CN1993461A

CN1993461A - 使用肠杆菌科菌株生产l－氨基酸的方法

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Publication number: CN1993461A
Application number: CNA200580026261XA
Authority: CN
Inventors: 梅希特希尔德·里平
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2005-07-05
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2025-07-05
Also published as: US20090068711A1; CN1993461B; EP1776451B1; WO2006015669A1; US7759094B2; ATE524540T1; EP1776451A1; DK1776451T3; ES2372290T3; DE102004037572A1

Abstract

本发明涉及一种通过发酵肠杆菌科的重组微生物生产L－氨基酸的方法，其特征是：a)在培养基中培养产生所希望的L－氨基酸并且其中lamB基因或编码基因产物麦芽糖孔蛋白的核苷酸序列被扩增，特别被过表达的微生物，所述培养在使得所希望的L－氨基酸在所述培养基中或细菌中被富集的条件下进行，和b)分离所希望的L－氨基酸，其中发酵肉汤中的组分和/或生物量以其整体或部分保留(＝0 bis 100％)在分离的产物中或被完全移除。

Description

使用肠杆菌科菌株生产L-氨基酸的方法

本发明涉及一种使用肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的重组微生物生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的方法，所述重组微生物中lamB基因或编码其基因产物麦芽糖孔蛋白(maltoporin)的核苷酸序列是扩增的，特别是过表达的，本发明还涉及这些微生物。

现有技术

L-氨基酸、尤其是L-苏氨酸，被用于人类药物及制药工业、食品工业、以及特别用于动物营养。

已知氨基酸是通过肠杆菌菌株，尤其是大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的发酵而生产的。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵方法，如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的成分如发酵期间的糖浓度，或涉及产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或涉及微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性的菌株或对调节重要的代谢物是营养缺陷的并产生氨基酸例如L-苏氨酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的类似方法也已经用于肠杆菌科的生产L-氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因并研究对生产的作用而进行。关于大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella)的细胞和分子生物学的信息概述可见于Neidhardt(ed)：Escherichia.coli andSalmonella，Cellular and Molecular Biology，2nd edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)。

发明目的

本发明人目的在于为L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的改良发酵生产而提供新方法。

发明描述

本发明涉及肠杆菌科重组微生物，其含有扩增的或过表达的编码具有麦芽糖孔蛋白LamB活性的多肽的lamB基因，并且以改良的方式生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸。

作为对比起始点，在每种情况中非重组的微生物不含有扩增的lamB基因。

这些微生物特别包括肠杆菌科的微生物，其中编码与选自SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列至少90％、特别至少95％、优选99％相同的多肽的多核苷酸是扩增的，所述多肽即具有麦芽糖孔蛋白LamB活性的多肽。

优选所述多肽的氨基酸序列与的SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或者SEQ ID No.8氨基酸序列相同。

所述微生物含有扩增的或者过表达的多核苷酸，选自：

a)具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；

b)具有在遗传密码简并范围内相应于SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；

c)具有在严格条件下与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ IDNo.7的序列的互补序列杂交的序列的多核苷酸；

d)具有含有功能性中性有义突变的SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7序列的多核苷酸，

所述多核苷酸编码基因产物麦芽糖孔蛋白(见下述)。

本发明另外涉及一种使用肠杆菌科的重组微生物通过发酵生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的方法，所述微生物特别已经产生L-氨基酸，并且其中至少lamB基因或者编码基因产物maltoporin LamB的核苷酸序列是扩增的。

优选使用所描述的微生物。

在下文中，如果提及L-氨基酸或氨基酸，这是指选自如下一组的一或多种氨基酸，包括其盐：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。优选L-苏氨酸。

本文中术语“扩增”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或者蛋白质的胞内活性或浓度增加，例如将基因的拷贝数增加至少一个，将基因与强启动子功能性连接或者使用编码具有高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，及在合适的情况下组合使用这些方法。

所述扩增方法、尤其是过表达提高了相应蛋白质的活性或浓度，基于野生型蛋白质或非重组微生物中所述蛋白质的活性或浓度，一般提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最多高至1000％或2000％。非重组微生物或者亲代菌株是指对其施行本发明方法的微生物。

本发明涉及一种通过发酵肠杆菌科重组微生物生产L-氨基酸的方法，特征在于：

a)在希望的L-氨基酸在培养基或者细胞中富集的条件下，将生产希望的L-氨基酸的微生物在培养基中培养，所述微生物中lamB基因或者编码其基因产物的核苷酸序列是扩增的、特别是过表达的，

b)分离希望的L-氨基酸，如果合适，发酵肉汤的成分和/或生物量的全部或者部分(≥0至100％)保留在分离的产物中或者被完全除去。

特别的具有扩增的或者过表达的lamB基因的重组微生物(即本发明的主题)可以由葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉(如果合适)，纤维素(如果合适)，或由甘油和乙醇生产L-氨基酸。所述微生物是肠杆菌科成员，选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属的情况中，特别可以使用大肠杆菌，在沙雷氏菌属的情况中，特别可以使用粘质沙雷氏菌。

重组微生物通常使用包含希望的基因、该基因的等位基因或其一部分或者扩增该基因表达的启动子的载体，通过转化、转导、接合或者这些方法的组合产生。

合适的特别的生产L-苏氨酸的埃希氏菌属，特别是大肠杆菌的菌株例如是：

-大肠杆菌H4581 (EP 0 301 572)

-大肠杆菌KY10935 (BioscienceBiotechnology and Biochemistry 61(11)：1877-1882(1997)

-大肠杆菌VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)

-大肠杆菌VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)

-大肠杆菌VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)

-大肠杆菌BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)

-大肠杆菌kat 13 (WO 98/04715)

-大肠杆菌KCCM-10132 (WO 00/09660)

合适的生产L-苏氨酸的沙雷氏菌属、特别是粘质沙雷氏菌的菌株例如是：

-粘质沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)：1045-1051(1979))

-粘质沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)：151-158(1987))

-粘质沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3)：255-265(1992))。

生产L-苏氨酸的肠杆菌科菌株优选具有选自如下一组的一或多种遗传或表型特征：α-氨基-β-羟戊酸抗性，硫赖氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋体素抗性，环戊烷-1-羧酸抗性，利福平抗性，缬氨酸类似物例如缬氨酸氧肟酸抗性，嘌呤类似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性，L-甲硫氨酸需求，L-异亮氨酸的部分及可补偿性需求(如果合适)，内消旋二氨基庚二酸需求，对含苏氨酸的二肽营养缺陷，L-苏氨酸抗性，苏氨酸萃余液抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，对氟丙酮酸敏感性，苏氨酸脱氢酶缺陷，蔗糖利用能力(如果合适)，苏氨酸操纵子扩增，高丝氨酸脱氢酶I扩增，天冬氨酸激酶I(优选反馈抗性形式)，高丝氨酸激酶扩增，苏氨酸合酶扩增，天冬氨酸激酶扩增(如果合适，反馈抗性形式)，天冬氨酸半醛脱氢酶扩增，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶扩增、(如果合适，反馈抗性形式)，磷酸烯醇丙酮酸合酶扩增，转氢酶扩增，RhtB基因产物扩增， RhtC基因产物扩增，YfiK基因产物扩增，丙酮酸羧化酶扩增，以及乙酸形成弱化。

已经发现肠杆菌科的微生物在lamB基因扩增、特别是过表达之后，以改良的形式生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸。

大肠杆菌的基因或者开放读框(ORF)的核苷酸序列是现有技术的一部分，可以得自Blattner等(Science 277：1453-1462(1997))公布的大肠杆菌基因组序列。已知N末端甲硫氨酸可以通过宿主特异性酶(甲硫氨酸氨肽酶)除去。

lamB基因的核苷酸序列也可以从肠杆菌科的弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimirium)中获知。

大肠杆菌的lamB基因在下文详述：

描述：大肠杆菌的lamB基因编码麦芽糖孔蛋白LamB，其也被称作麦芽糖/麦芽糊精特异性形成孔的膜蛋白(孔蛋白(porin))。

功能：大肠杆菌的麦芽糖孔蛋白LamB是一种三聚体蛋白质，其促进或者使得麦芽糖和麦芽糊精穿过肠细菌的外膜扩散，并且另外作为小的亲水性分子如葡萄糖或者海藻糖的非特异性孔蛋白，及作为噬菌体的细胞表面受体起作用。

参考文献：

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Benz et al.；Biochem.Biophys.Acta 1104：299-307(1992)

登记号：No.AE000477

另一基因名称：b4036

所述核苷酸序列可得自国立医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的生物技术信息中心(NCBI)的数据库、欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，Germany或者Cambridge，UK)的核苷酸序列数据库或者日本的DNA数据库(DDBJ，Mishima，Japan)。

大肠杆菌的lamB基因的核苷酸序列见SEQ ID No.3所示，弗氏志贺氏菌(AE015426)和鼠伤寒沙门氏菌(AE008897)的lamB基因的已知序列分别示于SEQ ID No.5和SEQ ID No.7。由这些开放读框编码的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8。

根据本发明可以使用本文段落中描述的基因。另外，可以使用得自遗传密码简并的所述基因的等位基因或者通过功能性中性有义突变得到的所述基因的等位基因。优选使用内源基因。

“内源基因”或者“内源核苷酸序列”分别是指物种群体中存在的基因或等位基因或者核苷酸序列。

包含功能性中性有义突变的lamB基因的合适等位基因含有在其编码的蛋白质中导致至少1个保守氨基酸置换的那些突变。

在芳族氨基酸的情况中，保守置换是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的彼此置换。在疏水性氨基酸的情况中，保守置换是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的彼此置换。在极性氨基酸的情况中，保守置换是谷氨酰胺与天冬酰胺的彼此置换。在碱性氨基酸的情况中，保守置换是精氨酸、赖氨酸和组氨酸的彼此置换。在酸性氨基酸的情况中，保守置换是天冬氨酸与谷氨酸的彼此置换。在含有羟基的氨基酸的情况中，保守置换是丝氨酸与苏氨酸的彼此置换。

在相同的方式中，可以使用编码上述蛋白质的变体的那些核苷酸序列，其另外在N或C末端包含至少1个氨基酸的扩展或者缩短。这种扩展或缩短不超过50、40、30、20、10、5、3或者2个氨基酸或者氨基酸残基。

合适的等位基因还包括编码其中插入或者缺失至少1个氨基酸的蛋白质的那些等位基因。这些称为插入/缺失(indel)的修饰的最大数目可以是2、3、5、10、20个，但在任何情况中均不超过30个氨基酸。

另外，合适的等位基因包括可通过杂交获得的那些等位基因，特别是在严格条件下使用SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7或其一部分、特别是编码区或者与其互补的序列获得的那些等位基因。

通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司(Boehringer Mannheim GmbH)(曼海姆，德国，1993)的手册“The DIGSystem Users Guide for Filter Hybridization”，以及Liebl等(InternationalJournal of Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))。杂交在严格条件下发生，即只有这样的杂交体形成：其中探针和靶序列(即用所述探针处理的多核苷酸)是至少70％相同的。已知杂交的严格性(包括洗涤步骤)通过改变缓冲液成分、温度和盐浓度而影响或确定。杂交反应通常在与洗涤步骤相比相对较低严格条件下进行(Hybaid Hybridisation Guide，HybaidLimited，Teddington，UK，1996)。

对于杂交反应，可以使用例如一种相应于5×SSC缓冲液的缓冲液在大约50℃-68℃进行。在这种情况下，探针也可以和与探针序列相同性低于70％的多核苷酸杂交。这种杂交体稳定性较差，在严格条件下通过洗涤除去。这可以通过例如将盐浓度降低至2×SSC及在合适的情况下随后降低为0.5×SSC(The DIG System Users Guide for Filter Hybridization，Boehringer Mannheim，德国曼海姆，1995)，在设定温度大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃实现。如果合适，可以将盐浓度降低至相当于0.2×SSC或者0.1×SSC。通过将杂交温度以大约1-2℃的幅度从50℃逐步提高至68℃，对与所用探针序列例如至少70％或至少80％或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％相同的多核苷酸进行分离。关于杂交的进一步指导可以试剂盒形式在市场上获得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆，目录号No.1603558)。所得核苷酸序列编码与SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或者SEQ ID No.8的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。

为了实现扩增，例如可提高基因或等位基因的表达或者蛋白质的催化性质。如果合适，可以组合这两种措施。

为获得过表达，例如可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒或启动子以相似方式起作用。通过导入可诱导性启动子，在通过发酵生产L-苏氨酸期间增强表达也是可能的。延长mRNA寿命的方法也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的降解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以存在于具有不同拷贝数的质粒中，或可以整合进染色体中并扩增。或者，另外通过改变培养基的组分和培养条件也可获得相关基因的过表达。

过表达的方法在现有技术中有充分描述，例如Martin等(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))所述。通过使用载体，拷贝数增加至少1个。作为载体，可以使用例如US 5,538,873中所述的质粒。作为载体，也可以使用噬菌体，例如EP 0 332 448所述的噬菌体Mu，或者噬菌体lambda(λ)。拷贝数的增加也可以通过将另一个拷贝掺入染色体的另一个位置而实现，例如在噬菌体λ的att位点(Yu and Court，Gene223，77-81(1998))。US 5,939,307描述了怎样通过掺入表达盒或者启动子而实现表达的增加，所述启动子例如tac启动子、trp启动子、lpp启动子或者例如位于染色体苏氨酸操纵子上游的噬菌体λ的P_L启动子和P_R启动子。以相似的方式可以使用噬菌体T7的启动子、gear-box启动子或者nar启动子。也可以使用这些表达盒或者启动子以过表达质粒携带的基因，如EP 0 593 792所述。质粒携带的基因的表达接下来可以通过使用lacI^Q等位基因控制(Glascock and Weickert，Gene 223，221-231(1998))。

本领域技术人员在如下文献中可发现关于这方面的指导：Chang andCohen(Journal of Bacteriology 134：1141-1156(1978))，Hartley and Gregori(Gene 13：347-353(1981))，Amann and Brosius(Gene 40：183-190(1985))，Broer et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 80：21-25(1983))，LaVallie et al.(BIO/TECHNOLOGY 11：187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa et al.(Plasmid 26：222-224(1991))，Quandt and Klipp(Gene 80：161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))，Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58：191-195(1998))及已知的遗传学和分子生物学教科书。

可以使用在肠杆菌中可以复制的质粒，例如衍生自pACYC184(Bartoloméet al.；Gene 102：75-78(1991))、pTrc99A(Amann etal.；Gene 69：301-315(1988))的克隆载体或者pSC101衍生物(Vocke andBastia；Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21)：6557-6561(1983))。在本发明的方法中，可以使用通过质粒载体转化的菌株，所述质粒载体携带至少一个lamB基因或者等位基因或者编码其基因产物LamB的核苷酸序列。

术语转化是指通过宿主(微生物)掺入一个分离的核酸。

通过序列置换(Hamilton et al.；Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))、接合或者转导，可以将与相应基因表达相关的突变转移至各种菌株中。

关于遗传学和分子生物学术语的更详细的解释可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Birge的教科书(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th edition，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或者Berg，Tymoczko和Stryer的教科书(Biochemistry，5th edition，Freeman andCompany，New York(USA)，2002)或者Sambrook et al.的手册(MolecularCloning，A Laboratory Manual(3-volume set)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。

另外，除了扩增lamB基因之外，扩增一或多种已知苏氨酸生物合成途径的酶或者回补代谢的酶或者产生还原的烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代谢的酶对于使用肠杆菌科的菌株生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸可以是有利的。通常优选使用内源基因。

例如，可以同时扩增、特别是过表达选自如下一组的一或多个基因：

●编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的至少一个基因(US-A-4,278,765)，

●编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的pyc基因(WO 99/18228)，

●编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and General Genetics231(2)：332-336(1992))，

●编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(WO 02/064808)

●编码吡啶转氢酶亚基的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158：647-653(1986))，

●编码赋予高丝氨酸抗性的蛋白质的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，

●编码赋予苏氨酸抗性的蛋白质的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，

●编码苏氨酸输出载体蛋白的谷氨酸棒杆菌的thrE基因(WO 01/92545)，

●编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 11；5257-5266(1983)；gene 23：199-209(1983))，

●编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因(WO 03/004598)，

●编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因(WO 03/004664)，

●编码磷酸转移酶系统PTS的磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶的ptsHIcrr操纵子的ptsH基因(WO 03/004674)，

●编码磷酸转移酶系统PTS的酶I的ptsHIcrr操纵子的ptsI基因(WO 03/004674)，

●编码磷酸转移酶系统PTS的葡萄糖特异性IIA成分的ptsHIcrr操纵子的crr基因(WO 03/004674)，

●编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因(WO 03/004670)，

●编码亮氨酸调节子的调节物的lrp基因(WO 03/004665)，

●编码fad调节子的调节物的fadR基因(WO 03/038106)，

●编码主要中间代谢的调节物的iclR基因(WO 03/038106)，

●编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpCF操纵子的ahpC基因(WO 03/004663)，

●编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpCF操纵子的ahpF基因(WO 03/004663)，

●编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，

●编码cys调节子的调节物的cysB基因(WO 03/006666)，

●编码NADPH亚硫酸还原酶的黄素蛋白的cysJIH操纵子的cysJ基因(WO 03/006666)，

●编码NADPH亚硫酸还原酶的血红素蛋白的cysJIH操纵子的cysI基因(WO 03/006666)，

●编码腺嘌呤基硫酸还原酶的cysJIH操纵子的cysH基因(WO03/006666)，

●编码具有抗-sigmaE活性的膜蛋白的rseABC操纵子的rseA基因(WO 03/008612)，

●编码sigmaE因子的全面调节物的rseABC操纵子的rseC基因(WO 03/008612)，

●编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucABCD操纵子的sucA基因(WO 03/008614)，

●编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸琥珀酰基转移酶(dihydrolipoyltranssuccinase)E2亚基的sucABCD操纵子的sucB基因(WO 03/008614)，

●编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基的sucABCD操纵子的sucC基因(WO 03/008615)，

●编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基的sucABCD操纵子的sucD基因(WO03/008615)，

●编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分的aceE基因(WO 03/076635)，

●编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分的aceF基因(WO 03/076635)，

●编码sigmaE因子活性的调节物的rseB基因(Molecular Microbiology24(2)：355-371(1997))，

●编码麦芽糖调节子的阳性转录调节物的malT基因(Gene 42：201-208(1986)，DE102004003411.7)，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)yaaU的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登记号AE000114，DE10361268.8)，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)yodA的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登记号AE000288，DE10361192.4)，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)yibD的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登记号AE000439，DE102004005836.9)。

另外，除了扩增lamB基因之外，弱化、特别是关闭选自如下一组的一或多个基因或者降低其表达，对于生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸可以是有利的：

●编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 169：4716-4721(1987))，

●编码苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archives in Microbiology149：36-42(1987))，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)yjfA的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登记号AAC77180，WO 02/29080)，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)ytfP的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登记号AAC77179，WO 02/29080)，

●编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，

●编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，

●编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因(WO 02/081721)，该基因也称作mlc基因，

●编码果糖阻抑物的fruR基因(WO 02/081698)，该基因也称作cra基因，

●编码Sigma³⁸因子的rpoS基因(WO 01/05939)，该基因也称作katF基因，以及

●编码天冬氨酸氨裂合酶(aspartate ammonium lyase)的aspA基因(WO 03/008603)。

文中术语“弱化”是指降低或关闭微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度，通过使用例如相比于原始菌株中较弱的启动子或使用编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因实现，或通过灭活相应酶或蛋白质或基因实现，及如果合适，组合使用这些方法实现。

通过弱化方法，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质的浓度或者非重组的起始微生物中蛋白质活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。所述起始微生物或者亲代菌株是指要对其施行本发明方法的微生物。

为了实现弱化，例如可以降低或者关闭基因或者开放读框的表达或者酶蛋白的催化性质。如果合适，可以组合这两种方法。

基因表达的降低可以通过合适的培养条件进行，通过遗传修饰(突变)基因表达的信号结构进行，或者通过反义RNA技术进行。基因表达的信号结构例如是阻抑基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可以在例如如下文献中发现这方面的信息：Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering 58：191-195(1998))，Carrier and Keasling(BiotechnologyProgress 15：58-64(1999))，Franch and Gerdes(Current Opinion inMicrobiology 3：159-164(2000))，及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers(“Molekulare Genetik”[Molecular Genetics]，6th edition，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1 995)或者Winnacker(“Gene und Klone”[Genes and Clones]，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)。

导致酶蛋白的催化性质改变或降低的突变可以从现有技术中得知。所述现有技术例如Qiu and Goodman(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 95：5511-5515(1998))，Wente andSchachmann(Journal of Biological Chemistry 266：20833-20839(1991))。

这方面的概括性解释可见于遗传学和分子生物学教科书，例如Hagemann(“Allgemeine Genetik”[General Genetics]，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

考虑至少1个碱基对或核苷酸的突变、转换、颠换、插入和缺失。根据突变所致的氨基酸置换对酶活性的作用，这些突变被描述为错义突变或者无义突变。错义突变导致蛋白质中指定氨基酸被置换为另一个，这种置换特别是非保守氨基酸置换。结果是蛋白质的功能性或者活性被削弱及降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。无义突变导致在基因的编码区中产生终止密码子，因此过早终止翻译。在基因中插入或者缺失至少一个碱基对导致移码突变，这导致掺入错误的氨基酸或者翻译过早终止。如果突变的结果是在编码区中产生终止密码子，这也导致翻译过早终止。缺失至少一个或者多个密码子也典型地导致酶活性的完全丧失。

关于产生这些突变的指导是现有技术的一部分，可以得自已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(“Molekulare Genetik”[Molecular Genetics]，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(“Gene und Klone”[Genes and Clones]，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(“Allgemeine Genetik”[General Genetics]，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教科书。

可以通过基因或者等位基因置换在合适的菌株中掺入合适的基因突变。

常规的方法是Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))所述的基因置换方法，其使用条件复制型pSC101衍生物pMAK705进行基因置换。也可以使用现有技术所述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 181：7143-7148(1999))或者Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182：842-847(2000))所述方法。

也可以通过接合或者转导将各个基因中的突变或者与各个基因或开放读框表达相关的突变转移至各种菌株中。

另外，除了扩增lamB基因之外，关闭不需要的副反应对于L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的生产可能是有益的(Nakayama：“Breeding of AminoAcid Producing Microorganisms”，in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。

根据本发明产生的微生物可通过分批培养法、补料分批培养法、重复补料分批培养法或者持续培养法(US.....)培养。已知培养方法见于由Chmiel所著教材(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)，或由Storhas所著教材(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)。

所用培养基必须以适当方式符合各菌株的要求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会(American Society for Bacteriology)(Washington D.C.，USA，1981)的“Manual of Methods for GeneralBacteriology”。

可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素(如果合适)，油和脂肪如豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。

可使用的氮源包括含氮的化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。所述氮源可单独或混合使用。

可使用的磷源包括磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所必需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。所述起始材料可以在培养期间以单批或一种适当方式加入至培养基中。

发酵通常在pH5.5-9.0、特别是pH6.0-8.0进行。为了控制培养物的pH值，可以适当方式加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸。为了控制泡沫产生，可以使用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择物质例如抗生素。为了保持有氧条件，可向培养物中导入氧气或含氧混合气，例如空气。培养温度通常在25℃-45℃，优选30℃-40℃。持续培养直至形成最大量的L-氨基酸或者L-苏氨酸。此目标通常在10-160小时内达到。

L-氨基酸可通过阴离子交换层析，随后进行茚三酮衍生化而分析，如Spackman et al.(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))所述，或者通过反相HPLC分析，如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))所述。

本发明用于通过发酵生产L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸，特别是L-苏氨酸。

本发明参考后文的实施例得以更详细的描述。

用于大肠杆菌的极限培养基(M9)和完全培养基(LB)由J.H.Miller(AShort Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)描述。从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有的限制、连接、Klenow和碱性磷酸酶处理技术均如Sambrook et al.(Molecular Cloning-ALaboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述进行。除非特别指出，则大肠杆菌的转化根据Chung et al.(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 86：2172-2175(1989))所述进行。

生产菌株和转化体的温育温度为37℃。

实施例1：表达质粒pTrc99AlamB的构建

将大肠杆菌K12的lamB基因使用聚合酶链反应(PCR)及合成的寡核苷酸扩增。从大肠杆菌K12 MG1655(登记号AE000477，Blattner et al.(Science 277：1453-1474(1997))的lamB基因的核苷酸序列开始，合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。对所述引物序列进行修饰，由此产生限制酶的识别位点。对于P_lam1neu引物，使用XbaI的识别序列，对于P_lam2neu引物，选择HindIII的识别序列，所述序列在如下核苷酸序列中以下划线标示：

P_lam1neu：

5’- TCTAGAGCCTGTCACAGGTGATGTGAA-3’(SEQ ID No.1)

P_lam2neu：

5’- AAGCTTACAGCCGTTGTAGGCCTGATA-3’(SEQ ID No.2)

使用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)，根据厂商指导分离用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA。在标准PCR条件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，Academic Press)，使用特异性引物由Vent-DNA-聚合酶(NewEngland Biolaps GmbH，Frankfurt，Germany)扩增一个1498bp DNA片段(SEQ ID No.3)。

根据厂商指导，将扩增的lamB片段与载体pCR-Blunt II-TOPO(ZeroTOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，Netherlands)连接，并转化进大肠杆菌菌株TOP10中。在混和了50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA之后，将载体用酶EcoRI和EcoRV切割，在0.8％强度琼脂糖凝胶中检测切割之后，将所述载体命名为pCRBluntlamB。

扩增的DNA片段或者PCR产物的核苷酸序列通过Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.，74：5463-5467(1977))所述的双脱氧链终止法使用得自PE Applied Biosystems(Weiterstadt，Germany)的“ABI Prism 377”测序设备进行检测。所述PCR产物的序列相应于SEQ ID No.3所示序列的第1-1498位。相关的LamB蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID No.4。

随后，将载体pCRBluntlamB用酶HindIII和XbaI切割，在0.8％强度琼脂糖凝胶中解离之后从凝胶中分离大约1500bp的lamB片段(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)，并与已经由酶HindIII和XbaI消化的载体pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)连接。将大肠杆菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)用连接方法转化，并在混和了50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。

在质粒DNA分离之后可以通过使用酶EcoRV和SspI进行对照切割而表明成功的克隆。

该质粒称作pTrc99AlamB(图1)。

实施例2：表达质粒pMW218lamB的构建

将实施例1所述的载体pCRBluntlamB用酶HindIII和XbaI切割，在0.8％强度的琼脂糖凝胶中解离之后从凝胶中分离lamB片段(QIAquickGel Extraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)，并与已经用酶HindIII和XbaI消化的低拷贝载体pMW218(Nippon Gene，Toyama，Japan)连接。将大肠杆菌菌株DH5α(Grant et al.：Proceedings of the National Academy ofSciences USA，87(1990)4645-4649)用连接方法转化，并在混和了50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。

在质粒DNA分离之后可以通过使用酶ClaI进行对照切割而表明成功的克隆。

该质粒称作pMW218lamB(图2)。

实施例3：使用菌株MG442/pTrc99AlamB和MG442/pMW218lamB生产L-苏氨酸

生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442在专利US-A-4,278,765中描述，其保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，Russia)，保藏号为CMIM B-1628。

将菌株MG442用实施例1和2所述的表达质粒pTrc99AlamB和pMW218lamB及载体pTrc99A和pMW218转化，在含有50μg/ml氨苄青霉素或者50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。以此方式形成菌株MG442/pTrc99AlamB、MG442/pTrc99A、MG442/pMW218lamB和MG442/pMW218。随后将选择的各个菌落在具有如下成分的极限培养基上生长：3.5g/l的Na₂HPO₄·2H₂O、1.5g/l的KH₂PO₄、1g/l的NH₄Cl、0.1g/l的MgSO₄·7H₂O、2g/l葡萄糖、20g/l琼脂、50mg/l氨苄青霉素或者50mg/l卡那霉素。在100ml锥形瓶中含有的10ml分批培养物中研究L-苏氨酸的形成。向其中加入如下成分的10ml预培养基：2g/l酵母提取物、10g/l的(NH₄)₂SO₄、1g/l的KH₂PO₄、0.5g/l的MgSO₄·7H₂O、15g/l的CaCO₃、20g/l葡萄糖、50mg/l氨苄青霉素或者50mg/l卡那霉素，接种并在37℃在得自Kühner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR温箱中以180rpm温育16小时。将该预培养物的250μl样品接种于10ml生产培养基中(25g/l的(NH₄)₂SO₄，2g/l的KH₂PO₄，1g/l的MgSO₄·7H₂O，0.03g/l的FeSO₄·7H₂O，0.018g/l的MnSO₄·1H₂O，30g/l的CaCO₃，20g/l葡萄糖，50mg/l氨苄青霉素或者50mg/l卡那霉素)，在37℃温育48小时。在温育之后，使用得自Dr Lange(Düsseldorf，Germany)的LP2W光度计在660nm测定波长确定培养悬浮液的光密度(OD)。

随后，在无菌过滤的培养物上清中使用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和使用茚三酮检测的柱后反应确定形成的L-苏氨酸的浓度。

表1示出实验结果。

表1

菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l
菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l	MG442/pTrc99A	2.0	2.1
MG442/pTrc99AlamB	2.0	2.6	MG442/pTrc99A	2.0	2.1
MG442/pTrc99AlamB	2.0	2.6	MG442/pMW218	6.2	1.7
MG442/pMW218lamB	5.7	2.5	MG442/pMW218	6.2	1.7

附图简述

图1：含有lamB基因的质粒pTrc99AlamB的图谱

图2：含有lamB基因的质粒pMW218lamB的图谱

长度数据为近似值。使用的缩写和名称具有如下含义：

●bla：编码氨苄青霉素抗性的基因

●kan：编码卡那霉素抗性的基因

●lac Iq：trc启动子的阻抑蛋白的基因

●lacZ’：编码β-半乳糖苷酶的α-肽的基因片段

●trc：trc启动子区域，IPTG可诱导

●lamB：lamB基因的编码区

●5S：5S rRNA区域

●rrnBT：rRNA终止子区域

限制酶的缩写具有如下含义：

●XbaI：得自巴氏黄单胞菌(Xanthomonas badrii)的限制性核酸内切酶

●HindIII：得自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的限制性核酸内切酶

●ClaI：得自阔显核菌(Caryophanon latum)的限制性核酸内切酶

●SspI：得自球衣菌属(Sphaerotilus)物种的限制性核酸内切酶

●EcoRV：得自大肠杆菌的限制性核酸内切酶。

序列表

<110>德古萨股份公司

<120>使用肠杆菌科菌株生产L-氨基酸的方法

<130>040163 BT

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(27)

<223>P_lamlneu

<220>

<221>Restriction site

<222>(1)..(6)

<223>XbaI

<400>1

tctagagcct gtcacaggtg atgtgaa 27

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(27)

<223>P_lam2neu

<220>

<221>Restriction site

<222>(1)..(6)

<223>HindIII

<400>2

aagcttacag ccgttgtagg cctgata 27

<210>3

<211>1498

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>PCR product

<222>(1)..(1498)

<223>lamB PCR product

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(27)

<223>Primer P_lamlneu

<220>

<221>CDS

<222>(57)..(1397)

<223>lamB coding region

<220>

<221>primer_bind

<222>(1472)..(1498)

<223>Primer P_lam2neu

<400>3

tctagagcct gtcacaggtg atgtgaaaaa agaaaagcaa tgactcagga gataga atg 59

Met

1

atg att act ctg cgc aaa ctt cct ctg gcg gtt gcc gtc gca gcg ggc 107

Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala Gly

5 10 15

gta atg tct gct cag gca atg gct gtt gat ttc cac ggc tat gca cgt 155

Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala Arg

20 25 30

tcc ggt att ggt tgg aca ggt agc ggc ggt gaa caa cag tgt ttc cag 203

Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe Gln

35 40 45

act acc ggt gct caa agt aaa tac cgt ctt ggc aac gaa tgt gaa act 251

Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu Thr

50 55 60 65

tat gct gaa tta aaa ttg ggt cag gaa gtg tgg aaa gag ggc gat aag 299

Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp Lys

70 75 80

agc ttc tat ttc gac act aac gtg gcc tat tcc gtc gca caa cag aat 347

Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln Asn

85 90 95

gac tgg gaa gct acc gat ccg gcc ttc cgt gaa gca aac gtg cag ggt 395

Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln Gly

100 105 110

aaa aac ctg atc gaa tgg ctg cca ggc tcc acc atc tgg gca ggt aag 443

Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly Lys

115 120 125

cgc ttc tac caa cgt cat gac gtt cat atg atc gac ttc tac tac tgg 491

Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr Trp

130 135 140 145

gat att tct ggt cct ggt gcc ggt ctg gaa aac atc gat gtt ggc ttc 539

Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly Phe

150 155 160

ggt aaa ctc tct ctg gca gca acc cgc tcc tct gaa gct ggt ggt tct 587

Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly Ser

165 170 175

tcc tct ttc gcc agc aac aat att tat gac tat acc aac gaa acc gcg 635

Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr Ala

180 185 190

aac gac gtt ttc gat gtg cgt tta gcg cag atg gaa atc aac ccg ggc 683

Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro Gly

195 200 205

ggc aca tta gaa ctg ggt gtc gac tac ggt cgt gcc aac ttg cgt gat 731

Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg Asp

210 215 220 225

aac tat cgt ctg gtt gat ggc gca tcg aaa gac ggc tgg tta ttc act 779

Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Lau Phe Thr

230 235 240

gct gaa cat act cag agt gtc ctg aag ggc ttt aac aag ttt gtt gtt 827

Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asr Lys Phe Val Val

245 250 255

cag tac gct act gac tcg atg acc tcg cag ggt aaa ggg ctg tcg cag 875

Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser Gln

260 265 270

ggt tct ggc gtt gca ttt gat aac gaa aaa ttt gcc tac aat atc aac 923

Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile Asn

275 280 285

aac aac ggt cac atg ctg cgt atc ctc gac cac ggt gcg atc tcc atg 971

Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser Met

290 295 300 305

ggc gac aac tgg gac atg atg tac gtg ggt atg tac cag gat atc aac 1019

Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile Asn

310 315 320

tgg gat aac gac aac ggc acc aag tgg tgg acc gtc ggt att cgc ccg 1067

Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg Pro

325 330 335

atg tac aag tgg acg cca atc atg agc acc gtg atg gaa atc ggc tac 1115

Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly Tyr

340 345 350

gac aac gtc gaa tcc cag cgc acc ggc gac aag aac aat cag tac aaa 1163

Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr Lys

355 360 365

att acc ctc gca caa caa tgg cag gct ggc gac agc atc tgg tca cgc 1211

Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser Arg

370 375 380 385

ccg gct att cgt gtc ttc gca acc tac gcc aag tgg gat gag aaa tgg 1259

Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys Trp

390 395 400

ggt tac gac tac acc ggt aac gct gat aac aac gcg aac ttc ggc aaa 1307

Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly Lys

405 410 415

gcc gtt cct gct gat ttc aac ggc ggc agc ttc ggt cgt ggc gac agc 1355

Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp Ser

420 425 430

gac gag tgg acc ttc ggt gcc cag atg gaa atc tgg tgg taa 1397

Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp

435 440 445

tagcaaaacc tgggccggat aaggcgttta cgccgcattc ggcaaccaac gcctgatgcg 1457

acgcttgcgc gtcttatcag gcctacaacg gctgtaagct t 1498

<210>4

<211>446

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>4

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala

20 25 30

Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe

35 40 45

Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu

50 55 60

Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp

65 70 75 80

Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln

85 90 95

Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln

100 105 110

Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly

115 120 125

Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr

130 135 140

Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly

145 150 155 160

Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly

165 170 175

Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr

180 185 190

Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro

195 200 205

Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg

210 215 220

Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe

225 230 235 240

Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val

245 250 255

Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser

260 265 270

Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile

275 280 285

Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser

290 295 300

Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile

305 310 315 320

Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg

325 330 335

Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly

340 345 350

Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr

355 360 365

Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser

370 375 380

Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys

385 390 395 400

Trp Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly

405 410 415

Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp

420 425 430

Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp

435 440 445

<210>5

<211>1341

<212>DNA

<213>Shigella flexneri

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1341)

<223>lamB coding region

<400>5

atg atg att act ctg cgc aaa ctt cct ctg gcg gtt gcc gtc gca gcg 48

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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195 200 205

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225 230 235 240

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405 410 415

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420 425 430

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<210>6

<211>446

<212>PRT

<213>Shigella flexneri

<400>6

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1 5 10 15

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20 25 30

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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180 185 190

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg

325 330 335

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340 345 350

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435 440 445

<210>7

<211>1359

<212>DNA

<213>Salmonella typhimurium

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1359)

<223>lamB coding region

<400>7

atg atg att act ctg cgc aaa ctc cca ctg gcg gtt gct gtc gca gcg 48

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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305 310 315 320

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325 330 335

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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Glu Ile Trp Trp

450

<210>8

<211>452

<212>PRT

<213>Salmonella typhimurium

<400>8

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala

20 25 30

Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly

115 120 125

Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr

130 135 140

Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Ile Glu Asn Ile Asp Leu Gly

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Asp Gly Val Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Thr Thr

210 215 220

Asp Gly Tyr Lys Leu Ala Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Met Phe

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Arg Gly Ser Asp Gly Ser Ser Ser Phe Thr Glu Glu Leu Ser Asp Gly

275 280 285

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290 295 300

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Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser Arg Pro Ala Ile Arg Ile

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Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys Trp Gly Tyr Ile Lys Asp

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Thr Asn Ser Arg Gly Asp Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met

435 440 445

Glu Ile Trp Trp

450

Claims

1.一种肠杆菌科重组微生物，其含有扩增的或过表达的编码具有麦芽糖孔蛋白LamB活性的多肽的lamB基因，并以改良的方式生产L-氨基酸、特别是L-苏氨酸。

2.权利要求1的肠杆菌科微生物，其中编码与选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列至少90％、特别是至少95％、优选99％相同的多肽的多核苷酸是被扩增的，所述多肽是具有麦芽糖孔蛋白LamB活性的多肽。

3.权利要求2的微生物，其含有选自如下一组的相应于lamB基因的过表达或者扩增的多核苷酸：

a)具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；

d)具有含有功能性中性有义突变的SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7序列的多核苷酸。

4.权利要求2的微生物，所述多肽具有与选自SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6和SEQ ID No.8的序列之一至少95％相同的氨基酸序列。

5.权利要求2的微生物，所述多肽具有与SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或者SEQ ID No.8的序列相同的氨基酸序列。

6.权利要求1-4中任一项的微生物，其通过使用含有lamB基因、这个基因的等位基因或其部分和/或启动子的载体经转化、转导、接合或者这些方法的组合而产生。

7.权利要求1-6中任一项的微生物，其中lam基因或者具有这种功能的多核苷酸序列的拷贝数至少增加1个。

8.权利要求7的微生物，所述lamB基因的拷贝数增加至少1个是通过将该基因或者具有这一功能的多核苷酸序列整合进所述微生物的染色体中而实现的。

9.权利要求7的微生物，所述lamB基因的拷贝数增加至少1个是通过在染色体外复制的载体实现的。

10.权利要求1或2的微生物，其特征在于为了实现扩增，

a)所述启动子和调节区域或者核糖体结合位点在lamB基因的上游被突变，或者

b)在所述lamB基因的上游掺入表达盒或者启动子。

11.权利要求1或2的微生物，所述lamB基因在扩增该基因表达的启动子的控制下。

12.权利要求1-11中任一项的微生物，其中通过扩增所述lamB基因，LamB基因产物(蛋白质)的浓度或者活性基于在非重组的起始菌株中该基因产物的活性或者浓度增加至少10％。

13.权利要求1-12中任一项的微生物，其中在所述微生物中希望的L-氨基酸的生物合成途径的其它基因另外是以扩增的形式、特别是以过表达的形式存在。

14.权利要求1-13中任一项的微生物，特征在于所述微生物选自埃希氏菌属、欧文氏菌属、普罗威登斯菌属和沙雷氏菌属。

15.一种通过发酵肠杆菌科重组微生物生产L-氨基酸的方法，特征在于：

a)在希望的L-氨基酸在培养基或细胞中富集的条件下，将生产希望的L-氨基酸的微生物在培养基中培养，所述微生物中lamB基因或者编码基因产物麦芽糖孔蛋白LamB的核苷酸序列是扩增的、特别是过表达的，和

b)分离希望的L-氨基酸，发酵肉汤的成分和/或生物量的全部或者部分(≥0至100％)保留在分离的产物中或者被完全除去。

16.权利要求15的方法，特征在于使用权利要求1-14中任一项的微生物。

17.权利要求15或16的方法，特征在于为了生产L-苏氨酸，发酵肠杆菌科的微生物，所述微生物中选自如下一组的一或多个基因也同时被扩增，特别是过表达：

17.1编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的至少一个基因，

17.2编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌的pyc基因，

17.3编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，

17.4编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，

17.5编码吡啶转氢酶亚基的pntA和pntB基因，

17.6编码赋予高丝氨酸抗性的蛋白质的rhtB基因，

17.7编码赋予苏氨酸抗性的蛋白质的rhtC基因，

17.8编码苏氨酸输出载体蛋白的谷氨酸棒杆菌的thrE基因，

17.9编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，

17.10编码葡糖磷酸变位酶的pgm基因，

17.11编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因，

17.12编码磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶的ptsH基因，

17.13编码磷酸转移酶系统的酶I的ptsI基因，

17.14编码葡萄糖特异性IIA成分的crr基因，

17.15编码葡萄糖特异性IIBC成分的ptsG基因，

17.16编码亮氨酸调节子的调节物lrp基因，

17.17编码fad调节子的调节物的fadR基因，

17.18编码主要中间代谢的调节物的iclR基因，

17.19编码烷基氢过氧化物还原酶的小亚基的ahpC基因，

17.20编码烷基氢过氧化物还原酶的大亚基的ahpF基因，

17.21编码半胱氨酸合酶A的cysK基因，

17.22编码cys调节子的调节物的cysB基因，

17.23编码NADPH亚硫酸还原酶的黄素蛋白的cysJ基因

17.24编码NADPH亚硫酸还原酶的血红素蛋白的cysI基因，

17.25编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因，

17.26编码具有抗-SigmaE活性的膜蛋白的rseA基因，

17.27编码SigmaE因子的全面调节物的rseC基因，

17.28编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基的sucA基因，

17.29编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸琥珀酰基转移酶E2亚基的sucB基因，

17.30编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基的sucC基因，

17.31编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基的sucD基因，

17.32编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分的aceE基因，

17.33编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分的aceF基因，

17.34编码SigmaE因子活性的调节物的rseB基因，

17.35编码麦芽糖调节子的正性转录调节物的malT基因，

17.36大肠杆菌的开放读框(ORF)yaaU的基因产物，

17.37大肠杆菌的开放读框(ORF)yodA的基因产物，和

17.38大肠杆菌的开放读框(ORF)yibD的基因产物。

18.权利要求15-17中任一项的方法，特征在于使用其中降低希望的L-氨基酸形成的代谢途径被至少部分弱化的微生物。

19.权利要求18的方法，特征在于为了生产L-苏氨酸，发酵肠杆菌科的微生物，其中选自如下一组的一或多个基因同时被弱化、特别是被关闭，或者降低其表达：

19.1编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，

19.2编码苹果酸脱氢酶的mdh基因，

19.3大肠杆菌的开放读框(ORF)yjfA的基因产物，

19.4大肠杆菌的开放读框(ORF)ytfP的基因产物，

19.5编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pckA基因，

19.6编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，

19.7编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物的dgsA基因，

19.8编码果糖阻抑物的fruR基因，

19.9编码Sigma³⁸因子的rpoS基因，

19.10编码天冬氨酸氨裂合酶的aspA基因。

20.权利要求15-17中任一项的方法，特征在于生产选自如下一组的L-氨基酸：L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。

21.权利要求20的方法，特征在于生产选自如下一组的L-氨基酸：L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸。