JPS61268185A - グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents
グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片Info
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- JPS61268185A JPS61268185A JP60292584A JP29258485A JPS61268185A JP S61268185 A JPS61268185 A JP S61268185A JP 60292584 A JP60292584 A JP 60292584A JP 29258485 A JP29258485 A JP 29258485A JP S61268185 A JPS61268185 A JP S61268185A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ） （以下しばしばＧＤＨと略す
る）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片
を有する組換え体ＤＮＡ、および該層換え体ＤＮＡを保
有する細胞に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細菌
は、大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られて
いる。またその変異株は。
タミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ） （以下しばしばＧＤＨと略す
る）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片
を有する組換え体ＤＮＡ、および該層換え体ＤＮＡを保
有する細胞に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細菌
は、大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られて
いる。またその変異株は。
Ｌ−リジン等のアミノ酸やイノシン酸等のプリンヌクレ
オチドを生産することも知られている。
オチドを生産することも知られている。
（従来の技術）
工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌に所望
の物質を大量に効率よく生産させるために、その細菌の
ＤＮＡ組換え技術による育種改良が試みられている。上
記細菌のＤＮＡ組換え技術による育種改良の重要な要素
として、上記細菌のある特定の遺伝子を含んだＤＮＡ断
片がある。
の物質を大量に効率よく生産させるために、その細菌の
ＤＮＡ組換え技術による育種改良が試みられている。上
記細菌のＤＮＡ組換え技術による育種改良の重要な要素
として、上記細菌のある特定の遺伝子を含んだＤＮＡ断
片がある。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌の育種改良を行うため
に、今までに該細菌の次の様な遺伝子がクローニングさ
れている。
に、今までに該細菌の次の様な遺伝子がクローニングさ
れている。
万円ら（昭和５８年、日本醗酵工学会大会講演要旨集Ｐ
、２８４）はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｓｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒ
−ｍｅｎｔｕｍ）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏ
ｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝
子をクローニングした。伊藤ら（日本農芸化学会昭和５
９年度大会講演要旨集Ｐ、４３１）は、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏ
ｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙ−１ａｓｅ）遺伝
子をクローニングした。勝亦ら（特開昭５８−１２６７
８９）は、コリネバクテリウム・グルタミクム（すＤ１
阻部μす肛ｄ且組１μ徂）（ＡＴＣＣ２１５４３）の５
−（２−アミノエチル）−システィン耐性を支配する遺
伝子とブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０６７
）のアンスラニル酸合成酵素（Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔ
ａ ５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子をクローニングした
。水上ら（日本農芸化学会昭和５９年度大会講演要旨集
Ｐ、２４９）は、コリネバクテリウム・グルタミクム（
垣ユ朋加望皇１ｕ註吐咀匡Ｕ）のＡＴＰ−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Ａ Ｔ Ｐ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆａｒａｓｅ）遺伝子をクロー
ニングした。佐野ら（特開昭５９−２１０８８７）は、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ＡＴＣＣ
１３８６９）のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（ｍｅｓ
ｏ−２，６−ｄｉａｍｉｎｏ ｐｉｍｅｌａｔｅ ｃａ
ｒ−ｂｏｘｙ−１ｙａｓａ）遺伝子をクローニングした
。
、２８４）はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｓｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒ
−ｍｅｎｔｕｍ）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏ
ｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝
子をクローニングした。伊藤ら（日本農芸化学会昭和５
９年度大会講演要旨集Ｐ、４３１）は、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏ
ｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙ−１ａｓｅ）遺伝
子をクローニングした。勝亦ら（特開昭５８−１２６７
８９）は、コリネバクテリウム・グルタミクム（すＤ１
阻部μす肛ｄ且組１μ徂）（ＡＴＣＣ２１５４３）の５
−（２−アミノエチル）−システィン耐性を支配する遺
伝子とブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０６７
）のアンスラニル酸合成酵素（Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔ
ａ ５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子をクローニングした
。水上ら（日本農芸化学会昭和５９年度大会講演要旨集
Ｐ、２４９）は、コリネバクテリウム・グルタミクム（
垣ユ朋加望皇１ｕ註吐咀匡Ｕ）のＡＴＰ−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Ａ Ｔ Ｐ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆａｒａｓｅ）遺伝子をクロー
ニングした。佐野ら（特開昭５９−２１０８８７）は、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ＡＴＣＣ
１３８６９）のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（ｍｅｓ
ｏ−２，６−ｄｉａｍｉｎｏ ｐｉｍｅｌａｔｅ ｃａ
ｒ−ｂｏｘｙ−１ｙａｓａ）遺伝子をクローニングした
。
（発明が解決しようとする問題点）
グルタミン酸は、他のアミノ酸へのアミノ基の直接的又
は間接的な供給源である。従って、グルタミン酸生産性
コリネ型細菌などの微生物の培養によって種々のアミノ
酸を製造するためにはその微生物の細胞内でのグルタミ
ン酸の産生が不可欠あ、る。また、所望のペプチドを微
生物の培養によって製造する場合には、その微生物を培
養することによる細胞内で生合成された種々のアミノ酸
からの生合成によって製造することができる。従って、
もし、グルタミン酸の細胞内での産生量を増加すること
ができれば、微生物の培養による所望のアミノ酸やペプ
チドの製造も高い収率で行なうことができる。
は間接的な供給源である。従って、グルタミン酸生産性
コリネ型細菌などの微生物の培養によって種々のアミノ
酸を製造するためにはその微生物の細胞内でのグルタミ
ン酸の産生が不可欠あ、る。また、所望のペプチドを微
生物の培養によって製造する場合には、その微生物を培
養することによる細胞内で生合成された種々のアミノ酸
からの生合成によって製造することができる。従って、
もし、グルタミン酸の細胞内での産生量を増加すること
ができれば、微生物の培養による所望のアミノ酸やペプ
チドの製造も高い収率で行なうことができる。
グルタミン酸は高濃度アンモニアイオン存在下でグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ、 Ｇ Ｄ Ｈ）の触媒作用により
合成される。従って、もし微生物細胞内でのＧＤＨ活性
を増強することができれば、微生物細胞内におけるグル
タミン酸の産生を促進することができる。
ミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ、 Ｇ Ｄ Ｈ）の触媒作用により
合成される。従って、もし微生物細胞内でのＧＤＨ活性
を増強することができれば、微生物細胞内におけるグル
タミン酸の産生を促進することができる。
前述のようにグルタミン酸の生産性の向上はグルタミン
酸だけでなくその他の種々アミノ酸の産生及び種々のペ
プチドの生産性の向上につながるものである。例えば、
グルタミン酸生産性コリネ型細菌、有用蛋白質生産菌あ
るいは単細胞蛋白質（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅ１ｌ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ）生産菌のＧＤＨ活性を強化することができれ
ば、それらの細菌の培養によるグルタミン酸やその他の
アミノ酸あるいはタンパク質の生産性を高めることがで
きる。しかしながら。
酸だけでなくその他の種々アミノ酸の産生及び種々のペ
プチドの生産性の向上につながるものである。例えば、
グルタミン酸生産性コリネ型細菌、有用蛋白質生産菌あ
るいは単細胞蛋白質（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅ１ｌ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ）生産菌のＧＤＨ活性を強化することができれ
ば、それらの細菌の培養によるグルタミン酸やその他の
アミノ酸あるいはタンパク質の生産性を高めることがで
きる。しかしながら。
従来ＧＤＨ活性を強化する有効な手段は見い出されてい
なかった。従って、微生物の培養による種々のアミノ酸
やペプチドの製造は満足できるものではなかった。
なかった。従って、微生物の培養による種々のアミノ酸
やペプチドの製造は満足できるものではなかった。
（問題を解決する為の手段および作用）本発明者らは上
記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、グルタミン
酸生産性コリネ型細菌からＧ Ｄ Ｈ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を分離しクローニングすることに成功し、遺
伝子操作により該ＤＮＡ断片でグルタミン酸生産性細菌
や有用蛋白質生産菌を形質転換することにより、これら
の細菌のＧＤＨ活性を増強できることを見出した。
記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、グルタミン
酸生産性コリネ型細菌からＧ Ｄ Ｈ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を分離しクローニングすることに成功し、遺
伝子操作により該ＤＮＡ断片でグルタミン酸生産性細菌
や有用蛋白質生産菌を形質転換することにより、これら
の細菌のＧＤＨ活性を増強できることを見出した。
これらの知見により本発明者らは本発明を完成するに到
った。
った。
即ち、基本的には、本発明によればグルタミン酸生産性
コリネ型細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ｌｕｔａｉａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ：
Ｇ Ｄ Ｈ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が提供される
。
コリネ型細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ｌｕｔａｉａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ：
Ｇ Ｄ Ｈ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が提供される
。
また、本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ： Ｇ Ｄ Ｈ
）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律
複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組
換え体ＤＮＡが提供される６ 更にまた、本発明によればグルタミン酸生産性コリネ型
細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａ
ｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ： Ｇ Ｄ
Ｈ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自
律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む
組換え体ＤＮＡを保有する細胞が提供される。
菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ： Ｇ Ｄ Ｈ
）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律
複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組
換え体ＤＮＡが提供される６ 更にまた、本発明によればグルタミン酸生産性コリネ型
細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａ
ｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ： Ｇ Ｄ
Ｈ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自
律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む
組換え体ＤＮＡを保有する細胞が提供される。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌とは、ダラム染色陽性
、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオチンを要求
するコリネ型細菌である。また該細菌は、ビオチンＩＩ
限培地で、または高濃度ビオチン含有培地では界面活性
剤等の添加により、培地中にＬ−グルタミン酸を著量蓄
積する。その代表的な微生物としては、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属、またはミクロバクテリ
ウム属に属する細菌が挙げられる。本発明のＤＮＡ断片
はこれらのグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のもの
である。
、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオチンを要求
するコリネ型細菌である。また該細菌は、ビオチンＩＩ
限培地で、または高濃度ビオチン含有培地では界面活性
剤等の添加により、培地中にＬ−グルタミン酸を著量蓄
積する。その代表的な微生物としては、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属、またはミクロバクテリ
ウム属に属する細菌が挙げられる。本発明のＤＮＡ断片
はこれらのグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のもの
である。
本発明のＤＮＡ断片はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産
生遺伝子を含有する。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ産
生遺伝子とはグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子であり、その遺伝子が微生物の細胞内で発現さ
れると、その細胞内でグルタミン酸デヒドロゲナーゼが
産生される。
生遺伝子を含有する。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ産
生遺伝子とはグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子であり、その遺伝子が微生物の細胞内で発現さ
れると、その細胞内でグルタミン酸デヒドロゲナーゼが
産生される。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼはα−ケトゲルタール酸
をグルタミン酸に転換する反応を触媒する酵素である。
をグルタミン酸に転換する反応を触媒する酵素である。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧＤＨ産生遺伝
子を含むＤＮＡ断片の分離は、通常の公知の宿主−ベク
ター系を用いて行なうことができる。
子を含むＤＮＡ断片の分離は、通常の公知の宿主−ベク
ター系を用いて行なうことができる。
宿主としては１例えば、大腸菌［エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）］が挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）］が挙げられる。
大腸菌としては例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） Ｋ ｌ ２株及びその変異株
を挙げることができる。その大腸菌又はその変異株を宿
主として用いる宿主−ベクター系において使用するベク
ターとしては上記大腸菌およびその変異株を形質転換す
るために通常用いられる公知のプラスミドを挙げること
ができる。また、宿主−ベクター系としてはグルタミン
酸生産性コリネ型細菌を宿主として、そして該細菌に適
合するプラスミドをベクターとして用いる宿主−ベクタ
ー系を用いることもできる。
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） Ｋ ｌ ２株及びその変異株
を挙げることができる。その大腸菌又はその変異株を宿
主として用いる宿主−ベクター系において使用するベク
ターとしては上記大腸菌およびその変異株を形質転換す
るために通常用いられる公知のプラスミドを挙げること
ができる。また、宿主−ベクター系としてはグルタミン
酸生産性コリネ型細菌を宿主として、そして該細菌に適
合するプラスミドをベクターとして用いる宿主−ベクタ
ー系を用いることもできる。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片は下記の方法によって、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌から単離することができる。
断片は下記の方法によって、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌から単離することができる。
（１）グルタミン酸生産性コリネ型細菌の菌体より、全
ＤＮＡを抽出し、種々の制限酵素で切断する。全ＤＮＡ
の抽出は、通常用いられている方法（リゾチウム・ＳＤ
Ｓ処理とフェノール・クロロホルム処理）により行うこ
とができる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては
、上記細菌の全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に
使用する宿主−ベクター系で用いられる後述のベクター
の開裂に用いることができる制限酵素であれば、いずれ
でも使用可能である。この除用いる制限酵素が、目的遺
伝子の内部を切断するかどうかは事前に不明なので、制
限酵素を作用させ、ＤＮＡを部分的に分解することによ
り、適当な大きさのＤＮＡ断片が得られる。このように
して得られた複数のＤＮＡ断片の中にグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が含まれてい
る。
ＤＮＡを抽出し、種々の制限酵素で切断する。全ＤＮＡ
の抽出は、通常用いられている方法（リゾチウム・ＳＤ
Ｓ処理とフェノール・クロロホルム処理）により行うこ
とができる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては
、上記細菌の全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に
使用する宿主−ベクター系で用いられる後述のベクター
の開裂に用いることができる制限酵素であれば、いずれ
でも使用可能である。この除用いる制限酵素が、目的遺
伝子の内部を切断するかどうかは事前に不明なので、制
限酵素を作用させ、ＤＮＡを部分的に分解することによ
り、適当な大きさのＤＮＡ断片が得られる。このように
して得られた複数のＤＮＡ断片の中にグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が含まれてい
る。
（２）ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる。
ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な制限
酵素を充分作用させることにより行なう。
酵素を充分作用させることにより行なう。
ベクターとしては形質転換すべき宿主菌に適合するもの
を用いる必要がある。そのベクターが使用しようとする
宿主菌によって消化されないことを予じめ確認する必要
がある。
を用いる必要がある。そのベクターが使用しようとする
宿主菌によって消化されないことを予じめ確認する必要
がある。
（３）ベクターＤＮＡの開裂部位に上記（１）で得たＤ
ＮＡ断片を各々組み込ませ、複数の閉環した組換え体Ｄ
ＮＡをつくる。ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断片
を組み込ませるには、公知の常法、例えばマニアティス
らの方法〔ティー、マニアティス（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）、 イー、エフ、フリッチュ（Ｅ、Ｆ、 Ｆｒ１
ｔｓｃ’ｈ）、 ジェイ、サンプルツク（Ｊ。
ＮＡ断片を各々組み込ませ、複数の閉環した組換え体Ｄ
ＮＡをつくる。ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断片
を組み込ませるには、公知の常法、例えばマニアティス
らの方法〔ティー、マニアティス（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）、 イー、エフ、フリッチュ（Ｅ、Ｆ、 Ｆｒ１
ｔｓｃ’ｈ）、 ジェイ、サンプルツク（Ｊ。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ：モレキュラークローニングアラ
ボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）
、コールドスプリングへ−バーエン。
ボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）
、コールドスプリングへ−バーエン。
ワイ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ、
Ｙ、） １９８２年〕を用いることができる。得られた
複数の組換え体ＤＮＡの中にグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有する組換え体Ｄ
ＮＡが含まれている。
Ｙ、） １９８２年〕を用いることができる。得られた
複数の組換え体ＤＮＡの中にグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有する組換え体Ｄ
ＮＡが含まれている。
（４）各組換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に移入し形質転換
体を得る。組換え体ＤＮＡの移入は、公知の方法、例え
ばマンデルらの方法〔マンデル、エム、 （Ｍａｎｄｅ
ｌ、 Ｍ、）、ヒガ、エイ、（Ｈｉｇａ＋ Ａ、）＋
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジ−（Ｊｏｕｒ−
ｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
、 ５３巻１５９−１６２頁（１９７０年）〕によって
行なうことができる。
体を得る。組換え体ＤＮＡの移入は、公知の方法、例え
ばマンデルらの方法〔マンデル、エム、 （Ｍａｎｄｅ
ｌ、 Ｍ、）、ヒガ、エイ、（Ｈｉｇａ＋ Ａ、）＋
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジ−（Ｊｏｕｒ−
ｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
、 ５３巻１５９−１６２頁（１９７０年）〕によって
行なうことができる。
宿主となる大腸菌は、目的遺伝子をクローニングした場
合宿主の表現型に変化が現れるものであれば、いずれで
も用いることができる。一般には、その様な変異株を使
用する必要がある。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤ
Ｈ）産生遺伝子をクローニングする場合には、宿主とな
る大腸菌は、ＧＤＨとグルタミン酸合成酵素（Ｇｌｕｔ
ａｍａｔｅ ５ｙｎｔｈａｓｅ）とを欠損している必要
がある。その理由を以下に述べる。上記変異株は生育す
るために、培地中にグルタミン酸を要求するので、グル
タミン酸無添加培地中では生育しない。しかしながら、
上記変異株をＧＤＨ産生遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで
形質転換するとその変異株はもはやその生育にグルタミ
ン酸を要求しなくなり、グルタミン酸無添加培地中でも
生育できるようになる。一方、たとえ上記変異株をＧＤ
Ｈ産生遺伝子を含まない組換え体ＤＮＡで形質転換して
も、その変異株はグルタミン酸をその生育に要求するの
でグルタミン酸無添加培地中では生育できない。従って
、得られた形質転換体をグルタミン酸無添加培地で培養
すれば、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有する
組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体だけが上記培地中
で生育する。
合宿主の表現型に変化が現れるものであれば、いずれで
も用いることができる。一般には、その様な変異株を使
用する必要がある。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤ
Ｈ）産生遺伝子をクローニングする場合には、宿主とな
る大腸菌は、ＧＤＨとグルタミン酸合成酵素（Ｇｌｕｔ
ａｍａｔｅ ５ｙｎｔｈａｓｅ）とを欠損している必要
がある。その理由を以下に述べる。上記変異株は生育す
るために、培地中にグルタミン酸を要求するので、グル
タミン酸無添加培地中では生育しない。しかしながら、
上記変異株をＧＤＨ産生遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで
形質転換するとその変異株はもはやその生育にグルタミ
ン酸を要求しなくなり、グルタミン酸無添加培地中でも
生育できるようになる。一方、たとえ上記変異株をＧＤ
Ｈ産生遺伝子を含まない組換え体ＤＮＡで形質転換して
も、その変異株はグルタミン酸をその生育に要求するの
でグルタミン酸無添加培地中では生育できない。従って
、得られた形質転換体をグルタミン酸無添加培地で培養
すれば、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有する
組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体だけが上記培地中
で生育する。
以上の理由から、ＧＤＨ及びグルタミン酸合成酵素の欠
損株を用いることにより所望の形質転換体を効率よく容
易に得ることができる。
損株を用いることにより所望の形質転換体を効率よく容
易に得ることができる。
上述の大腸菌の変異株は公知の常法、例えば下記の方法
により得ることができる。まず、大腸菌をＮ−メチル−
Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン（Ｎ−Ｍｅｔｈ
ｙｌ−Ｎ’ −ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａ
ｎｉｄｉｎｅ 。
により得ることができる。まず、大腸菌をＮ−メチル−
Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン（Ｎ−Ｍｅｔｈ
ｙｌ−Ｎ’ −ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａ
ｎｉｄｉｎｅ 。
ＮＴＧ）を用いて、公知の常法に従って変異処理し。
さらに公知の常法に従ってＬ−グルタミン酸要求株を分
離する。次に分離した株の細胞をＧＤＨ活性及びグルタ
ミン酸合成酵素活性の測定に供し、ＧＤＨ活性もグルタ
ミン酸合成酵素活性も示さない変異株の細胞を選別する
。選別した細胞を培養し、大腸菌のＧＤＨ及びグルタミ
ン酸合成酵素欠損変異株を得る。ＮＴＧ変異処理の代り
に、他の公知の変異誘導法〔例えば、紫外線照射、Ｘ線
照射、その他の変異誘起剤処理、トランスポゾン（Ｔｒ
ａｎｓρｏｓｏｎ）処理〕を用いることもできる。また
、研究者や公的機関より分譲されたＧＤＨ及びグルタミ
ン酸合成酵素欠損株を使用することもできる。
離する。次に分離した株の細胞をＧＤＨ活性及びグルタ
ミン酸合成酵素活性の測定に供し、ＧＤＨ活性もグルタ
ミン酸合成酵素活性も示さない変異株の細胞を選別する
。選別した細胞を培養し、大腸菌のＧＤＨ及びグルタミ
ン酸合成酵素欠損変異株を得る。ＮＴＧ変異処理の代り
に、他の公知の変異誘導法〔例えば、紫外線照射、Ｘ線
照射、その他の変異誘起剤処理、トランスポゾン（Ｔｒ
ａｎｓρｏｓｏｎ）処理〕を用いることもできる。また
、研究者や公的機関より分譲されたＧＤＨ及びグルタミ
ン酸合成酵素欠損株を使用することもできる。
（５）組換え体ＤＮＡを導入された大腸菌の中から目的
遺伝子を有する菌株を選択分離する。上記の工程（４）
によって得られる大腸菌の中から、グルタミン酸栄養要
求性を判断基準としてＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを保有する形質転換体を選択分離する。即ち、前記（
４）で得られた形質転換体を、常法に従がってグルタミ
ン酸無添加合成培地上で２０℃〜３７℃で培養する。グ
ルタミン酸無添加合成培地上で生育する菌株を選択する
。
遺伝子を有する菌株を選択分離する。上記の工程（４）
によって得られる大腸菌の中から、グルタミン酸栄養要
求性を判断基準としてＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを保有する形質転換体を選択分離する。即ち、前記（
４）で得られた形質転換体を、常法に従がってグルタミ
ン酸無添加合成培地上で２０℃〜３７℃で培養する。グ
ルタミン酸無添加合成培地上で生育する菌株を選択する
。
グルタミン酸無添加合成培地で生育した菌株について、
それらの細胞抽出液を用いて、公知の常法によりＧＤＨ
活性を測定する。その結果、高いＧＤＨ比活性を有する
形質転換株を選択分離し、培養することによりＧＤＨ産
生遺伝子クローニングを行なうことができる。得られた
菌株の細胞からのＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の
単離は公知の常法により例えば下記のようにして行なう
ことができる。
それらの細胞抽出液を用いて、公知の常法によりＧＤＨ
活性を測定する。その結果、高いＧＤＨ比活性を有する
形質転換株を選択分離し、培養することによりＧＤＨ産
生遺伝子クローニングを行なうことができる。得られた
菌株の細胞からのＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の
単離は公知の常法により例えば下記のようにして行なう
ことができる。
まず、公知の常法により該菌株の細胞から組換え体を分
離し、得られた組換え体ＤＮＡを制限酵素で処理して、
ベクターＤＮＡとＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と
に切断し、次に、この制限酵素処理試料を、アガロース
ゲル電気泳動に供する。アガロースゲル電気泳動上でベ
クターＤＮＡ断片とＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
とを充分分離する為には、該ＤＮＡ断片を含有する組換
え体ＤＮＡを、複数の制限酵素で処理する必要がある場
合もある。次に目的のＤＮＡ断片を含有するアガロース
ゲルを溶かした後、フェノール抽出、フェノール・クロ
ロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿によ
り、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離すること
ができる。
離し、得られた組換え体ＤＮＡを制限酵素で処理して、
ベクターＤＮＡとＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と
に切断し、次に、この制限酵素処理試料を、アガロース
ゲル電気泳動に供する。アガロースゲル電気泳動上でベ
クターＤＮＡ断片とＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
とを充分分離する為には、該ＤＮＡ断片を含有する組換
え体ＤＮＡを、複数の制限酵素で処理する必要がある場
合もある。次に目的のＤＮＡ断片を含有するアガロース
ゲルを溶かした後、フェノール抽出、フェノール・クロ
ロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿によ
り、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離すること
ができる。
本発明のＤＮＡ断片の具体的な一例として、微生物工業
技術研究所（以下しばしば単に微工研と略す）に寄託番
号微工研条寄第５５８号の下に寄託されている微生物コ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１より得
られるものが挙げられ、そのＤＮＡ断片は次の特徴を有
する。
技術研究所（以下しばしば単に微工研と略す）に寄託番
号微工研条寄第５５８号の下に寄託されている微生物コ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１より得
られるものが挙げられ、そのＤＮＡ断片は次の特徴を有
する。
（１）該ＤＮＡ断片は、分子量約５．４キロベースのデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
（２）該ＤＮＡ断片の両端は、制限酵素ＥｃｏＲＩによ
って生じる一本鎖末端である。
って生じる一本鎖末端である。
（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）ＢａｍＨＩ
３Ｂｇｆｌｌｌ
２ ＥｃｏＲＩ ０ ＨｉｎｄＩＩＩ ０Ｐｓｔ Ｉ
ｌ５ａｃ Ｉ
２ＳａＱ、Ｉ
０ Ｘｂａ Ｉ ＩＸ
ｈｏ Ｉ １制限
酵素による切断部位は、過剰の制限酵素存在下でＧＤＨ
産生遺伝子を含む断片を有するプラスミドを完全消化し
、それらの消化物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気
泳動および４％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供し、分離可能な断片の数から決定される。分子
の長さは、アガロ−スゲルミ気泳動の場合には、大腸菌
のラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡをＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化して得られる分子の長さ既知の断片、即
ち２１２３０塩基対５９４１９塩基対、６５５７塩基対
、４３７１塩基対、２３２２塩基対、 ２０２８塩基対
、５６５塩基対及び１２５塩基対の長さのＤＮＡ断片の
同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に
基づき、またポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合に
は、大腸菌のファイ・エックス１７４フアージ（φＸ
１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡをＨａｅ ｍで消化し
て得られる分子の長さ既知の断片、即ち１３５３塩基対
、１０７８塩基対、８７２塩基対、６０３塩基対、３１
０塩基対、２８１塩基対、２７１塩基対、２３４塩基対
、１９４塩基対、１１８塩基対及び７２塩基対の長さの
ＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距
離で描かれる標準線に基づき、消化プラスミドの分子の
長さを算出する。複数の断片を生じる場合には、それぞ
れの分子の長さを加算して求める。
３Ｂｇｆｌｌｌ
２ ＥｃｏＲＩ ０ ＨｉｎｄＩＩＩ ０Ｐｓｔ Ｉ
ｌ５ａｃ Ｉ
２ＳａＱ、Ｉ
０ Ｘｂａ Ｉ ＩＸ
ｈｏ Ｉ １制限
酵素による切断部位は、過剰の制限酵素存在下でＧＤＨ
産生遺伝子を含む断片を有するプラスミドを完全消化し
、それらの消化物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気
泳動および４％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供し、分離可能な断片の数から決定される。分子
の長さは、アガロ−スゲルミ気泳動の場合には、大腸菌
のラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡをＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化して得られる分子の長さ既知の断片、即
ち２１２３０塩基対５９４１９塩基対、６５５７塩基対
、４３７１塩基対、２３２２塩基対、 ２０２８塩基対
、５６５塩基対及び１２５塩基対の長さのＤＮＡ断片の
同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に
基づき、またポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合に
は、大腸菌のファイ・エックス１７４フアージ（φＸ
１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡをＨａｅ ｍで消化し
て得られる分子の長さ既知の断片、即ち１３５３塩基対
、１０７８塩基対、８７２塩基対、６０３塩基対、３１
０塩基対、２８１塩基対、２７１塩基対、２３４塩基対
、１９４塩基対、１１８塩基対及び７２塩基対の長さの
ＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距
離で描かれる標準線に基づき、消化プラスミドの分子の
長さを算出する。複数の断片を生じる場合には、それぞ
れの分子の長さを加算して求める。
上記プラスミドに対する前記制限酵素の相対的な切断部
位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で解析することにより求めることができる。
位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で解析することにより求めることができる。
この様にして得られるＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断
片は、ＧＤＨ産生遺伝子を損わない限り必要に応じてそ
の一部を変更することができる。
片は、ＧＤＨ産生遺伝子を損わない限り必要に応じてそ
の一部を変更することができる。
例えば、ＤＮＡ断片の一部を必要に応じて縮小化するこ
とができる。縮小化は、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素
で消化することにより行なうことができる。本発明のＤ
ＮＡ断片は、その様なＧＤＨ産生遺伝子を含む縮小化さ
れたＤＮＡ断片も包含する。縮小化によって得られるＧ
ＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の具体例としては、例
えば、下記のＤＮＡ断片を挙げることができる。
とができる。縮小化は、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素
で消化することにより行なうことができる。本発明のＤ
ＮＡ断片は、その様なＧＤＨ産生遺伝子を含む縮小化さ
れたＤＮＡ断片も包含する。縮小化によって得られるＧ
ＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の具体例としては、例
えば、下記のＤＮＡ断片を挙げることができる。
（Ｉ） の さが約４．５キロベースのＤ−ＮＡ瓶
崖 （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約４．５キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
崖 （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約４．５キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素ＢｇＱ
ＩＩ、ＥｃｏＲＩによって生じる一本鎖末端である。
ＩＩ、ＥｃｏＲＩによって生じる一本鎖末端である。
（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
ＢａｍＨＩ ３
ＢｇＱＩＩ Ｉ
ＥｃｏＲＩ ０
ＨｉｎｄＩＩ［０
Ｐｓｔ Ｉ ｌ５ａｃ Ｉ
２ＳａＱＩ
０ Ｘｂａ Ｉ ＩＸｈｏ Ｉ
１（ＩＩ）分子の長さが約３
．５キロベースのＤＮＡ斯ん （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．５キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
２ＳａＱＩ
０ Ｘｂａ Ｉ ＩＸｈｏ Ｉ
１（ＩＩ）分子の長さが約３
．５キロベースのＤＮＡ斯ん （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．５キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ 、Ｘｈｏ Ｉによって生じる一本鎖末端である。
ＲＩ 、Ｘｈｏ Ｉによって生じる一本鎖末端である。
（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
Ｂａｍｔ（Ｉ ３
８ｇ１２Ｉ［Ｉ
ＥｃｏＲＩ Ｏ
！（ｉｎｄ ｍ ０
Ｐｓｔ Ｉ ｌ
５ａｃ Ｉ ２
Ｓａｕｌ ０
Ｘｂａ Ｉ Ｉ
Ｘｈｏ Ｉ Ｏ
（ｍ） 子の長さが約３．２キロベースのＤＮＡ販皮
（１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．２キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ 、 Ｘｂａ Ｉによって生じる一本鎖末端である
。
ＲＩ 、 Ｘｂａ Ｉによって生じる一本鎖末端である
。
（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
ＢａｍＨＩ ３ＢｇＱｎ
Ｉ ＥｃｏＲＩ ０ Ｈｉｎｄ ｍ ０ Ｐｓｔ Ｉ ｌ ５ａｃ Ｉ ２ＳａＱＩ
０ Ｘｂａ Ｉ ０ Ｘｈｏ Ｉ ０ （ｒＶ） 子の さが・３．１キロベースのＤＮＡ新
庄 （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．１キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
Ｉ ＥｃｏＲＩ ０ Ｈｉｎｄ ｍ ０ Ｐｓｔ Ｉ ｌ ５ａｃ Ｉ ２ＳａＱＩ
０ Ｘｂａ Ｉ ０ Ｘｈｏ Ｉ ０ （ｒＶ） 子の さが・３．１キロベースのＤＮＡ新
庄 （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．１キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ 、 ＥｃｏＲＩによって生じる一本鎖末端である
。
ＨＩ 、 ＥｃｏＲＩによって生じる一本鎖末端である
。
（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
ＢａｍＨＩ ２Ｂｇｕｌ
ＩＥｃｏＲＩ
ＯＨｉｎｄｍ
０Ｐｓｔ Ｉ
ｌ５ａｃ Ｉ ２
Ｓａｉｌ ０Ｘｂａ Ｉ
０Ｘｈｏ Ｉ
Ｏまた５本発明のＤＮＡ断片は
ＧＤＨ産生遺伝子を損ねることなしにその制限部位の少
なくとも１ケ所の塩基配列を変更してその制限部位を切
断する制限酵素の種類を他の種類の制限酵素に変えるこ
とも容易にできる。更にまた、ＤＮＡ断片の両末端の少
なくとも一方の塩基配列を変更してそのＤＮＡ断片の末
端と結合させようとするベクターの開裂部位の塩基配列
と該ＤＮＡ断片の末端の塩基配列が合うようにすること
もできる。
ＩＥｃｏＲＩ
ＯＨｉｎｄｍ
０Ｐｓｔ Ｉ
ｌ５ａｃ Ｉ ２
Ｓａｉｌ ０Ｘｂａ Ｉ
０Ｘｈｏ Ｉ
Ｏまた５本発明のＤＮＡ断片は
ＧＤＨ産生遺伝子を損ねることなしにその制限部位の少
なくとも１ケ所の塩基配列を変更してその制限部位を切
断する制限酵素の種類を他の種類の制限酵素に変えるこ
とも容易にできる。更にまた、ＤＮＡ断片の両末端の少
なくとも一方の塩基配列を変更してそのＤＮＡ断片の末
端と結合させようとするベクターの開裂部位の塩基配列
と該ＤＮＡ断片の末端の塩基配列が合うようにすること
もできる。
前述のように、前記大腸菌のＧＤＨ及びグルタミン酸合
成酵素欠損株はその生育にグルタミン酸を要求し、かつ
ＧＤＨを産生じないが、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片を含有する組換え体ＤＮＡで上記変異株を形質転換
すると上記変異株はグルタミン酸を要求しなくなり、か
つＧＤＨを産生ずるようになる。従って１本発明のＤＮ
Ａ断片中にＧＤＨ産生遺伝子が存在することは、本発明
のＤＮＡ断片をベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作
成しその組換え体ＤＮＡを前記変異株の細胞に移入した
場合に、その細胞抄１グルタミン酸無添加培地で生育し
、細胞内にＧＤＨを産生ずるということにより確認する
ことができる。
成酵素欠損株はその生育にグルタミン酸を要求し、かつ
ＧＤＨを産生じないが、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片を含有する組換え体ＤＮＡで上記変異株を形質転換
すると上記変異株はグルタミン酸を要求しなくなり、か
つＧＤＨを産生ずるようになる。従って１本発明のＤＮ
Ａ断片中にＧＤＨ産生遺伝子が存在することは、本発明
のＤＮＡ断片をベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作
成しその組換え体ＤＮＡを前記変異株の細胞に移入した
場合に、その細胞抄１グルタミン酸無添加培地で生育し
、細胞内にＧＤＨを産生ずるということにより確認する
ことができる。
本発明の組換え体ＤＮＡは、ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ｂ）を含有する。ＧＤＨ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ａ）と自律複製に必要な遺伝子を含む
ＤＮＡ断片（Ｂ）とは直接または他の種類のＤＮＡを介
して間接的に結合している。ＤＮＡ断片（Ａ）としては
、前述の本発明のＤＮＡ断片を用いる。ＤＮＡ断片（Ｂ
）としては、公知の宿主−ベクター系で用いられるプラ
スミド、例えば、大腸菌の宿主−ベクター系で用いられ
るプラスミドおよびグルタミン酸生産性コリネ型細菌の
宿主−ベクター系で用いられるプラスミドなどを用いる
ことができる。大腸菌の宿主−ベクター系で用いられる
プラスミドとしては例えばプラスミドρＢＲ３２５及び
プラスミドρＢＲ３２５由来のプラスミドなどが挙げら
れる。グルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主−ベクタ
ー系で用いられるプラスミドとしては例えばプラスミド
ｐＡＧ１、ＰＡＧ３、ｐＡＧ１４、ρＡＧ５０及びそれ
らのプラスミド由来のプラスミドなどが挙げられる。プ
ラスミドｐＡＧ１、ρＡＧ１４、ρＡＧ３及びＰＡＧ５
０は後述の実施例に記載の方法により調製することがで
きる。プラスミドｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４及び
ｐＡＧ５０はそれぞれ第３図、第４図、第５図及び第６
図に示す制限酵素地図で表される。
ＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ｂ）を含有する。ＧＤＨ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ａ）と自律複製に必要な遺伝子を含む
ＤＮＡ断片（Ｂ）とは直接または他の種類のＤＮＡを介
して間接的に結合している。ＤＮＡ断片（Ａ）としては
、前述の本発明のＤＮＡ断片を用いる。ＤＮＡ断片（Ｂ
）としては、公知の宿主−ベクター系で用いられるプラ
スミド、例えば、大腸菌の宿主−ベクター系で用いられ
るプラスミドおよびグルタミン酸生産性コリネ型細菌の
宿主−ベクター系で用いられるプラスミドなどを用いる
ことができる。大腸菌の宿主−ベクター系で用いられる
プラスミドとしては例えばプラスミドρＢＲ３２５及び
プラスミドρＢＲ３２５由来のプラスミドなどが挙げら
れる。グルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主−ベクタ
ー系で用いられるプラスミドとしては例えばプラスミド
ｐＡＧ１、ＰＡＧ３、ｐＡＧ１４、ρＡＧ５０及びそれ
らのプラスミド由来のプラスミドなどが挙げられる。プ
ラスミドｐＡＧ１、ρＡＧ１４、ρＡＧ３及びＰＡＧ５
０は後述の実施例に記載の方法により調製することがで
きる。プラスミドｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４及び
ｐＡＧ５０はそれぞれ第３図、第４図、第５図及び第６
図に示す制限酵素地図で表される。
本発明の組換え体ＤＮＡは公知の宿主−ベクター系を用
いて作成することができる。例えば大腸菌の宿主−ベク
ター系、枯草菌の宿主ベクター系及びグルタミン酸生産
性コリネ型細菌の宿主−ベクター系などを用いて本発明
の組換え体ＤＮＡを作成することができる。
いて作成することができる。例えば大腸菌の宿主−ベク
ター系、枯草菌の宿主ベクター系及びグルタミン酸生産
性コリネ型細菌の宿主−ベクター系などを用いて本発明
の組換え体ＤＮＡを作成することができる。
本発明の組換え体ＤＮＡとしては、例えば、ｐＡＧ１０
３、ρＡＧ１１２、ｐＡＧｌｏｏｌ、ＰＡＧ１００２な
どがあげられる。組換え体Ｄ Ｎ Ａ ｐＡＧ１０３
、ｐＡＧ１１２は、ＧＤＨ産生遺伝子を含む上述のＤＮ
Ａ断片を、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２５又はｐＢＲ
３２５由来のプラスミドに組込んだ複合プラスミドであ
る。組換え体ＤＮＡ ＰＡＧｌｏｏＩ、ρＡＧ１００
２は、ＧＤＨ産生遺伝子を含む上述のＤＮＡを、グルタ
ミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミドＰＡＧ５０又は
ｐＡＧ５０由来のプラスミドに組込んだ複合プラスミド
である。
３、ρＡＧ１１２、ｐＡＧｌｏｏｌ、ＰＡＧ１００２な
どがあげられる。組換え体Ｄ Ｎ Ａ ｐＡＧ１０３
、ｐＡＧ１１２は、ＧＤＨ産生遺伝子を含む上述のＤＮ
Ａ断片を、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２５又はｐＢＲ
３２５由来のプラスミドに組込んだ複合プラスミドであ
る。組換え体ＤＮＡ ＰＡＧｌｏｏＩ、ρＡＧ１００
２は、ＧＤＨ産生遺伝子を含む上述のＤＮＡを、グルタ
ミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミドＰＡＧ５０又は
ｐＡＧ５０由来のプラスミドに組込んだ複合プラスミド
である。
本発明の細胞は、細菌とＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片を含有する組換え体ＤＮＡとを含有する。該層換え
体ＤＮＡは該細菌の中に保有されている。
断片を含有する組換え体ＤＮＡとを含有する。該層換え
体ＤＮＡは該細菌の中に保有されている。
該層換え体ＤＮＡとしては、上述の本発明の組換え体Ｄ
ＮＡが挙げられる。
ＮＡが挙げられる。
該細胞としては、公知の大腸菌の各株及び前述のグルタ
ミン酸生産性コリネ型細菌を挙げることができる。
ミン酸生産性コリネ型細菌を挙げることができる。
本発明の細胞は通常の公知の組換えＤＮＡ技術を用いて
該細菌を該層換え体ＤＮＡで形質転換することにより製
造することができる。
該細菌を該層換え体ＤＮＡで形質転換することにより製
造することができる。
本発明の細胞としては、例えば、宿主を大腸菌とした場
合には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＰＡ３４０（ｐＡＧ１０３）、
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ） Ｋ １２ＰＡ３４０ （ｐＡＧ１１２）などがあ
げられ、宿主をグルタミン酸生産性コリネ型細菌とした
場合には、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
８０１ （ｐ Ａ Ｇ１．００１）、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （ｐ Ａ Ｇ１００
２）などがあげられる。コリネバクテリウム０メラセコ
ラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ）８０１は、土壌より新たに分離された菌株で
あり、微生物工業技術研究所に寄託番号微工研条寄第５
５８号の下に寄託されれている。
合には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＰＡ３４０（ｐＡＧ１０３）、
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ） Ｋ １２ＰＡ３４０ （ｐＡＧ１１２）などがあ
げられ、宿主をグルタミン酸生産性コリネ型細菌とした
場合には、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
８０１ （ｐ Ａ Ｇ１．００１）、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （ｐ Ａ Ｇ１００
２）などがあげられる。コリネバクテリウム０メラセコ
ラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ）８０１は、土壌より新たに分離された菌株で
あり、微生物工業技術研究所に寄託番号微工研条寄第５
５８号の下に寄託されれている。
以下実施例により本発明の詳細な説明するが本発明はこ
れに限定されるものではない。
れに限定されるものではない。
（実施例）
実施例１
本実施例は、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
８０１ （微工研条寄５５８号）をＤＮＡ供与体と
して、同菌株のＧＤＨ産生遺伝子を、大腸菌の宿主ベク
ター系を利用してクローニングした例である。大腸菌宿
主としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ Ｋ１２） Ｋｌ ２ ＰＡ３４０を用
い、大腸菌ベクターとしては、ベクターｐＢＲ３２５を
用いた。
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
８０１ （微工研条寄５５８号）をＤＮＡ供与体と
して、同菌株のＧＤＨ産生遺伝子を、大腸菌の宿主ベク
ター系を利用してクローニングした例である。大腸菌宿
主としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ Ｋ１２） Ｋｌ ２ ＰＡ３４０を用
い、大腸菌ベクターとしては、ベクターｐＢＲ３２５を
用いた。
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１は
、微生物工業技術研究所に微工研条寄第５５８号として
寄託されている。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ） Ｋ１２ ＰＡ３４０は、イー
・コリジェネティック ストック センター（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、
（デパートメントオブヒニーマンジェネティックス、エ
ールユニバージティー、スクールオブメジシン、３３３
シーダーストリート、ピー、オー、ボックス３３３３、
二二−ヘイブン、コネチカット０６５１０、アメリカ合
衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、 Ｙａｌｅ Ｕｎｉ−ｖｅｒｓｉｔｙ、
５ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ３３３
ＣｅｄｅｒＳｔｒｅｅｔ Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ ３３３３
． Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 Ｃｏｎｎｅｃｔｉ−ｃｕｔ
０６５１０ Ｕ、Ｓ、Ａ、）］のバーバラジェイ、
バックマン（Ｂａｒｂａｒａ Ｊ、 Ｂａｃｈｍａｎｎ
）より分譲された菌株である。
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１は
、微生物工業技術研究所に微工研条寄第５５８号として
寄託されている。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ） Ｋ１２ ＰＡ３４０は、イー
・コリジェネティック ストック センター（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、
（デパートメントオブヒニーマンジェネティックス、エ
ールユニバージティー、スクールオブメジシン、３３３
シーダーストリート、ピー、オー、ボックス３３３３、
二二−ヘイブン、コネチカット０６５１０、アメリカ合
衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、 Ｙａｌｅ Ｕｎｉ−ｖｅｒｓｉｔｙ、
５ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ３３３
ＣｅｄｅｒＳｔｒｅｅｔ Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ ３３３３
． Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 Ｃｏｎｎｅｃｔｉ−ｃｕｔ
０６５１０ Ｕ、Ｓ、Ａ、）］のバーバラジェイ、
バックマン（Ｂａｒｂａｒａ Ｊ、 Ｂａｃｈｍａｎｎ
）より分譲された菌株である。
尚上記機関からは、誰でも菌株の分譲をうけることがで
きる。ベクターｐＢＲ３２５は、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−社（米国）より購入した。
きる。ベクターｐＢＲ３２５は、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリ−社（米国）より購入した。
（１）コリネバクテリウム・メラセコラ（７ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微
工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とその切断
糖蜜培地（ビート廃糖蜜８０ ｇ ／ Ｑ 、 Ｍｇ５
ｏ４＋ ７Ｈｚ ００．５ ｇ ／ Ｑ、尿素８ｇ／Ｑ
、リン酸１．５ｇ／ｎ、を含む水溶液をＰＨ６，２に調
整後１２０℃、１５分間殺菌して調製する）１００ｍ
１２に、コリネバクテリウム０メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｅｃｏｌａ）８０１
（微工研条寄第５５８号）を植菌し、３２℃にて−晩振
盪培養した。得られた培養液より菌体を集め、洗浄した
後、１０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ
８，０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液８ｒｎＱに懸濁
した。これにリゾチウムを最終濃度５ ｍｇ／ｍＱにな
るように加え、３７℃にて４時間反応させた。これにプ
ロナーゼＥ（シグマ社、米国より購入）を最終濃度２０
０μＱ ／ｍ Ｑになるように加え、室温で１５分間反
応させた。その後、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度
１％になるように添加して３７℃にて１時間反応させた
。反応終了後、反応液と等容のＴＮＥ緩衝液〔５ＱＩＩ
ＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、５ｎ＋Ｍ ＥＤＴ
Ａ、１００ｍＭ ＮａＣＱ 、 ｐＨ８，０）で飽和し
たフェノールを加え混合した後、１００００ ｒｐｍ（
１１０００ｇ ）で１Ｏ分間遠心分離して水層を回収し
た。この水層にフェノール・クロロホルム（１：１、ｖ
／ｖ）液を等容加えて混合の後、１００００ ｒｐｍ（
１１０００ｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収した
。この水層に等容のクロロホルムを加えて混合の後、１
００００ ｒｐｍ （１１０００ｇ）で１０分間遠心分
離して水層を回収した。この水層にリボヌクレアーゼＡ
（シグマ社、米国より購入）を最終濃度４０μｇ／ｍＱ
になる様に加えて３７℃にて１時間反応させた。反応終
了後、１１５容の５ＭＮａＣｆｆ水溶液と１７４容の５
０％ポリエチレングリコール６０００水溶液を添加混合
し、４℃にて４時間保持した。
ｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微
工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とその切断
糖蜜培地（ビート廃糖蜜８０ ｇ ／ Ｑ 、 Ｍｇ５
ｏ４＋ ７Ｈｚ ００．５ ｇ ／ Ｑ、尿素８ｇ／Ｑ
、リン酸１．５ｇ／ｎ、を含む水溶液をＰＨ６，２に調
整後１２０℃、１５分間殺菌して調製する）１００ｍ
１２に、コリネバクテリウム０メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｅｃｏｌａ）８０１
（微工研条寄第５５８号）を植菌し、３２℃にて−晩振
盪培養した。得られた培養液より菌体を集め、洗浄した
後、１０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ
８，０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液８ｒｎＱに懸濁
した。これにリゾチウムを最終濃度５ ｍｇ／ｍＱにな
るように加え、３７℃にて４時間反応させた。これにプ
ロナーゼＥ（シグマ社、米国より購入）を最終濃度２０
０μＱ ／ｍ Ｑになるように加え、室温で１５分間反
応させた。その後、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度
１％になるように添加して３７℃にて１時間反応させた
。反応終了後、反応液と等容のＴＮＥ緩衝液〔５ＱＩＩ
ＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、５ｎ＋Ｍ ＥＤＴ
Ａ、１００ｍＭ ＮａＣＱ 、 ｐＨ８，０）で飽和し
たフェノールを加え混合した後、１００００ ｒｐｍ（
１１０００ｇ ）で１Ｏ分間遠心分離して水層を回収し
た。この水層にフェノール・クロロホルム（１：１、ｖ
／ｖ）液を等容加えて混合の後、１００００ ｒｐｍ（
１１０００ｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収した
。この水層に等容のクロロホルムを加えて混合の後、１
００００ ｒｐｍ （１１０００ｇ）で１０分間遠心分
離して水層を回収した。この水層にリボヌクレアーゼＡ
（シグマ社、米国より購入）を最終濃度４０μｇ／ｍＱ
になる様に加えて３７℃にて１時間反応させた。反応終
了後、１１５容の５ＭＮａＣｆｆ水溶液と１７４容の５
０％ポリエチレングリコール６０００水溶液を添加混合
し、４℃にて４時間保持した。
次に試料を５０００ ｒｐＩｌｌ（２７００ｇ）で２０
分間遠心分離し、沈殿を回収した。得られた沈殿をＴＥ
緩衝液〔１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−）ＩＣＱ 、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５） ４ ｍ Ｑに溶か
し、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように
加えて、２倍容のエタノールを添加した。得られた混合
物を攪拌の後、−３０℃にて３時間保持し、１００００
ｒｐｍ（１１０００ｇ ） ’ｔ’ ２０分間遠心分
離し沈殿を回収した。得られた沈殿を減圧乾燥の後、Ｔ
Ｅ緩衝液２ＩＩＩＱに溶解し、ＤＮＡ濃度０．８５ｍｇ
／ｍＱの全ＤＮＡ溶液を得た。
分間遠心分離し、沈殿を回収した。得られた沈殿をＴＥ
緩衝液〔１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−）ＩＣＱ 、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５） ４ ｍ Ｑに溶か
し、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように
加えて、２倍容のエタノールを添加した。得られた混合
物を攪拌の後、−３０℃にて３時間保持し、１００００
ｒｐｍ（１１０００ｇ ） ’ｔ’ ２０分間遠心分
離し沈殿を回収した。得られた沈殿を減圧乾燥の後、Ｔ
Ｅ緩衝液２ＩＩＩＱに溶解し、ＤＮＡ濃度０．８５ｍｇ
／ｍＱの全ＤＮＡ溶液を得た。
ＤＮＡの切断のためには、３４μｇのＤＮＡに対して、
１６０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ にツポンジーン社よ
り購入）を加え、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ
（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍ
Ｍ Ｎａ（Ｐｉの緩衝液６７μＱ中で３７℃に゛て３Ｏ
分間反応を行なわせた。その後、７０℃で１０分間加熱
して、反応を停止させた。
１６０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ にツポンジーン社よ
り購入）を加え、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ
（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍ
Ｍ Ｎａ（Ｐｉの緩衝液６７μＱ中で３７℃に゛て３Ｏ
分間反応を行なわせた。その後、７０℃で１０分間加熱
して、反応を停止させた。
（２）ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦）Ｋ１２ＰＡ
３４０を５０ｍＭのＬ−ブロス（ポリペプトン１０ ｇ
／ｆｌ、酵母エキス５ｇ／１２、ＮａＣ（１５ｇＩＱ、
ＰＨ７，２）に植菌し、３７℃にて菌濃度５Ｘ１０”／
ｍＱまで増殖させた後、２℃で集菌した。得られた菌体
を５０ｍＭの氷冷した１ ００ ｍＭ ＭｇＣｎ ｚ水
溶液に懸濁した。得られた懸濁液から菌体を集菌後頁に
２５ｍｆｌの水冷した１ ００ ｍＭ ＣａＣＱ２水溶
液に懸濁した。懸濁液を水中で３０分間保持した後、懸
濁液から菌体を集菌して再度５ ｍＱの氷冷した１ ０
０ ｍＭ ＣａＣＱ ２水溶液に懸濁し、水中で１時間
保持した。得られた菌懸濁液２００μＱに、０゜１μｇ
のｐＢＲ３２５ＤＮＡ （ベセスダ リサーチラボラト
リ−社製、米国）を添加して、水中で１時間保持した。
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦）Ｋ１２ＰＡ
３４０を５０ｍＭのＬ−ブロス（ポリペプトン１０ ｇ
／ｆｌ、酵母エキス５ｇ／１２、ＮａＣ（１５ｇＩＱ、
ＰＨ７，２）に植菌し、３７℃にて菌濃度５Ｘ１０”／
ｍＱまで増殖させた後、２℃で集菌した。得られた菌体
を５０ｍＭの氷冷した１ ００ ｍＭ ＭｇＣｎ ｚ水
溶液に懸濁した。得られた懸濁液から菌体を集菌後頁に
２５ｍｆｌの水冷した１ ００ ｍＭ ＣａＣＱ２水溶
液に懸濁した。懸濁液を水中で３０分間保持した後、懸
濁液から菌体を集菌して再度５ ｍＱの氷冷した１ ０
０ ｍＭ ＣａＣＱ ２水溶液に懸濁し、水中で１時間
保持した。得られた菌懸濁液２００μＱに、０゜１μｇ
のｐＢＲ３２５ＤＮＡ （ベセスダ リサーチラボラト
リ−社製、米国）を添加して、水中で１時間保持した。
その後４２℃にて２分間保持した後、５ ｍｎのＬ−ブ
ロスを添加して、３７℃にて９Ｏ分間静置培養した。得
られた培養液を無菌水で適宜希釈して、１０μｇ／ｒｎ
Ｑのテトラサイクリンを含有するＬ−寒天培地（Ｌ−ブ
ロスに１５ｇ／Ｑの寒天を添加した培地）に塗布し、３
７℃で一晩培養し、プラスミドｐＢＲ３２５で形質転換
した大腸菌を得た。
ロスを添加して、３７℃にて９Ｏ分間静置培養した。得
られた培養液を無菌水で適宜希釈して、１０μｇ／ｒｎ
Ｑのテトラサイクリンを含有するＬ−寒天培地（Ｌ−ブ
ロスに１５ｇ／Ｑの寒天を添加した培地）に塗布し、３
７℃で一晩培養し、プラスミドｐＢＲ３２５で形質転換
した大腸菌を得た。
ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １２
Ｐ Ａ ３４０を、１００ｍ１２のテトラサイクリン（
１０μｇ／ｎｕを含むＬ−ブロスに植菌し、３７℃にて
一晩培養した。同培養液より集菌し、ＴＥ緩衝液で洗浄
後１５％（ｗ／ｖ）シュークロース、５０ＩＩＩＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＩＣＱ （ｐＨ８，５）、５０ ｍＭ
ＥＤＴＡ、２ｍ ｇ ／ｖａ Ｑリゾチウム（シグマ
、米国社より購入）よりなる水溶液２ｍＱに懸濁し、３
７℃にて３００分間反応せた。次に１ヘリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）溶液〔０，１％（ｗ／ｖ） トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ） Ｘ −１００，５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉ
ｓ）−ＨＣＱ、５０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 Ｐｔ（８，５
） ２ ｍＱを加えて、３７℃にて３０分間保持した。
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １２
Ｐ Ａ ３４０を、１００ｍ１２のテトラサイクリン（
１０μｇ／ｎｕを含むＬ−ブロスに植菌し、３７℃にて
一晩培養した。同培養液より集菌し、ＴＥ緩衝液で洗浄
後１５％（ｗ／ｖ）シュークロース、５０ＩＩＩＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＩＣＱ （ｐＨ８，５）、５０ ｍＭ
ＥＤＴＡ、２ｍ ｇ ／ｖａ Ｑリゾチウム（シグマ
、米国社より購入）よりなる水溶液２ｍＱに懸濁し、３
７℃にて３００分間反応せた。次に１ヘリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）溶液〔０，１％（ｗ／ｖ） トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ） Ｘ −１００，５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉ
ｓ）−ＨＣＱ、５０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 Ｐｔ（８，５
） ２ ｍＱを加えて、３７℃にて３０分間保持した。
次にこの溶液を、５℃にて３００００ ｒｐｍ （６４
０００ｇ）で１時間遠心分離し上清を回収し、この上清
にＴＥ緩衝液を加えて１８１ＩｌΩとした。この液に、
１０ｍｇ／ｍＲのエチジウムブロマイド水溶液１．２ｍ
Ｑと塩化セシウム１８．６４ ｇとを加えて静かに溶解
し、４００（ｌｏｒｐｍ （１０００００ｇ ）１５℃
で４８時間遠心分離した。ベクターｐＢＲ３２５は、紫
外線照射により遠心チューブ中、２本のバンドの下方と
して見い出され、このバンドを遠心チューブの側壁から
注射器で抜き取ることにより、ベクターｐＢＲ３２５画
分を得た。次にこの分画液を等容量のイソプロピルアル
コールで４回抽出してエチジウムブロマイドを除去し、
その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、Ｄ’ＮＡ濃度１
３０μｇ／ｍＱのプラスミドｐＢＲ３２５の透析完了液
ｉｎ＋９を得た６ プラスミドＰＢＲ３２５Ｄ Ｎ Ａ １７μｇを含む量
の上記透析完了液に対して４０単位の制限酵素ＥｃｏＲ
１を加えて、５０ｃＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ
（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ
ＮａＣＱの緩衝液１５０μα中で３７℃にて２時間反
応させた。
０００ｇ）で１時間遠心分離し上清を回収し、この上清
にＴＥ緩衝液を加えて１８１ＩｌΩとした。この液に、
１０ｍｇ／ｍＲのエチジウムブロマイド水溶液１．２ｍ
Ｑと塩化セシウム１８．６４ ｇとを加えて静かに溶解
し、４００（ｌｏｒｐｍ （１０００００ｇ ）１５℃
で４８時間遠心分離した。ベクターｐＢＲ３２５は、紫
外線照射により遠心チューブ中、２本のバンドの下方と
して見い出され、このバンドを遠心チューブの側壁から
注射器で抜き取ることにより、ベクターｐＢＲ３２５画
分を得た。次にこの分画液を等容量のイソプロピルアル
コールで４回抽出してエチジウムブロマイドを除去し、
その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、Ｄ’ＮＡ濃度１
３０μｇ／ｍＱのプラスミドｐＢＲ３２５の透析完了液
ｉｎ＋９を得た６ プラスミドＰＢＲ３２５Ｄ Ｎ Ａ １７μｇを含む量
の上記透析完了液に対して４０単位の制限酵素ＥｃｏＲ
１を加えて、５０ｃＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ
（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ
ＮａＣＱの緩衝液１５０μα中で３７℃にて２時間反
応させた。
その後、７０℃で１０分間加熱して、反応を停止させた
。この反応液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに
なる様に加え、更に２倍容のエタノールを添加して、−
３０℃にて３時間保持した。
。この反応液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに
なる様に加え、更に２倍容のエタノールを添加して、−
３０℃にて３時間保持した。
次に１２０００ｒｐｍ （８９００ｇ ）で室温で１０
分間遠心分離してＤＮＡ沈澱を回収し、得られた沈澱を
減圧乾燥した。乾燥した沈殿をＢＡＰＴ緩衝液（５０ｍ
Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＤ、ＰＨ８，４） ２００
μｆｌに溶解し。
分間遠心分離してＤＮＡ沈澱を回収し、得られた沈澱を
減圧乾燥した。乾燥した沈殿をＢＡＰＴ緩衝液（５０ｍ
Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＤ、ＰＨ８，４） ２００
μｆｌに溶解し。
バクチリアル・アルカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅ
−ｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ）（宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５
℃にて３０分間反応させた。更に同じ酵素を１単位添加
して、６５℃で３０分間反応させた。その後反応液に等
容のＴＨＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合し
た後、 １２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で
１０分間遠心分離して水層を回収し、更にもう一度同じ
操作を繰り返した。次に水層に等容のフェノール・クロ
ロホルム（１： １．ｖ／ｖ）液を添加して混合した後
、１２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で１０分
間遠心分離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロ
ロホルムを添加して攪拌した後、１２０００ ｒｐｍ（
８９００ｇ ）で室温で１０分間遠心分離し、水層を回
収した。該水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭ
になる様に加え、更に２倍容のエタノールを添加し攪拌
した後、−３０℃にて３時間保持した。
−ｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ）（宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５
℃にて３０分間反応させた。更に同じ酵素を１単位添加
して、６５℃で３０分間反応させた。その後反応液に等
容のＴＨＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合し
た後、 １２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で
１０分間遠心分離して水層を回収し、更にもう一度同じ
操作を繰り返した。次に水層に等容のフェノール・クロ
ロホルム（１： １．ｖ／ｖ）液を添加して混合した後
、１２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で１０分
間遠心分離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロ
ロホルムを添加して攪拌した後、１２０００ ｒｐｍ（
８９００ｇ ）で室温で１０分間遠心分離し、水層を回
収した。該水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭ
になる様に加え、更に２倍容のエタノールを添加し攪拌
した後、−３０℃にて３時間保持した。
その後、 １２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で１０
分間遠心分離し、ＤＮＡ沈澱を回収した。これを減圧乾
燥した後、２３μＱのＴＥ緩衝液で溶解した。
分間遠心分離し、ＤＮＡ沈澱を回収した。これを減圧乾
燥した後、２３μＱのＴＥ緩衝液で溶解した。
（３）ＤＮＡの組換え反応
実施例１工程（１）のＤ Ｎ Ａ ２．４μｇと前記実
施例１工程（２）のＤＮＡ１．４μｇと３単位のＴ４フ
ァージＤＮＡリガーゼにツポンジーン社より購入）とを
、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，
４）、１０ｍＭ ＭｇＣｎ ２．１０ ｍＭジチオトレ
イトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）、 １
ｍＭスペルミジン（Ｓｐｓｒｍｉｄｉｎｅ） 。
施例１工程（２）のＤＮＡ１．４μｇと３単位のＴ４フ
ァージＤＮＡリガーゼにツポンジーン社より購入）とを
、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，
４）、１０ｍＭ ＭｇＣｎ ２．１０ ｍＭジチオトレ
イトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）、 １
ｍＭスペルミジン（Ｓｐｓｒｍｉｄｉｎｅ） 。
１ ｍＭ ＡＴＰ、 ０．１ ｍｇ／ｍＱ ウシ血清
アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉ
ｎ、以下しばしばＢＳＡと略す）（ベセスダリチーチラ
ボラトジー社、米国より購入）の緩衝液１００μβ中で
、１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃にて１０
分間加熱することにより、反応を停止させた。
アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉ
ｎ、以下しばしばＢＳＡと略す）（ベセスダリチーチラ
ボラトジー社、米国より購入）の緩衝液１００μβ中で
、１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃にて１０
分間加熱することにより、反応を停止させた。
（４）組換えプラスミドの大腸菌への移入前記工程（２
）の方法により、エシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｓ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １ ２
Ｐ Ａ ３ ４ ０ のコンピテント細胞（
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を調製した。
）の方法により、エシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｓ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １ ２
Ｐ Ａ ３ ４ ０ のコンピテント細胞（
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を調製した。
コンピテント細胞懸濁液４００μＱと前記工程（３）の
反応液４０μＱとを混合して、水中に１時間保持した。
反応液４０μＱとを混合して、水中に１時間保持した。
その後、４２℃にて２分間加熱した後、５ｍ１２のＬ−
ブロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した。次
に、得られた培養液から菌体を集菌し、無菌水に懸濁し
た。得られたＳ濁液を、合成寒天培地（Ｎａ２ＨＰＯ４
６ｇ ／ Ｑ 、 ＫＨ２ＰＯ４３ｇ ／ Ｑ −Ｎａ
ＣＱｏ、５ｇ／１２．ＮＨ４ＣＱ Ｉｇ／Ｉ１１．
Ｍｇ５０４１ ｍＭ、ＣａＣＱ 。
ブロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した。次
に、得られた培養液から菌体を集菌し、無菌水に懸濁し
た。得られたＳ濁液を、合成寒天培地（Ｎａ２ＨＰＯ４
６ｇ ／ Ｑ 、 ＫＨ２ＰＯ４３ｇ ／ Ｑ −Ｎａ
ＣＱｏ、５ｇ／１２．ＮＨ４ＣＱ Ｉｇ／Ｉ１１．
Ｍｇ５０４１ ｍＭ、ＣａＣＱ 。
０．１ ｌｕＭ、グルコース２ｇ／Ｑ、寒天１５ｇ／ｆ
ｌ、Ｌ−スレオニン０．３ ｍ阿、Ｌ−ロイシン ０．
３ ｍＭ。
ｌ、Ｌ−スレオニン０．３ ｍ阿、Ｌ−ロイシン ０．
３ ｍＭ。
Ｌ−ヒスチジン０．１ ｍＭ、Ｌ−アルギニン ０．６
ｍ阿、チアミン０．０５ ｍＭ）に塗布して培養した。
ｍ阿、チアミン０．０５ ｍＭ）に塗布して培養した。
（５）コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃａｒ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
８０１）（微工研条寄第５５８号）のＧＤＨ産生遺伝子
を有する大腸菌の選択分離 前記実施例１工程（４）で得られた菌体を、クロラムフ
ェニコール（２０μｇ／ｖａＱ）とテトラサイクリン（
１０μｇ／ｍ１２）とを含む前記合成寒天培地と、テト
ラサイクリン（１０μｇ／ｍＱ）のみを含む前記合成寒
天培地とでそれぞれ培養し、生育の有無を調べた。クロ
ラムフェニコール感受性テトラサイクリン耐性グルタミ
ン酸非要求性を示す大腸菌の細胞を分離した。分離した
細胞は目的のＧＤＨ産生遺伝子を保持しており、これを
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ） Ｋ １２ Ｐ Ａ ３４０ （ｐＡＧ１０３）
と命名した。分離した大腸菌を培養してＧＤＨ産生遺伝
子をクローニングした。
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
８０１）（微工研条寄第５５８号）のＧＤＨ産生遺伝子
を有する大腸菌の選択分離 前記実施例１工程（４）で得られた菌体を、クロラムフ
ェニコール（２０μｇ／ｖａＱ）とテトラサイクリン（
１０μｇ／ｍ１２）とを含む前記合成寒天培地と、テト
ラサイクリン（１０μｇ／ｍＱ）のみを含む前記合成寒
天培地とでそれぞれ培養し、生育の有無を調べた。クロ
ラムフェニコール感受性テトラサイクリン耐性グルタミ
ン酸非要求性を示す大腸菌の細胞を分離した。分離した
細胞は目的のＧＤＨ産生遺伝子を保持しており、これを
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ） Ｋ １２ Ｐ Ａ ３４０ （ｐＡＧ１０３）
と命名した。分離した大腸菌を培養してＧＤＨ産生遺伝
子をクローニングした。
分離した大腸菌のＧＤＨ活性を、下記の方法で測定する
ことにより、クローニングした遺伝子がＧ Ｄ Ｈ産生
遺伝子であることを確認した。合成液体培地（ＫＨ２Ｐ
Ｏ４１３，６ｇＩＱ、 Ｋ２Ｓｏ、 ２．６１ｇ＃ｌ、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ，００，２ｇＩＱ 、 ＣａＣｆ１．
１０ ｍｇＩＱ 、 Ｆｅ５０．”７１１□００．５
ｍｇＩＱ、グルコース４ｇ／Ｒ，ＮＨ４＋１３ｇＩＱ、
Ｌ−スレオニン０．３ ｍＭ、Ｌ−ロイシン０．３ ｍ
Ｍ、Ｌ−ヒスチジン０．１ ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．
６ ｍＭ、チアミン０．０５ ｍＭ、 ｐＨ７，２）
１００ｍＱに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＰＡ３４０ （ｐＡＧ１０３
）を植菌し、３７℃で一日培養した。
ことにより、クローニングした遺伝子がＧ Ｄ Ｈ産生
遺伝子であることを確認した。合成液体培地（ＫＨ２Ｐ
Ｏ４１３，６ｇＩＱ、 Ｋ２Ｓｏ、 ２．６１ｇ＃ｌ、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ，００，２ｇＩＱ 、 ＣａＣｆ１．
１０ ｍｇＩＱ 、 Ｆｅ５０．”７１１□００．５
ｍｇＩＱ、グルコース４ｇ／Ｒ，ＮＨ４＋１３ｇＩＱ、
Ｌ−スレオニン０．３ ｍＭ、Ｌ−ロイシン０．３ ｍ
Ｍ、Ｌ−ヒスチジン０．１ ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．
６ ｍＭ、チアミン０．０５ ｍＭ、 ｐＨ７，２）
１００ｍＱに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＰＡ３４０ （ｐＡＧ１０３
）を植菌し、３７℃で一日培養した。
該大腸菌を集菌後、２ｍΩのＴＭ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、ｌＱｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７，６）に懸濁した。これを超音波処理し
た後、１４０００ ｒｐｍ （２００００ｇ）で２０分
間遠心分離して、細胞抽出液（粗酵素液）を調製した。
ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、ｌＱｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７，６）に懸濁した。これを超音波処理し
た後、１４０００ ｒｐｍ （２００００ｇ）で２０分
間遠心分離して、細胞抽出液（粗酵素液）を調製した。
尚、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ） Ｋ １２ＰＡ３４０やエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ翌旦） Ｋｌ ２ ＰＡ３４
０ （ｐＢＲ３２５）を培養する場合には、前記合成
液体培地に、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウムを添加し
た。
ｏｌｉ） Ｋ １２ＰＡ３４０やエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ翌旦） Ｋｌ ２ ＰＡ３４
０ （ｐＢＲ３２５）を培養する場合には、前記合成
液体培地に、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウムを添加し
た。
ＧＤＨ活性は、２．５ ＩＩＩＱの酵素反応液（５０ｍ
Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、４０ ｍＭ ＮＨ４Ｃ
Ｑ、 ０．２５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ１５ｍＭα−ケトグ
ルタル酸、１０〜１００μＱ細胞抽出液、ｐＨ７，６）
の３４０ ｎｍの吸光度の減少を、日立製作所製分光光
度計（２２８型）で測定することにより求めた。また細
胞抽出液の蛋白質濃度の測定にはローリ−（Ｌｏｗｒｙ
）ら〔オー、エイチ、ローリ−（０，Ｈ，ＬｏｏｆＶ）
ｔ エン、ジェイ、ローウェブロー（Ｎ、Ｊ、 Ｒｏ
ｗｅｂｒｏｕｇｈ）、アール、ジェイ２ランダル（Ｒ。
Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、４０ ｍＭ ＮＨ４Ｃ
Ｑ、 ０．２５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ１５ｍＭα−ケトグ
ルタル酸、１０〜１００μＱ細胞抽出液、ｐＨ７，６）
の３４０ ｎｍの吸光度の減少を、日立製作所製分光光
度計（２２８型）で測定することにより求めた。また細
胞抽出液の蛋白質濃度の測定にはローリ−（Ｌｏｗｒｙ
）ら〔オー、エイチ、ローリ−（０，Ｈ，ＬｏｏｆＶ）
ｔ エン、ジェイ、ローウェブロー（Ｎ、Ｊ、 Ｒｏ
ｗｅｂｒｏｕｇｈ）、アール、ジェイ２ランダル（Ｒ。
Ｊ、Ｒａｎｄａｌｌ） Ｔ ジェイ、パイオル、ケム（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、） １９３巻２６５頁（１９５１年）〕の方
法を用いた。
法を用いた。
尚、上記測定の標準蛋白質として、牛血清アルブミン（
和光紬薬工業社より購入）を用いた。
和光紬薬工業社より購入）を用いた。
結果を第１表に示す。
第 １ 表
注＝（１）反応液中の蛋白質１ ｍｇが、１分間に酸化
した還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎ
ｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 、
ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ。
した還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎ
ｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 、
ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ。
以下ＮＡＤＰＨと略す）の量（マイクロモル）で表示し
である。
である。
（２）イー・コリ ジェネティック ストックセンター
（Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅ
ｎｔｅｒ）。
（Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅ
ｎｔｅｒ）。
〔デパートメントオブヒニーマンジェネティックス、エ
ールユニバーシティ、スクールオブメジシン、３３３、
シーダーストリート、ピー、オー、ボックス３３３３、
ニューヘイブン、コネチカット０６５１０、アメリカ合
衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、 ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、 ５
ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３３ Ｃｅｄ
ｅｒＳｔｒｅｅｔ Ｐ、０． Ｂｏｘ ３３３３．
Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 Ｃｏｎ−ｎｅｃｔｉｃｕｔ ０
６５１０ Ｕ、Ｓ、Ａ、））のバーバラシェイパツク
マン（Ｂａｒｂａｒａ Ｊ、 Ｂａｃｈｍａｎｎ）より
分譲されたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ） Ｋ１２の変異菌株である。尚、上記機関
からは、誰でも菌株の分譲を受けることができる。本菌
株は、ＧＤＨとグルタミン酸合成酵素とを共に欠損して
いる。
ールユニバーシティ、スクールオブメジシン、３３３、
シーダーストリート、ピー、オー、ボックス３３３３、
ニューヘイブン、コネチカット０６５１０、アメリカ合
衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、 ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、 ５
ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３３ Ｃｅｄ
ｅｒＳｔｒｅｅｔ Ｐ、０． Ｂｏｘ ３３３３．
Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 Ｃｏｎ−ｎｅｃｔｉｃｕｔ ０
６５１０ Ｕ、Ｓ、Ａ、））のバーバラシェイパツク
マン（Ｂａｒｂａｒａ Ｊ、 Ｂａｃｈｍａｎｎ）より
分譲されたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ） Ｋ１２の変異菌株である。尚、上記機関
からは、誰でも菌株の分譲を受けることができる。本菌
株は、ＧＤＨとグルタミン酸合成酵素とを共に欠損して
いる。
第１表のＧＤＨ比活性測定結果より、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １２
Ｐ Ａ ３４０ （ｐＡＧ１０３）は、極めて高い
ＧＤＨ比活性を有していた。
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １２
Ｐ Ａ ３４０ （ｐＡＧ１０３）は、極めて高い
ＧＤＨ比活性を有していた。
（６）複合プラスミドｐＡＧ １０３の分離と解析プラ
スミドｐＢＲ３２５で形質転換されたエシェリヒア、コ
リに１２ ＰＡ３４０株の代わりにエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦）Ｋ１２ ＰＡ３
４０（ｐＡＧ１０３）を用いる以外は前記実施例１工程
（２）と実質的に同じ方法でプラスミドｐＡＧ１０３の
ＤＮＡを分離精製して１５０μｇのプラスミドｐＡＧ１
０３のＤＮＡを得た。このＤＮＡ ０．３μｇに、過
剰の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨｌ、 ＢｇｌＩ［
、Ｈｉｎｄｍにッポンジーン社より購入）、Ｐｓｔｌ（
ベセスダリチーチラボラトジー社、米国より購入）、５
ａｃｌ（宝酒造株式会社より購入）、５ａｌｌにッポン
ジーン社より購入ＬＸｂａＩにッポンジーン社より購入
）、Ｘｈｏ Ｉ （宝酒造株式会社より購入）〕を、そ
れぞれの適正条件にて反応させ、その消化した試料を常
法に従い１％（ν／Ｖ）アガロースゲル電気泳動、およ
び４％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した。泳動の終ったゲルを１μｇ ／ ｍ Ｑエチジウ
ムブロマイド水溶液に浸漬して３Ｏ分間染色した後、紫
外線をゲルに照射して生成したＤＮＡ断片に対応するバ
ンドの数を判定し、各断片の泳動距離から各々の分子の
長さを算出した。尚、分子の長さは、アガロースゲル電
気泳動の場合は同一アガロースゲル上で同時に電気泳動
したラムダファージ（λｐｈａｇｅ） Ｄ Ｎ Ａ に
ッポンジーン社より購入）の制限酵素１（ｉｎｄ ｍに
よる消化によって得られる既知の分子の長さ断片の泳動
距離との比較により、またポリアクリルアミドゲル電気
泳動の場合は同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に電
気泳動したファイエックス１７４フアージ（φＸ１７４
ρｈａｇｅ） Ｄ Ｎ Ａの制限酵素Ｈａｅ ｍによる
消化によって得られる既知の分子の長さの断片（ベセス
ダリチーチラボラトジー社、米国より購入）の泳動距離
との比較により算出した。更に、複数の制限酵素処理に
よって生じた消化断片を解析することにより、プラスミ
ド分子中の各制限酵素切断部位を決定した。
スミドｐＢＲ３２５で形質転換されたエシェリヒア、コ
リに１２ ＰＡ３４０株の代わりにエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦）Ｋ１２ ＰＡ３
４０（ｐＡＧ１０３）を用いる以外は前記実施例１工程
（２）と実質的に同じ方法でプラスミドｐＡＧ１０３の
ＤＮＡを分離精製して１５０μｇのプラスミドｐＡＧ１
０３のＤＮＡを得た。このＤＮＡ ０．３μｇに、過
剰の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨｌ、 ＢｇｌＩ［
、Ｈｉｎｄｍにッポンジーン社より購入）、Ｐｓｔｌ（
ベセスダリチーチラボラトジー社、米国より購入）、５
ａｃｌ（宝酒造株式会社より購入）、５ａｌｌにッポン
ジーン社より購入ＬＸｂａＩにッポンジーン社より購入
）、Ｘｈｏ Ｉ （宝酒造株式会社より購入）〕を、そ
れぞれの適正条件にて反応させ、その消化した試料を常
法に従い１％（ν／Ｖ）アガロースゲル電気泳動、およ
び４％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した。泳動の終ったゲルを１μｇ ／ ｍ Ｑエチジウ
ムブロマイド水溶液に浸漬して３Ｏ分間染色した後、紫
外線をゲルに照射して生成したＤＮＡ断片に対応するバ
ンドの数を判定し、各断片の泳動距離から各々の分子の
長さを算出した。尚、分子の長さは、アガロースゲル電
気泳動の場合は同一アガロースゲル上で同時に電気泳動
したラムダファージ（λｐｈａｇｅ） Ｄ Ｎ Ａ に
ッポンジーン社より購入）の制限酵素１（ｉｎｄ ｍに
よる消化によって得られる既知の分子の長さ断片の泳動
距離との比較により、またポリアクリルアミドゲル電気
泳動の場合は同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に電
気泳動したファイエックス１７４フアージ（φＸ１７４
ρｈａｇｅ） Ｄ Ｎ Ａの制限酵素Ｈａｅ ｍによる
消化によって得られる既知の分子の長さの断片（ベセス
ダリチーチラボラトジー社、米国より購入）の泳動距離
との比較により算出した。更に、複数の制限酵素処理に
よって生じた消化断片を解析することにより、プラスミ
ド分子中の各制限酵素切断部位を決定した。
その結果、プラスミドｐＡＧ１０３は、第１図の制限酵
素地図で示される構造を有し、ベクターｐＢＲ３２５の
制限酵素ＥｃｏＲＴ、切断部位に約５．４キロベースの
外来のＥｃｏＲＩ断片が組込まれていた。このＥｃ。
素地図で示される構造を有し、ベクターｐＢＲ３２５の
制限酵素ＥｃｏＲＴ、切断部位に約５．４キロベースの
外来のＥｃｏＲＩ断片が組込まれていた。このＥｃ。
ＲＩ断片が、コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■朋
脂区１妖四）ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微工
研条寄第５５８号）由来のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片である。第１図においてプラスミドの分子量は、
キロベース（ｋｂ）で表示しである。図中の記号は、後
で纏めて記す制限酵素であり、プラスミド上のその位置
は、その制限酵素切断部位を示す。その横に付した数字
は、制限酵素ＥｃｏＲＩの一方の切断部位を基準とした
プラスミド上での位置をキロベースで表示したものであ
る。また、ＰＢＲ３２５−（Ａ）はプラスミドｐＢＲ３
２５をＥｃｏＲＩで開環したＤＮＡ断片を示し、ＤＮＡ
−（Ａ）は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
（約５．４キロベース）を示す。
脂区１妖四）ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微工
研条寄第５５８号）由来のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片である。第１図においてプラスミドの分子量は、
キロベース（ｋｂ）で表示しである。図中の記号は、後
で纏めて記す制限酵素であり、プラスミド上のその位置
は、その制限酵素切断部位を示す。その横に付した数字
は、制限酵素ＥｃｏＲＩの一方の切断部位を基準とした
プラスミド上での位置をキロベースで表示したものであ
る。また、ＰＢＲ３２５−（Ａ）はプラスミドｐＢＲ３
２５をＥｃｏＲＩで開環したＤＮＡ断片を示し、ＤＮＡ
−（Ａ）は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
（約５．４キロベース）を示す。
プラスミドＰＡＧ１０３ ＤＮＡをプラスミドＰＢＲ３
２５の代わりに用いる以外は前記実施例１工程（２）と
実質的に同様の方法でエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ１２ ＰＡ３４０を形質
転換して形質転換体を得た。得られた形質転換体を薬剤
耐性及び栄養要求性に関して調べた結果、調べた形質転
換株は、全てテトラサイクリン耐性アンピシリン耐性ク
ロラムフェニコール感受性グルタミン酸非要求性であっ
た。更に、該形質転換株について、それらが保有するプ
ラスミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与
プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定され
るプラスミドであった。
２５の代わりに用いる以外は前記実施例１工程（２）と
実質的に同様の方法でエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ１２ ＰＡ３４０を形質
転換して形質転換体を得た。得られた形質転換体を薬剤
耐性及び栄養要求性に関して調べた結果、調べた形質転
換株は、全てテトラサイクリン耐性アンピシリン耐性ク
ロラムフェニコール感受性グルタミン酸非要求性であっ
た。更に、該形質転換株について、それらが保有するプ
ラスミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与
プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定され
るプラスミドであった。
（７） Ｇ Ｄ Ｈ産生遺伝子を含む約５．４キロベー
スのＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ１
０３（７）ＤＮＡ２０μｇＬニ一対シテ、１００単位の
制限酵素ＥｃｏＲＩ 、 ５ａｆｌ Ｉをそれぞれ加え
て、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−Ｈｆ、Ｑ（ｐＨ７，
４）、１０ｄ Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭＮａＣΩの緩衝
液１００μＱ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化
して得られた試料は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
−社、米国より購入したＬＭＰアガロース（Ａｇａｒｏ
ｓｅ）を使用し、４℃で電気泳動を行なう以外は前記と
同様の方法により、１％アガロースゲル電気泳動に供し
た。次に、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染
色して紫外線照射下に置き、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約
５．４キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付
近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガロー
スゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、６５
℃で１０分間保持し、アガロースゲルを完全にＴＥ緩衝
液に溶解した。次に、等容のフェノールを添加して、攪
拌の後、水層を回収した。該水層に等容のフェノール・
クロロホルム（１：１．ｖ／ｖ）液を添加して、攪拌の
後、水層を回収した。得られた水層に等容のクロロホル
ムを添加して、攪拌の後、水層を回収した。得られた水
層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように
添加し、更に２倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−
３０℃にて３時間保持した。
スのＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ１
０３（７）ＤＮＡ２０μｇＬニ一対シテ、１００単位の
制限酵素ＥｃｏＲＩ 、 ５ａｆｌ Ｉをそれぞれ加え
て、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−Ｈｆ、Ｑ（ｐＨ７，
４）、１０ｄ Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭＮａＣΩの緩衝
液１００μＱ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化
して得られた試料は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
−社、米国より購入したＬＭＰアガロース（Ａｇａｒｏ
ｓｅ）を使用し、４℃で電気泳動を行なう以外は前記と
同様の方法により、１％アガロースゲル電気泳動に供し
た。次に、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染
色して紫外線照射下に置き、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約
５．４キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付
近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガロー
スゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、６５
℃で１０分間保持し、アガロースゲルを完全にＴＥ緩衝
液に溶解した。次に、等容のフェノールを添加して、攪
拌の後、水層を回収した。該水層に等容のフェノール・
クロロホルム（１：１．ｖ／ｖ）液を添加して、攪拌の
後、水層を回収した。得られた水層に等容のクロロホル
ムを添加して、攪拌の後、水層を回収した。得られた水
層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように
添加し、更に２倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−
３０℃にて３時間保持した。
その後、１００００ ｒｐｍ （９０００ｇ）で室温で
１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈澱を回収した。次に
、得られた沈澱を減圧乾燥後、ＧＤＨ産生遺伝子を含む
約５．４キロベースのＤＮＡ断片を約２μｇ取得した。
１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈澱を回収した。次に
、得られた沈澱を減圧乾燥後、ＧＤＨ産生遺伝子を含む
約５．４キロベースのＤＮＡ断片を約２μｇ取得した。
（８） Ｇ Ｄ Ｈ産生遺伝子を含む約５．４キロベ一
スＤＮＡ断片の縮ノＪ）化 前記実施例１工程（２）で調製したベクターｐＢＲ３２
５ＤＮＡ１．３μｇに対して１５単位の制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩと１８単位の制限酵素ＢａｍＨＩとを加えて、５０
ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、
１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４゜１００ ｍＭ ＮａＣＱを
含有する緩衝液７５μｆｌ中で３７℃にて１時間反応さ
せた。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１：
１ ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した
。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を
回収した。
スＤＮＡ断片の縮ノＪ）化 前記実施例１工程（２）で調製したベクターｐＢＲ３２
５ＤＮＡ１．３μｇに対して１５単位の制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩと１８単位の制限酵素ＢａｍＨＩとを加えて、５０
ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ（ｐＨ７，４）、
１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４゜１００ ｍＭ ＮａＣＱを
含有する緩衝液７５μｆｌ中で３７℃にて１時間反応さ
せた。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１：
１ ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した
。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を
回収した。
そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるよう
に加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０℃
で３時間保持した後、１２０００ ｒｐｍ（８９００ｇ
）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し
、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
に加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０℃
で３時間保持した後、１２０００ ｒｐｍ（８９００ｇ
）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し
、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ１
０３のＤＮＡ１．６μｇに対して、１５単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩを加えて５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−
ＨＣｎ （ｐＨ７，４）１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，１０
０ｔｒｒＭ ＮａＣＱを含む緩衝液６ｏμａ中で３７℃
にて１時間反応させた。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃
度３００ ｍＭになるように加えて、次に２倍容のエタ
ノールを添加して、−３０℃で３時間保持した後、１２
０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で１０分間遠心
分離してＤＮＡの沈殿を回収し、これを減圧乾燥した。
０３のＤＮＡ１．６μｇに対して、１５単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩを加えて５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−
ＨＣｎ （ｐＨ７，４）１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，１０
０ｔｒｒＭ ＮａＣＱを含む緩衝液６ｏμａ中で３７℃
にて１時間反応させた。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃
度３００ ｍＭになるように加えて、次に２倍容のエタ
ノールを添加して、−３０℃で３時間保持した後、１２
０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で１０分間遠心
分離してＤＮＡの沈殿を回収し、これを減圧乾燥した。
このＤＮＡ全量に対して、０゜６単位の制限酵素Ｂａｍ
ＨＩを加えて、 １０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ
ＮａＣＱ 。
ＨＩを加えて、 １０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ
ＮａＣＱ 。
１ ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉ
ｔｏｌ）の緩衝液６０μα中で３７℃にて１時間反応さ
せた。そこへフェノール・クロロホルム（１：１ ｖ／
ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に等容
のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した。
ｔｏｌ）の緩衝液６０μα中で３７℃にて１時間反応さ
せた。そこへフェノール・クロロホルム（１：１ ｖ／
ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に等容
のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した。
そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００ ｍＭになるよ
うに加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃で３時間保持した後、１２０００ ｒｐｍ （８９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回
収し、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
うに加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃で３時間保持した後、１２０００ ｒｐｍ （８９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回
収し、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。
前記のＤＮＡ試料ＩとＤＮＡ試料■との全量に対して、
３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼを、５０ｍＭ ト
リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４）、１０ ｍ
Ｍ ＭｇＣＱ ２゜１０ ｍＭジチオトレイトール（Ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） 。
３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼを、５０ｍＭ ト
リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４）、１０ ｍ
Ｍ ＭｇＣＱ ２゜１０ ｍＭジチオトレイトール（Ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） 。
１ ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、 １
ｍＭ ＡＴＰ、 ０．１ｍｇ／ｍ Ｑ ＢＳＡを含む
緩衝液１００μＱ中で、１５℃にて一晩作用させた。そ
の後、７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を
停止させた。
ｍＭ ＡＴＰ、 ０．１ｍｇ／ｍ Ｑ ＢＳＡを含む
緩衝液１００μＱ中で、１５℃にて一晩作用させた。そ
の後、７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を
停止させた。
得られたりガーゼ反応液を用いて、前記実施例１工程（
４）と実質的に同様の方法により、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋｌ ２
ＰＡ３４０の形質転換操作を行った。その結果、アンピ
シリン耐性でグルタミン酸非要求性を示す形質転換体を
多数得ることができた。これらの形質転換体について、
前記実施例１工程（６）と実質的に同様の方法により、
各形質転換体の保有するプラスミドを分離し解析した。
４）と実質的に同様の方法により、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋｌ ２
ＰＡ３４０の形質転換操作を行った。その結果、アンピ
シリン耐性でグルタミン酸非要求性を示す形質転換体を
多数得ることができた。これらの形質転換体について、
前記実施例１工程（６）と実質的に同様の方法により、
各形質転換体の保有するプラスミドを分離し解析した。
得られたプラスミドをプラスミドｐＡＧ１１２と命名し
た。プラスミドｐＡＧ１１２を保持する形質転換体の菌
株について、前記実施例１工程（５）と実質的に同様の
方法によりＧＤＨ活性を測定した結果、極めて高いＧＤ
Ｈ比活性が認められた。
た。プラスミドｐＡＧ１１２を保持する形質転換体の菌
株について、前記実施例１工程（５）と実質的に同様の
方法によりＧＤＨ活性を測定した結果、極めて高いＧＤ
Ｈ比活性が認められた。
プラスミドＰＡＧ１１２は第２図の制限酵素地図で示さ
れる構造を有し、ベクターｐＢＲ３２５の約４．４キロ
ベースのＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片と、約３．１キ
ロベースの外来のＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片とが結
合してできた組換え体ＤＮＡであった。この約３．１キ
ロベースの外来のＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片が、コ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅ−ｃｏｌａ）８０１（微工
研条寄第５５８号）由来のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片である。第２図においてｐＢＲ３２５−（Ｂ）は
ｐＢＲ３２５由来のＤＮＡ断片（約４．４キロベース）
を示し、ＤＮＡ−（Ｂ）は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片（約３．１キロベース）を示す。
れる構造を有し、ベクターｐＢＲ３２５の約４．４キロ
ベースのＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片と、約３．１キ
ロベースの外来のＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片とが結
合してできた組換え体ＤＮＡであった。この約３．１キ
ロベースの外来のＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片が、コ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅ−ｃｏｌａ）８０１（微工
研条寄第５５８号）由来のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片である。第２図においてｐＢＲ３２５−（Ｂ）は
ｐＢＲ３２５由来のＤＮＡ断片（約４．４キロベース）
を示し、ＤＮＡ−（Ｂ）は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片（約３．１キロベース）を示す。
プラスミドＰＡＧ１１２をプラスミドｐＢＲ３２５の代
わりに用いる以外は前記実施例１工程（２）と実質的に
同様の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−
４すａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＰＡ３４０を形質転換した
。得られた形質転換体を薬剤耐性及び栄養要求性に関し
て調べた結果、調べた形質転換体は、全てアンピシリン
耐性グルタミン酸非要求性であった。更に、得られた形
質転換体について、それらが保有するプラスミドを解析
した結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比
べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。
わりに用いる以外は前記実施例１工程（２）と実質的に
同様の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−
４すａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＰＡ３４０を形質転換した
。得られた形質転換体を薬剤耐性及び栄養要求性に関し
て調べた結果、調べた形質転換体は、全てアンピシリン
耐性グルタミン酸非要求性であった。更に、得られた形
質転換体について、それらが保有するプラスミドを解析
した結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比
べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。
（９）ＧＤＨ産生遺伝子を含む約３．１キロベースのＤ
ＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（８）で調製したプラスミドｐＡＧ１
１２のＤＮＡ ５０μｇに対して、２００単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩを加えて、５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉ
ｓ）−）ＩＣＱ （ｐＨ７，４）、 １０ ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ４，１００ｍＭ ＮａＣＱを含む緩衝液１００μΩ
中で、３７℃にて２時間反応させた。
ＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（８）で調製したプラスミドｐＡＧ１
１２のＤＮＡ ５０μｇに対して、２００単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩを加えて、５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉ
ｓ）−）ＩＣＱ （ｐＨ７，４）、 １０ ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ４，１００ｍＭ ＮａＣＱを含む緩衝液１００μΩ
中で、３７℃にて２時間反応させた。
そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるよう
に加えて、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０
’Ｃで３時間保持した後、 １２０００ ｒｐｍ（８９
００ｇ ）で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈澱を回収
し、これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量に対して、６
単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加えて、１０ ｍＭトリス
（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ
Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＭ ＮａＣＱ、 １ ｎ＋Ｍジチ
オトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）の
緩衝液ＩＱＯμＱ中で、３７℃にて、１時間反応させた
。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１： １
、 ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後。
に加えて、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０
’Ｃで３時間保持した後、 １２０００ ｒｐｍ（８９
００ｇ ）で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈澱を回収
し、これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量に対して、６
単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加えて、１０ ｍＭトリス
（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ
Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＭ ＮａＣＱ、 １ ｎ＋Ｍジチ
オトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）の
緩衝液ＩＱＯμＱ中で、３７℃にて、１時間反応させた
。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１： １
、 ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後。
水層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加して攪
拌の後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終
濃度３００ｍＭになるように加え、次に２倍容のエタノ
ールを添加して、−３０℃で３時間保持した後、１２０
００ ｒｐｍ（８９００ｇ ）で室温で１０分間遠心分
離してＤＮＡの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した。こ
れを１００μＱのＴＥ緩衝液に溶かした後、このＤＮＡ
断片混合液より、前記実施例１工程（７）と実質的に同
様の方法を用いて、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約３．１キ
ロベースのＤＮＡ断片を、約０．５μｇ取得した。
拌の後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終
濃度３００ｍＭになるように加え、次に２倍容のエタノ
ールを添加して、−３０℃で３時間保持した後、１２０
００ ｒｐｍ（８９００ｇ ）で室温で１０分間遠心分
離してＤＮＡの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した。こ
れを１００μＱのＴＥ緩衝液に溶かした後、このＤＮＡ
断片混合液より、前記実施例１工程（７）と実質的に同
様の方法を用いて、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約３．１キ
ロベースのＤＮＡ断片を、約０．５μｇ取得した。
（以下余白）
（１０） Ｇ Ｄ Ｈ産生遺伝子を含む約３．２キロベ
ースのＤＮＡ断片の分離。
ースのＤＮＡ断片の分離。
前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ１
０３のＤＮＡ２０μｇに対して１００単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ 、 Ｘｂａ Ｉを加えて、５０ｍ）４ トリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ Ｍ
ｇ５Ｏ，、１００ｍＭ ＮａＣ１の緩衝液１００μΩ中
で、３７℃にて２時間反応させた。消化した試料は、前
記実施例１工程（７）と実質的に同様の方法により、１
％アガロースゲル電気泳動に供し、約３．２キロベース
のＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロースゲ
ルを切り出した。切り出したアガロースゲルより、前記
実施例１工程（７）と実質的に同様の方法によりＤＮＡ
を抽出した。その結果、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約３．
２キロベースのＤＮＡ断片を約２μｇ取得した。
０３のＤＮＡ２０μｇに対して１００単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ 、 Ｘｂａ Ｉを加えて、５０ｍ）４ トリ
ス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ Ｍ
ｇ５Ｏ，、１００ｍＭ ＮａＣ１の緩衝液１００μΩ中
で、３７℃にて２時間反応させた。消化した試料は、前
記実施例１工程（７）と実質的に同様の方法により、１
％アガロースゲル電気泳動に供し、約３．２キロベース
のＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロースゲ
ルを切り出した。切り出したアガロースゲルより、前記
実施例１工程（７）と実質的に同様の方法によりＤＮＡ
を抽出した。その結果、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約３．
２キロベースのＤＮＡ断片を約２μｇ取得した。
（１１）ＧＤＨ産生遺伝子を含む約３．５キロベースの
ＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製した□プラスミドｐＡＧ
１０３のＤＮＡ ２０μｇに対して１００単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩ 、 Ｘｈｏ Ｉを加えて、５０ｍＭト
リス（Ｔｒｉｓ）−ＭＣＩ（ｐＨ７、４）、１０ ＩＭ
Ｍｇ５ｏ、、 １００ ｍＭＮａＣｌの緩衝液１０
０μ１２中で、３７℃にて２時間反応させた。消化した
試料は、前記実施例１工程（７）と実質的に同様の方法
により、アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５キロ
ベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロ
ースゲルを切り出した。切り出したアガロースゲルより
、前記実施例１工程（７）と実質的に同様の方法により
ＤＮＡを抽出した。その結果、ＧＤＨ産生遺伝子を含む
約３．５キロベースのＤＮＡ断片を約３μｇ取得した。
ＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製した□プラスミドｐＡＧ
１０３のＤＮＡ ２０μｇに対して１００単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩ 、 Ｘｈｏ Ｉを加えて、５０ｍＭト
リス（Ｔｒｉｓ）−ＭＣＩ（ｐＨ７、４）、１０ ＩＭ
Ｍｇ５ｏ、、 １００ ｍＭＮａＣｌの緩衝液１０
０μ１２中で、３７℃にて２時間反応させた。消化した
試料は、前記実施例１工程（７）と実質的に同様の方法
により、アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５キロ
ベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近のアガロ
ースゲルを切り出した。切り出したアガロースゲルより
、前記実施例１工程（７）と実質的に同様の方法により
ＤＮＡを抽出した。その結果、ＧＤＨ産生遺伝子を含む
約３．５キロベースのＤＮＡ断片を約３μｇ取得した。
（１２） Ｇ Ｄ Ｈ産生遺伝子を含む約４．５キロベ
ースのＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ１
０３ノＤＮＡ ４０ ｐ ｇニ対シテ、１００単位の制
限酵素ＢｇＱＵを加えて、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）
−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，１
ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ）を含む緩衝液１００μＱ中で、３７℃にて４時間反
応させた。次に得られた反応液に酢酸ナトリウムを最終
濃度３００ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタ
ノールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３時間保持した
。その後、１２０００ｒｐｍ（８９００ｇ ） テ室温
１’ｉｏ分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し、減圧
乾燥した。このＤＮＡ全量に対して、１００単位の制限
酵素にＥｃｏＲＩを加えて、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉ
ｓ）−ＨＣＩ （ｐＨ７，４）、１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，
、１００ｍＭ ＮａＣ１を含む緩衝液１００μα中で、
３７℃にて４時間反応させた。
ースのＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ１
０３ノＤＮＡ ４０ ｐ ｇニ対シテ、１００単位の制
限酵素ＢｇＱＵを加えて、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）
−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，１
ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ）を含む緩衝液１００μＱ中で、３７℃にて４時間反
応させた。次に得られた反応液に酢酸ナトリウムを最終
濃度３００ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタ
ノールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３時間保持した
。その後、１２０００ｒｐｍ（８９００ｇ ） テ室温
１’ｉｏ分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し、減圧
乾燥した。このＤＮＡ全量に対して、１００単位の制限
酵素にＥｃｏＲＩを加えて、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉ
ｓ）−ＨＣＩ （ｐＨ７，４）、１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，
、１００ｍＭ ＮａＣ１を含む緩衝液１００μα中で、
３７℃にて４時間反応させた。
消化した試料は、前記実施例１工程（７）と実質的に同
様の方法により、アガロースゲル電気泳動に供し、約２
．９キロベースと約１．６キロベースのＤＮＡ断片の存
在をそれぞれ確認し、ＤＮＡ断片を含んだアガロースゲ
ルをそれぞれ切り出した。
様の方法により、アガロースゲル電気泳動に供し、約２
．９キロベースと約１．６キロベースのＤＮＡ断片の存
在をそれぞれ確認し、ＤＮＡ断片を含んだアガロースゲ
ルをそれぞれ切り出した。
切り出したアガロースゲルより、前記実施例１工程（７
）と実質的に同様の方法によりＤＮＡを、それぞれ抽出
した。その結果、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約４．５キロ
ベースのＤＮＡ断片を、約２．９キロベースのＤＮＡ断
片と約１．６キロベースのＤＮＡ断片として、それぞれ
約２μｇと約１μｇ取得した。
）と実質的に同様の方法によりＤＮＡを、それぞれ抽出
した。その結果、ＧＤＨ産生遺伝子を含む約４．５キロ
ベースのＤＮＡ断片を、約２．９キロベースのＤＮＡ断
片と約１．６キロベースのＤＮＡ断片として、それぞれ
約２μｇと約１μｇ取得した。
実施例２
本実施例では、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来の
ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を、該細菌のベクタ
ーに組込んで組換え体ＤＮＡを得。
ＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を、該細菌のベクタ
ーに組込んで組換え体ＤＮＡを得。
得られた組換え体ＤＮＡを大量に産生できる形質転換体
を作成した。グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧ
ＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、前記実施例
］、工程（７）で調製したＧＤＨ産生遺伝子を含む約５
．４キロベースのＥｃｏＲＩ断片を使用した。グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌のベクタープラスミドとしては
、プラスミドｐＡＧ５０を使用した。プラスミド ＰＡ
Ｇ５０は、該細菌のプラスミドｐＡＧ１及びＰＡＧ３よ
り、後述する方法により作成されたベクタープラスミド
である。プラスミドｐＡＧ１は、コリネバクテリム・メ
ラセコラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４３ （微工研条寄第５６０
号）より分離されたテトラサイクリン耐性プラスミドで
ある。プラスミドρＡＧ３は、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ（＄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｌ１ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
２２２２０ （微工研条寄第５５９号）より分離された
クリプテイックプラスミドである。
を作成した。グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧ
ＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、前記実施例
］、工程（７）で調製したＧＤＨ産生遺伝子を含む約５
．４キロベースのＥｃｏＲＩ断片を使用した。グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌のベクタープラスミドとしては
、プラスミドｐＡＧ５０を使用した。プラスミド ＰＡ
Ｇ５０は、該細菌のプラスミドｐＡＧ１及びＰＡＧ３よ
り、後述する方法により作成されたベクタープラスミド
である。プラスミドｐＡＧ１は、コリネバクテリム・メ
ラセコラ（Ｃｏｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４３ （微工研条寄第５６０
号）より分離されたテトラサイクリン耐性プラスミドで
ある。プラスミドρＡＧ３は、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ（＄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｌ１ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
２２２２０ （微工研条寄第５５９号）より分離された
クリプテイックプラスミドである。
（１）プラスミドＰＡＧ５０の作成と該プラスミド保有
コリネバクテリウム・メラセコラ（並■ｎａｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （ｐＡＧ
５０）からの該プラスミドの分離 プラスミドｐＡＧ５０は、次の方法で作成した。先ずプ
ラスミドρＡＧＩを縮小化してプラスミドｐＡＧ１４を
作成し、該プラスミドよりテトラサイクリン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片を分離した。次に該ＤＮＡ断片をプラ
スミドｐ、ＡＧ３に組込んでプラスミドＰＡＧ５０を作
成した。以下、上述の操作について詳細に説明する。
コリネバクテリウム・メラセコラ（並■ｎａｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （ｐＡＧ
５０）からの該プラスミドの分離 プラスミドｐＡＧ５０は、次の方法で作成した。先ずプ
ラスミドρＡＧＩを縮小化してプラスミドｐＡＧ１４を
作成し、該プラスミドよりテトラサイクリン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片を分離した。次に該ＤＮＡ断片をプラ
スミドｐ、ＡＧ３に組込んでプラスミドＰＡＧ５０を作
成した。以下、上述の操作について詳細に説明する。
■コリネバクテリウム・メラセコラ（７ｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４３ （微工研条寄
第５６０号）菌体からのプラスミドＰＡＧＩの分離上記
菌株を、半合成培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、尿素
３ ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、 ＮａＣ０５０ｍｇ、Ｍ
ｇＳＯ４−７Ｈ２０４００■、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ，
０２ｍｇ、ＦｅＳＯ４・４−６Ｈ２０２■、グルコース
２０ ｇ、ビオチン５０μｇ、チア°ミン塩酸塩２００
μｇ、酵母エキス１ｇを純水に溶かしてＩＱとし、ｐＨ
７，２に調整した培地〕で、３２℃、１晩振盪培養し、
得られた培養液８ｍＱを２００ｍＱの前記半合成培地に
移植して、３２℃で５時間振盪培養した。
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４３ （微工研条寄
第５６０号）菌体からのプラスミドＰＡＧＩの分離上記
菌株を、半合成培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、尿素
３ ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、 ＮａＣ０５０ｍｇ、Ｍ
ｇＳＯ４−７Ｈ２０４００■、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ，
０２ｍｇ、ＦｅＳＯ４・４−６Ｈ２０２■、グルコース
２０ ｇ、ビオチン５０μｇ、チア°ミン塩酸塩２００
μｇ、酵母エキス１ｇを純水に溶かしてＩＱとし、ｐＨ
７，２に調整した培地〕で、３２℃、１晩振盪培養し、
得られた培養液８ｍＱを２００ｍＱの前記半合成培地に
移植して、３２℃で５時間振盪培養した。
培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液〔５０ｍＨグル
コース、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２５ ｍＭ トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ （ｈｙ
ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｒ＋
Ｑ：Ｔｒｉｓ〕、１０［８ｇ／ＩＩＩＱリゾチウム（シ
グマ社、米国より購入）、ｐＨ８，０）１０ ｒｎＱに
懸濁し４２℃で１時間反応させた。本反応液にアルカリ
−ドデシル硫酸ナト１ノウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅ
ｃｙｌ−ｓｕｌｆｔｅ以下ＳＤＳと略す）液（０，２Ｎ
Ｎａ０ｔ（，１％（ｗ／ｖ） ５Ｏ３３２０ｍＱを添
加攪拌の後、水中に５分装置いた。次に本反応液に、氷
冷した酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム水溶液６０
ｍＱ、酢酸１１．５ｒａＱ、純水２８．５ｍＱの混合液
）１５ｍＱを添加攪拌の後、水中に１０分分間−て溶菌
物を得た。溶菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５分間
、１２．０００ ｒｐｍ（１３０００ｇ）の遠心分離を
行い、上澄液を回収した。
コース、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２５ ｍＭ トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ （ｈｙ
ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｒ＋
Ｑ：Ｔｒｉｓ〕、１０［８ｇ／ＩＩＩＱリゾチウム（シ
グマ社、米国より購入）、ｐＨ８，０）１０ ｒｎＱに
懸濁し４２℃で１時間反応させた。本反応液にアルカリ
−ドデシル硫酸ナト１ノウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅ
ｃｙｌ−ｓｕｌｆｔｅ以下ＳＤＳと略す）液（０，２Ｎ
Ｎａ０ｔ（，１％（ｗ／ｖ） ５Ｏ３３２０ｍＱを添
加攪拌の後、水中に５分装置いた。次に本反応液に、氷
冷した酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム水溶液６０
ｍＱ、酢酸１１．５ｒａＱ、純水２８．５ｍＱの混合液
）１５ｍＱを添加攪拌の後、水中に１０分分間−て溶菌
物を得た。溶菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５分間
、１２．０００ ｒｐｍ（１３０００ｇ）の遠心分離を
行い、上澄液を回収した。
これを等容のフェノール・クロロホルム液（１：１）で
抽出して水層を回収した。これに２倍容のエタノールを
添加攪拌して、５分間室温に置き、２０℃で１０分間、
１０，０００ ｒｐｍ（１１，０００ｇ）の遠心分離を
行い沈殿を得た。得られた沈殿を、７０％（ｖ／ｖ）エ
タノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、ＴＥ緩衝液［
１０ｍＭ トリス、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐ＋１７．
５）２０ｍＱ中に溶解した。この液に、１０ｍｇ／＋＋
＋Ｑエチジウムブロマイド水溶液１．２ ｍｇと塩化セ
シウム２３゜６ｇとを加えて静かに溶解し、４０，００
０ ｒｐｍ（１００，０００ｇ）１５℃で４８時間遠心
分離した。紫外線照射により遠心チューブ中、２本のバ
ンドが見出され、下方のバンドを遠心チューブの側壁か
ら注射器で抜き取ることにより、プラスミドρＡＧＩを
得た。次いでこの分画液を等容量のイソプロピルアルコ
ールで４回抽出した。抽出物からエチジウムブロマイド
を除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮ
Ａ濃度５０／ｊｇ／ｍ１２のプラスミドｐＡＧ１の透析
完了液１ｍＱを得た。
抽出して水層を回収した。これに２倍容のエタノールを
添加攪拌して、５分間室温に置き、２０℃で１０分間、
１０，０００ ｒｐｍ（１１，０００ｇ）の遠心分離を
行い沈殿を得た。得られた沈殿を、７０％（ｖ／ｖ）エ
タノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、ＴＥ緩衝液［
１０ｍＭ トリス、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐ＋１７．
５）２０ｍＱ中に溶解した。この液に、１０ｍｇ／＋＋
＋Ｑエチジウムブロマイド水溶液１．２ ｍｇと塩化セ
シウム２３゜６ｇとを加えて静かに溶解し、４０，００
０ ｒｐｍ（１００，０００ｇ）１５℃で４８時間遠心
分離した。紫外線照射により遠心チューブ中、２本のバ
ンドが見出され、下方のバンドを遠心チューブの側壁か
ら注射器で抜き取ることにより、プラスミドρＡＧＩを
得た。次いでこの分画液を等容量のイソプロピルアルコ
ールで４回抽出した。抽出物からエチジウムブロマイド
を除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮ
Ａ濃度５０／ｊｇ／ｍ１２のプラスミドｐＡＧ１の透析
完了液１ｍＱを得た。
■プラスミドｐＡＧ１の試験管内ＤＮＡ組換え。
前記実施例２工程（１）−ので調製したプラスミドＰＡ
ＧＩのＤＮＡ０．５μｇに対して１０単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩを加え、５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−Ｈ
ＣＱ （ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１０
０ｍＭ ＮａＣＱの緩衝液４０μΩ中で、３７℃にて２
時間反応させた。その後７０℃で１０分間加熱して反応
を停止させた。この反応液２０μＱと３単位のＴ４ファ
ージＤＮＡリガーゼにッポンジーン社より購入）とを、
５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐ）１７．
４）、１０ ｍＭ ＭｇＣＱ ２．１０ ｍＭジチオト
レイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ ｍ
Ｍスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｓ）、１ ｍＭ
ＡＴＰ、 ０．１ｍｇ／＋ａＱＢＳＡ（ベセスダリチー
チラボラトジー社、米国より購入）の緩衝液５０μＱ中
で１５℃にて１晩反応させた。
ＧＩのＤＮＡ０．５μｇに対して１０単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩを加え、５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−Ｈ
ＣＱ （ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１０
０ｍＭ ＮａＣＱの緩衝液４０μΩ中で、３７℃にて２
時間反応させた。その後７０℃で１０分間加熱して反応
を停止させた。この反応液２０μＱと３単位のＴ４ファ
ージＤＮＡリガーゼにッポンジーン社より購入）とを、
５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐ）１７．
４）、１０ ｍＭ ＭｇＣＱ ２．１０ ｍＭジチオト
レイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ ｍ
Ｍスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｓ）、１ ｍＭ
ＡＴＰ、 ０．１ｍｇ／＋ａＱＢＳＡ（ベセスダリチー
チラボラトジー社、米国より購入）の緩衝液５０μＱ中
で１５℃にて１晩反応させた。
（以下余白）
■プラスミドｐＡＧ１４の取得
（プラスミドのキユアリング）
コリネバクテリウム・メラセコラ（並■ｎｅｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４３
（微工研条寄第５６０号）をＬＧ培地（トリプトンＬｏ
ｇ、酵母エキス５ ｇ、 ＮａＣＱ ５ ｇ、グルコー
ス２ｇを純水に溶かしてＩＱとし、ｐＨ７，２に調整し
た培地）５ｍＱに一白金耳植菌して、３７℃で１晩振盪
培養した。
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４３
（微工研条寄第５６０号）をＬＧ培地（トリプトンＬｏ
ｇ、酵母エキス５ ｇ、 ＮａＣＱ ５ ｇ、グルコー
ス２ｇを純水に溶かしてＩＱとし、ｐＨ７，２に調整し
た培地）５ｍＱに一白金耳植菌して、３７℃で１晩振盪
培養した。
この培養液を無菌水で希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地
に１．５重量％の寒天を添加した培地）に塗布し、３２
℃で２日間培養した。生じたコロニー１００個を取り、
テトラサイクリン１０ μｇ／ｍＱを含有するＬＧ寒天
培地に釣菌した。３２℃で２日間培養して２株のテトラ
サイクリン感受性株を選択した。得られた２株のテトラ
サイクリン感受性株について、前記と同様なプラスミド
の単離法によりプラスミドＰＡＧＩの存在を調べた。そ
の結果得られた２株のテトラサイクリン感受性株は、い
ずれもプラスミドを保持していないプラスミドキュアー
ト（Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｕｒｅｄ）株であった。これら
の−方の株を以後の形質転換実験の宿主として用いた。
に１．５重量％の寒天を添加した培地）に塗布し、３２
℃で２日間培養した。生じたコロニー１００個を取り、
テトラサイクリン１０ μｇ／ｍＱを含有するＬＧ寒天
培地に釣菌した。３２℃で２日間培養して２株のテトラ
サイクリン感受性株を選択した。得られた２株のテトラ
サイクリン感受性株について、前記と同様なプラスミド
の単離法によりプラスミドＰＡＧＩの存在を調べた。そ
の結果得られた２株のテトラサイクリン感受性株は、い
ずれもプラスミドを保持していないプラスミドキュアー
ト（Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｕｒｅｄ）株であった。これら
の−方の株を以後の形質転換実験の宿主として用いた。
（形質転換）
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
−ｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４
３ （微工研条寄第５６０号）より前記の操作で分離し
たプラスミドキュアート株を、前記半合成培地で３２℃
、１２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍＭを同じ半
合成培地５０ ｍρに植菌して３２℃で振盪培養した。
−ｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２４
３ （微工研条寄第５６０号）より前記の操作で分離し
たプラスミドキュアート株を、前記半合成培地で３２℃
、１２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍＭを同じ半
合成培地５０ ｍρに植菌して３２℃で振盪培養した。
日立製作所製分光光度計（２２８型）で波長６６０ｎｍ
における吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０゜２になっ
た時点で培養液にペニシリンＧを０．３単位／ｍＱの濃
度になるように添加した。添加後頁に３２℃で１．５時
間培養を続けた。
における吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０゜２になっ
た時点で培養液にペニシリンＧを０．３単位／ｍＱの濃
度になるように添加した。添加後頁に３２℃で１．５時
間培養を続けた。
その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ、カザ
ミノ酸１０ ｇ、酵母エキス１０ ｇ 、 Ｋ２ＨＰ
０４０．３５ ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４０，１５ｇ、シュー
クロース１．３７ ｇ、Ｎ−１〜リス（ハイドロキシメ
チル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔ Ｅ
Ｓ ： Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｍｅｔｈｙｌ
）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）５．７３ ｇ、 ＭｇＣ（１２０，
９５ｇ、 ＣａＣＱ、 １．１１ ｇを純水に溶かして
ＩＱとし、ＮａＯＨでＰＩ（７，２に調整した培地〕５
ｍＱに懸濁した。この菌濡濁液４．５ｒｒ＋Ｑに、３ｍ
ｇ／ｍｎ濃度のりゾチウムを含有するＲ培地（ミリポア
フィルタ−で除菌した）０．５ｍＭを添加して、３５℃
で５時間静置し反応させてプロトプラスト化細胞を得た
。反応混合物を７．００Ｏｒｐｍ（４５００Ｋ）で５℃
で７分間遠心分離してプロトプラスト化した細胞を回収
し、Ｒ培地５爪Ωに懸濁した。同様の操作を更にもう一
度行った後、Ｒ培地５＋ｎＱに再懸濁してプロトプラス
ト懸濁液とした。
ミノ酸１０ ｇ、酵母エキス１０ ｇ 、 Ｋ２ＨＰ
０４０．３５ ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４０，１５ｇ、シュー
クロース１．３７ ｇ、Ｎ−１〜リス（ハイドロキシメ
チル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔ Ｅ
Ｓ ： Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｍｅｔｈｙｌ
）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）５．７３ ｇ、 ＭｇＣ（１２０，
９５ｇ、 ＣａＣＱ、 １．１１ ｇを純水に溶かして
ＩＱとし、ＮａＯＨでＰＩ（７，２に調整した培地〕５
ｍＱに懸濁した。この菌濡濁液４．５ｒｒ＋Ｑに、３ｍ
ｇ／ｍｎ濃度のりゾチウムを含有するＲ培地（ミリポア
フィルタ−で除菌した）０．５ｍＭを添加して、３５℃
で５時間静置し反応させてプロトプラスト化細胞を得た
。反応混合物を７．００Ｏｒｐｍ（４５００Ｋ）で５℃
で７分間遠心分離してプロトプラスト化した細胞を回収
し、Ｒ培地５爪Ωに懸濁した。同様の操作を更にもう一
度行った後、Ｒ培地５＋ｎＱに再懸濁してプロトプラス
ト懸濁液とした。
前記実施例２工程（１）−■で得られたりガーゼ反応液
５０ μＱと２倍濃度ＴＳＭＣ液（７３ＭＣ液は、ＴＥ
Ｓ２５ ＩＩＮ、シュークロース０．４Ｍ、ＭｇＣＱ、
１０ ｍＭ、ＣａＣＱ２３０ｆｌ１Ｍを含み、ＮａＯ
ＨでｐＨ７，２に調整した水溶液である）５０μＱとの
混合液を上記プロトプラスト懸濁液０．５ ｍΩに添加
混合した。その後頁にＰＥＧ液（７３ＭＣ液にポリエチ
レングリコール６．０００（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｇｌｙｃｏｌ ６０００）を４０％（ｗ／ｖ）濃度に
溶解する３１．５ｍＭを添加してゆるやかに混和し、２
分間室温で静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポ
リビニルピロリドン（Ｐ Ｖ Ｐ ： Ｐｏ１ｙ−ｖｉ
ｎｙｌ ｐｙｒｒｏＬｉｄｏｎｅ）４０ ｇ／ Ｑを添
加する）５ｍＭを添加して、４．００Ｏｒｐｍ（１８０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離して上澄液を除去した
。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう一度行いプ
ロトプラストを沈殿として得た。得られたプロトプラス
トを０．５ｍＭのＲ−ＰＶＰ液にゆるやかに懸濁した。
５０ μＱと２倍濃度ＴＳＭＣ液（７３ＭＣ液は、ＴＥ
Ｓ２５ ＩＩＮ、シュークロース０．４Ｍ、ＭｇＣＱ、
１０ ｍＭ、ＣａＣＱ２３０ｆｌ１Ｍを含み、ＮａＯ
ＨでｐＨ７，２に調整した水溶液である）５０μＱとの
混合液を上記プロトプラスト懸濁液０．５ ｍΩに添加
混合した。その後頁にＰＥＧ液（７３ＭＣ液にポリエチ
レングリコール６．０００（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｇｌｙｃｏｌ ６０００）を４０％（ｗ／ｖ）濃度に
溶解する３１．５ｍＭを添加してゆるやかに混和し、２
分間室温で静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポ
リビニルピロリドン（Ｐ Ｖ Ｐ ： Ｐｏ１ｙ−ｖｉ
ｎｙｌ ｐｙｒｒｏＬｉｄｏｎｅ）４０ ｇ／ Ｑを添
加する）５ｍＭを添加して、４．００Ｏｒｐｍ（１８０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離して上澄液を除去した
。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう一度行いプ
ロトプラストを沈殿として得た。得られたプロトプラス
トを０．５ｍＭのＲ−ＰＶＰ液にゆるやかに懸濁した。
得られた懸濁液を３時間、３０’Ｃに保った後、Ｒ−ｐ
ｖｐ液で希釈し、希釈懸濁液を得た。一定量の希釈懸濁
液をテトラサイタリン１０μｇ／ｍ（ｌ濃度を含む再生
培地に植菌した。再生培地はＲ培地ニＰＶＰ ４０ ｇ
／ｉｌｌ、寒天１５ｇ／Ｑを添加シテ得られる下層寒天
培地と、その上に重層された、ＰｖＰ４０ｇＩＱ、寒天
６ｇＩＱを添加して得られる上層寒天培地とからなる重
層寒天培地である。植苗はプロトプラスト懸濁液を溶け
た上層寒天培地３ｍＱと混合して、下層寒天培地上に重
層することにより行なった。植菌した再生培地を３２℃
で４日間培養してテトラサイクリン耐性形質転換株を得
た。
ｖｐ液で希釈し、希釈懸濁液を得た。一定量の希釈懸濁
液をテトラサイタリン１０μｇ／ｍ（ｌ濃度を含む再生
培地に植菌した。再生培地はＲ培地ニＰＶＰ ４０ ｇ
／ｉｌｌ、寒天１５ｇ／Ｑを添加シテ得られる下層寒天
培地と、その上に重層された、ＰｖＰ４０ｇＩＱ、寒天
６ｇＩＱを添加して得られる上層寒天培地とからなる重
層寒天培地である。植苗はプロトプラスト懸濁液を溶け
た上層寒天培地３ｍＱと混合して、下層寒天培地上に重
層することにより行なった。植菌した再生培地を３２℃
で４日間培養してテトラサイクリン耐性形質転換株を得
た。
出現したテトラサイクリン耐性形質転換株から任意に１
０株を選び、テトラサイクリン１ｏμｇ／ｍＱ濃度を含
むＬＧ寒天培地上で純化した後、実施例１工程（１）で
プラスミドρＡＧＩを分離した方法と実質的に同様の方
法により、各菌株からプラスミドを分離した。各プラス
ミドＤＮＡ０．５μｇに対して前記実施例１工程（６）
の方法により、各プラスミド中の制限酵素切断部位を決
定した。その結果、プラスミドｐＡＧ１４を取得した。
０株を選び、テトラサイクリン１ｏμｇ／ｍＱ濃度を含
むＬＧ寒天培地上で純化した後、実施例１工程（１）で
プラスミドρＡＧＩを分離した方法と実質的に同様の方
法により、各菌株からプラスミドを分離した。各プラス
ミドＤＮＡ０．５μｇに対して前記実施例１工程（６）
の方法により、各プラスミド中の制限酵素切断部位を決
定した。その結果、プラスミドｐＡＧ１４を取得した。
このプラスミドＤＮＡを用いて、前記と実質的に同様な
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｓｒｉｃ＋ｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
２２２４３ （微工研条寄第５６０号）のプラスミドキ
ュアート株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性株について、それらが保有するプラスミドを解析し
た結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比べ
て、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｓｒｉｃ＋ｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
２２２４３ （微工研条寄第５６０号）のプラスミドキ
ュアート株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性株について、それらが保有するプラスミドを解析し
た結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比べ
て、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。
■プラスミドＰＡＧ１４からのテトラサイクリン耐性遺
伝子を含むＤＮＡ断片の分離 前記実施例２工程（１）−〇で調製したプラスミドｐＡ
Ｇ１４のＤＮＡ２０μｇに対して、１００単位の制限酵
素ＢａｍＨＩ 、 Ｂｇｌ■をそれぞれ加えて、 １０
ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４）
、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＭＮａＣＱ、１ ｍ
Ｍジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ）の緩衝液１００ｍｕ中で、３７℃にて２時間反応さ
せた。消化した試料は、前記実施例１工程（６）の方法
により、１％アガロースゲル電気泳動に供した。ただし
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米国より購入
したＬＭＰ アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）を使用し
、４℃で電気泳動した。
伝子を含むＤＮＡ断片の分離 前記実施例２工程（１）−〇で調製したプラスミドｐＡ
Ｇ１４のＤＮＡ２０μｇに対して、１００単位の制限酵
素ＢａｍＨＩ 、 Ｂｇｌ■をそれぞれ加えて、 １０
ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４）
、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、５０ｍＭＮａＣＱ、１ ｍ
Ｍジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ）の緩衝液１００ｍｕ中で、３７℃にて２時間反応さ
せた。消化した試料は、前記実施例１工程（６）の方法
により、１％アガロースゲル電気泳動に供した。ただし
、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社、米国より購入
したＬＭＰ アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）を使用し
、４℃で電気泳動した。
次に、エチジウムブロマイドで染色したアガロースを紫
外線照射下に置き、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む
約３．１キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その
付近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガロ
ースにその重量の３倍量のＴＥＢ衝液を加えて、６５℃
で１０分間保持し、アガロースゲルを完全に溶かした。
外線照射下に置き、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む
約３．１キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その
付近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガロ
ースにその重量の３倍量のＴＥＢ衝液を加えて、６５℃
で１０分間保持し、アガロースゲルを完全に溶かした。
次に等容のフェノールを添加して、攪拌の後、水層を回
収した。得られた水層に等容のフェノール・クロロホル
ム（１： １）液を添加して、攪拌の後、水層を回収し
た。得られた水層に等容のクロロホルムを添加して、攪
拌の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリ
ウムを最終濃度３００ ｍＭになるように添加し、更に
２倍容のエタノールにて３時間保持した。その後、１０
，０００ ｒｐｍ（９，０００ｇ）で室温で１０分間遠
心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収し、得られた沈殿を減
圧乾燥した。
収した。得られた水層に等容のフェノール・クロロホル
ム（１： １）液を添加して、攪拌の後、水層を回収し
た。得られた水層に等容のクロロホルムを添加して、攪
拌の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリ
ウムを最終濃度３００ ｍＭになるように添加し、更に
２倍容のエタノールにて３時間保持した。その後、１０
，０００ ｒｐｍ（９，０００ｇ）で室温で１０分間遠
心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収し、得られた沈殿を減
圧乾燥した。
■プラスミドｐＡＧ３の調製と制限酵素ＢａｍＨＩ処理
前記実施例２工程（１）−■の方法により、コリネバク
テリウム・メラセコラ（並■朋α臣頃吐已ｍｅｌａｓｓ
ｅｃｏｌａ） ２２２２０ （微工研条寄第５５９号）
から分離精製したプラスミドｐＡＧ３のＤＮＡ４μｇに
対して、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加えて、１０
ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４
）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ ＮａＣＱ、ｌ
ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔ
ｏｌ）の緩衝液１００ｍｆｆ中で、３７℃にて２時間反
応させた。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１
： １）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に
等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収し
た。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００鱈になるよ
うに加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃にて３時間保持した後、１２．００Ｏｒｐｍ（８９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回
収し、これを減圧乾燥した。
テリウム・メラセコラ（並■朋α臣頃吐已ｍｅｌａｓｓ
ｅｃｏｌａ） ２２２２０ （微工研条寄第５５９号）
から分離精製したプラスミドｐＡＧ３のＤＮＡ４μｇに
対して、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加えて、１０
ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４
）、１０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ ＮａＣＱ、ｌ
ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔ
ｏｌ）の緩衝液１００ｍｆｆ中で、３７℃にて２時間反
応させた。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１
： １）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に
等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収し
た。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００鱈になるよ
うに加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃にて３時間保持した後、１２．００Ｏｒｐｍ（８９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回
収し、これを減圧乾燥した。
■プラスミドｐＡＧ５０の取得
前記実施例２工程（１）−■及び■で調製した夫々のＤ
ＮＡ全量と３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５
０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４
）、１０ ｍＭ ＭｇＣＱｚ、１０ ｍＭジチオトレイ
トール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ ｍＭス
ペルミジン（Ｓｐｅｒ−ｍｉｄｉｎｅ）、Ｌ ｍＭ Ａ
ＴＰ、０．１１１１ｇ／ＩＩＩ Ｑ ＢＳＡを含む緩衝
液５０μＱ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後７
０℃にて１０分間加熱して反応を停止させた。
ＮＡ全量と３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５
０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ７，４
）、１０ ｍＭ ＭｇＣＱｚ、１０ ｍＭジチオトレイ
トール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ ｍＭス
ペルミジン（Ｓｐｅｒ−ｍｉｄｉｎｅ）、Ｌ ｍＭ Ａ
ＴＰ、０．１１１１ｇ／ＩＩＩ Ｑ ＢＳＡを含む緩衝
液５０μＱ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後７
０℃にて１０分間加熱して反応を停止させた。
得られたりガーゼ反応液５０μＱを用いて、前記実施例
２工程（１）−〇と同じ形質転換操作によりコリネバク
テリウム・メラセコラ（販互朋ｂａｃｔｅｒｉ四ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微工研条寄第５５８号
）のテトラサイクリン耐性形質転換株を取得した。ただ
し、再生培地による培養は、７日間とした。得られたテ
トラサイクリン耐性形質転換株について、前記実施例２
工程（１）の方法により、各株の保有するプラスミドを
分離し、前記実施例１工程（６）の方法によりそれぞれ
のプラスミドを解析した。得られたプラスミドをｐＡＧ
５０と命名した。
２工程（１）−〇と同じ形質転換操作によりコリネバク
テリウム・メラセコラ（販互朋ｂａｃｔｅｒｉ四ｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微工研条寄第５５８号
）のテトラサイクリン耐性形質転換株を取得した。ただ
し、再生培地による培養は、７日間とした。得られたテ
トラサイクリン耐性形質転換株について、前記実施例２
工程（１）の方法により、各株の保有するプラスミドを
分離し、前記実施例１工程（６）の方法によりそれぞれ
のプラスミドを解析した。得られたプラスミドをｐＡＧ
５０と命名した。
このプラスミドＤＮＡを用いて、前記と実質的に同様の
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃａｒ ｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８
０１ （微工研条寄第５５８号）を形質転換してテトラ
サイクリン耐性形質転換体を得た。得られたテトラサイ
クリン耐性形質転換体について、それらが保有するプラ
スミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プ
ラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定される
プラスミドであった。
方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃａｒ ｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８
０１ （微工研条寄第５５８号）を形質転換してテトラ
サイクリン耐性形質転換体を得た。得られたテトラサイ
クリン耐性形質転換体について、それらが保有するプラ
スミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プ
ラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定される
プラスミドであった。
（２）プラスミドＰＡ０５にのＧＤＨ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の組込み 前記実施例２工程（１）−■で調製したプラスミドｐＡ
Ｇ５０のＤＮＡ ５ ｔｔｇに対して、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩを１５単位加えて、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−
ＨＣＱ （ｐＨ７゜４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１
００ｍＭ ＮａＣＱを含む緩衝液６０μΩ中で３７℃に
て２時間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱し
て、反応を停止させた。
ＤＮＡ断片の組込み 前記実施例２工程（１）−■で調製したプラスミドｐＡ
Ｇ５０のＤＮＡ ５ ｔｔｇに対して、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩを１５単位加えて、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−
ＨＣＱ （ｐＨ７゜４）、１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，、１
００ｍＭ ＮａＣＱを含む緩衝液６０μΩ中で３７℃に
て２時間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱し
て、反応を停止させた。
この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ ｍＭになる
様に加え、更に２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃にて３時間保持した。次に１２．０００ ｒｐｍ（８
゜９００ ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈
殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥した。得られた試
料をＢＡＰＴ緩衝液（５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）
−ＨＣＱ、ＰＨ８，４） ２００ ＩＱに溶解し、バク
チリアル・アルカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｉｒ
ａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓ−ｐｈａｔａｓｅ）
（宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５℃
にて３０分間反応させた。更に該酵素を１単位添加して
、６５℃にて３０分間反応させた。その後１反応液に等
容のＴＨＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合し
た後、 １２．００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分
間遠心分離して水層を回収し、更にもう１回同じ操作を
繰り返した。次に水層に等容のフェノール・クロロホル
ム（１：１、Ｖ／■）液を添加して混合した後、１２．
００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し、
水層を回収した。更に水層に等容のクロロホルムを添加
して攪拌したｉ。
様に加え、更に２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃にて３時間保持した。次に１２．０００ ｒｐｍ（８
゜９００ ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈
殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥した。得られた試
料をＢＡＰＴ緩衝液（５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）
−ＨＣＱ、ＰＨ８，４） ２００ ＩＱに溶解し、バク
チリアル・アルカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｉｒ
ａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓ−ｐｈａｔａｓｅ）
（宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５℃
にて３０分間反応させた。更に該酵素を１単位添加して
、６５℃にて３０分間反応させた。その後１反応液に等
容のＴＨＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、混合し
た後、 １２．００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分
間遠心分離して水層を回収し、更にもう１回同じ操作を
繰り返した。次に水層に等容のフェノール・クロロホル
ム（１：１、Ｖ／■）液を添加して混合した後、１２．
００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離し、
水層を回収した。更に水層に等容のクロロホルムを添加
して攪拌したｉ。
１２．０００ ｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分
間遠心分離し、水層を回収した。得られた水層に酢酸ナ
トリウムを最終濃度３００ ｍＭになる様に加え、２倍
容のエタノールを添加し攪拌した後、−３０℃にて３時
間保持した。その後、１２．０００ ｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収
した。これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と前記実施
例１工程（７）で調製したＤＮＡ １ μｇと３単位の
Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼにッポンジーン社より購入
）とを、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ
７，４）、１０ｍＭ ＭｇＣ１，、１０ｎ＋Ｍジチオト
レイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１
ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１ｍＭ
ＡＴＰ、０．１ ｍｇ／ｍ Ｑ ＢＳＡ（ベセスダリチ
ーチラボラトジー社、米国より購入）の緩衝液５０μΩ
中で、１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃にて
１０分間加熱することにより、反応を停止させた。
間遠心分離し、水層を回収した。得られた水層に酢酸ナ
トリウムを最終濃度３００ ｍＭになる様に加え、２倍
容のエタノールを添加し攪拌した後、−３０℃にて３時
間保持した。その後、１２．０００ ｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収
した。これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と前記実施
例１工程（７）で調製したＤＮＡ １ μｇと３単位の
Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼにッポンジーン社より購入
）とを、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ （ｐＨ
７，４）、１０ｍＭ ＭｇＣ１，、１０ｎ＋Ｍジチオト
レイトール（Ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１
ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１ｍＭ
ＡＴＰ、０．１ ｍｇ／ｍ Ｑ ＢＳＡ（ベセスダリチ
ーチラボラトジー社、米国より購入）の緩衝液５０μΩ
中で、１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃にて
１０分間加熱することにより、反応を停止させた。
（３）ＧＤＨ産生遺伝子を含有した複合プラスミドｐＡ
Ｇ１００１の取得 コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■ｎｅｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微
工研条寄第５５８号）を、前記半合成培地で３２℃、１
２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍＱを同じ半合成
培地５０１１ＩＱに植菌して３２℃で振盪培養した。日
立製作所製分光光度計（２２８型）で波長６６０ ｎｍ
における吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になっ
た時点で培養液にペニシリンＧを０．３単位／ＩＩＩＱ
の濃度になるように添加した。これを更に３２℃で１．
５時間培養を続けた。
Ｇ１００１の取得 コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■ｎｅｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （微
工研条寄第５５８号）を、前記半合成培地で３２℃、１
２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍＱを同じ半合成
培地５０１１ＩＱに植菌して３２℃で振盪培養した。日
立製作所製分光光度計（２２８型）で波長６６０ ｎｍ
における吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になっ
た時点で培養液にペニシリンＧを０．３単位／ＩＩＩＱ
の濃度になるように添加した。これを更に３２℃で１．
５時間培養を続けた。
その培養液より菌体を集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ
、カザミノ酸１０ ｇ、酵母エキス１０ ｇ、Ｋ、１（
ＰＯ４０，３５ｇ、 ＫＨ，ＰＯ４０，１５ｇ、シュー
クロース１．３７ｇ、Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル
）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ：Ｎ−
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ
−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａ
ｃｉｄ） ５．７３ ｇ、 ＭｇＣｎ２０．９５ ｇ、
ＣａＣＱ２１．１１ ｇを純水に溶かしてＩＱとし、
ＮａＯＨでＰＨ７，２に調整した培地）５ｍΩに懸濁し
た。この菌懸濁液４．５ｍＱに、３ ｍｇ／ｍＱ濃度の
りゾチウムを含有するＲ培地（ミリポアフィルタ−で除
菌した）０．５１１ＩＱを添加して、３５℃で５時間静
置反応させてプロトプラスト化細胞を得た。反応混合物
を７．００Ｏｒｐｍ（４，５００ｇ）、５℃で７分間遠
心分離してプロトプラスト化した細胞を回収し、Ｒ培地
５＋ｍＱに懸濁した。同様の操作を更にもう一度行った
後、Ｒ培地５ロΩに再懸濁してプロトプラスト菌懸濁液
とした。
、カザミノ酸１０ ｇ、酵母エキス１０ ｇ、Ｋ、１（
ＰＯ４０，３５ｇ、 ＫＨ，ＰＯ４０，１５ｇ、シュー
クロース１．３７ｇ、Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル
）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ：Ｎ−
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ
−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎ−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａ
ｃｉｄ） ５．７３ ｇ、 ＭｇＣｎ２０．９５ ｇ、
ＣａＣＱ２１．１１ ｇを純水に溶かしてＩＱとし、
ＮａＯＨでＰＨ７，２に調整した培地）５ｍΩに懸濁し
た。この菌懸濁液４．５ｍＱに、３ ｍｇ／ｍＱ濃度の
りゾチウムを含有するＲ培地（ミリポアフィルタ−で除
菌した）０．５１１ＩＱを添加して、３５℃で５時間静
置反応させてプロトプラスト化細胞を得た。反応混合物
を７．００Ｏｒｐｍ（４，５００ｇ）、５℃で７分間遠
心分離してプロトプラスト化した細胞を回収し、Ｒ培地
５＋ｍＱに懸濁した。同様の操作を更にもう一度行った
後、Ｒ培地５ロΩに再懸濁してプロトプラスト菌懸濁液
とした。
前記実施例２工程（２）で得られたりガーゼ反応液５０
μＱと前述の２倍濃度ＴＳＭＣ液５０μＱとの混合液を
上記プロトプラスト菌懸濁液０．５＋＋＋Ｑに添加混合
した。その後頁に前述のＰＥＧ液１．５ｍＡを添加して
ゆるやかに混和し、２分間室温で静置した。その後Ｒ−
ＰＶＰ液５ＩｌＩＱを添加して、４，０００ ｒｐｍ
（１８００ｇ）で１０分間遠心分離して上澄液を除去し
た。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう一度行っ
た後、沈降したプロトプラストを０．５ｍ１２のＲ−Ｐ
ＶＰ液でゆるやかに懸濁した。
μＱと前述の２倍濃度ＴＳＭＣ液５０μＱとの混合液を
上記プロトプラスト菌懸濁液０．５＋＋＋Ｑに添加混合
した。その後頁に前述のＰＥＧ液１．５ｍＡを添加して
ゆるやかに混和し、２分間室温で静置した。その後Ｒ−
ＰＶＰ液５ＩｌＩＱを添加して、４，０００ ｒｐｍ
（１８００ｇ）で１０分間遠心分離して上澄液を除去し
た。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう一度行っ
た後、沈降したプロトプラストを０．５ｍ１２のＲ−Ｐ
ＶＰ液でゆるやかに懸濁した。
３時間、３０℃に保った後、Ｒ−ＰＶＰ液で希釈し、そ
の一定量をテトラサイクリン１０μｇ／ｍＱ濃度を含む
前述の再生培地の溶けた上層寒天培地３ｍｆｆと混合し
て、下層寒天培地上に重層し、３２℃で７日間培養した
。
の一定量をテトラサイクリン１０μｇ／ｍＱ濃度を含む
前述の再生培地の溶けた上層寒天培地３ｍｆｆと混合し
て、下層寒天培地上に重層し、３２℃で７日間培養した
。
得られたテトラサイクリン耐性形質転換体を、テトラサ
イクリン１ｏμｇ／ｌｌｌＩ２を含むＬＧ寒天培地（Ｌ
−寒天培地にグルコース５ｇＩＱを添加した培地）上で
純化した後、各菌株から前記実施例２工程（１）−■の
方法により、プラスミドを分離し、前記実施例１工程（
６）の方法によりそれらのプラスミドを解析した。得ら
れたプラスミドをプラスミドｐＡＧ１００１と命名した
。プラスミドｐＡＧ１００１は、第７図に示した様に、
プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に
、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧＤＨ産生遺
伝子を含む約５゜４キロベースのＤＮＡ断片が組込まれ
た複合プラスミドである。
イクリン１ｏμｇ／ｌｌｌＩ２を含むＬＧ寒天培地（Ｌ
−寒天培地にグルコース５ｇＩＱを添加した培地）上で
純化した後、各菌株から前記実施例２工程（１）−■の
方法により、プラスミドを分離し、前記実施例１工程（
６）の方法によりそれらのプラスミドを解析した。得ら
れたプラスミドをプラスミドｐＡＧ１００１と命名した
。プラスミドｐＡＧ１００１は、第７図に示した様に、
プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に
、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＧＤＨ産生遺
伝子を含む約５゜４キロベースのＤＮＡ断片が組込まれ
た複合プラスミドである。
（以下余白）
（４）プラスミドＰＡＧ１００Ｉ保有菌株のＧＤＨ活性
測定 プラスミドｐＡＧ、１００１を保有するコリネバクテリ
ウム０メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１を、テトラサイクリン
１０μｇ／ｍＱ含有前記糖蜜培地５０ｍｆｌで、３２℃
にて一晩培養した。
測定 プラスミドｐＡＧ、１００１を保有するコリネバクテリ
ウム０メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１を、テトラサイクリン
１０μｇ／ｍＱ含有前記糖蜜培地５０ｍｆｌで、３２℃
にて一晩培養した。
この培養液より菌体を集菌し、０．８％ＮａＣ１水溶液
２９ｍ Ｑで２回洗浄後、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ２
−（モルフォリノ）エタンスルホン酸（以下ＭＥＳと略
す）、１０ｍＭＭｎＳＯ４，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７，０） １０ ｍ Ｈに懸濁した。これを、ブラウン
社製（西独）のＭＳＫセルホモジナイザー（８５３０２
１型）で処理した後、Ｌ４０００ｒｐｍ（２００００ｇ
）で室温で２０分間遠心分離して細胞抽出液（粗酵素
液）を調製した。
２９ｍ Ｑで２回洗浄後、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ２
−（モルフォリノ）エタンスルホン酸（以下ＭＥＳと略
す）、１０ｍＭＭｎＳＯ４，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７，０） １０ ｍ Ｈに懸濁した。これを、ブラウン
社製（西独）のＭＳＫセルホモジナイザー（８５３０２
１型）で処理した後、Ｌ４０００ｒｐｍ（２００００ｇ
）で室温で２０分間遠心分離して細胞抽出液（粗酵素
液）を調製した。
ＧＤＨ活性は、３．ＯｍＱの酵素反応液（１００ｍＭト
リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ８，１）、５＋ｏＭ
ａ−ケトゲルタール酸、１０ ｍＭ （ＮＨ４）２Ｓｏ
、、 ０．１５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ１５０μＱ細胞抽出
液〕の３４０ｎｍの吸光度の減少を日立製作所製分光光
度計（２２８型）で測定することにより求めた。また、
細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、前記実施例１工程
（５）の方法を用いた。結果を第２表に示す。
リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ８，１）、５＋ｏＭ
ａ−ケトゲルタール酸、１０ ｍＭ （ＮＨ４）２Ｓｏ
、、 ０．１５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ１５０μＱ細胞抽出
液〕の３４０ｎｍの吸光度の減少を日立製作所製分光光
度計（２２８型）で測定することにより求めた。また、
細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、前記実施例１工程
（５）の方法を用いた。結果を第２表に示す。
（５）プラスミドＰＡＧ１００Ｉの縮小化前記実施例２
工程（３）で調製したプラスミドＰＡＧ１００ＩのＤＮ
Ａ ５μｇに対して制限酵素Ｘｂａ １を１５単位加
えて、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ７
，４） 、 １０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ
ＮａＣ１を含む緩衝液５０μα中で、３７℃にて２時
間反応させた。その後、７０℃にて１ｏ分間加熱するこ
とにより、反応を停止させた。次にこの反応液に２倍容
のエタノールを添加して、−３０℃で３時間保持した後
、１２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で１０分
間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し、減圧乾燥した。
工程（３）で調製したプラスミドＰＡＧ１００ＩのＤＮ
Ａ ５μｇに対して制限酵素Ｘｂａ １を１５単位加
えて、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ７
，４） 、 １０ ｍＭ ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ
ＮａＣ１を含む緩衝液５０μα中で、３７℃にて２時
間反応させた。その後、７０℃にて１ｏ分間加熱するこ
とにより、反応を停止させた。次にこの反応液に２倍容
のエタノールを添加して、−３０℃で３時間保持した後
、１２０００ ｒｐｍ （８９００ｇ）で室温で１０分
間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し、減圧乾燥した。
このＤＮＡ全量と３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼ
とを、５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ
７，４）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１，，１０ｍＭジチオト
レイトール、１ ｍＭスペルミジン、１ ｍＭＡＴＰ、
０．１ｍｇ／ｍＱＢＳＡの緩衝液５０μｆｌ中で、１５
℃にて一晩反応させた。その後７０℃にて１０分間加熱
することにより、反応を停止させた。
とを、５０ＩＩＩＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ
７，４）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１，，１０ｍＭジチオト
レイトール、１ ｍＭスペルミジン、１ ｍＭＡＴＰ、
０．１ｍｇ／ｍＱＢＳＡの緩衝液５０μｆｌ中で、１５
℃にて一晩反応させた。その後７０℃にて１０分間加熱
することにより、反応を停止させた。
このリガーゼ反応液を用いて、前記実施例２工程（３）
の方法によりコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
８０１ （微工研条寄第５５８号）を形質転換した。
の方法によりコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
８０１ （微工研条寄第５５８号）を形質転換した。
得られたテトラサイクリン耐性形質転換体を、テトラサ
イクリン１０μｇ／ｍ＋２を含む前記ＬＧ寒天培地上で
純化した後、各株から前記実施例２工程（１）−■の方
法と実質的に同様の方法によりプラスミドを分離し、前
記実施例１工程（６）と実質的に同様の方法によりそれ
らのプラスミドを解析した。得られたプラスミドをプラ
スミドρＡＧ１００２と命名した。
イクリン１０μｇ／ｍ＋２を含む前記ＬＧ寒天培地上で
純化した後、各株から前記実施例２工程（１）−■の方
法と実質的に同様の方法によりプラスミドを分離し、前
記実施例１工程（６）と実質的に同様の方法によりそれ
らのプラスミドを解析した。得られたプラスミドをプラ
スミドρＡＧ１００２と命名した。
第８図に示した様に、プラスミドｐＡＧ１００２は、プ
ラスミドｐＡＧ１００１の約３．１キロベ・−スのＸｂ
ａ Ｉ断片が欠失したプラスミドである。
ラスミドｐＡＧ１００１の約３．１キロベ・−スのＸｂ
ａ Ｉ断片が欠失したプラスミドである。
コリネバクテリウム・メラセコラ（７
ｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１ （
ｐ Ａ Ｇ １００２ ）について、前記実施例２工程
（４）の方法によりＧＤＨ活性を測定した結果を前記工
程（４）の結果とともに示す。第２表から明らかな様に
プラスミドｐＡＧ１００１及びｐＡＧ１００２を保有す
る細胞では、プラスミドを保有しない細胞及びプラスミ
ドρＡＧ５０を保有する細胞に比べて高いＧＤＨ比活性
が認められた。尚プラスミドを保有しない細胞（コリネ
バクテリウム・メラセコラ８０１）はテトラサイクリン
を含有しない培地で培養した。
ｐ Ａ Ｇ １００２ ）について、前記実施例２工程
（４）の方法によりＧＤＨ活性を測定した結果を前記工
程（４）の結果とともに示す。第２表から明らかな様に
プラスミドｐＡＧ１００１及びｐＡＧ１００２を保有す
る細胞では、プラスミドを保有しない細胞及びプラスミ
ドρＡＧ５０を保有する細胞に比べて高いＧＤＨ比活性
が認められた。尚プラスミドを保有しない細胞（コリネ
バクテリウム・メラセコラ８０１）はテトラサイクリン
を含有しない培地で培養した。
第２表
注１）第１表の注１）と同じ。
注２）コリネバクテリウム・メラセコラ（如ｎ凹二ｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１゜
本菌株は、微生物工業技術研究所に、微工研条寄第５５
８号として寄託されている。
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ８０１゜
本菌株は、微生物工業技術研究所に、微工研条寄第５５
８号として寄託されている。
尚、本文中で用いた制限酵素の名称は、次の菌種から得
られる制限酵素の略称である。
られる制限酵素の略称である。
ＥｃｏＲＩ ：エシエリヒア・コリＲＹＩ３（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ９旦ＲＹ１３） ＢａｍＨＩ ：バチルス・アミロリクエファシェンスＨ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍ １ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｈ）ＢｇｌＩ［：バチルス・グロビギイ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ〔妙■■） Ｈａｅｍ：ヘモフィラス・エジプティウス（奥咀堅り回
現徂彰獲ガ佳ハ胆） Ｂｉｎｄ ｍ ：ヘモフィラス・インフルエンザＲｄ（
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｕｌｅｎｚａａ Ｒｄ
）Ｐｓｔ Ｉ ：プロビデンシア・スチニーアーティー
１６４（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ
１６４）Ｓａｃ Ｉ ：ストレプトマイセス・アクロモ
ゲネス（Ｓｔｒｅ ｔｏｗ ａｓｓ ａｃｈｒｏｍｏ
ｅｎｅｓ）ＳａＱｌ：ストレプトマイセス・アルバスＧ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｇ）Ｘｂａ
Ｉ ：キサントモナス・バドリ（Ｘａｎｔｈｏ＋ａｏ
ｎａｓｂａｄｒｉｉ） Ｘｈｏ Ｉ ：キサントモナス・ホルシコラ（発明の効
果） 既存の宿主ベクター系を用いて、そのベクターに本発明
のＤＮＡ断片を組み込み、その宿主に本発明のＤＮＡ断
片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを移入することにより、
ＧＤＨ活性活性強化前種することができる。また、本発
明のＤＮＡ断片を細胞に移入したでけでは本発明のＧＤ
Ｈ遺伝子が発現しない菌種においても、そのＧＤＨ構造
遺伝子をその菌種で発現するプロモーターの下流に接続
することにより、本発明のＧＤＨ産生遺伝子を発現させ
、高ＧＤＨ活性株を育種することができる。
ｅｒｉｃｈｉａ９旦ＲＹ１３） ＢａｍＨＩ ：バチルス・アミロリクエファシェンスＨ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍ １ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｈ）ＢｇｌＩ［：バチルス・グロビギイ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ〔妙■■） Ｈａｅｍ：ヘモフィラス・エジプティウス（奥咀堅り回
現徂彰獲ガ佳ハ胆） Ｂｉｎｄ ｍ ：ヘモフィラス・インフルエンザＲｄ（
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｕｌｅｎｚａａ Ｒｄ
）Ｐｓｔ Ｉ ：プロビデンシア・スチニーアーティー
１６４（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ
１６４）Ｓａｃ Ｉ ：ストレプトマイセス・アクロモ
ゲネス（Ｓｔｒｅ ｔｏｗ ａｓｓ ａｃｈｒｏｍｏ
ｅｎｅｓ）ＳａＱｌ：ストレプトマイセス・アルバスＧ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｇ）Ｘｂａ
Ｉ ：キサントモナス・バドリ（Ｘａｎｔｈｏ＋ａｏ
ｎａｓｂａｄｒｉｉ） Ｘｈｏ Ｉ ：キサントモナス・ホルシコラ（発明の効
果） 既存の宿主ベクター系を用いて、そのベクターに本発明
のＤＮＡ断片を組み込み、その宿主に本発明のＤＮＡ断
片を組み込んだ組換え体ＤＮＡを移入することにより、
ＧＤＨ活性活性強化前種することができる。また、本発
明のＤＮＡ断片を細胞に移入したでけでは本発明のＧＤ
Ｈ遺伝子が発現しない菌種においても、そのＧＤＨ構造
遺伝子をその菌種で発現するプロモーターの下流に接続
することにより、本発明のＧＤＨ産生遺伝子を発現させ
、高ＧＤＨ活性株を育種することができる。
そして、高ＧＤＨ活性株を育種することにより、微生物
による物質（アミノ酸、蛋白質等）生産を、改善するこ
とができる。
による物質（アミノ酸、蛋白質等）生産を、改善するこ
とができる。
第１図は、プラスミドｐＡＧ１０３の制限酵素地図であ
る。第２図は、プラスミドｐＡＧ１１２の制限酵素地図
である。第１図及び第２図においてＰＢＲ３２５−（Ａ
）はプラスミドｐＢＲ３２５をＥｃｏＲＩで開環したＤ
ＮＡ断片を示し、ｐＢＲ３２５−（Ｂ）はプラスミドρ
ＢＲ３２５由来のＤＮＡ断片を示す。またＤ Ｎ Ａ
−（Ａ）は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
（約５．４キロベース）を示し、Ｄ Ｎ Ａ −（Ｂ）
は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（約３．
１キロベース）を示す。第３図は、プラスミドｐＡＧ１
の制限酵素地図である。第４図は、プラスミドｐＡＧ３
の制限酵素地図である。第５図は、プラスミドｐＡＧ１
４の制限酵素地図である。第６図は、プラスミドＰＡＧ
５０の制限酵素地図である。第７図は、プラスミドｐＡ
Ｇ１００１の制限酵素地図である。第８図は。 プラスミドρＡＧ１００２の制限酵素地図である。図中
において、ｐＡＧ５０− （Ａ）はプラスミドｐＡＧ５
０をＥｃｏＲＩで開環したＤＮＡ断片を示し、ｐＡＧ５
０− （Ｂ）は、プラスミドＰＡ０５０由来のＤＮＡ断
片を示す。またＤＮＡ−（Ｃ）は、本発明のＧＤＨ産生
遺伝子を含むＤＮＡ断片（約３．２キロベース）を示す
。 プラスミド分子の長さは、キロベース（Ｋｂ）で表示し
である。図中記号は、発明の詳細な説明に記した制限酵
素基であり、プラスミド上のその位置は、その制限酵素
切断部位を示す。その横に付した数字は、第１図、第２
図、第３図、第４図、第５図、第６図、第７図及び第８
図において、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ 、ＥｃｏＲ
Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ 、 Ｈｉｎｄｍ、Ｘｂａ Ｉ 、
ＢａｉｇＨＩ 、 ＥｃｏＲＩ 、 ＥｃｏＲＩの切断
部位を基準としたプラスミド上での位置を、キロベース
で表示したものである。 特許出願人 旭化成工業株式会社 第１図 第２図 Ｘｂａ工（２，４７ 第７図
る。第２図は、プラスミドｐＡＧ１１２の制限酵素地図
である。第１図及び第２図においてＰＢＲ３２５−（Ａ
）はプラスミドｐＢＲ３２５をＥｃｏＲＩで開環したＤ
ＮＡ断片を示し、ｐＢＲ３２５−（Ｂ）はプラスミドρ
ＢＲ３２５由来のＤＮＡ断片を示す。またＤ Ｎ Ａ
−（Ａ）は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
（約５．４キロベース）を示し、Ｄ Ｎ Ａ −（Ｂ）
は本発明のＧＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（約３．
１キロベース）を示す。第３図は、プラスミドｐＡＧ１
の制限酵素地図である。第４図は、プラスミドｐＡＧ３
の制限酵素地図である。第５図は、プラスミドｐＡＧ１
４の制限酵素地図である。第６図は、プラスミドＰＡＧ
５０の制限酵素地図である。第７図は、プラスミドｐＡ
Ｇ１００１の制限酵素地図である。第８図は。 プラスミドρＡＧ１００２の制限酵素地図である。図中
において、ｐＡＧ５０− （Ａ）はプラスミドｐＡＧ５
０をＥｃｏＲＩで開環したＤＮＡ断片を示し、ｐＡＧ５
０− （Ｂ）は、プラスミドＰＡ０５０由来のＤＮＡ断
片を示す。またＤＮＡ−（Ｃ）は、本発明のＧＤＨ産生
遺伝子を含むＤＮＡ断片（約３．２キロベース）を示す
。 プラスミド分子の長さは、キロベース（Ｋｂ）で表示し
である。図中記号は、発明の詳細な説明に記した制限酵
素基であり、プラスミド上のその位置は、その制限酵素
切断部位を示す。その横に付した数字は、第１図、第２
図、第３図、第４図、第５図、第６図、第７図及び第８
図において、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ 、ＥｃｏＲ
Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ 、 Ｈｉｎｄｍ、Ｘｂａ Ｉ 、
ＢａｉｇＨＩ 、 ＥｃｏＲＩ 、 ＥｃｏＲＩの切断
部位を基準としたプラスミド上での位置を、キロベース
で表示したものである。 特許出願人 旭化成工業株式会社 第１図 第２図 Ｘｂａ工（２，４７ 第７図
Claims (12)
- （１）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙ
−ｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片。 - （２）該ＤＮＡ断片が、コリネバクテリウム属細菌由来
であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載
のＤＮＡ断片。 - （３）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙ
−ｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を含
むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え体ＤＮＡ。 - （４）該ＤＮＡ断片（Ａ）が、コリネバクテリウム属細
菌由来であることを特徴とする特許請求の範囲第（３）
項記載の組換え体ＤＮＡ。 - （５）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主−ベクター
系で用いられるベクターを含有することを特徴とする特
許請求の範囲第（３）項記載の組換え体ＤＮＡ。 - （６）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コリ
ネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるベクターを含
有することを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載
の組換え体ＤＮＡ。 - （７）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙ
−ｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を含
むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え体ＤＮＡを保有した
細胞。 - （８）該ＤＮＡ断片（Ａ）が、コリネバクテリウム属細
菌由来であることを特徴とする特許請求の範囲第（７）
項記載の細胞。 - （９）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主−ベクター
系で用いられるベクターを含有することを特徴とする特
許請求の範囲第（７）項記載の細胞。 - （１０）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コ
リネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるベクターを
含有することを特徴とする特許請求の範囲第（７）項記
載の細胞。 - （１１）該細胞が、エシェリヒア属細菌であることを特
徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の細胞。 - （１２）該細胞が、グルタミン酸生産性コリネ型細菌で
あることを特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の
細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27410984 | 1984-12-27 | ||
| JP59-274109 | 1984-12-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268185A true JPS61268185A (ja) | 1986-11-27 |
Family
ID=17537128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292584A Pending JPS61268185A (ja) | 1984-12-27 | 1985-12-27 | グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61268185A (ja) |
| FR (1) | FR2575492B1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63214189A (ja) * | 1987-03-04 | 1988-09-06 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｌ―グルタミン酸の製造方法 |
| WO2000053726A1 (fr) * | 1999-03-09 | 2000-09-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine |
| US6995250B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Thermophilic amino acid biosynthesis system enzyme gene of thermotolerant coryneform bacterium |
| WO2007114465A1 (ja) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
| US7294491B2 (en) | 2003-05-07 | 2007-11-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-glutamic acid |
| US8129151B2 (en) | 1998-03-18 | 2012-03-06 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2679921B1 (fr) * | 1991-07-30 | 1995-03-03 | Orsan | Procede d'obtention d'une souche bacterienne permettaant l'expression d'une sequence codante determinee. |
| WO1993003158A1 (fr) * | 1991-07-30 | 1993-02-18 | Orsan | Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries |
| JP3880636B2 (ja) * | 1994-01-10 | 2007-02-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
| ID23892A (id) * | 1997-08-12 | 2000-05-25 | Ajinomoto Kk | Metode pembuatan asam l-glutamat melalui fermentasi |
| ES2218009T3 (es) * | 1999-02-20 | 2004-11-16 | Degussa Ag | Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes. |
| DE19907347A1 (de) | 1999-02-20 | 2000-08-24 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE60034843T2 (de) * | 1999-06-03 | 2008-01-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von L-arginin |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2076853B (en) * | 1980-04-17 | 1983-12-21 | Ajinomoto Kk | L-glutamic acid producing microorganisms |
| JPS5867699A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP60292584A patent/JPS61268185A/ja active Pending
- 1985-12-27 FR FR8519357A patent/FR2575492B1/fr not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BACTERIOL.=1984 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63214189A (ja) * | 1987-03-04 | 1988-09-06 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｌ―グルタミン酸の製造方法 |
| JP2520895B2 (ja) * | 1987-03-04 | 1996-07-31 | 旭化成工業株式会社 | Ｌ―グルタミン酸の製造方法 |
| US8129151B2 (en) | 1998-03-18 | 2012-03-06 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid |
| WO2000053726A1 (fr) * | 1999-03-09 | 2000-09-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine |
| US6995250B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Thermophilic amino acid biosynthesis system enzyme gene of thermotolerant coryneform bacterium |
| US7125977B2 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
| US7183403B2 (en) | 1999-10-04 | 2007-02-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
| US7294491B2 (en) | 2003-05-07 | 2007-11-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-glutamic acid |
| WO2007114465A1 (ja) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2575492A1 (fr) | 1986-07-04 |
| FR2575492B1 (fr) | 1988-09-16 |
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