CN113278597B - 新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用，属于生物医药领域。所述CoA连接酶为PcAAE1和PcAAE2，氨基酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示，两种酶均具有CoA连接酶的作用，PcAAE2能够催化底物生成广藿香酮合成的前体物质4‑甲基戊酰‑辅酶A，是广藿香酮合成通路中的关键合酶。本发明通过提高PcAAE1或PcAAE2的转录水平或改变其在不同组织中的表达模式，能进一步提高广藿香酮的产量，并在广藿香酮通路解析及酵母生产广藿香酮具有较强的理论基础和广泛的应用价值。

Description

新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用。

背景技术

广藿香(Pogostemonis Herba)，也称作藿香、山茴香等，是唇形科刺蕊草属植物，多年生芳香草本，株高50～150cm，老茎粗1～1.2cm，叶片对生圆形，叶脉下陷，叶表皱缩，叶两面被柔毛。轮伞花序多花，花期为6～9个月。广藿香植物，原产于印度、马来西亚、越南等东南亚国家，在宋代传入我国，主要在台湾地区、海南，广东、福建等地栽培。广藿香地上部分药用，具有多种药理活性，芳香化浊、开胃止呕、发表解暑等功效。广藿香的应用价值在于它的精油。广藿香精油被广泛用于香水、香料、洗发水、香皂等产品。广藿香精油用于芳香疗法，可以缓解抑郁、压力、镇定神经、控制食欲和提高性欲。广藿香精油除了具有杀虫、抗病原菌、抗真菌性能外，还具有其他一些生物学活性，如抗病毒、抗氧化剂、镇痛、抗炎、抗血小板、抗血栓形成、抗诱变、止吐、抗纤溶和细胞毒素等。

广藿香精油含有大量的次生代谢物，主要化学成分是广藿香醇(Patchoulicalcohol)和广藿香酮(Pogostone)，是广藿香芳香气味的重要来源。广藿香酮是广藿香药材的有效药用成分之一，广藿香酮主要在植物的茎和叶片中合成。研究表明，广藿香酮是广藿香药材抗病原微生物活性的有效成分。

目前广藿香酮的合成通路还未被解析，广藿香酮是由4-甲基-戊酰侧链和4-羟基-6-甲基-2- 吡喃酮核心环两部分构成。据推测，4-甲基-戊酰侧链的前体物质4-甲基-戊酰辅酶A(4MVCoA) 来源于短侧链脂肪酸的延伸。4-甲基-戊酰辅酶A是由酰基激活酶(AAE)超家族成员通过两步机制激活羧酸形成。首先，通过ATP焦磷酸化，将羧酸基团腺苷化，形成酶联的酰基-CoA 中间体，然后AMP被辅酶A基团取代，形成相应的酰基-CoA硫酯。AAE(Acyl-activating enzymes,酰基激活酶)超家族具有12个碱基的保守区域，即AMP连接框，是AAE超家族的典型特征。有研究发现羧酸和其它植物激素能被偶联到AAE家族的碱基上。广藿香酮主要从广藿香植物叶片提取，材料的获取受到广藿香种植地域限制，同时涉及复杂的提取过程和高昂的成本。尽管广藿香酮可以通过化学方法合成，但是产率和成本限制了其在工业和医药行业的大规模应用。因此对广藿香酮代谢途径的解析是解决这种具有重要经济价值和药用价值的次生代谢化合物在工业和医药行业大规模应用需求的有效途径。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶，本发明的目的之二在于提供短侧链脂肪酸CoA连接酶在制备广藿香酮中的应用，本发明的目的之三在于提供一种同源蛋白，本发明的目的之四在于提供含有PcAAE1或PcAAE2核苷酸序列的重组载体，本发明的目的之五在于提供一种重组蛋白，本发明的目的之六在于提供一种用于制备 4-甲基-戊酰基间苯三酚的重组酵母菌，本发明的目的之七在于提供一种体外制备4-甲基-戊酰辅酶A的方法，本发明的目的之八在于提供一种体外制备异戊酰辅酶A的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、新型短侧链脂肪酸CoA连接酶，所述脂肪酸CoA连接酶为PcAAE1或PcAAE2，所述PcAAE1是去除信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述PcAAE2的氨基酸序列如SEQID NO:12所示，所述PcAAE1和PcAAE2具有短链脂肪酸CoA连接酶活性。

作为优选的技术方案之一，所述PcAAE1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述PcAAE2 核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2、所述短侧链脂肪酸CoA连接酶在制备广藿香酮中的应用。

3、一种同源蛋白，所述同源蛋白与所述短侧链脂肪酸CoA连接酶相比具有至少90％的氨基酸序列或核苷酸序列相同，并且具有与所述短侧链脂肪酸CoA连接酶相同的生物学功能。

4、含有所述PcAAE1或PcAAE2核苷酸序列的重组载体。

5、一种重组蛋白，所述重组蛋白为通过所述重组载体导入工程菌中所表达。

6、一种用于制备4-甲基-戊酰基间苯三酚的重组酵母菌，所述重组酵母菌中含有HIVPS 的重组质粒和所述PcAAE1或PcAAE2的重组载体。

作为优选的技术方案之一，所述HIVPS的基因序列如SEQ ID NO:17所示。

7、一种体外制备4-甲基-戊酰辅酶A的方法，所述方法为，PcAAE2以4-甲基戊酸和辅酶A为底物，25℃下反应15min，分离纯化，即可得到4-甲基-戊酰辅酶A。

8、一种体外制备异戊酰辅酶A的方法，所述方法为，PcAAE1以异戊酸和辅酶A为底物，25℃下反应15min，分离纯化，即可得到异戊酰辅酶A。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了两种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶PcAAE1和PcAAE2，两种蛋白均具有 CoA连接酶的作用。PcAAE2能够催化底物生成广藿香酮合成的前体物质4-甲基戊酰-辅酶 A，是广藿香酮合成通路中的关键合成酶。在酵母菌中同时表达PcAAE2(或PcAAE1)和HIVPS蛋白可以生产4-甲基-戊酰基间苯三酚(PIHP)。通过提高PcAAE2的转录水平或改变其在不同组织中的表达模式，能进一步提高广藿香酮的产量。PcAAE2蛋白能够特异性的识别4-甲基戊酸，且活性高，有利于促进广藿香酮合成通路中其它酶功能的表征如聚酮合酶，为实现利用合成生物学方法在异源表达系统重建广藿香酮合成通路奠定基础，最终实现大量合成广藿香酮的目标。本发明在广藿香酮通路解析及酵母生产广藿香酮具有较强的理论基础和广泛的应用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为广藿香酮在广藿香植物不同发育时期的代谢组分析结果，A为广藿香植物的不同发育时期形态，B为广藿香植物在不同发育时期的广藿香酮含量。

图2为PcAAE2和PcAAE1基因在广藿香植物的不同发育时期的表达模式，A为PcAAE1基因在藿香不同发育时期各发育器官的表达情况，B为PcAAE2基因在藿香不同发育时期各发育器官的表达情况。

图3为PcAAE1和PcAAE2蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图4为在酵母菌中共表达PcAAE2和HIVPS蛋白生成PIHP的结果图及质谱图，A为结果图，B为质谱图。

图5为PcAAE1和PcAAE2蛋白体外活性分析，A为PcAAE2蛋白作用底物4-甲基戊酸生成4-甲基-戊酰辅酶A，PcAAE1蛋白以异戊酸为底物生成异戊酰辅酶A，B为两种酶作用不同底物生成产物的质谱图。

具体实施方式

以下实施方案所涉及的方法有利于更好的理解本发明，但并不限定本发明。在实施例中所用的实验材料，无特殊说明均从常规生化试剂公司购买。以下定量及酶活实验均为三次重复，结果取平均值。本发明所用的pESC，pET-28a载体和酵母菌株YPH499均由中科院遗传与发育生物学研究所提供。pESC载体包括四个载体分别是pESC-His、pESC-Leu、pESC-Ura 和pESC-Trp，本研究主要使用了pESC-His和pESC-Leu两种载体。

实施例1

广藿香酮在广藿香植物不同发育时期的代谢组分析

图1中A为不同发育时期的广藿香植物，主要包括幼苗期、5周大小的根茎叶、6周、7周和8周时期植物的根、茎和叶。用化学试剂MTBE提取广藿香植物不同发育时期的广藿香酮，用GC-MS检测广藿香酮的含量，结果如图1中B所示，广藿香酮主要在幼苗期、5周和6周大小植物的幼嫩叶和茎中含量较高，但在根及老叶中含量较低。

实施例2

PcAAE1、PcAAE2基因序列的发现及不同发育时期的表达模式

(1)PcAAE1、PcAAE2基因序列的发现

提取广藿香植物在不同发育时期及不同器官的RNA，构建RNAseq库，主要包括幼苗期、 5周大小的根茎叶、8周时从植物顶端依次向下的顶端叶，第二片叶和第三片叶。通过RNA 文库与拟南芥AAEs(Acyl-activating enzymes,酰基激活酶)超家族比对，找到31个潜在的广藿香AAEs超家族基因。AAEs超家族共有六个分支，已报道分支VI的基因可能对短链脂肪酸活性较高，进化树分析发现广藿香中有8个基因属于AAEs亚家族VI的分支PcAAE1～8。

分别利用引物SEQ ID NO:1～4获得广藿香植物PcAAE1和PcAAE2基因序列，去除信号肽的PcAAE1的核苷酸序列，如SEQ ID NO:5所示，PcAAE2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

PcAAE1-F：ATGAGCCAGATTTTGCGGCG(SEQ ID NO:1)

PcAAE1-R：TCAAGAGAGACTGCCAAGGGC(SEQ ID NO:2)

PcAAE2-F：ATGGAGGGTGTGGTCAAGTGTC(SEQ ID NO:3)

PcAAE2-R：TCAAGAAAGGCTGCCCATGG(SEQ ID NO:4)

利用实时荧光定量PCR的方法检测PcAAE1及PcAAE2在广藿香植物不同发育时期的转录水平，引物序列如SEQ ID NO:7～10所示，主要包括幼苗期，5周大小的顶端叶、茎和根，6周大小的顶端叶、茎及根，7周、8周和9周大小的顶端叶和第二片叶。

PcAAE1-RT-F:GGTTGCTGAACGGCGTAC(SEQ ID NO:7)

PcAAE1-RT-R:CACCTTCCCAGCTCGCTC(SEQ ID NO:8)

PcAAE2-RT-F:GCACCACCGTTGTCTTCAG(SEQ ID NO:9)

PcAAE2-RT-R:GGTCTTGGCGAGTGTTCAAC(SEQ ID NO:10)

结果如图2中的A、B所示，PcAAE1基因在藿香不同发育时期及不同发育器官均有表达，并没有表现出明显的组织差异，但PcAAE2在不同组织的表达有明显差异，该基因在幼苗期表达量最高，在幼嫩的叶和茎中表达量较高，而在根中表达量较低，PcAAE2基因的表达模式与广藿香酮在不同组织中的积累成正相关关系。

实施例3

PcAAE1和PcAAE2蛋白的表达和纯化

为了纯化出有蛋白活性的PcAAE1，需要去除该基因的信号肽序列，获得PcAAE1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，PcAAE2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，用引物扩增PcAAE1的目标片段，

PcAAE1-pETN-F：

PcAAE1-pETN-R：

用以下引物扩增PcAAE2的目的片段，

PcAAE2-pETN-F：

PcAAE2-pETN-R：

将获得的PcAAE1和PcAAE2的目的片段分别进行切胶回收，用

 HiFiDNA Assembly Cloning Kit试剂盒进行同源重组，将胶回收产物分别与NdeI和BamHI双酶切的 pET28a空载体连接；将连接产物转化至JM109感受态中，涂在含有50μg/mL的卡那霉素的板上进行筛选；挑选单菌落进行PCR鉴定，将扩增出目的片段的菌株进行摇菌，送测序，测序正确即为阳性菌株，命名为重组质粒pET-28a-AAE1和pET-28a-AAE2。

将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，涂在含有50μg/mL的卡那霉素的板上，37℃培养箱过夜培养；挑单菌落于3mL的K⁺抗性的液体LB中，放置于37℃摇床220rpm 振荡培养10h，按1:100的比例，吸取1mL菌液于100mL的K⁺抗性的液体LB中，进行扩摇；振荡培养2-3h，测菌液OD₆₀₀大约在0.3-0.6时，加入0.1mM的IPTG，16℃180rpm 过夜培养；8000rpm离心5min收集菌体，加入10mL的PBS缓冲液，重悬菌体，按说明书破碎细胞；使用Qiagen公司的His-tag蛋白纯化试剂盒，分别纯化出PcAAE1和PcAAE2蛋白；对上述蛋白进行SDS-PAGE电泳，PcAAE2和PcAAE1蛋白电泳结果如图3所示。

实施例4

酵母菌中共表达PcAAE2和HIVPS蛋白生成PIHP

将PcAAE2基因插入pESC-Leu载体的多克隆位点获得pESC-Leu-AAE2重组质粒。同时将HIVPS蛋白导入pESC-His载体，得到重组质粒pESC-His-VPS，HIVPS基因序列如SEQ IDNO:17所示。具体步骤如下：

(1)构建pESC-Leu-AAE2和pESC-His-VPS的表达载体

以2周大小的广藿香植物的幼叶cDNA为模板，使用引物PcAAE2-Leu-F和PcAAE2-Leu-R扩增出PcAAE2基因片段，以HIVPS质粒为模板，使用引物VPS-His-F和 VPS-His-R扩增出HIVPS基因片段。分别连接至Not I和Bcu I双酶切的pESC-Leu和pESC-His 空载体中，切胶回收；将基因的目的片段与载体的胶回收产物在TAKARA

 HD Cloning Kit试剂盒条件下进行同源重组反应；将连接产物转化至JM109感受态中，涂在含有 50μg/mL氨苄青霉素的平板上筛选，挑选单克隆菌株，做菌落PCR，将扩增出目的片段的菌株送测序，测序正确后方可认定为阳性菌株，即获得重组载体pESC-Leu-AAE2和 pESC-His-VPS。

PcAAE2-Leu-F：

PcAAE2-Leu-R：

VPS-His-F：

VPS-His-R：

(2)将重组质粒pESC-Leu-AAE2和pESC-His-VPS导入酿酒酵母YPH499菌株中获得重组菌

使用LiAc法制备酵母菌株YPH499的酵母感受态细胞；在50μL的酵母感受态细胞中，依次加入240μL的PEG(50％W/V)，36μL的1M的LiAc，5μL的SS-DNA，最后加入5μL 的pESC-Leu-AAE2和5μL的pESC-His-VPS质粒，最后用水补足至360μL；剧烈振荡，直至无块状酵母沉淀，放置30℃的培养箱培养30min，每间隔10min，上下颠倒混匀一次；42℃水浴热击20min，8000rpm离心30s去除上清，加入500μL的无菌水，枪头轻轻吹打重悬酵母沉淀；吸取100μL菌液涂板，SD缺陷平板(缺亮氨酸和组氨酸)；将酵母平板放置30℃的恒温培养箱中培养2-4天，观察酵母在缺陷培养基上的生长状态。

SD缺陷培养基的配方：6.7g酵母氮源(无氨基酸)、20g葡萄糖、1.3g氨基酸缺陷的粉末、40μg色氨酸、20mg尿嘧啶，蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌15min；

(3)重组菌生产4-甲基-戊酰基间苯三酚(PIHP)

从SD缺陷培养基上挑取单菌落于3mL的液体SD培养基中，28℃180rpm振荡培养2d；吸取1mL的以上活化的重组菌于20mL的SD培养液中，过夜振荡培养，当OD₆₀₀为1.0-1.3 时，1000g离心5min收集菌体，用无菌水洗涤菌体2-3次；吸取以上菌体至20mL的半乳糖诱导的SG培养液中(SG诱导培养基是用20g的半乳糖替换葡萄糖，其它成分和SD缺陷培养基相同)，同时加入0.2mM的4-甲基戊酸；振荡培养3-4d，离心收集上清；预处理之后用UHPLC-QTOF-MS检测目标产物PIHP。

(4)超高效-四极杆飞行时间质谱联用仪(UHPLC-QTOF-MS)检测PIHP

取3mL的上清，按1:1的比例加入乙酸乙酯(含5μM的柚皮素作为内标，英文名Naringenin)，涡旋振荡，室温放置30min，10000g离心10min，取上清至5mL的玻璃管中，用氮吹仪吹干，加入300μL甲醇溶解，之后用甲醇溶液稀释5倍，滤膜过滤，取100μL 用UHPLC-QTOF-MS跑样；

UHPLC-QTOF-MS色谱条件，梯度洗脱：溶剂A为0.1％体积比的甲酸水溶液，溶剂B为纯乙腈；洗脱过程：开始洗脱液为溶剂A，在0-0.5min时溶剂B洗脱液由0上升到40％，溶剂A在洗脱液中的体积由100％下降到60％；在0.5-2.5min溶剂A占洗脱液的60％，溶剂 B的体积比是40％；在2.5-3.5min时溶剂B在洗脱液中的体积从40％上升至100％，溶剂A 的体积比显著下降至0；从3.5-4.5min时洗脱液为100％的溶剂A；从4.5-4.51min溶剂A在洗脱液的占比由0％线性增加至100％，溶剂B则由100％线性下降至0％；4.51-6min洗脱液为100％的溶剂A；

结果如图4中A所示，分别转化PcAAE2和HIVPS质粒并没有目标产物的生成，当同时把PcAAE2和HIVPS转入酵母中不加底物4-甲基戊酸时，只生成异戊酰基间苯三酚(PIVP)，当加入底物4-甲基戊酸时可以同时生成PIVP和PIHP，且PIHP的产量明显高于PIVP。PIVP 和PIHP的质谱图如图4中B所示，PIVP的相对保留时间是1.79min，PIHP的相对保留时间在2.49min。

实施例5

PcAAE1和PcAAE2蛋白的底物特异性检测

AMP偶联的酶促反应体系：0.1M Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl₂，1mM磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate)，5mM ATP，0.4mM NADH，4U肌激酶，4U乳酸脱氢酶， 4U丙酮酸激酶，0.5mM辅酶A，0.2mM游离酸的底物和1μg纯化的目标蛋白，最后用水补足至200μL。酶标仪检测NAD⁺在340纳米波长的吸光度，共运行15min，每间隔1min 检测一次吸光值。

检测PcAAE1和PcAAE2两种蛋白对十二种不同的短链脂肪酸的活性(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、4-甲基戊酸、5-甲基己酸、庚酸、辛酸和苯甲酸)。

结果如表1所示，PcAAE1对底物异戊酸的活性最高，其次是丁酸，而PcAAE2蛋白对4-甲基戊酸的活性最高，对异戊酸和丁酸的活性次之，以最高酶活为100％计算PcAAE1和PcAAE2蛋白对游离酸底物的酶活。

表1 PcAAE1和PcAAE2蛋白对不同游离酸的活性

实施例6

PcAAE1和PcAAE2蛋白具有短侧链脂肪酸CoA连接酶的催化活性

构建AMP偶联的酶促反应体系：0.1M Tris-HCl(PH 7.5)，10mM MgCl₂，1mM磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate)，5mM ATP，0.4mM NADH，4U肌激酶，4U乳酸脱氢酶，4U丙酮酸激酶，1mM辅酶A，不同浓度的游离酸的底物和1μg纯化的目标蛋白，用水补足至200μL；

(1)蛋白PcAAE1对底物丁酸和异戊酸的K_m和K_cat，固定1mM的辅酶A和5mM的 ATP浓度，对底物设置8个不同浓度梯度，分别是1mM、0.8mM、0.6mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、0.05mM和0.025mM；

(2)蛋白PcAAE2对底物丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、4-甲基戊酸、庚酸和5-甲基己酸的K_m和K_cat，按照(2)中方法固定辅酶A和ATP的浓度，对每种底物设置相同的浓度梯度；

按照AMP偶联的酶促反应体系加入目标蛋白(PcAAE1或PcAAE2)和底物，25℃下反应15min。酶标仪检测NAD⁺在340nm波长的吸光度，共运行15min，间隔1min检测一次吸光值；以上实验均进行三次重复，求平均值。

结果如表2所示，PcAAE1对底物异戊酸的催化效率最高K_cat/K_m为332937±7532M^{– 1}s^–1，而PcAAE2蛋白对4-甲基-戊酸的催化活性最高K_cat/K_m为51854±2765M^–1s^–1，其次是戊酸37288±436M^–1s^–1。

表2 PcAAE1和PcAAE2蛋白的短侧链脂肪酸CoA连接酶的催化活性

实施例7

PcAAE1和PcAAE2蛋白体外活性分析

配置酶促反应体系：0.1M Tris-HCl(PH 7.5)，10mM MgCl₂，5mM ATP，0.5mM CoA，1)加入0.2mM的4-甲基戊酸和10μg的PcAAE2蛋白，最后用水补足至200μL；2)加入 0.2mM的异戊酸和10μg的PcAAE1蛋白，最后用水补足至200μL；以失活的PcAAE1和 PcAAE2蛋白为对照，即98℃沸水浴煮5min。酶促反应条件为25℃，15min。

酶促反应产物的检测：

200μL的反应液加入200μL的甲醇，涡旋混匀，13000rpm离心5min，取上清用0.45μm滤膜过滤，取100μL用UHPLC-QTOF-MS仪器跑样；

UHPLC-QTOF-MS(Agilent,6545LC/QTOF-MS)C18柱(超高效液相色谱柱C18,Φ2.1× 50mm,1.8μm)；

UHPLC-QTOF-MS色谱条件：梯度洗脱：溶剂A为0.1％体积比的甲酸水溶液，溶剂B为甲醇，流速是0.5毫升/分钟；洗脱过程：开始洗脱液为溶剂A，在0-0.5min时溶剂B洗脱液由0上升到40％，溶剂A在洗脱液中的体积由100％下降到60％；在0.5-2.5min溶剂A 占洗脱液的60％，溶剂B的体积比是40％；在2.5-3.5min时溶剂B在洗脱液中的体积从40％上升至100％，溶剂A的体积比显著下降至0；从3.5-4.5min时洗脱液为100％的溶剂A；从 4.5-4.51min溶剂A在洗脱液的占比由0％线性增加至100％，溶剂B则由100％线性下降至 0％；4.51-6min洗脱液为100％的溶剂A；

质谱设定范围是200-1000m/z，正负离子模式扫描时间100ms。

结果如图5中A所示，PcAAE2蛋白作用底物4-甲基戊酸生成4-甲基-戊酰辅酶A，PcAAE1蛋白作用底物异戊酸生成异戊酰辅酶A；图5中B为不同酶作用不同底物产物的质谱图，CoA是766.11(m/z),异戊酰辅酶A是850.13(m/z)和4-甲基-戊酰辅酶A是864.12(m/z)。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagccaga ttttgcggcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaagagaga ctgccaaggg c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagggtg tggtcaagtg tc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaagaaagg ctgcccatgg 20

<210> 5

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagggta tggtgaggtg tccggcgaat tacgtggcgt tatcccccat aagctttctg 60

gagcgagctg ggaaggtgta cagggatacc acttccattg tgtacggttc tgtgaggtat 120

acttgggagc agactcgact cagatgcact caactcgctt ctgcactcac tcgattaggg 180

atctcttatg gtgatgtggt agcaacactg gcgcctaaca taccagcaat gcaagagctg 240

cattttgctg tacccatggc cggagccgtt atttgcacgc tcaacactcg ccacgactcc 300

aacatgatct ctatcctcct ccaacattcc gacagtaaga tcatctttgt agatcaccac 360

ttgctcccca ttgctcaagg agctttccat cttcttgctc aaaacaaaat caaaccacca 420

atcctcgtac tgatttcaga acatggtgct ccaaatccca cctttccccc ttgggaaact 480

cacgactatg agactcttct atccagtgga gatgctgatt acatcgccaa acggccaaga 540

accgagtggg atcccatcag tgtcaactac acgtcaggca ccacgtctcg tcccaaaggg 600

gtggtttaca accacagagg agcgtacctt aatgctctgg caacggcatc cattcatggg 660

atgagctcca tgcctgtata cctttggaca gtgcccatgt tccattgtaa tgggtggtgc 720

ttgatctggg gcatggctgc tttgggtggg accaacatct gcctcaggca agtctcccct 780

aaggagatct ttcaaagcat tgttatgcac caggtcacac acatgggagg ggctccaact 840

gtgttgaaca tgatcataaa ttcgagtgat cggaagcccc tgcctcacag ggtagacata 900

atgacgggtg gctcacctcc gcccccctcg atcctttccc agattgagga acttggtttc 960

cgagtatccc acttgtacgg tcttacagag acgtacgggc caggcacatc gtgcgtgtgg 1020

aagcccgagt gggatgccct gcctcgcgaa gagcagtaca ggctcaaggc gaggcagggc 1080

gtggagcatt atggtctcga ggaagttgat gttattaacc ctgccaccat ggagagtgtg 1140

cctgcagatg gtgcaacaat gggtgagata atgtttagag gaaacactgt aatgagtgga 1200

taccttaaag atgtgaaagc cacggaagaa gcctttaaag gagggtggtt tagaagtggt 1260

gatcttgctg tgaaacatga gaatgggtac atagaagtga aggacagagc gaaagacatc 1320

gtgatatccg gtggggagaa cataagtaca gtcgaagtag agacggtctt gtatcgccac 1380

ccggcggttc ttgaggccgc ggtggttgca aggccggata aacactgggg gcagacgcca 1440

tgtgcgttcg ttaaattaaa agacgggttt gagcttagct cgaaggagat aatagacttc 1500

tgtagagacc gtttgcctca ttacatggca cctcggagtg ttgtctttga ggagttgcca 1560

aaaacctcca ctggtaagat tcaaaagttc atcctcagag agaaagcaaa agcccttggc 1620

agtctctctt ga 1632

<210> 6

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggagggtg tggtcaagtg tcctgcaaat tacgtcccgt tgacgccgat aagctttctg 60

aaccgagctg ccaaggtcta ccgcgatgca acttccgttg tctacggttc tatcagattc 120

acttgggcgc agacgcacca ccgttgtctt cagctcgcct ctgcattgac caaattaggg 180

gtttctcgtg gtgatgtgat agcaactttg gcccctaaca taccagcaat gcttgagctg 240

catttcgctg taccgatggc cggcgccgtt atttgcccgt tgaacactcg ccaagacctc 300

aacatgatct ctgtcctgct ccaacattca gaatctaaga tcatcttcgt ggatcaccag 360

ttcctccagc ttgctcgacg agcatgcaat cttctagcag aaaagaaaat caaaccacca 420

acgctcgtgc tgattcctga acttggcacc ccaattccta gctattcttg ttcggatact 480

catgattatg agactctcgt agctagtgga gatgctgaat acatcaccaa acggcctaaa 540

accgagtggg atcctatcag tatcaactat acatctggca ccacgtctcg tcccaaaggg 600

gtggtttata accatagagg agtatacctt aatgctatgg caacaacatc tcttcatggg 660

atgagttcga cgtctgtcta cctttggaca gtgccgatgt tccactgcaa cgggtggtcc 720

ctgatctggg gcttggctgc tttgggtggg actaacattt gcctcaggaa agtttccccc 780

aaggaaatct ttgaaagcat tgtgctcaac aaggtcactc acatgggagg ggctccgact 840

gtcttaaaca tgattgtaaa tgccagtgat ctgaagcccc tgtctcacaa ggttgatata 900

atgactgggg ggtcatcacc accaccatcg atcctttcca agagcgagga gcttggtttc 960

cgaacattgc acgcttatgg acttacagaa cttaatgggg tagccatgac atgcatgtgg 1020

aagcccgagt gggatacctt gcctcgcgaa gagcagtaca agctcaaggc aaggcaagga 1080

atccaccatt atgctataga ggaagccgat gttatcgact ctgccaccat ggagagtgta 1140

cctgcagatg gcaaatcaat gggtgaggta atgtttagag gaaacactgt aatgggtgga 1200

taccttaaag atgtaaaagc cacagaagaa gctttgaaag gtgggtggtt tagaactggt 1260

gatctcgccg tgaaacatga tgatggctac atagaagtga aagacagatt aaaagacatc 1320

ataatatctg gtggagaaaa cataagtaca attgaattag agtcagtttt gtacagtcat 1380

cccgccgtgt ttgaagcagc ggttgtcgca agaccggatg atcactgggg ggagacaccc 1440

tgtgtattta tgaagttgaa agacggattt gagcttagtt ccaaggaggt aatagacttc 1500

tgccgagacc atttgcctca ttacatagca cctcggacag tcgtttttga ggatttgcca 1560

aaaaactcga ctggtaagat tcaaaaattt gtcctcaggg agaaagcaaa agccatgggc 1620

agcctttctt ga 1632

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggttgctgaa cggcgtac 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccttccca gctcgctc 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaccaccgt tgtcttcag 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtcttggcg agtgttcaac 20

<210> 11

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Glu Gly Met Val Arg Cys Pro Ala Asn Tyr Val Ala Leu Ser Pro

1               5                   10                  15

Ile Ser Phe Leu Glu Arg Ala Gly Lys Val Tyr Arg Asp Thr Thr Ser

            20                  25                  30

Ile Val Tyr Gly Ser Val Arg Tyr Thr Trp Glu Gln Thr Arg Leu Arg

        35                  40                  45

Cys Thr Gln Leu Ala Ser Ala Leu Thr Arg Leu Gly Ile Ser Tyr Gly

    50                  55                  60

Asp Val Val Ala Thr Leu Ala Pro Asn Ile Pro Ala Met Gln Glu Leu

65                  70                  75                  80

His Phe Ala Val Pro Met Ala Gly Ala Val Ile Cys Thr Leu Asn Thr

                85                  90                  95

Arg His Asp Ser Asn Met Ile Ser Ile Leu Leu Gln His Ser Asp Ser

            100                 105                 110

Lys Ile Ile Phe Val Asp His His Leu Leu Pro Ile Ala Gln Gly Ala

        115                 120                 125

Phe His Leu Leu Ala Gln Asn Lys Ile Lys Pro Pro Ile Leu Val Leu

    130                 135                 140

Ile Ser Glu His Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe Pro Pro Trp Glu Thr

145                 150                 155                 160

His Asp Tyr Glu Thr Leu Leu Ser Ser Gly Asp Ala Asp Tyr Ile Ala

                165                 170                 175

Lys Arg Pro Arg Thr Glu Trp Asp Pro Ile Ser Val Asn Tyr Thr Ser

            180                 185                 190

Gly Thr Thr Ser Arg Pro Lys Gly Val Val Tyr Asn His Arg Gly Ala

        195                 200                 205

Tyr Leu Asn Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ile His Gly Met Ser Ser Met

    210                 215                 220

Pro Val Tyr Leu Trp Thr Val Pro Met Phe His Cys Asn Gly Trp Cys

225                 230                 235                 240

Leu Ile Trp Gly Met Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn Ile Cys Leu Arg

                245                 250                 255

Gln Val Ser Pro Lys Glu Ile Phe Gln Ser Ile Val Met His Gln Val

            260                 265                 270

Thr His Met Gly Gly Ala Pro Thr Val Leu Asn Met Ile Ile Asn Ser

        275                 280                 285

Ser Asp Arg Lys Pro Leu Pro His Arg Val Asp Ile Met Thr Gly Gly

    290                 295                 300

Ser Pro Pro Pro Pro Ser Ile Leu Ser Gln Ile Glu Glu Leu Gly Phe

305                 310                 315                 320

Arg Val Ser His Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Tyr Gly Pro Gly Thr

                325                 330                 335

Ser Cys Val Trp Lys Pro Glu Trp Asp Ala Leu Pro Arg Glu Glu Gln

            340                 345                 350

Tyr Arg Leu Lys Ala Arg Gln Gly Val Glu His Tyr Gly Leu Glu Glu

        355                 360                 365

Val Asp Val Ile Asn Pro Ala Thr Met Glu Ser Val Pro Ala Asp Gly

    370                 375                 380

Ala Thr Met Gly Glu Ile Met Phe Arg Gly Asn Thr Val Met Ser Gly

385                 390                 395                 400

Tyr Leu Lys Asp Val Lys Ala Thr Glu Glu Ala Phe Lys Gly Gly Trp

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Gly Asp Leu Ala Val Lys His Glu Asn Gly Tyr Ile Glu

            420                 425                 430

Val Lys Asp Arg Ala Lys Asp Ile Val Ile Ser Gly Gly Glu Asn Ile

        435                 440                 445

Ser Thr Val Glu Val Glu Thr Val Leu Tyr Arg His Pro Ala Val Leu

    450                 455                 460

Glu Ala Ala Val Val Ala Arg Pro Asp Lys His Trp Gly Gln Thr Pro

465                 470                 475                 480

Cys Ala Phe Val Lys Leu Lys Asp Gly Phe Glu Leu Ser Ser Lys Glu

                485                 490                 495

Ile Ile Asp Phe Cys Arg Asp Arg Leu Pro His Tyr Met Ala Pro Arg

            500                 505                 510

Ser Val Val Phe Glu Glu Leu Pro Lys Thr Ser Thr Gly Lys Ile Gln

        515                 520                 525

Lys Phe Ile Leu Arg Glu Lys Ala Lys Ala Leu Gly Ser Leu Ser

    530                 535                 540

<210> 12

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Glu Gly Val Val Lys Cys Pro Ala Asn Tyr Val Pro Leu Thr Pro

1               5                   10                  15

Ile Ser Phe Leu Asn Arg Ala Ala Lys Val Tyr Arg Asp Ala Thr Ser

            20                  25                  30

Val Val Tyr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Trp Ala Gln Thr His His Arg

        35                  40                  45

Cys Leu Gln Leu Ala Ser Ala Leu Thr Lys Leu Gly Val Ser Arg Gly

    50                  55                  60

Asp Val Ile Ala Thr Leu Ala Pro Asn Ile Pro Ala Met Leu Glu Leu

65                  70                  75                  80

His Phe Ala Val Pro Met Ala Gly Ala Val Ile Cys Pro Leu Asn Thr

                85                  90                  95

Arg Gln Asp Leu Asn Met Ile Ser Val Leu Leu Gln His Ser Glu Ser

            100                 105                 110

Lys Ile Ile Phe Val Asp His Gln Phe Leu Gln Leu Ala Arg Arg Ala

        115                 120                 125

Cys Asn Leu Leu Ala Glu Lys Lys Ile Lys Pro Pro Thr Leu Val Leu

    130                 135                 140

Ile Pro Glu Leu Gly Thr Pro Ile Pro Ser Tyr Ser Cys Ser Asp Thr

145                 150                 155                 160

His Asp Tyr Glu Thr Leu Val Ala Ser Gly Asp Ala Glu Tyr Ile Thr

                165                 170                 175

Lys Arg Pro Lys Thr Glu Trp Asp Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Thr Ser

            180                 185                 190

Gly Thr Thr Ser Arg Pro Lys Gly Val Val Tyr Asn His Arg Gly Val

        195                 200                 205

Tyr Leu Asn Ala Met Ala Thr Thr Ser Leu His Gly Met Ser Ser Thr

    210                 215                 220

Ser Val Tyr Leu Trp Thr Val Pro Met Phe His Cys Asn Gly Trp Ser

225                 230                 235                 240

Leu Ile Trp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn Ile Cys Leu Arg

                245                 250                 255

Lys Val Ser Pro Lys Glu Ile Phe Glu Ser Ile Val Leu Asn Lys Val

            260                 265                 270

Thr His Met Gly Gly Ala Pro Thr Val Leu Asn Met Ile Val Asn Ala

        275                 280                 285

Ser Asp Leu Lys Pro Leu Ser His Lys Val Asp Ile Met Thr Gly Gly

    290                 295                 300

Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ile Leu Ser Lys Ser Glu Glu Leu Gly Phe

305                 310                 315                 320

Arg Thr Leu His Ala Tyr Gly Leu Thr Glu Leu Asn Gly Val Ala Met

                325                 330                 335

Thr Cys Met Trp Lys Pro Glu Trp Asp Thr Leu Pro Arg Glu Glu Gln

            340                 345                 350

Tyr Lys Leu Lys Ala Arg Gln Gly Ile His His Tyr Ala Ile Glu Glu

        355                 360                 365

Ala Asp Val Ile Asp Ser Ala Thr Met Glu Ser Val Pro Ala Asp Gly

    370                 375                 380

Lys Ser Met Gly Glu Val Met Phe Arg Gly Asn Thr Val Met Gly Gly

385                 390                 395                 400

Tyr Leu Lys Asp Val Lys Ala Thr Glu Glu Ala Leu Lys Gly Gly Trp

                405                 410                 415

Phe Arg Thr Gly Asp Leu Ala Val Lys His Asp Asp Gly Tyr Ile Glu

            420                 425                 430

Val Lys Asp Arg Leu Lys Asp Ile Ile Ile Ser Gly Gly Glu Asn Ile

        435                 440                 445

Ser Thr Ile Glu Leu Glu Ser Val Leu Tyr Ser His Pro Ala Val Phe

    450                 455                 460

Glu Ala Ala Val Val Ala Arg Pro Asp Asp His Trp Gly Glu Thr Pro

465                 470                 475                 480

Cys Val Phe Met Lys Leu Lys Asp Gly Phe Glu Leu Ser Ser Lys Glu

                485                 490                 495

Val Ile Asp Phe Cys Arg Asp His Leu Pro His Tyr Ile Ala Pro Arg

            500                 505                 510

Thr Val Val Phe Glu Asp Leu Pro Lys Asn Ser Thr Gly Lys Ile Gln

        515                 520                 525

Lys Phe Val Leu Arg Glu Lys Ala Lys Ala Met Gly Ser Leu Ser

    530                 535                 540

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggtgccgcg cggcagccat atggagggta tggtgaggtg tcc 43

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcgacggag ctcgaattcg agagagactg ccaagggctt ttg 43

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggtgccgcg cggcagccat atggagggtg tggtcaagtg tc 42

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtcgacggag ctcgaattcg agaaaggctg cccatggctt ttg 43

<210> 17

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggcgtccg taactgtaga gcaaatccga aaggctcagc gagctgaagg tccggccacc 60

atcctcgcca ttggcaccgc cgttcctgcc aactgtttca accaagctga ttttcccgac 120

tactactttc gtgtcaccaa aagtgaacac atgactgatc tcaaaaagaa gttccaacga 180

atgtgtgaaa aatccactat aaaaaagcgt tacttgcact tgaccgaaga gcatctgaag 240

cagaacccac atctgtgcga gtacaatgca ccatctctga acacacgcca agacatgttg 300

gtggttgaag ttcccaagct tgggaaggag gctgcaatca atgccatcaa agaatggggc 360

caacccaagt ccaagatcac ccatctcatc ttctgcaccg gctcctccat cgacatgcca 420

ggagccgatt accaatgcgc caagcttctc ggcctccgac cctcggtgaa gcgagtgatg 480

ctgtatcaac tcggctgtta tgccggtgga aaagttcttc gcatagccaa ggacatagca 540

gagaacaaca agggcgctag agttctcatt gtgtgctctg agatcacagc ttgtatcttt 600

cgcgggccct cggagaaaca tttggattgc ttggtggggc aatctctgtt cggagacggg 660

gcatcttcgg tcatcgttgg tgccgaccct gatgcctcgg taggcgagcg gccgatcttc 720

gagttggttt cagctgcgca gacgattttg cctaactcgg atggagccat agccgggcac 780

gtaacggaag ccgggctgac atttcacttg ctgagggacg tgccagggtt gatctcccaa 840

aacattgaga agagcttgat tgaggccttc actccgattg ggattaatga ctggaacaac 900

atattctgga ttgcacatcc cggtggacct gccattctgg acgagataga ggccaagctc 960

gagctgaaga aggagaagat gaaggcgtct cgtgaaatgc tgagcgagta tgggaacatg 1020

tcatgtgcaa gcgttttctt catagtagat gagatgagga aacagtcgtc gaaggaaggg 1080

aagtctacca ccggagatgg actggagtgg ggcgctctct tcgggtttgg accgggtctg 1140

acggtggaga cggtggtctt gcacagcgtg cccacaaacg tctaa 1185

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaattcaacc ctcactaaag ggcatggagg gtgtggtcaa gtgtc 45

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcatccttg taatccatcg atatcaagaa aggctgccca tgg 43

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaattcaacc ctcactaaag ggcatggcgt ccgtaactgt agagc 45

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtcatccttg taatccatcg atattagacg tttgtgggca cgc 43

Claims (8)

1.新型短侧链脂肪酸CoA连接酶，其特征在于，所述脂肪酸CoA连接酶为PcAAE2，所述PcAAE2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述PcAAE2具有短链脂肪酸CoA连接酶活性。

2.短侧链脂肪酸CoA连接酶基因，其特征在于，所述脂肪酸CoA连接酶基因为PcAAE2基因，所述PcAAE2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.权利要求1所述的短侧链脂肪酸CoA连接酶或权利要求2所述的短侧链脂肪酸CoA连接酶基因在制备广藿香酮中的应用。

4.含有权利要求2中所述的PcAAE2基因的核苷酸序列的重组载体。

5.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为通过权利要求4所述的重组载体导入工程菌中所表达。

6.一种用于制备4-甲基-戊酰基间苯三酚的重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌中含有HIVPS的重组质粒和权利要求4中所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组酵母菌，其特征在于，所述HIVPS的基因序列如SEQ IDNO:17所示。

8.一种体外制备4-甲基-戊酰辅酶A的方法，其特征在于，所述方法为，PcAAE2以4-甲基戊酸和辅酶A为底物，25℃下反应15min，分离纯化，即可得到4-甲基-戊酰辅酶A，所述PcAAE2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

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