将上述获得的扩增产物进行Dpn1消化处理，Dpn1处理体系为：10μL 10×Dpn1Buffer(Thermo公司)、5μL Dpn1(Therom公司，400,000cohesive end units/ml)，80μL PCR扩增产物，补充蒸馏水至100μL，消化处理4小时，随后对处理后的产物，进行胶回收处理备用。

再将上述胶回收后得到的消化产物，转入Trans1-T1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl LB培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，PCR筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明正确的质粒命名为pERG6gRNA，该质粒包含ERG6基因启动子(序列7)对应的N20序列(GTCAAATCAACCAAACAGCT)。

表1为构建ERG6基因启动子、PRY1位点gRNA质粒引物

2、获得pHXT1启动子同源片段和pERG7启动子同源片段

以酿酒酵母BY4742(记载在Carrie baker brachmann et al.,1998,Yeast,14:115-132,公众可从天津工业生物技术研究所获得)基因组为模板，分别使用引物pERG6-50-pHXT1-up/pERG6-50-pHXT1-down、pERG6-50-pERG7-up/pERG6-50-pERG7-down(见表2)进行PCR扩增，方法见实施例1步骤1,获得带有ERG6基因启动子同源臂的pHXT1片段和带有ERG6基因启动子同源臂的pERG7片段，分别命名为ERG6-50-pHXT1(序列5)及ERG6-50-pERG7(序列6)。

上述ERG6-50-pHXT1中，该片段包含ERG6启动子部分50bp上游同源臂(序列5第1-50位)、1000bpHXT1启动子(序列5第51-1051位)、52bp下游同源臂(序列5第1052-1104位)；

上述ERG6-50-pERG7中，该片段包含ERG6启动子部分50bp上游同源臂(序列6第1-50位)、774bpERG7启动子(序列6第51-825位)、52bp下游同源臂(序列6第826-878位)。

表2为扩增调控片段引物

3、结合CRISPR-Cas9技术调控ERG6表达

1)制备LP104菌株感受态

将酿酒酵母LP104菌株在酵母培养基中培养，得到LP104菌株培养液(OD约0.6-1.0)；

上述酵母培养基由0.8％SD-Ura-His-Leu-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.01％Ura.(各百分号均表示g/100mL)和水组成。

取1mL LP104菌株培养液(OD约0.6)分装到1.5mL EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1mL处理液(10mMLiAc；10mM DTT；0.6M山梨醇；10mM Tris-HCl(pH7.5)，处理液使用时才加DTT，余量为水)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1mL 1M山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M山梨醇重悬二次)，到最终体积约为80μL，制备LP104菌株感受态细胞。

2)转化

向上述LP104菌株感受态细胞中分别加入如下3种质粒混合物：pERG6gRNA质粒和ERG6 del oligo(表2)、pERG6gRNA质粒和ERG6-50-pHXT1、pERG6gRNA质粒和ERG6-50-pERG7；(每个片段各2μL，约200ng/μL)，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1mL1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。得到转化不同DNA的3种单克隆的平板。

从每种单克隆平板中任意挑选8个单克隆进行PCR验证(pERG6-upTGCTCGCTATCCTCGCCATC；pERG6-down CCAATATCATCACCATGTAACTCCCTA扩增，得到1140bp、914bp、0bp为阳性克隆。)，鉴定出正确的阳性克隆，分别命名为菌株LP117、LP122、LP118。

重组菌LP117为将pERG6gRNA质粒和ERG6 del oligo转入LP104菌株中得到的重组菌，该重组菌为将ERG6 del oligo替换LP104菌株的ERG6基因(Gene ID:855003,updatedon 6-Dec-2021)得到的重组菌。

重组菌LP122为将pERG6gRNA质粒和ERG6-50-pHXT1转入LP104菌株中得到的重组菌，该重组菌为将LP104菌株基因组中ERG6基因的启动子(序列7)替换为pHXT1启动子(序列5第51-1051位)得到的重组菌。

重组菌LP118为将pERG6gRNA质粒和ERG6-50-pERG7转入LP104菌株中得到的重组菌，该重组菌为将LP104菌株基因组中ERG6基因的启动子(序列7)替换为pERG7启动子(序列6第51-825位)得到的重组菌。

二、重组菌在生产薯蓣皂素中的应用

1、摇瓶发酵

1)摇瓶发酵

在相应固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂，余量为水；各百分号均表示g/100mL)中活化上述一制备的LP117、LP122、LP118菌株；再接种于相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖；各百分号均表示g/100mL)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)；以初始OD0.1的接种量分别各自接种于3瓶含15mL相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖；各百分号均表示g/100mL，余量为水)的100mL三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养5天，得到发酵液。

2)、检测发酵产物

取2mL发酵液用分光光度计检测OD₆₀₀。

产物提取方法如下：取5mL发酵液于15ml离心管中，11000r/min离心2min，去培养基，无菌水清洗两次后，加入1mL 3M HCL，煮沸10min，无菌水清洗1次，1mL 1.5M NaOH-甲醇溶液(3g NaOH溶于50mL甲醇中)重悬沉淀，于60℃孵育6h。加1ml正己烷涡旋10min。取上层过0.22μm有机尼龙滤膜等待检测备用。

气相色谱检测：使用安捷伦科技5975C气相色谱仪，配备色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mm*0.5μm)。进样口温度300℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时5min；色谱条件：240℃维持5min，10℃/min加热至300℃，300℃保持25min，总共36min。

气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测：气相质谱串联-质谱(GC-MS)安捷伦科技5975C气相色谱仪与三轴插入xl MSD探测器，配备色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mm*0.5μm)。GC-MS测定条件：进样口温度300℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时5min；色谱条件：240℃，维持5min，10℃/min加热至300℃，300℃保持25min，总共36min。MS条件：SIM：69,139,282和414。

薯蓣皂素和胆固醇标准品购买于阿拉丁公司用于定性和定量分析。

使用安捷伦科技5975C气相色谱仪检测产物，与薯蓣皂素标准品的出峰时间一致的为薯蓣皂素，与胆固醇标准品标准品的出峰时间一致的为胆固醇。

菌株OD₆₀₀和薯蓣皂素产量的结果如图2所示，可以看出，从菌株生长情况LP118菌株优于LP117和LP122其他菌株，从薯蓣皂素合成情况，LP118菌株优于其他菌株，LP085-Vc薯蓣皂素产量8mg/L(发酵液中薯蓣皂素含量)、LP104薯蓣皂素产量约24.6mg/L、LP118薯蓣皂素产量约31.4mg/L。因此选择该菌株进行下述实验。

2、分批补料发酵

将上述一制备的重组菌LP118菌株进行分批补料发酵，具体方法及步骤参考文献[Paddon C J,Westfall P J,Pitera D J,et al.High-Level Semi-SyntheticProduction of the Potent Antimalarial Artemisinin[J].Nature,2013,496(7446):528-32.，或Westfall P J,Pitera D J,Lenihan J R,et al.Production ofAmorphadiene in Yeast,and Its Conversion to Dihydroartemisinic Acid,Precursorto the Antimalarial Agent Artemisinin[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(3):E111-8.]。

菌株生长OD₆₀₀、胆固醇产量和薯蓣皂素产量检测方法如上述1所示。

结果如图4所示，(A)为LP118高密度发酵菌株生长及薯蓣皂素产量图，(B)为发酵罐壁积累的黑色物质实物图，(C)为黑色物质成分检测图，可以看出，在5L罐中对LP118菌株进行分批补料发酵，该菌株在发酵罐中显示出了较长的延滞期，并在120h后迅猛生长。值得注意的是在240h时，发酵罐壁开始积累黑色物质(图4B)。待288h发酵结束后，对黑色物质的具体成分进行GC-MS检测，确定其主要成分为薯蓣皂素(图4C)。而其前体胆固醇及其他副产物的含量较少，据此，推测这些黑色物质可能并不是因细胞破裂后死亡堆积导致的，而是在酵母基因组中存在与薯蓣皂素结合的特异性转运蛋白或分泌蛋白将薯蓣皂素运输至胞外而产生的一些分泌物。但具体薯蓣皂素如何被分泌至胞外的机制仍不清楚，需要进一步实验验证。

三、高低产量薯蓣皂素菌株转录组分析

为了进一步清晰黑色物质出现的原因及形成过程，对具有不同含量的薯蓣皂素菌株(LP085-Vc薯蓣皂素产量8mg/L、LP1047薯蓣皂素产量约24.6mg/L、LP118薯蓣皂素产量约31.4mg/L)在摇瓶发酵的不同时间点(6h、24h)进行转录组测试。发现，与LP085-Vc相比，分泌的固醇结合蛋白编码基因PRY1在LP104-17和LP118菌株中24h的表达均有显著增强(图3)。故推测PRY1可能参与甾醇的分泌及转运过程。

实施例2、调控酿酒酵母中Pry1基因来调控酿酒酵母薯蓣皂素的生产

为了研究PRY1的增强表达是否有助于薯蓣皂素的生产，在实施例1制备的重组菌LP118菌株中敲除或过表达PRY1基因。

一、在LP118菌株中敲除Pry1

1、酿酒酵母内源PRY1基因gRNA质粒的构建

以质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN.Y-SUP4t(#43803购买自Addgene)为模板，使用引物43803-up和43803-PRY1gRNA-down1(见表1)进行PCR扩增，得到环形扩增产物，扩增产物与原大小一致，仅替换识别PRY1基因N20；

再将环形扩增产物按照实施例1的一的1的方法转入Trans1-T1感受态细胞中，提取阳性克隆质粒，测序结果表明正确的质粒命名为pPRY1gRNA，该质粒包含PRY1基因(GeneID:853366,updated on 7-Nov-2021)对应的N20序列(TTTTTAATATCCCGTAATTG)。

2、结合CRISPR-Cas9技术敲除PRY1基因

1)制备LP118菌株感受态

将LP118菌株制备感受态细胞，感受态制备方法与实施例1的一的3相同。

2)转化

向上述LP118菌株感受态细胞中分别加入pPRY1gRNA质粒和PRY1 del Oligo(表2)各2μL(每个片段约200ng/μL)，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1mL 1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。得到转化DNA的单克隆平板。

从单克隆平板中任意挑选8个单克隆进行PCR验证(pry1-up-94

GGTCTATCGCTACGTCGTAAGCTA pry1-down-250 CGTATATCTCCAGAAAATGCCCAGT得到376bp为阳性克隆。)，鉴定出正确的阳性克隆，分别命名为菌株LP118,ΔPRY1。

重组菌LP118,ΔPRY1为将pPRY1gRNA质粒和PRY1 del Oligo转入LP118菌株中得到的重组菌，该重组菌为将LP104菌株基因组中ERG6基因的启动子(序列7)替换为pERG7启动子(序列4第51-825位)，且敲除PRY1基因(Gene ID:853366,updated on 7-Nov-2021)得到的重组菌。

二、重组菌LP118,ΔPRY1在生产薯蓣皂素中的应用

1、摇瓶发酵

发酵方法与实施例1二的1相同

2、检测发酵产物

产物检测方法与实施例1二的1相同。

菌株OD₆₀₀和薯蓣皂素产量结果如见图5所示，可以看出，与LP118相比，敲除PRY1的LP118,ΔPRY1菌株生长显著变差，薯蓣皂素产量显著下降。

因此，下面尝试过表达PRY1基因对薯蓣皂素产量的影响。

三、在LP118菌株中过表达Pry1

分别在LP118、LP104菌株中用质粒pRS426过表达PRY1基因，具体如下：

1、构建pRS426-PRY1质粒

以酿酒酵母BY4742基因组为模板，分别使用引物SexAI-PRY1-F/AscI-PRY1-R进行(见表3)进行PCR扩增，方法见实施例1一的步骤1，获得5’端带有SexAI酶切位点，3’端带有AscI酶切位点的PRY1片段，命名为SexAI-PRY1-AscI(序列8，该片段包含SexAI酶切位点7bp、430bpTEF1启动子、8bpAscI酶切位点)。

以酿酒酵母BY4742基因组为模板，分别使用引物SacII-TEF1/SexAI-TEF1和AscI-CYC1t/CYC1t-SacII进行(见表3)进行PCR扩增，方法见实施例1步骤1，获得5’端带SacII酶切位点，3’端带有SexI酶切位点的TEF1片段，命名为SacII-TEF1-SexAI(序列9，该片段包含SacII酶切位点6bp、900bpPRY1基因、7bpSexAI酶切位点)和5’端带AscI酶切位点，3’端带有SacII酶切位点的CYC1片段，命名为AscI-CYC1-SacII(序列10，该片段包含AscI酶切位点8bp、307bpCYC1终止子、6bpSacII酶切位点)。

表3为扩增构建pRS426-PRY1质粒引物

将SexAI-PRY1-AscI PCR扩增片段用Thermo公司SexA I和Asc I进行双酶切，SacII-TEF1-SexAI PCR扩增片段、AscI-CYC1-SacII PCR扩增片段分别用Thermo公司SacII和SexA I、AscI II和Sac II进行双酶切，pRS426质粒用SacII进行单酶切，酶切产物胶回收备用。

连接获得质粒pRS426-PRY1。连接体系：片段及骨架各50ng，5μL 2×Quickligation Buffer(NEB公司)、0.5μL Quick ligase(NEB公司，400,000cohesive endunits/ml)，补充蒸馏水至10μL，室温反应10min得到连接产物，转入Trans1-T1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl LB培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，PCR筛选5个阳性单菌落，将验证正确的单克隆测序验证，得到质粒pRS426-PRY1。

pRS426-PRY1为将TEF1-PRY1-CYC1所示的片段插入pRS426质粒(ATCC产品目录号:77107)的SacII酶切位点间得到的载体。TEF1-PRY1-CYC1所示的片段的核苷酸序列依次由序列9第7-437位、序列8第8-908位和序列10第9-304位组成。

2、利用质粒pRS426-PRY1，分别在LP118、LP104-17菌株中过表达PRY1基因

考虑到LP118菌株本身PRY1基因就具有较高的表达量(转录组数据图3)且调控过ERG6基因对菌株生长等的多方面影响，这里选择对LP104也同时进行PRY1的过表达实验。

1)制备菌株感受态

将LP118和LP104菌株分别在酵母培养基中培养，得到LP118菌株培养液(OD约0.6-1.0)和LP104菌株培养液(OD约0.6-1.0)；

上述酵母培养基由0.8％浓度SD-Ura-His-Leu-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.01％Ura.(各百分号均表示g/100mL)和水组成。

感受态制备方法与实施例1相同。

2)转化

向上述LP118菌株感受态细胞或LP104-17菌株感受态细胞中加入2μL 200ng/μLpRS426-PRY1，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1mL 1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。得到转化2种质粒的单克隆平板。

从相应平板上挑选一个转化子并命名为LP118,OV-PRY1，LP104-17，OV-PRY1。

重组菌LP118,OV-PRY1为将PRY1基因以重组质粒pRS426-PRY1形式导入LP118菌株中得到的重组菌，实现PRY1过表达。

重组菌LP104，OV-PRY1为将PRY1基因以重组质粒pRS426-PRY1形式导入LP104菌株中得到的重组菌，实现PRY1过表达。

3、摇瓶发酵

将重组菌LP118,OV-PRY1和LP104，OV-PRY1按照实施例1的二的1的方法进行摇瓶发酵。

按照实施例1的二收集摇瓶的发酵液，GC-MS检测，结果如图5所示，表明，与对照菌株LP118相比，和LP118，ΔPRY1菌株的薯蓣皂素积累量显著降低90％。

高拷贝2μ质粒(pRS426)过表达PRY1的菌株LP118,OV-PRY1与LP118相比，并没有进一步促进LP118菌株薯蓣皂素的产生(图6)。考虑到PRY1在LP118中已经有较高的表达水平，而ERG6基因表达减弱对LP118菌株生长的负面影响也可能会干扰PRY1的有效合成。

因此，检测LP104，OV-PRY1和LP104，菌株OD₆₀₀和薯蓣皂素(DSG)产量结果如图6所示，可以看出，与LP104相比，LP104，OV-PRY1可以显著使薯蓣皂素的产量提高1.42倍；与LP104相比，LP118,OV-PRY1可以显著使薯蓣皂素的产量提高1.32倍，结果表明，PRY1有助于DSG的产生。

上述结果表明，相较于LP104菌株而言，LP118中ERG6基因的表达调控增加了薯蓣皂素的产量，且菌株生长变慢；另一方面，通过转录组数据可以看出该菌株PRY1的表达强度相较于LP104明显提高，因此进一步过表达难以观察到明显现象。而在没有明显生长缺陷的前体菌株LP104菌株中过表达该基因效果更加显著。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种分泌型糖蛋白及其在甾体激素细胞工厂中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7314

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60

aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120

tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180

cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240

gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300

gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360

caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420

gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480

tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540

tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600

atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660

agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720

ttatctactt tttacaacaa atataaaaca atggctatgg aattgttgtt gttgatccca 780

gcttttattg ttgcaatcat cattttcttt tcttttaaat caactaacgg tacttctaca 840

aagccattga agttgcctcc aggtcaaatg ggttggcctt ttattggtca tacaatccct 900

tttatgcaac cacattcttc agcttctttg ggtccataca tcgatttgaa cactgcaaga 960

tacggtacaa tttttagaat gaatttgttg gctaagccaa ctatcgtttc agcagatcca 1020

gaattcaata gatacatctt gcaaaacgaa ggtagattgt tcgaaaactc ttgtccaact 1080

tcaattgctg aaattatggg tagatggtct atgttggcat taacaggtga cgttcataga 1140

gaaatgagat caatcgctgt ttcttttatg tcaaacgtta agttgagaac atacttcatc 1200

ggtgacatcg aacaacaagc aattaaagtt ttggcttctt gggcaggtag agatgctcca 1260

ttttcagcac aagatgaagg taaaaagttc gcttttaatt tgatggttaa acatttgatg 1320

tctatggaac caggaatgaa ggaaactgaa caattgagat ctgaatacca tgcttttatg 1380

aagggtatgg catcaattcc aattaatttg ccaggtacag cttacagaaa agcattgcaa 1440

tctagatcaa tcatcttgaa gattatgggt gaaaaattag atgaaagaat taaacaagtt 1500

aaagaaggtt gtgaaggttt ggaacaagat gatttgttag cttctgtttc aaagcatcca 1560

aatttggcaa aggaacaaat cttggatttg atcttgtcta tgttgtttgc tggtcatgaa 1620

acttcttcag ctgcaatcgc tttggcaata tactttttgg aatcatgtcc aaaagctgtt 1680

gaacaattga gagaagaaca taaggaaatc gcaagacaaa agaaagaaag aggtgaaaca 1740

ggtttgaact gggatgatta caagaaaatg gaattcactc attgtgttat taatgaaaca 1800

ttgagaatgg gtaacatcgt taagttctta catagaagag ctattaaaga tgttcaattc 1860

aaaggttacg atatcccatg tggttgggaa gttgttccaa ttatttctgc tgcacatttg 1920

gattcttcaa tctatgatga tccacaaaga tacgatccat ggagatggca agctatttta 1980

gctggtaaca ctaaaaataa caacgttaca tcaattatgt ctttttcagg tggtccaaga 2040

ttgtgtccag gtgctgaatt ggcaaagttg gaaatcgctg ttttcttgca tcatttggtt 2100

caaaagtacc aatgggaaat ggcagaacat gattacccag tttctttccc atttttaggt 2160

ttcccaaaga gattgccaat taaagttaga ccattgggtg actaaagtta taaaaaaaat 2220

aagtgtatac aaattttaaa gtgactctta ggttttaaaa cgaaaattct tattcttgag 2280

taactctttc ctgtaggtca ggttgctttc tcaggtatag catgaggtcg ctcttattga 2340

ccacacctct accggcatgc cgaatactag cgttgaatgt tagcgtcaac aacaagaagt 2400

ttaatgacgc ggaggccaag gcaaaaagat tccttgatta cgtaagggag ttagaatcat 2460

tttgaataaa aaacacgctt tttcagttcg agtttatcat tatcaatact gccatttcaa 2520

agaatacgta aataattaat agtagtgatt ttcctaactt tatttagtca aaaaattagc 2580

cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc caaaataggg ggcgggttac acagaatata 2640

taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt attcctggca tccactaaat ataatggagc 2700

ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa aagaatccca gcaccaaaat attgttttct 2760

tcaccaacca tcagttcata ggtccattct cttagcgcaa ctacagagaa caggggcaca 2820

aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg gagtgatgca acctgcctgg agtaaatgat 2880

gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc tatctcattt tcttacacct tctattacct 2940

tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa aaaaaaggtt gaaaccagtt ccctgaaatt 3000

attcccctac ttgactaata agtatataaa gacggtaggt attgattgta attctgtaaa 3060

tctatttctt aaacttctta aattctactt ttatagttag tctttttttt agttttaaaa 3120

caccaagaac ttagtttcga ataaacacac ataaacaaac aaaatgttcc cattggccat 3180

tatcgttttg ttgttcccaa ctctgctgtt gttgtttatt ggtgttgctt tgggtttgag 3240

atctggtgct aatgaatctt ggaaaaagag gggtttgaat atccctccag gttctatggg 3300

ttggcctttg ttgggtgaaa ctattgcttt tagaaagttg catccatgca catctttggg 3360

tgagtatatg gaagatagat tgcagagata cggtaagatc tacaggtcta atttgtttgg 3420

tgctccaact gttgtttctg ctgatgctga attgaacaga ttcgttttga tgaacgatgg 3480

caagttgttt gaaccatctt ggccaaaatc tgttgccgat attttgggta agacctccat 3540

gttggttttg actggtgaaa tgcacaggta catgaagtct ttgtctgtta acttcatggg 3600

tatcgccaga ttgagaaatc atttcttggg tgattccgag aggtacattt tggaaaattt 3660

ggctacttgg aaagagggtg ttccatttcc agctaaagaa gaagcttgta agatcacctt 3720

taacctgatg gtcaagaaca tcttgtctat gaatccaggt gaaccagaaa ccgaaagatt 3780

gaggatcttg tacatgtctt tcatgaaggg tgttattgcc atgccattga attttccagg 3840

tactgcttac agaaaggcca ttcaatctag agccactatc ttgaaaacca tcgaacactt 3900

gatggaagat cgtttggaaa aaaagaaggc cggtactgat aatattggtg aagctgattt 3960

gttgggcttc atcttggaac aatctaactt ggatgctgaa caattcggtg acttgttgtt 4020

gggtttgtta tttggtggtc acgaaacatc ttctaccgct attactttgg ctatctactt 4080

cttggaaggt tgtccaaaag ctgtccaaga attgagagaa gaacatttga acttggtcag 4140

gatgaagaaa cagagaggtg aatctaaagc tttgacgtgg gaagattaca agtctatgga 4200

tttcgctcaa tgcgttgtct ctgaaacttt gagattgggt aacatcatca agttcgttca 4260

cagaaaagct aacaccgatg tccaattcaa gggttacgat attccatctg gttggtctgt 4320

tattccagtt tttgctgctg ctcatttgga tcctactgtt tacgataatc cacaaaagtt 4380

cgatccttgg agatggcaaa ctatctcttc atctactgcc agaatcgata actacatgcc 4440

atttggtcaa ggtttgagaa attgtgctgg tttggaattg gctaagatgg aaattgctgt 4500

tttcttgcac cacttggtct tgaatttcga ttgggaatta gctgaaccag atcatccatt 4560

ggcttatgct tttccagaat tcgaaaaagg cttgccaatc aaggtcagaa agttgtctat 4620

tttggagtaa gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg 4680

ttatgtaaaa taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg 4740

agccacttaa atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca 4800

aaaagcaagg cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta 4860

tatcaacgaa gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat 4920

gggttactca taagtgtacc gaagactgca ttgaaagttt atgttttttc actggaggcg 4980

tcattttcgc gttgagaaga tgttcttatc caaatttcaa ctgttatata gaagtgatcc 5040

cccacacacc atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg 5100

actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc 5160

tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga 5220

ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt 5280

tcttgaaaat tttttttttt gatttttttc tctttcgatg acctcccatt gatatttaag 5340

ttaataaacg gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact 5400

ttttttactt cttgctcatt agaaagaaag catagcaatc taatctaagt tttaattaca 5460

aaatggattt gccatctgct tcagctgctg ttgctgctgc tactgctgca gttattttct 5520

tgttgactat ctacctgctg ccaaagaaaa aatctccagc ttctactggt aagaacggtt 5580

ctacttcttt ggaatcttac ccagttattg gtaacttgcc acacttcgtt aagaacagaa 5640

acagattctt ggattgggtt gccgaaatca tttctcaatc tccaactggt actgttattg 5700

ctgctccatt ggtttttact tctaacccag aaaacgttga acataccgct aagtctagat 5760

ttgatgctta tgctagaggt ccagctgcta cagctgtttt acatgatttt ttaggttccg 5820

gcatcttgaa cgttgatggt gatagttgga gggctcaaag aaagactgct tcttctgaat 5880

tcactaccag atctttgaga gccttcattt tggatgctgt tgacggtgaa gctgctggta 5940

gattattgcc attattgtct agagctgctg cttctggtga agtttttgac ttgcaagatg 6000

tcttggaaag attcgccttc gataacattt gctccattat tttcgatgcc gatccaaact 6060

gtttgaacga tactcatgat ggtgttggtg aaagattcta ccatgctttt catgatgcta 6120

ccttgttgtc tactggcaga tattactatc cattccattg ggtttggagg ttgttgagat 6180

ggttgaattt gggtactgaa aagcgtttga gagatgccgt ttctgatgtt cataaggcca 6240

ttgatgaatt ggtcggttct agaaaaactg aagttggtac tactgttaga aggcaaggtg 6300

gtggttctga tttgttgtca agatttgctg aaggtggtga ttactccgat gatgttttaa 6360

gggatgtctt gatcaacttc gttttggctg gtagagatac aactccatca gctttgactt 6420

ggtttttctt tatgatctcc tccagaccag atgttgttga tcaaattttg gacgagatca 6480

ggtccatcag agatcatcaa gatagatcta atccaaacgg tggtggtggc ggttttactt 6540

tggaagaatt gagagaaatg aactacttgc atgctgccat taccgaatcc ttgagattga 6600

atccaccagt tccattgatg ccaaagatgt gtatggaaga tgatgtattg ccagatggta 6660

ctgtagttag aagaggttgg actgttatgt actctgcttt tgctatgggt agaaaggctg 6720

aaatttgggg tgaagattgc atggaattca aaccagaaag atggttggat gatggtggtt 6780

gttttaaatc tgcttccgct tatagattgc cagcatttca tgctggtcct agaatttgtt 6840

tgggtaaaga tatggcctac attcagatga aggctgttgc ttcatctttg ttggaaaggt 6900

tcgaagttga agtcgttgaa aaaagaggta agccagaatt gtccatcacc atgagaatgg 6960

acagaggttt gccagttaga gtgaaagaaa gaaagcgtgg ttgttaaccg ctgatcctag 7020

agggccgcat catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg 7080

ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta 7140

tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca 7200

gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct 7260

cgaaggcttt aatttgcaag ctgcggccct gcattaatga atcggccaac gcgc 7314

<210> 2

<211> 5057

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60

aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120

tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180

cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240

gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300

gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360

caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420

gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480

tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540

tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600

atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660

agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720

ttatctactt tttacaacaa atataaaaca atgcaatcat cctccgtaaa ggtatcccca 780

ttcgacttaa tgtcagcaat catcaagggt tctatggacc aatcaaacgt atcatcagaa 840

tcaggtggtg ctgcagccat ggttttggaa aacagagaat tcattatgat cttgactaca 900

tccattgctg ttttgatcgg ttgtgttgtc gtattgatat ggagaagatc aggtcaaaaa 960

caatccaaga ctccagaacc acctaaacct ttgattgtta aggatttgga agtagaagtt 1020

gatgacggta aacaaaaggt tacaatattt ttcggtacac aaaccggtac tgctgaaggt 1080

ttcgcaaaag ccttggctga agaagcaaag gccagatacg aaaaggcaat ttttaaggtt 1140

gtcgatttgg atgactatgc cggtgacgac gatgaatacg aagaaaaatt gaaaaaggaa 1200

actttggcct ttttcttttt ggctacatat ggtgacggtg aaccaaccga caatgctgca 1260

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tatggtgttt tcggtttggg taacagacaa tacgaacatt tcaacaaagt tgcaaaggta 1380

gttgacgata taatcacaga acaaggtggt aaaagaatcg tcccagtagg tttgggtgac 1440

gatgaccaat gtattgaaga tgacttcgcc gcttggagag aattattatg gcctgaatta 1500

gatcaattgt taagagacga agatgacgct accactgtat ctacaccata taccgcagcc 1560

gttttggaat acagagtcgt atttcatgat cctgaaggtg catcattaca agacaagtca 1620

tggggttccg ccaatggtca tactgttcac gatgctcaac acccatgtag agccaacgtt 1680

gctgtcagaa aagaattgca tactcctgct agtgatagat cttgcacaca cttggaattc 1740

gacatttctg gtactggttt aacatatgaa accggtgacc atgtaggtgt ttactgtgaa 1800

aatttgccag aaacagtcga agaagcagaa agattgttag gtttctcacc tgatgtatat 1860

ttttccatac acaccgaaag agaagacggt actccattaa gtggttcttc attgtctcca 1920

ccttttccac cttgcacttt gagaacagca ttaaccagat acgccgatgt tttgtccagt 1980

cctaaaaagt ctgcattggt cgccttagct gcacatgcat cagatccatc cgaagccgac 2040

agattgaaat atttggctag tccttctggt aaagatgaat acgctcaatg ggttgtcgca 2100

agtcaaagat ctttgttaga aattatggcc gaatttccat ctgctaagcc acctttgggt 2160

gtcttctttg ccgctgtagc tccaagattg caacctagat actacagtat ctcttcatcc 2220

ccaaagatgg ttccttctag aatacatgtt acctgtgcat tggtctgcga taaaatgcca 2280

actggtagaa tccacaaggg tatttgttca acatggatga aatatgccgt tccattagaa 2340

gaatcacaag attgctcctg ggcacctatc ttcgttagac aatcaaactt caaattgcca 2400

gctgatacct ccgtccctat cattatgatt ggtccaggta caggtttagc tcctttcaga 2460

ggtttcttgc aagaaagatt tgcattgaag gaagctggtg cagaattggg tagttctatc 2520

ttgttctttg gttgtagaaa cagaaagatg gattacatct acgaagacga attgaacggt 2580

ttcgtagaaa gtggtgcttt gtctgaattg atcgttgcat tttcaagaga aggtccaact 2640

aaggaatacg ttcaacataa gatgatggaa aaggctagtg atatctggaa cgtcatctct 2700

caaggtggtt atatatacgt atgcggtgac gctaagggta tggcaagaga cgttcataga 2760

actttgcaca caatcttaca agaacaaggt tctttagatt catccaaggc tgaatcaatg 2820

gtaaagaact tacaaatgac tggtagatac ttgagagatg tctaaagtga tcccccacac 2880

accatagctt caaaatgttt ctactccttt tttactcttc cagattttct cggactccgc 2940

gcatcgccgt accacttcaa aacacccaag cacagcatac taaatttccc ctctttcttc 3000

ctctagggtg tcgttaatta cccgtactaa aggtttggaa aagaaaaaag agaccgcctc 3060

gtttcttttt cttcgtcgaa aaaggcaata aaaattttta tcacgtttct ttttcttgaa 3120

aatttttttt tttgattttt ttctctttcg atgacctccc attgatattt aagttaataa 3180

acggtcttca atttctcaag tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta 3240

cttcttgctc attagaaaga aagcatagca atctaatcta agttttaatt acaaaatggc 3300

tatggaattg ttgttgttga tcccagcttt tattgttgca atcatcattt tcttttcttt 3360

taaatcaact aacggtactt ctacaaagcc attgaagttg cctccaggtc aaatgggttg 3420

gccttttatt ggtcatacaa tcccttttat gcaaccacat tcttcagctt ctttgggtcc 3480

atacatcgat ttgaacactg caagatacgg tacaattttt agaatgaatt tgttggctaa 3540

gccaactatc gtttcagcag atccagaatt caatagatac atcttgcaaa acgaaggtag 3600

attgttcgaa aactcttgtc caacttcaat tgctgaaatt atgggtagat ggtctatgtt 3660

ggcattaaca ggtgacgttc atagagaaat gagatcaatc gctgtttctt ttatgtcaaa 3720

cgttaagttg agaacatact tcatcggtga catcgaacaa caagcaatta aagttttggc 3780

ttcttgggca ggtagagatg ctccattttc agcacaagat gaaggtaaaa agttcgcttt 3840

taatttgatg gttaaacatt tgatgtctat ggaaccagga atgaaggaaa ctgaacaatt 3900

gagatctgaa taccatgctt ttatgaaggg tatggcatca attccaatta atttgccagg 3960

tacagcttac agaaaagcat tgcaatctag atcaatcatc ttgaagatta tgggtgaaaa 4020

attagatgaa agaattaaac aagttaaaga aggttgtgaa ggtttggaac aagatgattt 4080

gttagcttct gtttcaaagc atccaaattt ggcaaaggaa caaatcttgg atttgatctt 4140

gtctatgttg tttgctggtc atgaaacttc ttcagctgca atcgctttgg caatatactt 4200

tttggaatca tgtccaaaag ctgttgaaca attgagagaa gaacataagg aaatcgcaag 4260

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<213> Artificial sequence

<400> 6

acgtgtacca gtacgtctat gttcattttc tatttcatcg tgacgagatt atggtgcaca 60

gttggtttgt tttaacggta tgcgttttgt atacctctat tatgtagtgc aagaaaatct 120

gctgctattc gtgattactg ttacaaccta acggtttaaa tgaaacctgg ttctgaaggg 180

tcattttata acttcaagtt cccttagcct ttcgattcat tttgattatg ccatttctag 240

accgtgttat aggcgctggc gtttaatttg gtgtagcttg gtttagtcaa gagttgtatt 300

agtgttcctc gataaagtcg atgtttccgg atattgtgtt aaaatttcaa gtatgctact 360

aatggggtaa agttgcatga ttagcagaga catatggctt gttatggttc ggcttcctca 420

tttttcatgc ttagtttttg tccatctcat tgtacatttc tgaatcctaa tgcatgactc 480

cctaacatta ctattaaatt ctcaatagtg aagaataagc aaaatgggaa ccatgataat 540

ttctagcttt ctctccaccc ctattttaat ttgcaatcat atatagtact ttcaatagca 600

tcttttctag atttgatatc tgcggaaact tttcgtttat aatcgtttag gtgaaaagtt 660

tttatatcgg ttatttacag atatacattt tctcaaaaaa aaaaaaatat aatacatgcc 720

ctcagctttt aataaagcca ttgagcacaa gcctctccag taatgtactg ctgtgcccaa 780

taaccttacc aataatcgtc gcccacaaag aaagtacaaa acagagatga gtgaaacaga 840

attgagaaaa agacaggccc aattcactag ggagtt 876

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

tgctcgctat cctcgccatc acgtgtacca gtacgtctat gttcattttc tatttcatcg 60

tgacgagatt ttgaaccctc aaactccgct aatgaacccg gagaaacgac atccagcgac 120

ctcttggcgg tagacacact catggtttaa gaaacaactt ttccttcttt aaacgttttg 180

ggtggcaaaa aacttccctt aaacaaacta aaaatggctc gtgttcatgc acaagtcaac 240

caggggctca ggaaaaaaag ctaaacacca atcctatata taacgtaaag gtactgtgct 300

taatcggtaa acggaagact attaagcaaa tgtatctctt aagaccttac gcatccatca 360

gttgccaccc tcctactctt catcggaggg tttccggttc ccatgacaaa gacggcgctt 420

tggcggggcc caaattgtta cccgcaccca gaaaaagaaa agagtaacct aggtcaaatc 480

aaccaaacag ctagggctgg ttactatttt tgaaaagatg caacagggta agatcagcaa 540

aatttagggc cgaacaaagc cccgatcttc gtatatggta cctcgttccc gtacttattt 600

tcaatttttg gcgtcgttta ctgccgtttc cgataaatac aaaaaagttt tcgagaagcg 660

agagtaagtg aggagcagac aatgtattat tcactgtaaa ctgctccact tcgtctcaat 720

ggtacacttc atttttatcg ccttacgaag catgcgtttt atgcgaagat tggtgagaaa 780

cctccaatac ttgctgttgc cgataacttc ttcattgctt tttatatagt tcgggtgttt 840

tctcctatcc tctgctgctc tctttttctt tccattcgtc tttgtaattt ataagctgtt 900

aattttcatt caagtttccc ttatctgttt tactttcgat ttaagtttta cataatttaa 960

aaaaacaaga ataaaataat aatatagtag gcagcataag 1000

<210> 8

<211> 915

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

acctggtatg aaactttcta aattatcgat cttaacctcc gccttagcca cgtctgcatt 60

ggccgctcct gccgttgtta ctgtcactga acacgcccat gaggctgcag tcgttactgt 120

gcaaggcgta gtttatgtcg aaaacggcca aacacgtaca acttacgaaa cactagctcc 180

tgcttccact gccactccaa cttctacagc tacagctttg gttgctcccc ctgtcgctcc 240

ttcctctgct tccagcaatt ccgatgtggt cttgtctgct ttgaagaact tagcctctgt 300

ttggggtaaa actaccgatt caacgaccac gttgacatct tctgaatcta catcgcaatc 360

gttggctcaa gctactacga cttctacacc cgctgctgct tccaccactt ccacacccgc 420

tgctaccacc accacttctc aagccgctgc tactagctca gcatcgtctt cggatagtga 480

cctgtcagat tttgcctctt ctgtgttggc tgaacacaac aagaagagag ctttgcacaa 540

ggacacacca gctttgtcct ggtccgatac tttggcctcc tacgctcaag actatgctga 600

caactatgat tgctccggca ctttgaccca ttctggcggt ccatacggtg aaaacttggc 660

tttgggttat gacggcccag ctgccgtcga cgcttggtac aatgaaattt ccaactacga 720

cttctcgaat ccaggctttt caagtaacac tggccacttt actcaagtcg tttggaagtc 780

caccacccaa gttggttgtg gcatcaaaac ctgtggcggt gcatggggtg actatgtcat 840

ctgtagttac gaccccgcag gaaactacga aggcgaatac gccgataatg tcgagcccct 900

agcttaaggc gcgcc 915

<210> 9

<211> 443

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ccgcggagtg atcccccaca caccatagct tcaaaatgtt tctactcctt ttttactctt 60

ccagattttc tcggactccg cgcatcgccg taccacttca aaacacccaa gcacagcata 120

ctaaatttcc cctctttctt cctctagggt gtcgttaatt acccgtacta aaggtttgga 180

aaagaaaaaa gagaccgcct cgtttctttt tcttcgtcga aaaaggcaat aaaaattttt 240

atcacgtttc tttttcttga aaattttttt ttttgatttt tttctctttc gatgacctcc 300

cattgatatt taagttaata aacggtcttc aatttctcaa gtttcagttt catttttctt 360

gttctattac aacttttttt acttcttgct cattagaaag aaagcatagc aatctaatct 420

aagttttaat tacaaaacct ggt 443

<210> 10

<211> 315

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

ggcgcgcccc gctgatccta gagggccgca tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt 60

cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct 120

aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa 180

tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc 240

ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa gctgcggccc tgcattaatg 300

aatcggccaa cgcgc 315

Claims (7)

1.一种重组菌，为在含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌中进行如下1)或1)和2)的改造，得到的重组菌：

1)调控所述底盘酿酒酵母中甾醇-C24位甲基转移酶ERG6基因的表达；

2)提高所述底盘酿酒酵母中脂结合蛋白PRY1基因的表达或该基因编码蛋白的含量；

所述含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌为在过表达乙酰辅酶A到鲨烯合成路径基因的YSBYT30中过表达StDWF5、GgDHCR24、DGCYP90G、VcCYP94N，SvvCPR以及VcCYP90B27得到的重组菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：

所述调控所述底盘酿酒酵母中甾醇-C24位甲基转移酶ERG6基因的表达为将底盘酿酒酵母中甾醇-C24位甲基转移酶ERG6基因的启动子替换为pHXT1启动子或pERG7启动子。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：

所述提高所述底盘酿酒酵母中脂结合蛋白PRY1基因的表达或该基因编码蛋白的含量为将所述脂结合蛋白PRY1基因导入所述底盘酿酒酵母中。

4.一种制备权利要求1-3中任一所述重组菌的方法，按照权利要求1-3中任一所述重组菌中的改造方法制备。

5.由权利要求4所述方法得到的重组菌。

6.权利要求1-3中任一所述重组菌或权利要求5所述重组菌在生产薯蓣皂素或提高薯蓣皂素产量中的应用。

7.一种生产薯蓣皂素的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求1-3中任一所述重组菌或权利要求5所述重组菌，得到薯蓣皂素。