CN114150012B

CN114150012B - 异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母及其构建方法

Info

Publication number: CN114150012B
Application number: CN202111364221.3A
Authority: CN
Inventors: 卢文玉; 张传波; 叶楠; 田锦平
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114150012A

Abstract

本发明公开了异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法，其构建方法为：将优化后的糖基转移酶GTK1基因和优化后的糖基转移酶UGT1基因转入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到重组菌1；敲除重组菌1的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因，得到重组菌2，敲除重组菌2的β‑葡萄糖水解酶EGH1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶PGM1基因和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因，得到重组菌3；实验证明，重组菌1、2、3发酵得到人参皂苷F2的产量依次为15.5mg/L，20.15mg/L与44.83mg/L。

Description

异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法及应用。

背景技术

人参皂苷F2(简称为F2)属于人参二醇型皂苷，是Rb1、Rb2、Rc和Rd等失去若干糖基代谢降解形成的次级皂苷之一，皂苷元的C-3位和C-20位均为Glc糖基。F2是一种白色粉末，在人参中含量极其微少，仅存在于人参茎叶皂苷中，但其在抑制肿瘤、抗氧化等方面具有突出的效果，且由于尺寸较小，亲水性好，细胞膜渗透性强，生物利用度高，在人体中的吸收利用率高达70％，在抑制肿瘤、细胞保护、抑制肥胖、抗炎症等医药领域前景优良。

虽然F2具有很高的药用价值，但由于天然产量很少，制备技术方面存在空白，因此利用合成生物学相关技术构建细胞工厂，通过生物法获取高纯度高产量的F2对医药研发和传统药食资源开发利用都具有重要意义。近年来，采用合成生物学技术异源合成了一些天然产物，但在微生物中高产量异源合成人参皂苷F2还未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

本发明的第二个目的是提供第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

本发明的第三个目的是提供第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

本发明的第四个目的是提供第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法。

本发明的第五个目的是提供第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法。

本发明的第六个目的是提供第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法。

本发明的第七个目的是提供第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

本发明的第八个目的是提供第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

本发明的第九个目的是提供第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

本发明的技术方案概述如下：

第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：

将优化后的糖基转移酶GTK1基因和优化后的糖基转移酶UGT1基因转入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；

所述优化后的糖基转移酶GTK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；

所述优化后糖基转移酶UGT1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示。

第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：

敲除上述第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因，得到第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；

所述二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；

所述二酰甘油激酶DGK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示。

第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：

敲除上述第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的β-葡萄糖水解酶EGH1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶PGM1基因和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因，得到第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；

所述β-葡萄糖水解酶EGH1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；

所述磷酸葡萄糖变位酶PGM1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.6所示；

所述UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.7所示。

第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

本发明的优点：

本发明成功构建了三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。实验证明，本发明的异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵得到人参皂苷F2，重组菌1、2、3的人参皂苷F2产量依次为15.5mg/L，20.15mg/L与44.83mg/L。

附图说明

图1.酿酒酵母胞内代谢产物分析。其中A为F2标准品和重组菌1代谢产物液相图；B为F2标准品和重组菌1代谢产物中F2的质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，选用中国专利号201410735927.X，发明名称为：一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用中实施例3获得的“合成原人参二醇的酵母菌株W3a”，在本案中简称“酿酒酵母W3a”。

其它包括达玛烯二醇合酶DS、原人参二醇合酶PPDS及细胞色素P450酶还原酶AtCPR1编码序列的重组菌也可以用于本发明。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1a(ATCC：208352)，以下简称酿酒酵母ATCC208352，酿酒酵母BY4741(ATCC 4040002)以下简称酿酒酵母ATCC 4040002，购买时间，2016.6，网址：https://www.atcc.org/)

实施例1第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母(简称重组菌1)的构建方法

糖基转移酶GTK1来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，糖基转移酶UGT1来源于人参(Ginseng)，均由武汉金开瑞生物工程有限公司酿酒酵母密码子优化后，得到优化后糖基转移酶GTK1基因用SEQ ID NO.1所示；优化后糖基转移酶UGT1基因用SEQ ID NO.2所示；通过化学合成的方法合成，将SEQ ID NO.1所示基因和SEQ ID NO.2所示基因融合后，导入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母，简称重组菌1。

(1)GTK1和UGT1融合蛋白构建

将优化后糖基转移酶GTK1的终止密码子删除，以多肽Linker GSTSSGSSG连接，后接带有终止密码子的优化后糖基转移酶UGT1基因片段，构建GTK1-GSTSSGSSG-UGT1融合蛋白。

以酿酒酵母ATCC208352基因组为模板，利用HOL-F(SEQ ID NO.8)与TEF1-HOL-R(SEQ ID NO.9)PCR扩增HOL片段，利用HOL-TEF1-F(SEQ ID NO.10)与GTK1-TEF1-R(SEQ IDNO.11)PCR扩增P_TEF1片段；以GTK1(SEQ ID NO.1)为模板，利用TEF1-GTK1-F(SEQ ID NO.12)与UGT1-GTK1-R(SEQ ID NO.13)PCR扩增GTK1片段；以UGT1(SEQ ID NO.2)为模板，利用GTK1-UGT1-F(SEQ ID NO.14)与CYC1-UGT1-R(SEQ ID NO.15)PCR扩增UGT1片段；以酿酒酵母ATCC208352基因组为模板，利用UGT1-CYC1-F(SEQ ID NO.16)与URA3-CYC1-R(SEQ IDNO.17)PCR扩增T_cyc1片段，利用URA3-HOR-F(SEQ ID NO.20)与HOR-R(SEQ ID NO.21)PCR扩增HOR片段；以质粒pXP218(购自Addgene)为模板，利用CYC1-URA3-F(SEQ ID NO.18)与HOR-URA3-R(SEQ ID NO.19)PCR扩增URA3片段。将扩增得到的HOL，P_TEF1，GTK1，UGT1，T_cyc1，URA3与HOR片段融合，获得HOL-P_TEF1-GTK1-GSTSSGSSG-UGT1-T_cyc1-URA3-HOR表达模块。

(2)酿酒酵母转化

将酿酒酵母W3a的单菌落接种于3ml YPD液体培养基中，在30℃，220rpm的摇床中培养12h；将培养的酵母种子液转接到新的3ml YPD液体培养基中，30℃，在220rpm的转速下培养5h；取1ml菌液于提前灭过菌的1.5ml离心管中，4000rpm离心机离心3min，弃上清，收集菌体；1ml无菌水洗涤一次，4000rpm离心机离心3min，弃上清，收集菌体。然后将1ml 100mMLiAc水溶液加入菌体中混匀，室温静置5min。将静置结束后的细胞4000rpm离心3min，用移液枪除去LiAc液体。将鲑鱼精DNA(Solarbio，10mg/ml)进行开水煮沸5min，然后快速放入准备好的冰上冷却。

依次向菌体沉淀离心管中加入120μl PEG3350(50g PEG3350/100ml水)、18μL1.0M LiAc水溶液、开水煮沸后5μl鲑鱼精DNA、37μL HOL-P_TEF1-GTK1-GSTSSGSSG-UGT1-T_cyc1-URA3-HOR片段，体系共180μl。然后温和地用移液枪吹打1min，使其混匀；将上述混匀的离心管放置42℃水浴锅热激30min后，4000rpm离心机离心3min，除去上清；继续加入干净的1mlYPD液体培养基，30℃，220rpm摇床进行复苏培养2h；将复苏好的离心管在4000rpm转速下离心3min，弃去上层培养基，再用1ml无菌水洗涤两次；最后向含有菌体的离心管中加入200μl的无菌水并混匀，涂布于缺尿嘧啶的SC培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养2天，待单菌落长出，筛选获得重组菌1。

实施例2第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母菌株(简称重组菌2)的构建方法

敲除重组菌1的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因获得重组菌2，所述二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述二酰甘油激酶DGK1的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示。

(1)二酰甘油激酶DGK1基因表达模块构建

以酿酒酵母ATCC208352基因组为模板，

利用DGA1-F(SEQ ID NO.22)

与TEF1-DGA1-R(SEQ ID NO.23)PCR扩增DGA1L片段，利用DGA1-TEF1-F(SEQ IDNO.24)与DGK1-TEF1-R(SEQ ID NO.25)PCR扩增P_TEF1片段，利用TEF1-DGK1-F(SEQ IDNO.26)与CYC1-DGK1-R(SEQ ID NO.27)PCR扩增DGK1片段，利用DGK1-CYC1-F(SEQ IDNO.28)与Bleo-CYC1-R(SEQ ID NO.29)PCR扩增T_CYC1片段；以pSH65质粒(购买自武汉淼灵生物科技有限公司)为模板，利用CYC1-Bleo-F(SEQ ID NO.30)与DGA1-Bleo-R(SEQ IDNO.31)PCR扩增Bleo片段；以酿酒酵母ATCC208352基因组为模板，利用Bleo-DGA1-F(SEQ IDNO.32)与DGA1-R(SEQ ID NO.33)PCR扩增DGA1R片段。将扩增得到的DGA1L，P_TEF1，DGK1，T_cyc1，Bleo与DGA1R片段融合，获得DGA1L-P_TEF1-DGK1-T_cyc1-Bleo-DGA1R表达模块。

(2)酿酒酵母转化，按照实施例1步骤(2)的转化方法，将步骤(1)中获得的DGA1L-P_TEF1-DGK1-T_cyc1-Bleo-DGA1R表达模块转化入重组菌1中，重组菌涂布于博来霉素的YPD平板上进行筛选，获得重组菌2。

实施例3第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母(简称重组菌3)的构建方法

在重组菌2中敲除β-葡萄糖水解酶EGH1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶PGM1和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因，得到重组菌3。

所述β-葡萄糖水解酶EGH1的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；

所述磷酸葡萄糖变位酶PGM1的核苷酸序列以SEQ ID NO.6所示；

所述UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1的核苷酸序列以SEQ ID NO.7所示；

(1)磷酸葡萄糖变位酶PGM1和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1表达模块构建

以酿酒酵母ATCC208352基因组为模板，利用EGH1L-F(SEQ ID NO.34)与PGK1-EGH1L-R(SEQ ID NO.35)PCR扩增EGH1L片段，利用EGH1-PGK1-F(SEQ ID NO.36)与PGM1-PGK1-R(SEQ ID NO.37)PCR扩增P_PGK1片段，利用PGK1-PGM1-F(SEQ ID NO.38)与PGM2t-PGM1-R(SEQ ID NO.39)PCR扩增PGM1片段，利用PGM1-PGM2t-F(SEQ ID NO.40)与TDH3-PGM2t-R(SEQ ID NO.41)PCR扩增T_PGM2片段，利用PGM2t-TDH3-F(SEQ ID NO.42)与UGP1-TDH3-R(SEQ ID NO.43)PCR扩增P_TDH3片段，利用TDH3-UGP1-F(SEQ ID NO.44)与ADE2-UGP1-R(SEQ ID NO.45)PCR扩增UGP1-T_UGP1片段；以酿酒酵母ATCC 4040002基因组为模板，利用UGP1-ADE2-F(SEQ ID NO.46)与EGH1-ADE2-R(SEQ ID NO.47)PCR扩增ADE2片段，利用ADE2-EGH1R-F(SEQ ID NO.48)与EGH1R-R(SEQ ID NO.49)PCR扩增EGH1R片段。将扩增得到的EGH1L，P_PGK1，PGM1，T_PGM2，P_TDH3片段融合，获得EGH1L-P_PGK1-PGM1-T_PGM2-P_TDH3模块，将UGP1-T_UGP1，ADE2，EGH1R片段融合，获得UGP1-T_UGP1-ADE2-EGH1R表达模块。

(2)酿酒酵母转化

按照实施例1步骤(2)的转化方法，将本实施例步骤(1)中获得的EGH1L-P_PGK1-PGM1-T_PGM2-P_TDH3与UGP1-T_UGP1-ADE2-EGH1R表达模块转化入重组菌2中，利用缺失腺嘌呤的SC平板进行筛选，获得重组菌3。

实施例4重组菌的发酵过程和代谢物的提取与测定

(1)重组菌的发酵过程与代谢物提取

以所构建的各个重组菌进行微生物发酵，检测胞内代谢产物中人参皂苷F2的生成。

将构建的各重组菌株单菌落接种于2mL YPD液体培养基中30℃，200rpm过夜培养。取适量种子液接种于盛有50mL YPD液体培养基的摇瓶中，使发酵液初始OD为0.1，进行为期4天的发酵。发酵结束后向1mL发酵液中加入400μL正丁醇和与菌体体积相当的石英砂，涡旋震荡30分钟，12000rpm离心10分钟，收集上层有机相，0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析。若有机相提取液中浓度过低，则增加发酵液的体积，用乙酸乙酯萃取多次后合并有机相，蒸干后用400μL正丁醇溶解，进行HPLC-MS分析，检测结果，见图1(图1B中的F2为人参皂苷F2的简称)。

(2)代谢产物的HPLC-MS测定

色谱条件：使用Hypersil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm；Elite AnalyticalInstruments Co.，Ltd.，中国大连)进行HPLC分析，检测波长为203nm，柱温50℃，流动相条件为：0-40min，40-100％乙腈；40-45min，100％乙腈。制作人参皂苷F2浓度的标准曲线用于定量分析菌株代谢物中人参皂苷F2的产量。

质谱条件：信号源类型，ESI；离子极性，正；所有光谱都是在50/1200的m/z范围内获得的；干气流，6.0L/min；干燥温度180℃；雾化器压力为0.8bar；探头电压+4.5kV

(3)测定结果

重组菌1、2、3中人参皂苷F2产量依次为15.5mg/L，20.15mg/L与44.83mg/L。

(4)实施例所用培养基

YPD液体培养基：葡萄糖终浓度为20g/L，酵母浸粉终浓度为10g/L，蛋白胨终浓度为20g/L，以蒸馏水配制。YPD固体培养基则在YPD液体培养基中加20g/L的琼脂粉。

SC培养基：葡萄糖终浓度为2g/L，无氨基酵母氮源(YNB)终浓度为6.7g/L，氨基酸混合物终浓度为0.2g/L，20g/L的琼脂粉,以蒸馏水配制，缺失氨基酸混合物指去掉氨基酸混合物中的对应成份。

氨基酸混合物：甘氨酸，2.0g；丙氨酸，2.0g；甲硫氨酸，2.0g；赖氨酸，2.0g；精氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；天冬酰胺，2.0g；天冬氨酸，2.0g；苯丙氨酸，2.0g；半胱氨酸，2.0g；脯氨酸，2.0g；酪氨酸，2.0g；谷氨酸，2.0g；缬氨酸，2.0g；苏氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；异亮氨酸，2.0g；肌醇，2.0g；谷酰胺，2.0g；对氨基苯甲酸0.2g；腺嘌呤，0.5g；亮氨酸10g；甲硫氨酸，2g；色氨酸，2g；组氨酸，2g；尿嘧啶，2g。

序列表

<110> 天津大学

<120> 异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccaacg ttttgatgat tggttttcca ggtgaaggtc atatcaaccc atctattggt 60

gttatgaagg aattgaagtc caggggtgaa aacattactt actatgctgt caaagagtac 120

aaagagaaga ttaccgcttt ggacatcgaa ttcagagaat accatgattt cagaggtgac 180

tactttggta agaatgctac tggtgatgaa gaaagggatt tcaccgaaat gttgtgtgct 240

tttttgaagg cctgtaagga tattgctacc catatctatg aagaagtcaa gcacgaatcc 300

tacgattacg ttatctacga tcatcatttg ttggccggta aggttatcgc taatatgttg 360

aagttgccaa ggttttcttt gtgtactacc ttcgctatga acgaagaatt cgccaaagaa 420

atgatgggtg cttatatgaa gggttccttg gaagattctc cacactatga atcttaccaa 480

caattggctg aaaccttgaa cgctgatttt caagccgaaa tcaaaaagcc attcgatgtt 540

tttttggccg atggtgattt gactatcgtt ttcacttcta gaggtttcca accattggca 600

gaacaatttg gtgaaagata cgttttcgtt ggtccatcca ttactgaaag agctggtaac 660

aacgatttcc cattcgatca aatcgacaac gagaacgttt tgttcatctc tatgggtacg 720

attttcaaca accagaagca attcttcaac cagtgtttgg aagtgtgcaa ggattttgat 780

ggtaaggttg ttttgtccat cggtaagcac attaagacct ctgaattgaa cgatatccca 840

gagaacttta tcgttagacc atacgttcca cagttggaaa ttttgaagag agcctctttg 900

ttcgttactc atggtggtat gaattctact tctgaaggct tgtacttcga aaccccattg 960

gttgttattc caatgggtgg tgatcaattc gttgttgctg atcaagttga aaaagttggt 1020

gctggtaagg tcatcaagaa agaagaattg tccgagtcct tgctgaaaga aaccattcaa 1080

gaagtcatga acaacaggtc ttacgctgaa aaggctaaag aaatcggtca atctttgaaa 1140

gctgctggtg gttctaaaaa agctgccgat tctattttgg aagccgttaa gcaaaaaacc 1200

caatctgcta acgctctcga gtaa 1224

<210> 2

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagtcag aattgatttt cttgccagca cctgccatag gtcatttggt cggtatggta 60

gaaatggcta agttgtttat ttctagacac gaaaatttgt cagtcacagt attgatcgca 120

aagttctaca tggataccgg tgtagacaac tacaacaaat ctttgttgac taacccaaca 180

cctagattga ctattgttaa tttgccagaa acagatcctc aaaactacat gttgaagcca 240

agacatgcta tcttcccttc tgtaatcgaa acccaaaaga ctcacgttag agatatcatc 300

tctggtatga cacaatctga atcaacccaa gttgtcggtt tgttggccga tttgttgttt 360

attaacataa tggacatagc taatgaattc aacgtaccaa cctatgttta ctctcctgct 420

ggtgcaggtc atttgggttt agcattccac ttgcaaactt tgaacgataa aaagcaagac 480

gtcaccgaat tcagaaactc tgatactgaa ttgttagtac catcattcgc aaatccagtc 540

cctgccgaag tattgccttc tatgtacgtt gataaggaag gtggttatga ctacttgttt 600

tccttattca gaagatgtag agagagtaag gcaatcatta ttaacacttt cgaagaattg 660

gaaccatatg ccattaactc tttgagaatg gattcaatga tcccacctat ctacccagtc 720

ggtcctatat tgaatttgaa cggtgacggt caaaattccg acgaagctgc agttatcttg 780

ggttggttag atgaccaacc accttcttca gtagttttct tgtgtttcgg ttcctacggt 840

agtttccaag aaaaccaagt taaggaaatc gctatgggtt tggaaagatc aggtcataga 900

ttcttgtggt ctttaagacc atcaattcct aagggtgaaa caaagttgca attgaagtac 960

tccaatttga aggaaatatt accagttggt ttcttggata gaaccagttg cgttggtaaa 1020

gtcataggtt gggccccaca agttgctgtc ttgggtcatg aatccgttgg tggtttctta 1080

agtcactgtg gttggaattc cactttggaa agtgtctggt gcggtgtacc agttgccaca 1140

tggcctatgt atggtgaaca acaattgaac gctttcgaaa tggttaagga attgggtata 1200

gcagttgaaa tcgaagtcga ttacaaaaag gactacttca acatgaagaa cgatttcatc 1260

gttagagcag aagaaatcga aacaaaaatt aaaaagttga tgatggacga aaacaactct 1320

gaaataagaa agaaagttaa ggaaatgaaa gaaaagtcca gagccgctat gagtgaaaat 1380

ggttccagtt acaactcatt ggctaaatta ttcgaagaaa ttatgtaa 1428

<210> 3

<211> 1257

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

atgtcaggaa cattcaatga tataagaaga aggaagaagg aagaaggaag ccctacagcc 60

ggtattaccg aaaggcatga gaataagtct ttgtcaagca tcgataaaag agaacagact 120

ctcaaaccac aactagagtc atgctgtcca ttggcgaccc cttttgaaag aaggttacaa 180

actctggctg tagcatggca cacttcttca tttgtactct tctccatatt tacgttattt 240

gcaatctcga caccagcact gtgggttctt gctattccat atatgattta tttttttttc 300

gataggtctc ctgcaactgg cgaagtggta aatcgatact ctcttcgatt tcgttcattg 360

cccatttgga agtggtattg tgattatttc cctataagtt tgattaaaac tgtcaattta 420

aaaccaactt ttacgctttc aaaaaataag agagttaacg aaaaaaatta caagattaga 480

ttgtggccaa ctaagtattc cattaatctc aaaagcaact ctactattga ctatcgcaac 540

caggaatgta cagggccaac gtacttattt ggttaccatc cacacggcat aggagcactt 600

ggtgcgtttg gagcgtttgc aacagaaggt tgtaactatt ccaagatttt cccaggtatt 660

cctatttctc tgatgacact ggtcacacaa tttcatatcc cattgtatag agactactta 720

ttggcgttag gtatttcttc agtatctcgg aaaaacgctt taaggactct aagcaaaaat 780

cagtcgatct gcattgttgt tggtggcgct agggaatctt tattaagttc aacaaatggt 840

acacaactga ttttaaacaa aagaaagggt tttattaaac tggccattca aacggggaat 900

attaacctag tgcctgtgtt tgcatttgga gaggtggact gttataatgt tctgagcaca 960

aaaaaagatt cagtcctggg taaaatgcaa ctatggttca aagaaaactt tggttttacc 1020

attcccattt tctacgcaag aggattattc aattacgatt tcggtttgtt gccatttaga 1080

gcgcctatca atgttgttgt tggaaggcct atatacgttg aaaagaaaat aacaaatccg 1140

ccagatgatg ttgttaatca tttccatgat ttgtatattg cggagttgaa aagactatat 1200

tacgaaaata gagaaaaata tggggtaccg gatgcagaat tgaagatagt tgggtaa 1257

<210> 4

<211> 873

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

atggggaccg aagatgccat tgcccttcca aatagcacgc tagagccgcg taccgaagct 60

aagcaaagac tatcatctaa gagtcatcaa gtctcggcga aagtaacgat tccagcaaaa 120

gaagaaatta gtagtagcga tgacgatgca cacgttccag tgacagaaat acatttgaaa 180

tctcatgaat ggttcggcga ttttataact aaacatgaaa ttccccgtaa ggtgttccat 240

tcttccattg gctttattac tttgtacctg tatacgcagg gtattaatta taaaaatgtt 300

ttatggcctt tgatatacgc cttcatcata ttgtttattt tggatctgat aagactaaac 360

tggccctttt tcaatatgct ttactgtaga actgtgggtg cgctaatgag aaaaaaggag 420

attcatacat acaatggggt attgtggtac attcttgggt taatcttttc ttttaacttt 480

ttctctaaag atgttacctt aatatcgtta tttttgctaa gttggtccga tacagccgcc 540

gcaactattg gaagaaagta tggtcattta acacccaaag tggcaagaaa taaatccctt 600

gcaggttcga tagctgcgtt tacagttggt gttatcacct gctgggtatt ttatggctat 660

tttgttcctg cctacagcta cgtcaacaaa cctggcgaga tccaatggag cccagaaaca 720

agcagattaa gtttgaatat gctatccttg ttaggtggtg tggtagctgc tttgagtgaa 780

ggtatagatt tgttcaactg ggatgataat ttcactattc ctgtcctgtc atcacttttt 840

atgaacgcag taatcaaaac attcaagaaa taa 873

<210> 5

<211> 2295

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 5

atgcctgcca aaatacacat ttctgcagac ggtcagtttt gcgataaaga tggcaacgag 60

atccaattgc gtggtgtcaa tttggatccg tcagttaaaa tccctgcaaa gccattccta 120

tccacccacg ctcccataga aaatgacacg tttttcgagg atgctgataa agtcagtttc 180

atcaatcacc ccttagttct tgatgatatc gaacagcata tcatcagatt gaaatcactg 240

ggttacaata ccattcgttt acccttcacc tgggaatctc ttgaacatgc tggtccagga 300

cagtacgatt ttgactatat ggattatatc gtcgaggtac taaccaggat taacagcgta 360

caacaaggta tgtacattta tttggaccct caccaagacg tctggtctag gtttagcggt 420

ggatctggag caccgctatg gaccttatac tgtgcagggt ttcaacctgc aaacttcctg 480

gccaccgatg ctgcaatctt acataattat tatattgacc ccaaaacggg cagggaagtt 540

ggcaaagatg aagagtccta ccctaagatg gtttggccta caaactactt caaactggcg 600

tgtcaaacaa tgtttacgtt attctttggt gggaaacaat atgctcctaa gtgcacaatt 660

aatggagaaa acatacagga ttacttgcaa ggaaggttta atgatgcaat catgacactg 720

tgcgcaagaa ttaaagaaaa ggctcctgag ttgtttgaga gcaactgcat tattggatta 780

gagtctatga acgagccaaa ctgtggttac attggtgaaa caaatctcga tgtgattccg 840

aaagagagaa atttgaaatt gggcaaaacg ccaacggcat ttcaaagctt tatgctgggt 900

gaaggtattg agtgcacaat agatcaatat aaaaggacat tttttggatt ttctaaggga 960

aaaccgtgca caatcaatcc caaaggcaaa aaagcttggc tgagtgcaga ggaaagagat 1020

gcgatagatg cgaagtataa ttgggaaagg aaccctgaat ggaaaccaga cacttgcatt 1080

tggaaactcc atggtgtttg ggagattcag aatggtaaac gccctgtttt actcaaacca 1140

aattacttta gccaacctga tgcaacggta tttataaaca atcattttgt tgactattac 1200

actggaattt ataacaagtt tagggaattc gatcaagaat tgtttattat aatccaaccg 1260

ccggtaatga agccaccacc caatttacaa aattctaaaa tattggacaa taggacgatt 1320

tgtgcatgtc atttttatga tggtatgaca ctaatgtata agacatggaa taaacgaatt 1380

ggcatagaca cctatggact agtaaacaaa aaatactcaa atcctgcctt tgctgtagtg 1440

cttggcgaaa acaatatacg gaaatgcatt aggaagcaat tatcagaaat gcaaaaggac 1500

gctaaatcca tgcttggaaa aaaagtacct gtattcttca ccgaaattgg tattccattt 1560

gacatggacg acaagaaagc atatattaca aatgactatt cttcacagac cgctgcattg 1620

gatgctcttg gatttgcatt agaaggaagt aatctttcgt acaccttatg gtgttattgc 1680

agtattaatt cacatatatg gggtgacaat tggaacaatg aagatttttc gatttggtcc 1740

ccggatgaca aaccactcta tcacgatacc cgagcaaaaa ctcctactcc tgagccatct 1800

ccagcctcta ctgtggcttc ggtatccact tctacatcta aatcgggttc ttcacaacca 1860

ccaagtttca taaaaccaga taatcattta gatttggata gtccctcgtg cactttaaag 1920

agcgacttgt cagggttcag agctcttgat gctataatga gaccattccc catacaaatt 1980

cacggaagat ttgagtttgc tgagtttaac ttatgtaata aatcctacct tttgaaatta 2040

gttggtaaaa cgacacctga acagataact gtccctacat atatttttat accacggcac 2100

cattttacac caagccggtt gtcaattcgt tcatcatcag gtcattatac ctataacact 2160

gactaccagg ttcttgaatg gtttcacgag cctggccatc agttcattga aatttgcgca 2220

aaatcgaagt caaggcccaa cacccctgga agtgacactt cgaatgactt accagcggaa 2280

tgcgttatca gctaa 2295

<210> 6

<211> 1713

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 6

atgtcacttc taatagattc tgtaccaaca gttgcttata aggaccaaaa accgggtact 60

tcaggtttac gtaagaagac caaggttttc atggatgagc ctcattatac tgagaacttc 120

attcaagcaa caatgcaatc tatccctaat ggctcagagg gaaccacttt agttgttgga 180

ggagatggtc gtttctacaa cgatgttatc atgaacaaga ttgccgcagt aggtgctgca 240

aacggtgtca gaaagttagt cattggtcaa ggcggtttac tttcaacacc agctgcttct 300

catataatta gaacatacga ggaaaagtgt accggtggtg gtatcatatt aactgcctca 360

cacaacccag gcggtccaga gaatgattta ggtatcaagt ataatttacc taatggtggg 420

ccagctccag agagtgtcac taacgctatc tgggaagcgt ctaaaaaatt aactcactat 480

aaaattataa agaacttccc caagttgaat ttgaacaagc ttggtaaaaa ccaaaaatat 540

ggcccattgt tagtggacat aattgatcct gccaaagcat acgttcaatt tctgaaggaa 600

atttttgatt ttgacttaat taaaagcttc ttagcgaaac agcgcaaaga caaagggtgg 660

aagttgttgt ttgactcctt aaatggtatt acaggaccat atggtaaggc tatatttgtt 720

gatgaatttg gtttaccggc agaggaagtt cttcaaaatt ggcacccttt acctgatttc 780

ggcggtttac atcccgatcc gaatctaacc tatgcacgaa ctcttgttga cagggttgac 840

cgcgaaaaaa ttgcctttgg agcagcctcc gatggtgatg gtgataggaa tatgatttac 900

ggttatggcc ctgctttcgt ttcgccaggt gattctgttg ccattattgc cgaatatgca 960

cccgaaattc catacttcgc caaacaaggt atttatggct tggcacgttc atttcctaca 1020

tcctcagcca ttgatcgtgt tgcagcaaaa aagggattaa gatgttacga agttccaacc 1080

ggctggaaat tcttctgtgc cttatttgat gctaaaaagc tatcaatctg tggtgaagaa 1140

tccttcggta caggttccaa tcatatcaga gaaaaggacg gtctatgggc cattattgct 1200

tggttaaata tcttggctat ctaccatagg cgtaaccctg aaaaggaagc ttcgatcaaa 1260

actattcagg acgaattttg gaacgagtat ggccgtactt tcttcacaag atacgattac 1320

gaacatatcg aatgcgagca ggccgaaaaa gttgtagctc ttttgagtga atttgtatca 1380

aggccaaacg tttgtggctc ccacttccca gctgatgagt ctttaaccgt tatcgattgt 1440

ggtgattttt cgtatagaga tctagatggc tccatctctg aaaatcaagg ccttttcgta 1500

aagttttcga atgggactaa atttgttttg aggttatccg gcacaggcag ttctggtgca 1560

acaataagat tatacgtaga aaagtatact gataaaaagg agaactatgg ccaaacagct 1620

gacgtcttct tgaaacccgt catcaactcc attgtaaaat tcttaagatt taaagaaatt 1680

ttaggaacag acgaaccaac agtccgcaca tag 1713

<210> 7

<211> 1500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 7

atgtccacta agaagcacac caaaacacat tccacttatg cattcgagag caacacaaac 60

agcgttgctg cctcacaaat gagaaacgcc ttaaacaagt tggcggactc tagtaaactt 120

gacgatgctg ctcgcgctaa gtttgagaac gaactggatt cgtttttcac gcttttcagg 180

agatatttgg tagagaagtc ttctagaacc accttggaat gggacaagat caagtctccc 240

aacccggatg aagtggttaa gtatgaaatt atttctcagc agcccgagaa tgtctcaaac 300

ctttccaaat tggctgtttt gaagttgaac ggtgggctgg gtacctccat gggctgcgtt 360

ggccctaaat ctgttattga agtgagagag ggaaacacct ttttggattt gtctgttcgt 420

caaattgaat acttgaacag acagtacgat agcgacgtgc cattgttatt gatgaattct 480

ttcaacactg acaaggatac ggaacacttg attaagaagt attccgctaa cagaatcaga 540

atcagatctt tcaatcaatc caggttccca agagtctaca aggattcttt attgcctgtc 600

cccaccgaat acgattctcc actggatgct tggtatccac caggtcacgg tgatttgttt 660

gaatctttac acgtatctgg tgaactggat gccttaattg cccaaggaag agaaatatta 720

tttgtttcta acggtgacaa cttgggtgct accgtcgact taaaaatttt aaaccacatg 780

atcgagactg gtgccgaata tataatggaa ttgactgata agaccagagc cgatgttaaa 840

ggtggtactt tgatttctta cgatggtcaa gtccgtttat tggaagtcgc ccaagttcca 900

aaagaacaca ttgacgaatt caaaaatatc agaaagttta ccaacttcaa cacgaataac 960

ttatggatca atctgaaagc agtaaagagg ttgatcgaat cgagcaattt ggagatggaa 1020

atcattccaa accaaaaaac tataacaaga gacggtcatg aaattaatgt cttacaatta 1080

gaaaccgctt gtggtgctgc tatcaggcat tttgatggtg ctcacggtgt tgtcgttcca 1140

agatcaagat tcttgcctgt caagacctgt tccgatttgt tgctggttaa atcagatcta 1200

ttccgtctgg aacacggttc tttgaagtta gacccatccc gttttggtcc aaacccatta 1260

atcaagttgg gctcgcattt caaaaaggtt tctggtttta acgcaagaat ccctcacatc 1320

ccaaaaatcg tcgagctaga tcatttgacc atcactggta acgtcttttt aggtaaagat 1380

gtcactttga ggggtactgt catcatcgtt tgctccgacg gtcataaaat cgatattcca 1440

aacggctcca tattggaaaa tgttgtcgtt actggtaatt tgcaaatctt ggaacattga 1500

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgctttctg aaaacacgac 20

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgaagctat ggtgtgtgga ttgtaatgca agacgctga 39

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcagcgtctt gcattacaat ccacacacca tagcttcaa 39

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatcatcaaa acgttggcca tcttagatta gattgctatg c 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcatagcaat ctaatctaag atggccaacg ttttgatgat t 41

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accactagaa ccagatgatg ttgagccagc gttagcagat tgg 43

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggctcaacat catctggttc tagtggtatg aagtcagaat tga 43

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttccttttcg gttagagcgg atttacataa tttcttcgaa taatttagcc aatg 54

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tattcgaaga aattatgtaa atccgctcta accgaaaagg aaggagt 47

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tatatcagtt attacccctt cgagcgtccc aaaaccttct c 41

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gttttgggac gctcgaaggg gtaataactg atataattaa attg 44

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggtcgtcaca gtagctgaca tacgaattcg agctcggtac c 41

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtaccgagc tcgaattcgt atgtcagcta ctgtgacgac c 41

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgtaatgcc caatttttcg c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgtcaggaa cattcaatga t 21

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttgaagctat ggtgtgtgga aatgggcaat gaacgaaa 38

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tttcgttcat tgcccatttc cacacaccat agcttcaa 38

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tggcatcttc ggtccccatc ttagattaga ttgctatgc 39

<210> 26

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcatagcaat ctaatctaag atggggaccg aagatgcca 39

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cttttcggtt agtgcggatt tatttcttga atgttttgat tac 43

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtaatcaaaa cattcaagaa ataaatccgc actaaccgaa aag 43

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctggtcaact tggccatctt cgagcgtccc aaaacct 37

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aggttttggg acgctcgaag atggccaagt tgaccag 37

<210> 31

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cttgcgtaga aaatgggaat tcagtcctgc tcctcgg 37

<210> 32

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccgaggagca ggactgaatt cccattttct acgcaag 37

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttacccaact atcttcaatt c 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

atgcctgcca aaatacacat t 21

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaagtcagga atctaaaata caccgctaaa cctagacca 39

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tggtctaggt ttagcggtgt attttagatt cctgacttc 39

<210> 37

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggtacagaat ctattagaag tgacatttgt ttttatattt gttg 44

<210> 38

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

caacaaatat aaaaacaaat gtcacttcta atagattctg tac 43

<210> 39

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atcattaagc cattagtaaa tcattctatg tgcggactgt tggt 44

<210> 40

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

accaacagtc cgcacataga atgatttact aatggcttaa tga 43

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gctaacattc aacgctagta tacccagttg aacaattctg gt 42

<210> 42

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

accagaattg ttcaactggg tatactagcg ttgaatgtta gc 42

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ggtgtgcttc ttagtggaca tttttgtttg tttatgtgtg tt 42

<210> 44

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aacacacata aacaaacaaa aatgtccact aagaagcaca cc 42

<210> 45

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ccaactgttc tagaatccat atacgggaca aatgtaacaa acg 43

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cgtttgttac atttgtcccg tatatggatt ctagaacagt tggt 44

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cacagtagag gctggagatt tatttgtttt ctaaataagc 40

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gcttatttag aaaacaaata aatctccagc ctctactgtg 40

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ttagctgata acgcattccg 20

Claims

1.异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：

敲除第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因并过表达二酰甘油激酶DGK1基因，得到第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；

所述二酰甘油激酶DGK1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示；

所述第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母用下述步骤构建：将优化后的糖基转移酶GTK1基因和优化后的糖基转移酶UGT1基因转入生产原人参二醇PPD的酿酒酵母，得到第一种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；

2.异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：

敲除权利要求1所述的第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的β-葡萄糖水解酶EGH1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶PGM1基因和UDP葡萄糖焦磷酸化酶UGP1基因，得到第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母；

所述β-葡萄糖水解酶EGH1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.5所示；

3.权利要求1的异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

4.权利要求2的异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母。

5.权利要求3的第二种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。

6.权利要求4的第三种异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷F2的应用。