CN105420135A - 一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)YZG13-GE1，基因型为：pZGV6-GE1，pZMVA4，菌株已于2015年09月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC？No.11465。实验证实本发明所述的重组酿酒酵母菌株在摇瓶发酵生产单萜香叶醇过程中即可获得66mg/L香叶醇，分批发酵能够产生192mg/L香叶醇，而在补料分批发酵过程中，香叶醇最高产量可达292mg/L，比之前文献报道的产量高出8倍，为目前报道的利用酿酒酵母合成香叶醇的最高产量。本发明所述的重组酿酒酵母菌株对于利用廉价原料通过发酵法生产香叶醇及其衍生产物如抗癌单萜类生物碱具有重要的意义。

Description

一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
萜类化合物(又称异戊二烯类化合物)是自然界中广泛存在的一类具有巨大应用价值的天然化合物，主要包括单萜类、倍半萜类、双萜类、多萜类等。萜类化合物可作为香料、生物燃料、药物、色素等，具有广阔的应用前景。例如，单萜类香叶醇、柠檬烯可用作香料，蒎烯的二聚物可作为航空燃料；倍半萜类amorphadiene和青蒿酸为重要的抗疟疾药物青蒿素的前体，甜没药烯、法呢烯衍生物可作为生物燃料替代柴油及航空燃油；双萜类紫杉醇是一种有效的抗癌药物；多萜类人参皂苷以及各种类胡萝卜素等都是重要的生物活性物质。萜类化合物种类繁多，结构复杂，化学合成困难，目前主要从天然植物中直接提取，这不仅造成植物资源的浪费，而且分离纯化产率很低。随着生物合成技术的不断发展，通过改造微生物细胞，使之成为能利用利用廉价的底物高效合成萜类化合物的细胞工厂，可以大大降低生产成本，具有广泛的应用前景。其中，香叶醇为一种重要的单萜，是玫瑰精油的主要成分，除了被广泛用做香料，调味品之外，还可被用作抗菌剂和合成多种抗癌单萜类生物碱的前体。
异戊烯基焦磷酸(isopentenyldiphosphate，IPP)是合成萜类化合物的最关键的前体，可以由自然界中两条独立的生物合成途径合成。一条是甲羟戊酸途径(MVApathway)，存在于古细菌、少数细菌以及大多数真核生物中；另一条是2-甲基赤藓醇-4-磷酸途径(MEPpathway)，存在于大多数细菌以及蓝藻中。绿色植物中同时存在这两条途径。目前，通过改造微生物细胞中内源的MEP或者MVA途径过量合成萜类化合物的前体，同时引入异源的萜类合成途径，实现了多种萜类化合物的微生物合成，主要以倍半萜合成为主。
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为真核模式生物，具有生长速度快、抑制物耐受性高，优良的工业生产特性以及成熟的遗传操作体系使其成为最具潜力的微生物细胞工厂之一。酿酒酵母细胞中的MVA途径主要用于合成细胞膜的重要组分麦角固醇，以维持细胞的正常生长。倍半萜是利用酿酒酵母合成的最为广泛的萜类化合物，例如青蒿酸产量可达25g/L，甜没药烯可达900mg/L等；然而其它萜类化合物如单萜，双萜和三萜则产量较低，大多低于50mg/L。尤其是单萜的合成，由于酿酒酵母细胞本身缺乏香叶基焦磷酸合成酶，故不能有效合成单萜合成的直接前体香叶基焦磷酸(GPP)，这就大大降低了单萜的产量。另外，单萜对细胞的毒性也是限制其产量的重要因素之一。
基于上述单萜合成的限制性因素，经检索通过调节细胞中GPP的合成以及功能性表达高活性的香叶醇合成酶构建高产香叶醇的酿酒酵母重组菌株的专利及文献还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其在发酵制备香叶醇中的应用。
本发明所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YZG13-GE1，该菌株基因型为：pZGV6-GE1，pZMVA4，已于2015年09月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCCNo.11465。
本发明所述高产单萜香叶醇重组酿酒酵母菌株构建方法概述：将含有香叶醇合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突变体融合蛋白基因tVoGES-ERG20F96W-N127W的表达载体pZGV6-GE1与含有异戊烯基二磷酸异构酶基因IDI1、HMG-CoA还原酶基因tHMG1和甾醇调节转录因子基因UPC2-1表达载体pZMVA4共转化酿酒酵母单倍体菌株CEN.PK102-5B，得到含有两个质粒的重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1，即为高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株。
上述技术方案较具体的步骤是：构建质粒pZGV6-GE1，通过融合PCR的方法构建香叶醇合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突变体融合蛋白基因tVoGES-ERG20F96W-N127W，然后通过GibsonAssembly的方法将上述基因克隆到表达载体pJFE3的BamHI/PstI位点处得到表达载体pZGV6-GE1；构建辅助质粒pJFE3-UPC2-1，将甾醇调节转录因子基因UPC2-1克隆到表达载体pJFE3的BamHI/SbfI位点得到表达载体pJFE3-UPC2-1；构建质粒pZMVA4，将异戊烯基二磷酸异构酶基因IDI1克隆到表达载体pIYC04的BamHI/SalI位点处得到表达载体pZMVA1，再将HMG-CoA还原酶基因tHMG1基因通过GibsonAssembly的方法克隆到表达载体pZMVA1的SpeI位点得到表达载体pZMVA2，最后将从辅助质粒pJFE3-UPC2-1扩增得到的UPC2-1的表达框TEF1p-UPC2-1-PGK1t片段通过GibsonAssembly的方法克隆到表达载体pZMVA2的Kpn2I位点处，得到表达载体pZMVA4；将质粒pZGV6-GE1和质粒pZMVA4共转化酿酒酵母单倍体菌株CEN.PK102-5B，得到重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1，其基因型为：pZGV6-GE1，pZMVA4。
进一步的，上述技术方案的实施步骤是：
(1)含有香叶醇合成途径中关键基因表达框的表达载体的构建：
①质粒pZGV6-GE1：用于表达融合基因tVoGES-ERG20(F96W-N127W)，以尿嘧啶为筛选标记。其中tVoGES为来源于Valerianaofficinalis的香叶醇合成酶(VoGES)(Accessionno.KF951406)，且以酿酒酵母为表达宿主进行密码子优化和删除导肽序列；ERG20(F96W-N127W)为酿酒酵母内源基因ERG20突变体。
②质粒pZMVA4：用于表达香叶醇合成上游途径(即酿酒酵母内源的MVA途径)的关键基因IDI、tHMG1、UPC2-1，以组氨酸为筛选标记。
(2)高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株的构建：
将步骤(1)中的pZGV6-GE1和pZMVA4两个质粒同时转化酿酒酵母CEN.PK102B菌株，通过SD-Ura-His培养基(酵母基础氮源yeastnitrogenbase1.7g/L，葡萄糖glucose20g/L，硫酸铵(NH4)2SO45g/L，缺尿嘧啶和组氨酸的氨基酸混合物CSM-Ura-His0.65g/L)筛选得到转化成功的转化子，即为重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1。
本发明所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株在发酵生产香叶醇中的应用。
本发明所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株在发酵生产香叶醇衍生产物(如抗癌单萜类生物碱)中的应用。
以不同发酵方式对重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1测试产生香叶醇的影响，结果显示本发明所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株产量是目前文献报道最高产量(36mg/L)的8倍。具体的：
①好氧摇瓶发酵：40mLSD-Ura-His培养基中添加4mL十二烷作为萃取剂，初始接种OD600为0.2，培养48小时，香叶醇产量达到最大值66.2mg/L。
②分批发酵：1L全自动控制发酵罐，培养基体积0.8L，添加200mL十二烷作为萃取剂，初始接种OD600为0.2，通气量1vvm，发酵48小时，香叶醇产量197mg/L。
③补料分批发酵：培养基初始体积0.4L，培养12小时后添加200mL十二烷作为萃取剂，其他条件同②，36小时开始以一定的速率开始补料，72小时香叶醇产量达到最高值293mg/L。该产量是目前文献报道最高产量(36mg/L)的8倍。
本发明公开了一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，使香叶醇的产量得到较大幅度的提高。本发明创新之处在于，通过筛选不同植物来源的香叶醇合成酶并对删除导肽序列的香叶醇合成酶与完整的香叶醇合成酶的活性作了比较，最终确定Valerianaofficinalis来源的香叶醇合成酶删除导肽后(tVoGES)的香叶醇合成活性最高，然后通过融合蛋白的方式大大提高了蛋白的催化效率，同时结合碳代谢通量的优化提高前体GPP的供应，使香叶醇的产量得到较大幅度的提高。本发明的技术策略为构建酿酒酵母平台合成其它高值单萜类化合物并实现工业化生产打下了坚实的基础。
附图说明
图1质粒pZVG6-GE1的构建流程图。
图2辅助质粒pIYC04-UPC2-1质粒构建流程图。
图3质粒pZMVA4的构建流程图。
图4重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1产香叶醇GC-MS图谱。
其中：A图香叶醇标准品GC图谱，B图为对照菌株GC图谱，C图为YZG13-GE1菌株GC图谱。
图5重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1好氧摇瓶发酵过程中香叶醇产生量的变化。
图6重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1和对照菌株好氧摇瓶发酵过程中胞内鲨烯含量变化。
图7重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1和对照菌株分批发酵过程中代谢产物的变化。
其中：A图为YZG13-GE1菌株分批发酵代谢产物的变化，B图为对照菌株分批发酵代谢产物的变化。
Symbols:■,glucose；▲,ethanol；◆,glycerol；★,aceticacid；●,OD600。
图8重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1分批发酵过程中香叶醇产生量的变化。
图9重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1分批发酵过程中OD值以及香叶醇产生量的变化。
具体实施方式
实施例1微生物材料来源及培养和分子生物学技术方法
(1)培养基
大肠杆菌(Escherichiacoli)培养使用的LB培养基：10gL-1蛋白胨，5gL-1酵母提取物，10gL-1NaCl；固体培养基需添加20gL-1琼脂粉；灭菌条件：115℃，30min；使用时，添加氨苄青霉素(Amp)至终浓度200μgmL-1用于筛选E.coli转化子。
酿酒酵母培养使用的培养基包括①YEPD培养基：20gL-1葡萄糖，20gL-1蛋白胨，10gL-1酵母粉；②SD-Ura-His合成培养基：20gL-1葡萄糖，1.7gL-1酵母基础氮源，5gL-1硫酸铵，0.65gL-1缺尿嘧啶和组氨酸的氨基酸混合物。其中，葡萄糖需单独灭菌后添加；固体培养基需添加20gL-1琼脂粉；灭菌条件：115℃，30min。摇瓶培养和发酵罐培养需分别添加10％和20％十二烷(过滤除菌)。补料分批发酵时，补料为20xSD-Ura-His合成培养基，速率控制菌体比生长速率为0.1h-1。
(2)酶与试剂
T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs(Beijing)LTD.)；RestrictionEnzymes,FastDigestenzymes,GeneRuler1kbDNALadder(ThermoFisherScientificInc.)；Gibson连接液(实验室配制)；蛋白胨、酵母提取物(购自OXOID公司)和琼脂粉(购自Solarbio公司)；葡萄糖(国药化学试剂有限公司)；其它化学试剂均为国产分析纯。真菌和酵母用蛋白酶抑制剂复合物(上海生工生物工程有限公司)；
PlasmidMiniKitI，Cycle-PureKit，GelExtractionkit(OmegaBio-TekInc.)；相应的实验操作按产品说明书进行；苯酚氯仿法提取基因组DNA。
Trans5αChemicallyCompetentCell，pEASY-BluntSimpleCloningKit购于北京全式金生物技术有限公司并按说明书进行操作。
PCR使用的TransStartFastPfuDNAPloymerase和EasyTaqDNAPloymerase购于北京全式金生物技术有限公司；PhusionHigh-FidelityDNAPloymerase购于ThermoFisherScientificInc.。反应体系按说明书进行添加，PCR反应程序分别设置如下：①95℃2min，1个循环；95℃30s，Tm-5℃20s，72℃2-4kb/min，30个循环；72℃10min，1个循环；4℃保温。②94℃2-5min，1个循环；94℃30s，50-60℃30s，72℃1-2kb/min，30-35个循环；72℃5-10min，1个循环；4℃保温。③98℃30s，1个循环；98℃10s，50-60℃30s，72℃2-4kb/min，30-35个循环；72℃10min，1个循环；4℃保温。
(3)引物及测序
植物来源的基因密码子优化以及合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成，相关引物和DNA的序列测定由上海博尚生物技术有限公司或苏州金唯智生物科技有限公司完成。
(4)酵母转化
酿酒酵母转化通过醋酸锂/聚乙二醇/单链DNA共转化方法(DanielGietz&Woods,2002)进行转化。
实施例2质粒pZGV6-GE1的构建
(1)PCR扩增DNA片段
以下片段通过PCR进行扩增：片段tVoGES，ERG20，ERG20(F96W-N127W)。
以质粒pUC57-VoGES为模板，用引物1和引物2扩增片段tVoGES；以CEN.PK102-5B基因组为模板，用引物3和引物4扩增ERG20；以片段ERG20为模板，分别用引物3、6和引物5、4扩增的上下游片段(F→W)，然后用引物3和4融合PCR扩增得到ERG20F96W片段；以片段ERG20F96W为模板采取同样方法得到ERG20(F96W-N127W)片段，所用引物分别为引物3、4、7和8；其中片段tVoGES和ERG20(F96W-N127W)之间存在30bp的重叠序列以及Linker序列，tVoGES5’和ERG20(F96W-N127W)3’端带有用于GibsonAssembly连接必需的40bp的同源序列。
(2)PCR扩增tVoGES-GGGS-ERG20(F96W-N127W)融合片段
通过融合PCR扩增片段tVoGES-GGGS-ERG20(F96W-N127W)：将步骤(1)中得到的DNA片段tVoGES和ERG20(F96W-N127W)同时作为模板，用引物9和引物12进行PCR扩增；
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR使用的TransStartFastPfuDNAPloymerase。
(3)质粒构建(见图1)
用BamHI和PstI双酶切质粒pJFE3(本实验室构建)得到线性化的载体片段，然后采用GibsonAssembly的方法将片段连接到线性化载体pJFE3上得到重组质粒pZGV6-GE1；
质粒pZGV6-GE1中片段tVoGES-GGGS-ERG20(F96W-N127W)用BamHI和PstI双酶切验证大小，测序验证序列无碱基突变。
表1：PCR所用引物列表
实施例3质粒pZMVA4的构建
(1)PCR扩增DNA片段
通过普通PCR扩增得到：IDI1，tHMG1和UPC2-1片段。
以CEN.PK102-5B基因组为模板，使用引物13和14扩增得到IDI1片段，上下游分别引入BamHI和SalI酶切位点；使用引物15和16扩增得到tHMG1片段，上下游分别引入用于GibsonAssembly的40bp同源序列，其中上游引物15的5’端添加起始密码子ATG，确保翻译正常开始，避免蛋白质发生移码突变；使用引物17和18扩增得到UPC2片段，然后使用含有碱基突变的下游引物19和20扩增得到UPC2-1片段，上下游分别引入BamHI和SbfI酶切位点，其中点突变发生在888位氨基酸G→D。以质粒pJFE3-UPC2-1为模板，使用引物21和22扩增UPC2-1基因表达框TEF1p-Ru-xylA-PGK1t片段，两端分别引入用于Gibson连接的40bp同源序列。
上述步骤中所述引物的序列见表1。PCR使用TransStartFastPfuDNAPloymerase。
(2)质粒的构建(见图2，图3)
①将BamHI和SalI酶切纯化后的IDI1片段克隆到质粒pIYC04(由JensNielsen赠送，CenterforMicrobialBiotechnology,TechnicalUniversityofDenmark,DK-2800Kgs.Lyngby,Denmark)的BamHI和SalI位点，得到重组质粒pZMVA1；
②用GibsonAssembly的方法将纯化后的两端带有40bp同源序列的tHMG1片段克隆到质粒pZMVA1的SpeI位点，得到重组质粒pZMVA2；
③将BamHI和SbfI酶切纯化后的UPC2-1片段克隆到质粒pJFE3的BamHI和SbfI的位点，得到重组质粒pJFE3-UPC2-1；
④用GibsonAssembly的方法将纯化后的两端带有40bp同源序列的TEF1p-UPC2-1-PGK1t片段克隆到质粒pZMVA2的Kpn2I位点，得到重组质粒pZMVA4。
以上质粒转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，含有氨苄青霉素钠LB固体平板上筛选得到正确的转化子，然后提取质粒对基因片段进行测序验证。
实施例4重组酿酒菌株YZG13-GE1的构建
将实施例2和3中所得质粒pZGV6-GE1(Ura缺陷型)和pZMVA4(His缺陷型)共转化CEN.PK102-5B(MATaura3-52his3Δ1leu2-3,112)菌株(由P赠送，InstituteforMolecularBiosciences,GoetheUniversity,Frankfurt,Germany)，通过SD-Ura-His固体培养基筛选得到正确的转化子，然后挑取2个单菌落于5mLSD-Ura-His液体培养基中，30℃，200rpm，培养24小时，提取酵母质粒通过PCR验证两个质粒存在，将正确的转化子划线于SD-Ura-His固体培养基平板，30℃培养两天待单菌株明显形成放4℃冰箱备用。
实施例5香叶醇产量检测
待测菌株单菌落接种到5mLSD-Ura-His液体培养基，30℃，200rpm培养24小时，再转接至10mLSD-Ura-His液体培养基二次活化12小时。将活化菌种接种至盛有40mLSD-Ura-His液体培养基的150mL的三角瓶中，加入10％体积(4mL)的十二烷，初始接种OD为0.1，棉塞封口，30℃，200rpm培养48小时，取十二烷层13000rpm离心10min，转移至气相小瓶，-80℃保存。气相色谱(GC-FID)检测香叶醇，根据标准曲线计算样品的香叶醇含量。
1、标准曲线的制备：准备6个5mL容量瓶，精确量取5.69μL香叶醇(5mg),溶于十二烷，十二烷定容至5mL，制成1mg/mL香叶醇标准母液；用十二烷2倍稀释得到梯度为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/mL的标准香叶醇溶液，GC-FID检测各个香叶醇浓度的峰面积响应值，然后以香叶醇浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，R2≥0.980。
2、GC检测条件：使用ShimadzuGC-FID气相色谱系统定量标准品和样品；GC-MS定性标准品和样品；GC-FID色谱条件：Rtx-Wax色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温条件：初始温度60℃，保持2min，以10℃/min升温至150℃，保持10min，最后以20℃/min升温至230℃，保持5min，总分析时间29min；进样口温度为260℃，检测器温度为280℃，载气为氮气，流速为0.78mL/min；进样体积1μL，分流比为10:1。GC-MS色谱条件：Rtx-5色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为氦气；质谱条件：EI电离源，以20次/秒速率全扫描(m/z40-500)，其它条件同GC-FID。
结果见图4。
实施例6鲨烯含量测
菌体培养条件同实施例5，取培养液8mL8000rpm离心，去上清，1mL无菌水洗一次，离心去上清，重悬细胞于0.8mL20％氢氧化钾-乙醇溶液(氢氧化钾(20％(wt/vol)溶于50％乙醇)，把悬浊液转移至2.0-mL螺口破胞管，旋紧盖子后沸水浴5分钟，冷却至室温，加入0.4mL十二烷，漩涡震荡5分钟，室温13000rpm离心10分钟，取上层十二烷层0.2mL于气相小瓶中，-20℃保存备用，气相色谱(GC-FID)检测鲨烯含量，根据标准曲线计算样品的鲨烯含量。
1、标准曲线的制备：准备6个5mL容量瓶，精确量取5.83μL鲨烯(5mg),溶于十二烷，十二烷定容至5mL，制成1mg/mL鲨烯标准母液；用十二烷2倍稀释得到梯度为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/mL的标准鲨烯溶液，GC-FID检测各个鲨烯浓度对应的峰面积，然后以鲨烯浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，R2≥0.980。
2、GC-FID检测条件：使用ShimadzuGC-FID气相色谱系统检测标准品和样品；色谱条件：Rtx-1701色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；程序升温条件：初始温度80℃，保持1min，以20℃/min升温至280℃，保持15min，总分析时间27min；进样口温度为250℃，检测器温度为280℃，载气为氮气，流速为1.05mL/min；进样体积1μL，不分流进样。
结果见图4。
实施例7重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1好氧摇瓶发酵
使用SD-Ura-His培养基(酵母基础氮源yeastnitrogenbase1.7g/L，葡萄糖glucose20g/L，硫酸铵(NH4)2SO45g/L，缺尿嘧啶和组氨酸的氨基酸混合物CSM-Ura-His0.65g/L)在摇瓶好氧条件下检测重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1生产香叶醇的能力，并以含有pJFE3和pIYC04质粒的菌株作为对照。菌株活化如实施例5中所述，发酵条件如下所述：培养温度为30℃，150mL摇瓶中装有40mLSD-Ura-His培养基，摇床转速为200rpm，棉塞封口，初始接种OD值为0.1，加入10％体积的十二烷萃取香叶醇，培养60小时。发酵过程中分别在36小时、48小时和60小时取十二烷层200μL，按照实施例5中描述的GC-MS方法定性香叶醇的存在并用GC-FID方法定量香叶醇的产量和鲨烯的含量。发酵实验重复三次，数据取平均值进行计算。菌株YZG13-GE1发酵过程中香叶醇的积累量变化如图5所示。
以20g/L葡萄糖为碳源进行发酵培养时，对照菌株发酵代谢物没有检测到香叶醇的存在，而菌株YZG13-GE1检测到香叶醇的存在，并且产量随着培养时间的延长而增加，在48小时达到最大值，达到66.2mg/L，48小时以后香叶醇的产量开始下降。同时，鲨烯的含量变化不明显(见图6)。本发明的菌株YZG13-GE1摇瓶发酵的香叶醇产量较之前文献的报道的36mg/L提高了30.2mg/L，提高率达到了84％，说明本发明的菌株具有较强的香叶醇生产能力。
实施例8重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1分批发酵
为了进一步测试重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1生产香叶醇的能力，对其进行培养条件控制更优的1L全自动控制发酵罐分批发酵，培养基以及对照菌株同实施例7中的所述。菌株活化如实施例5中所述，发酵条件如下所述：培养基体积为0.8L，初始OD值为0.2，搅拌速率为600rpm，通气量1VVM，pH为5.5(流加2.5M氢氧化钠溶液控制)，溶氧≥30％，培养12小时后一次性流加20％体积的十二烷萃取香叶醇，每3小时取样测OD值并离心取上清进行HPLC检测发酵代谢产物，36小时后每12小时取十二烷层检测香叶醇的积累量。菌株YZG13-GE1发酵过程中OD值以及代谢产物的变化如图7A所示，对照菌株发酵过程中OD值以及发酵代谢产物的变化如图7B所示。由图7可知，菌株YZG13-GE1最大比生长速率(μmax)较对照菌株有所提高(0.35vs.0.31h-1)，其他代谢产物没有明显的变化，说明MVA途径碳通量增加促进了细胞的生长。菌株YZG13-GE1的香叶醇积累量在48小时乙醇完全消耗完后达到最大值197mg/L(见图8)，60小时以后开始下降。实验室结果表明，良好的培养条件控制促进了菌株YZG13-GE1生产香叶醇的能力，产量提高了3倍。
实施例9重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1补料分批发酵
为了最大化重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1生产香叶醇的能力，本发明进行了补料分批发酵测试。发酵条件如下所述：初始培养基体积为0.4L，补料溶液20×SD-Ura-His培养基，葡萄糖和乙醇完全消耗完后(大约36小时)开始以一定的速率补料，通过控制比生长速率为0.1h-1调整补料速率，最终培养体积设定为0.8L，每12小时取样测定OD值和香叶醇的积累量，其他发酵参数同实施例8中分批发酵所述。菌株YZG13-GE1发酵过程中OD值以及香叶醇的产量变化如图9所示。由图4可知，发酵培养60小时香叶醇产量达到最大值293mg/L，随着补料的继续进行，OD值继续增长至50，但是香叶醇的产量呈现下降趋势。据相关文献报道以及本课题的研究发现，单萜具有较高的毒性，就香叶醇而言，当培养液中浓度达到200mg/L时，就会严重影响了菌体的生长，这可能解释了菌株YZG13-GE1在分批补料发酵后期OD值和香叶醇产量都出现下降的原因。
总之，截至目前为止，本发明涉及的重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1香叶醇的产量是最高的，较之前文献报道提高了8倍多，这也说明酿酒酵母具有生产高值单萜类化合物的巨大潜力。

Claims (5)

1.一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YZG13-GE1，该菌株基因型为：pZGV6-GE1，pZMVA4，已于2015年09月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.11465。
2.权利要求1所述高产单萜香叶醇重组酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是：将含有香叶醇合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突变体融合蛋白基因tVoGES-ERG20F96W-N127W的表达载体pZGV6-GE1与含有异戊烯基二磷酸异构酶基因IDI1、HMG-CoA还原酶基因tHMG1和甾醇调节转录因子基因UPC2-1表达载体pZMVA4共转化酿酒酵母单倍体菌株CEN.PK102-5B，得到含有两个质粒的重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1，即为高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株。
3.如权利要求2所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是：构建质粒pZGV6-GE1，通过融合PCR的方法构建香叶醇合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突变体融合蛋白基因tVoGES-ERG20F96W-N127W，然后通过GibsonAssembly的方法将上述基因克隆到表达载体pJFE3的BamHI/PstI位点处得到表达载体pZGV6-GE1；构建辅助质粒pJFE3-UPC2-1，将甾醇调节转录因子基因UPC2-1克隆到表达载体pJFE3的BamHI/SbfI位点得到表达载体pJFE3-UPC2-1；构建质粒pZMVA4，将异戊烯基二磷酸异构酶基因IDI1克隆到表达载体pIYC04的BamHI/SalI位点处得到表达载体pZMVA1，再将HMG-CoA还原酶基因tHMG1基因通过GibsonAssembly的方法克隆到表达载体pZMVA1的SpeI位点得到表达载体pZMVA2，最后将从辅助质粒pJFE3-UPC2-1扩增得到的UPC2-1的表达框TEF1p-UPC2-1-PGK1t片段通过GibsonAssembly的方法克隆到表达载体pZMVA2的Kpn2I位点处，得到表达载体pZMVA4；将质粒pZGV6-GE1和质粒pZMVA4共转化酿酒酵母单倍体菌株CEN.PK102-5B，得到重组酿酒酵母菌株YZG13-GE1，其基因型为：pZGV6-GE1，pZMVA4。
4.权利要求1所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株在发酵生产香叶醇中的应用。
5.权利要求1所述高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株在发酵生产香叶醇衍生产物中的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107629120A (zh) * 2017-08-23 2018-01-26 东北林业大学 白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用
CN110438145A (zh) * 2019-07-15 2019-11-12 天津大学 合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用
CN112553097A (zh) * 2020-11-26 2021-03-26 天津大学 一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法
CN114990147A (zh) * 2021-03-01 2022-09-02 深圳蓝晶生物科技有限公司 构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法以及通过该方法构建的重组需钠弧菌及其应用
CN115305254A (zh) * 2021-05-08 2022-11-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN116083462A (zh) * 2021-11-05 2023-05-09 武汉大学 一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株
CN116590165A (zh) * 2023-07-10 2023-08-15 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一株利用木糖生产香叶醇的酿酒酵母菌株及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898037A (zh) * 2014-03-11 2014-07-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898037A (zh) * 2014-03-11 2014-07-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CODRUTA IGNEA 等: ""Engineering Monoterpene Production in Yeast Using a Synthetic Dominant Negative Geranyl Diphosphate Synthase"", 《ACS SYNTHETIC BIOLOGY》 *
JIDONG LIU 等: ""Overproduction of geraniol by enhanced precursor supply in Saccharomyces cerevisiae"", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
刘继栋: ""代谢工程改造酿酒酵母生产单萜的关键问题解析"", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107629120A (zh) * 2017-08-23 2018-01-26 东北林业大学 白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用
CN107629120B (zh) * 2017-08-23 2021-05-11 东北林业大学 白桦bHLH9蛋白在调控三萜类化合物合成中的应用
CN110438145A (zh) * 2019-07-15 2019-11-12 天津大学 合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用
CN112553097A (zh) * 2020-11-26 2021-03-26 天津大学 一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法
CN112553097B (zh) * 2020-11-26 2022-09-13 天津大学 一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法
CN114990147A (zh) * 2021-03-01 2022-09-02 深圳蓝晶生物科技有限公司 构建生产香叶醇的重组需钠弧菌的方法以及通过该方法构建的重组需钠弧菌及其应用
CN115305254A (zh) * 2021-05-08 2022-11-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN115305254B (zh) * 2021-05-08 2024-03-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN116083462A (zh) * 2021-11-05 2023-05-09 武汉大学 一种萜类合酶基因及其表达盒、表达载体和重组微生物菌株
CN116590165A (zh) * 2023-07-10 2023-08-15 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一株利用木糖生产香叶醇的酿酒酵母菌株及其应用
CN116590165B (zh) * 2023-07-10 2023-09-26 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一株利用木糖生产香叶醇的酿酒酵母菌株及其应用

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