CN111363018B

CN111363018B - 重组菌株及其在l-色氨酸制备中的应用

Info

Publication number: CN111363018B
Application number: CN202010220862.0A
Authority: CN
Inventors: 张亚; 程江红; 张晓云; 吴涛; 赵津津; 李岩
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: CN111363018A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组菌株及其在L‑色氨酸制备中的应用。本发明提供了突变的mg1B蛋白及编码该蛋白的核酸分子，菌株中含有1amB^Tyr143Leu，mg1B^Thr31Ser突变，则该菌株被赋予异麦芽糖的利用能力。在过表达glvA基因和glvC基因的菌株中引入上述突变，则该菌株具有利用异麦芽糖能力且可以产生L‑色氨酸，本发明进一步的提供了利用该微生物生产L‑色氨酸的方法。更具体地，本发明涉及通过改造加进化的方式可利用异麦芽糖，从而更具有提高L‑色氨酸生产能力的大肠杆菌，以及利用该微生物生产L‑色氨酸的方法。

Description

重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用。

背景技术

L-色氨酸是芳香族必需氨基酸的一种，分子式为C₁₁H₁2N₂O₂，白色至黄白色晶体或结晶性粉末。无臭或微臭，长时间光照则着色。与酸在暗处加热较稳定。与其他氨基酸、糖类、醛类共存时极易分解。

L-色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。在医药领域，是氨基酸输液的重要组分和重要的医药中间体，可用于孕妇营养补剂和乳幼儿特殊奶粉，用于烟酸缺乏症(糙皮病)治疗药，作为安神药，调节精神节律、改善睡眠。在食品应用领域，色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促进发酵。在饲料领域，色氨酸还可促进动物的采食、削弱应激反应、改善动物睡眠，还可以增加胎儿和幼仔的抗体、提高乳畜泌乳。降低日粮优质蛋白用量，节约饲料成本，降低日粮蛋白饲料用量，节约配方空间等。

L-色氨酸可由化学合成法、蛋白质水解法，酶促转化法、直接发酵法、添加前体发酵法进行生产。目前主流生产方法为直接发酵法。

目前工业上生产氨基酸，常已甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，在L-色氨酸发酵生产中也不例外，以糖作为原料添加在培养基中。甘蔗糖蜜中含有大量的淀粉，而很少直接作为原料进行添加，而是在淀粉酶等糖化酶液的作用下，变为淀粉水解液，主要成分是单糖葡萄糖，除此之外，还含有二糖麦芽糖、异麦芽糖或者三糖潘糖等这样的小分子糖。在发酵过程中，当使用淀粉水解液作为原料时，发酵一定程度仅作为主要成分葡萄糖可以被完全消耗，而麦芽糖、异麦芽糖、潘糖等杂糖不能被利用，他们将与L-氨基酸发生美拉德反应，使氨基酸在纯化步骤成为问题，影响提取的收率。因此，降低发酵培养基剩余的杂多糖，可减少提取压力，提高产品纯度，进而节约生产成本，增加效益。

早期，已有研究人员发现在酿酒酵母中，存在基因AGT1，其编码Agtlp蛋白质，可将麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖等各自α-糖苷摄入到菌体(Han，E.K.，et al.，MolecularMicrobiology.1995，17，1093.)。异麦芽糖的同化除了需要异麦芽糖转运蛋白以外，还需要异麦芽糖酶存在，研究人员发现在枯草芽孢杆菌中存在malL基因，编码α-糖苷酶，可水解蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖等多糖(Michael K.Dahl.，et al.，Joumalofbacteriology，1998，2574-2578)。2001年，研究人员发现，在肺炎克雷伯氏菌中，存在aglB和aglA基因，其中aglA基因编码转运蛋白，可将蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖等摄入到胞内，aglB基因编码磷酸-α-葡萄糖苷酶，将6-磷酸-α-糖苷分解为葡萄糖等，将多糖进行利用(John Thompson，etal.，The Journal of Biological Chemistry.2001，37415-37425)。

大肠杆菌遗传背景更清晰，且培养条件简单，将其作为基因工程菌株具有发酵操作简单的优势，但以大肠杆菌为代表的肠杆菌科细菌群通常不能同化异麦芽糖，也不能确定其是否能够将异麦芽糖摄入到菌体内。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用，该菌株以大肠杆菌为底盘菌，能够利用异麦芽糖，且能够产生L-色氨酸。

本发明提供了突变的mglB蛋白，其第31位苏氨酸突变为丝氨酸。

本发明中，突变的mglB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了编码所述突变的mglB蛋白的核酸分子。

本发明中，突变的mglB基因的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明所述的蛋白或的核酸分子在构建可利用异麦芽糖的重组宿主中的应用。

本发明还提供了重组埃希氏菌，其glvA基因和glvC基因过表达，且lamB基因和/或mglB基因发生突变。

本发明提供的重组埃希氏菌中，glvA基因和glvC基因过表达，且lamB基因和mglB基因发生突变。

本发明中，过表达的glvA基因和glvC基因来自枯草芽孢杆菌。

本发明中，所述lamB基因突变使lamB蛋白的第143位酪氨酸突变为亮氨酸；所述mglB基因突变使mglB蛋白的第31位苏氨酸突变为丝氨酸。

在本发明中，突变lamB基因的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，突变的lamB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明中，所述重组埃希氏菌为重组的大肠埃希氏菌。

一些实施例中，所述重组埃希氏菌的其出发菌株为大肠埃希氏菌SA01。

所述的重组埃希氏菌的保藏编号为CGMCC No.19056。

本发明还提供了重组埃希氏菌的构建方法，

其过表达glvA基因和glvC基因后，利用异麦芽糖进行定向进化；

或过表达glvA基因和glvC基因后，采用基因工程手段引入lamB基因和/或mglB基因的突变。

本发明实施例中，采用定向进化的方法获得突变的lamB基因和/或mglB基因。所述定向进化采用含有异麦芽糖的培养基，其中异麦芽糖的浓度为2g/L。

本发明还提供了重组埃希氏菌在制备L-色氨酸中的应用。

本发明提供的重组埃希氏菌异源引入枯草芽孢杆菌的glvA和glvC基因，仍不能利用异麦芽糖，通过定向进化，获得可利用异麦芽糖同时高产L-色氨酸的菌株。经验证，在含2g/l异麦芽糖的M9培养基上验证生长，同出发菌株SA01相比，SMW040菌株(进化)具有明显的生长优势，同时可100％利用异麦芽糖。在同时含有20g/l葡萄糖和6g/l异麦芽糖的培养基中，发酵24h，出发菌株MHZ-0800生长受到一定程度抑制，异麦芽糖没有被消耗，同时产酸仅1.02g/l；而突变菌株MHZ-0812正常生长，OD值未受影响，产酸提高至3.41g/L。

本发明还提供了一种L-色氨酸的制备方法，其培养本发明所述的重组菌株，获得含有L-色氨酸的培养液。

本发明中，培养所述重组菌株的培养基中，葡萄糖的浓度为20g/L，异麦芽糖的浓度为6g/L。

本发明中，所述培养重组菌株的培养液包括水和如下浓度的组分：

本发明中，所述培养重组菌株的条件为37℃，220rpm，pH值为7.0，发酵24h。

所述发酵前，还包括菌种活化的步骤，所述活化的培养基包括水和如下浓度的组分：

本发明提供了突变的mglB蛋白及编码该蛋白的核酸分子，菌株中含有lamB^Tyr143Leu，mglB^Thr31Ser突变，则该菌株被赋予异麦芽糖的利用能力。在过表达glvA基因和glvC基因的菌株中引入上述突变，则该菌株具有利用异麦芽糖能力且可以产生L-色氨酸，本发明进一步的提供了利用该微生物生产L-色氨酸的方法。更具体地，本发明涉及通过改造加进化的方式可利用异麦芽糖，从而更具有提高L-色氨酸生产能力的大肠杆菌，以及利用该微生物生产L-色氨酸的方法。

生物保藏说明

生物材料MHZ-0812，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli.，于2019年11月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19056。

具体实施方式

本发明提供了重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

实施例中涉及的引物名称及序列如表1

表1引物名称及序列

实施例中涉及菌株：

SA01是在野生菌E.coli K-12的基础上，失活基因tnaA和serA得到，之后将生产色氨酸的质粒pMG43导入到SA01即得到MHZ-0800；因此SA01有保藏菌株，不需要在MHZ-0800的基础上再消除pMG43质粒得到；

MHZ-0800(CGMCC NO.6863)遗传背景如下：野生菌E.coli K-12(CICC 10303)为出发菌，失活丝氨酸合成路径serA基因(目的：防止之后pMG43质粒丢失)、同时失活色氨酸内运基因tnaA，得到SA01；pMG43质粒的导入过表达了色氨酸末端合成路径的trpEDCBA操纵子以及前体供应路径的aroG基因。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：过表达glvA/glvC基因方案pTargetF载体和全长片段的构建

(1)过表达glvA基因方案pTargetF-glvA载体以及P1-glvA全长片段构建

首先使用gRNAglvAup-f1/glvA-pF-r为引物，以质粒pTargetT为模板，通过PCR法扩增在5’区具有speI限制性酶位点以及3’区具有SalI限制性酶位点的包含N20和sgRNA的片段；其次用限制性酶speI和salI处理扩增的片段和pTargetT质粒载体，进行片段胶回收；然后，将处理后的载体和片段进行T4酶连接，以构建pTargetF-glvA质粒。

首先使用glvAup-f1/P1-glvAup-r1为引物，以色氨酸菌株MHZ-0800基因组为模板，通过PCR法扩增出glvA插入位点的上游同源臂(片段1)；其次，以P1-glvAdn-fl/P1-glvAdn-r1为引物，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，通过PCR法扩增出glvA基因全长(片段2)；引物对P1-glvAdn-f2/P1-glvAdn-r1以glvA基因全长(片段2)为模板扩增出glvA基因全长和P1启动子(片段3，SEQ ID NO：1)，然后，以glvAdn-f1/glvAdn-r1为引物，以色氨酸菌株MHZ-0800为模板，通过PCR法扩增出glvA插入位点的下游同源臂(片段4)；最后对4个片段OE-PCR扩增得到2590bp个碱基对的上游+P1-glvA+下游全长片段。

(2)过表达glvC基因方案pTargetF-glvC载体以及P1-glvC全长片段构建

首先使用gRNAglvCup-f1/glvC-pF-r为引物，以质粒pTargetT为模板，通过PCR法扩增扩增在5’区具有speI限制性酶位点以及3’区具有BglII限制性酶位点的包含N20和sgRNA的片段；其次用限制型酶speI/BglII进行处理扩增的片段和pTargetT质粒载体，进行片段胶回收；然后，将处理后的载体和片段进行T4酶连接，以构建pTargetF-glvC质粒。

首先使用glvCup-f1/P1-glvCup-r1为引物对，以色氨酸菌MHZ-0800基因组为模板，通过PCR法扩增出插入位点的上游同源臂(片段1)；其次，引物对P1-glvCdn-f1/P1-glvCdn-r1以枯草芽孢杆菌168基因组为模板扩增出glvC基因全长(片段2)；引物对P1-glvCdn-f2/P1-glvCdn-r1以glvC基因全长(片段2)为模板扩增出glvC基因全长和P1启动子(片段3，SEQ ID NO：2)，引物对glvCdn-f1/glvCdn-r1以色氨酸生产菌MHZ-0800基因组为模板扩增出插入位点的下游同源臂(片段4)；对四个片段OE-PCR扩增得到2706bp个碱基对是上游+P1-glvC+下游全长片段。

实施例2：过表达glvA和glvC基因菌株的构建

在本专利示例中，亲代菌株为根据专利WO 87/01130及Mascarenhas D等所描述的方法(Mascarenhas D等，Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis inagenetically engineered strain of escherichia coli.Applied and EnvironmentalMicrobiology，57：2995-2999，1991)构建的色氨酸生产菌MHZ-0800(CGMCC NO.6863)，其宿主菌SA01为E.coli K-12(CICC 10303)衍生的E.coli K-12 CICC 10303 tnaA serA，包含质粒pMG43，为pBR322来源的，包含有serA，及反馈抑制去除aroG和trpEDCBA操纵子的质粒。

从冻存管中取出发菌株SA01(不含pMG43质粒)在LB平板上活化，37℃培养16-24hr，从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的的试管中，37℃，150-240rpm震荡培养2-3hr，至OD₆₀₀值在0.6-0.8之间，6000rpm离心5-10min，弃上清，无菌双蒸水重悬洗涤两次，6000rpm离心5-10min，弃上清，10％甘油重悬洗涤两次，6000rpm离心5-10min，弃上清，取100ul的10％甘油重悬菌体，感受态细胞制备完成，将质粒pCas转入，30℃复苏1小时，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃进行筛选，挑选含有pCas质粒的阳性克隆子，按照上述方法再次制备感受态细胞，在离心收集菌体前1小时加终浓度为10mM的阿拉伯糖诱导RED的表达，电转上述制备的pTargetF-glvC质粒(2ul)和上游+P1-glvC+下游全长片段(10ul)，30℃复苏1小时，涂布含有50μg/mL壮观霉素奇霉素和50μg/mL卡那霉素双抗性的LB平板，30℃进行筛选，以glvCup-f/glvCdn-r为引物对，对克隆子进行PCR鉴定，将正确的阳性克隆子进行测序。

将测序正确的阳性克隆子接含50μg/mL卡纳霉素的LB液体培养基，加入终浓度为0.5mM的IPTG 30℃培养8-20小时，划线含50μg/mL卡那霉素的LB固体分单菌，30℃培养，将单菌落分别对点50μg/mL卡那霉素的LB固体平板和同时含有50μg/mL壮观霉素奇霉素、50μg/mL卡那霉素双抗性LB平板，在双抗性平板不长，单抗平板正常生长的菌为成功消除pTargetF-glvC质粒的阳性克隆子，命名为SMW033。用上述同样的方法，将glvA基因转入SMW033菌株，以glvAup-f/glvAdn-r为引物对，对克隆子进行PCR鉴定，将正确的阳性克隆子进行测序。将测序正确的阳性克隆子接含50μg/mL卡纳霉素的LB液体培养基，加入终浓度为0.5mM的IPTG42℃培养8-20小时，划线无抗的LB固体分单菌，42℃培养，将单菌落分别对点无抗的LB固体平板、含有50μg/mL壮观霉素奇霉素的LB平板、含有50μg/mL卡那霉素的LB平板、含有50μg/mL壮观霉素奇霉素和50μg/mL卡那霉素双抗性LB平板，在双抗性平板和单抗性平板均不长、无抗平板正常生长的菌为成功消除pTargetF-glvC和pCas质粒的阳性克隆子，命名为SMW040，即为同时整合glvA和glvC基因的菌株。

实施例3：通过改造加进化方法获得利用异麦芽糖的菌株

将上述SMW040菌株在无抗的LB平板上划线，37℃培养16-24hr，从平板上挑取单菌落，同时接种到装有5mL含有2g/l异麦芽糖和含有2g/l葡萄糖的基本盐培养基(具体配方如下)的试管中，培养至24h，在含2g/l异麦芽糖的试管不生长，含有2g/l葡萄糖的试管正常生长，OD长至1.3，证明该菌株仍不能利用异麦芽糖，对该菌株进行定向进化。方法如下：将LB平板上的单菌落接种于装有5mL LB培养基的试管中，稀释涂布于含有2g/L异麦芽糖的双抗基本盐培养基上，异麦芽糖纯度为95％。37℃培养70h，将转化子转接划线含有2g/l异麦芽糖的M9平板培养基，37℃继续培养24h，在平板上生长的菌株即为表型正确的阳性克隆子。

基本盐培养基即M9培养基成分：

名称	含量(g/L)
		异麦芽糖	2.0
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	17.1
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	3.0
NaCl	0.5
		NH<sub>4</sub>Cl	1.0
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	0.49
		CaCl<sub>2</sub>	0.011
卡纳霉素(根据需要添加)	50mg
		壮观霉素奇霉素(根据需要添加)	50mg

实施例4：表型正确菌株利用异麦芽糖的生长验证

将平板上表型正确的菌株进一步验证其利用异麦芽糖的效果，将表型正确的阳性克隆子接种到装有5mL LB培养基的的试管中，37℃，150-240rpm震荡培养过夜，按照初始OD为0.05转接到含有2g/l异麦芽糖的M9培养基中，37℃，150-240rpm震荡，12h、24h取样测其OD₆₀₀值和异麦芽糖含量。

结果如下：

表1表型正确菌株异麦芽糖利用生长验证实验结果

备注：培养基添加2g/l异麦芽糖，纯度为95％，液相检测实际含量为1.9g/l。

发酵12h，对照菌株SA01、出发菌SMW040以及SMW040系列(进化)菌株在含有2g/l葡萄糖的M9培养基均可正常生长，OD600均可达到1.2左右，葡萄糖可耗尽。而在含有2g/l异麦芽糖的M9培养基上，发酵至24h，对照菌株SA01、出发菌SMW040几乎没有生长，并且异麦芽糖没有被利用；平板上筛选的表型正确的阳性克隆子SMW040系列(进化)在含有2g/l异麦芽糖的M9培养基上有显著的生长优势，同时菌株可100％利用异麦芽糖。

实施例5：利用异麦芽糖菌株摇瓶发酵生产L.色氨酸

从冻存管中取可以利用异麦芽糖的SMW040系列(进化)菌株在LB平板上活化，制备感受态，将质粒pMG43转化到利用异麦芽糖的菌株中，获得色氨酸生产菌，命名为MHZ-0812。通过摇瓶发酵方法验证其色氨酸生产能力。

工程菌株MHZ-0812被保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.19056。

从冻存管中取大肠杆菌MHZ-0800和利用异麦芽糖工程菌株MHZ-0812在LB平板上(20μg/mL四环素)上活化，37℃培养18-24hr，从平板上刮下一环菌体，接种到装有50mL种子培养基(20μg/mL四环素)的500mL锥形瓶中，37℃，220-240rpm震荡培养培养4-7小时，OD₆₀₀控制在8-10；将2mL种子液转接到装有20mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，往复摇床37℃，220rpm发酵培养，每菌株3个重复，同时将2ml浓度为200g/l的葡萄糖溶液和600ul浓度为200g/l的异麦芽糖溶液转接到发酵培养基中，葡萄糖和异麦芽糖的终浓度20g/l和6g/l。发酵24h，发酵结束还原发酵液初始体积20ml，测样品OD₆₀₀值，用生物传感仪测定发酵液葡萄糖含量，并用HPLC的方法测定发酵液色氨酸含量和异麦芽糖含量。

种子培养基组分：

发酵培养基组分：

名称	用量(g/L)
		葡萄糖	20
异麦芽糖	6
		酵母提取物	1.0
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>.3H<sub>2</sub>O	7.5
		柠檬酸	2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.0
		(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	20.0
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	0.1
		FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.1
ZnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	0.1
		CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.1
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.03
		CaCO<sub>3</sub>	20
pH	7.0

表2色氨酸菌株摇瓶实验结果

备注：培养基中添加6g/l异麦芽糖，纯度为95％，实际含5.7g/l。

24h发酵结束，当培养基中仅含20g/l的葡萄糖时，对照菌株MHZ-0800OD₆₀₀值达21.6，葡萄糖完全被利用，产酸2.4g/l；但当培养中同时添加20g/l葡萄糖和6g/l异麦芽糖时，对照菌株MHZ-0800的生长严重受到抑制，OD₆₀₀值仅9.0，葡萄糖残留7.5g/l，异麦芽糖没有被消耗，同时产酸仅1.02g/l；与MHZ-0800相对比，实验菌MHZ-0812正常生长，OD值未受影响，产酸提高至3.41g/L。。

实施例6：MHZ-0812菌株的全基因测序

对MHZ-0812菌株进行全基因测序，包含2处突变，其中1处为lamB基因第143位由酪氨酸突变为亮氨酸。lamB基因编码外膜孔蛋白，负责麦芽糖和麦芽糊精等的转运，并且对于含有3个葡糖基的糊精转运是必不可少的。有文献报道，该基因的第143位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸可使细胞膜孔径变大，同时也可增加对淀粉、麦芽糖的亲和力。该基因的143位氨基酸由酪氨酸突变为亮氨酸可能是造成MHZ-0812菌株利用异麦芽糖的一个主要原因。另一处突变为为mglB基因第31位由苏氨酸突变为丝氨酸，该基因编码D-半乳糖ABC转运蛋白，为周质膜转运蛋白，第31位氨基酸的突变可能也是导致MHZ-0812菌株利用异麦芽糖的关键因素。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用

<130> MP1937950

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccctttgat attgcatccc gcgtatataa tatgtcaaat cagaagagta ttgctaatga 60

agaaaaaatc attctcaatc gtaatagcgg gcggagggag cactttcact ccagggatcg 120

tactcatgct cttggaccat ttggaggagt ttccgatcag aaagctgaag ctgtatgata 180

atgataagga gagacaggat cgaattgcag gcgcctgtga cgtttttatc agagaaaaag 240

cgccggatat tgaatttgca gcgacgactg acccggaaga agcttttaca gatgtcgatt 300

ttgttatggc gcacatcaga gtagggaaat acgcgatgcg cgcgcttgat gagcaaattc 360

cgttaaagta cggagttgtc ggccaggaga cgtgcgggcc gggcgggatc gcatacggta 420

tgcgttcgat cggcggtgtg cttgaaatat tagattacat ggaaaaatac tcgcctgatg 480

cgtggatgct caattattcc aatccggcgg caattgtggc tgaagctacg agacgcctta 540

gaccgaattc taaaattctc aatatctgtg atatgccggt tgggatcgaa gaccggatgg 600

cgcaaattct tggcttatcc tcaagaaaag aaatgaaggt ccgctattac ggattgaatc 660

atttcggctg gtggacatcg attcaggatc aagagggcaa cgatttaatg ccgaagctga 720

aggaacatgt atcccaatac ggttatattc cgaaaacaga ggctgaagct gtggaggcaa 780

gctggaatga cacgttcgcc aaagcgcgtg acgtgcaggc tgcagatcct gacacactgc 840

cgaatacgta tttgcaatat tatttgttcc cagatgatat ggtgaaaaaa tcaaatccga 900

atcatacgcg ggcgaatgaa gtcatggaag ggcgcgaagc ttttattttc agccaatgtg 960

acatgatcac acgtgaacag tcctcggaaa acagcgaaat taaaatcgat gaccacgcat 1020

cgtatatcgt tgatcttgcc cgggcgattg cctacaacac aggtgaaaga atgctgttga 1080

ttgttgaaaa taacggtgca attgcgaact ttgacccgac tgcgatggtt gaggtgccat 1140

gcatcgtcgg ctcaaatgga cctgaaccga ttaccgttgg caccattccg caattccaga 1200

aagggctcat ggagcagcag gtatccgttg agaagctgac tgttgaagcg tgggcagaga 1260

aatcgttcca aaagctgtgg caggcgctga tcctgtcaaa aacagtgccg aacgcgcgtg 1320

tggcaagact cattcttgag gatttagtgg aggccaacaa agacttctgg cctgagcttg 1380

atcaaagccc aacccgcata tcataa 1406

<210> 2

<211> 1607

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccctttgat attgcatccc gcgtatataa tatgtcaaat cagaagagta ttgctaatgt 60

ttgtgcctgt tttattattc gcgttcgccg gcattatcgt cggtatcagc acgctcttta 120

aaaataaaac cctcatggga ccgctcgccg atcctgacgg tttttggtat cagtgctggt 180

atatcattga gcagggcggc tggactgttt ttaaccaaat gccgctctta ttcgccattg 240

gcatcccggt tgctttggcg aagaaagctc aggcacgcgc ctgtttggaa gcgcttactg 300

tctacctgac attcaactat tttgtcagcg cgatattgac ggtatgggga ggagcatttg 360

gcgtcgacat gaatcaagag gtcggcggaa cgagcgggtt aacgatgatt gcgggcataa 420

aaacgctcga taccaacatc atcggagcca tctttatttc ttcgattgtc gtctttttgc 480

ataatcgcta ttttgataaa aaactgcccg attttctcgg catctttcaa ggctcaacat 540

atatcgtgat gatttccttc tttattatga tcccaattgc gttggctgtg tcttatattt 600

ggccgatggt tcaatcggga atcggctcgc ttcaaagctt cctggttgct tctggggcgg 660

tgggcgtttg gatatacacg tttttggaac ggattttaat tccgaccggc cttcatcact 720

ttatttacac gccgtttatt tatggcccgg ctgtagcgga aggcgggatc gtcacgtatt 780

gggcacagca tctcggcgaa tattcgcaaa gcgccaaacc gctgaaggag ctctttccgc 840

aaggcggatt cgcgcttcac ggcaactcga aaatcttcgg tattccgggt atcgccctgg 900

ctttttatgt gacagccaaa aaggaaaaga aaaaactcgt cgcagggctg ctgattcctg 960

tcacactgac agcgattgtc gccggtatta cagagccgat tgagtttacg ttcttattca 1020

tttcaccttt cttatttgcg gttcacgccg tgcttgccgc cacaatgtcg acagttatgt 1080

atatggccgg cgtcgtcgga aatatgggag gcggactgat tgaggcggta accttgaact 1140

ggattccgct ctttggcagc cacggtatga catatgtgta tcaaattttg atcgggctct 1200

cgtttacagc aatttatttt ttcgtcttca gatttttaat cctcaaattc aatatcgcta 1260

caccaggacg ggaaaaggat gaacagcagg aaacaaagct atattcgaaa aaggaataca 1320

gagaacgaaa aaacaaggat gaaacggcct ccgctgctga aacggctgat gacaccgctt 1380

ttctgtatat tgaagcgctg ggcggaaaag acaacatcac tgaagtcaca aactgcgcca 1440

cccgcctcag agtcagtgtc aaggatgaaa caaaggttga acccgacagc gtattccgcg 1500

cgcttggcgc acacggcgtt gtcaggaacg ggaaggcgtt tcaggtaatt atcggattaa 1560

gcgtgccgca gatgcgggag cgtgtggaaa aaatattgaa tcaataa 1607

<210> 3

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatgatta ctctgcgcaa acttcctctg gcggttgccg tcgcagcggg cgtaatgtct 60

gctcaggcaa tggctgttga tttccacggc tatgcacgtt ccggtattgg ttggacaggt 120

agcggcggtg aacaacagtg tttccagact accggtgctc aaagtaaata ccgtcttggc 180

aacgaatgtg aaacttatgc tgaattaaaa ttgggtcagg aagtgtggaa agagggcgat 240

aagagcttct atttcgacac taacgtggcc tattccgtcg cacaacagaa tgactgggaa 300

gctaccgatc cggccttccg tgaagcaaac gtgcagggta aaaacctgat cgaatggctg 360

ccaggctcca ccatctgggc aggtaagcgc ttctaccaac gtcatgacgt tcatatgatc 420

gacttcttat actgggatat ttctggtcct ggtgccggtc tggaaaacat cgatgttggc 480

ttcggtaaac tctctctggc agcaacccgc tcctctgaag ctggtggttc ttcctctttc 540

gccagcaaca atatttatga ctataccaac gaaaccgcga acgacgtttt cgatgtgcgt 600

ttagcgcaga tggaaatcaa cccgggcggc acattagaac tgggtgtcga ctacggtcgt 660

gccaacttgc gtgataacta tcgtctggtt gatggcgcat cgaaagacgg ctggttattc 720

actgctgaac atactcagag tgtcctgaag ggctttaaca agtttgttgt tcagtacgct 780

actgactcga tgacctcgca gggtaaaggg ctgtcgcagg gttctggcgt tgcatttgat 840

aacgaaaaat ttgcctacaa tatcaacaac aacggtcaca tgctgcgtat cctcgaccac 900

ggtgcgatct ccatgggcga caactgggac atgatgtacg tgggtatgta ccaggatatc 960

aactgggata acgacaacgg caccaagtgg tggaccgtcg gtattcgccc gatgtacaag 1020

tggacgccaa tcatgagcac cgtgatggaa atcggctacg acaacgtcga atcccagcgc 1080

accggcgaca agaacaatca gtacaaaatt accctcgcac aacaatggca ggctggcgac 1140

agcatctggt cacgcccggc tattcgtgtc ttcgcaacct acgccaagtg ggatgagaaa 1200

tggggttacg actacaccgg taacgctgat aacaacgcga acttcggcaa agccgttcct 1260

gctgatttca acggcggcag cttcggtcgt ggcgacagcg acgagtggac cttcggtgcc 1320

cagatggaaa tctggtggta a 1341

<210> 4

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala

20 25 30

Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe

35 40 45

Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu

50 55 60

Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp

65 70 75 80

Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln

85 90 95

Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln

100 105 110

Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly

115 120 125

Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Leu Tyr

130 135 140

Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly

145 150 155 160

Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly

165 170 175

Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr

180 185 190

Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro

195 200 205

Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg

210 215 220

Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe

225 230 235 240

Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val

245 250 255

Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser

260 265 270

Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile

275 280 285

Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser

290 295 300

Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile

305 310 315 320

Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg

325 330 335

Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly

340 345 350

Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr

355 360 365

Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser

370 375 380

Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys

385 390 395 400

Trp Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly

405 410 415

Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp

420 425 430

Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp

435 440 445

<210> 5

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaataaga aggtgttaac cctgtctgct gtgatggcca gcatgttatt cggtgccact 60

gcacacgctg ctgatactcg cattggtgta tcaatctata agtacgacga taactttatg 120

tctgtagtgc gcaaggctat tgagcaagat gcgaaagccg cgccagatgt tcagctgctg 180

atgaatgatt cacagaatga ccagtccaag cagaacgatc agatcgacgt attgctggcg 240

aaaggggtga aggcactggc aatcaacctg gttgacccgg cagctgcggg tacggtgatt 300

gagaaagcgc gtgggcaaaa tgtgccggtg gtattcttta acaaagaacc gtctcgtaag 360

gcgctggata gctacgacaa agcctactac gttggcactg actccaaaga gtccggcatt 420

attcaaggcg atttgattgc taaacactgg gcggcgaatc agggttggga tctgaataaa 480

gacggtcaga ttcaattcgt actgctgaaa ggtgaaccgg gccatccgga tgcagaagca 540

cgtaccactt acgtgattaa agagctgaac gacaaaggca ttaaaactga acagttacag 600

ttagataccg ctatgtggga taccgctcag gcgaaagata agatggacgc ctggctgtct 660

ggcccgaacg ccaacaaaat cgaagtggtt atcgccaaca acgatgcgat ggcaatgggc 720

gcggtagaag cactgaaagc acacaacaag tccagcattc cggtgtttgg cgtcgatgct 780

ctgccagaag cgctggcgct ggtgaaatcc ggtgcactgg cgggcaccgt actgaacgat 840

gctaacaacc aggcgaaagc gacctttgat ctggcgaaaa acctggccga tggtaaaggt 900

gcggctgatg gcaccaactg gaaaatcgac aacaaagtgg tccgcgtacc ttatgttggc 960

gtagataaag acaacctggc tgaattcagc aagaaataa 999

<210> 6

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asn Lys Lys Val Leu Thr Leu Ser Ala Val Met Ala Ser Met Leu

1 5 10 15

Phe Gly Ala Thr Ala His Ala Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Ser Ile

20 25 30

Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile Glu

35 40 45

Gln Asp Ala Lys Ala Ala Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp Ser

50 55 60

Gln Asn Asp Gln Ser Lys Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu Ala

65 70 75 80

Lys Gly Val Lys Ala Leu Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala Ala

85 90 95

Gly Thr Val Ile Glu Lys Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val Phe

100 105 110

Phe Asn Lys Glu Pro Ser Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys Ala

115 120 125

Tyr Tyr Val Gly Thr Asp Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly Asp

130 135 140

Leu Ile Ala Lys His Trp Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn Lys

145 150 155 160

Asp Gly Gln Ile Gln Phe Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His Pro

165 170 175

Asp Ala Glu Ala Arg Thr Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp Lys

180 185 190

Gly Ile Lys Thr Glu Gln Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp Thr

195 200 205

Ala Gln Ala Lys Asp Lys Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn Ala

210 215 220

Asn Lys Ile Glu Val Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met Gly

225 230 235 240

Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val Phe

245 250 255

Gly Val Asp Ala Leu Pro Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly Ala

260 265 270

Leu Ala Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala Thr

275 280 285

Phe Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp Gly

290 295 300

Thr Asn Trp Lys Ile Asp Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val Gly

305 310 315 320

Val Asp Lys Asp Asn Leu Ala Glu Phe Ser Lys Lys

325 330

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatactagta ttaagtttct gctggtagag ttttagagct agaaatagc 49

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgtcgactt caaaaaaagc accgactcgg tgcc 34

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgaacagtg gggctatgtc 20

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacgcgggat gcaatatcaa agggatctac cagcagaaac ttaatcttgt 50

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ataatatgtc aaatcagaag agtattgcta atgaagaaaa aatcattctc aatcg 55

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccctttgat attgcatccc gcgtatataa tatgtcaaat cagaagagta ttgcta 56

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttccagcgcc ttttggtgca cgcctttatg atatgcgggt tgggctttga 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcaaagccca acccgcatat cataaaggcg tgcaccaaaa ggcgctggaa 50

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcgtcgacca tacattccca gcgattcagc 30

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgccgggca acagcccgca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtcagaaaga tgctgtacct 20

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aatactagtc aggcaatgaa agctattccg ttttagagct agaaatagc 49

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaagatcttt caaaaaaagc accgactcgg tgcc 34

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgctgctgat taatgcttcg 20

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tacgcgggat gcaatatcaa agggaggaat agctttcatt gcctgcagcg 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgtcaaatc agaagagtat tgctaatgtt tgtgcctgtt ttattattcg 50

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tccctttgat attgcatccc gcgtatataa tatgtcaaat cagaagagta ttgcta 56

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagcagacgg gcgcgaatgg tacccttatt gattcaatat tttttccaca 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgtggaaaaa atattgaatc aataagggta ccattcgcgc ccgtctgctg 50

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctctagact ccccgttgaa gagtggga 28

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aggtacagca tctttctgac 20

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgagtacgg tcagcgcct 19

Claims

1.保藏编号为CGMCC No.19056埃希氏菌。

2.权利要求1所述的埃希氏菌在制备L-色氨酸中的应用。

3.L-色氨酸的制备方法，其特征在于，培养权利要求1所述的埃希氏菌，获得含有L-色氨酸的培养液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养的培养液包括水和如下浓度的组分：