CN110438145A - 合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用 - Google Patents

合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用 Download PDF

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CN110438145A CN201910636614.1A CN201910636614A CN110438145A CN 110438145 A CN110438145 A CN 110438145A CN 201910636614 A CN201910636614 A CN 201910636614A CN 110438145 A CN110438145 A CN 110438145A
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张传波
李曼
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Abstract

本发明公开了合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用，其构建方法为：将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W‑N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC‑XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1；将质粒1转化进入谷氨酸棒状杆菌，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1；本发明为香叶醇的合成提供更多的前体，发酵时间短，42‑48小时，经气质检测，未检测出相应的副产物。

Description

合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用。
背景技术
香叶醇又名牻牛儿醇，常温下为无色或黄色油状液体，具有温和的玫瑰花气息，味有苦感。常用于食品添加剂，为玫瑰系香精的主剂，又是各种花香香精中不可缺少的调香原料，也可看作增甜剂，还可用于配制食品，香皂，日用化妆品香精。从天然精油中制取的产品，配制食品和日用化妆香精时，含香叶醇大于90％。工业品香叶醇是制造香草醇、紫罗兰酮和维生素A的原料。
医药原料用于抗菌和驱虫，临床治疗慢性支气管炎效果较好，不仅有改善肺通气功能和降低气道阻力的作用，而且对提高机体免疫功能也颇有裨益，且有起效快，副作用小的优点。香叶醇还具有抗氧化应激、抗炎症反应、抗肿瘤细胞增殖和调节血脂代谢作用。
近年来，随着合成生物学的发展，微生物萜类合成研究的深入，香叶基焦磷酸合成酶和香叶醇合成酶的不断发掘，具有遗传背景清晰，基因编辑技术完善，内含萜类合成途径的酿酒酵母被作为合成香叶醇的底盘，并取得了一定的研究成果，但由于酵母内源的麦角甾醇合成途径调控复杂，为工程化改造带来困难。
谷氨酸棒状杆菌作为一种氨基酸生产菌，发酵操作和基因操作成熟。因其合成萜类化合物的内源途径被解析，开始应用于萜类化合物的合成。目前，谷氨酸棒状杆菌已成功用于朱栾倍半萜和类胡萝卜素等药物前体的生物合成，但尚未有用于生产香叶醇的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌发酵生产香叶醇的用途。
本发明的技术方案概述如下：
合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，包括如下步骤：
将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1；将质粒1转化进入谷氨酸棒状杆菌，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1；
所述酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；
所述截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示；
ERG20F96W-N127W和tVoGES间的核糖体结合位点的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示。
上述构建方法构建的合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1。
上述方法还可以包括如下步骤：
将脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和异戊烯焦磷酸异构酶基因idi通过融合PCR的方法连接，同源区加入第二种核糖体结合位点序列，插入到质粒pXMJ19的XbaI和SmaI酶切位点，得到质粒2；将质粒2转化到所述合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1中，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌2。
所述脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示；
所述异戊烯焦磷酸异构酶基因idi的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示；
dxs和idi间的第二种核糖体结合位点的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示。
上述构建方法构建的合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌2。
谷氨酸棒状杆菌1发酵生产香叶醇的用途。
谷氨酸棒状杆菌2发酵生产香叶醇的用途。
本发明的优点：
本发明在谷氨酸棒状杆菌中以香叶基焦磷酸为合成前体，通过引入香叶基焦磷酸合成酶和香叶醇合成酶，成功构建了利用葡萄糖为碳源合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌菌株。并通过脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因过表达，为香叶醇的合成提供更多的前体，发酵时间短，42-48小时，经气质检测，未检测出相应的副产物。
附图说明
图1.本发明使用的质粒的遗传图谱。
A:将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1。
B:将脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入到质粒pXMJ19的XbaI和SmaI酶切位点，得到质粒2；。
图2.谷氨酸棒状杆菌胞内代谢产物GC分析图谱。
A:导入pEC-XK99E空质粒的对照菌株3发酵提取物GC分析。
B:导入pEC-XK99E和pXMJ19空质粒的对照菌株4发酵提取物GC分析。
C：重组菌株1发酵提取物GC分析。
D：香叶醇标准品GC分析。
E：香叶醇标准品质谱图。
F：重组菌株1合成香叶醇质谱图。
图3.构建菌株香叶醇含量分析。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明、
谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E(GenBank:AY219683.1)；
谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)
质粒pXMJ19(GenBank:AJ133195.1)
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面各实施例中提到的重组菌1为合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1的简称，重组菌2为合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌2的简称。
实施例1香叶醇合成表达载体的构建
(1)相关基因的获取
以酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W片段为模板，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，扩增得到酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W(SEQ ID NO.1)。
根据截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶的氨基酸序列，通过化学合成的方法，由金斯瑞生物科技有限公司合成，得到截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES(SEQ ID NO.2)，以序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物扩增。
以野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，以序列SEQ ID NO.11和SEQID NO.12为引物，扩增得到谷氨酸棒状杆菌脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(SEQ IDNO.4)。
以野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，以序列SEQ ID NO.13和SEQID NO.14为引物，扩增得到谷氨酸棒状杆菌异戊烯焦磷酸异构酶基因idi(SEQ ID NO.5)。
核糖体结合位点序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6通过人工合成方式得到。
(2)香叶醇合成表达载体的构建
将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列SEQ ID NO.3，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1。
具体步骤为：以酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W片段为模板，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，扩增得到酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W(SEQ ID NO.1)，共表达的tVoGES以序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物扩增,再以纯化后的两种片段混合物为模板，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10为引物扩增两基因的融合片段，核糖体结合位点序列SEQ ID NO.3通过引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9引入。所得融合片段与质粒pEC-XK99E用XbaI和SacI内切酶进行酶切、连接，得到质粒1(图1A)。
(3)脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因过表达载体的构建
提高脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和异戊烯焦磷酸异构酶的表达水平的质粒，具体构建步骤如下：
将脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列SEQ ID NO.6，插入到质粒pXMJ19的XbaI和SmaI酶切位点，得到质粒2。
具体步骤为：以野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，以序列SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12为引物，扩增得到dxs基因,以序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物扩增idi基因,再以纯化后的两种片段混合物为模板，以序列SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.14为引物扩增两基因的融合片段，核糖体结合位点序列SEQ ID NO.6通过引物SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13引入。所得融合片段与质粒pXMJ19用XbaI和SmaI内切酶进行酶切、连接，得到质粒2(图1B)。
上述PCR扩增条件：95℃，10min；95℃，15S；52-58℃，15S，30个循环；72℃，3.0min；72℃，5min。
实施例2合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌的构建
合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞构建方法，同时在谷氨酸棒状杆菌中表达香叶基焦磷酸合成酶和香叶醇合成酶，得到重组菌1。
将能表达香叶基焦磷酸合成酶和香叶醇合成酶的质粒1转化进入谷氨酸棒状杆菌，得到能合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1。
为了进行重组菌株的对照，便于代谢产物的对比分析，按照上述转化方法构建了含有pEC-XK99E空质粒的谷氨酸棒状杆菌重组菌3，在菌株3的基础上导入pXMJ19空质粒得到谷氨酸棒状杆菌重组菌4。
质粒的谷氨酸棒状杆菌转化方法为：从-80℃冰箱中取出保存的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，冰上放置直到融化。加入一定量的质粒DNA到感受态细胞中，用移液器轻柔的吹吸数次，将DNA和感受态细胞混合均匀。用移液器将混匀的DNA质粒和感受态细胞体系吸入到用卫生纸擦干外壁的预冷电击杯(孔径1mm)中，将电击杯安置到电转仪中，调节电转仪档位至阳性菌项，电击2次(1800V,2.5ms)。迅速将46℃预热的1mL BHIS培养基导入电击杯中，用移液器转移菌液至2ml离心管中，在46℃水浴锅中精确计时热击6分钟，迅速转移至冰上，放置2min。离心管于30℃，220rpm振荡培养，复苏1h。7200rpm室温离心2分钟，弃去上清液，加入100μL无菌水重悬菌体，用玻璃涂布器将菌液均匀涂布在添加25mg/L硫酸卡那霉素或10mg/L氯霉素的BHIS琼脂培养基上。30℃恒温培养箱中放置30min左右,待表面液体被充分吸收后，倒置平板过夜培养。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列进行测序验证。
实施例3
提高香叶醇合成菌脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和异戊烯焦磷酸异构酶表达水平的菌株(合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌2)构建
提高重组菌1的脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和异戊烯焦磷酸异构酶的表达水平，将能表达脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和异戊烯焦磷酸异构酶的质粒2转化到重组菌1中，得到重组菌2。
转化方法为：从-80℃冰箱中取出保存的重组菌1的感受态细胞，冰上放置直到融化。加入一定量的质粒2，用移液器轻柔的吹吸数次混合均匀。用移液器将混匀的DNA质粒和感受态细胞体系吸入到用卫生纸擦干外壁的预冷电击杯(孔径1mm)中，将电击杯安置到电转仪中，调节电转仪档位至阳性菌项，电击2次(1800V,2.5ms)。迅速将46℃预热的1mL BHIS培养基导入电击杯中，用移液器转移菌液至2ml离心管中，在46℃水浴锅中精确计时热击6分钟，迅速转移至冰上，放置2min。离心管于30℃，220rpm振荡培养，复苏1h。7200rpm室温离心2分钟，弃去上清液，加入100μL无菌水重悬菌体，用玻璃涂布器将菌液均匀涂布在添加25mg/L硫酸卡那霉素和10mg/L氯霉素的BHIS琼脂培养基上。30℃恒温培养箱中放置30min左右,待表面液体被充分吸收后，倒置平板过夜培养。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列进行测序验证。
实施例4
重组菌株的发酵过程和代谢物提取与测定
(1)重组菌的发酵过程与代谢物提取
取保存的重组菌1和菌株3转接于50mL含卡那霉素的液体LB试管中过夜培养，离心收集菌体用无菌CGXII培养基重悬菌体，分别接入装有50mL CGXII摇瓶中，初始OD600约为1.0，发酵条件为IPTG 1mmol/L,30℃，120rpm，pH 6.0，葡萄糖40g/L，正十二烷添加量10％，培养48个小时，测产物。
取保存的重组菌2和菌株4转接于50mL含卡那霉素和氯霉素的液体LB试管中过夜培养，离心收集菌体用无菌CGXII培养基重悬菌体，分别接入装有50mL CGXII摇瓶中，初始OD600约为1.0，发酵条件为IPTG 1mmol/L,30℃，120rpm，pH 6.0，葡萄糖40g/L，正十二烷添加量10％，培养48个小时，测产物。
香叶醇属于单萜化合物，易挥发且对菌体细胞的生长有抑制作用，为了减少在发酵过程中香叶醇的挥发损耗，降低对菌体生长的抑制作用，在发酵过程中添加正十二烷进行双相发酵。胞外的香叶醇直接取上层正十二烷相进行检测；胞内香叶醇，可通过将发酵液离心，收集菌体沉淀，加入正十二烷后，用超声破碎方法破碎细胞，然后12000rpm离心10min，吸取有机相进行检测。气质联用检测样品的制备，在发酵过程中不加正十二烷，发酵结束后，加入乙酸乙酯作为提取剂，漩涡震荡后离心，取乙酸乙酯相作为检测样品。在进行气相或气质联用检测前，样品需要用0.22μm孔径的有机相滤膜进行过滤，除去杂质。
(2)代谢产物的GC-MS测定
GC测定
气相色谱条件：色谱柱为BR-SWax柱，氮气流速1mL/min，进样温度250℃，进样分流比1:50，进样量1μL；炉温：150℃保持5min，5℃/min升高至250℃，250℃保持5min；FID检测器：250℃。标准曲线定量分析。
GC-MS测定
气相质谱联用条件：色谱柱HP-5ms，氦气流速1mL/min，进样口温度280℃，检测口温度250℃，不分流，进样量1μL；炉温：45℃保持3min，10℃/min升高至300℃，300℃保持1min；离子源温度230℃，离子扫描范围41-550m/z。
(3)测定结果
A：含有pEC-XK99E空质粒的谷氨酸棒状杆菌重组菌3中未检测到香叶醇(图2A)。
B：含有pEC-XK99E和pXMJ19空质粒的谷氨酸棒状杆菌重组菌4中未检测到香叶醇(图2B)。
C：重组菌1检测到了香叶醇(图2C)。
D：重组菌1和重组菌2中香叶醇的产量分别为：5.38±0.38mg/L和12.18±0.44mg/L。(图3中的1为重组菌1的香叶醇的产量，2为重组菌2的香叶醇的产量)
序列表
<110> 天津大学
<120> 合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60
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gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180
gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240
aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttactggtt ggtcgccgat 300
gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360
gttggggaaa ttgccatctg ggacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420
aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480
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accgaggaga acggcaagtt caaggagtcc ctgggcgagg ataccatcgg tatcctgtcc 420
ctgtacgagg cctcctacct gggtggtaag ggtgaggaga tcctgtccga ggctatgaag 480
ttctccgagt ccaagctgcg agagtcctcc ggtcatgtcg ctcctcatat ccgacgacag 540
atcttccagt ccctggagct gcctcgacac ctgcgaatgg ctcgactgga gtctcgacga 600
tacatcgagg aggactactc caacgagatc ggcgctgact cctccctgct ggagctggct 660
aagctggatt tcaactccgt ccaggccctg caccagatgg agctgaccga gatttcccga 720
tggtggaagc agctgggcct gtccgacaag ctgccttttg ctcgagaccg acccctggag 780
tgtttcctgt ggactgtcgg tctgctgccc gagcctaagt actctggttg ccgaatcgag 840
ctggccaaga ccatcgctgt cctgctggtt atcgacgaca tcttcgacac ctacggctcc 900
tacgaccagc tgatcctgtt caccaacgcc atccgacgat gggacctgga tgctatggac 960
gagctgcctg agtacatgaa gatctgctac atggccctgt acaacaccac caacgagatc 1020
tgctacaagg tcctgaagga gaacggctgg tccgtcctgc cttacctgga gcgaacttgg 1080
atcgacatgg tcgagggctt catgctggag gctaagtggc tgaactccgg cgagcagcct 1140
aacctggagg cttacatcga gaacggcgtc accaccgctg gttcttacat ggctctggtc 1200
cacctgttct tcctgatcgg cgacggtgtc aacgacgaga acgtcaagct gctgctggac 1260
ccttacccca agctgttctc ctccgctggt cgaatcctgc gactgtggga tgacctgggt 1320
actgctaagg aggagcagga gcgaggtgac gtttcctctt ccatccagct gtacatgaag 1380
gagaagaacg tccgatccga gtccgagggt cgagagggta ttgtcgagat catctacaac 1440
ctgtggaagg acatgaacgg cgagctgatc ggctccaacg ctctgcctca ggctatcatc 1500
gagacctcct tcaacatggc ccgaacctcc caggtcgtct accagcacga ggatgacacc 1560
tacttctcct ccgtcgataa ctacgtccag tccctgttct tcacccccgt ctctgtctcc 1620
gtctaa 1626
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgcgcgaa aggatttttt accc 24
<210> 4
<211> 1911
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
atgggaattc tgaacagtat ttcaacacct gctgacttaa aggcccttaa tgatgaggat 60
ttggacgctc ttgccaaaga aatccgaact ttcctggtcg ataaagtcgc agcaactggt 120
ggccacttag gtccaaattt gggcgtagtg gaattaacca tcggtcttca tcgagttttc 180
gattcgcctc aagacccgat catctttgat acttctcacc agtcctatgt gcataagatc 240
ctgacgggtc gcgctaaaga ttttgattct ttgcgtcaaa aagatggcct ttctggttac 300
acctgccgtg ctgaaagtga gcacgattgg actgagtctt cgcatgcttc ggcggccttg 360
tcttatgcgg atggtttgtc taaagccaag cagttggatg gcgataccac gcatagtgtg 420
gttgctgtcg ttggtgatgg cgctctaact ggcggcatgt gttgggaagc actgaacaat 480
attgctgctg gtaaagaccg caaagttgtt gtcgtagtca atgacaatgg ccggagttat 540
tctccaacca ttggcggatt tgcggaaaac cttgcgggcc ttcgcatgca gcctttctat 600
gatcgcttca tggaaaaggg caagacgtcc ctgaaatcca tggggtgggt aggggagcgt 660
acttttgaag cgctccatgc atttaaagaa ggtgtgaaga gcaccgtcat tcccaccgaa 720
atgttccctg aactgggcat gaaatacgtg ggtccggttg atggacataa ccaaaaagct 780
gtcgacaatg cgctgaaata cgctcatgat tatgatggcc ccatcatcgt gcacatggtc 840
accgaaaagg gtcgtggtta cgcgcctgct gagcaggatt tggacgaatt gatgcactcc 900
acgggcgtca tcgatccgct cacaggagct cctaaatctg catcaaagcc cggttggacc 960
tctgtgttca gcgatgagct ggtcaagatt ggtgcgcaga atgaaaacgt tgttgccatc 1020
accgccgcga tggcaggtcc taccggtctg tccaagttcg aagccaattt ccccaaccga 1080
ttctttgatg tcggcattgc tgagcagcac gcggtaactt ctgccgcagg cctcgcattg 1140
ggtggaaaac accctgtggt ggctatttac tccacgttct tgaaccgcgc ttttgatcag 1200
ctgctcatgg atgtgggcat gctcaaccag cctgttactt tggtgcttga tcgctcaggt 1260
gtcacgggtt cggatggagc gagccacaat ggcgtctggg atatggcgct gacctcgatc 1320
gttccaggcg tgcaggtggc ggcaccacgt gatgaggatt ccttgcgtga gctgctcaat 1380
gaggctattt ccatcgatga tggccccaca gttgtgcgtt tccccaaggg cgacttgcca 1440
actccaattg ttgctatcga caccttggaa gacggcgtgg atgtcctcgc atatgaagac 1500
gccactgacg ttgaatcaac cgacgatgcg ccatcagttc tcatcattgc ggtaggcgag 1560
cgcgcaactg ttgcacttga cgttgcttcc aggattaaac agcacggcgt gaacgtcacg 1620
gttgttgacc cccgctggat tgtccccatc ccgcagtcct tggtcgcgct gtctgatgat 1680
catgacctcg tgatcaccat cgaagacggc gtcatccacg gcggcgtggg atccttgctc 1740
tctgatgcgc ttaacgcctc tgaggtggat acccctcgcc gacaaatcgc cgtgccccag 1800
aagtacctgg atcacgcgtc ccgcaatgaa gtgctcgccg attatggcct cgacgccgac 1860
ggcattgaaa ccactgttgt tggatggctg gattccctgt tcggggaata a 1911
<210> 5
<211> 588
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 5
gtgtctaagc ttaggggcat gactactgag gttgaactgg ttgttttagc tgattccgag 60
ggcaatccta ttggtactgc gccgaaagct acggtgcaca ctaaggacac gcctctgcat 120
ttcgcgtttt ccacctatat tttgaacccg cgtggggagc tgttggtgac gcgtcgtgca 180
ttgtcgaaga agacatggcc tggtgtgtgg acgaactcta tgtgtgggca ccctggtccg 240
gatgagacaa acgcggatgc gattcgtcgc aggggtgtcg atgagttggg gctggaggta 300
gattctttct tggatattca agagattctg cctgattacc agtaccgtgc tgtcgacgcg 360
tccggcattg tggagtggga gttgtgcccg gtccacctcg tgcgtttagc ggtgggggaa 420
tttgtggagc cactggatga tgaggtggag gagttcgagt gggcggaacc gcagaagctt 480
ttcgacgctg ttgatgccac accatttgtg ttttctccat ggctagtgga tcagcttagc 540
gcccctgagc tgcgccaagc catcctggaa gcgtttgacg cagagtaa 588
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaaggaggc tcttcaggtg t 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagctcatg gcttcagaaa aagaaattag 30
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtaaaaaa tcctttcgcg cgccctattt gcttctcttg taaactt 47
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcgcgcgaa aggatttttt acccatgtct accgcctcct cc 42
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctctagatt agacggagac agagacg 27
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctctagaat gggaattctg aacagtattt c 31
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acacctgaag agcctccttt cttttattcc ccgaacaggg 40
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaaggaggc tcttcaggtg tgtgtctaag cttaggggca t 41
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgccccggga gttagttact ctgcgtcaaa c 31

Claims (6)

1.合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1；将质粒1转化进入谷氨酸棒状杆菌，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1；
所述酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W的核苷酸序列用SEQID NO.1所示；
所述截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示；
ERG20F96W-N127W和tVoGES间的核糖体结合位点的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是还包括如下步骤：
将脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和异戊烯焦磷酸异构酶基因idi通过融合PCR的方法连接，同源区加入第二种核糖体结合位点序列，插入到质粒pXMJ19的XbaI和SmaI酶切位点，得到质粒2；将质粒2转化到所述合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1中，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌2。
所述脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示；
所述异戊烯焦磷酸异构酶基因idi的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示；
dxs和idi间的第二种核糖体结合位点的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示。
3.权利要求1合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌的构建方法构建的合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1。
4.权利要求2合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌的构建方法构建的合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌2。
5.权利要求3的谷氨酸棒状杆菌1发酵生产香叶醇的用途。
6.权利要求4的谷氨酸棒状杆菌2发酵生产香叶醇的用途。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951767A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法
CN110951631A (zh) * 2019-12-31 2020-04-03 江南大学 一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法
CN111019966A (zh) * 2019-12-26 2020-04-17 华南农业大学 一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898037A (zh) * 2014-03-11 2014-07-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用
CN105176905A (zh) * 2015-10-16 2015-12-23 天津大学 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株及构建方法
CN105420135A (zh) * 2016-01-06 2016-03-23 山东大学 一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用
CN107828709A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 天津大学 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法
WO2018069418A2 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Evolva Sa Production of citronellal and citronellol in recombinant hosts
CN108085262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 中国科学院天津工业生物技术研究所 对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898037A (zh) * 2014-03-11 2014-07-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用
CN105176905A (zh) * 2015-10-16 2015-12-23 天津大学 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株及构建方法
CN105420135A (zh) * 2016-01-06 2016-03-23 山东大学 一株高产单萜香叶醇的重组酿酒酵母菌株及其应用
WO2018069418A2 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Evolva Sa Production of citronellal and citronellol in recombinant hosts
CN108085262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 中国科学院天津工业生物技术研究所 对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途
CN107828709A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 天津大学 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CODRUTA IGNEA等: ""Engineering Monoterpene Production in Yeast Using a Synthetic Dominant Negative Geranyl Diphosphate Synthase"", 《ACS SYTHETIC BIOLOGY》 *
JIANZHI ZHAO等: ""Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae"", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
KIM,P.等: ""Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032 chromosome, complete genome"", 《GENBANK DATABASE》 *
MAN LI等: ""Engineering Corynebacterium glutamicum for Geraniol Production"", 《TRANSACTIONS OF TIANJIN UNIVERSITY》 *
徐硕: ""谷氨酸棒状杆菌生物合成香叶醇底盘的构建"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
徐硕等: ""谷氨酸棒状杆菌异源合成萜类化合物的研究进展"", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019966A (zh) * 2019-12-26 2020-04-17 华南农业大学 一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法
CN111019966B (zh) * 2019-12-26 2023-01-24 华南农业大学 一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法
CN110951767A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法
CN110951767B (zh) * 2019-12-27 2020-11-03 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法
CN110951631A (zh) * 2019-12-31 2020-04-03 江南大学 一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法
CN110951631B (zh) * 2019-12-31 2021-03-02 江南大学 一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法

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