CN113637617B - 一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过构建一种以枯草芽孢杆菌为宿主，表达编码SMT蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因的重组枯草芽孢杆菌，首次实现了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的胞外分泌。采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本，并且该方法不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

硒是人体必需的微量元素，通过形成以硒代半胱氨酸为活性中心的硒蛋白行使生理功能。硒的生物利用率随硒的来源以及营养状态而改变，甲基化硒是低分子量硒代谢物主要的活性形式，而甲基硒代半胱氨酸(SeMCys)作为甲基化硒的直接供体，被证明是最有效的抗癌硒化合物之一，是比硒蛋白更有效的硒源类补充剂。

目前SeMCys的制备方法主要是化学合成法，但是这些化学合成方法都有各自的缺点，比如：步骤复杂，或工艺冗长，或反应条件苛刻，或原料价格高，或涉及剧毒原料等，致使这些合成方法大都难以投入大规模实际生产，因此，市场上的甲基硒代半胱氨酸仍然非常昂贵。

而现有技术中，并没有采用生物发酵法制备甲基硒代半胱氨酸，由于发酵法具有以下优势：发酵细胞更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物，因此有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。

虽然自然界的微生物可以在菌体内富集有机硒，但是由于缺乏相关的酶，无法合成SeMCys，而目前仅仅有报道在酿酒酵母中表达双沟黄芪来源硒代半胱氨酸甲基转移酶，可以在胞内积累SeMCys，但无法将产物分泌到培养基中，从而限制其产量，并且其胞内的产量仅仅为1.14μg/g干重。

因此，急需开发一种可直接实现胞外分泌甲基硒代半胱氨酸的食品级的基因工程菌，该基因工程菌更具有研究价值及工业化应用潜力。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，表达编码SMT蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述半胱氨酸转运蛋白为半胱氨酸转运蛋白Bcr、半胱氨酸转运蛋白YdeD、半胱氨酸转运蛋白TolC、半胱氨酸转运蛋白YfiK或半胱氨酸转运蛋白CydD。

在本发明的一种实施方式中，所述SMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述SMT蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，半胱氨酸转运蛋白Bcr的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；半胱氨酸转运蛋白YdeD的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；半胱氨酸转运蛋白TolC的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；半胱氨酸转运蛋白YfiK的氨基酸序列如SEQ ID NO.11；半胱氨酸转运蛋白CydD的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一种实施方式中，编码半胱氨酸转运蛋白Bcr的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码半胱氨酸转运蛋白YdeD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码半胱氨酸转运蛋白的TolC核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码半胱氨酸转运蛋白YfiK的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码半胱氨酸转运蛋白CydD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pP43NMK质粒或pSTOP1622质粒为载体，表达编码SMT蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因。

本发明还提供了一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)将编码SMT蛋白的基因和载体进行Gibson组装，得到重组载体-SMT，将重组载体-SMT转入枯草芽孢杆菌中得到重组菌-SMT；

(2)将编码半胱氨酸转运蛋白的基因和载体进行Gibson组装，得到重组载体-半胱氨酸转运蛋白，将重组载体-半胱氨酸转运蛋白转入到步骤(1)获得的重组菌-SMT中，得到上述重组枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种制备甲基硒代半胱氨酸的方法，所述方法为：以上述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产甲基硒代半胱氨酸。

在本发明的一种实施方式中，先将上述的重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于温度为30～38℃、转速为150～300rpm的条件下进行培养，最终获得含有甲基硒代半胱氨酸的发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的种子液的OD₆₀₀不低于1.8。

本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌或上述构建方法得到的重组枯草芽孢杆菌或上述制备甲基硒代半胱氨酸的方法在制备甲基硒代半胱氨酸或含甲基硒代半胱氨酸产品中的应用。

[有益效果]

(1)本发明首次实现了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的胞外分泌。采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本，并且该方法不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。

(2)本发明利用具有强启动子P₄₃启动子和P_xylA启动子的表达载体过表达编码SMT蛋白的基因和编码半胱氨酸转运蛋白的基因，增强甲基硒代半胱氨酸的分泌，从而提高胞外甲基硒代半胱氨酸的产量；本发明可使枯草芽孢杆菌发酵生产甲基硒代半胱氨酸的产量从几乎为0提高到80μg/L，远远高于现有报道的重组酿酒酵母的胞内积累SeMCys1.14μg/g干重。

(3)由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于食品安全级菌株，因此，利用以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主获得的重组枯草芽孢杆菌生产得到的甲基硒代半胱氨酸可达到食品级。

具体实施方式

下述实施例中涉及的pP43NMK质粒和pSTOP1622质粒均购自普如汀生物技术(北京)有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基：葡萄糖10g/L，大豆蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，无水氯化钙0.1g/L，十二水合磷酸氢二钠1.26g/L，自然pH，115℃灭菌15min，初始硒浓度4μg/mL。

种子培养基：葡萄糖10g/L，大豆蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，无水氯化钙0.1g/L，十二水合磷酸氢二钠1.26g/L，自然pH，115℃灭菌15min。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

甲基硒代半胱氨酸含量检测：UPLC-MS法检测条件如下：

仪器：Waters XevoTQS-micro型超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪；色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18 Column，2.1×100mm 1.8μm、柱温40℃、样品室温度10℃、进样体积5μL、流速0.2mL/min、运行时间7min、流动相A为0.1％甲酸水溶液、流动相B为乙腈，流动相浓度梯度见表1。

表1流动相梯度表

实施例1：重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT的构建

(1)表达载体pP43NMK-SMT的构建

化学合成编码SMT蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；在编码SMT蛋白的基因两端加上pP43NMK同源序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示和核苷酸序列如SEQID NO.14所示)得到SMT片段；将pP43NMK经Kpn I和Sma I酶切回收，得到pP43NMK片段；将SMT片段与pP43NMK片段利用Gibson Asembly Master Mix进行组装得到SMT表达载体pP43NMK-SMT。

将表达载体pP43NMK-SMT转化到感受态细胞，得到转化产物；将转化产物涂布在LB培养中得到转化子，挑取转化子接种至LB培养基中培养后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-SMT。

(2)重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT的构建

根据spizizen转化法，进行枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化；将表达载体pP43NMK-SMT转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞，得到重组菌枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT，将转化产物采用卡那霉素抗性平板培养，在37℃倒置培养12h直至出现菌落，挑取单菌落培养保存，并提取基因组进行PCR鉴定，得到重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT。

实施例2：半胱氨酸转运蛋白表达载体的构建

(1)大肠杆菌基因组DNA的提取：将大肠杆菌菌种接种到LB培养基中，37℃下200r/min培养12h，离心收集菌体，采用TIANGEN公司细菌基因组DNA试剂盒提取大肠杆菌的基因组DNA。

(2)设计引物序列，从上述步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组DNA中扩增出半胱氨酸转运蛋白基因，扩增条件如下：94℃预变性3min，随后进行30次循环94℃20s、55℃20s和72℃3min，最后72℃反应10min；具体引物如下：

编码半胱氨酸转运蛋白Bcr的基因：利用引物Bcr-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和Bcr-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组DNA中扩增Bcr基因；

编码半胱氨酸转运蛋白YdeD的基因：利用引物YdeD-F(核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示)和YdeD-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组DNA中扩增YdeD基因；

编码半胱氨酸转运蛋白TolC的基因：利用引物TolC-F(核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示)和TolC-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组DNA中扩增TolC基因；

编码半胱氨酸转运蛋白YfiK的基因：利用引物YfiK-F(核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示)和YfiK-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组DNA中扩增YfiK基因；

编码半胱氨酸转运蛋白CydD的基因：利用引物CydD-F(核苷酸序列如SEQ IDNO.23所示)和CydD-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)从步骤(1)中得到的大肠杆菌基因组DNA中扩增CydD基因；

(3)将pSTOP1622质粒经Spe I和Bam HI酶切回收，分别与步骤(2)中得到Bcr、YdeD、TolC、YfiK和CydD半胱氨酸转运蛋白片段，利用New England Biolabs公司的GibsonAsembly Master Mix进行组装，分别得到质粒pSTOP1622-Bcr、pSTOP1622-YdeD、pSTOP1622-TolC、pSTOP1622-YfiK、pSTOP1622-CydD。

实施例3重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-半胱氨酸转运蛋白的构建

分别将表达载体pSTOP1622-Bcr、pSTOP1622-YdeD、pSTOP1622-TolC、pSTOP1622-YfiK、pSTOP1622-CydD转化到重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT中，分别得到重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-Bcr、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YdeD、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-TolC、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YfiK、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-CydD；分别将上述转化产物采用卡那霉素和四环素抗性平板培养，在37℃倒置培养12h直至出现菌落，挑取单菌落培养保存，并提取并提取基因组进行PCR鉴定，分别得到重组成功的重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-Bcr、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YdeD、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-TolC、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YfiK、重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-CydD。

实施例4：重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-半胱氨酸转运蛋白的验证

以枯草芽孢杆菌168为宿主，按照实施例1-3的方法分别得到枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-Bcr、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YdeD、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-TolC、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YfiK、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-CydD；

分别将枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-Bcr、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YdeD、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-TolC、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YfiK、枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-CydD接种于种子培养基上，37℃下过夜培养，得到种子液；

分别将上述种子液以5％的接种量接种于发酵培养基，使培养基中菌液浓度达到OD0.09，37℃、200r/min培养8h时添加木糖至终浓度0.8％，继续发酵16h，得到发酵液；

分别将上述得到的发酵液离心去除菌体，用滤膜过滤后超滤，用UPLC-MS法分别检测甲基硒代半胱氨酸含量，结果如表2所示。

结果显示，野生枯草芽孢杆菌菌株168和枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT均无法检测到胞外分泌甲基硒代半胱氨酸的含量；而本发明的所有重组枯草芽孢杆菌菌株的甲基硒代半胱氨酸胞外产量均得到提高，说明半胱氨酸转运蛋白促进了甲基硒代半胱氨酸的分泌，本发明成功的构建了可实现胞外分泌甲基硒代半胱氨酸的含量的重组枯草芽孢杆菌。其中草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-Bcr菌株产量最高，枯草芽孢杆菌168/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YdeD的产量次之。

表2重组菌甲基硒代半胱氨酸的胞外产量

对比例1

具体实施方式同实施例4，区别在于，采用半胱氨酸转运蛋白YahO(核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，克隆基因所用引物YahO-F序列如SEQID NO.27所示，引物YahO-R序列如SEQ ID NO.28所示)，构建重组枯草芽孢杆菌/pP43NMK-SMT/pSTOP1622-YahO；结果显示：胞外未能检测到甲基硒代半胱氨酸。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京工商大学

<120> 一种利用枯草芽孢杆菌合成甲基硒代半胱氨酸的方法

<130> BAA191110A

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagctcac cgctgattac agattttctg catcaagcgg gcagagcagc ggttattgcg 60

ggaggccttg gaacagaact tcagagacat ggagcggatc tgaatgatcc gctttggtca 120

gcaaaatgcc tgctgtcatg tccgcatctg attagacagg tgcatctgga ttatctggaa 180

aatggagcag atattattat cacagcgagc tatcaagcga caattcaggg attcaaagca 240

aaaggatttt ctgatgaaga aggagaagcg cttctgagaa gaagcgttga aattgcaaga 300

gaagcgagag atctttatta tcagagatgt gcggaatcaa gcagcgataa tggagatgat 360

tcaagaattc tgaaacagag accgattctg attgcgggaa gcgttggctc atatggcgcg 420

tatctggcgg atggaagcga attttcaggc aattatggag atgcgattaa gagcgaaaca 480

ctgaaagatt ttcatagaag aaaggtgcaa atcctggcag atagcggcgt tgatcttctg 540

gcatttgaag cagttccgaa taagctggaa gcgcaggcgt atgcggatct gcttgaagaa 600

gaaaatatta ttacgccggc atggtttgca ttcacttcaa aagatggcaa taatgttgtt 660

tcaggcgata gcattgaaga atgtggatca attgcggaaa gctgcgataa agtggttgcg 720

gtgggaatta attgtacacc gccgagattc attcatgatc ttattcttct tctgaagaag 780

gttacagcga aaccgattgt gatctatccg aatagcggcg aaacatatga tgcaattaga 840

aaagaatggg gacagaattc aggcgtgaca gatgaagatt ttgtgagcta tgtggataaa 900

tggtgcgaaa gcggagcaag cctggtgggc ggctgttgta gaacaacacc ggatacaatt 960

agaggaatct ataaaattct gagcagcgga cagtcaccga cattttcagc gaaataa 1017

<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgaccaccc gacagcattc gtcgtttgct attgttttta tccttggcct gctggccatg 60

ttgatgccgc tgtcgattga tatgtatctg cccgcgctac cggtaatttc agcgcagttt 120

ggcgtaccgg cgggcagtac gcagatgacc ctcagtactt atattctggg ctttgcgttg 180

gggcagttaa tctacgggcc gatggcagac agcttcgggc gtaagccggt ggtgctcggc 240

ggtacgctgg tgtttgccgc cgccgcggtg gcgtgtgcgt tggcaaacac catcgatcag 300

ctgattgtga tgcgtttctt ccacgggctg gctgcggctg cggccagcgt ggtcattaac 360

gccctgatgc gcgatattta cccgaaagaa gagttctcgc ggatgatgtc gtttgtcatg 420

ctggtgacaa ccattgcacc gctgatggca ccgatagttg gcggctgggt gctggtgtgg 480

ctgagctggc attacatctt ctggatcctg gcattagcgg cgattctggc ttcggcaatg 540

attttcttcc tgattaaaga aaccttacca ccggagcgtc gtcagccatt tcacattcgt 600

accactattg gtaactttgc ggcgctgttc cgccataaac gtgtcctgag ctacatgctt 660

gccagtggtt tcagctttgc cgggatgttc tcattcttaa gcgccggacc gtttgtttat 720

attgaaatta accacgtcgc gccggaaaac tttggttatt actttgcgct aaacattgtt 780

tttctgttcg tgatgaccat ctttaacagc cgcttcgtcc gccgcattgg cgcgttaaat 840

atgttccgct cggggttgtg gatacaattt attatggcag cgtggatggt catcagtgcg 900

ctgctggggc tgggattttg gtcgctggtg gttggcgttg cggcgtttgt gggctgcgtg 960

tcgatggtgt catccaatgc gatggcggtc attcttgatg agtttcccca tatggcggga 1020

acggcatctt cgctggcagg aaccttccgt tttggcatag gggcaattgt tggcgcattg 1080

ctttctcttg cgacctttaa ctctgcatgg ccgatgattt ggtcaattgc attctgcgca 1140

accagctcca ttctcttctg tctgtacgcc agtcggccga aaaaacggtg a 1191

<210> 3

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtcgcgaa aagatggggt gttggcgcta ctggtagtgg tcgtatgggg gctaaatttt 60

gtggtcatca aagtggggct tcataacatg ccaccgctga tgctggccgg tttgcgcttt 120

atgctggtcg cttttccggc tatctttttt gtcgcacgac cgaaagtacc actgaatttg 180

ctgctggggt atggattaac catcagtttt gcgcagtttg cttttctttt ttgtgccatt 240

aacttcggta tgcctgctgg actggcttcg ctggtgttac aggcacaggc gttttttact 300

atcatgcttg gcgcgtttac tttcggggag cgactgcatg gcaaacaatt ggcggggatc 360

gccttagcga tttttggcgt actggtgtta atcgaagata gtctgaacgg tcagcatgtg 420

gcgatgctcg gctttatgtt gaccctggcg gcagcattta gttgggcgtg tggcaacatc 480

ttcaataaaa agatcatgtc gcactcaacg cgtccggcgg tgatgtcgct ggtaatctgg 540

agcgctttaa tcccaatcat tcccttcttt gttgcctcgc tgattctcga tggttccgca 600

accatgattc acagtctggt tactatcgat atgaccacca tcttgtctct gatgtatctg 660

gcgtttgtgg cgacaattgt tggttatggg atctggggga cgttactggg acgctatgaa 720

acctggcggg ttgcaccgtt atcgttactg gtgcccgtag taggactggc aagtgcggca 780

ctattgttgg atgaacgctt aacgggtctg caatttttag gtgcggtgct cattatgacc 840

gggctgtata tcaatgtatt tggcttgcgg tggcgtaaag cggtaaaggt gggaagttaa 900

<210> 4

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc 60

caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt 120

aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta 180

ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac 240

ggcatcaact ctaacgcgac cagtgcgtcc ttgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg 300

tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacgtat 360

cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat 420

gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat 480

caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc 540

gcacagtacg ataccgtgct ggcgaacgaa gtgaccgcac gtaataacct tgataacgcg 600

gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggctgc gctgaatgtc 660

gaaaacttta aaaccgacaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa 720

cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggcgcgcga gcaaattcgc 780

caggcgcagg atggtcactt accgactctg gatttaacgg cttctaccgg gatttctgac 840

acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat 900

atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt 960

aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgtcggtg ccagcgagca actggaaagt 1020

gcccatcgta gcgtcgtgca gaccgtgcgt tcctccttca acaacattaa tgcatctatc 1080

agtagcatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgctc aaagctcatt agacgcgatg 1140

gaagcgggct actcggtcgg tacgcgtacc attgttgatg tgttggatgc gaccaccacg 1200

ttgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg 1260

aatattaagt cagctctggg tacgttgaac gagcaggatc tgctggcact gaacaatgcg 1320

ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgcac cgcaaacgcc ggaacagaat 1380

gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcaccag tcgttcagca aacatccgca 1440

cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaact ga 1482

<210> 5

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgacaccga cccttttaag tgctttttgg acttacaccc tgattaccgc catgacgcca 60

ggaccgaaca atattctcgc ccttagctca gctacaacgc acggatttcg tcagagtact 120

cgcgtgctgg cagggatgag tctgggattt ttaatcgtca tgttgctatg cgcgggaatt 180

tcgttttcac tggctgttat cgacccggca gcagtgcatc tgttgagttg ggcaggggcg 240

gcatatattg tctggctggc gtggaaaatc gctaccagtc caacaaagga agatgggctt 300

cagacaaaac caatcagttt ttgggccagc tttgctttgc agtttgtgaa cgtcaaaatc 360

attttgtatg gcattacagc actgtcgacg tttgtcctgc cgcaaacgca ggcgctaagc 420

tggataattg gcgtcagcgt tttgctggcg atgattggga cgtttggcaa tgtgtgctgg 480

gcgctggcgg ggcacctgtt tcagcgattg tttcgccagt atggtcgcca gttaaatatc 540

gtgctcgcgc tgctgctggt ctattgcgcg gtacgcattt tctattaa 588

<210> 6

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcgcgctt tgctacccta tctggcactg tataaacgtc ataaatggat gttaagtctt 60

ggtattgtgc tggcaattgt gacgctgctc gccagtatcg gtctgttgac actttccggc 120

tggttcctct cggcctcagc ggttgcgggg gttgccggac tgtacagctt caactatatg 180

ctacccgctg cgggcgtgcg tggcgcagca atcacccgta ctgccgggcg ctattttgaa 240

cgtctggtaa gtcacgacgc gactttccgc gtgttgcagc atctgcgcat ttacaccttc 300

agcaaattgc tgcccctctc ccctgccgga ctggcgcgct atcgtcaggg cgaattgctc 360

aatcgcgtgg tggcggatgt tgatacgctc gatcatcttt acctgcgcgt tatctcgccg 420

ctggtgggcg cttttgtggt gattatggtg gtgacaatcg ggttaagttt ccttgatttc 480

accctcgcct ttacgctggg cggcattatg ttactgacgc ttttcctgat gccaccgctg 540

ttttatcgtg cgggaaaaag caccgggcaa aatctgactc atcttcgcgg acagtatcgc 600

caacaactga cggcctggct gcaagggcaa gctgagctga ccatttttgg tgccagcgat 660

cgttatcgca cgcaactaga gaatacagaa attcaatggc tggaagcgca acgccgtcaa 720

tctgaactga ccgcattgtc gcaagcgata atgctgctca ttggcgcgtt agcggtgatc 780

ctgatgctgt ggatggcgtc tggcggcgtt ggcggcaatg ctcaacccgg cgcgttaatt 840

gccctgtttg tcttctgcgc gttagccgcg tttgaagcac tggcaccagt aacgggtgca 900

tttcagcatc tggggcaagt cattgcctct gccgtacgta tctctgactt aacggatcaa 960

aaaccggagg tcacctttcc tgatacccaa actcgtgttg ccgatcgcgt ttcgctgacg 1020

ttacgggatg ttcagttcac ttatccggag caatctcaac aggcacttaa agggatttct 1080

cttcaggtaa acgccgggga acatatagcg attctcgggc gaaccggatg cggcaaatca 1140

acactgttac aacagctgac ccgcgcatgg gacccgcaac agggcgagat tttgcttaac 1200

gatagcccca tagccagcct gaatgaagcg gctctacgac agaccatcag cgttgttcct 1260

cagcgagtgc atctgtttag cgccacgctg cgtgataatc ttttactcgc ctcgcctggc 1320

agtagtgatg aggctctgtc ggagatcttg cgtcgcgttg gcctggaaaa gctgctcgag 1380

gatgcaggtc tcaacagttg gttaggtgaa ggcggacgcc agctctccgg tggtgaactg 1440

cgccgtctgg ctatcgcccg tgcgctgtta catgatgcgc cactggtgtt gctggatgaa 1500

cctaccgaag gcttagatgc cacaaccgaa agccagatcc ttgaattgct tgcagaaatg 1560

atgcgtgaga aaacggtgtt aatggtcacc catcgacttc gcggactctc tcgtttccaa 1620

caaataatag tgatggacaa cgggcaaatt attgagcaag gtactcacgc agaactgctt 1680

gccagacagg ggcgttatta ccagttcaag cagggtttgt aa 1722

<210> 7

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Ser Ser Pro Leu Ile Thr Asp Phe Leu His Gln Ala Gly Arg Ala

1 5 10 15

Ala Val Ile Ala Gly Gly Leu Gly Thr Glu Leu Gln Arg His Gly Ala

20 25 30

Asp Leu Asn Asp Pro Leu Trp Ser Ala Lys Cys Leu Leu Ser Cys Pro

35 40 45

His Leu Ile Arg Gln Val His Leu Asp Tyr Leu Glu Asn Gly Ala Asp

50 55 60

Ile Ile Ile Thr Ala Ser Tyr Gln Ala Thr Ile Gln Gly Phe Lys Ala

65 70 75 80

Lys Gly Phe Ser Asp Glu Glu Gly Glu Ala Leu Leu Arg Arg Ser Val

85 90 95

Glu Ile Ala Arg Glu Ala Arg Asp Leu Tyr Tyr Gln Arg Cys Ala Glu

100 105 110

Ser Ser Ser Asp Asn Gly Asp Asp Ser Arg Ile Leu Lys Gln Arg Pro

115 120 125

Ile Leu Ile Ala Gly Ser Val Gly Ser Tyr Gly Ala Tyr Leu Ala Asp

130 135 140

Gly Ser Glu Phe Ser Gly Asn Tyr Gly Asp Ala Ile Lys Ser Glu Thr

145 150 155 160

Leu Lys Asp Phe His Arg Arg Lys Val Gln Ile Leu Ala Asp Ser Gly

165 170 175

Val Asp Leu Leu Ala Phe Glu Ala Val Pro Asn Lys Leu Glu Ala Gln

180 185 190

Ala Tyr Ala Asp Leu Leu Glu Glu Glu Asn Ile Ile Thr Pro Ala Trp

195 200 205

Phe Ala Phe Thr Ser Lys Asp Gly Asn Asn Val Val Ser Gly Asp Ser

210 215 220

Ile Glu Glu Cys Gly Ser Ile Ala Glu Ser Cys Asp Lys Val Val Ala

225 230 235 240

Val Gly Ile Asn Cys Thr Pro Pro Arg Phe Ile His Asp Leu Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Lys Lys Val Thr Ala Lys Pro Ile Val Ile Tyr Pro Asn Ser

260 265 270

Gly Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Arg Lys Glu Trp Gly Gln Asn Ser Gly

275 280 285

Val Thr Asp Glu Asp Phe Val Ser Tyr Val Asp Lys Trp Cys Glu Ser

290 295 300

Gly Ala Ser Leu Val Gly Gly Cys Cys Arg Thr Thr Pro Asp Thr Ile

305 310 315 320

Arg Gly Ile Tyr Lys Ile Leu Ser Ser Gly Gln Ser Pro Thr Phe Ser

325 330 335

Ala Lys

<210> 8

<211> 396

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Val Thr Thr Arg Gln His Ser Ser Phe Ala Ile Val Phe Ile Leu Gly

1 5 10 15

Leu Leu Ala Met Leu Met Pro Leu Ser Ile Asp Met Tyr Leu Pro Ala

20 25 30

Leu Pro Val Ile Ser Ala Gln Phe Gly Val Pro Ala Gly Ser Thr Gln

35 40 45

Met Thr Leu Ser Thr Tyr Ile Leu Gly Phe Ala Leu Gly Gln Leu Ile

50 55 60

Tyr Gly Pro Met Ala Asp Ser Phe Gly Arg Lys Pro Val Val Leu Gly

65 70 75 80

Gly Thr Leu Val Phe Ala Ala Ala Ala Val Ala Cys Ala Leu Ala Asn

85 90 95

Thr Ile Asp Gln Leu Ile Val Met Arg Phe Phe His Gly Leu Ala Ala

100 105 110

Ala Ala Ala Ser Val Val Ile Asn Ala Leu Met Arg Asp Ile Tyr Pro

115 120 125

Lys Glu Glu Phe Ser Arg Met Met Ser Phe Val Met Leu Val Thr Thr

130 135 140

Ile Ala Pro Leu Met Ala Pro Ile Val Gly Gly Trp Val Leu Val Trp

145 150 155 160

Leu Ser Trp His Tyr Ile Phe Trp Ile Leu Ala Leu Ala Ala Ile Leu

165 170 175

Ala Ser Ala Met Ile Phe Phe Leu Ile Lys Glu Thr Leu Pro Pro Glu

180 185 190

Arg Arg Gln Pro Phe His Ile Arg Thr Thr Ile Gly Asn Phe Ala Ala

195 200 205

Leu Phe Arg His Lys Arg Val Leu Ser Tyr Met Leu Ala Ser Gly Phe

210 215 220

Ser Phe Ala Gly Met Phe Ser Phe Leu Ser Ala Gly Pro Phe Val Tyr

225 230 235 240

Ile Glu Ile Asn His Val Ala Pro Glu Asn Phe Gly Tyr Tyr Phe Ala

245 250 255

Leu Asn Ile Val Phe Leu Phe Val Met Thr Ile Phe Asn Ser Arg Phe

260 265 270

Val Arg Arg Ile Gly Ala Leu Asn Met Phe Arg Ser Gly Leu Trp Ile

275 280 285

Gln Phe Ile Met Ala Ala Trp Met Val Ile Ser Ala Leu Leu Gly Leu

290 295 300

Gly Phe Trp Ser Leu Val Val Gly Val Ala Ala Phe Val Gly Cys Val

305 310 315 320

Ser Met Val Ser Ser Asn Ala Met Ala Val Ile Leu Asp Glu Phe Pro

325 330 335

His Met Ala Gly Thr Ala Ser Ser Leu Ala Gly Thr Phe Arg Phe Gly

340 345 350

Ile Gly Ala Ile Val Gly Ala Leu Leu Ser Leu Ala Thr Phe Asn Ser

355 360 365

Ala Trp Pro Met Ile Trp Ser Ile Ala Phe Cys Ala Thr Ser Ser Ile

370 375 380

Leu Phe Cys Leu Tyr Ala Ser Arg Pro Lys Lys Arg

385 390 395

<210> 9

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp

1 5 10 15

Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Pro

20 25 30

Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile

35 40 45

Phe Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr

50 55 60

Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile

65 70 75 80

Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln

85 90 95

Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu

100 105 110

His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu

115 120 125

Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Leu Gly

130 135 140

Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile

145 150 155 160

Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser

165 170 175

Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala

180 185 190

Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr

195 200 205

Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala

210 215 220

Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu

225 230 235 240

Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu

245 250 255

Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe

260 265 270

Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly

275 280 285

Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser

290 295

<210> 10

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe

1 5 10 15

Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala

20 25 30

Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala

35 40 45

Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu

50 55 60

Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn

65 70 75 80

Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser

85 90 95

Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala

100 105 110

Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr Leu Ile

115 120 125

Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val

130 135 140

Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp

145 150 155 160

Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val

165 170 175

Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr

180 185 190

Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ile Thr

195 200 205

Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys

210 215 220

Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys

225 230 235 240

Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Ala Arg

245 250 255

Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Leu

260 265 270

Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Thr

275 280 285

Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn

290 295 300

Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val

305 310 315 320

Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ser Glu

325 330 335

Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg Ser Ser

340 345 350

Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gln

355 360 365

Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr

370 375 380

Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Thr

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu

405 410 415

Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln

420 425 430

Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser Thr Asn

435 440 445

Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp

450 455 460

Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala

465 470 475 480

Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn

485 490

<210> 11

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Val Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr

20 25 30

Thr His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu

35 40 45

Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu

50 55 60

Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala

65 70 75 80

Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys

85 90 95

Glu Asp Gly Leu Gln Thr Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala

100 105 110

Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Ile Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Ile Ile Gly

130 135 140

Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp

145 150 155 160

Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg

165 170 175

Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg

180 185 190

Ile Phe Tyr

195

<210> 12

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Arg Ala Leu Leu Pro Tyr Leu Ala Leu Tyr Lys Arg His Lys Trp

1 5 10 15

Met Leu Ser Leu Gly Ile Val Leu Ala Ile Val Thr Leu Leu Ala Ser

20 25 30

Ile Gly Leu Leu Thr Leu Ser Gly Trp Phe Leu Ser Ala Ser Ala Val

35 40 45

Ala Gly Val Ala Gly Leu Tyr Ser Phe Asn Tyr Met Leu Pro Ala Ala

50 55 60

Gly Val Arg Gly Ala Ala Ile Thr Arg Thr Ala Gly Arg Tyr Phe Glu

65 70 75 80

Arg Leu Val Ser His Asp Ala Thr Phe Arg Val Leu Gln His Leu Arg

85 90 95

Ile Tyr Thr Phe Ser Lys Leu Leu Pro Leu Ser Pro Ala Gly Leu Ala

100 105 110

Arg Tyr Arg Gln Gly Glu Leu Leu Asn Arg Val Val Ala Asp Val Asp

115 120 125

Thr Leu Asp His Leu Tyr Leu Arg Val Ile Ser Pro Leu Val Gly Ala

130 135 140

Phe Val Val Ile Met Val Val Thr Ile Gly Leu Ser Phe Leu Asp Phe

145 150 155 160

Thr Leu Ala Phe Thr Leu Gly Gly Ile Met Leu Leu Thr Leu Phe Leu

165 170 175

Met Pro Pro Leu Phe Tyr Arg Ala Gly Lys Ser Thr Gly Gln Asn Leu

180 185 190

Thr His Leu Arg Gly Gln Tyr Arg Gln Gln Leu Thr Ala Trp Leu Gln

195 200 205

Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ile Phe Gly Ala Ser Asp Arg Tyr Arg Thr

210 215 220

Gln Leu Glu Asn Thr Glu Ile Gln Trp Leu Glu Ala Gln Arg Arg Gln

225 230 235 240

Ser Glu Leu Thr Ala Leu Ser Gln Ala Ile Met Leu Leu Ile Gly Ala

245 250 255

Leu Ala Val Ile Leu Met Leu Trp Met Ala Ser Gly Gly Val Gly Gly

260 265 270

Asn Ala Gln Pro Gly Ala Leu Ile Ala Leu Phe Val Phe Cys Ala Leu

275 280 285

Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ala Pro Val Thr Gly Ala Phe Gln His Leu

290 295 300

Gly Gln Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Ile Ser Asp Leu Thr Asp Gln

305 310 315 320

Lys Pro Glu Val Thr Phe Pro Asp Thr Gln Thr Arg Val Ala Asp Arg

325 330 335

Val Ser Leu Thr Leu Arg Asp Val Gln Phe Thr Tyr Pro Glu Gln Ser

340 345 350

Gln Gln Ala Leu Lys Gly Ile Ser Leu Gln Val Asn Ala Gly Glu His

355 360 365

Ile Ala Ile Leu Gly Arg Thr Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu Leu Gln

370 375 380

Gln Leu Thr Arg Ala Trp Asp Pro Gln Gln Gly Glu Ile Leu Leu Asn

385 390 395 400

Asp Ser Pro Ile Ala Ser Leu Asn Glu Ala Ala Leu Arg Gln Thr Ile

405 410 415

Ser Val Val Pro Gln Arg Val His Leu Phe Ser Ala Thr Leu Arg Asp

420 425 430

Asn Leu Leu Leu Ala Ser Pro Gly Ser Ser Asp Glu Ala Leu Ser Glu

435 440 445

Ile Leu Arg Arg Val Gly Leu Glu Lys Leu Leu Glu Asp Ala Gly Leu

450 455 460

Asn Ser Trp Leu Gly Glu Gly Gly Arg Gln Leu Ser Gly Gly Glu Leu

465 470 475 480

Arg Arg Leu Ala Ile Ala Arg Ala Leu Leu His Asp Ala Pro Leu Val

485 490 495

Leu Leu Asp Glu Pro Thr Glu Gly Leu Asp Ala Thr Thr Glu Ser Gln

500 505 510

Ile Leu Glu Leu Leu Ala Glu Met Met Arg Glu Lys Thr Val Leu Met

515 520 525

Val Thr His Arg Leu Arg Gly Leu Ser Arg Phe Gln Gln Ile Ile Val

530 535 540

Met Asp Asn Gly Gln Ile Ile Glu Gln Gly Thr His Ala Glu Leu Leu

545 550 555 560

Ala Arg Gln Gly Arg Tyr Tyr Gln Phe Lys Gln Gly Leu

565 570

<210> 13

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

attatgtaaa atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacatg 60

agctcaccgc tgattacag 79

<210> 14

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gattacgcca agcttctgca gtctagaccc gggttatttc gctgaaaatg tcgg 54

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agggggaaat gtacaatggt ccaaactagt atgaccaccc gacagcattc gt 52

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcgaggttta gccggcatgc ggccggtacc ggatcctcac cgttttttcg gccgact 57

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agggggaaat gtacaatggt ccaaactagt atgtcgcgaa aagatggggt 50

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcgaggttta gccggcatgc ggccggtacc ggatccttaa cttcccacct ttaccgc 57

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agggggaaat gtacaatggt ccaaactagt atgaagaaat tgctcccc 48

<210> 20

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcgaggttta gccggcatgc ggccggtacc ggatcctcag ttacggaaag ggttat 56

<210> 21

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agggggaaat gtacaatggt ccaaactagt atgacaccga cccttttaag tg 52

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcgaggttta gccggcatgc ggccggtacc ggatccttaa tagaaaatgc gtaccg 56

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agggggaaat gtacaatggt ccaaactagt atgcgcgctt tgctacccta 50

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcgaggttta gccggcatgc ggccggtacc ggatccttac aaaccctgct tgaactggt 59

<210> 25

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgaaaataa tctctaaaat gttagtcggt gcgttagcgt tagccgttac caatgtctat 60

gccgctgaat tgatgaccaa agcggaattt gaaaaagttg aatcgcagta tgaaaaaata 120

ggtgatattt caaccagcaa tgaaatgtcg actgcagatg caaaagaaga tttgatcaaa 180

aaagcggatg aaaaaggggc tgatgtgttg gtactgacct ccggtcaaac tgacaataag 240

atccacggca cggcaaatat ttataagaag aagtaa 276

<210> 26

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Met Lys Ile Ile Ser Lys Met Leu Val Gly Ala Leu Ala Leu Ala Val

1 5 10 15

Thr Asn Val Tyr Ala Ala Glu Leu Met Thr Lys Ala Glu Phe Glu Lys

20 25 30

Val Glu Ser Gln Tyr Glu Lys Ile Gly Asp Ile Ser Thr Ser Asn Glu

35 40 45

Met Ser Thr Ala Asp Ala Lys Glu Asp Leu Ile Lys Lys Ala Asp Glu

50 55 60

Lys Gly Ala Asp Val Leu Val Leu Thr Ser Gly Gln Thr Asp Asn Lys

65 70 75 80

Ile His Gly Thr Ala Asn Ile Tyr Lys Lys Lys

85 90

<210> 27

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

agggggaaat gtacaatggt ccaaactagt atgaaaataa tctctaaaat gtta 54

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gcgaggttta gccggcatgc ggccggtacc ggatccttac ttcttcttat aaatatttgc 60

Claims (7)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的SMT蛋白和半胱氨酸转运蛋白；所述半胱氨酸转运蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的半胱氨酸转运蛋白Bcr、氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的半胱氨酸转运蛋白YdeD、氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的半胱氨酸转运蛋白TolC、氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的半胱氨酸转运蛋白YfiK或氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示的半胱氨酸转运蛋白CydD。

2.如权利要求1所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pP43NMK质粒或pSTOP1622质粒为载体，表达SMT蛋白和半胱氨酸转运蛋白。

3.一种构建权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将编码SMT蛋白的基因和载体进行Gibson组装，得到重组载体-SMT，将重组载体-SMT转入枯草芽孢杆菌中得到重组菌-SMT；

（2）将编码半胱氨酸转运蛋白的基因和载体进行Gibson组装，得到重组载体-半胱氨酸转运蛋白，将重组载体-半胱氨酸转运蛋白转入到步骤（1）获得的重组菌-SMT中，得到权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌。

4.一种制备甲基硒代半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法为：以权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产甲基硒代半胱氨酸。

5.如权利要求4所述的制备甲基硒代半胱氨酸的方法，其特征在于，先将权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于温度为30~38℃、转速为150~300 rpm的条件下进行培养，最终获得含有甲基硒代半胱氨酸的发酵液。

6.如权利要求5所述的制备甲基硒代半胱氨酸的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌的种子液的OD₆₀₀不低于1.8。

7.权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求3所述的构建方法得到的重组枯草芽孢杆菌或权利要求4~6任一所述的制备方法在制备甲基硒代半胱氨酸或含甲基硒代半胱氨酸产品中的应用。