ES2218009T3

ES2218009T3 - Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes.

Info

Publication number: ES2218009T3
Application number: ES00102601T
Authority: ES
Inventors: Achim Dr. Marx; Bettina Dr. Mockel; Walter Dr. Pfefferle; Hermann Dr. Sahm; Albert Dr. De Graaf; Lothar Dr. Eggeling
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Degussa GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Evonik Operations GmbH
Priority date: 1999-02-20
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2004-11-16
Anticipated expiration: 2020-02-08
Also published as: HU0000747D0; CN1266905A; RU2247778C2; ATE263246T1; CN1222622C; EP1029919B1; BRPI0000897B1; EP1029919A3; BR0000897A; HUP0000747A2; EP1029919A2; SK1942000A3; ID24801A; AU770187B2; JP2000236893A; AU1760000A; CA2299105A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de uno o varios de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo de L-treonina, L-isoleucina, L-valina y L-triptófano, por fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con un gen de la glutamato-deshidrogenasa procedente de microorganismos, en las que se incrementa la actividad intracelular de la glutamato-deshidrogenasa, sobre-expresándose en especial la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la glutamato-deshidrogenasa.

Description

Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes.

Objeto de la invención es un procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes, en las que se produce una sobre-expresión especialmente del gen de la glutamato-deshidrogenasa.

Estado de la técnica

Los L-aminoácidos se utilizan en la nutrición animal, en medicina humana y en la industria farmacéutica.

Los L-aminoácidos se preparan de forma fermentativa con cepas de bacterias corineformes productoras de L-aminoácidos, en especial Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de este grupo de productos, se trabaja constantemente en la optimización del procedimiento de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden afectar a las medidas técnicas de fermentación tales como, por ejemplo, agitación y aprovisionamiento de oxígeno, o a la composición del medio de nutrición tales como, por ejemplo, la concentración de azúcares durante la fermentación, o al procesamiento en la forma de producto mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del propio microorganismo.

Para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos, se utilizan métodos tales como mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta forma, se obtienen cepas que son resistentes contra antimetabolitos tales como, por ejemplo, la lisin-analogon-S-(2-aminoetil)-cisteína, o que son auxotróficas para aminoácidos importantes en la regulación y que producen L-aminoácidos.

Desde hace algunos años, se utilizan, asimismo, métodos de la técnica del ADN recombinante para la mejora de las cepas de Corynebacterium glutamicum productoras de L-aminoácidos, en los que se amplifican los genes de biosíntesis individuales y se investiga su efecto sobre la producción de L-aminoácidos. Artículos de recopilación sobre este asunto comprenden, entre otros, los de Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", en: Biology of Industrial Microorganisms; Demain y Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, Londres, Reino Unido, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

La enzima glutamato-deshidrogenasa cataliza la aminación reductora del ácido \alpha-cetoglutárico en ácido glutamínico. En la Solicitud de Patente francesa 2.575.492 se describe un fragmento de ADN de Corynebacterium melassecola 801, portador de un gen de glutamato-deshidrogenasa. Posiblemente, se le utiliza allí para elevar la formación de ácido glutamínico en la fermentación de Corynebacterium melassecola, para preparar los aminoácidos glutamina, prolina y arginina a partir de glutamato. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)) describieron la secuencia de nucleótidos del gen de la glutamato-deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032. La referencia sólo contiene datos acerca del incremento de la actividad específica de la enzima en la célula.

Por el documento WO 99/46363 se conoce la preparación de L-lisina con Corynebacterium, transformada con el gen gdh procedente de un Peptostreptococcus asaccharolyticus. La secuencia de nucleótidos del gen de la glutamato-deshidrogenasa de Peptostreptococcus asaccharolyticus se encuentra en Snedecor et al. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)).

Misión de la invención

Los presentes inventores se han impuesto como misión poner a disposición nuevas medidas para una preparación fermentativa mejorada de otros L-aminoácidos.

Descripción de la invención

Los L-aminoácidos se utilizan en la nutrición animal, en medicina humana y en la industria farmacéutica. Existe, por lo tanto, un interés general en poner a disposición nuevos procedimientos mejorados para la preparación de L-aminoácidos.

Cuando, en lo sucesivo, se haga referencia a L-aminoácidos, se dan a entender los aminoácidos formadores de proteínas L-treonina, L-isoleucina, L-valina, L-triptófano y, eventualmente, sus sales, en especial, L-treonina y L-triptófano.

Objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de uno o más de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo de la L-treonina, L-isoleucina, L-valina y L-triptófano, por fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas de microorganismos en las que se incrementa la actividad intracelular de la glutamato-deshidrogenasa y, en especial, se produce una sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la glutamato-deshidrogenasa.

En las reivindicaciones se encuentran las formas de realización preferidas.

El incremento de la actividad intracelular de una o múltiples enzimas en un microorganismo, codificado por el correspondiente ADN, se lleva a cabo, por ejemplo, aumentando el número de copias del gen o de los genes, utilizando un potente promotor o un gen que codifique una correspondientes enzima con una elevada actividad y, eventualmente, combinando estas medidas.

Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa, o a partir de glicerina y etanol. Se puede tratar de representantes de las bacterias corineformes, en especial del género Corynebacterium. Dentro del género de Corynebacterium se debe citar, especialmente, la especie Corynebacterium glutamicum que es conocida en la industria por su capacidad para producir L-aminoácidos.

Cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, son las cepas de tipo salvaje conocidas

Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermetum ATCC13869 y

Brevibacterium divaricatum ATCC14020

y los mutantes o cepas preparados a partir de las mismas, tales como, por ejemplo,

las cepas productoras de L-treonina

Corynebacterium glutamicum FERM-P 5835

Brevibacterium flavum FERM-P 4164 y

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4180,

o las cepas productoras de L-isoleucina

Corynebacterium glutamicum FERM-P 756

Brevibacterium flavum FERM-P 759 y

Brevibacterium lactofermentum FER-P 4192,

o las cepas productoras de L-valina

Brevibacterium flavum FERM-P 512 y

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845,

y las cepas productoras de L-triptófano

Corynebacterium glutamicum FERM-BP 478

Brevibacterium flavum FERM-BP 475 y

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 7127.

Los inventores han descubierto que las bacterias corineformes producen, tras la sobre-expresión de la L-glutamato-deshidrogenasa, L-aminoácidos de manera optimizada, sin que se reivindique aquí el ácido L-glutamínico.

De acuerdo con la invención, se puede utilizar el gen de la glutamato-deshidrogenasa de C. glutamicum, descrito por Börmann et al. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Adicionalmente, resulta adecuado el gen de la glutamato-deshidrogenasa de otros microorganismos tales como, por ejemplo, de Peptostreptococcus asaccharolyticus, descrito por Snedecor et al. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)). Además, se pueden utilizar alelos de los mencionados genes, procedentes de la degeneración del código genético o de las mutaciones de sentido ("sense mutations") de función neutra.

Para obtener una sobre-expresión, se puede elevar el número de copias del correspondiente gen, o se puede mutar la región promotora y reguladora, que se encuentra aguas arriba del gen estructural. Del mismo modo funcionan los cartuchos de expresión, incorporados aguas arriba del gen estructural. Mediante promotores inducibles resulta posible, adicionalmente, elevar la expresión en el transcurso de la producción fermentativa de L-aminoácidos. A través de medidas para prolongar la duración de la vida del ARNm se mejora, igualmente, la expresión. De la misma manera, evitando la degradación de la proteína enzimática se potencia la actividad enzimática. Los genes o construcciones génicas pueden estar presentes en plasmidios con diferente número de copias, o estar integrados en los cromosomas con la correspondiente amplificación. De forma alternativa, se puede lograr, adicionalmente, una sobre-expresión de los genes afectados modificando la composición de los medios y la realización de los cultivos.

El experto encontrará referencias en, entre otros, Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Patente Europea EPS 0.472.869, en la Patente de EE.UU. 4.601.893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular.

Ejemplos de plasmidios con cuya cooperación se puede sobre-expresar la glutamato-deshidrogenasa son pEK1, 9gdh-1 y pEKExpgdh, que están contenidos en las cepas ATCC13032/pEK1, 9gdg-1 y DH5\alpha/pEKExpgdh. El plasmidio pEK1, 9gdh-1 es un vector pendular que contiene el gen de la glutamato-deshidrogenasa dependiente de NADP de C. glutamicum. El plasmidio pEKExpgdh es un vector pendular que contiene la glutamato-deshidrogenasa dependiente de NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus.

Adicionalmente, para la producción de los correspondientes L-aminoácidos puede ser conveniente la sobre-expresión de una o varias enzimas de las respectivas vías de síntesis de los aminoácidos, junto con la glutamato-deshidrogenasa. De esta forma, resulta posible, por ejemplo

\bullet: para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-valina, se puede sobre-expresar, adicionalmente, el gen que codifica la acetohidroxiácido-sintasa (documento EP-B 0356739),

\bullet: para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-triptófano se puede sobre-expresar, adicionalmente, el gen que codifica la antranil-ácido fosforibosil-transferasa (documento EP-B 0124048),

\bullet: para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-treonina o L-isoleucina se puede sobre-expresar, adicionalmente, el gen que codifica la homoserin-deshidrogenasa (documento EP-A 0131171).

Adicionalmente, para la producción de los correspondientes L-aminoácidos puede ser conveniente, además de la sobre-expresión de la glutamato-deshidrogenasa, inhibir las reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

Los microorganismos preparados de acuerdo con la invención se pueden cultivar de manera continua o discontinua en procedimientos de lote (cultivo en serie) o en procedimiento de lote de alimentación (procedimiento de afluencia) o procedimiento repetido de lote de alimentación (procedimiento de afluencia repetitivo) con fines de producción de L-aminoácidos. Una recopilación de los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo utilizado debe satisfacer adecuadamente los requisitos de las correspondientes cepas. La obra "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., EE.UU., 1981) contiene descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos. Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de carbono tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerina y etanol, y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético. Estos elementos se pueden usar aislados o mezclados. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos que contengan nitrógeno orgánico tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de manantial de maíz, harina de semillas de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar aisladas o mezcladas. Como fuente de fósforo se pueden utilizar hidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato dipotásico, o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener, adicionalmente, sales metálicas tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, necesarias para el crecimiento. Por último, se pueden agregar nutrientes esenciales tales como aminoácidos y vitaminas a los elementos anteriormente mencionados. Al medio de cultivo se pueden agregar, adicionalmente, precursores adecuados. Los elementos mencionados se pueden agregar al cultivo en forma de una única adición, o de manera adecuada durante el cultivo.

Para el control de pH del cultivo se utilizan, de manera adecuada, compuestos básicos tales como hidróxido sódico, hidróxido de potasio, amoniaco, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el control de desarrollo de espuma se pueden emplear agentes antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plasmidios se pueden agregar al medio sustancias de acción selectiva adecuadas, por ejemplo, antibióticos. Con el fin de mantener las condiciones aerobias, se alimentan al cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo es normalmente de 20ºC hasta 45ºC y, preferentemente, de 25ºC a 40ºC. El cultivo se prolonga durante el tiempo necesario para que se forme el máximo de los L-aminoácidos deseados. Este objetivo se alcanza, normalmente, en el plazo de 10 horas hasta 160 horas.

El análisis de los L-aminoácidos se puede llevar a cabo de manera automática, basado en la cromatografía de intercambio de aniones, con derivatización posterior de ninhidrina, como lo describe Spackmann et al. (Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)).

Se han depositado los siguientes microorganismos en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania), según el Acuerdo de Budapest:

Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032(pEK1, 9gdh-1 como DSM 12614;

Escherichia coli K12 cepa DH5\alpha/pEKExpgdh como DSM 12613.

Ejemplos

La presente invención se explicará de forma más detallada mediante ejemplos de realización.

A este efecto se llevaron a cabo ensayos con cepas productoras de aminoácidos, en los que se demuestra la superioridad del procedimiento reivindicado:

a): la cepa de Brevibacterium flavum DSM5399 (documento EP-B 0.385.940), productora de L-treonina y L-isoleucina, y

b): la cepa ATCC13032\DeltailvA, depositada como DSM12455 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares en Braunschweig (Alemania), según el Acuerdo de Budapest, productora de L-valina y pobre en isoleucina.

Ejemplo 1 Preparación de productores de L-aminoácidos con refuerzo de glutamato-deshidrogenasa

El plasmidio pEK1,9gdh-1 se corresponde con el plasmidio pEK1.9gdh descrito por Börmann et al. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). Se le aisló de ATCC13032(pEK1,9gdh-1. Del mismo modo, se aisló el plasmidio conocido pEKExpgdh (Marx et al., Metabolic Engineering 1, 35-48 (1991)), portador del gen de la glutamato-deshidrogenasa de Peptostreptococcus asaccharo-lyticus (Snedecor et al., Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)), de la cepa de E. coli DH5\alpha/pEKExpgdh.

Las cepas DSM5399 y ATCC13032\DeltailvA se transformaron con el plasmidio pEK1,9gdh-1 de la forma descrita por Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)). La selección de los transformantes se efectuó sobre Agar de Cerebro-Corazón de la Compañía Merck (Darmstadt, Alemania), suplementado con 50 mg/l de kanamicina. De esta manera, se formaron las cepas DSM5715/pEK1,pgdh-1, DSM5399/pEK11,9gdh-1 y ATCC13032\DeltailvA/pEK1,9gdh-1. De la misma forma se transformó la cepa DSM5715 con el plasmidio pEKExpgdh y se obtuvo la cepa DSM5715/
pEKExpgdh.

TABLA 1

Componentes	Concentración por litro
(NH_{4})_{2}SO_{4}	20 g
Urea	5 g
KH_{2}PO_{4}	1 g
K_{2}HPO_{4}	1 g

TABLA 1 (continuación)

Componentes	Concentración por litro
MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O	0,25 g
Ácido 3-morfolin-propanosulfónico	42 g
FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O	10 mg
MnSO_{4} \cdot H_{2}O	10 mg
ZnSO_{4} \cdot 7H_{2}O	1 mg
CuSO_{4}	0,2 mg
NiCl_{2} \cdot 6H_{2}O	0,02 mg
CaCl_{2}	10 mg
Ácido proto-catecólico	0,03 mg
Biotina	200 \mug
Medio CgXII (Keilhauer et al.)

Después de la fermentación, se determinaron la densidad óptica (DO) (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instruments GmbH, Gräfelfing, Alemania) a una longitud de onda de medición de 600 nm, y la concentración de L-aminoácidos formados con un analizador de aminoácidos de la Compañía Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio de iones y posterior reacción de columna con detección de ninhidrina. En las Tablas 2 y 3 se presentan los resultados de los ensayos.

Ejemplo 2 Preparación de L-treonina y L-isoleucina

Se precultivó la cepa DSM5399/pEK1,9gdh-1 en medio completo CgIII (Kase y Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9), 1611-1621 (1972)) con 50 \mug/ml de kanamicina. Se inocularon 10 ml de Medio CgIII, contenido en un matraz de Erlenmeyer de 100 ml con 4 deflectores, con un asa de inoculación de la cepa y el cultivo se incubó durante 16 horas a 240 rpm y a 30ºC.

Para la inoculación de 10 ml del medio de producción, contenidos en el matraz de Erlenmeyer de 100 ml con 4 capas de desviación, se determinó la DO (660 nm) del precultivo. El cultivo principal se inoculó hasta una DO de 0,1. Como medio de producción se utilizó el medio CgXII descrito por Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 1993, 175:5595-5603). La composición del medio se representa en la Tabla 1. Se agregaron 4% de glucosa y 50 mg/l de sulfato de kanamicina. Las células se incubaron a 33ºC, 250 rpm y una humedad del aire de 80% durante 48 horas. Seguidamente, se determinó, de la forma anteriormente indicada, la densidad óptica a 660 nm y la concentración de L-treonina y L-isoleucina formadas. En la Tabla 2 se representa el resultado del ensayo.

TABLA 2

Cepa	DO	L-treonina g/l	L-isoleucina g/l
DSM5399	10,5	1,77	1,05
DSM5399/pEK1,9gdh-1	11,0	2,26	1,44

Ejemplo 3 Preparación de L-valina

Se precultivó la cepa ATCC13032\Deltailva/pEK1,9gdh-1 en medio completo CgIII (Kase y Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)) con 50 \mug/ml de kanamicina. Se agregaron 50 ml de Medio CgIII, contenido en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml con 4 deflectores, con un asa de incubación de la cepa y el cultivo se incubó durante 16 horas a 140 rpm y 30ºC.

Para la inoculación de 60 ml de medio de producción, contenidos en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml con 4 deflectores, se determinó la DO (660 nm) del precultivo. El cultivo principal se separó por centrifugación y se retiró el sobrenadante. El granulado se recogió en 5 ml de medio de producción y el cultivo principal se inoculó a una DO de 0,3. Como medio de producción se utilizó Medio CgXII (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 1993 175:5595-5603), como se ha descrito en el Ejemplo 2 (con 4% de glucosa). Las células se incubaron a 30ºC, 150 rpm durante 48 h. Seguidamente, se determinó la densidad óptica a 660 nm y la concentración en L-valina formada, del modo anteriormente descrito. En la Tabla 3 se representa el resultado del ensayo.

TABLA 3

Cepa	DO	L-valina g/l
ATCC13032\DeltailvA	18,5	0,29
ATCC13032\DeltailvA/pEK1,9gdh-1	17,6	0,45

Ejemplo 4 Preparación de L-lisina, L-valina y L-alanina

Se precultivó la cepa DSM5715/pEKExpgdh en medio complejo 2TY, compuesto por 16 g/l de triptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl. Se inocularon 60 ml de medio 2TY, contenidos en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con 2 deflectores, con un asa de inoculación de la cepa y el cultivo se incubó durante 12 horas a 150 rpm y a 30ºC.

Para la inoculación de 60 ml de medio de producción, contenidos en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con 2 placas de desviación, el precultivo se separó por centrifugación a 5000 rpm en una centrifugadora Sepatech Minifuge RF (Heraeus, Hanau, Alemania) durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y el granulado se resuspendió en 1 ml de medio de producción. Se agregó al medio de producción una parte alícuota de esta suspensión celular, de forma que se obtuvo una DO600 de aprox. 0,4. Como medio de producción se utilizó el medio CGC descrito por Schrumpf et al. (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) (Tabla 5), suplementado con 25 g/l de glucosa, 350 mg/l de leucina, 42 g/l de ácido 3-morfolino-propanosulfónico y 50 mg/l de monosulfato de kanamicina a pH 7. Los cultivos se incubaron durante 30 horas a 30ºC y a 150 rpm.

TABLA 4

Componente	Concentración por litro
(NH_{4})_{2}SO_{4}	5 g
Urea	5 g
KH_{2}PO_{4}	0,5 g
K_{2}HPO_{4}	0,5 g
MgSO_{4} \cdot 7 H_{2}O	0,25 g
FeSO_{4} \cdot 7 H_{2}O	10 mg
MnSO_{4} \cdot H_{2}O	10 mg
ZnSO_{4} \cdot 7 H_{2}O	1 mg
CuSO_{4}	0,2 mg
NiCl_{2} \cdot 6 H_{2}O	0,02 mg
CaCl_{2} \cdot 2 H_{2}O	10 mg
Biotina	200 \mug

A continuación, se determinaron la densidad óptica (DO) (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instruments GmbH, Gräfelfing, Alemania) a una longitud de onda de medición de 600 nm y la concentración en L-alanina, L-lisina y L-valina formadas, con un analizador de aminoácidos de la Compañía Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y reacción de columna posterior con detección de ninhidrina. En la Tabla 5 aparece el resultado del ensayo.

TABLA 5

Cepa	DO	L-alanina g/l	L-lisina g/l	L-valina g/l
DSM5715	29,4	Indicios	1,6	0,1
DSM5715/pEKExpgdh	19,4	0,6	2,1	0,6

Claims

1. Procedimiento para la preparación de uno o varios de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo de L-treonina, L-isoleucina, L-valina y L-triptófano, por fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con un gen de la glutamato-deshidrogenasa procedente de microorganismos, en las que se incrementa la actividad intracelular de la glutamato-deshidrogenasa, sobre-expresándose en especial la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la glutamato-deshidrogenasa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las que se refuerzan, además, los genes restantes de la vía metabólica de la formación de los L-aminoácidos deseados.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las que se inactivan, al menos parcialmente, las vías metabólicas que reducen la formación del o de los L-aminoácidos deseados.

4. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un vector de plasmidio y porque el vector de plasmidio es portador de la secuencia de nucleótidos que codifica la glutamato-deshidrogenasa.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque se utiliza la bacteria transformada con el vector de plasmidio pEK1,9gdh-1, depositado en Corynebacterium glutamicum, bajo el número DSM 12614.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con el vector de plasmidio pEKExpgdh, depositado en E. coli bajo el número DSM 12613.

7. Procedimiento para la preparación de uno o varios de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo de L-treonina, L-isoleucina, L-valina y L-triptófano, por fermentación de bacterias corineformes según la reivindicación 1, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

a): fermentación de bacterias transformadas con el gen de la glutamato-deshidrogenasa, en las cuales se incrementa la actividad intracelular de la glutamato-deshidrogenasa, sobre-expresándose en especial la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la glutamato-deshidrogenasa,

b): aumento del o de los L-aminoácidos deseados en el medio o en las células de las bacterias, y

c): aislamiento del o de los L-aminoácidos.