CN115305254B - 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115305254B
CN115305254B CN202110499258.0A CN202110499258A CN115305254B CN 115305254 B CN115305254 B CN 115305254B CN 202110499258 A CN202110499258 A CN 202110499258A CN 115305254 B CN115305254 B CN 115305254B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
promoter
introducing
sequence
saccharomyces cerevisiae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110499258.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115305254A (zh
Inventor
张学礼
戴住波
李荣生
王冬
石玉松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN202110499258.0A priority Critical patent/CN115305254B/zh
Publication of CN115305254A publication Critical patent/CN115305254A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115305254B publication Critical patent/CN115305254B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01034—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (NADPH) (1.1.1.34)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01088—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (1.1.1.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/99—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with other acceptors (1.6.99)
    • C12Y106/99001—NADPH dehydrogenase (1.6.99.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01009—Acetyl-CoA C-acetyltransferase (2.3.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/0301—Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (2.3.3.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0101—(2E,6E)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.10), i.e. geranyltranstransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01028—Dimethylallylcistransferase (2.5.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01036—Mevalonate kinase (2.7.1.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04002—Phosphomevalonate kinase (2.7.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/07—Diphosphoric monoester hydrolases (3.1.7)
    • C12Y301/07011—Geranyl diphosphate diphosphatase (3.1.7.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03073—Valencene synthase (4.2.3.73)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/03—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing C=C bonds (5.3.3)
    • C12Y503/03002—Isopentenyl-diphosphate DELTA-isomerase (5.3.3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用。该萜类底盘微生物的构建方法包括：对出发酿酒酵母进行A9和/或A10的改造，得到名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母；A9、将驱动法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20基因的启动子替换为名称为pERG1启动子的ERG1基因的启动子或名称为pERG7的ERG7基因的启动子；A10、将驱动鲨烯合酶基因ERG9基因的启动子替换为名称为pERG7的ERG7基因的启动子。本发明利用ERG1的启动子或ERG7的启动子替换酿酒酵母中EGR20的启动子或者ERG9的启动能提高工程菌中单萜和倍半萜等植物挥发性萜类的产量。

Description

一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
植物挥发性萜类是鲜花，水果，蔬菜的主要香味来源，目前广泛应用于化妆品，食品和医药等领域。自然界的萜类生物，主要由甲戊二羟酸途径(MVA途径)和2-基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)两种途径生成和衍生而来，其两种中间代谢物牻牛儿基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)是植物挥发性萜类的重要来源。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，GPP和FPP由一种双功能酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)合成，它将异戊二烯焦磷酸(IPP)与二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)转化为GPP，并添加另一个IPP来产生FPP，两个FPP分子能在鲨烯合酶(ERG9)的催化中合成三萜麦角固醇等衍生物。天然的ERG20与单萜合酶竞争GPP，单萜类化合物的合成主要受其前体GPP量的限制。理论上可以通过敲除ERG20或者下调ERG20来降低ERG20对GPP的竞争。同样ERG9的敲除或者下调也能提高FPP合成倍半萜的潜力。然而ERG20和ERG9的缺失均是致命的，并且对于下游基本细胞成分(包括甾醇、泛醌等)的合成代谢是必不可少的。
发明内容
本发明提供了一种重组酿酒酵母的构建方法，包括：对出发酿酒酵母进行如下A1-A8的改造，并对所述出发酿酒酵母进行如下A9和/或A10的改造，得到名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母：
A1、导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1基因；A2、导入甲羟戊酸激酶基因ERG12基因；A3、导入异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1基因；A4、导入MVAPP脱羧酶基因ERG19基因；A5、导入HMG-CoA还原酶基因HMGR基因；A6、导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合酶基因ERG13基因；A7、导入MVAP激酶基因ERG8基因；A8、导入乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因ERG10基因；A9、将驱动法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20基因的启动子替换为名称为pERG1启动子的ERG1基因的启动子或名称为pERG7的ERG7基因的启动子；A10、将驱动鲨烯合酶基因ERG9基因的启动子替换为名称为pERG7的ERG7基因的启动子。
可选地，上述A1-A8还包括使上述导入基因得到表达。
上述出发酿酒酵母可为野生型酿酒酵母，例如为酿酒酵母CEN.PK2-1D。
可选地，根据上述的方法，所述pERG1启动子的序列如SEQ ID No.16的第51位-第857位所示；和/或，所述pERG7启动子的序列如SEQ ID No.17的第51位-第824位所示。
上述A9和A10可通过CRISPR/CAS9系统替换上述启动子，具体可为将CAS9基因、gRNA基因和包含pERG1启动子和/或pERG7启动子的DNA片段导入所述出发酿酒酵母菌，并使CAS9基因和gRNA基因表达。所述gRNA基因编码的gRNA片段靶向驱动ERG20基因的启动子(pERG20启动子)和/或靶向驱动ERG9基因的启动子(pERG9启动子)。该靶序列例如可为TTTCTACTTGCCTGTCGCAT和/或CGTGTTCTCGCTGCTCGTTT。
可选地，根据上述的方法，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1序列第530-1054位所示；和/或，所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1序列所示；和/或，所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1序列所示；和/或，所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1序列所示；和/或，所述HMGR基因编码的HMGR蛋白质的序列为genbank登陆号：WP_011241944.1序列所示；和/或，所述ERG13基因编码的ERG13蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013580.1序列所示；和/或，所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013947.1序列所示；和/或，所述ERG10基因编码的ERG10蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015297.1序列所示。
可选地，根据上述的方法，所述tHMG1基因的序列如SEQ ID No.1的第757位-第2340位所示；和/或，所述ERG12基因的序列如SEQ ID No.2的第801位-第2132位所示；和/或，所述IDI1基因的序列如SEQ ID No.3的第1001位-第1867位所示；和/或，所述ERG19基因的序列如SEQ ID No.4的第1001位-第2191位所示；和/或，所述HMGR基因的序列如SEQ IDNo.5的第563位-第1864位所示；和/或，所述ERG13基因的序列如SEQ ID No.6的第823位-第2298位所示；和/或，所述ERG8基因的序列如SEQ ID No.7的第801位-第2156位所示；和/或，所述ERG10基因的序列如SEQ ID No.8的第431位-第1627位所示。
可选地，根据上述的方法，A1、通过向所述出发酿酒酵母导入tHMG1基因表达盒实现，所述tHMG1基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述tHMG1基因和终止子；和/或，A2、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG12基因表达盒实现，所述ERG12基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG12基因和终止子；和/或，A3、通过向所述出发酿酒酵母导入IDI1基因表达盒实现，所述IDI1基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述IDI1基因和终止子；和/或，A4、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG19基因表达盒实现，所述ERG19基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG19基因和终止子；和/或，A5、通过向所述出发酿酒酵母导入HMGR基因表达盒实现，所述HMGR基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述HMGR基因和终止子；和/或，A6、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG13基因表达盒实现，所述ERG13基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG13基因和终止子；和/或，A7、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG8基因表达盒实现，所述ERG8基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG8基因和终止子；和/或，A8、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG10基因表达盒实现，所述ERG10基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG10基因和终止子。
例如，tHMG1基因表达盒序列如SEQ ID No.1所示；ERG12基因表达盒序列如SEQ IDNo.2所示；IDI1基因表达盒如SEQ ID No.3所示；ERG19基因表达盒如SEQ ID No.4所示；HMGR基因表达盒如SEQ ID No.5所示；ERG13基因表达盒如SEQ ID No.6所示；ERG8基因表达盒如SEQ ID No.7所示；ERG10基因表达盒如SEQ ID No.8所示。
可选地，根据上述的方法，所述重组酿酒酵母中，A1-A8中的基因整合入所述出发酿酒酵母的YJL064W位点；所述pERG1替换驱动ERG20基因的启动子的第-248--1位；所述pERG7替换驱动ERG20基因的启动子的第-248--1位；所述pERG7替换驱动ERG9基因的启动子的第-174--1位。
利用上述方法得到的所述的名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母也属于本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种重组酿酒酵母的构建方法，包括：对上述的名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母进行如下B1-B4或C1-C3或D1-D3或E1-E2或F1-F2的改造，得到名称为所述萜类生产菌的重组酿酒酵母；
B1、导入tHMG1基因；B2、导入香叶醇还原酶基因OYE2基因；B3、导入香叶醇合成酶基因ObGES基因；B4、导入ERG20基因96位和127位双点突变基因ERG20F96W/N127W基因；C1、导入tHMG1基因；C2、导入橙花醇合成酶GmNES基因；C3、导入橙花基二磷酸合成酶SINDPS1基因；D1、导入tHMG1基因；D2、导入芳樟醇合成酶基因CbLIS基因；D3、导入ERG20F96W/N127W基因；E1、导入法尼基焦磷酸合酶的基因synSmFPS基因；E2、导入瓦伦烯合成酶基因synCsVal基因；F1、导入法尼基焦磷酸合酶的基因synSmFPS基因；F2、导入橙花叔醇合成酶基因optiNES基因。
上述重组酿酒酵母的构建方法还可包括使上述导入基因得到表达。具体地，OYE2基因编码的OYE2蛋白质的序列可为genbank登陆号：NP_012049.1序列所示；ObGES基因基因编码的ObGES基因蛋白质的序列可为genbank登陆号：AMK97466.1序列第35-569位所示；GmNES基因编码的GmNES蛋白质的序列可为genbank登陆号：AEE92791.1序列所示；SINDPS1基因编码的SINDPS1蛋白质的序列可为genbank登陆号：QNM36897.1序列所示；CbLIS基因编码的CbLIS蛋白质的序列可为genbank登陆号：AAD19839.1序列所示；synSmFPS基因编码的synSmFPS蛋白质的序列可为genbank登陆号：AYC62332.1序列所示；synCsVal基因编码的synCsVal蛋白质的序列可为genbank登陆号：QES86623.1序列所示；optiNES基因编码的optiNES蛋白质的序列可为genbank登陆号：ANE83804.1序列所示。
B1-B4或C1-C3或D1-D3或E1-E2或F1-F2的改造可通过向萜类底盘菌导入上述基因表达盒实现。例如，OYE2基因表达盒序列如SEQ ID No.10所示；GmNES基因表达盒序列如SEQID No.11所示；ObGES基因和ERG20F96W/N127W基因表达盒如SEQ ID No.12所示；SINDPS1基因表达盒如SEQ ID No.13所示；CbLIS基因和ERG20F96W/N127W基因表达盒如SEQ ID No.14所示。
可选地，根据上述的方法，所述萜类生产菌中，B1-B4或C1-C3或D1-D3中的基因整合入所述萜类底盘菌的NDT80位点；E1-E2或F1-F2中的基因通过表达质粒导入所述萜类底盘菌。
根据上述的方法得到的名称为所述萜类生产菌的重组酿酒酵母也属于本发明的保护范围之内。
本发明还提供了如下任一一种应用。
X1、上述得到名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母的构建方法在制备生产萜产品中的应用；X2、上述得到名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母的构建方法在生产萜中的应用；X3、名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母在制备生产萜产品中的应用；X4、名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母在生产萜中的应用；X5、上述得到名称为萜类生产菌的重组酿酒酵母的构建方法在制备生产萜产品中的应用；X6、上述得到名称为萜类生产菌的重组酿酒酵母的构建方法在生产萜中的应用；X7、名称为萜类生产菌的重组酿酒酵母在制备生产萜类物质产品中的应用；X8、名称为萜类生产菌的重组酿酒酵母在生产萜类物质中的应用。
上文中，所述生产萜产品可为表达萜的重组菌。所述萜可为香叶醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、橙花叔醇。
酵母环氧鲨烯合成酶(ERG1)的表达受麦角固醇负调控，ERG1的启动子表达能受到细胞中麦角固醇丰度的调控，本发明利用ERG1的启动子或酵母羊毛甾醇合成酶(ERG7)的启动子替换酿酒酵母中EGR20的启动子或者ERG9的启动能显著提高工程菌中单萜和倍半萜等植物挥发性萜类的产量，并且成功构建了系列高产高附加值的细胞工厂。
附图说明
图1为CIT1菌株产物的GC-MS分析结果，其中，A为菌株HP001、CIT1以及香叶醇(Geraniol)和香茅醇(Citronellol)标准品的峰图，B(1)为数据库中香叶醇的MS图，B(2)为数据库中香茅醇的MS图，B(3)为CIT1样品的香叶醇MS图，B(4)为菌株CIT1发酵样品中香茅醇产物的MS图。
图2为NEROL菌株产物的GC-MS分析结果，其中，A为菌株HP001、NEROL以及橙花醇(Nerol)标准品的峰图，B(1)为数据库中橙花醇的MS图，B(2)为菌株NEROL发酵样品中橙花醇产物的MS图。
图3为LIN菌株产物的GC-MS分析结果，其中，A为菌株HP001、LIN以及橙花醇(Linalool)标准品的峰图，B(1)为数据库中芳樟醇的MS图，B(2)为菌株LIN发酵样品中芳樟醇产物的MS图。
图4为NED菌株产物的GC-MS分析结果，其中，A为菌株HP001、NED以及橙花叔醇(Nerolidol)标准品的峰图，B(1)为数据库中橙花叔醇的MS图，B(2)为NED发酵样品中橙花叔醇产物的MS图。
图5为VAL菌株产物的GC-MS分析结果，其中，A为菌株HP001、VAL以及瓦伦烯(Valencene)标准品的峰图，B(1)为数据库中瓦伦烯的MS图，B(2)为VAL发酵样品中瓦伦烯产物的MS图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验。
下述实施例使用的培养基及组分具体如下：
SD固体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，2％葡萄糖，0.01％Leu.(亮氨酸)，0.005％His.(组氨酸)，0.01％Ura.(尿嘧啶)，0.01％Trp.(色氨酸)和2％琼脂粉；
SD液体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.005％His.，0.01％Ura.，0.01％Trp.；
SD-Trp固体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.005％His.，0.01％Ura.，2％琼脂粉；
SD-Trp液体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.005％His.，0.01％Ura.；
SD-Trp-Ura固体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.005％His.，2％琼脂粉；
SD-Trp-5FOA固体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.005％His.，0.01％Ura.，0.05％5-FOA.，2％琼脂粉；
SD-Trp-His固体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.01％Ura.，2％琼脂粉；
SD-Trp-His液体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.01％Ura.；
SD-Trp-Leu固体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His.(组氨酸)，0.01％Ura.(尿嘧啶)和2％琼脂粉；
SD-Trp-Leu液体选择培养基：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Ura.。
下述实施例所涉及的基因片段以及蛋白质序列相关信息参见下表。
基因片段相关信息
蛋白质系列相关信息
genbank登陆号 更新时间
tHMG1蛋白质 AJS96703.1第530-1054位 2016/5/23
ERG12蛋白质 NP_013935.1 2020/10/2
IDI1蛋白质 NP_015208.1 2020/10/2
ERG19蛋白质 NP_014441.1 2020/10/2
HMGR蛋白质 WP_011241944.1 2019/6/19
ERG13蛋白质 NP_013580.1 2020/10/2
ERG8蛋白质 NP_013947.1 2020/10/2
ERG10蛋白质 NP_015297.1 2020/10/2
OYE2蛋白质 NP_012049.1 2020/3/09
GmNES蛋白质 AEE92791.1 2013/10/24
ObGES蛋白质 AMK97466.1第35-569位 2016/09/18
SINDPS1蛋白质 QNM36897.1 2020/09/05
CbLIS蛋白质 AAD19839.1 1999/03/12
LEU2蛋白质 ASW25893.1 2017/07/05
synSmFPS蛋白质 AYC62332.1 2018/09/30
synCsVal蛋白质 QES86623.1 2019/09/29
optiNES蛋白质 ANE83804.1 2016/03/21
实施例1
一、启动子元件的构建以及功能基因的获取
1、PCR扩增
在SD固体选择培养基中活化酿酒酵母CEN.PK2-1D(以下简称NK2，购自欧洲酿酒酵母保藏中心(EUROSCARF))，然后接种于相应液体选择培养基中，于30℃，250rpm培养16小时制备种子液。提取NK2菌株基因组DNA(使用康为世纪酵母基因组提取试剂盒(货号：CW0569)，根据厂商说明提取基因组)。以酿酒酵母NK2的基因组DNA为模板，分别采用表1中引物搭配，分别扩增得到启动子片段pERG1、pERG7(pERG1启动子为ERG1基因上游-1至-807位，pERG7启动子为ERG7基因上游-1至-774位)，再用含有pERG20和pERG9启动子区域同源臂的引物扩增得到启动子片段pERG20-pERG1、pERG20-pERG7、pERG9-pERG7。
扩增体系如下：TAKARAHSDNA聚合酶5×PS Buffer 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板0.5μl，/>HS聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件如下：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火15秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经割胶回收保存。
表1引物序列
2、相关基因的全合成
委托金斯瑞生物科技有限公司对synHMGR基因、SINDPS1基因、CbLIS基因、GmNES基因、synCsVal基因进行全合成，并将其插入pUC57载体(金斯瑞生物科技有限公司提供)的SexA1和Asc1克隆位点间，得到克隆型质粒pUC57-synHMGR、pUC57-SINDPS1、pUC57-CbLIS、pUC57-GmNES、pUC57-synCsVal。
二、重组质粒的构建
1、YJL064W-gRNA、pERG20-gRNA和pERG9-gRNA质粒的构建
以pLPPgRNA为模板，分别采用表2中引物搭配，分别扩增得到gRNA片段YJL064W-gRNA、pERG20-gRNA和pERG9-gRNA。将扩增得到的gRNA片段PCR产物用Dpn1酶处理三小时以上，然后取5-10μl转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到YJL064W-gRNA质粒、pERG20gRNA质粒和pERG9gRNA质粒，该质粒相关信息如表3所示。(pLPPgRNA记载在文章：Wang,D.,Wang,J.,Shi,Y.,Li,R.,&Zhang,X..(2020).Elucidation of the completebiosynthetic pathway of the main triterpene glycosylation products of panaxnotoginseng using a synthetic biology platform.Metabolic Engineering,61.中，pM3-GES、pM4-ERG20F96W–N127W记载在文章：Tao W,Siwei L,Bolin Z,et al.EngineeringSaccharomyces cerevisiae for the production of the valuable monoterpene estergeranyl acetate[J].Microbial Cell Factories,2018,17(1):85.中，pUC57-synSmFPS记载在中国专利：基于重组微生物法合成β-榄香烯，CN201610961269.5中)
表2引物序列
2、pRS425-ObGES-ERG20F96W/N127W、pRS425-synSmFPS-synCsVal、pRS425-CbLIS-ERG20F96W/N127W、pRS425-SINDPS1、pM4-OYE2、pM4-GmNES重组质粒的构建
(1)、PCR扩增
以酿酒酵母NK2的基因组DNA为模板，采用表2中引物，扩增得到香叶醇还原酶OYE2的功能基因片段。以合成的功能基因质粒为模板，分别采用表2中引物扩增得到ObGES-ERG20F96W/N127W、CbLIS-ERG20F96W/N127W、synSmFPS-synCsVa1基因融合片段和OYE2基因片段。
(2)、酶切连接构建重组质粒
将上述得到的片段纯化后，用限制性内切酶SexA1和Asc1分别双酶切质粒pRS425-LEU2-TEF1-SynPn3-29(实验室保存，记录在文章Wang,D.,Wang,J.,Shi,Y.,Li,R.,&Zhang,X..(2020).Elucidation of the complete biosynthetic pathway of the maintriterpene glycosylation products of panax notoginseng using a syntheticbiology platform.Metabolic Engineering,61.中)、pUC57-GmNES、pUC57-SINDPS1和质粒pM4-tHMG1(实验室保存，记载在文章：Tao W,Siwei L,Bolin Z,et al.EngineeringSaccharomyces cerevisiae for the production of the valuable monoterpene estergeranyl acetate[J].Microbial Cell Factories,2018,17(1):85.中)，以及片段ObGES-ERG20F96W/N127W、CbLIS-ERG20F96W/N127W、OYE2、synSmFPS-synCsVa1，然后割胶回收。
割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-TDH3-//-TPI1(5749bp，100ng)载体(质粒pM4-tHMG1割胶回收产物)和GmNES(质粒pUC57-GmNES割胶回收产物)(1605bp，20ng)、OYE2(片段OYE2割胶回收产物)(1203bp，30ng)片段，以及pRS425-LEU2-TEF1-//-CYC1(7576bp，120ng)载体(pRS425-LEU2-PTEF1-Pn3-32-TCYC1割胶回收产物)和SINDPS1片段(质粒pUC57-SINDPS1割胶回收产物)(783bp，20ng)、ObGES-ERG20F96W/N127W(片段ObGES-ERG20F96W/N127W割胶回收产物)(2763bp，105ng)、CbLIS-ERG20F96W/N127W(片段CbLIS-ERG20F96W/N127W割胶回收产物)(3681bp，90ng)、synSmFPS-synCsVa1(片段synSmFPS-synCsVa1割胶回收产物)(2964bp，130ng)片段。分别将目的片段和对应载体进行连接，连接体系如下：5μl 2×QuickLigation Buffer(NEB公司)、0.5μl Quick T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesiveend units/ml)，补充ddH2O至10μl，25℃反应10min，得到连接产物，转入Trans1 T1感受态细胞并进行测序验证，得到重组载体。
3、pM7-HMGR的质粒构建
以酿酒酵母NK2的基因组DNA为模板，采用引物Pac1-TEF2-F和SexA1-TEF2-R扩增获得启动子pTEF2(562bp)，采用引物Asc1-ENO2-F和Pme1-ENO2-R扩增获得终止子tENO2(400bp)。扩增体系如下：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)×10μl，dNTPMix×4μl，引物Pac1-TEF2-F和SexA1-TEF2-R(Asc1-ENO2-F和Pme1-ENO2-R)各1.5μl，基因组DNA模板为1.5μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl。
Pac1-TEF2-F：5’-GCTTAATTAAATGGGGCCGTATACTTACATATAGTAGA-3’
SexA1-TEF2-R：5’-GCACCAGGTGTTTAGTTAATTATAGTTCGTTGACCGTATATTCTAAAAAC-3’
Asc1-ENO2-F：5’-GCGGCGCGCCAGTGCTTTTAACTAAGAATTATTAGTCTTTTCTGCT-3’
Pme1-ENO2-R：5’-GCGTTTAAACAGGTATCATCTCCATCTCCCATATGC-3’
用限制性内切酶SexAⅠ和AscⅠ分别双酶切质粒pUC57-synHMGR，割胶回收目的片段获得片段SexAⅠ-synHMGR-AscⅠ；用限制性内切酶SexAⅠ和pacⅠ分别双酶切片段pTEF2，割胶回收目的片段获得SexAⅠ-pTEF2-pacⅠ；用限制性内切酶Asc1和Pme1分别双酶切片段tENO2，割胶回收目的片段获得Asc1-tENO2-Pme1，将三个片段各50ng加入连接体系：2ul 10XT4ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入，PCR体系：PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)x 10μl，dNTPMix 4μl，引物Pac1-TEF2-F和Pme1-ENO2-R各1.5μl，连接产物为1μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，补加ddH2O至总体积50μl，得到表达盒PTEF2-HMGR-TENO2。将表达盒克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到重组载体pM7-HMGR。
经过测序，重组载体已将基因的表达盒插入克隆载体的克隆位点间，并将其命名为pRS425-ObGES-ERG20F96W/N127W、pRS425-CbLIS-ERG20F96W/N127W、pRS425-synSmFPS-synCsVa1、pRS425-SINDPS1、pM4-OYE2、pM4-GmNES、pM7-HMGR。重组载体的相关信息如表3所示。
表3重组载体信息
三、重组菌的构建
1、底盘菌HP001、HP001-pERG1-ERG20、HP001-pERG7-ERG20、HP001-pERG7-ERG9的构建
分别用表4描述的质粒为PCR模板(pδ-tHMG1、pM9-ERG12、pM16-IDI1、pM5-ERG19、pM8-ERG13、pM11-ERG8、pM3-ERG10记载于文献：中国中药杂志，林庭庭，王冬，戴住波，张学礼，黄璐琦，2016，41(6)：1008-1015中)和相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块片段：M1(含有PPGK1-tHMG1-TADH1表达盒)、M2(含有PPDC1-ERG12-TADH2表达盒)、M3(含有PENO2-IDI1-T-PDC1表达盒)、M4(含有PPYK1-ERG19-TPGI1表达盒)、M5(含有PTEF2-HMGR-TENO2表达盒)、M6(含有PFBA1-ERG13-TTDH2表达盒)和M7(含有PTDH3-ERG8-TTPI1表达盒)、M8(含有PTEF1-ERG10-TCYC1表达盒)。
扩增体系如下：TAKARAHSDNA聚合酶5×PS Buffer 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板0.5μl，/>HS聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火15秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经割胶回收保存。
表4引物信息
/>
在SD液体培养基中活化酵母底盘细胞NK2，以醋酸锂法制备感受态细胞。加入2μlp414-TEF1p-Cas9-CYC1t质粒(实验室保存，购买自addgene。)，转化子在SD-Trp固体选择培养基中30℃恒温箱培养48小时后划线培养。将上述得到的菌株在SD-Trp液体选择培养基中活化，以醋酸电锂法制备感受态细胞。在感受态中加入2μl YJL064W-gRNA质粒，再将上述扩增得到的M1、M2、M3、M4、M5、M6(PFBA1-ERG13-TTDH2)和M7和M8这8个模块片段(总量8μl)以摩尔比1:1:1:1:1:1:1:1加入到酵母感受态细胞中。转化子在SD-Trp-Ura固体选择培养基中30℃恒温箱培养48小时后划线培养，进行PCR验证，验证正确的菌株在SD-Trp-5FOA固体选择培养基中培养24h消除gRNA质粒，命名为HP001。菌株HP001相关信息参见表7。
HP001的构建原理具体为菌株NK2中预先转入可以表达Cas9蛋白的重组质粒p414-PTEF1-Cas9-TCYC1，而后表达gRNA的重组质粒(YJL064W-gRNA质粒)与重组片段(M1-M8)一同转化进菌株中，YJL064W-gRNA质粒识别并结合YJL064W位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使YJL064W位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的重组片段M1-M8通过同源重组修复被整合进入菌株DNA中。
在SD液体培养基中活化酵母底盘细胞HP001，醋酸锂法制备感受态。将上述得到的pERG20-gRNA质粒(2μl，表达靶向pERG20的gRNA)，分别搭配2μl pERG20-pERG1片段和2μlpERG20-pERG7片段加入到制备好的酵母感受态细胞中。将上述得到的pERG9-gRNA质粒(2μl，表达靶向pERG9的gRNA)搭配2μl pERG9-pERG7片段加入到制备好的酵母感受态细胞中。转化子在SD-Trp-Ura固体选择培养基中30℃恒温箱培养48小时。以上述方法提取酵母基因组DNA，以提取的菌株基因组DNA为模板,分别采用表5中引物PCR扩增片段，测序验证。
验证结果：菌株HP001-pERG1-ERG20和菌株HP001-pERG7-ERG20，以ERG20-OUT-F/ERG20-R为引物验证。PCR扩增条带大小约为2.1K的为HP001-pERG1-ERG20验证正确的菌株，条带大小约为2.0K的为HP001-pERG7-ERG20验证正确的菌株，而条带大小1.6K为原始条带，表示未替换成功。菌株HP001-pERG1-ERG20以PTH1-OUT-F/ERG9-R为引物验证。PCR扩增条带大小约为1.8K的为HP001-pERG1-ERG20验证正确的菌株，而条带大小1.2K为原始条带，表示未替换成功。
验证正确的菌株在SD-Trp-5FOA固体选择培养基中培养24h消除gRNA质粒，分别命名为HP001-pERG1-ERG20、HP001-pERG7-ERG20、HP001-pERG7-ERG9。HP001-pERG1-ERG20、HP001-pERG7-ERG20和HP001-pERG7-ERG9的相关信息参见表7。
表5验证引物信息
2、重组菌株的构建
(1)、基因模块的构建
分别用表6描述的PCR模板(NDT80-HIS3记载在文章：张丽丽,2017，中国中药杂志中)和相应引物进行PCR扩增，分别获得功能模块：M9(含有NDT80-HIS3-up)、M10(含有PPGK1-tHMG1-TADH1表达盒)、M11(含有PTDH3-OYE2-TTPI1表达盒)、M12(含有PTDH3-GmNES-TTPI1表达盒)、M13(含有PTEF1-ObGES-ERG20F96W/N127W-TCYC1表达盒)、M14(含有PTEF1-SINDPS1-TCYC1表达盒)、M15(含有PTEF1-CbLIS-ERG20F96W/N127W-TCYC1表达盒)、M16(含有PPGK1-tHMG1-TADH1表达盒)、M17(含有NDT80-HIS3-down)。
扩增体系如下：TAKARAHSDNA聚合酶5×PS Buffer 10μl，dNTPMix 4μl，引物各1.5μl，DNA模板0.5μl，/>HS聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，补加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火15秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。产物经割胶回收保存。
表6引物序列
/>
(2)、重组菌株的构建
在SD-Trp液体选择培养基活化上述得到的酵母底盘细胞HP001、HP001-pERG1-ERG20、HP001-pERG7-ERG20，分别以醋酸锂法制备感受态细胞。分别将M9、M17、M10、M11、M13搭配(总量8μl，制备菌株CIT1、CIT-pERG1、CIT-pERG7)，M9、M17、M10、M12、M14搭配(总量8μl，制备菌株NEROL、NEROL-pERG1、NEROL-pERG7)，M9、M17、M15、M16搭配(总量6μl，制备菌株LIN、LIN-pERG1、LIN-pERG7)，以等摩尔比加入到酵母感受态细胞中。转化子在SD-Trp-His固体选择培养基中30℃恒温箱培养48小时。以上述方法提取酵母基因组，以提取的菌株基因组为模板，按照表7所示的引物搭配验证功能基因，条带大小正确的菌株即为正确菌株，验证正确的菌株进行命名。菌株CIT1、CIT-pERG1、CIT-pERG7表达tHMG1蛋白质、OYE2蛋白质、ObGES蛋白质和ERG20F96W/N127W蛋白质。菌株NEROL、NEROL-pERG1、NEROL-pERG7表达tHMG1蛋白质、GmNES蛋白质、SINDPS1蛋白质。菌株LIN、LIN-pERG1、LIN-pERG7表达tHMG1蛋白质、CbLIS蛋白质和ERG20F96W/N127W蛋白质。
在SD-Trp液体选择培养基中活化酵母底盘细胞HP001、HP001-pERG7-ERG9，以醋酸电锂法制备感受态细胞。分别加入2μl pRS313-Leu-TEF1-synSFPS-optiNES质粒(实验室保存，记载在张丽丽，等，2017，中国中药杂志，)和2μl pRS425-synSmFPS-synCsVa1质粒到酵母感受态细胞中，转化子在SD-Trp-Leu固体选择培养基中30℃恒温箱培养36h后划线培养。在SD-Trp-Leu液体培养基中活化菌株，提取菌株酵母质粒(使用天根酵母质粒提取试剂盒(货号：DP112-02)，根据厂商说明提取酵母质粒)，以提取的酵母质粒为模板，按照表7中的引物搭配验证菌株，验证正确的菌株命名为NED、NED-pERG7、VAL、VAL-pERG7。菌株NED和NED-pERG7表达LEU2蛋白质和optiNES蛋白质，菌株VAL和VAL-pERG7表达LEU2蛋白质和CsVA1蛋白质。
上述构建的重组菌相关信息参见表8。
表7菌株验证
表8菌株信息
/>
四、摇瓶发酵和检测
1、工程菌培养及产物提取
根据表9，在相应固体选择培养基中活化上述制备的所有酵母工程菌株，于相应液体选择培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15ml相应液体选择培养基的100ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养1天。然后CIT1、CIT-pERG1、CIT-pERG7、NEROL、NEROL-pERG1、NEROL-pERG7、LIN、LIN-pERG1、LIN-pERG7菌株发酵液加入1.5ml油酸甲酯，NED、NED-pERG7、VAL、VAL-pERG7菌株发酵液中加入1.5ml十二烷，继续震荡培养5天。最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集有机相备用。
表9培养菌株使用的培养基
菌种名 固体选择培养基 液体选择培养基
CIT1 SD-Trp-His SD-Trp-His
CIT-pERG1 SD-Trp-His SD-Trp-His
CIT-pERG7 SD-Trp-His SD-Trp-His
NEROL SD-Trp-His SD-Trp-His
NEROL-pERG1 SD-Trp-His SD-Trp-His
NEROL-pERG7 SD-Trp-His SD-Trp-His
LIN SD-Trp-His SD-Trp-His
LIN-pERG1 SD-Trp-His SD-Trp-His
LIN-pERG7 SD-Trp-His SD-Trp-His
NED SD-Trp-Leu SD-Trp-Leu
NED-pERG7 SD-Trp-Leu SD-Trp-Leu
VAL SD-Trp-Leu SD-Trp-Leu
VAL-pERG7 SD-Trp-Leu SD-Trp-Leu
2、定性定量分析
GC--MS检测
单萜化合物检测：将转化后物质用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜(0.22μm)，用GC-MS检测。检测仪器：安捷伦气质联用仪Agilent 7890A/5975C。GC-MS测定条件：进样口温度250℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：45℃，1min，5℃/min到130℃，10℃/min到250℃，保温1min；MS条件：Full Scan:50-750amu。
倍半萜化合物橙花叔醇检测：将转化后物质用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜(0.22μm)，用GC-MS检测。检测仪器：安捷伦气质联用仪Agilent 7890A/5975C。GC-MS测定条件：进样口温度250℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：45℃，1min，10℃/min到300℃保温5min；MS条件：Full Scan:50-750amu。
用相应的标准品进行定性定量，香叶醇标准品(货号：G107515)购自阿拉丁公司、香茅醇标准品(货号：G107515)和芳樟醇标准品(货号：B20387)购自上海源叶生物科技有限公司、橙花醇标准品(货号：N0077)购自浙江联硕生物科技有限公司，橙花叔醇标准品(货号：B50652)购自上海源叶生物科技有限公司，瓦伦烯标准品(货号：V911338)购自上海麦克林生化科技有限公司。图1-5为实施例所制备的所有酵母工程菌株生产各种产物的GC-MS检测图。
实验重复三次，结果各工程菌发酵6天时产量如下：
CIT1菌株的香叶醇产量为9.82±1.11mg/L，香茅醇产量为7.87±1.42mg/L；
CIT-pERG1菌株的香叶醇产量为91.79±8.51mg/L，香茅醇产量为41.35±6.07mg/L；
CIT-pERG7菌株的香叶醇产量为130.24±23.20mg/L，香茅醇产量为60.77±7.94mg/L。
NEROL菌株的橙花醇产量为0.55±0.01mg/L；
NEROL-pERG1菌株的橙花醇产量为8.33±0.02mg/L；
NEROL-pERG7菌株的橙花醇产量为12.46±0.05mg/L。
LIN菌株的芳樟醇产量为5.31±0.04mg/L；
LIN-pERG1菌株的芳樟醇产量为7.56±0.03mg/L；
LIN-pERG7菌株的芳樟醇产量为8.99±0.03mg/L。
VAL菌株的瓦伦烯产量为1.54±0.05mg/L；
VAL-pERG7菌株的瓦伦烯产量为5.30±0.03mg/L；
NED菌株的橙花叔醇产量为209.25±36.74mg/L；
NED-pERG7菌株的橙花叔醇产量为912.72±31.76mg/L。
3、生物反应器发酵培养
1)培养基配置
氯化钙母液：19.2g/L二水氯化钙。
微量金属盐母液：19.1g/L乙二胺四乙酸二钠；10.2g/L七水硫酸锌；0.5g/L四水氯化锰；0.86g/L六水氯化钴；0.78g/L五水硫酸铜；0.56g/L二水钼酸钠；5.12g/L七水亚硫酸铁。
维他命母液：0.05g/L生物素；0.2g/L对氨基苯甲酸纳；1g/L烟酸；1g/L泛酸钙；1g/L盐酸吡哆醇；1g/L盐酸硫胺素；25g/L肌醇。
种子培养基和发酵培养基：25g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，6.15g/L七水硫酸镁，0.72g/L七水硫酸锌，8g/L磷酸二氢钾，2ml/L氯化钙母液，10ml/L微量金属盐母液；12ml/L维他命母液，1g/L色氨酸，其余为水。
补料培养基：800g/L葡萄糖，5.125g/L七水硫酸镁，3.5g/L硫酸钾，0.28g/L硫酸钠，9g/L磷酸二氢钾，1g/L色氨酸，其余为水。
2)工程菌pERG7-CIT发酵
按“1、工程菌培养及产物提取”中方法活化工程菌pERG7-CIT。回补氨基酸筛选标记后，挑取平板上的单克隆至装有SD-Trp-Ura-His-Leu培养基的试管，30℃，250rpm振荡培养过夜；吸取500μL菌液至装有50ml SD-Trp-Ura-His-Leu培养基的250ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养24h；
分别吸取2ml菌液至3个装有100ml无机盐种子培养基的1L三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养48h；最后经火焰接种环，将种子液加入含3L发酵培养基的7L发酵罐(德国Eppendorf公司，型号：320)中。
发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH 5.0，溶氧30％，空气流量3-20L/min，搅拌转速300-1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气级联。当溶氧值大于60％时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5g/L。
在发酵结束前3小时，添加10％(相对于培养液体积)的油酸甲酯，发酵结束后分离有机相。
按“2、定性定量分析”中转化方法和检测方法处理，并进行定性定量分析，工程菌pERG7-CIT高密度发酵192小时后能得到6.37g/L(相对于培养液)香茅醇和340mg/L香叶醇(相对于培养液)。
符合本发明目的的重组菌，包括但不限于表9中记载的具体实验例，均可按照“3、生物反应器发酵培养”中所述的发酵方法进行发酵培养，得到对应产物。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60
aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120
tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180
cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240
gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300
gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360
caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420
gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480
tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540
tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600
atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660
agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720
ttatctactt tttacaacaa atataaaaca aaaacaatgg ctgcagacca attggtgaaa 780
actgaagtca ccaagaagtc ttttactgct cctgtacaaa aggcttctac accagtttta 840
accaataaaa cagtcatttc tggatcgaaa gtcaaaagtt tatcatctgc gcaatcgagc 900
tcatcaggac cttcatcatc tagtgaggaa gatgattccc gcgatattga aagcttggat 960
aagaaaatac gtcctttaga agaattagaa gcattattaa gtagtggaaa tacaaaacaa 1020
ttgaagaaca aagaggtcgc tgccttggtt attcacggta agttaccttt gtacgctttg 1080
gagaaaaaat taggtgatac tacgagagcg gttgcggtac gtaggaaggc tctttcaatt 1140
ttggcagaag ctcctgtatt agcatctgat cgtttaccat ataaaaatta tgactacgac 1200
cgcgtatttg gcgcttgttg tgaaaatgtt ataggttaca tgcctttgcc cgttggtgtt 1260
ataggcccct tggttatcga tggtacatct tatcatatac caatggcaac tacagagggt 1320
tgtttggtag cttctgccat gcgtggctgt aaggcaatca atgctggcgg tggtgcaaca 1380
actgttttaa ctaaggatgg tatgacaaga ggcccagtag tccgtttccc aactttgaaa 1440
agatctggtg cctgtaagat atggttagac tcagaagagg gacaaaacgc aattaaaaaa 1500
gcttttaact ctacatcaag atttgcacgt ctgcaacata ttcaaacttg tctagcagga 1560
gatttactct tcatgagatt tagaacaact actggtgacg caatgggtat gaatatgatt 1620
tctaaaggtg tcgaatactc attaaagcaa atggtagaag agtatggctg ggaagatatg 1680
gaggttgtct ccgtttctgg taactactgt accgacaaaa aaccagctgc catcaactgg 1740
atcgaaggtc gtggtaagag tgtcgtcgca gaagctacta ttcctggtga tgttgtcaga 1800
aaagtgttaa aaagtgatgt ttccgcattg gttgagttga acattgctaa gaatttggtt 1860
ggatctgcaa tggctgggtc tgttggtgga tttaacgcac atgcagctaa tttagtgaca 1920
gctgttttct tggcattagg acaagatcct gcacaaaatg ttgaaagttc caactgtata 1980
acattgatga aagaagtgga cggtgatttg agaatttccg tatccatgcc atccatcgaa 2040
gtaggtacca tcggtggtgg tactgttcta gaaccacaag gtgccatgtt ggacttatta 2100
ggtgtaagag gcccgcatgc taccgctcct ggtaccaacg cacgtcaatt agcaagaata 2160
gttgcctgtg ccgtcttggc aggtgaatta tccttatgtg ctgccctagc agccggccat 2220
ttggttcaaa gtcatatgac ccacaacagg aaacctgctg aaccaacaaa acctaacaat 2280
ttggacgcca ctgatataaa tcgtttgaaa gatgggtccg tcacctgcat taaatcctaa 2340
agttataaaa aaaataagtg tatacaaatt ttaaagtgac tcttaggttt taaaacgaaa 2400
attcttattc ttgagtaact ctttcctgta ggtcaggttg ctttctcagg tatagcatga 2460
ggtcgctctt attgaccaca cctctaccgg catgccga 2580
<210> 2
<211> 2532
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgcgactg ggtgagcata tgttccgctg atgtgatgtg caagataaac aagcaaggca 60
gaaactaact tcttcttcat gtaataaaca caccccgcgt ttatttacct atctctaaac 120
ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag cacactgcac ccataccttc 180
cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc cttcccgatt ccgcccgcta 240
aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca taacctatgc atttaaaaga 300
ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt ggaaaaaatg aataatttat 360
gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta tggaataatc aatcaattga 420
ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct ttgagtactt ttcttcataa 480
ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg tgtcttgatc tacttgctat 540
cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag ctcatttgaa tcagcttatg 600
gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg aacataggaa aaaaaaatat 660
ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg gtttgttccc tttattttca 720
tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata 780
acacagtcaa atcaatcaaa atgtcattac cgttcttaac ttctgcaccg ggaaaggtta 840
ttatttttgg tgaacactct gctgtgtaca acaagcctgc cgtcgctgct agtgtgtctg 900
cgttgagaac ctacctgcta ataagcgagt catctgcacc agatactatt gaattggact 960
tcccggacat tagctttaat cataagtggt ccatcaatga tttcaatgcc atcaccgagg 1020
atcaagtaaa ctcccaaaaa ttggccaagg ctcaacaagc caccgatggc ttgtctcagg 1080
aactcgttag tcttttggat ccgttgttag ctcaactatc cgaatccttc cactaccatg 1140
cagcgttttg tttcctgtat atgtttgttt gcctatgccc ccatgccaag aatattaagt 1200
tttctttaaa gtctacttta cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg 1260
tatcactggc cttagctatg gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa 1320
agctgtcaga aaacgataag catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta 1380
ttcacggtac cccttcagga atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat 1440
ttgaaaaaga ctcacataat ggaacaataa acacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt 1500
tcccagccat tccaatgatc ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg 1560
ttgctcgcgt tcgtgtgttg gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag 1620
atgccatggg tgaatgtgcc ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta 1680
aaggcaccga tgacgaggct gtagaaacta ataatgaact gtatgaacaa ctattggaat 1740
tgataagaat aaatcatgga ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac 1800
ttattaaaaa tctgagcgat gatttgagaa ttggctccac aaaacttacc ggtgctggtg 1860
gcggcggttg ctctttgact ttgttacgaa gagacattac tcaagagcaa attgacagct 1920
tcaaaaagaa attgcaagat gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga 1980
ctggctgctg tttgttaagc gcaaaaaatt tgaataaaga tcttaaaatc aaatccctag 2040
tattccaatt atttgaaaat aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc 2100
caggaaacac gaatttacca tggacttcat aagcggatct cttatgtctt tacgatttat 2160
agttttcatt atcaagtatg cctatattag tatatagcat ctttagatga cagtgttcga 2220
agtttcacga ataaaagata atattctact ttttgctccc accgcgtttg ctagcacgag 2280
tgaacaccat ccctcgcctg tgagttgtac ccattcctct aaactgtaga catggtagct 2340
tcagcagtgt tcgttatgta cggcatcctc caacaaacag tcggttatag tttgtcctgc 2400
tcctctgaat cgtctccctc gatatttctc attttccttc gcatgccagc attgaaatga 2460
tcgaagttca atgatgaaac ggtaattctt ctgtcattta ctcatctcat ctcatcaagt 2520
tatataattc ta 2616
<210> 3
<211> 2267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcctactc ttgccgttgc catccaaaat gagctagaag gtggattaac aaatataatg 60
acaaatcgtt gcttgtctga cttgattcca ctacagttac aaatatttga cattgtatat 120
aagttttgca agttcatcaa atctatgaga gcaaaattat gtcaactgga ccccgtacta 180
tatgagaaac acaaaagcgg gatgatgaaa acactaaacg aaggctatcg tacaaacaat 240
ggcggtcagg aagatgttgg ttaccaagaa gatgccgccc tggaattaat tcagaagctg 300
attgaataca ttagcaacgc gtccagcatt tttcggaagt gtctcataaa ctttactcaa 360
gagttaagta ctgaaaaatt cgacttttat gatagttcaa gtgtcgacgc tgcgggtata 420
gaaagggttc tttactctat agtacctcct cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga 480
acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa 540
aactggcatc cactaattga tacatctaca caccgcacgc cttttttctg aagcccactt 600
tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca 660
ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca tttggttcat cgtggttcat taattttttt 720
tctccattgc tttctggctt tgatcttact atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga 780
attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca 840
gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca aacgcaattg taattaattc ttattttgta 900
tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt tttattttat ttttcttttc ttagtttctt 960
tcataacacc aagcaactaa tactataaca tacaataata atgactgccg acaacaatag 1020
tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg caaaaccaaa cacctgaaga 1080
cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa agacctaata cccgatctag 1140
tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct ggtcatgatg aggagcaaat 1200
taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac gataatgcta ttggtgccgg 1260
taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag ggtttactac atcgtgcatt 1320
ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta caacaaagag ccactgaaaa 1380
aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct catccactat gtattgatga 1440
cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag ggcgctatta ctgcggcggt 1500
gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa actaagacaa ggggtaagtt 1560
tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat gaaccatggg gtgaacatga 1620
aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa aacttgactg tcaacccaaa 1680
cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat gatttgaaaa ctatgtttgc 1740
tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt tgcgagaatt acttattcaa 1800
ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat gacaggcaaa ttcatagaat 1860
gctataagcg atttaatctc taattattag ttaaagtttt ataagcattt ttatgtaacg 1920
aaaaataaat tggttcatat tattactgca ctgtcactta ccatggaaag accagacaag 1980
aagttgccga cagtctgttg aattggcctg gttaggctta agtctgggtc cgcttcttta 2040
caaatttgga gaatttctct taaacgatat gtatattctt ttcgttggaa aagatgtctt 2100
ccaaaaaaaa aaccgatgaa ttagtggaac caaggaaaaa aaaagaggta tccttgatta 2160
aggaacactg tttaaacagt gtggtttcca aaaccctgaa actgcattag tgtaatagaa 2220
gactagacac ctcgatacaa ataatggtta ctcaattcaa aactgcc 2341
<210> 4
<211> 2591
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgctacta ttttggagat taatctcagt acaaaacaat attaaaaaga ggtgaattat 60
ttttcccccc ttattttttt tttgttaaaa ttgatccaaa tgtaaataaa caatcacaag 120
gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaatagccgc catgaccccg gatcgtcggt tgtgatacgg 180
tcagggtagc gccctggtca aacttcagaa ctaaaaaaat aataaggaag aaaaaaatag 240
ctaatttttc cggcagaaag attttcgcta cccgaaagtt tttccggcaa gctaaatgga 300
aaaaggaaag attattgaaa gagaaagaaa gaaaaaaaaa aaatgtacac ccagacatcg 360
ggcttccaca atttcggctc tattgttttc catctctcgc aacggcggga ttcctctatg 420
gcgtgtgatg tctgtatctg ttacttaatc cagaaactgg cacttgaccc aactctgcca 480
cgtgggtcgt tttgccatcg acagattggg agattttcat agtagaattc agcatgatag 540
ctacgtaaat gtgttccgca ccgtcacaaa gtgttttcta ctgttctttc ttctttcgtt 600
cattcagttg agttgagtga gtgctttgtt caatggatct tagctaaaat gcatattttt 660
tctcttggta aatgaatgct tgtgatgtct tccaagtgat ttcctttcct tcccatatga 720
tgctaggtac ctttagtgtc ttcctaaaaa aaaaaaaagg ctcgccatca aaacgatatt 780
cgttggcttt tttttctgaa ttataaatac tctttggtaa cttttcattt ccaagaacct 840
cttttttcca gttatatcat ggtccccttt caaagttatt ctctactctt tttcatattc 900
attctttttc atcctttggt tttttattct taacttgttt attattctct cttgtttcta 960
tttacaagac accaatcaaa acaaataaaa catcatcaca atgaccgttt acacagcatc 1020
cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg gggaaaaggg acacgaagtt 1080
gaatctgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg caagatgacc tcagaacgtt 1140
gacctctgcg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact ttgtggttaa atggagaacc 1200
acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtctgcgc gacctacgcc aattaagaaa 1260
ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct caatggaaac tccacattgt 1320
ctccgaaaat aactttccta cagcagctgg tttagcttcc tccgctgctg gctttgctgc 1380
attggtctct gcaattgcta agttatacca attaccacag tcaacttcag aaatatctag 1440
aatagcaaga aaggggtctg gttcagcttg tagatcgttg tttggcggat acgtggcctg 1500
ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca gtacaaatcg cagacagctc 1560
tgactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc gatattaaaa aggatgtgag 1620
ttccactcag ggtatgcaat tgaccgtggc aacctccgaa ctatttaaag aaagaattga 1680
acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc attgttgaaa aagatttcgc 1740
cacctttgca aaggaaacaa tgatggattc caactctttc catgccacat gtttggactc 1800
tttccctcca atattctaca tgaatgacac ttccaagcgt atcatcagtt ggtgccacac 1860
cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg tttgatgcag gtccaaatgc 1920
tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactcttt gcatttatct ataaattgtt 1980
tggctctgtt cctggatggg acaagaaatt tactactgag cagcttgagg ctttcaacca 2040
tcaatttgaa tcatctaact ttactgcacg tgaattggat cttgagttgc aaaaggatgt 2100
tgccagagtg attttaactc aagtcggttc aggcccacaa gaaacaaacg aatctttgat 2160
tgacgcaaag actggtctac caaaggaata aacaaatcgc tcttaaatat atacctaaag 2220
aacattaaag ctatattata agcaaagata cgtaaatttt gcttatatta ttatacacat 2280
atcatatttc tatattttta agatttggtt atataatgta cgtaatgcaa aggaaataaa 2340
ttttatacat tattgaacag cgtccaagta actacattat gtgcactaat agtttagcgt 2400
cgtgaagact ttattgtgtc gcgaaaagta aaaattttaa aaattagagc accttgaact 2460
tgcgaaaaag gttctcatca actgtttaaa aggaggatat caggtcctat ttctgacaaa 2520
caatatacaa atttagtttc aaagatgaat cagtgcgcga aggacataac tcatgaagcc 2580
tccagtatac c 2677
<210> 5
<211> 2264
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggggccgt atacttacat atagtagatg tcaagcgtag gcgcttcccc tgccggctgt 60
gagggcgcca taaccaaggt atctatagac cgccaatcag caaactacct ccgtacattc 120
atgttgcacc cacacattta tacacccaga ccgcgacaaa ttacccataa ggttgtttgt 180
gacggcgtcg tacaagagaa cgtgggaact ttttaggctc accaaaaaag aaagaaaaaa 240
tacgagttgc tgacagaagc ctcaagaaaa aaaaaattct tcttcgacta tgctggaggc 300
agagatgatc gagccggtag ttaactatat atagctaaat tggttccatc accttctttt 360
ctggtgtcgc tccttctagt gctatttctg gcttttccta tttttttttt tccatttttc 420
tttctctctt tctaatatat aaattctctt gcattttcta tttttctctc tatctattct 480
acttgtttat tcccttcaag gttttttttt aaggagtact tgtttttaga atatacggtc 540
aacgaactat aattaactaa acatgactgg taaaacaggt catatcgatg gtttgaattc 600
tagaatcgaa aagatgagag atttggaccc agcacaaaga ttagttagag ttgctgaagc 660
tgcaggtttg gaaccagaag ctatttctgc attagctggt aatggtgcat tgccattatc 720
attggctaac ggtatgatcg aaaacgttat cggtaaattc gaattgccat tgggtgttgc 780
tactaacttc acagttaacg gtagagatta tttgatccca atggctgttg aagaaccatc 840
tgttgttgct gcagcttcat acatggcaag aattgctaga gaaaatggtg gttttactgc 900
acatggtaca gctccattga tgagagctca aattcaagtt gttggtttag gtgacccaga 960
aggtgcaaga caaagattgt tagctcataa agcagctttt atggaagcag ctgatgctgt 1020
tgatccagtt ttagttggtt tgggtggtgg ttgtagagat atcgaagttc atgtttttag 1080
agatactcca gttggtgcta tggttgtttt gcatttgatc gttgatgtta gagatgcaat 1140
gggtgctaac actgttaaca caatggcaga aagattggct ccagaagttg aaagaattgc 1200
aggtggtact gttagattga gaattttgtc taatttggct gatttgagat tggttagagc 1260
aagagttgaa ttggctccag aaacattaac tacacaaggt tatgatggtg cagatgttgc 1320
tcgtggtatg gttgaagcat gtgctttagc aattgttgat ccatacagag cagctactca 1380
taataagggt atcatgaacg gtatcgatcc agttgttgtt gcaactggta atgattggag 1440
agctattgaa gctggtgcac atgcttatgc agctagaact ggtcattaca cttcattgac 1500
aagatgggaa ttagctaatg atggtagatt ggttggtact attgaattac cattggcatt 1560
aggtttggtt ggtggtgcta ctaaaacaca tccaacagca agagcagctt tagctttgat 1620
gcaagttgaa actgcaacag aattggctca agttacagca gctgttggtt tagctcaaaa 1680
tatggcagct attagagcat tggctactga aggtattcaa agaggtcata tgacattgca 1740
tgcaagaaac atcgctatta tggcaggtgc tactggtgca gatatcgata gagttacaag 1800
agttattgtt gaagctggtg acgtttcagt tgcaagagct aagcaagttt tggaaaacac 1860
ataaagtgct tttaactaag aattattagt cttttctgct tattttttca tcatagttta 1920
gaacacttta tattaacgaa tagtttatga atctatttag gtttaaaaat tgatacagtt 1980
ttataagtta ctttttcaaa gactcgtgct gtctattgca taatgcactg gaaggggaaa 2040
aaaaaggtgc acacgcgtgg ctttttcttg aatttgcagt ttgaaaaata actacatgga 2100
tgataagaaa acatggagta cagtcacttt gagaaccttc aatcagctgg taacgtcttc 2160
gttaattgga tactcaaaaa agatggatag catgaatcac aagatggaag gaaatgcggg 2220
ccacgaccac agtgatatgc atatgggaga tggagatgat acct 2338
<210> 6
<211> 2699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacctgaagc ataactgaca ctactatcat caatacttgt cacatgagaa ctctgtgaat 60
aattaggcca ctgagatcca actggcaccg ctggcttgaa caacaatacc agccttccaa 120
cttctgtaaa taacggcggt acgccagtgc caccagtacc gttacctttc ggtatacctc 180
ctttccccat gtttccaatg cccttcatgc ctccaacggc tactatcaca aatcctcatc 240
aagctgacgc aagccctaag aaatgaataa caatactgac agtactaaat aattgcctac 300
ttggcttcac atacgttgca tacgtcgata tagataataa tgataatgac agcaggatta 360
tcgtaatacg taatagttga aaatctcaaa aatgtgtggg tcattacgta aataatgata 420
ggaatgggat tcttctattt ttcctttttc cattctagca gccgtcggga aaacgtggca 480
tcctctcttt cgggctcaat tggagtcacg ctgccgtgag catcctctct ttccatatct 540
aacaactgag cacgtaacca atggaaaagc atgagcttag cgttgctcca aaaaagtatt 600
ggatggttaa taccatttgt ctgttctctt ctgactttga ctcctcaaaa aaaaaaaatc 660
tacaatcaac agatcgcttc aattacgccc tcacaaaaac ttttttcctt cttcttcgcc 720
cacgttaaat tttatccctc atgttgtcta acggatttct gcacttgatt tattataaaa 780
agacaaagac ataatacttc tctatcaatt tcagttattg ttcttccttg cgttattctt 840
ctgttcttct ttttcttttg tcatatataa ccataaccaa gtaatacata ttcaaaatga 900
aactctcaac taaactttgt tggtgtggta ttaaaggaag acttaggccg caaaagcaac 960
aacaattaca caatacaaac ttgcaaatga ctgaactaaa aaaacaaaag accgctgaac 1020
aaaaaaccag acctcaaaat gtcggtatta aaggtatcca aatttacatc ccaactcaat 1080
gtgtcaacca atctgagcta gagaaatttg atggcgtttc tcaaggtaaa tacacaattg 1140
gtctgggcca aaccaacatg tcttttgtca atgacagaga agatatctac tcgatgtccc 1200
taactgtttt gtctaagttg atcaagagtt acaacatcga caccaacaaa attggtagat 1260
tagaagtcgg tactgaaact ctgattgaca agtccaagtc tgtcaagtct gtcttgatgc 1320
aattgtttgg tgaaaacact gacgtcgaag gtattgacac gcttaatgcc tgttacggtg 1380
gtaccaacgc gttgttcaac tctttgaact ggattgaatc taacgcatgg gatggtagag 1440
acgccattgt agtttgcggt gatattgcca tctacgataa gggtgccgca agaccaaccg 1500
gtggtgccgg tactgttgct atgtggatcg gtcctgatgc tccaattgta tttgactctg 1560
taagagcttc ttacatggaa cacgcctacg atttttacaa gccagatttc accagcgaat 1620
atccttacgt cgatggtcat ttttcattaa cttgttacgt caaggctctt gatcaagttt 1680
acaagagtta ttccaagaag gctatttcta aagggttggt tagcgatccc gctggttcgg 1740
atgctttgaa cgttttgaaa tatttcgact acaacgtttt ccatgttcca acctgtaaat 1800
tggtcacaaa atcatacggt agattactat ataacgattt cagagccaat cctcaattgt 1860
tcccagaagt tgacgccgaa ttagctactc gcgattatga cgaatcttta accgataaga 1920
acattgaaaa aacttttgtt aatgttgcta agccattcca caaagagaga gttgcccaat 1980
ctttgattgt tccaacaaac acaggtaaca tgtacaccgc atctgtttat gccgcctttg 2040
catctctatt aaactatgtt ggatctgacg acttacaagg caagcgtgtt ggtttatttt 2100
cttacggttc cggtttagct gcatctctat attcttgcaa aattgttggt gacgtccaac 2160
atattatcaa ggaattagat attactaaca aattagccaa gagaatcacc gaaactccaa 2220
aggattacga agctgccatc gaattgagag aaaatgccca tttgaagaag aacttcaaac 2280
ctcaaggttc cattgagcat ttgcaaagtg gtgtttacta cttgaccaac atcgatgaca 2340
aatttagaag atcttacgat gttaaaaaat aaatttaact ccttaagtta ctttaatgat 2400
ttagttttta ttattaataa ttcatgctca tgacatctca tatacacgtt tataaaactt 2460
aaatagattg aaaatgtatt aaagattcct cagggattcg atttttttgg aagtttttgt 2520
ttttttttcc ttgagatgct gtagtatttg ggaacaatta tacaatcgaa agatatatgc 2580
ttacattcga ccgttttagc cgtgatcatt atcctatagt aacataattt gatgcctgaa 2640
ggaccggcat cacggatttt cgataaagca cttagtatca cactaattgg cttttcgcc 2787
<210> 7
<211> 2558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta atgacgcgga ggccaaggca 60
aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt gaataaaaaa cacgcttttt 120
cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga atacgtaaat aattaatagt 180
agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt 240
acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga 300
acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 360
aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 420
ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 480
ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 540
atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 600
agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 660
atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 720
tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata 780
aacacacata aacaaacaaa atgtcagagt tgagagcctt cagtgcccca gggaaagcgt 840
tactagctgg tggatattta gttttagata caaaatatga agcatttgta gtcggattat 900
cggcaagaat gcatgctgta gcccatcctt acggttcatt gcaagggtct gataagtttg 960
aagtgcgtgt gaaaagtaaa caatttaaag atggggagtg gctgtaccat ataagtccta 1020
aaagtggctt cattcctgtt tcgataggcg gatctaagaa ccctttcatt gaaaaagtta 1080
tcgctaacgt atttagctac tttaaaccta acatggacga ctactgcaat agaaacttgt 1140
tcgttattga tattttctct gatgatgcct accattctca ggaggatagc gttaccgaac 1200
atcgtggcaa cagaagattg agttttcatt cgcacagaat tgaagaagtt cccaaaacag 1260
ggctgggctc ctcggcaggt ttagtcacag ttttaactac agctttggcc tccttttttg 1320
tatcggacct ggaaaataat gtagacaaat atagagaagt tattcataat ttagcacaag 1380
ttgctcattg tcaagctcag ggtaaaattg gaagcgggtt tgatgtagcg gcggcagcat 1440
atggatctat cagatataga agattcccac ccgcattaat ctctaatttg ccagatattg 1500
gaagtgctac ttacggcagt aaactggcgc atttggttga tgaagaagac tggaatatta 1560
cgattaaaag taaccattta ccttcgggat taactttatg gatgggcgat attaagaatg 1620
gttcagaaac agtaaaactg gtccagaagg taaaaaattg gtatgattcg catatgccag 1680
aaagcttgaa aatatataca gaactcgatc atgcaaattc tagatttatg gatggactat 1740
ctaaactaga tcgcttacac gagactcatg acgattacag cgatcagata tttgagtctc 1800
ttgagaggaa tgactgtacc tgtcaaaagt atcctgaaat cacagaagtt agagatgcag 1860
ttgccacaat tagacgttcc tttagaaaaa taactaaaga atctggtgcc gatatcgaac 1920
ctcccgtaca aactagctta ttggatgatt gccagacctt aaaaggagtt cttacttgct 1980
taatacctgg tgctggtggt tatgacgcca ttgcagtgat tactaagcaa gatgttgatc 2040
ttagggctca aaccgctaat gacaaaagat tttctaaggt tcaatggctg gatgtaactc 2100
aggctgactg gggtgttagg aaagaaaaag atccggaaac ttatcttgat aaataagatt 2160
aatataatta tataaaaata ttatcttctt ttctttatat ctagtgttat gtaaaataaa 2220
ttgatgacta cggaaagctt ttttatattg tttctttttc attctgagcc acttaaattt 2280
cgtgaatgtt cttgtaaggg acggtagatt tacaagtgat acaacaaaaa gcaaggcgct 2340
ttttctaata aaaagaagaa aagcatttaa caattgaaca cctctatatc aacgaagaat 2400
attactttgt ctctaaatcc ttgtaaaatg tgtacgatct ctatatgggt tactcataag 2460
tgtaccgaag actgcattga aagtttatgt tttttcactg gaggcgtcat tttcgcgttg 2520
agaagatgtt cttatccaaa tttcaactgt tatataga 2642
<210> 8
<211> 1934
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa atgtctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagaaccc caattggttc 480
attccagggt tctctatcct ccaagacagc agtggaattg ggtgctgttg ctttaaaagg 540
cgccttggct aaggttccag aattggatgc atccaaggat tttgacgaaa ttatttttgg 600
taacgttctt tctgccaatt tgggccaagc tccggccaga caagttgctt tggctgccgg 660
tttgagtaat catatcgttg caagcacagt taacaaggtc tgtgcatccg ctatgaaggc 720
aatcattttg ggtgctcaat ccatcaaatg tggtaatgct gatgttgtcg tagctggtgg 780
ttgtgaatct atgactaacg caccatacta catgccagca gcccgtgcgg gtgccaaatt 840
tggccaaact gttcttgttg atggtgtcga aagagatggg ttgaacgatg cgtacgatgg 900
tctagccatg ggtgtacacg cagaaaagtg tgcccgtgat tgggatatta ctagagaaca 960
acaagacaat tttgccatcg aatcctacca aaaatctcaa aaatctcaaa aggaaggtaa 1020
attcgacaat gaaattgtac ctgttaccat taagggattt agaggtaagc ctgatactca 1080
agtcacgaag gacgaggaac ctgctagatt acacgttgaa aaattgagat ctgcaaggac 1140
tgttttccaa aaagaaaacg gtactgttac tgccgctaac gcttctccaa tcaacgatgg 1200
tgctgcagcc gtcatcttgg tttccgaaaa agttttgaag gaaaagaatt tgaagccttt 1260
ggctattatc aaaggttggg gtgaggccgc tcatcaacca gctgatttta catgggctcc 1320
atctcttgca gttccaaagg ctttgaaaca tgctggcatc gaagacatca attctgttga 1380
ttactttgaa ttcaatgaag ccttttcggt tgtcggtttg gtgaacacta agattttgaa 1440
gctagaccca tctaaggtta atgtatatgg tggtgctgtt gctctaggtc acccattggg 1500
ttgttctggt gctagagtgg ttgttacact gctatccatc ttacagcaag aaggaggtaa 1560
gatcggtgtt gccgccattt gtaatggtgg tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa 1620
gatatgaccg ctgatcctag agggccgcat catgtaatta gttatgtcac gcttacattc 1680
acgccctccc cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta 1740
ggtccctatt tattttttta tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat 1800
ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct 1860
tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcaag ctgcggccct gcattaatga 1920
atcggccaac gcgc 1998
<210> 9
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 60
ccatgattac gccaagctct gttccattga tttcttctct attgttatat cataattttc 120
atgaggtaat tcattgattt ttttgaatgc taatgagcct actttgaaaa tattctcatg 180
ttcaaaagag cgtgccggtt tcagttcgat ttgcttcata ttaacagaaa aactacttga 240
gtaaactaaa tcctcctttt ctaaacaccc ttccatacct cttgaagatg aactcggata 300
tttcagagag gaatctggac attgattttt caaagcaccc agtttgttct ggatatgttc 360
aagagtctcc acccttttat ttggcctgaa gaacggatcc tcattttcct tcgaagcttc 420
cattggtgtg gattgacgag atttgatagg cgagatggag gccccagagt tcggtgcacc 480
tagcgccact ttggatcgcc ttttcgaagg tcttgcattt aagcaacttt catttaacgg 540
ctgcgccatt gatggcattt ttctttttgt gctgttttgt gaggaattga cactcgacgg 600
tgttctcaca gttattcgct gagatgacgc atagttagaa ggtgatcttc ctctaataat 660
aagaggaggc gttttcattt cttgcaaata cacaaacatc ccttttgatc cattttttaa 720
agccag 750
<210> 10
<211> 2405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta atgacgcgga ggccaaggca 60
aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt gaataaaaaa cacgcttttt 120
cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga atacgtaaat aattaatagt 180
agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt 240
acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga 300
acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 360
aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 420
ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 480
ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 540
atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 600
agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 660
atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 720
tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata 780
aacacacata aacaaacaaa atgccatttg ttaaggactt taagccacaa gctttgggtg 840
acaccaactt attcaaacca atcaaaattg gtaacaatga acttctacac cgtgctgtca 900
ttcctccatt gactagaatg agagcccaac atccaggtaa tattccaaac agagactggg 960
ccgttgaata ctacgctcaa cgtgctcaaa gaccaggaac cttgattatc actgaaggta 1020
cctttccctc tccacaatct gggggttacg acaatgctcc aggtatctgg tccgaagaac 1080
aaattaaaga atggaccaag attttcaagg ctattcatga gaataaatcg ttcgcatggg 1140
tccaattatg ggttctaggt tgggctgctt tcccagacac ccttgctagg gatggtttgc 1200
gttacgactc cgcttctgac aacgtgtata tgaatgcaga acaagaagaa aaggctaaga 1260
aggctaacaa cccacaacac agtataacaa aggatgaaat taagcaatac gtcaaagaat 1320
acgtccaagc tgccaaaaac tccattgctg ctggtgccga tggtgttgaa atccacagcg 1380
ctaacggtta cttgttgaac cagttcttgg acccacactc caataacaga accgatgagt 1440
atggtggatc catcgaaaac agagcccgtt tcaccttgga agtggttgat gcagttgtcg 1500
atgctattgg ccctgaaaaa gtcggtttga gattgtctcc atatggtgtc ttcaacagta 1560
tgtctggtgg tgctgaaacc ggtattgttg ctcaatatgc ttatgtctta ggtgaactag 1620
aaagaagagc taaagctggc aagcgtttgg ctttcgtcca tctagttgaa cctcgtgtca 1680
ccaacccatt tttaactgaa ggtgaaggtg aatacaatgg aggtagcaac aaatttgctt 1740
attctatctg gaagggccca attattagag ctggtaactt tgctctgcac ccagaagttg 1800
tcagagaaga ggtgaaggat cctagaacat tgatcggtta cggtagattt tttatctcta 1860
atccagattt ggttgatcgt ttggaaaaag ggttaccatt aaacaaatat gacagagaca 1920
ctttctacaa aatgtcagct gagggataca ttgactaccc tacgtacgaa gaagctctaa 1980
aactcggttg ggacaaaaat taagattaat ataattatat aaaaatatta tcttcttttc 2040
tttatatcta gtgttatgta aaataaattg atgactacgg aaagcttttt tatattgttt 2100
ctttttcatt ctgagccact taaatttcgt gaatgttctt gtaagggacg gtagatttac 2160
aagtgataca acaaaaagca aggcgctttt tctaataaaa agaagaaaag catttaacaa 2220
ttgaacacct ctatatcaac gaagaatatt actttgtctc taaatccttg taaaatgtgt 2280
acgatctcta tatgggttac tcataagtgt accgaagact gcattgaaag tttatgtttt 2340
ttcactggag gcgtcatttt cgcgttgaga agatgttctt atccaaattt caactgttat 2400
ataga 2485
<210> 11
<211> 2807
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta atgacgcgga ggccaaggca 60
aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt gaataaaaaa cacgcttttt 120
cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga atacgtaaat aattaatagt 180
agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt 240
acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga 300
acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 360
aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 420
ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 480
ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 540
atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 600
agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 660
atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 720
tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata 780
aacacacata aacaaacaaa atggataata tctatattaa acaagcattg gttttgaagg 840
aagttaagca tgttttccaa aaattgatcg gtgaagatcc aatggaatct atgtacatgg 900
ttgatacaat ccaaagattg ggtatcgaac atcatttcga agaagaaatc gaagctgcat 960
tgcaaaagca acatttgatt ttctcttctc atttgtctga tttcgcaaac aaccataaat 1020
tgtgtgaagt tgctttgcct tttagattgt tgagacaaag aggtcattac gttttggcag 1080
atgttttcga taatttgaag tcaaataaga aagaattcag agaaaaacat ggtgaagatg 1140
ttaagggttt gatttcttta tacgaagcta ctcaattggg tattgaaggt gaagattcat 1200
tggatgatgc aggttactta tgtcatcaat tgttacatgc ttggttaact agacatgaag 1260
aacataacga agcaatgtac gttgctaaga cattgcaaca tccattacat tacgatttgt 1320
ctagattcag agatgatact tcaatcttgt tgaacgattt caagacaaaa agagaatggg 1380
aatgtttgga agaattagca gaaattaatt cttcaatcgt tagattcgtt aatcaaaatg 1440
aaattacaca agtttacaag tggtggaagg atttgggttt aaataacgag gttaagttcg 1500
caagatacca accattgaag tggtacatgt ggccaatggc ttgttttact gatccaagat 1560
tttcagaaca aagaatcgaa ttgacaaaac caatttcttt agtctacatc atcgatgata 1620
tttttgatgt ttacggtact ttggatcaat tgactttgtt tactgatgca attaaaagat 1680
gggaattggc ttctactgaa caattgccag atttcatgaa gatgtgtttg agagttttgt 1740
acgaaattac aaatgatttt gctgaaaaga tttgtaagaa acatggtttt aatccaattg 1800
aaactttgaa gagatcttgg gttagattgt tgaacgcatt tttagaagaa gctcattggt 1860
tgaactctgg tcatttgcca agatcagcag aatatttgaa caacggtatc gtttcaacag 1920
gtgttcatgt tgttttggtt cattctttct ttttgatgga ttactcaatt aataatgaaa 1980
ttgttgctat cgttgataac gttccacaaa tcatccattc tgttgcaaag atcttgagat 2040
tgtcagatga tttggaaggt gctaaatctg aagatcaaaa cggtttggat ggttcataca 2100
tcgattgtta catgaacgaa catcaagatg tttctgcagg tgacgctcaa agacatgttg 2160
ctcatttgat ttcatgtgaa tggaagagat taaatagaga aatcttgact caaaaccaat 2220
tgccatcttc ttttactaac ttttgtttga atgctgcaag aatggttcca ttgatgtacc 2280
attacagatc taacccaggt ttgtcaactt tgcaagaaca tgttaaattg ttgtctaata 2340
atgctgttgc aggtgctgaa agacatgttg ttcatatttt gtgtttacaa tttgttattg 2400
aataagatta atataattat ataaaaatat tatcttcttt tctttatatc tagtgttatg 2460
taaaataaat tgatgactac ggaaagcttt tttatattgt ttctttttca ttctgagcca 2520
cttaaatttc gtgaatgttc ttgtaaggga cggtagattt acaagtgata caacaaaaag 2580
caaggcgctt tttctaataa aaagaagaaa agcatttaac aattgaacac ctctatatca 2640
acgaagaata ttactttgtc tctaaatcct tgtaaaatgt gtacgatctc tatatgggtt 2700
actcataagt gtaccgaaga ctgcattgaa agtttatgtt ttttcactgg aggcgtcatt 2760
ttcgcgttga gaagatgttc ttatccaaat ttcaactgtt atataga 2899
<210> 12
<211> 3413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa atgtctgctt gtactccttt ggcatctgct atgccattgt cttctactcc 480
attgattaac ggtgataatt ctcagagaaa aaatacaaga caacatatgg aagagtcttc 540
atctaaaaga agagaatatt tgttggaaga aacaacaaga aaattgcaaa gaaacgatac 600
tgaatctgtt gagaaattaa aattgataga taacattcaa caattaggta ttggatacta 660
ttttgaagat gctataaatg ctgttttacg ttctcctttt tctacaggtg aagaagattt 720
gtttacagct gcattgagat ttaggttgtt gaggcataat ggtattgaaa tttctcctga 780
aattttcttg aagttcaaag atgaaagggg aaagttcgat gaatctgata ctttgggttt 840
attgtcttta tacgaggctt caaacttggg tgttgctggt gaagagattt tggaggaggc 900
tatggagttc gctgaagcta ggttgaggag gtctttgtct gagccagcag ctccattgca 960
cggtgaagtt gcacaggctt tagacgtccc aaggcacttg agaatggcta gattggaagc 1020
tagaagattt attgaacaat acggtaagca gtctgaccat gacggtgact tgttggaatt 1080
ggcaatttta gattataacc aagtccaggc tcagcaccag tctgaattga cagaaattat 1140
taggtggtgg aaagaattgg gattggttga taaattatct tttggtagag atagaccatt 1200
ggaatgcttt ttgtggactg tcggtttgtt gccagagcca aagtattctt ctgttagaat 1260
tgagttggct aaagctattt ctattttgtt ggttattgat gatattttcg atacatacgg 1320
tgaaatggat gatttaattt tgttcactga cgctattaga aggtgggact tagaggctat 1380
ggaaggttta cctgaatata tgaagatttg ctacatggct ttgtacaata ctacaaacga 1440
agtttgttat aaagttttaa gagatactgg tagaattgtt ttgttaaatt tgaaatcaac 1500
ttggattgat atgattgaag gttttatgga agaggctaaa tggttcaacg gaggttctgc 1560
tcctaagttg gaggaatata ttgaaaatgg tgtttcaact gctggtgctt acatggcttt 1620
cgctcatatt ttctttttaa ttggagaagg tgttactcat caaaattctc aattgttcac 1680
tcaaaagcca tatccaaaag tcttttctgc tgcaggtaga attttgagat tgtgggacga 1740
cttgggtaca gctaaggagg agcaagagag gggtgattta gcttcttgtg ttcaattatt 1800
tatgaaggaa aaatcattga ctgaagagga ggctagatct agaattttgg aagaaattaa 1860
gggtttatgg agagatttga atggtgagtt ggtctataat aagaatttac cattatcaat 1920
tattaaagtc gctttgaaca tggctagggc ttctcaggtc gtctataaac acgatcaaga 1980
tacttacttt tcttctgttg acaattacgt tgatgcttta tttttcactc aataaggtgg 2040
tggttctatg gcttcagaaa aagaaattag gagagagaga ttcttgaacg ttttccctaa 2100
attagtagag gaattgaacg catcgctttt ggcttacggt atgcctaagg aagcatgtga 2160
ctggtatgcc cactcattga actacaacac tccaggcggt aagctaaata gaggtttgtc 2220
cgttgtggac acgtatgcta ttctctccaa caagaccgtt gaacaattgg ggcaagaaga 2280
atacgaaaag gttgccattc taggttggtg cattgagttg ttgcaggctt actggttggt 2340
cgccgatgat atgatggaca agtccattac cagaagaggc caaccatgtt ggtacaaggt 2400
tcctgaagtt ggggaaattg ccatctggga cgcattcatg ttagaggctg ctatctacaa 2460
gcttttgaaa tctcacttca gaaacgaaaa atactacata gatatcaccg aattgttcca 2520
tgaggtcacc ttccaaaccg aattgggcca attgatggac ttaatcactg cacctgaaga 2580
caaagtcgac ttgagtaagt tctccctaaa gaagcactcc ttcatagtta ctttcaagac 2640
tgcttactat tctttctact tgcctgtcgc attggccatg tacgttgccg gtatcacgga 2700
tgaaaaggat ttgaaacaag ccagagatgt cttgattcca ttgggtgaat acttccaaat 2760
tcaagatgac tacttagact gcttcggtac cccagaacag atcggtaaga tcggtacaga 2820
tatccaagat aacaaatgtt cttgggtaat caacaaggca ttggaacttg cttccgcaga 2880
acaaagaaag actttagacg aaaattacgg taagaaggac tcagtcgcag aagccaaatg 2940
caaaaagatt ttcaatgact tgaaaattga acagctatac cacgaatatg aagagtctat 3000
tgccaaggat ttgaaggcca aaatttctca ggtcgatgag tctcgtggct tcaaagctga 3060
tgtcttaact gcgttcttga acaaagttta caagagaagc aaatagccgc tgatcctaga 3120
gggccgcatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc 3180
tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat 3240
agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag 3300
acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc 3360
gaaggcttta atttgcaagc tgcggccctg cattaatgaa tcggccaacg cgc 3525
<210> 13
<211> 1520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa atgtctgcta gaggtttgaa taagatctct tgttctttga atttgcaaac 480
tgaaaaattg tgttacgaag ataacgataa cgatttggat gaagaattga tgccaaagca 540
tatcgctttg atcatggatg gtaacagaag atgggcaaaa gataaaggtt tagaagttta 600
cgaaggtcat aagcatatca tcccaaaatt gaaggaaatt tgtgatattt cttcaaaatt 660
gggtattcaa atcatcactg ctttcgcatt ttctacagaa aactggaaga gatcaaagga 720
agaagttgat ttcttgttac aaatgttcga agaaatctat gatgaatttt ctagatcagg 780
tgttagagtt tctatcatcg gttgtaagtc agatttgcca atgactttgc aaaagtgtat 840
cgctttgaca gaagaaacta caaagggtaa taagggtttg catttggtta ttgcattgaa 900
ctacggtggt tactacgata tcttgcaagc tactaagtca atcgttaata aggcaatgaa 960
cggtttgtta gatgttgaag atatcaataa gaatttgttc gatcaagaat tagaatctaa 1020
gtgtccaaac ccagatttgt tgattagaac tggtggtgaa caaagagttt caaatttctt 1080
gttgtggcaa ttggcttaca cagaattcta cttcactaac acattgttcc cagatttcgg 1140
tgaagaagat ttgaaggaag caatcatgaa cttccaacaa agacatagaa gattcggtgg 1200
tcatacatat taaccgctga tcctagaggg ccgcatcatg taattagtta tgtcacgctt 1260
acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga 1320
agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 1380
tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 1440
cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcaagctgc ggccctgcat 1500
taatgaatcg gccaacgcgc 1570
<210> 14
<211> 4421
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa atgcaattga tcactaactt ttcttcatct tcatctgaat tgcaattctt 480
ggttgataag gttaagagag aatctttgtc atcttcatct tcaaacacac aaaatttgtt 540
tttgtcaact tctccatacg atacagcttg gttagcattg attccacatc cacatcatca 600
tcatcatcat ggtagaccaa tgttcgaaaa gtgtttgcaa tggattttgc ataatcaaac 660
tccacaaggt ttttgggctg cagctggtga caacatctct gatactgatg atgatgttac 720
attggattgt ttgttgtcaa cattagcttg tttggttgca ttaaaaagat ggcaattagc 780
tccagatatg attcataagg gtttggaatt cgttaacaga aacactgaaa gattggttat 840
gaaacaaaaa ccatctgatg ttccaagatg gttcacaatc atgttcccag caatgttaga 900
attggcaggt gcttcttcat taagagttga tttctctgaa aatttgaaca gaattttggt 960
tgaattatca caaaatagag atgatatctt gactagagaa gaagttgatg aaaagaaaca 1020
atactctcca ttgttgttgt ttttggaagc attgccagca caatcatacg ataatgatgt 1080
tttgaagcaa atcatcgata agaatttgtc taatgatggt tcattattgc aatcaccatc 1140
tgcaactgct agagcataca tgatcactgg taacacaaga tgtttgtctt acttacattc 1200
attgacaaac tcatgttcta acggtggtgt tccatctttt tacccagttg atgatgattt 1260
gcatgatttg gttatggtta accaattgac tagatcaggt ttgacagaac atttgatccc 1320
agaaatcgat catttgttgt tgaaggttca aaagaattac aagtacaaaa aggcttctcc 1380
aaaatcttta tactcaatcg cagctgaatt atacagagat tctttggcat tctggttgtt 1440
gagagttaac aaccattggg tttcaccatc tattttctgt tggttcttgg atgatgatga 1500
aatcagagat catatcgaaa ctaactacga agaattcgca gctgttttgt tgaacgttta 1560
cagagctaca gatttgatgt tttctggtga agttcaattg gttgaagcta gatcatttgc 1620
aactaaaaat ttggaaaaga ttttggctac tggtaacatc cataagacaa acgcagatat 1680
ttcttcatct ttacataaaa tgattgaaca tgaattgaga gttccatgga cagctagaat 1740
ggatcatgtt gaaaacagaa tttggatcga agaaattgct tcatctgcat tgtggttcgg 1800
taaatcatct tatttgagat tgtcttgttt ccataagatg tcattacaac aattggctgt 1860
taaaaattac actttgagac aattggttta cagagatgaa ttagcagaag ttgaaagatg 1920
gtctaaagaa agaggtttgt gtgatatggg tttttgtaga gaaaagactg gttactgtta 1980
ttacgctttt gcagcttcaa catgtttgcc atggtcatct gatgttagat tggttttgac 2040
taaggcagct gttgttatta cagttgcaga tgatttcttt gatgttgaag gttctatggt 2100
tgatttggaa aaattgactg atgctgttag aagatgggat gcagaaggtt tgggttcaca 2160
ttctaagaca atcttcgaag cattggatga tttggttaac gaagttagat tgaagtgttt 2220
tcaacaaaac ggtcaagata ttaagaataa tttgcaacaa ttgtggtacg aaacattcca 2280
ttcttggttg atggaagcta aatggggtaa aggtttgact tctaaaccat cagttgatgt 2340
ttacttaggc aatgctatga catctattgc agctcatact atggttttga cagcatcatg 2400
cttgttaggt ccaggttttc cagttcatca attatggtct caaagaagac atcaagatat 2460
cacttcattg ttgatggttt tgacaagatt gttgaacgat atccaatctt atttgaagga 2520
agaagatgaa ggtaaaatta attacgtttg gatgtacatg atcgaaaaca accaagcatc 2580
tatcgatgat tcagttagac atgttcaaac tattattaac gttaagaaac aagaattcat 2640
tcaaagagtt ttgtctgatc aacattgtaa tttgccaaaa tcttttaaac aattacattt 2700
ttcatgtttg aaagttttta atatgttttt caattcatct aacatttttg atactgatac 2760
agatttgttg ttggatatcc atgaagcatt tgtttctcca ccacaagttc caaaattcaa 2820
accacatatc aaaccaccac atcaattacc agcaacattg caaccaccac atcaaccaca 2880
acaaatcatg gttaataaga agaaagttga aatggtttac aagtcatacc atcatccttt 2940
taaagttttt actttgcaaa agaaacaatc atctggtcat ggtacaatga atccaagagc 3000
ttctatcttg gcaggtccaa acatcaaatt gtgtttttca taaggtggtg gttctatggc 3060
ttcagaaaaa gaaattagga gagagagatt cttgaacgtt ttccctaaat tagtagagga 3120
attgaacgca tcgcttttgg cttacggtat gcctaaggaa gcatgtgact ggtatgccca 3180
ctcattgaac tacaacactc caggcggtaa gctaaataga ggtttgtccg ttgtggacac 3240
gtatgctatt ctctccaaca agaccgttga acaattgggg caagaagaat acgaaaaggt 3300
tgccattcta ggttggtgca ttgagttgtt gcaggcttac tggttggtcg ccgatgatat 3360
gatggacaag tccattacca gaagaggcca accatgttgg tacaaggttc ctgaagttgg 3420
ggaaattgcc atctgggacg cattcatgtt agaggctgct atctacaagc ttttgaaatc 3480
tcacttcaga aacgaaaaat actacataga tatcaccgaa ttgttccatg aggtcacctt 3540
ccaaaccgaa ttgggccaat tgatggactt aatcactgca cctgaagaca aagtcgactt 3600
gagtaagttc tccctaaaga agcactcctt catagttact ttcaagactg cttactattc 3660
tttctacttg cctgtcgcat tggccatgta cgttgccggt atcacggatg aaaaggattt 3720
gaaacaagcc agagatgtct tgattccatt gggtgaatac ttccaaattc aagatgacta 3780
cttagactgc ttcggtaccc cagaacagat cggtaagatc ggtacagata tccaagataa 3840
caaatgttct tgggtaatca acaaggcatt ggaacttgct tccgcagaac aaagaaagac 3900
tttagacgaa aattacggta agaaggactc agtcgcagaa gccaaatgca aaaagatttt 3960
caatgacttg aaaattgaac agctatacca cgaatatgaa gagtctattg ccaaggattt 4020
gaaggccaaa atttctcagg tcgatgagtc tcgtggcttc aaagctgatg tcttaactgc 4080
gttcttgaac aaagtttaca agagaagcaa atagccgctg atcctagagg gccgcatcat 4140
gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa 4200
ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt 4260
attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc 4320
atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 4380
ttgcaagctg cggccctgca ttaatgaatc ggccaacgcg c 4421
<210> 15
<211> 1993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catcataagg aattccggga ttctccccat gaaaggtatc tggatctacc actgcaccta 60
aaattacatg caagctaaag tgtttatttt gttgggatgg tttcttcacg ctaattgatg 120
aagcaaattg aactctttca taacgggcaa ctttctgaat agaatcttct ggataggaaa 180
acaataaaga gtccactcca tattcttcat aattaacgtg gtctctgtgc aaataaaaag 240
tggaatcgta ttttttcatt ttagtgatat ttcgaacatt tgaagcttct cttatgattt 300
gatgttttgg caaaggggaa ggcaccaacg gacatactga aggacaaaat tgaggacctt 360
tgtcgcgttt cgctgtatgc tggacgagat tgatttccgt gtcgtcgtcg tcattcttag 420
cttttatttt gatagcgaaa tattgcactc ttaatctgct ttctactgaa gagtcttcaa 480
cgagaagatc aaaactgctc tttaaaaaag tatccaaatc acaatttgcc gtttcaaacg 540
ttgatactaa ggtaaaataa tttcttttat aacctaccca ctcttcatca atatggtcga 600
acgtttaaag cggtttaaac gtgtcactac ataagaacac ctttggtgga gggaacatcg 660
ttggtaccat tgggcgaggt ggcttctctt atggcaaccg caagagcctt gaacgcactc 720
tcactacggt gatgatcatt cttgcctcgc agacaatcaa cgtggagggt aattctgcta 780
gcctctgcaa agctttcaag aaaatgcggg atcatctcgc aagagagatc tcctactttc 840
tccctttgca aaccaagttc gacaactgcg tacggcctgt tcgaaagatc taccaccgct 900
ctggaaagtg cctcatccaa aggcgcaaat cctgatccaa acctttttac tccacgcgcc 960
agtagggcct ctttaaaagc ttgaccgaga gcaatcccgc agtcttcagt ggtgtgatgg 1020
tcgtctatgt gtaagtcacc aatgcactca acgattagcg accagccgga atgcttggcc 1080
agagcatgta tcatatggtc cagaaaccct atacctgtgt ggacgttaat cacttgcgat 1140
tgtgtggcct gttctgctac tgcttctgcc tctttttctg ggaagatcga gtgctctatc 1200
gctaggggac caccctttaa agagatcgca atctgaatct tggtttcatt tgtaatacgc 1260
tttactaggg ctttctgctc tgtcatcttt gccttcgttt atcttgcctg ctcatttttt 1320
agtatattct tcgaagaaat cacattactt tatataatgt ataattcatt atgtgataat 1380
gccaatcgct aagaaaaaaa aagagtcatc cgctaggtgg aaaaaaaaaa atgaaaatca 1440
ttaccgaggc ataaaaaaat atagagtgta ctagaggagg ccaagagtaa tagaaaaaga 1500
aaattgcggg aaaggactgt gttatgactt ccctgactaa tgccgtgttc aaacgatacc 1560
tggcagtgac tcctagcgct caccaagctc ttaaaacgga attatggtgc actctcagta 1620
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 1680
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 1740
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgatc cggacgccac 1800
cgctggtacc gagctcggat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttgcccttaa 1860
gggcaattct gcagatatcc atcacactgg cggccgctcg agcatgcatc tagagggccc 1920
aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 1980
tgggaaaacc ctg 2059
<210> 16
<211> 907
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtatattcac cgtcctctac acatatttta aatactgatg aagtgacaag agtcttgtcg 60
aatactacta tgaccgcttt ttagaatcgt acgacaacgg tgaccacttg attggtctgg 120
gggtcctaca acttgatttt atcgttgaaa acaagaatat agacagcctt cttgccaact 180
cttatttgca ccagcaaaga ggcggtgcaa tcatcagtaa tacaggactt gtctcgcaag 240
atacgaccaa gccgtactac gttcgggatt taatcttctc gcagtctgca ggcgccttga 300
gatttgcgtt cggcctaaac gtttgctcca caaacgtgaa tggtatgaac atggacatga 360
gcgtggttca gggcactcta cgggatcgtg gcgaatggga atcgttctgc aagctcttct 420
accaaaccat cggcgaattt gcgtcgcttt aatgcgatac tgccgtagcg ggccttcgta 480
tagctcggcc gagctcgtac aaaaggcaag cagtgtatcg gacagagctg atataacaca 540
atacgctcgt agtcgatgca tgccgtggct gctctcggtc gggtataagt cttagacaat 600
agtcttacct cgcatgtata ataaatcttt tgtatttaat ctattatatg tttctatgct 660
tttttttcct attgttgttt gcttttcctt ttccttattt ctttctagct tctaattttc 720
tttctttttt tttttttttt cattgaaaat tatatatata tatatatatc agaacaattg 780
tccagtattg aacaatacag gttatttcga acaattgaaa aaaaaaaatc acagaaaaac 840
atatcgagaa aagggtcatg gcttcagaaa aagaaattag gagagagaga ttcttgaacg 900
ttttccc 937
<210> 17
<211> 874
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtatattcac cgtcctctac acatatttta aatactgatg aagtgacaag atggtgcaca 60
gttggtttgt tttaacggta tgcgttttgt atacctctat tatgtagtgc aagaaaatct 120
gctgctattc gtgattactg ttacaaccta acggtttaaa tgaaacctgg ttctgaaggg 180
tcattttata acttcaagtt cccttagcct ttcgattcat tttgattatg ccatttctag 240
accgtgttat aggcgctggc gtttaatttg gtgtagcttg gtttagtcaa gagttgtatt 300
agtgttcctc gataaagtcg atgtttccgg atattgtgtt aaaatttcaa gtatgctact 360
aatggggtaa agttgcatga ttagcagaga catatggctt gttatggttc ggcttcctca 420
tttttcatgc ttagtttttg tccatctcat tgtacatttc tgaatcctaa tgcatgactc 480
cctaacatta ctattaaatt ctcaatagtg aagaataagc aaaatgggaa ccatgataat 540
ttctagcttt ctctccaccc ctattttaat ttgcaatcat atatagtact ttcaatagca 600
tcttttctag atttgatatc tgcggaaact tttcgtttat aatcgtttag gtgaaaagtt 660
tttatatcgg ttatttacag atatacattt tctcaaaaaa aaaaaaatat aatacatgcc 720
ctcagctttt aataaagcca ttgagcacaa gcctctccag taatgtactg ctgtgcccaa 780
taaccttacc aataatcgtc gcccacaaag aaagtacaaa acagatggct tcagaaaaag 840
aaattaggag agagagattc ttgaacgttt tccc 874
<210> 18
<211> 874
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgacttacca tcctatttgc tttgcccttt ttcttttcca ctgcactttg atggtgcaca 60
gttggtttgt tttaacggta tgcgttttgt atacctctat tatgtagtgc aagaaaatct 120
gctgctattc gtgattactg ttacaaccta acggtttaaa tgaaacctgg ttctgaaggg 180
tcattttata acttcaagtt cccttagcct ttcgattcat tttgattatg ccatttctag 240
accgtgttat aggcgctggc gtttaatttg gtgtagcttg gtttagtcaa gagttgtatt 300
agtgttcctc gataaagtcg atgtttccgg atattgtgtt aaaatttcaa gtatgctact 360
aatggggtaa agttgcatga ttagcagaga catatggctt gttatggttc ggcttcctca 420
tttttcatgc ttagtttttg tccatctcat tgtacatttc tgaatcctaa tgcatgactc 480
cctaacatta ctattaaatt ctcaatagtg aagaataagc aaaatgggaa ccatgataat 540
ttctagcttt ctctccaccc ctattttaat ttgcaatcat atatagtact ttcaatagca 600
tcttttctag atttgatatc tgcggaaact tttcgtttat aatcgtttag gtgaaaagtt 660
tttatatcgg ttatttacag atatacattt tctcaaaaaa aaaaaaatat aatacatgcc 720
ctcagctttt aataaagcca ttgagcacaa gcctctccag taatgtactg ctgtgcccaa 780
taaccttacc aataatcgtc gcccacaaag aaagtacaaa acagatggga aagctattac 840
aattggcatt gcatccggtc gagatgaagg cagc 902

Claims (8)

1.一种萜类生产菌的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于：包括：对出发酿酒酵母进行如下A1-A8的改造，并对所述出发酿酒酵母进行如下A9和/或A10的改造，得到名称为萜类底盘菌的重组酿酒酵母：
A1、导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1基因；
A2、导入甲羟戊酸激酶基因ERG12基因；
A3、导入异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1基因；
A4、导入MVAPP脱羧酶基因ERG19基因；
A5、导入HMG-CoA还原酶基因HMGR基因；
A6、导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合酶基因ERG13基因；
A7、导入MVAP激酶基因ERG8基因；
A8、导入乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因ERG10基因；
A9、将驱动法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20基因的启动子替换为名称为pERG1启动子的ERG1基因的启动子或名称为pERG7的ERG7基因的启动子；
A10、将驱动鲨烯合酶基因ERG9基因的启动子替换为名称为pERG7的ERG7基因的启动子；
对萜类底盘菌的重组酿酒酵母进行如下B1-B4或C1-C3或D1-D3或E1-E2或F1-F2的改造，得到名称为萜类生产菌的重组酿酒酵母；
B1、导入tHMG1基因；
B2、导入香叶醇还原酶基因OYE2基因；
B3、导入香叶醇合成酶基因ObGES基因；
B4、导入ERG20基因96位和127位双点突变基因ERG20F96W/N127W基因；所述ERG20F96W/N127W基因的序列如SEQ ID No.12的第2048位-第3106位所示；
C1、导入tHMG1基因；
C2、导入橙花醇合成酶GmNES基因；
C3、导入橙花基二磷酸合成酶SINDPS1基因；
D1、导入tHMG1基因；
D2、导入芳樟醇合成酶基因CbLIS基因；
D3、导入ERG20F96W/N127W基因；
E1、导入法尼基焦磷酸合酶的基因synSmFPS基因；
E2、导入瓦伦烯合成酶基因synCsVal基因；
F1、导入法尼基焦磷酸合酶的基因synSmFPS基因；
F2、导入橙花叔醇合成酶基因optiNES基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述pERG1启动子的序列如SEQ ID No.16的第51位-第857位所示；
和/或，所述pERG7启动子的序列如SEQ ID No.17的第51位-第824位所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1序列第530-1054位所示；
和/或，所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1序列所示；
和/或，所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1序列所示；
和/或，所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1序列所示；
和/或，所述HMGR基因编码的HMGR蛋白质的序列为genbank登陆号：WP_011241944.1序列所示；
和/或，所述ERG13基因编码的ERG13蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013580.1序列所示；
和/或，所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013947.1序列所示；
和/或，所述ERG10基因编码的ERG10蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015297.1序列所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
A1、通过向所述出发酿酒酵母导入tHMG1基因表达盒实现，所述tHMG1基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述tHMG1基因和终止子；
和/或，A2、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG12基因表达盒实现，所述ERG12基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG12基因和终止子；
和/或，A3、通过向所述出发酿酒酵母导入IDI1基因表达盒实现，所述IDI1基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述IDI1基因和终止子；
和/或，A4、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG19基因表达盒实现，所述ERG19基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG19基因和终止子；
和/或，A5、通过向所述出发酿酒酵母导入HMGR基因表达盒实现，所述HMGR基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述HMGR基因和终止子；
和/或，A6、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG13基因表达盒实现，所述ERG13基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG13基因和终止子；
和/或，A7、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG8基因表达盒实现，所述ERG8基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG8基因和终止子；
和/或，A8、通过向所述出发酿酒酵母导入ERG10基因表达盒实现，所述ERG10基因表达盒含有启动子、由所述启动子驱动的所述ERG10基因和终止子。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组酿酒酵母中，A1-A8中的基因整合入所述出发酿酒酵母的YJL064W位点；所述pERG1替换驱动ERG20基因的启动子的第-248--1位；所述pERG7替换驱动ERG20基因的启动子的第-248--1位；所述pERG7替换驱动ERG9基因的启动子的第-174--1位。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述萜类生产菌中，B1-B4或C1-C3或D1-D3中的基因整合入所述萜类底盘菌的NDT80位点；E1-E2或F1-F2中的基因通过表达质粒导入所述萜类底盘菌。
7.权利要求1-6任一所述的方法得到的名称为所述萜类生产菌的重组酿酒酵母。
8.应用，其特征在于，所述应用为如下任一一种应用，
X1a、权利要求1-6中任一所述的方法进行B1-B4改造时，所述方法在生产香叶醇或香茅醇中的应用；
X1b、权利要求1-6中任一所述的方法在进行C1-C3改造时，所述方法在生产橙花醇中的应用；
X1c、权利要求1-6中任一所述的方法在进行D1-D3改造时，所述方法在生产芳樟醇中的应用；
X1d、权利要求1-6中任一所述的方法在进行E1-E2改造时，所述方法在生产瓦伦烯中的应用；
X1e、权利要求1-6中任一所述的方法在进行F1-F2改造时，所述方法在生产橙花叔醇中的应用；
X2a、权利要求1-6中任一所述的方法进行B1-B4改造获得的重组酿酒酵母在生产香叶醇或香茅醇中的应用；
X2b、权利要求1-6中任一所述的方法在进行C1-C3改造获得的重组酿酒酵母在生产橙花醇中的应用；
X2c、权利要求1-6中任一所述的方法在进行D1-D3改造获得的重组酿酒酵母生产芳樟醇中的应用；
X2d、权利要求1-6中任一所述的方法在进行E1-E2改造获得的重组酿酒酵母在生产瓦伦烯中的应用；
X2e、权利要求1-6中任一所述的方法在进行F1-F2改造获得的重组酿酒酵母在生产橙花叔醇中的应用。
CN202110499258.0A 2021-05-08 2021-05-08 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用 Active CN115305254B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110499258.0A CN115305254B (zh) 2021-05-08 2021-05-08 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110499258.0A CN115305254B (zh) 2021-05-08 2021-05-08 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115305254A CN115305254A (zh) 2022-11-08
CN115305254B true CN115305254B (zh) 2024-03-26

Family

ID=83853602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110499258.0A Active CN115305254B (zh) 2021-05-08 2021-05-08 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115305254B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820344A (zh) * 2011-12-30 2014-05-28 天津工业生物技术研究所 生产次丹参酮二烯的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
CN105420135A (zh) * 2016-01-06 2016-03-23 山东大学 一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用
WO2018082588A1 (zh) * 2016-11-04 2018-05-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种重组菌及其用途
WO2018120983A1 (zh) * 2016-12-28 2018-07-05 中国中医科学院中药研究所 产甘草次酸的重组酿酒酵母、其构建方法以及用途
CN108949601A (zh) * 2018-07-17 2018-12-07 天津大学 利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法
CN110484572A (zh) * 2019-08-30 2019-11-22 浙江工业大学 一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820344A (zh) * 2011-12-30 2014-05-28 天津工业生物技术研究所 生产次丹参酮二烯的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
CN105420135A (zh) * 2016-01-06 2016-03-23 山东大学 一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用
WO2018082588A1 (zh) * 2016-11-04 2018-05-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种重组菌及其用途
WO2018120983A1 (zh) * 2016-12-28 2018-07-05 中国中医科学院中药研究所 产甘草次酸的重组酿酒酵母、其构建方法以及用途
CN108949601A (zh) * 2018-07-17 2018-12-07 天津大学 利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法
CN110484572A (zh) * 2019-08-30 2019-11-22 浙江工业大学 一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Metabolic Engineering of Different Microbial Hosts for Lycopene Production;Meijie Li et al.;《J. Agric. Food Chem.》;第68卷;第14104-14122页 *
Production of plant volatile terpenoids (rose oil) by yeast cell factories;Rongsheng Li et al.;《Green Chem.》;第23卷;第5088-5096页 *
高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建;张丽丽等;《中国中药杂志》;第42卷(第15期);第2962-2968页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115305254A (zh) 2022-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111434773B (zh) 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用
CN108060092A (zh) 一种重组菌及其用途
CN112280698B (zh) 高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
CN112695003B (zh) 一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用
CN101861384A (zh) 使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法
CN112175848B (zh) 一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用
CN113774079A (zh) 重组酿酒酵母及其构建方法和应用
CN110607247A (zh) 一种提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法
CN114058525A (zh) 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用
CN110804561B (zh) 一种高产c6-c10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途
CN112608936B (zh) 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
CN109136119B (zh) 微生物及其用途
CN115305254B (zh) 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN115873836B (zh) 一种橙花叔醇合成酶及应用
CN114525215B (zh) 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用
CN109136120B (zh) 微生物及其用途
CN116042425A (zh) 一种生产广藿香醇的酵母工程菌及其应用
CN111548946B (zh) 一种生产次丹参酮二烯的重组酵母工程菌
CN113817757A (zh) 一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用
CN113969288A (zh) 一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用
CN110468091B (zh) 微生物及其用途
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
CN115322913B (zh) 产玫瑰精油的重组酿酒酵母及其构建方法和应用
CN115261243B (zh) 重组酿酒酵母及其构建方法和应用
CN115247183B (zh) 重组微生物的构建方法、相关生物材料及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant