CN113801861B

CN113801861B - 一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4′-o-甲基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN113801861B
Application number: CN202111098372.9A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 高松; 陈坚; 曾伟主; 余世琴
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN113801861A

Abstract

本发明公开了一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4′‑O‑甲基转移酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。本发明筛选获得了朝鲜淫羊藿来源的的黄酮4‑O‑甲基转移酶，并将其在微生物细胞中进行表达，用于催化8‑异戊烯基山奈酚合成淫羊藿素。本发明构建的重组酿酒酵母可以催化50mg/L的8‑异戊烯基山奈酚，获得2.0mg/L的淫羊藿素，在食品、医药领域有重要的应用价值。

Description

一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4′-O-甲基转移酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4′-O-甲基转移酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。

背景技术

淫羊藿是传统的中草药，具有多种医药保健功能，如抗肿瘤、缓解糖尿病并发症、抗衰老、抗抑郁等作用。其中朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)作为淫羊藿的道地药材，药用价值高。淫羊藿中主要的成分为淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C，上述主要成分都是由淫羊藿素在不同位置糖基化获得，因此淫羊藿素是淫羊藿苷等主要成分的前体。淫羊藿苷等属于植物天然产物，植物提取法是植物天然产物的主要获取途径，而微生物法合成植物天然产物因不受季节影响、能耗低，污染少等优点，成为具有潜力的获取植物天然产物的替代方案。

发明内容

本发明提供了朝鲜淫羊藿来源的黄酮4′-O-甲基转移酶，为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄酮4′-O-甲基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码所述黄酮4′-O-甲基转移酶的基因。

在一种实施方式中，所述基因具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体携带SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明提供一种含有所述基因或表达所述4′-O-甲基转移酶的微生物细胞。

本发明还提供了含有所述基因或所述表达载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞的基因组上整合了SEQ ID NO.8所示的基因。

在一种实施方式中，所述微生物细胞中含有携带SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母菌株C800(CEN.PK2-1D；MATα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2；gal80::KanMX)(公开于论文Gao,S.；Zhou,H.；Zhou,J.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization forefficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae[J].J Agric Food Chem 2020,68(25),6884-6891.)。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是以酿酒酵母菌株C800为宿主，表达SEQID NO.1所示的4′-O-甲基转移酶或含有连接了SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID NO.1所示的4′-O-甲基转移酶或含有连接了SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。

本发明提供了构建所述重组微生物细胞的方法，所述方法是将SEQ ID NO.8所示的基因连接至pY26-PGAL7-EGFP中EGFP基因所在位置，替换EGFP基因，再将重组质粒转入酿酒酵母C800中，构建得到重组酿酒酵母。

本发明还提供了一种产4′-O-甲基转移酶的方法，是将所述重组微生物细胞接种至培养基中，于28～37℃培养至少12h。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞为重组大肠杆菌，所述培养基为LB培养基。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌接种至LB培养基中，于35～40℃培养至OD₆₀₀为0.04～0.06，加入终浓度为0.01～1mM的IPTG，于28～30℃诱导表达至少8h。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞为重组酿酒酵母，所述方法是将酿酒酵母先接种至YNB培养基中培养获得种子液，再将种子液转移至YPD培养基中，于28～32℃培养至少20h，获得4′-O-甲基转移酶。

在一种实施方式中，所述方法是将所述重组酿酒酵母接种至培养基中培养，并在接种后每10～14h加入底物8-异戊烯基山奈酚，培养至少72h。

在一种实施方式中，所述方法还包括收集细胞培养液中的4′-O-甲基转移酶。

在一种实施方式中，所述方法具体为：收集细胞培养液中的细胞，破碎细胞，离心分离细胞破碎物，收集离心后的上清液。

本发明还提供一种生产淫羊藿素的方法，是将所述重组酿酒酵母或其代谢产物接种至含8-异戊烯基山奈酚的培养基中，将8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素。

在一种实施方式中，所述方法是将1mg的EkF4′OMT酶催化50μM的底物8-异戊烯基山奈酚，30℃反应至少4h。

本发明还提供所述重组酿酒酵母在制备微生物细胞催化剂方面的应用。

本发明还提供所述重组酿酒酵母在生产含淫羊藿素的医用营养品或药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明首次从朝鲜淫羊藿中筛选获得了具有专一的底物识别作用的黄酮4′-O-甲基转移酶，可以通过在微生物细胞中异源表达合成淫羊藿素。本发明构建的重组酿酒酵母菌株可以催化50mg/L的8-异戊烯基山奈酚，获得2.0mg/L的淫羊藿素，而纯酶催化体系中可以催化50μM的8-异戊烯基山奈酚(约17.7mg/L)获得5.7μM的淫羊藿素(约2.11mg/L)，相对于传统的植物提取方法，本发明的微生物转化法在食品、医药领域有巨大的应用前景。

附图说明

图1为8-异戊烯基山奈酚经过EkF4′OMT1催化产淫羊藿素示意图；8-异戊烯基山奈酚经过EkF4′OMT1的催化，将甲基供体S-腺苷-L-蛋氨酸的甲基基团转移到8-异戊烯基山奈酚的4′位置，获得淫羊藿素。

图2为验证EkF4′OMT1催化能力的高效液相色谱结果；自上而下的第一条液相图为8-异戊烯基山奈酚的标准品色谱曲线；第二条液相图为淫羊藿素的标准品色谱曲线；第三至第九条液相图依次为7条淫羊藿来源的黄酮4′-异戊烯基转移酶催化反应后的反应体系的色谱曲先，EkF4′OMT1具有催化功能，反应物中可以检测到淫羊藿素的产生。

图3为液相-质谱联用检测EkF4′OMT1催化能力的结果；其中：A1：8-异戊烯基山奈酚和淫羊藿素的标准品混合物在液质-质谱联用中液相结果，8-异戊烯基山奈酚出峰时间为10.07min，淫羊藿素的出峰时间为11.02min；A2：标准品中8-异戊烯基山奈酚的质谱结果，阴离子模式下检测到8-异戊烯基山奈酚的分子量为353；A3：标准品中淫羊藿素质谱结果，阴离子模式下检测到淫羊藿素的分子量为367；B1：实施例3的4′-O-甲基转移酶EkF4′OMT1发酵液在液相-质谱联用中的液相结果，在10.07min和11.02min具有目标峰；B2：实施例3的发酵液中底物8-异戊烯基山奈酚的质谱结果，可以确定10.07min的物质与8-异戊烯基山奈酚标准品一致；B3：实施例3的发酵液中产物淫羊藿素的质谱结果，可以确定反应产物中保留时间为11.02min处的物质淫羊藿素标准品一致。

图4为EkF4′OMT1的酶促反应动力学曲线。

具体实施方式

YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。

YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

LB培养基：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠。根据需求添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。

固体培养基中添加20g/L的琼脂粉。

缓冲液A：20mM K₂HPO₄，20mM KH₂PO₄，50mM NaCl，pH 7.4。

缓冲液B：20mM K₂HPO₄，20mM KH₂PO₄，50mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4。

PBS缓冲液：160mL的20mM NaH₂PO4与840mL的20mM Na₂HPO₄混合(pH 7.5)。

8-异戊烯基山奈酚和产物淫羊藿素的检测方法：样品使用岛津高效液相检测(Prominence LC-20A instrument)，C18反相色谱柱(4.6mm×250mm,Thermo)，柱温25℃。流动相为乙腈(A)：水(B)，并添加1‰的三氟乙酸。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为350nm。流动相条件为0-10min(B:10-40％)，10-30min(B:40-80％)，30-35min(B:80％)，35-37min(B:80-10％)，37-40min(B:10％)。

黄酮4′-O-甲基转移酶酶活的测定方法及定义：定义在pH7.5的PBS缓冲液，30℃条件下，每分钟催化1μmol的底物8-异戊烯基山奈酚转化为产物淫羊藿素所需的酶量为1个酶活单位(1U)。将黄酮4′-O-甲基转移酶加入至含1.5mM S-腺苷-L-甲硫氨酸、0.05mM 8-异戊烯基山奈酚的PBS溶液中，于30℃反应1h。终止反应后加入等体积乙酸乙酯，充分混合均匀后，14000rpm离心5min取上清液用于液相检测8-异戊烯基山奈酚和淫羊藿素的含量，计算酶活。

实施例1：预测和获取EkF4′OMT

本发明中以已报道的来源于康乃馨(Dianthus caryophyllus L.)的黄酮4′-O-甲基转移酶Dca35603.1(公开于文献《Purification and properties of a new S-adenosyl-L-methionine:flavonoid 4'-O-methyltransferase from carnation(Dianthus caryophyllus L.)》)的氨基酸序列为模板，通过tBLASTn(参考文献《Spatialorganization of silybin biosynthesis in milk thistle[Silybum marianum(L.)Gaertn]》)，从淫羊藿RNA-seq数据库中预测到7条潜在的同源基因，依次对应c211815、c213106、c202830、c225047、c195237、c208537和c207007，分别被命名为EkF4′OMT1、EkF4′OMT2、EkF4′OMT3、EkF4′OMT4、EkF4′OMT5、EkF4′OMT6和EkF4′OMT7，原始核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，密码子优化后的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14中所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7中所示。

本实施例tBLASTn的预测序列及评分见表1，预测的序列在朝鲜淫羊藿不同组织中的分布见表2，菌株和质粒的基因型见表3，引物名称及序列见表4。

表1 tBLASTn预测序列及评分

*:DcF4′OMT即为Dca35603.1编码的蛋白，此处用作为tBLASTn的模板

表2预测的序列在朝鲜淫羊藿不同组织中的分布^*

*:其中的数字代表RNA-Seq结果中各个基因的FPKM值(Fragments Per Kilobaseof exon model per Million mapped fragments，即每千个碱基的转录在每百万映射读取的数值)，用于表征特定基因的丰度，数值越大，表示基因的丰度越高。

表3菌株和质粒的基因型

表4引物名称及序列

下划线代表酶切位点

实施例2：表达朝鲜淫羊藿F4′OMT的重组菌株的构建

(1)重组质粒的构建

将合成的如SEQ ID NO.8～14所示的基因分别整合在质粒pY26-PGAL7-EGFP(公开于论文Gao,S.；Xu,X.Y.；Zeng,W.Z.,et al.,Efficient biosynthesis of(2S)-eriodictyol from(2S)-naringenin in Saccharomyces cerevisiae through acombination of promoter adjustment and directed evolution[J].ACS Synth Biol2020,9(12),3288-3297.中)，将SEQ ID NO.8～14所示基因分别完全取代EGFP的DNA序列，并使用强启动子P_GAL7起始转录，依次获得质粒pY26-EkF4′OMT1、pY26-EkF4′OMT2、pY26-EkF4′OMT3、pY26-EkF4′OMT4、pY26-EkF4′OMT5、pY26-EkF4′OMT6和pY26-EkF4′OMT7。

使用引物EkF4′OMT1-F/EkF4′OMT1-R从质粒pY26-EkF4′OMT1上扩增EkF4′OMT1序列，使用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切扩增的片段并回收，然后插入到pETDuet-1的BamHI和HindIII位点，获得质粒pETDuet-EkF4′OMT1。

(2)重组酿酒酵母的构建

通过酿酒酵母的高效转化方法(Gietz,R.D.；Schiestl,R.H.,High-efficiencyyeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method[J].Nat Protoc2007,2(1),31-4.)，将步骤(1)构建的重组质粒pY26-EkF4′OMT1、pY26-EkF4′OMT2、pY26-EkF4′OMT3、pY26-EkF4′OMT4、pY26-EkF4′OMT5、pY26-EkF4′OMT6和pY26-EkF4′OMT7分别转化到酿酒酵母菌株C800中，将转化液涂布在YNB固体平板上，30℃培养3-5天直至长出单菌落，即为重组菌，依次将重组菌命名为CMT1、CMT2、CMT3、CMT4、CMT5、CMT6和CMT7。

(3)重组大肠杆菌的构建

通过大肠杆菌高效转化法，将质粒pETDuet-EkF4′OMT1转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，并涂布在添加了100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养后获得重组菌株EMT1。

实施例3：表达朝鲜淫羊藿F4′OMT的重组酵母转化生产淫羊藿素

将实施例2构建的重组菌用于发酵验证，以柚皮素、二氢山奈酚、芹菜素、山奈酚和8-异戊烯基山奈酚为底物，检测有无底物消耗和新物质生成。

菌株CMT1、CMT2、CMT3、CMT4、CMT5、CMT6和CMT7发酵条件如下，在250mL摇瓶中发酵条件：挑取至少10个单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基。将种子培养基以2％(V/V)转接到到含有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，在第12、24、36和48h时，分别向培养基中添加12.5mg/L的8-异戊烯基山奈酚，共计添加50mg/L的8-异戊烯基山奈酚。30℃，220rpm发酵培养72小时。取500μL的发酵液于2mL的破碎管中，13500rpm离心5min，去上清液。将菌体沉淀添加0.5mm玻璃珠和500μL的乙酸乙酯，使用MP震荡破碎仪破碎细胞，按照推荐程序震荡8-10个循环，每个循环40s。将破碎液13500rpm离心5min后，使用尼龙膜过滤后备用检测。

液相结果证明，实施例1筛选的所有来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4′-O-甲基转移酶中，仅有EkF4′OMT1具有催化8-异戊烯基山奈酚合成淫羊藿素的能力。EkF4′OMT1的催化产物经过液相-质谱联用，进一步证明为淫羊藿素。经过72h发酵后，重组酿酒酵母菌株CMT1(此时发酵液OD₆₀₀约为80)可以催化50mg/L的8-异戊烯基山奈酚，获得2.0mg/L的淫羊藿素。

实施例4：朝鲜淫羊藿F4′OMT的酶学性质鉴定

挑取实施例2构建的重组大肠杆菌单菌落EMT1接种于含有5mL液体LB培养基的50mL摇瓶中，培养基中添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。37℃，220rpm培养12h后，按照起始OD₆₀₀＝0.05转接到含有50mL新鲜LB培养基的250mL摇瓶中，培养基中添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，37℃，220rpm培养3-4h，待OD₆₀₀＝1.5-2.0时，添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，同时将培养温度降低为30℃。诱导表达8h后将细胞培养液于4℃，5000rpm离心10min后去除上清液，沉淀使用50mL PBS缓冲液重悬2次后，4℃，5000rpm离心10min去除上清液。沉淀使用50mL的PBS重悬后加入已经预冷到4℃的高压均质机中。将高压均质机调节为850bar，开机并破碎2次后收集裂解液。裂解液4℃，14000rpm离心10min保留上清液。上清液过0.45μm的滤膜备用。过滤液即为粗酶液。

使用亲和层析法回收带有His标签的EkF4′OMT1蛋白质。使用缓冲液A平衡1mL镍柱，然后以1mL/min流速上粗酶液，以1mL/min流速冲洗10个镍柱体积的缓冲液A，随后以1mL/min流速使用缓冲液B冲洗镍柱，根据UV值收集洗脱峰。将收集到的洗脱峰使用脱盐柱(Hitrap Desalting,5mL)进行脱盐处理，用pH 7.5的PBS以5mL/min的流速洗脱回收目标蛋白。使用NanoDrop对回收的目标蛋白进行定量，并用pH 7.5的PBS稀释至蛋白浓度为5mg/mL置于4℃冰上备用。

取200μL蛋白溶液(约含1mg酶)于1.5mL离心管(0.12U)，依次添加300μL溶解了0.5mM S-腺苷-L-甲硫氨酸的PBS溶液、500μL溶解了0.1mM 8-异戊烯基山奈酚的PBS溶液(6.5U/g)。吹打混匀后置于30℃水浴锅中反应1h。取800μL反应液于5mL离心管中，添加800μL乙酸乙酯，充分混合均匀后14000rpm离心5min取上清液用于液相检测。结果显示，纯酶催化体系中每1mg酶可以催化50μM的8-异戊烯基山奈酚(约17.7mg/L)获得5.7μM的淫羊藿素(2.11mg/L)。EkF4′OMT1的Vmax、Km、kcat和Kcat/Km依次为123.6nM/(min·mg)、14.8μmol/L、0.0837/s和0.00565μmol/(L·s)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4'-O-甲基转移酶及其应用

<130> BAA210493A

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 1

Met Met Asn Gly Asn Asn Tyr Asp Glu Gly Lys Glu Leu Leu Glu Ala

1 5 10 15

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20 25 30

Leu His Cys Ala Val Arg Leu Asp Ile Pro Asp Ile Ile Asn Asn His

35 40 45

Pro Arg Lys Pro Ile Thr Leu Ser Glu Leu Ala Lys Glu Leu Gln Ile

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Phe Ser Leu Ser Pro Phe Leu Gln Leu Ile Ser Asp Pro Ile Phe Ile

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130 135 140

Ile Thr Pro Phe Glu Ala Thr His Gly Thr Ser Asp Phe Gln Tyr Phe

145 150 155 160

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165 170 175

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210 215 220

Ser Tyr Asp His Pro Asn Ile Gln Arg Val Ala Gly Asp Met Phe Lys

225 230 235 240

Ser Val Pro Ser Ala Gln Ala Ile Leu Leu Lys Leu Ile Leu His Asp

245 250 255

Trp Ser Asp Glu Asp Cys Ile Arg Ile Leu Lys Lys Cys Lys Glu Ala

260 265 270

Val Pro Glu Glu Gly Gly Lys Val Ile Val Val Asp Val Ala Leu Asp

275 280 285

Glu Glu Ser Asp His Glu Leu Thr Ser Thr Arg Leu Ile Leu Asp Ile

290 295 300

Asp Met Leu Val Asn Thr Gly Gly Lys Glu Arg Thr Lys Gln Asp Trp

305 310 315 320

Glu Lys Leu Val Lys Ser Ala Gly Phe Arg Gly Phe Asn Ile Thr His

325 330 335

Ile Ala Ala Val Gln Ser Val Ile Gln Ile Phe Pro

340 345

<210> 4

<211> 355

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 4

Met Asp Ile Ile Gly Arg Asp Pro Thr Arg Thr Glu Asp Glu Glu Ile

1 5 10 15

Gln Ala Gln Val Gln Ile Trp Lys His Met Tyr Gly Phe Ala Asp Thr

20 25 30

Met Met Leu Arg Cys Ala Ile Gln Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His

35 40 45

Lys Gln Gly Pro Met Ala Leu Ala Gln Leu Ala Ser Glu Leu Pro Leu

50 55 60

Ser Ser Ile Asp Ile Asp Arg Phe His His Val Met Arg Tyr Leu Val

65 70 75 80

His Met Glu Leu Phe Thr Thr Thr Thr Asp Lys Thr Ser Gly Asp Thr

85 90 95

Ile Tyr Gly Pro Thr Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Lys Glu Asp Glu

100 105 110

Asn Ser Leu Arg Pro Tyr Ala Met Leu Gln Thr Asp Pro Glu Ala Phe

115 120 125

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130 135 140

Trp Val Ser Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Tyr Ala Lys Ile Glu Asn Glu

145 150 155 160

Pro Ala His Lys Asn Met Val Asn Glu Ala Met Ala Ser His Thr Arg

165 170 175

Ser Met Val Gln Ala Leu Val Ser Gly Leu Val Lys Glu Gln Ile Leu

180 185 190

Asp Gly Val Gly Ser Phe Val Asp Val Gly Gly Asn Thr Gly Thr Ala

195 200 205

Ala Lys Ala Ile Lys Asp Glu Phe Pro His Leu Lys Cys Ile Val Met

210 215 220

Asp Leu Ile His Ile Ile Asp Ser Val Val His Asp Pro Tyr Leu Asp

225 230 235 240

Phe Val Pro Gly Asp Met Phe Ala Ser Val Pro Phe Ala Asp Ala Val

245 250 255

Leu Val Lys Ser Val Leu His Asn Tyr Glu Asp Asp Asp Cys Leu Lys

260 265 270

Ile Leu Ile Lys Cys Lys Glu Ala Ile Pro Ser Ala Gly Gly Lys Leu

275 280 285

Ile Leu Val Glu Ile Val Leu Asp Thr Glu Asn Leu Pro Glu Leu Ala

290 295 300

Phe Ala Arg Leu Gly Met Asp Met Glu Met Ile Cys Met Gly Gly Lys

305 310 315 320

Glu Arg Thr Lys Gln Glu Trp Ala Asp Ile Leu His Lys Ala Gly Tyr

325 330 335

Ser His His Lys Ile Ile Pro Ile Met Ala Ile Glu Ser Ile Ile Val

340 345 350

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355

<210> 5

<211> 355

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 5

Met Asp Ile Ile Gly Arg Asp Pro Thr Arg Thr Glu Asp Glu Glu Ile

1 5 10 15

Gln Ala Gln Val Gln Ile Trp Lys His Met Tyr Gly Phe Ala Asp Thr

20 25 30

Met Met Leu Arg Cys Ala Ile Gln Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His

35 40 45

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50 55 60

Ser Ser Ile Asp Ile Asp Arg Phe His His Val Met Arg Tyr Leu Val

65 70 75 80

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100 105 110

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Trp Val Ser Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Tyr Ala Lys Ile Glu Asn Glu

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Pro Ala His Lys Asn Met Val Asn Glu Ala Met Ala Ser His Thr Arg

165 170 175

Ser Met Val Gln Ala Leu Val Ser Gly Leu Val Lys Glu Gln Ile Leu

180 185 190

Asp Gly Val Gly Ser Phe Val Asp Val Gly Gly Asn Thr Gly Thr Ala

195 200 205

Ala Lys Ala Ile Lys Asp Glu Phe Pro His Leu Lys Cys Ile Val Met

210 215 220

Asp Leu Ile His Ile Ile Asp Ser Val Val His Asp Pro Tyr Leu Asp

225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

Ile Leu Val Glu Ile Val Leu Asp Thr Glu Asn Leu Pro Glu Leu Ala

290 295 300

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305 310 315 320

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<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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180 185 190

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210 215 220

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260 265 270

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275 280 285

Gly Asp Ala Ile Phe Met Lys Trp Ile Leu His Asp Trp Ser Asp Glu

290 295 300

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325 330 335

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<211> 360

<212> PRT

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 7

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65 70 75 80

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85 90 95

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Arg Val Lys His Val Gly Gly Asp Met Phe Ala Ser Val Pro Lys Gly

245 250 255

Asp Ala Ile Phe Leu Lys Trp Ile Leu His Asn Trp Ser Asp Glu Asn

260 265 270

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275 280 285

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<210> 8

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgatgaacg gtaacaacta cgatgaaggt aaagaattat tagaagctca agctcatatt 60

tggaagcata tttctaactt tatttcttcc atgtctttgc attgtgctgt tagattggat 120

attcctgata ttattaataa ccatccaaga aagccaatta ccttatctga attggccaag 180

gaattgcaaa ttccagaacc aaaatctgca tttttgttta gattaatgag atgtttagtt 240

cactctggtt tcttcgcttt gcaaagaaat catgaaaccc aagaagaagg ttacgtttta 300

actccatcct ctaagttgtt gttgaaatct cacccattct ctttatctcc attcttacaa 360

ttgatttctg acccaatttt tatcactcca tggttccata ttcatgattg gtttcaaatt 420

actaatgtca tgatcactcc atttgaagct actcatggta cttctgactt ccaatacttc 480

ggtgccaacc caagattggg taaagttttt gatgatgcta tggcctgtga tgccagattg 540

gttattaacg ttttgttgaa gaagtgtaag gaaaagttcg aaggtcttaa gtctttggtt 600

gatgttggtg gtggtactgg tactattggt agagctatct gtgacgcttt cccagaaatt 660

aagtgtatcg tttttgattt gccacaagtt gttggttctt tggaaggtac aaagaatttg 720

gaattcgttt ctggtgacat gttccaatct attccatctg ctgatgttgt gttgttgaag 780

tgggttatgc atgattggac tgacgaagaa tgtgttaaca ttttgaagag atctcgtgaa 840

gctatcccat ctaaggaaca aggtggtaaa gttattatta ttgatatggt cgttgatgat 900

actaagggta ctaacgaatc tactgaagct caaattttgt tcgatatcgc tatgatggtc 960

accaacagag gtaaagaaag aactgaaact gaatggaaga aattgttctt tgatgctggt 1020

ttctcttcct acaagatctg tccagttttg ggtttgagat ctttgattga agttttccca 1080

taa 1083

<210> 9

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggaagaaa tgtctcaaca aatgaaggaa attggtaatg gtgttggtgg tgaagaattg 60

ttggaagctc aagctcatgt ttggaaccac atgtttaact tcatttcctc tatgtctttg 120

aagtgtgccg ttgaattggg tattccagat atcattcata atcatccaca taaaccaatt 180

actttgtccg aattagttga atctttgaag atttgtcaag gtaaatcttt ccacgtttac 240

agattaatga gattgttggt tcattctggt actttcgcta gacaaaagat tccagaaacc 300

caagaacatg gttacgtttt gactccagct tctaagttgt tgttgaagtc tcattgtatg 360

acaatgactc cattcatttt ggctatgtta gatccaaaat tagttactac ttggcatttc 420

ttgtccgatt ggtttgaaag atctgatgaa atgattaacc cttttgaagc tgctaatggt 480

acttccgtct ggaagtacta tgagaaaaac caagatatcg gtaaactatt tgccgaatct 540

atggcttgtg atgcttcttt agttatgaac gttgttttga aggaatgtaa gatgaaattc 600

gaaggtttga actcttttgt tgatgttggt ggtggtactg gtacagttgc tagattaatt 660

gctgaagctt tcccagatac taagtgtact gttttggact tgcctcaagt tgttggtagt 720

ttacaaggtt ctagaaattt ggaattcgtt agtggtgaca tgtttgaatc cattccatcc 780

gctgatgttg ctttcttgaa gtggatctta catgactggt ctgatgaaga atgtgttaaa 840

attttgtcta gatgtagaga agctattcca tctaaggaaa acggtggtag agttattatt 900

ttggatatgg ttttggatgg taaaaagaat gaaaattatg aatccactga aacacaatta 960

ttctttgata tgttgatgat ggttttagtt aagggtaaag aaagaactga aattgaatgg 1020

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agatctttta ttgaagtttt cccataa 1107

<210> 10

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggttaatg ttgctgctgc tgatgatgtt caaggtgttg ttgatattaa ggctcaagct 60

catttgtgga aaattatata cggttttgct gattctttag ttttgagatg tgctgttgaa 120

ttgggtattg ctgaaattat taataataat aatcatccaa ttactttatc cgaattagct 180

agtaacttac cattgccaca tgttaatact gatcatttgt atagattaat gagatatttg 240

gttcatatga aattggttaa attagaagaa aaacaatatt ctttgttacc tactggtaca 300

ttgttgttaa aagatgctga aaggaatatg gttccaatga ttttaggtat gactcaaaaa 360

gattttgtta cttcttggca ttatatgaaa gatggtttat ctgatgatgg tacagctttt 420

gaaaaaggta tgggtatgac tatttgggaa tatttgcaag gtcatccaga acaatctcaa 480

ttgtttaatc aaggtatggc tggtgaaact agattgttaa catcatcttt gatttctggt 540

tgtggagata tttttcaagg tattacttct ttagttgatg taggtggtgg taatggtact 600

actttaaaag ctatttctga agcttttcca catattaatt gtactttgtt tgatttgcca 660

tatgtaattg ctgattctta tgatcatcct aatattcaaa gagttgctgg agatatgttt 720

aaatctgttc catcagctca agctattttg ttgaaattga ttttacatga ttggtctgat 780

gaagattgta ttagaatttt gaaaaaatgt aaagaagcag ttccagaaga aggaggtaaa 840

gttattgttg ttgatgttgc attagatgaa gaatctgatc atgaattaac ttctactaga 900

ttgattttag atatagatat gttagttaat actggtggta aagaaagaac taaacaagat 960

tgggaaaaat tagttaaatc tgctggtttt agaggtttta atattactca tattgctgct 1020

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<210> 11

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggatatta ttggtagaga tactagaact gatattgctg ttatttggaa gcatatgtac 60

ggtgctgata ctatgatgag atgtgctatt ggtattgata ttattcataa gggtatggct 120

gctgcttctt cttctattga tattgataga catcatgtta tgagatacgt tcatatgact 180

accactactg ataagacctc tggtgacacc atctacggta ctgctgcctc tggtaaagat 240

aattctagat acgctatgac cgatgctacc atgtggaacc atattgtttc tgatggttct 300

aagaactact gggtttctac ttacacttct tacgctaaga ttaacgctca taagaacatg 360

gttaatgcta tggcttccca tactagatct atggttgctg tttctggtgt taagatcgat 420

ggtgttggtt ctgttgatgt tggtggtaat actggcactg ctgctaaggc tatcaaggat 480

cacaagtgta ttgttatgga tattcatatc atcgactctg ttgttcatga ttacgacgtt 540

ggtgacatgg cttctgttgc tgatgctgtt gttaagtctg ttcataatta cgatgatgat 600

tgtaagatta ttaagtgtaa ggctatttct gctggtggta aaattgttat tgttgatact 660

aacgctgcta gaggtatgga tatgatgatt tgtatgggtg gtaaaagaac taagtgggct 720

gatattcaca aggctggtta ctctcatcac aagattatta ttatggctat ttctattatt 780

gttgcttact aa 792

<210> 12

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgattacta aaattactgc tgctgtttgg aagcatatgt acggtgctac tattatgaga 60

tgtactgttg gtattgatat tcataaaggt atgactcatg ctaacgctaa cactattaat 120

gatagacatc acattattag atacgttcat atgaagaagg ttatcactca tactacttat 180

actacttctg cttctaaggt tagagctcat aagaaatccg cttacgttat gactcatatt 240

tctatttggg gtcatgttaa agattgtggc aagaaaacct attgggctaa gtacggtgtt 300

tccatgtaca agattactga ttccaataag aatgatgcta tgacttctca ctctatgatg 360

attgctgttg atggtattaa gggtaaagat gttaacacag ttgatgttgg tggtaacggt 420

gctgctgcta aggctatttc tattgctacc ggtgttagat gtatggttat ggatcatgtt 480

gtctctgtta gagccgatat tgttgctggc gatatgtcta ttaaggctga tgttgttatg 540

aagtccactc ataactatga tgatgattgt aagattaaca actgtaaggc tattgcttcc 600

ggtaacggta aagttattgt tattgtcatt ggtatgaact cttctgctag atctatgatt 660

atgatgatgg gtggcaagag aaccaagtgg aatgataagg ctggttctca cagaattatt 720

attatggcca tttctattat tgttgctact taa 753

<210> 13

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgacttact cttctactaa ctctacctct tactctatta ctattaccac tatgggttcc 60

actaacatta agattactga cgctgatgct tgtaaccacg ctatggcttc tgctagtgtt 120

atggttaagg ctgctattga tgttatcatt gctaaggctg gtggtgctta cgtttctact 180

attgcctctc acacttctaa tgttgctgtt atggatagaa tgagagcttc atacaaggtt 240

gtttcttctt ccactacttc cgttgacgga aaggttagat acggtgctgt ctgtaagact 300

aaaaacgatg gtgtttctat tgctgttatg aacgataaga ttatgtcttg gtatcataag 360

gacactgttg gtggtattaa taaggcttat ggtatgactg cttaccatgg tactgataga 420

aataaggtta atggtatgag tgatcattct actattacta tgaagaaggt ttacaagggt 480

ggcaagtctg ttgttgatgt tggtggtggt actggtgcta ctgttaacat gattgtttct 540

aagtactcca ttaagggtat taacgaccat gttgttgatg ccgcttacac tggtgttcat 600

attggtggtg acatggtctc tgttaagggc gatgccatta tgaagtggat tcatgattgg 660

tctgatcatt ctaaaaagaa ctgtaaggct gatggtaaag ttattattgc ttctgttgtt 720

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atgaagatct aa 852

<210> 14

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgggttctg ttaacattac taatgatgac tgttatgcca ttgtttctgg ttccgttatg 60

atggttatgg ctgccatgga tcatattatt gctaaagctg gtggtgctaa atcttccatt 120

gcttccacta ccaagaatgc tgctgttatg gttgatagga ttagagtttc ttactctgtt 180

attactgctt cttctactac ttacggtgac ggtaaagtta gatacggtgc tgtttgtaag 240

tatgatcatg gtgtttcttc ttcttgttcc tctacttaca ccaaaactat ggccggtaaa 300

gatactgttg gtggtgacac tactagaatt aacggttgta atatgtctta tggtgacgtt 360

gctggtaaca gagttatgga tcacacctct attgttatga agagaattgc ttataacggt 420

ggtaacgttg ttgatgttgc tggtggtgtt ggtactatgt cctcaattac tacaaagtac 480

gctattaact gtattaacga tgttattcat gcttacagag ttaagcatgt tggtggcgat 540

atggcttctg ttaagggtga cgctattaag tggattcata actggtctga taactgtgtt 600

cgtaagaaat gttacgctat tgctggtaaa gtcatcgttg tcgatgctat tattgatgtt 660

tcttctactg gtgctaaggg tatttgtgat atgatggtta actgtggtgg tagaagaact 720

aagtgtgcta aggctggtaa tagagttgct tgtgcttgta agaacggtgt ttataagtaa 780

<210> 15

<211> 1083

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 15

atgatgaatg gaaacaacta cgatgaagga aaagagcttc ttgaagcaca agctcatata 60

tggaagcata tatccaattt cataagctcc atgtccctcc actgtgcagt tcgattagat 120

atacccgata tcatcaacaa ccatcctcga aaacctatta cactctctga attagccaaa 180

gagcttcaaa tccccgaacc aaaatctgca tttttgtttc gtctaatgcg atgtttggtc 240

cattccggct ttttcgccct gcaaagaaat catgaaactc aagaagaagg ttatgtttta 300

acaccttcat ctaaactact tttgaaaagc catcccttca gcttgtcacc atttttgcaa 360

ctcatatcag atcctatttt cataacgcct tggtttcata ttcacgattg gtttcaaatc 420

actaatgtta tgatcacacc gtttgaggcc acccatggga cgagcgactt tcagtatttt 480

ggcgcaaacc ctaggcttgg aaaggtgttt gatgatgcca tggcttgtga tgctcggttg 540

gtgataaatg tactgttgaa aaagtgtaag gagaagtttg aagggttgaa atcattggtt 600

gatgttggcg gtggtactgg aaccattggt agggccattt gcgatgcctt ccccgagatc 660

aaatgtatag tctttgatct accacaagtt gttgggagct tggaagggac caaaaatttg 720

gagtttgtta gtggggatat gtttcagtct atcccttcag ctgatgttgt tctcctaaag 780

tgggtcatgc atgattggac tgatgaggaa tgcgtgaaca tactcaaacg atctagggag 840

gcgattccat caaaagagca gggaggcaag gtgatcataa tagacatggt agtcgatgac 900

acgaaaggga ctaatgaatc aactgaagcc cagatcttgt ttgatatcgc tatgatggtt 960

acgaacagag ggaaagagag aactgagact gaatggaaga agctcttctt tgatgccggt 1020

ttcagtagct acaagatatg tcctgttcta ggcttaaggt ctttaataga agtatttcct 1080

tag 1083

<210> 16

<211> 1107

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 16

atggaggaaa tgtctcaaca aatgaaggag atcggtaacg gagttggggg agaagagctt 60

cttgaagctc aagctcatgt atggaaccac atgttcaatt tcataagttc catgtcactc 120

aaatgtgcag ttgagttagg tataccagac atcatccaca accatcctca caaacctatt 180

actctctctg aactagtcga atcactcaaa atctgtcaag gaaagtcctt tcatgtctac 240

cgcctcatgc gtttattggt ccattctggt actttcgcca gacaaaaaat acctgaaact 300

caagaacatg gatatgtctt aacacctgcg tcgaaactcc ttttgaaaag ccattgcatg 360

acaatgacac ctttcatatt agcaatgtta gatcctaagt tagtaacaac ttggcatttt 420

ctcagtgatt ggttcgagag gagtgatgag atgatcaatc cgtttgaggc tgcaaatgga 480

acgagcgtgt ggaagtacta tgagaagaac caagatattg gcaagttgtt tgccgagtcc 540

atggcttgtg atgcaagttt ggtgatgaat gttgtgttaa aagagtgtaa gatgaagttt 600

gaggggttga attcgtttgt tgatgttgga ggtggtacag gaacggtagc taggttaatt 660

gccgaagcct ttccggacac gaagtgtact gtgttagatc taccacaagt ggttggatct 720

ttgcaaggga gcaggaatct ggagtttgtg agtggggata tgtttgagtc catcccatct 780

gctgatgtag ctttcttgaa gtggatcttg catgattgga gcgatgagga atgcgtgaaa 840

atcctgagca gatgcagaga agcgattcca tccaaagaaa atggagggag agtaatcata 900

ctagacatgg tacttgatgg gaagaaaaac gaaaactatg agtcaactga aacacaactc 960

ttcttcgaca tgttgatgat ggttctggtc aaaggaaaag agagaactga gattgaatgg 1020

gaaaagctct tcctggatgc aggtttcagt ggctacacta tcactcctat tttgggttta 1080

aggtctttca ttgaagtatt cccttaa 1107

<210> 17

<211> 1050

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 17

atggtgaatg ttgctgctgc tgatgatgtt caaggagtag tagacataaa agctcaggct 60

cacttatgga aaatcattta cgggtttgcc gattctctag tccttcgatg tgctgtagag 120

cttgggattg cagaaattat caacaacaac aatcatccca tcacactgtc cgagcttgct 180

tcaaacctcc ctcttcccca tgtgaatacg gatcacttgt atcgcttaat gcgatacttg 240

gttcacatga aactagtaaa actggaagaa aaacaatact ctctcctgcc aactggaact 300

ctcctcttaa aggatgcaga gaggaacatg gtcccaatga tccttgggat gacacagaaa 360

gattttgtaa cttcttggca ctacatgaaa gatggtttaa gcgatgatgg gactgccttt 420

gagaaaggaa tggggatgac tatatgggaa tatttacaag gacatcctga acagagccag 480

cttttcaatc aagggatggc tggggagact aggcttctca cctcttcact tatttctggt 540

tgtggagaca tttttcaagg tattacatct ctcgtcgatg ttggtggagg aaatggtact 600

actcttaaag ccatctccga agcctttcct catatcaact gcacgctgtt tgatctccct 660

tatgttattg ccgattctta tgaccatcct aatatccaac gtgttgctgg ggacatgttc 720

aagtctgtac ctagtgctca ggccatccta ctcaagctga ttctgcacga ctggagcgat 780

gaggactgca tcaggatttt gaagaaatgc aaggaagcag tcccagaaga gggaggtaag 840

gtaatagttg tggatgtggc actagatgaa gaatctgatc atgagctcac tagcacaaga 900

ttgatccttg atattgacat gttggtcaat actgggggta aagaaagaac caagcaagat 960

tgggagaaac tcgtcaaatc tgcaggtttt cgaggtttca acatcaccca catagcagcc 1020

gtacagtctg ttattcagat tttcccctaa 1050

<210> 18

<211> 1065

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 18

atggatatca ttggcagaga tcctactaga actgaggatg aagagatcca agctcaagtc 60

caaatatgga agcatatgta tggattcgca gacacaatga tgttaagatg tgccatacaa 120

ctagggatac cagatataat tcacaaacaa ggccccatgg cattggctca attggcaagt 180

gaattgccac tcagttcaat cgatattgat cgatttcacc atgtgatgag gtacttagta 240

cacatggaat tgttcacaac cacgacggac aagaccagtg gagatacaat ctacggccca 300

actgctgctt caggtctgct attgaaggaa gatgaaaaca gtttgaggcc atatgctatg 360

ttacaaactg acccagaagc attcacaatg tggaaccata tagttgagag cttagatgga 420

tcaaagaact actgggtctc aacttatgaa acctccctgt atgcgaagat agagaacgaa 480

ccagcccata agaatatggt aaatgaggca atggcgagtc acacgaggtc aatggttcag 540

gcccttgtgt ccgggttggt gaaggaacag atacttgatg gtgtcgggtc atttgtggat 600

gttggaggca atacaggtac agctgctaag gcgatcaagg acgagtttcc tcatctgaag 660

tgcattgtga tggatttgat tcatatcatt gacagtgtag tccatgaccc gtacctggac 720

tttgtgcctg gggatatgtt tgcctcggtg ccctttgccg atgctgtttt agttaagtct 780

gttcttcaca attatgagga cgatgactgc ctaaagatat taatcaaatg caaggaagcc 840

ataccttcgg caggaggaaa gttgatcttg gtagaaattg ttcttgacac agaaaatttg 900

ccggagttgg cttttgcgag actagggatg gatatggaaa tgatttgtat gggaggaaag 960

gagagaacta agcaagaatg ggctgatatc ttacacaaag ctgggtatag tcatcataag 1020

atcataccga ttatggccat tgaatcgata attgtagctt accct 1065

<210> 19

<211> 1044

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 19

atggagatca ccaaagaaga gattactgct caagctcaag tatggaagca catgtacgga 60

tttgcagaga cgatcatgct acgatgtacc ctcgtcctag gaataccgga catactccac 120

aagcagggcc cgatgacact gcatcaattg gcaaatgcgc tacccctgaa cacaatcaac 180

ttagatcgat tccaccacat aataaggtat ttagtccaca tgaaattgct caaagttata 240

acacatgaaa ccacccaaga acagcagtac acactcacat ctgcatcaaa gctgctagtc 300

agagcccaca aaaagagctt agccccctat gtcatgttac aaacacaccc agaagaaatc 360

tccatttggg gacatgtgaa ggactgtctt gaagggaaga aaacatattg ggaggccaag 420

tatggggtgt ctatgtatga aaagatagaa acagatcctg agagtaataa gttgtttaat 480

gatgctatga cgagccattc gatgttcatg atcccggcct tggtagatgg gttgataaag 540

ggtaagcttc tcgatgaggt aaatacattg gtcgatgttg ggggaaattt tggtgctgct 600

gctaaagcaa tatccattgc gttcactggt gtccgttgta tggtcatgga cttgctccat 660

gtcgttgaga gtgtacgtgc agatcctgag ttgattttcg ttgctgggga tatgttttct 720

ttgattccta aagccgatgt tgttttaatg aagtctactc tacataacta tgaagatgat 780

gattgcctca agattttaaa caactgcaag gaagctatag cttcagggaa tggaaaggtg 840

attctagtag aaattgtaat tgggatggaa aatttgccag aattttcttc agcaaggttg 900

agtatggaga tagaaatgat gctaatgggt ggaaaggaaa gaacaaagca agaatgggag 960

aatctcttgg acaaagctgg atttagtcac cgtgagatta ttccaataat ggctattgaa 1020

tcaatcatcg tagccactct gtag 1044

<210> 20

<211> 1188

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 20

atgttcttta ctcaatatcc atcacccagc accttcttga accccctctc cacttcccct 60

ctctatctct caattccaac ccaaattaca accatgggtt caacccaaaa tcaaattaaa 120

atcacagacg cagaagaaga tgaagcatgt aaccatgcta tgcaactagc aagcgcatcg 180

gttcttccca tggttttaaa agcggcaata gagctagatg ttcttgaaat tattgccaag 240

gcagggcctg gtgcgtatgt tagcccaact gaaatagctt cacatctccc cactagtaac 300

gtagaggcgc cggttatgct tgatcgtatg ctaaggctac ttgctagcta caaggttgtg 360

agtagcagcc tgactacttc agtggatggc aaggttgaga ggctctatgg tttggcacct 420

gtatgtaagt tcttgaccaa gaatgaagat ggggtttcta ttgctccctt ggttctcatg 480

aatcaagata agatcctcat ggagagttgg taccacttga aagatacagt tcttgaagga 540

ggcattccat tcaacaaggc atatgggatg actgcatttg agtaccatgg aacagatcct 600

agattcaata aggttttcaa cttgggaatg tctgatcact ccactattac aatgaaaaaa 660

ctcctcgagg tatacaaggg cttcgaagga cttaaatcag tggtcgatgt tggtggtgga 720

actggagcta cagtcaacat gattgtttcc aaataccctt cgattaaggg catcaacttc 780

gacttgcccc atgtcgttga agatgcaccg gcttatactg gtgttgagca tattggagga 840

gacatgtttg ttagcgttcc caaaggggat gcaatcttca tgaagtggat acttcatgat 900

tggagcgacg aacacagctt gaaatttttg aaaaattgta aggaagcact cccagaagat 960

ggaaaggtca tcattgctga atcagtcctt cccgtgttcc ctgagacaaa tctcgccgca 1020

aacactgttt tccaactaga caacattatg ttggcacata accctggagg aaaagagagg 1080

actgagaaag attttgaagc tttggcaaag ggagctggtt ttgctggttt tagagttgct 1140

tgtggtgctt acagcacttg ggtcatggag ttcttgaaac agatataa 1188

<210> 21

<211> 1087

<212> DNA

<213> Epimedium koreanum Nakai

<400> 21

catgggttct gtagaaaacc agatccaaca aaccaaccaa gatgaggaag attgcttgta 60

tgcaatccaa ctagtcagcg gttctgtcat gcctatggtc atgcaagcag caatggatct 120

cgagctgttt cacattatag caaaagcagg tgaaggggca aagctctcac catctgagat 180

tgcatcgcaa cttactacca aaaatccaga ggcagctgtt atggttgatc gtattctgcg 240

gcttcttgta agttattccg tcatcactgc ctctagtacc acttacggag atgggaaagt 300

tgagaggtta tatggcttgg cacctgtttg caagtacctt cttccagacg aacatggagt 360

tagtttgtct tcctgcttga gcctgagtac ttacccaact gaactcaaaa caatggccgg 420

cctgaaggac actgtactcg aaggtgggga tacatttacc cgaatcaatg gttgcaatat 480

gttctcctat tttggacaag accctgtatt agctgggctc ttcaataggg tgatgttcga 540

tcacacgagt attgttatga agaggattct tgcggaatac aatggtttcc aaggtttgaa 600

tctagttgta gatgtagctg gtggggttgg aaccatgagt agtctcatca ctaccaagta 660

tcctgctatc aactgcatca actttgactt gcctcctgtt atcgaacatg caccacctta 720

tcctcgtgtt aaacacgttg gaggagatat gtttgcaagt gtcccgaaag gagacgccat 780

tttcctaaag tggattttac acaattggag cgacgaaaat tgtgtgagat tgctgaagaa 840

gtgttatgaa gctatccctg ctcaaggaaa ggtgattgtt gttgatgcca ttattcccga 900

tgtgcctgag tccagtaccg gagccaaagg catctgccaa ctggaccttc ttatgatggt 960

aaactgtccc ggtggaagag aaagaacaca aaaagaattg gaatgccttg ctaagcaagc 1020

cggatttaat cgtgttgaac tggcatgttt tgcttgtaag aatggggtct tggaattcta 1080

caaatga 1087

Claims

1.朝鲜淫羊藿来源的黄酮4´-O-甲基转移酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述黄酮4´-O-甲基转移酶的基因。

3.一种表达载体，其特征在于，携带SEQ ID NO.8所示的基因。

4.含有权利要求2所述基因或表达权利要求1所述黄酮4´-O-甲基转移酶的微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，含有携带SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒，或在基因组上整合了SEQ ID NO.8所示的基因。

6.一种产黄酮4´-O-甲基转移酶的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的微生物细胞接种至培养基中，于28~37℃培养至少8 h，收集黄酮4´-O-甲基转移酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将表达黄酮4´-O-甲基转移酶的重组大肠杆菌接种至LB培养基中，于35~40℃培养至OD₆₀₀为0.04~0.06，加入终浓度为0.01~1 mM的IPTG，于28~30℃诱导表达至少8 h。

8.权利要求1所述的黄酮4´-O-甲基转移酶在催化8-异戊烯基山奈酚生产淫羊藿素，或生产含淫羊藿素的医用营养品或药物中的应用。

9.一种生产淫羊藿素的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的微生物细胞或其代谢产物接种至含8-异戊烯基山奈酚的培养基中，将8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素；所述代谢产物含黄酮4´-O-甲基转移酶。