JPS6255089A - ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細
菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（
Ｐｈｏｓｐｔｔｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｃ　ｃａｒｂ
ｏｘｙｌａｓｅ）（以下しばしばＰＥＰＣと略する）産
生遺伝子を含むＤＮＡ１！ＩＴ片、および該ＤＮＡ断片
を有する組換え体ＤＮＡ、および紋紙換え体ＤＮＡを有
する細胞に関する。グルタミン酸性産性コリネバクテリ
ウム属細菌は、大量にＬ−グルタミン酸を生産すること
が知られている。またその変異株は、Ｌ　−ＩＪリジン
のアミノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産
することも知られている。

（従来の技術） 工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネバクテリウム
屈細菌に所望の物質を大量に効率よく生産させるために
、その細菌のＤ　Ｎ　Ａ　Ｍｉ換え技術による育種改良
が試みられている。上記細菌のＤＮＡキ、１１換え技術
による育種改良の重要な要素として、上記細菌のある特
定の遺伝子を含んだＤＮＡ断片がある。

グルタミン酸生産性コリネ型細菌の育種改良を行なうた
めに今までに、グルタミン酸性産性コリネバクテリウム
属細菌の次の遺伝子がクローニングされている。

（１）　　コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒ
ｙ−ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
　（ＡＴＣＣ２１５４３）の５−（２−アミノエチル）
−システィン耐性を支配する遺伝子と、ブレビバクテリ
ウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｃ＋＋＋＋
　ｆＬａｖｕｍ）　（ＡＴＣＣ１４０６７）のアンスラ
ニル酸合成酵素（Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ　５ｙｎｔ
ｈｅＬａｓｅ）遺伝子（勝亦ら、特開昭５８−１２６７
８９号）（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクム
（Ｃｏｒｙ−ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｂｑ旦憇匹憇）
のＡＴＰ−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ａ　Ｔ
　Ｐ　−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）遺伝子（水上ら、白木農芸化学会昭和５９
年度大会講演要旨集Ｐ、２４９）など。

（発明が解決しようとする問題点） アミノ酸、核酸等の菌体成分の多くは、トリカルボン酸
回路（以下しばしばｒＴＣＡ回路」と略す）の中間体よ
り直接あるいは間接的に生合成される。ＴＣＡ回路は細
胞内で起こる一連の酵素反応であり、ＴＣＡ回路の中間
体の一種であるオキザロ酢酸はＰＵＰＣによる反応によ
って供給される。

従って前記グルタミン酸性産性コリネバクテリウム属細
菌の細胞内におけるＰＩＥＰ（：活性を増強することが
できれば、該細菌の発酵によってアミノ酸や核酸等を大
計に生産することができる。

一般に、微生物の細胞中の所望の酵素の活性を増強する
ために、該酵素をコードする遺伝子のクローニングを行
ない、クローニングして得られた遺伝子で微生物の細胞
を形質転換することが行なわれている。ＰＥＰＣについ
てはブレビバクテリウム・ラフ！・ファーメンタム　（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏ−ｆｃｒｍ
ｅｎｔｕｍ）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａ
ｒｂｏｘｙｌａｓｅ　：ＰＥＰＣ）　遺伝子がクローニ
ングされている（伊蕗ら、白木農芸化学会昭和５９年度
大会講演要旨集Ｐ。

４３１）。更にブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌａｃｔｏｆ
ｅｒｍｅｎｔｕｍ）由来のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子でブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　Ｉａｃｔｏｆｅｒ−ｍｅｎ　ｔｕｍ）の細胞を
形質転換して該細菌のＰＥＰＣ活性を増強することが報
告されている（特開昭６０−８７７８８号）。アミノ酸
や核酸等を大量に生産できるコリネバクテリウム属細菌
を得るために、上記ＰＥＰＣ産生遺伝子でアミノ酸や核
酸等を工業的に生産するために用いられているグルタミ
ン酸生産性コリネバクテリウ１、属細菌の細胞を形質転
換する試みがなされている。しかしながら、アミノ酸の
生産について満足できる結果は得られていない。

従って、アミノ酸や核酸等を大計に生産することのでき
るグルタミン酸生産性コリネバクテリウｌ、属細菌はこ
れまで得られていなかった。

（問題点を解決する為の手段および作用）本発明者らは
、上記問題点を解決するべく鋭意研究を行なった結果、
グルタミン酸性産性コリネバクテリウム属細菌より、該
苗種のＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離しク
ローニングすることに成功し、遺伝子操作により該ＤＮ
Ａ断片でコリネバクテリウム屈細菌を形質転換すること
により、この細菌のｐｃｐｃ活性を増強できることを見
出した。これらの知見により本発明者らは本発明を完成
するに敗った。

即ち、基本的には、本発明によればグルタミン酸生産性
コリネバクテリウム属細菌由来のホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃｎｏｌｐｙ
ｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　：　ＰＥＰＣ
）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が提供される。

また、本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ産
生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律複製
に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え
体ＤＮＡが提供される。

更にまた、本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ
バクテリウム属細菌由来のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕ−ｖ
ａｔｃ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　：　ＰＥＰＣ）産生
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に
必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え体
ＤＮＡを保有した細胞が提供される。

グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細菌とはダラ
ム染色陽性、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオ
チンを要求するコリネ型細菌である。また該細菌は、ビ
オチン制限培地で、または高濃度ビオチン含有培地では
界面活性剤等の添加により、培地中にＬ−グルタミン酸
を著■蓄積する。本発明のＤＮＡ断片は上記グルタミン
酸生産性コリネバクテリウム属細菌由来のものである。

本発明のＤＮＡ断片はホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼをコードする遺伝子（以下しばしばｒＰＥＰ
Ｃ産生遺伝子」と称する）を含有する。

該遺伝子が微生物の細胞内で発現すると該細胞内でホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）が
産生される。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼはホスホエノールピルビン酸とオキザロ酢酸との間の
転化を触媒する酵素である。

グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細菌のＰＥＰ
Ｃ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離は、通常の公知の
宿主−ベクター系を用いて行なうことができる。宿主と
しては、例えば、大腸菌〔エシェリヒア・コリ　（Ｕｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）〕が挙げられる。大腸菌
としては例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２株及びその変異株を挙
げることができる。その大腸菌又はその変異株を宿主と
して用いる宿主−ベクター系において使用するベクター
としては上記大腸菌およびその変異株を形質転換するた
めに通常用いられる公知のプラスミドを挙げることがで
きる。また、宿主−ベクター系としてはグルタミン酸生
産性コリネ型細菌を宿主として、そして該細菌に適合す
るプラスミドをベクターとして用いる宿主−ベクター系
を用いることもできる。グルタミン酸生産性コリネ型細
菌としてはコリネバクテリウム（並■匹−ｂａｃ　ｔｅ
ｒ　ｉ　ｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃ−Ｌｅｒｉｕｍ）属またはミクロバクテリウム（Ｍ
ｉｃｒｏｂａｃ−Ｌｅｒｉｕｍ）　屈に屈する細菌が挙
げられる。

ＰＥＩ’Ｃ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片は下記の方法に
よって、グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細菌
から単離することができる。

（１）　　グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細
菌の菌体より、全ＤＮＡを抽出し、種々の制限酵素で切
断する。全ＤＮＡの抽出は、通常用いられている方法（
リゾチウム・ＳＤＳ処理とフェノール・クロロホルム処
理）により行うことができる。

全ＤＮへの切断に用いる制限酵素としては、上記細菌の
全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に使用する宿主
−ベクター系で用いられる後述のベクターの開裂に用い
ることができる制限酵素であれば、いずれでも使用可能
である。この陸用いる制限酵素が、゛目的遺伝子の内部
を切断するかどうかは事前に不明なので、制限酵素を作
用させ、ＤＮＡを部分的に分解することにより、適当な
大きさのＤＮＡ断片が得られる。このようにして得られ
た複数のＤＮＡ断片の中にＰＩＥＰＣ産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片が含まれている。

（２）ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる。

ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な制限
酵素を充分作用させることにより行なう。

ベクターとしては形質転換すべき宿主菌に適合するもの
を用いる必要がある。そのベクターが使用しようとする
宿主菌によって消化されないことを予じめ確認する必要
がある。

（３）ベクターＤＮＡの開裂部位に上記（１）で得たＤ
ＮＡ断片を各々組み込ませ、複数の閉環した組換え体Ｄ
ＮＡをつくる。ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断片
を組み込ませるには、公知の常法、例えばマニアティス
らの方法〔ティー、マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）　、イー、エフ、フリッチュ（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ）、ジェイ、サンプルツク（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ）；モレキュラー　クローニングア　ラボラトリ−マ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　、コールドスプ
リングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド
スプリングハーバーエヌ、ワイ、　（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｎ、Ｙ、）　１９８２年〕を用
いることができる。得られた複数の組換え体ＤＮＡの中
にｐｃｐｃ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有するＭｉ
ｔＡえ体ＤＮＡが含まれている。

（４）各組換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に移入し形質転換
体を得る。組換え体ＤＮＡの移入は、公知の方法、例え
ばマンデルらの方法〔マンデル、エム。

（Ｍａｎｄｅｌ、　ｔ’１．）＋　　ヒガ、エイ、（旧
ｇａ＋　＾、）、ジャーナルオブモレキュラーバイオロ
ジ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇ３１）、　５３巻１５９−１６２　ｇｏ９７ｏ年
）〕によって行なうことができる。

形質転換で宿主として用いる大腸菌としては、大腸菌の
Ｐεｐｃ欠損株が用いられる。その理由を以下に述べる
。上記変異株は生育するために、培地中にグルタミン酸
またはＴＣＡ回路で中間体として生成する有機酸を要求
するので、グルタミン酸およびＴＣＡ回路で生成する有
機酸無添加培地中では生育しない。

しかしながら、上記変異株をＰＥＰＣ産生遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡで形質転換するとその変異株はもはやそ
の生育にグルタミン酸または上記有機酸を要求しなくな
り、グルタミン酸及び上記ｆ機酸無添加培地中でも生育
できるようになる。一方、たとえ−上記変異株をＰＥＰ
Ｃ産生遺伝子を含まない組換え体ＤＮＡで形質転換して
も、その変異株はグルタミン酸または上記有機酸をその
生育に要求するのでグルタミン酸及び上記有機酸無添加
培地中では生育できない。従って、得られた形質転換体
をグルタミン酸及び上記有機酸無添加培地で培養すれば
、ＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有する組換
え体ＤＮＡを保有する形質転換体だけが上記培地中で生
育する。以上の理由から、ＰＩＥＰＣの欠損株を用いる
ことにより所望の形質転換体を効率よく容易に得ること
ができる。

上述の大腸菌の変異株は公知の常法、例えば下記の方法
により得ることができる。まず、大腸菌をＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ　−Ｍｅｔ
ｈｙｌ　−Ｎ　’　−ｎｉＬｒｏ　−Ｎ　−ｎｉｔｒｏ
−ｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ、　Ｎ　Ｔ　Ｇ　）を用いて
、公知の常法に従って変異処理し、さらに公知の常法に
従ってＬ−グルタミン酸要求株を分離する。次に分離し
た株の細胞をＰＥＰＣ活性の測定に供し、ｆ’Ｅ［’ｃ
を示さない変異株の細胞を選別する。選別した細胞を培
養し、大腸菌のＰＥＰＣ欠撰変欠株変異株。ＮＴＧ変異
処理の代りに、他の公知の変異誘導法〔例えば、紫外線
照射、Ｘ線照射、その他の変異誘起剤処理、トランスポ
ゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）処理）を用いることもで
きる。また、研究者や公的機関より分譲されたＰＩ！Ｐ
Ｃ欠損株を使用することもできる。

（５）組換え体ＤＮＡを町人された大腸菌の中から目的
遺伝子を有する菌株を選別分離する。上記の工程（４）
によって得られる大腸菌の中から、グルタミン酸栄養要
求性を判断基準としてＰＥＩ’Ｃ遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを保有する形質転換体を選別分離する。即ち、前
記（４）で得られた形質転換体を、常法に従ってグルタ
ミン酸無添加合成培地上で２０℃〜３７℃で培養する。

グルタミン酸無添加合成培地上で生育する菌株を選択す
る。グルタミン酸無添加合成培地で生育した菌株につい
て、それらの細胞抽出液を用いて、公知の常法によりＰ
ＥＰＣ活性を測定する。その結果、高いＰＩＥＰＣ比活
性を有する形質転換株を選択分離し、培養することによ
りＩＩＥＰＣ産生遺伝子を含むＤ　Ｎ　Ａ　ＩＩＪｉ片
のクローニングを行なうことができる。得られた菌株の
細胞からのＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離
は公知の常法により例えば下記のようにして行なうこと
ができる。

まず、公知の常法により該菌株の細胞から組換え体を分
離し、得られた組換え体ＤＮＡを制限酵素で処理して、
ベクターＤＮＡとＰＥＰｃ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
とに切断し、次に、この制限酵−素処理試料を、アガロ
ースゲル電気泳動に供する。

アガロースゲル電気泳動上でベクターＤＮＡ断片とＰＥ
ＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片とを充分分離する為に
は、該ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡを、複数の
制限酵素で処理する必要がある場合もある。次に目的の
ＤＮＡ断片を含有するアガロースゲルを熔かした後、フ
ェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿により、ＰＥＰＣ産生遺伝
子を含むＤＮＡ断片を分離することができる。

本発明のＩ）　Ｎ　Ａ断片の具体的な一例として、微生
物工業技術研究所（以下しばしば単に微工研と略す）に
寄託番号徽工研条寄第５５８号の下に寄託されている微
生物コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１
より得られるものが挙げられ、そのＤＮＡ断片は次の特
徴を有する。

＋１１　　該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約１１．５キ
ロベースのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、制限酵素Ｘｂａ　Ｉによ
って生じる一本鎖末端である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）Ｂａｍｌｌ　１
　　　　　　　　　３ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　３ １１ｉｎｄｌｌｌ　　　　　　　　　　５Ｐｓｔ　Ｉ　
　　　　　　　　　９ Ｓａｌ　　Ｉ　　　　　　　　　　２ Ｘｂａ　　Ｉ　　　　　　　　　　０ 制限酵素による切断部位は、過剰の制限酵素存在下でＰ
ＥＰＣ産生遺伝子を含む断片を有するプラスミドを完全
消化し、それらの消化物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲ
ル電気泳動および４％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供し、分ｈｌ可能な断片の数から決定され
る。分子の長さは、アガロースゲル電気泳動の場合には
、大腸菌のラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを
ｌ１ｉｎｄｌｌｒで消化して得られる分子の長さ既知の
断片、即ち２１２３０塩基対、゛９４１９塩基対、６５
５７塩基対、４３７Ｌ塩基対、２３２２塩基対、２０２
８塩基対、５６５塩基対及び１２５塩基対の長さのＤＮ
Ａ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる
標準線に基づき、またポリアクリルアミドゲル電気泳動
の場合には、大腸菌のファイ・エックス１７４フアージ
（φＸ　１７４　ｐｌ＋ａｇｅ）のＤＮＡをｌ１ａｅｌ
ｌｌで消化して得られる分子の長さ既知の断片、即ら１
３５３塩基対、１０７８塩基対、８７２塩基対、６０３
塩基対、３１０塩基対、２８１塩基対、２７１塩法対、
２３４塩基対、１９４塩基対、１１８塩基対及び７２塩
基対の長さのＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル
上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、消化プラス
ミドの分子の長さを算出する。複数の断片を生じる場合
には、それぞれの分子の長さを加算して求める。

上記プラスミドに対する前記制限酵素の相対的な切断部
位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で解析することにより求めることができる。

この様にして得られるｐｃｐｃ産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片は、ＰＥＰＣ産生遺伝子を損わない限り必要に応じ
てその一部を変更することができる。例えば、ＤＮＡ断
片の一部を必要に応じて縮小化することができる。縮小
化は、３１　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を適当な制限酵素で消化す
ることにより行なうことができる。本発明のＤＮＡ断片
は、その様なＰＩＥＰＣ産生遺伝子を含む縮小化された
Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＩＪｉ片も包含する。

縮小化によって得られるＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の具体例としては、例えば、下記のＤＮＡ断片を
挙げることができる。

（１）ｆＨ子ρ長さが約８．３キロヘースのＤＮＡ版片
− （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約８．３キロベー
スのデオキシリポ核ｆｉｆｆｉ（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ１！Ｉ′ｒ片の両端は、それぞれ制限酵
素Ｓａｌ　Ｉ　、Ｘｂａ　Ｉによって住じる一本鎖末端
である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）Ｂａｍｌ１１　
　　　　　　　　３ ［ｃｏＲＩ　　　　　　　　　　３ 肌片 ＋１１　　該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約６．４キロ
ベースのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡＵｒ片の両端は、それぞれ制限酵素［１
ｃｏＲｌ　＋　Ｓａ　ｌ　Ｉによって生しる一本鎖末端
である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）Ｂａｍｌ１１　
　　　　　　　　２ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　２ 旧ｎｄＩＩＩ　　　　　　　　　　５ Ｐｓｔ　　Ｉ　　　　　　　　　　６ Ｓａｌ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｉ Ｘｂａ　　Ｉ　　　　　　　　　　０ （ＢＩ）　　＼子の−さが約５．５キロベースのＤＮＡ
販片 （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約５．５キロヘー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素Ｐｓｔ
ｌによって生じる一本鎖末端である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）ＢａｍＨＩ　　
　　　　　　　　Ｉ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　２１１
ｉｎｄｌｌ［４ ＰｓＬ　　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　３Ｓａ
ｌ　　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｘｂａ　
　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　０（ｒＶ）分子
の長さが約４．８キロベースのＤＮＡ肌片 （１）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約４．８キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡＵｒ片の両端は、それぞれ制限酵素Ｂａ
ｍ１ｌ　Ｉ　、Ｓａｌ　Ｉによって生じる一本鎖末端で
ある。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）Ｂａｍｌ１１’
　　　　　　　　　Ｉ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　２ １１ｉｎｄＩ［１４ Ｐｓｔ　Ｉ　　　　　　　　　　５ Ｓａｌ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｉ Ｘｂａ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｏ へ子の長さが約３．９キロベースのＤＮＡＩ！ｆ１（１
）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．９キロベースの
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素、Ｈｉ
ｎｄ　ｍ　ｒ　Ｓａｌ　Ｉによって生じる一本鎖末端で
ある。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）ＢａｍＨＩ　　
　　　　　　　　Ｉ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　２ ＨｉｎｄＩＩ［２ Ｐｓｔ　　Ｉ　　　　　　　　　　３ Ｓａｌ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｉ Ｘｂａ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｏ ＼　の　さが糸・３．３キロベースのＤＮＡ断１（１１
該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．３キロヘースのデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素５ａｌ
Ｉによって生じる一本鎖末端である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）［３ａｍｌｌ　
Ｉ　　　　　　　　　　　ＩＩＥｃｏＲＩ　　　　　　
　　　　２ Ｉｌｉｎｄｌｌｌ　　　　　　　　　’　　２Ｐｓｔ　
　Ｉ　　　　　　　　　　３ Ｓａｌ　　Ｉ　　　　　　　　　　０ Ｘｂａ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｏ また、本発明のＤＮＡ断片はＰＥＰＣ産生遺伝子を損ね
ることなしにその制限部位の少なくとも１ケ・所の塩基
配列を変更してその制限部位を切断する制限酵素の種類
を他の種類の制限酵素に変えることも容易にできる。更
にまた、ＤＮＡ断片の両末端の少なくとも一方の塩基配
列を変更してそのＤＮＡ断片の末端と結合させようとす
るベクターの開裂部位の塩基配列と該ＤＮＡ断片の末端
の塩基配列が合うようにすることもできる。

前述のように、前記大腸菌のＰＥＰＣ欠損株はその生育
にグルタミン酸またはＴＣＡ回路で生成する有欣酸を要
求し、かつＰＥＰＣを産生じないが、ＰＥＰＣ産生遺伝
子を含むＤＮＡ　１１片を含をする組換え体ＤＮＡで上
記変異株を形質転換すると上記変異株はグルタミン酸ま
たは上記有機酸を要求しなくなり、かつＰＥＰＣを産生
ずるようになる。従って、本発明のＤＮＡ断片にＰ［Ｅ
ＰＣ産生遺伝子が存在することは、本発明のＤＮＡ断片
をベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作成しその組換
え体ＤＮＡをｉｉｉ記変異株の細胞に移入した場合に、
その細胞がグルタミン酸及び前記有機酸無添加培地で生
育し、細胞内にＰＥＰＣを産生するということにより確
認することができる。

本発明の組換え体ＤＮＡは、ＰＥＰＣ産生遺１云子を含
むＤＮＡ断片（八）と細胞内での自律復製に必要な遺伝
子を含むＤＮＡ断片（１１）を含有する。Ｐ　Ｉｉ　１
１　Ｃ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（八）と自律複製に
必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とは直接または他
の種類のＤＮＡを介して間接的に結合している。

ＤＮＡ断片（Ａ）としては、前述の本発明のＤＮＡ断片
を用いる。ＤＮＡ断片（Ｂ）としては、公知の宿主−ベ
クター系で用いられるベクター由来のＤＮＡ断片、例え
ば、グルタミン酸生産性コリネ型１田菌の宿主−ベクタ
ー基で用いられるベクターを含むＤＮＡ断片、大腸菌の
宿主−ベクター系で用いられるベクターを含むＤＮＡ断
片および枯草菌の宿主−ベクター系で用いられるベクタ
ーを含むＤＮＡｌｌ１片などを用いることができる。上
記のグルタミン酸生産性コリネ型細閑としてはコリネバ
クテリウム属に属する１１■菌、ブレビバクテリウム属
に属する細菌およびミクロバクテリウム属に属する細菌
があげられる。グルタミン酸生産性コリネ型１［菌の宿
主−ベクター系で用いられるベクターとしてはイ列えば
プラスミド ｐＡＧ５０，　ｐＡＧｌ０３及びそれらのゲラスミ１由
来のプラスミドなど力（あげられる。プラスミドリネバ
クテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂｌｌｃｔｅｒ
ｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）２２２４３　　（ｍ１
研に微工研条寄第Ｆ［ＥＩ？ＭＢＰ−　５　６　０号の
下に寄託されている）から得ることができる。プラスミ
ドｐＡＧ３はコリネハクテリマシム°メラセコラ（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
）２２２２０　　（微工研に微工研条寄第ＦＩＥＩ？Ｍ
　［ｌＰ−　５　５　９号の下に寄託されている）より
得ることができる。

プラスミｔ’ｐＡＧ１４はプラスミドｐＡＧｌの欠失誘
導体である。プラスミドｐＡＧ５０はプラスミドｐＡＧ
１４の一部分とプラスミ）”ｐＡＧ３＃＝播≠とからな
る。プラスミド”ｐＡＧｌ０３番よプラスミドル［ｌＲ
３２５の［ｃｏＲ　Ｉ　＋ＪＪｌ新断片と、コリネバク
テリウム・メラセコラ（並Ｈ−ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（微工研条寄第ＦＥ
ＲＭＢＰ−　５　５　８号）由来でありグルタミンＭデ
ヒドロゲナーゼ産生遺伝子を含む分子長さ約５．　４　
ｋｂのＤＮＡ断片とからなる。これらのプラスミドの取
得方法は後述の実施例において説明する。プラスミ　Ｆ
ｐＡＧ１０３，　　ｐＡＧｌ，　　ｐＡＧ３，　　ｐＡ
Ｇｌ４　　及びｐＡＧ５０　　はそれぞれ第３図、第６
図、第７図、第８図及び第９図に示す制限酵素地図で表
される。大腸菌の宿主−ベクター系で用いられるベクタ
ーとしては例えばプラスミドｐＢＲ３２５及びプラスミ
ドｐ［ｌＲ３２５由来のプラスミドなどが挙げられる。

枯草菌の宿主−ベクター基で用いられるベクターとして
は例えばプラスミドｒ．ＵＢ１１０及びプラスミドｐＵ
Ｂ１１Ｑ山来のプラスミドが挙げられる。

本発明の組換え体ＤＮＡはＤ　Ｎ　Ａ　＋ｌＶｒ片（八
）を直接ｏ　Ｎ　Ａ　ＩＪｆｉ片（１３）に結合するこ
とによって作成することができる。また、本発明の組換
え体ＤＮＡはＤＮＡ断片（八）を別の種類のＤＮＡ断片
を介して間接的にＤＮＡ断片（Ｂ）に結合して作成する
こともできる。本発明の組換え体ＤＮＡは公知の宿主−
ベクター系を用いて作成することができる。

例えば大腸菌の宿主−ベクター系、枯草菌の宿主−ベク
ター系及びグルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主−ベ
クター系などを用いて本発明の組換え体ＤＮＡを作成す
ることができる。

ＤＮＡＩＶｒ片（Ａ）及びＤＮＡ断片（Ｂ）を含む本発
明の組換え体ＤＮＡとしては、例えば、プラスミドｐＡ
Ｇ２０３．　　ｐＡＧ２１１．　　ｐＡＧ２０４．　　
ｐＡＧ２２１．　　ｐＡＧ２００１゜ｐＡＧ２００２な
ど力（あげられる。プラスミドｐＡＧ２０３は分子長さ
約５．５キロベースを有する前述のＤＮＡ断片（Ｉ［［
）をＤＮＡ断片（八）として、及びプラスミドｐＢＲ３
２５のＰｓｔｌ切断断片をＤＮＡ断片（Ｂ）として含む
。プラスミドｐＡＧ２１１は分子長さ約３．３キロベー
スを有する前述のＤＮＡ断片（ＩＶ）をＤＮＡ断片（八
）として及びプラスミドｐＢＲ３２５の５ａｉｌ切断断
片をＤＮＡ断片（Ｂ）として含む。プラスミドｐＡＧ２
０４は分子長さ約１１．５キロベースを有する前述のＤ
ＮＡ断片をＤＮＡ断片（八）として及びプラスミドｐＡ
Ｇ１０３のＸｂａ　１切断断片をＤＮＡ断片（Ｂ）とし
て含む。プラスミドｐＡＧ２２１は分子長さ約１１，５
キロベースを有する前述のＤＮＡ断片をＤＮＡ断片（Ａ
）として及びプラスミドｐ［１Ｒ３２５由来のプラスミ
ドＸｂａｌ切断断片をＤＮＡ断片（Ｂ）として含む。

プラスミドｐＡＧ２００１は分子長さ約３．３キロヘー
スを有する前述のＤＮＡ断片（ＴＲＩ）をＤＮＡ断片（
八）として及びプラスミドｐＡＧ５０の５ａｌｌ切断断
片をＤＮＡ断片（Ｂ）として含む。プラスミドρ＾Ｇ２
００２は分子長さ約薗、５キロベースの前述のＤＮＡ断
片をＤＮＡ断片（Ａ）として及びプラスミドｐＡＧ５０
のＸｂａ　Ｉ切断断片をＤＮＡ断片（Ｂ）として含む。

上記の本発明の組換え体ＤＮＡは、その少なくとも１箇
所の制限部位についてその塩基配列を変えることにより
、ＰＥＰＣ産生遺伝子全体及び複製を支配する遺伝子を
損なうことなく、その制限部位を切断する酵素の種類を
別の制限酵素に変えるように修飾することができる。

本発明の細胞は、細菌とＰＲＰＣ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を含有する組換え体（Ａ）と細胞内での自律複製
に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え
体ＤＮＡとからなる。紋紙換え体ＤＮＡは該細菌の中に
保有されている。

該Ｍ１換え体ＤＮＡとしては、上述の本発明の組換え体
ＤＮＡが挙げられる。

該細胞としては、例えば、公知の大腸菌の各株及び前述
のグルタミン酸生産性コリネ型細菌を挙げることができ
る。

本発明の細胞は通常の公知の組換えＤＮＡ技術を用いて
該細菌を紋紙換え体ＤＮＡで形質転換することにより製
造することができる。

本発明の細胞としては、例えば宿主を大腸菌とした場合
には、エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
匹旦）　　Ｋ　１２３４２−１６７　（ｐＡＧ２０３）
、　　エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２３４２−１６７（ｐＡＧ２１
１）、エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２３４２−１６７　（ｐＡＧ２０
４）およびエシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２３４２　１６７（ｐＡＧ２２
１）などがあげられ、宿主をグルタミン酸生産性コリネ
型細菌とした場合には、コリネバクテリウム・メラセコ
ラ　（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａ−ｓ
ｓｅｃｏｌａ）　８０１　（ｐＡＧ２００１）　、　コ
リネバクテリウムΦメラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｃｃｏｌａ）８０１　（ｐＡ
Ｇ２００２）などがあげられる。エシェリヒア・コリＫ
　１２３４２−１６７（ｐＡＧ２０３）　、エシェリヒ
ア・コリＫ　１２３４２−１６７（ｐＡＧ２１１）　、
エシェリヒア・コリＫ　１２３４２−１６７（ｐＡＧ２
０４）及びエシェリヒア・コリＫ　１２３４２−１６７
（ｐＡＧ２２１）はエシェリヒア・コリＫ　１２３４２
−１６７の細胞を前述のプラスミドｐＡＧ２０３．　ｐ
ＡＧ２１１．　ｐＡＧ２０４及びｐＡＧ２２１でそれぞ
れ形質転換して調製したものである。エシェリヒア・コ
リ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２
３４２−１６７はイー、コリ　ジェネティック　ストッ
ク　センター（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔ
ｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）　（デパートメントオプヒュー
マンジエネティックス、エール大学医学部、アメリカ合
衆国、　０６５１０コネチカソト。

ニューヘイブン、ピーオーボックス３３３３．シーダー
　ストリート　３３３　　（ＤｅｐａｒｔｍｅｎＬ　ｏ
ｆ　ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｙａｌｅ　　Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ　　５ｃｈｏｏｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ。

３３３　　Ｃｅｄｅｒ　　５ｔｒｅｅｔ　　Ｉ’、０．
Ｂｏｘ　　３３３３　　Ｎｅｗ　　ｌ１ａｖｅｎ。

Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　０６５１０　Ｕ、Ｓ、八、）
〕のバーパラ　シェイパツクマン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ
、Ｂａｃｈｍａｎｎ）より公的に入手することができる
。コリネバクテリウム・メラセコラ８０１　　（ｐＡＧ
２００１）及びコリネバクテリウム・メラセコラ８０１
　　（ｐＡＧ２００２）は、コリネバクテリウム・メラ
セコラ８０１の細胞を前述のプラスミドｐＡＧ２００１
及びｐＡＧ２００２でそれぞれ形質転換することにより
調製する。コリネバクテリウム・メラセコラ　（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
　８　Ｑ　１は、前述のように微生物工業技術研究所に
寄託番号微工研条寄第５５８号の下に寄託されている。

以下実施例により本発明の詳細な説明するが本発明はこ
れに限定されるものではない。

（実施例） 実施例１ 本実施例は、コリネバクテリウム・メラセコラ８０１　
　（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ　８０１　）（微工研条寄第５５８号）をＤＮ
Ａ供与体として、該菌株のＰＥＰＣ産生遺伝子を、大腸
菌の宿主ベクター系を利用してクローニングした例であ
る。大腸菌宿主としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈ　１ａｃｏｌｉ）Ｋ　１２３４２−１６７
を用い、大腸菌ベクターとしては、ベクターｐＢＲ３２
５を用いた。コリネバクテリウム・メラセコラ８０１　
　（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃＬｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ　８０１　）は、微生物工業技術研究所に微工研
条寄第５５８号として寄託されている。エシェリヒア・
コリＫ　１２３４２　１６７　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊ
ａ　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２３４２　１６７）はイー、コリ
　ジェネテインク　ストック　センター　（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｌｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ。

Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　３３３　ＣｅｄｅｒＳｔｒｅｅ
ｔ　Ｉ’、Ｏ，Ｂｏｘ　３３３３　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ
、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ０６５１０　Ｕ、Ｓ、Ａ、
）のバーバラ　ジェイ　バンクマン（Ｂａｒｂａｒａ　
Ｊ、Ｂａｃｔ＋＋＋＋ａｎｎ）より分譲された菌株であ
る。尚、上記機関からはだれでも該菌株の分譲をうける
ことができる。ベクターρ［ｌＲ３２５は、ヘゼスダ・
リサーチ・ラボラトリ−社（米国）より購入した。

＋１１　　コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃ
ｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）　（ａ工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製
とその切断糖蜜培地（ビート廃糖蜜８０　ｇ　／　（！
　、Ｍｇ５Ｏ＜　・７１！２００．５ｇ／ｌ、尿素８　
ｇ／ｌ、リン酸１．５　ｇ　／　１、ｐ　Ｈ６，２に鋼
覧後１２０℃１５分間殺菌する。）１’ＯＯｍＪに、コ
リネバクテリウム・メラセコラ８０１　　（Ｃｏｒ　ｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０
１　）（微工研条寄第５５８号）を植菌し、３２℃にて
一晩振とう培養した。得られた培養液より菌体を集め、
洗浄した後、１１０ｆｆ１トリス（Ｔｒ　ｉｓ）　−１
１ｃ　／１（ｐＨ８，０）　、１　ｍＭ　［１ＤＴＡの
緩衝液８　ｍｌに懸濁した。これにリゾチウムを最終濃
度５■／ｍｅになるように加え、３７℃にて４時間反応
させた。これにプロナーゼＥ（シグマ社、米国より購入
）を最終濃度２００μｇ／ｍｌｌになるように加え、室
温で１５分間反応させた。その後、ドデシル硫酸ナトリ
ウムをＲｎ　濃度１％（ｗ／ｖ）になるように添加して
３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、反応液にＴ
ＮＥ緩衝液（５０ｍＭトリス−１１（Ｊ、５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　１００ｍＭ　ＮａＣｅ　、　ｐＨ８，０）で飽
和した等容のフェノールを加え混合した後、１０．００
Ｏｒｐｍ（１１，０００ｇ）で１０分間遠心分離して水
層を回収した。この水層にフェノール・クロロホルム（
１；１　、　ｖ／ｖ）液を等容加えて混合の後、１０．
００Ｏｒｐｍ（１１、ＯＯＯｇ）で１０分間遠心分離し
て水層を回収した。この水層に更に等容のクロロホルム
を加えて混合の後、１０．００Ｏｒｐｍ　（１１，ＯＯ
Ｏｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収した。この水
層にリボヌクレアーゼＡ（シグマ社、米国より購入）を
最終濃度４０μｇ／ｍ１になる様に加えて３７℃にて１
時間反応させた。反応終了後、１１５容の５ＭＮａ（１
水？＄　ｔ＆と１７４容の５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレ
ングリコール６．０００水溶液を添加混合し、４℃にて
４時間保持した。得られた試料を５．００Ｏｒｐｍ（２
，７００ｇ）で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。

沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭｌ−リス−１１（１，１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　。

ｐＨ７゜５）４　ｍｌに溶かし、酢酸ナトリウムを最終
濃度３００ｍＭになるように加えて、２倍容の工タノー
ルを）会力目した。得られた７昆合物を攪１生の後、３
０’Ｃにて３時間保持し、１０．００Ｏｒｐｍ　（１１
，０００ｇ）で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。

回収した沈殿を減圧乾燥の後、ＴＥ緩緩衝液２クｌ溶解
し、Ｉ）　Ｎ　Ａ　？５度０．８５　ｍｇ／　ｍβの全
ＤＮＡ？容ン夜を得た。

全ＤＮＡのｔ５１３１ｔＪｉのためには、１４５ｇｇの
全ＤＮＡに対しζ、１６単位の制限酵素Ｐｓｔｌ（ベゼ
スダリサーチラポラｌ−ＩＪ−社、米国より１１１η人
）を加え、１０ｍＭｈリスー１１ｃ＃　（ｐＨ７，４）
　、１０ｍＭＭｇ５０４．５０ｍＭ　ＮａＣｐ１１ｍＭ
ジチ第１・レイトールを含む緩衝’ｔ（１２００ｔｔ　
ｎ中で３０°Ｃにて２時間反応させた。その？＆７０°
Ｃで１０分間加熱して反応を停止させた。

（２）ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１
２３４２−１６７を５０ｍ７！のし一ブロス（ポリペプ
トン１０ｇ／ｆｆ、酵母エキス５ｇ／４、〜ａｃ（！５
ｇ／ｅ、ｐ　１１７．２　）　ニ４ａ菌し、３７℃ニテ
菌４度５Ｘ１０’（１１／ｍｉ２まで増殖させた後、２
℃で集菌した。得られた菌体を５０ｍρの氷冷した１　
００ｍＭ　’ＡＢＣＩ□水溶液に懸濁し、集菌後火に２
５ｍｆｆの水冷した１　００ｍＭ　Ｃａｆｌ！　ｚ水溶
液に）懸濁した。水中で３０分保持した後、集菌して再
度５ｍｌの水冷した１　００ｍＭ　ＣａＣ１ｚ水）８液
に）懸濁し、水中で１時間保持した〔コンピテントセル
（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ））。

この菌）懸ン蜀ンＦｊ、２００μｐに０．１μｇのｐＢ
Ｒ３２５ＤＮＡを添加して、水中で１時間保持した。そ
の後４２℃にて２分間保持した後、５　ｍ／のし一ブロ
スを添加して、３７°Ｃにて９０分間静置１１″！ｉ養
した。得られた培養液を適当に希釈して、２０μｇ／ｍ
７！のクロラムフェニコールを添加したＬ−寒天培地（
Ｌ−ブロスに１５ｇ／ｆｆの寒天を添加した培地）に塗
布し３７℃で一晩培養した。得られたｐ［１Ｒ３２５に
よる形質転換株より、以下のようにして該ベクターの調
製を行った。

ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２３４２
　１６７を、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍρ）
　’ｃ　含ｔ：　１００ｍｌのし一ブロスに植菌し、３
７°Ｃにて一晩培養した。得られた培養液より集菌しＴ
ＥＥ衝液で洗（’ｆ＋　を多：、１５％（ｗ／ｖ）シュ
ークロース、５０ｍＭトリス　−Ｉｔｃｈ　　（ｐｌ（
８，５）　　、　５　０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　、　２＋
ｒｇ／　　ｍβリヅチウム（シグマ社、米国製）よりな
る水溶液２　ｍｆｆに懸濁し、室温にて３０分間反応さ
せた。

次にトす［ン（Ｔｒｉｔｏｎ）　’（容Ｙ夜〔０，１％
（ｗ／ｖ）ｌ・リドン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００，
５０ＪＩ−リス−１１Ｃ／！、５０ｍＭ　１４ＤＴＡ　
、　　ｐＨ８，５）　　２　ｍｊ２を加えて３７゛Ｃに
て３０分間保持した。次にこの溶液を、５°Ｃにて３０
．０００　ｒｐｍ　（６４，０００ｇ）で１時間遠心分
離し上清を回収し、ＴＥＨＪｉ液を加えて１８ｍ１とし
た。このン１ｋに、１０ｍｇ／ｍｆｆのエチジウムフ゛
ロマイド水溶液１．２ｍＡと塩化セシウム１８．６４　
ｇとを加えて静かにン容角￥し、４０．００Ｏｒｐｍ　
（１００，ＯＯＯｇ）　、１５℃で４８時間遠心分離し
た。ベクターρＢＲ３２５は、紫外線照射により遠心チ
ューブ中、２本のバンドの下方として見い出され、この
ハンドを遠心チューブの側面から注射器で快き取ること
により、ベクターｐＢＲ３２５を分離した。次にこの分
画液を等８平のイソプロピルアルコールで４回抽出し、
得られた抽出液からエチジウムブロマイドを除去し、そ
の後にＴＥＥ衝液に対して透析して、Ｄ　Ｎ　Ａ　？Ｈ
度１５０μｇ　／　ｍβのベクターｐＢＲ３２５の透析
完了液１　　ｍｅを得た。

ベクターｐＢＲ３２５Ｄ　Ｎ　Ａ　１５μｇを含む透析
完了液に対して４５単位の制限酵素Ｐｓ口を加えて、１
０ｍＭ）リス−ＩＩｃ　ｅ　（’ｐＨ７，４）　　１０
　ｍＭ　ＭＢＳＯ，，５０ｍＭＮａＣｊ！、１ｍＭジチ
オトレイトールの緩衝液１５０μβ中で３０℃にて２時
間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱して、反
応を停止させた。

この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになる様
に加え、２倍容のエタノールを添加して、−３０℃にて
３時間保持した。次に１２，０００　ｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で室温で１０分間遠心分甜してＤＮＡ沈殿を回収
し、回収した沈殿を減圧乾燥した。得られた沈殿をＢＡ
ＰＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−１１Ｃ／　、　ｐＨ８，
４）２００μｌに？８解し、バクテリア・アルカライン
・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉ
ｎｅρｈｏｓｐｈａｓｅ）　（宝酒造株式会社より購入
）を１単位添加して６５°Ｃにて３０分間反応させた。

更に該酵素を１単位添加して、６５°Ｃで３０分間反応
させた。その後、反応液に等容のＴＥＮ緩街液で飽和し
たフェノールを加え、混合した液、１２，０００ｒｐｍ
　（（１，９０ｈ）で室温で１０分間遠心分離して水層
を回収し、更にもう１回同じ操作を繰り返した。

次に水層に等容のフェノール・クロロホルム（１：Ｌｖ
／ｖ）液を添加して混合した後、１２．００Ｏｒｐｍ（
８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離し、水層を回
収した。更に水層に等容のクロロホルム、を添加して攪
拌した後、１２，０００　ｒｐｍ（８，９００Ｈ）で室
温で１０分間遠心分離し、水層を回収した。該水層に酢
酸ナトリウムをｒｉｉｉ６．１　？ｆｆｉ度３００ｍＭ
になるように加え、２倍容のエタノールを添加し攪拌し
た後、−３０℃にて３時間保持した。その後、１２．０
０Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離
し、ＤＮＡ沈殿を回収した。これを減圧乾燥した後、３
０μ！のＴＥ緩衝液で溶解した。

＋３）ＤＮＡの組換え反応 前記実施例１工程（［）で得られたＤ　Ｎ　Ａ　２．９
μｇと前記実施例１工程（２）で得られたＤＮＡ１．５
ｇｇと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼにソボンジ
ーン社より購入）とを、５０ｍＭ）リス−１１ｃρ（ｐ
Ｈ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｚ　、１０ｍＭジ
チオトレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ
、０．１ｍｇ／ｍ＃ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　
：　Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）　（ベ
ゼスダリサーチラ；ドラトリー社、米国より購入）の緩
衝？１１００μβ中で、１５℃にて一晩反応させた。そ
の後、７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を
停止させた。

（４）組換え体プラスミドの大腸菌への移入前記実施例
１工程（２）と実質的に同様の方法により、エシェリヒ
ア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）Ｋ　１
２３４２−１６７のコンピテントセル（Ｃｏｍｐｅ　ｔ
ｅｎ　ｔｃｅｌｌ）懸濁液を調製した。得られた細胞懸
濁液４００μｌと前記実施例１工程（３）で得られた反
応液４０μｌとを混合して、水中に１時間保持した。

その後、４２℃にて２分間加熱した後、５　ｍｌ！のＬ
−ブロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した。

次に、得られた培養液から集菌し、無菌水に懸濁した。

得られた懸濁液を、合成寒天培地（ＮａｚｌｌＰＯ，ｔ
　６　ｇ　／　ｌ！　−ＫＩ１２Ｐ０４３　ｇ　／　７
！、ＮａＣ１０，５ｇ／　ｅ、Ｎｌ１４Ｃ＃　１　ｇ／
　ｌ、ＭｇＳＯ４１ｍＭ、ＣａＣＩｔ　。

０．１ｎ＋Ｍ、グルコース２ｇ／ρ、寒天１５ｇ／ｊ２
、Ｌ−スレオニン０．３ｍＭ、Ｌ−ロイシンＱ、３ｍｔ
’ｌ、Ｌ−ヒスチジン０．１ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．
６ｍＭ、チアミン０．０５ｍＭ）に塗布して培養した。

（５）　　コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃ
ｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ　８０１　）　（ｍ工研条寄第５５８号）のＩ’ＥＰ
Ｃ産生遺伝子を有する大腸菌の選択分離 前記実施例１工程（４）で得られた菌株を、アンピシリ
ン（３Ｏａｇ　／　ｍＡ）とテトラナイフリン（１Ｏａ
ｇ／ｍｊｌ’）とを含む前記合成寒天培地と、テトラサ
イクリン（１Ｏａｇ／＋ｎ！りのみを含む前記合成寒天
培地とでそれぞれ培養し、生育の有無を調べた。その結
果、７ンピシリン怒受性テトラサイクリン耐性グルタミ
ン酸非要求性を示す菌株を、目的のｐｃｐｃ産生遺伝子
を保有した大腸菌エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｌｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２３４２−１６７　
（ｐＡＧ２０３）として分間（した。

該大腸菌のＰＥＰＣ活性を、下記の方法で測定すること
により、クローニングした逍伝子がＰＥＰＣ産生遺伝子
であることを確認した。合成液体培地（ＫＨ２ＰＯ４１
３，６ｇ　／ρ、Ｋ２ＳＯ４２，６１ｇ　／　’、Ｍｇ
５Ｏａ　４１１ｚ００．２　ｇ／　ｊ！、、ＣａＣｊ２
ｚ　　ｌ　Ｏｍｇ／　１２１ＦｅＳＯ，，７Ｈ２００，
５ｍｇ／　Ｒ、グルコース４ｇ／Ｎ、ＮＨａＣ１３ｇ　
／　Ｅ　、　Ｌ−スレオニン０．３ｍＭ、Ｌ−ロイシン
０．３　ｍＭ、Ｌ−ヒスチジン０．１ｍＭ、Ｌ−アルギ
ニン０．６ｍＭ、チアミン０．０５ｍＭ、ｐＨ７，２）
１００ｎｌで、エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｌ＋ｅｒ
　ｉｃｈ　１ａｃｏｌｉ）　Ｋ　１２３４２−ＩＣ＋’
７　（ｐＡＧ２０３）を振とう培養した。該大腸菌を集
菌後、２　ｍＥのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ２　　（Ｎ−
モルフォリノ）エタンスルポン酸：　ＭＥ　Ｓ、　　１
０ｍＭ　Ｍｎ５Ｏイ１０ｍＭ　ＥＤＴ八、　　ｐ！−１
７，０〕に懸濁した。これを超音波処理した後、１４．
００Ｏｒｐｍ　（２０，０００ｇ）で２０分間遠心分離
して、細胞抽出液（粗酵素液）をｔＪ製した。尚、エシ
エＫ　１２３４２−１６７　（ｐ１３Ｒ３２５）を培養
する場合には前記合成液体培地に、１０ｍＭグルタミン
酸ナトリウｌ、を添加した。

ＰＥｒ’Ｃ活性は、２．５ｍ７！の酵素反応？ＩＩ（１
００ｍＭＭＥＳ　（ｐｉｆ　７．４　）　、２ｍＭホス
ホエノールピルビン酸、１０ｍＭ　Ｎａ１ｌＣＯ３、Ｏ
，１ｍＭアセチルＣｏＡ　　（シグマ社、米国より購入
）　、３．３ｍＭ　ＭＩＩＳＯ４，０，０５ｍＭ　５＋
５　’−ジチオビスー（２−ニトロ安息香酸）：ＤＴＮ
Ｂ、５　、ｉｉ′Ｌ位／ｍａｌクエン酸合成酵素（ブタ
心臓より得たもの、シグマ社、米国、より購入）、１０
〜１００１ｔ　１細胞抽出液〕の４１２ｎｍの吸光度の
増大を、日立製作所製分光光度計（２２８型）で測定す
ることにより求めた。また、細胞抽出液の蛋白質濃度の
卸２す定には、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）　　ら〔オー、
エイヂ、ローリ−（０，１１，Ｌｏｗｒｙ）＋エヌ、ジ
エイ、ローウェブロー（Ｎ、Ｊ、　Ｒｏｗｅｂｒｏｕｇ
ｈ）＋　アール、ジェイ。

ランダル（Ｒ，Ｊ、　Ｒａｎｄａｌｌ）、ジエイ、パイ
オル、ケム（Ｊ、　［１ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、）　１９
３巻２６５　ｐ　（１９５１年）〕の方法を用いた。尚
、上記測定の標準蛋白質として、牛血清アルブミン（和
光純薬工業社より購入）を用いた。

測定結果を後述の工程（７）に記載の第１表に示す。

第１表のＰＥＰＣ比活性測定結果より、エシェリヒア・
コリ　（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ、ｏｌｉ）　　
Ｋ　１２３４２　１６７（ｐＡＧ２０３）は、極めて高
いｌ’ＵＰｃ活性を有していた。

（６）複合プラスミドｐＡＧ２０３の分離と解析エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　
Ｋ　１２３４２−１６７　（ｐＡＧ２０３）より、前記
実施例１工程（２）と実質的に同様の方法でプラスミド
ｐＡＧ２０３のＤＮＡを、１７０μｇ分離精製した。こ
のＤ　Ｎ　Ａ　０．３μｇに、過剰の制限酵素（ＩＥｃ
ｏＲＴ　　にノボンジーン社より購入）　、Ｂａｍ１ｌ
　Ｉ　　にソポンジーン社より購入）、Ｈｉｎｄｌｌｌ
　（−ソポンジーン社より！１ζ人）、Ｐｓｔｌ。

５ａｌｌにノポンジーン社より購入）〕を、それぞれの
適適正性にて反応させ、その消化した試料気泳動に供し
た。泳動の終ったゲルを１μｇ　／　ｍ　１エチジウム
ブロマイド水溶液に浸漬して３０分間染色した後、紫外
線をゲルに照射して生成断片の数を判定し、各断片の泳
動距離から各々の分子量をＩγ出した。尚、分子量は、
同一アガロースゲル上で同ｎ、＋Ｆに電気泳動したラム
ダファージ（λ　ρｈａｇｅ）１）ＮＡ　にノボンジー
ン社より購入）の制限酵素１１ｉｎｄｔＵによる消化断
片の既知分子上に、または同一ポリアクリルアミドゲル
上で同時に電気泳動したファイエックス１７４フアージ
（φχ１７４ρｈａｇｅ）ＤＮＡの制限酵素１１ａｅＪ
Ｈによる消化断片（ベゼスダリサーチラボラトリ社、米
国より購入）の既知分子房に、基づいて算出した。更に
、複数の制限酵素処理によって生じた消化断片を解析す
ることにより、プラスミド分子中の各制限酵素処理析部
位を決定した。

その結果、プラスミドｐＡＧ２０３は、第１図の制限酵
素地図で示される構造を有し、ベクターρＢＲ３２５の
制限酵素Ｐｓｔｌ切断部位に約５．５キロベースのＰε
ｐｃ産生遺伝子を含む外来のＰｓｔｌ＠片が組み込まれ
ていた。このＰｓＬＩ断片が、コリネバクテリウム”メ
ラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｒｕｍ　＋＊ｅｌ
ａｓｓｅｃｏｌａ８０１　（倣工ωＦ条寄第５５８号）
由来のＰＥＰＣ産生ｊｎ伝子を含むＤ　Ｎ　Ａ　ＩＩＪ
ｉ片である。

プラスミドρへＧ２０３Ｄ　Ｎ　Ａにより、前記実施例
１工程（２）と実質的に同様の方法でエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２３４
２−１６７を形質転換した。得られた形質転換体の薬剤
耐性及び栄養要求性を調べた結果、調べた形質転換株は
、全てテトラサイクリン耐性アンピシリン感受性グルタ
ミン酸非要求性であった。更に該形質転換株について、
それらが保有するプラスミドは、供与プラスミドと比べ
て制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドであ
った。

（７）　　Ｐ　Ｅ　ＰＣ産生遺伝子を含む約５．５キロ
ベースのＤＮＡ断片の縮小化 前記実施例１工程（２）で調製したベクターｐＢＲ３２
５ＤＮＡ３μｇに対して２０単位の制限酵素５ａｉｌを
加えて、５０＋ｎＭＩ−リスー１１Ｃｊ！　（ｐＨ７，
４）　、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣｊ
！の緩衝液５０μｌ中で３７℃にて２時間反応させた。

そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１：ｌν／Ｖ
）液を添加して撹拌の後、水層を回収した。更に等容の
クロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した。そ
こへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭ！こなるよう
に加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０℃
で３時間保持した後、１２．ＯＯＯｒｐｍ（８，９００
ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、これ
を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料り。

前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ２
０３ノＤ　Ｎ　Ａ　３．４　ｐ　ｇ　ニ対し　テ、２０
ｍ位の制限酵素５ａｌｌを加えて、５０ｍＭトリス−Ｉ
ｆ（１（ｐＨ７、４）　、　　１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，
１００ｍＭ　ＮａＣｌ２を含む緩衝液５０μβ中で３７
℃で°２時間反応させた。そこへ等容のフェノール・ク
ロロホルム（１：１　ｖ／ｖ）液を添加して１児拌の後
、水層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加して
攪拌の後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最
終深度３００ｍｔＨこなるように加え、次に２倍容のエ
タノールを添加して、−３０℃で３時間保持した後、１
２，０００ｒｐｍ　（８，９００ｇ）で１０分間遠心分
離してＤＮＡの沈殿を回収し、これを減圧乾燥した（Ｄ
ＮＡ試料Ｈ）。

前記のＤＮＡ試料■とＤＮＡ試料■との全量に対して、
３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼを５０−トリス−
ＩＩｃ／　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　
２．１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジン
、１ｍＭＡＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｉｌ！ＢＳＡを含む緩
衝液５０μβ中で、１５°Ｃにて一晩作用させた。その
後、７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を停
止させた。

このリガーゼ反応液を用いて、前記実施例１工程（４）
と実質的に同様の方法により、エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２３４２−
１６７の形質転換操作を行った。得られた形質転換体の
薬剤耐性及び栄養要求性を調べた結果アンピシリン耐性
クロラムフェニコール耐性テトラサイクリン感受性グル
タミン酸非要求性を示す菌株を多数分離することができ
た。これらの菌株について、前記実施例１工程（６）と
実質的に同様の方法により各菌株の保有するプラスミド
を分離し解析した。得られたプラスミドをｐＡＧ２１１
と命名した。プラスミドｐＡＧ２１１を保持する菌株エ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ
）　Ｋ　１２３４２−１６７　（ｐＡＧ２１１）につい
て、前記実施例１工程（５）と実質的に同様の方法によ
りＩ’ＥＰＣ活性を測定した結果、第１表に示す様に高
いｐｃｐｃ比活性が認められた。本実施例では、２０μ
ｇ／ｍ７！のクロラムフェニコールを添加した合成液体
培地を用いた。

プラスミドｐＡＧ２１１は、第２図の制限酵素地図で示
される構造を有し、ベクターｐｒｓＩ？３２５の制限酵
素５ａｌｌ切断部位に約３．３キロヘースの外来の５ａ
ｌｔ断片が組み込まれていた。この５ａｌＴ断片が、コ
リネバクテリウム・メラセコラ８０１　　（並■些−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０１　
）　（徽工研条寄第５５８号）由来のＰＥＰＣ産生遺伝
子を含むＤＮＡ断片である。

プラスミド’　ｐＡＧ２１１　Ｄ　Ｎ　Ａにより、前記
実施例１工程（２）と実質的に同様の方法でエシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｔ＋ｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　
１２３４２　１６７を形質転換した。得られた形質転換
体の薬剤耐性と栄養要求性を調べた結果、調べた形質転
換株は、全てクロラムフェニコール耐性アンピシリン耐
性テトラサイクリン怒受性グルタミン酸非要求性であっ
た。

更に該形質転換株について、それらが保有するプラスミ
ドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プラス
ミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプラ
スミドであった。

第　　　１　　　表 注１）反応液中の蛋白質１ｎｗが、１分間に生成させた
オキザロ酢酸のマイクロモル数で表示しである。実際に
は、生成したオキザロ酢酸を、過剰のクエン酸合成酵素
とアセチルコエンザイムＡとで反応させてクエン酸とし
、この時生成したコエンザイムＡを、Ｓ　Ｈ７！定量試
薬を用いて定量した。得られたコエンザイムＡの量に基
づいてオキザロ酢酸の指を計算した。

注２）　イー、コリ　ジェネティソク　ストックセンタ
ー（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ
ｅｎｔｅｒ）　＋　（デパー）・メン１へオブヒューマ
ンジェネティソクス、エールユニバーシティ１スクール
オブメジシン、３３３．シーダーストリート、ピー　、
　、ｌ−−、ホックス３３３３．ニューヘイブン、コネ
ヂカｙ　１０６５１０．アメリカ合衆国（Ｄｅｐａｒ　
ｔｍｅｎ　ｔｏｆ　ｌｌｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、
　Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈｏｏｌｏｆ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　３３３　Ｃｅｄｅｒ　５ｔｒｅ
ｅｔ　ｒ’、ｏ、Ｂｏｘ３３３３、Ｎｅｗ　　ｌ１ａｖ
ｅｎ、Ｃｏｎｎ（！ｃｔｉｃｕｔ　　０６５１０　１Ｊ
、Ｓ、八、）〕のパーパラ　ジエイ　バックマン（ｒｌ
ａｒｈａｒａ　Ｊ。

Ｂａｃｈｍａｎｎ）より分譲されたエシェリヒア・コリ
（旦堕ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　Ｋ　１２の変異菌株
である。尚、上記機関からは、誰でも菌株の分詑を受け
ることができる。本菌株は、ＰＥＰＣ活性を共に欠損し
ている。

（８１ＰＩＥｒ’Ｃ産生遺伝子を含む約３．３キロヘー
スのＤＮＡ１！ｙＩ片の分離 前記実施例１工程（７）で調製したプラスミドｐＡＧ２
１１のＤＮＡ３０μｇに対して、１００単位の制限酵素
５ａｌＩを加えて、５０ｍＭ）リス−１１ｃρ（ｐ　）
Ｉ　７．４　）、１０ｍＭ　Ｍｔ３ＳＯａ、　　１００
ｍＭ　ＮａＣｌ！の緩衝ン夜１００μβ中で、３７℃に
て２時間反応させてＤＮＡを消化した。消化した試料は
、前記実施例１工程（６）と実質的に同様の方法により
、１％アガロースゲル電気泳動に供した。ただし、ベゼ
スダ・リサーチ・ラボラトリ−社（米国）より購入した
ＬＭＰアガロースを使用し、４℃で電気泳動した。次に
エチジウムブロマイドで染色した後染色したアガロース
ゲルを紫外線照射下に置き、ＰＩＥｒ’Ｃ産生遺伝子を
含む約３．３キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、
その付近のアガロースゲルを切り出した。該アガロース
ゲルにその重量の３倍量のＴＥＩＩ衝液を加えて、６５
℃で１０分間保持し、アガロースゲルを完全にとかした
。得られた溶液に等容のフェノールを添加して、攪拌の
後、水層を回収した。

得られた水層に、等容のフェノール・クロロボルム（１
：１ｖ／ν）液を添加して、攪拌の後、水層を回収した
。得られた水層に、等容のクロロホルムを添加して、攪
拌の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリ
ウｌ、を最終濃度３００ｍＦＩになるように添加し、更
に２倍容のエタノールを加えて１９２拌の後、−３０°
Ｃにて３時間保持した。

その後、１０．ＯＯＯｒｐｍ（９，ＯＯＯｇ）で室温で
１０分間遠心分姉して、ＤＮＡの沈殿を回収した。次に
、回収した沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液２０μｌに）
８解した。以上の操作により、ＰＣＩ’Ｃ産生遺伝子を
担う約３．３キロベースのＤＮＡ断片を、約３μｇ取得
した。

＋Ｑｌ　　１３ＥＰ　Ｃ産生遺伝子を含む約５．５キロ
ベースの　゛ＤＮＡ断片の分離 前記実施例１工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ２
０３のＤＮＡ５０μｇに対して、１５０単位の制限酵素
Ｂａｍｔｌ　Ｉ　、Ｓａｌ　Ｉをそれぞれ加えて、５０
ｍ１’ｌトリス−ＩＩｃ’Ｎ　（ｐＨ７，４）、ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣｊ！の緩衝液１
００μβ中で、３７℃にて３時間反応させた。消化した
試料は、前記実施例１工程（８）と実質的に同様の方法
によりアガロースゲル電気泳動に供し、目的の約３．８
キロベース、約４．１キロヘースのＤＮＡ断片の存在を
確認し、両ＤＮＡ断片の存在する付近のアガロースゲル
を切り出した。

切り出したアガロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩
衝液を加えて、６５℃で１０分間保持し、アガロースゲ
ルを完全にとかした。得られた溶液に等容のフェノール
を添加して、攪拌の後水層を回収した。得られた水層に
、等容のフェノール・クロロホルム（１：Ｌｖ／ν）液
を添加して、１災件の後、水層を回収した。得られた水
層に、等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を
回収した。得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度
３００ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタノー
ルを加えて攪拌の後、−３０℃にて３時間保持した。そ
の後、１０．００Ｏｒｐｍ（９，ＯＯＯｇ）で室温で１
０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収した。次に、
得られた沈殿を減圧乾燥した後、得られたＤＮＡ全量に
対して、５０単位の制限酵素１’ｓｔｌを加えて、１０
ｍＭ）リス−１１Ｃｊ２　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＭ
ｇＳＯ４，５０ｍＭ　ＮａＣ４１１ｍＭジチオトレイト
ールの緩衝液５０μβ中で、３０℃にて３時間反応させ
てＤＮＡを消化した。消化した試料は、前記実施例１工
程（８）と実質的に同様の方法によりアガロースゲル電
気泳動に供し、目的の約１．０キロヘース、約１．２キ
ロヘースのＤＮＡ断片の存在を確認し、両ＤＮＡ断片の
存在する付近のアガロースゲルを切り出した。切り出し
たアガロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加
えて、６５℃で１０分間保持し、アガロースケルを完全
にとかした。次に、得られた溶液に等容のフェノールを
添加して、攪拌の後氷層を回収した。得られた水層に、
等容のフェノール・クロロホルム（ｌ：１ν／ν）液を
添加して攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に等
容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した
。得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍ
Ｍになるように添加し、更に２倍容のエタノールを加え
て攪拌した後、−３０°Ｃに７Ｃ３時間保持した。その
後、１０．００Ｏｒｐｍ（９、０００ｇ）で室温で１０
分間遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収した。次に、回
収した沈殿を減圧乾燥した。以上の操作により、ＰＥＰ
Ｃ産生遺伝子を含む約５．５キロベースのＤＮＡ断片の
一部である約１．０キロヘース、１．２キロベースのＰ
ｓｔ　Ｉ　−３ａＩ　ｒ断片を分離し、両ＤＮＡ断片を
合せて、約２μｇを取得した。得られた両ＤＮＡ断片を
゛ｒＥｉｌ衝液２０μｌに溶解した。

以上の様にして、ＰＥｌＩＣ産生遺伝子を含む約５．５
キロベースを、分子の長さ約１．０ギロヘース、約１．
２キロヘース及び約３．３キロヘースの３つのＤＮＡ断
片として単離するごとができた。ＰＥｒ’Ｃ産生遺伝子
を含む約５．５キロヘースのＤ　Ｎ　Ａ　ＩｉＩ′ｉ片
の中央部分の約３．３キロベースの５ａｌＩ断片は、前
記実施例１工程（８）で分離した約３．３キｌコヘース
のＤＮＡ断片と同一である。

実施例２ 本実施例は、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　
８０１　）ｉ工研条寄第５５８号）をＤＮＡ供与体とし
て、該菌株のＰ　’Ｅ　Ｐ　Ｃ産生遺伝子を、大腸菌の
宿主ヘクター系を利用してクローニングした例である。

宿主大腸菌としては、実施例１と同様エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２３
４２−１６７を用い、大腸菌ベクターとしては、複合プ
ラスミドｐＡＧ１０３を用いた。

プラスミドｐＡＧ１０３は、第３図の制限酵素地図で示
される構造を存し、プラスミドｐＢＲ３２５の制限酵素
ＥｃｏＲＩ切断部位に、約５．４キロヘースのコリネバ
クテリウム・メラセコラ（幻ｒｙｎｅｂａｃ　ｔｅｒ　
ｉ　ｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　　８０１　（微工
研条寄第５５８号）由来のグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ（Ｇ　Ｉ　ｕ　Ｌａｍａ　ｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ
ａｓｅ、　Ｇ　Ｄ　Ｈ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が
組み込まれている。このＧ　Ｄ　ｌ−［産生遺伝子を含
むＤＮＡ断片上に制限酵素Ｘｂａ　Ｉ断片部位が存在し
ている。

プラスミＦｐＡＧ１０３の作成とその調製について、以
下に詳しく説明する。

（１１プラスミドｐＡＧ１０３の３固装（イ）コリネバ
クテリウム・メラセコラ（並■匹−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１　　（？ａ工研条
寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製とその切断実施例
１工程（１）と実質的に同様の操作を繰返してコリネバ
クテリウム・メラセコラ（ｄ−ｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ）　　８０１　　（ｉｉｌ工研条寄第５
５８号）の全ＤＮＡを得た。

この全ＤＮＡの切断のためには、３４μどのＤＮＡに対
し、１６Ｏ単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（−’−ノポ
ン・ジーン社製）を加え、５０ｍＭ　）リス−１１ｃβ
（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ｈｓｏ＜、１００ｍＭ　
Ｎａ（ｌを含む緩衝液６７μβ中で、３７°Ｃにて３０
分間反応を行なわせた。その後、７０°Ｃで１０分間加
熱して、反応を停止させた。

（ロ）ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂光づ、ベクタ
ーｐＢＲ３２５（ベゼスダ・リサーチ・ラボラＩ・り一
部、米国より購入）をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ延）　Ｋ　１２　　ＰＡ３４０に１多大し
、入し、得られた形質転換株からｐＢＲ３２５を調製し
た。

エシェリヒア・コリ　（ｌＥｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｊ）　Ｋ　１２ＰＡ３４０は、イー、コリ　ジェネ
ティノクストソクセンター（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）、デパートメント
オブヒューマンジェネティソクス。

エールユニハーシティースクールオブメジシン、３３３
　ジ−ダーストリー１・　ピー、オー、ボックス３３３
３ニューヘイブン、コネチカノト０６５１０、アメリカ
合衆国（Ｄｅｐａｒｔｍｃ：ｎｕ　ｏｆ　ｌｌｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ　５ｃｂｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　。

３３３　　Ｃｅｄｅｒ　５ｔｒｅｅｔ　Ｐ、０．Ｂｏｘ
　３３３３　Ｎｅｗ　１ｌａｖｅｎ。

Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　０６５１０　Ｕ、Ｓ、八、）
のハーバ°ラ　シェイパツクマン（ｒｌａｒｂａｒａ　
Ｊ、Ｂａｃｈｍａｎｎ）より分譲されたエシェリヒア・
コリ（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１
２の変異菌株である。尚、上記機関からは、誰でも該菌
株の分議を受けることができる。本菌株は、ＧＤｌｌと
グルタミン酸合成酵素（ＧｌｕＬａｍａｔｅ　５ｙｎｔ
ｈａｓｅ）とを欠…しているので、生育にグルタミン酸
を要求する。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　ＰＡ３４０を５０ｍ１のし
一ブロス（ポリペプトン１０　ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ
／２、Ｎａ（Ｊ５ｇ７ｅ、ｐＨ７，２）に植菌し、３７
°Ｃにて菌濃度５Ｘ１０”個／１ＩｌＮまで増殖させた
後、遠心分離により２℃で集菌した。得られた菌体を５
０ｍＮの水冷したｌ　ＯＯｍＭ　ＭｇＣｆ、水溶液に）
Ｕ濁し、集菌後更に２５ｎ＋ｊ！の氷冷したｌ　００ｍ
Ｍ　ＣａＣ１ｚ水溶液に懸濁した。水中で３０分間保持
した後、集菌して再度５　ｍＱの水冷した１　００ｍＭ
　ＣａＣ！　２水）８液に゛懸濁し、水中で１時間保持
した。この菌懸濁液２００μｌに０．１μｇのｐＢＲ３
２５Ｄ　Ｎ　Ａを添加して、水中で１時間保持した。そ
の後４２℃にて２分間保持した後、５　ｍｌのＬ−ブロ
スを添加して、３７°Ｃにて９０分間静置培養した。得
られた培養液を適当に希釈して、１０μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを添加した■７−寒天培地（Ｌ−ブロスに
１５　ｇ／ｌの寒天を添加した培地）に塗布し、３７℃
で一晩培養してｐＢＲ３２５による大腸菌の形質転換を
得た。

ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２　Ｐ
Ａ３４０を１００＋ｙｌのテトラサイクリン（１０μｇ
７ｍｌ＞を含むし一ブロスに植菌し、３７℃にて一晩培
養した。得られた培養物より集菌し、ＴＥ１１衝液で洗
浄後、１５％（−／ν）シュークロース、５０ｍＭ）リ
ス−１１Ｇ＃（ｐＨ８，５）　、５０ｍＭ　ＥＤＴ＾、
２ｍｇ／１１１１リゾチーム（シグマ社、米国より購入
）の緩衝液２　ｍｌに懸濁し、室温にて３０分間反応さ
せた。次にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ン容液〔０，１％
（ｗ／ｖ））リドン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００，５
０Ｍｍ　トリス−ＩＩＣ（１，５０ｍＭ１、ＤＴＡ、ｐ
Ｈ８，５）　　２　ｍ（ｌをカロえて、３７℃にて３０
分間保持した。次にこの？８液を、５℃にて３０　、０
０Ｏｒｐｍ　（６４，０００ｅ）で１時間遠心分離し上
清を回収し、ＴＥ緩；Ｊｉ？夜を力■えて１８ｍｇとし
た。このｔ夜にｌＯ■／ｍ７！のエチジウムブロマイド
水溶液１．２ｍＭと塩化セシウム１８．６４　ｇとを加
えて静かに／８解し、４０，０００　ｒｐｍ（１００，
０００ｇ）　１５°Ｃで４８時間遠心分離した。ベクタ
ーｐＩＩＩ＋３２５は、紫外孫照射により遠心チューブ
中、２本のバンドの下方として見い出され、このバンド
を遠心チューブの側面から注射器で抜き取るごとにより
、ベクターｐ旧？３２５画分を分離した。次にこの分画
液を等容量のイソプロピルアルコールで４回抽出して、
エチジウムブロマイドを除去し、その後にＴＥ緩衝液に
対して透析してＤ　Ｎ　Ａ　濃度１３０μｇ／ｍｌのベ
クター　ｐＢｌ？３２５の透析完了Ｗ１１ｍｆを１１↓
た。

ベクターｐＢＲ３２５Ｄ　Ｎ　Ａ　１７　ｐｇ　ニ対し
て４０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加えて、５０　ｍＭ
　ｉリス−Ｈ（Ｊ（ｐ　Ｈ７，４）　、１０ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣｊ！を含む緩衝液１５０μ
ｇ中で３７℃にて２時間反応させた。その後、７０℃で
１０分間加熱して、反応を停止させた。この液に酢酸す
トリウムを最終濃度３００ｍＭになるように加え、２倍
容のエタノールを添加して、−３０℃にて３時間保持し
た。次に１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で
１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、減圧乾燥し
た。得られた沈殿をＢＡＰＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−
１１（［、ｐＨ８，４）２００μｌに溶解し、バクチリ
アル・アルカリ・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ−ｐｈａｔａｓｅ）　（
宝酒造株式会社より購入）を１単位添加して６５℃にて
３０分間反応させた。更に該酵素を１単位添加して、６
５℃で３０分間反応させた。

その後、反応液にＴＥＮ緩衝液で飽和した等容のフェノ
ールを加え、混合した後、１２，０００　ｒｐｍ（８，
９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離して水層を回収し
、更にもう１回同じ操作を繰り返した。次に水Ｈに等容
のフェノール・クロロホルム（１：１ν／ｖ）液を添加
した後、１２，０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温
で１０分間遠心分離し、水層を回収した。更に水層に等
容のクロロホルムを添加して、攪拌した後、１２．００
Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離し
、水層を回収した。得られた水層に酢酸ナトリウムをＲ
終濃度３００ｍＭ４こなる様に加え、２倍容のエタノー
ルを添加し撹拌した後、−３０℃にて３時間保持した。

その後、１２，０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０
分間遠心分離し、ＤＮＡの沈殿を回収した。これを減圧
乾燥した後、２３μｌのＴＥ緩１１ｉ液に溶解した。

（ハ）ＤＮＡの組み換え反応 実施例２工程（１１−（イ）で得られたＤ　Ｎ　Ａ　２
．４μｇと実施例２工程（１１−（ロ）で得られたＤＮ
Ａ１．４μｇと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼに
ッポンジーン社より購入）とを、５０ｍＭトリス−１１
ｃ７！（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣＪｚ　、１
０ｍＭジチ第１・レイトール、１ｍＭスペルミジン、１
ｍＭ　ＡＴＰ、　０．１ｔｒｙ／　ｍｅ　Ｂ　Ｓ　Ａ　
（Ｂｏｖｉｎｅ　　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）ベゼ
スダリサーチ・ラボラトリ−社、米国より購入）の緩衝
液１００μβ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後
、７０°Ｃにて１０分間加熱することにより、反応を停
止させた。

（ニ）組換え体プラスミドの大腸菌への移入実施例２工
程（１１−（ロ）と実質的に同様の方法により、エシェ
リヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
Ｋ　１２　ＰＡ３４０のコンピテントセル（Ｃｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ））懸濁液を調製した。得られた細
胞懸濁４００μｌと実施例２工程（１１−（ハ）で得ら
れた反応液４０１！とを混合して、水中に１時間保持し
た。その後、４２℃にて２分間加熱した後、５　ｍｌの
し一プロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した
。

次に、得られた培養液から集菌し、無菌水に）Ｕ濁した
。懸濁液を、合成寒天培地（ＮａｚｌｌＰＯａ　６　ｇ
　／１　、　ＫＨ２ＰＯ４３ｇ　／　１、ＮａＣ１０，
５ｇ　／　ｅ　５ＮＩＩ４Ｃ１１ｇ　／　ｊ！　、ｈｓ
Ｏ４１ｍＭ、ＣａＣｊ２ｚ０．１ｍＭ、グルコース２ｇ
／ｌ、寒天１５ｇ／ｊ２．Ｌ−スレオニン０．３ｍＭ、
Ｌ−ロイシン０．３　ｍＭ、Ｌ−ヒスチジン０．１ｍＭ
、Ｌ−アルギニン０．６　ｍＭ、チアミン０．０５ｍＭ
）に塗布して培養した。

（ホ）コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅ
ｂａｃｔｅ旦ｕｓ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　８０１　
）　（微工研条寄第５５８号）のＧ　Ｄ　Ｈ産生遺伝子
を有する大腸菌の選択分離 実施例２工程（１１−（ニ）で得られる菌株を、クロラ
ムフェニコール（２０℃ｇ／ｍｆｆ）とテトラサイクリ
ン（１０℃ｇ／ｍ６）とを含む前記合成寒天培地とテト
ラサイクリン（１０℃ｇ／ｍｅ）のみを含む前記合成寒
天培地とでそれぞれ培養し、生育の有無を調べた。その
結果、クロラムフェニコール感受性テ１〜ラサイクリン
耐性グルタミン酸非要求性を示す菌株を単離し、口約の
ＣＤ　）［産生遺伝子を保持した大腸菌エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　　　Ｋ
　　１　２　　　ＰＡ３４０　　（ｐＡＧ１０３）　　
　と命名した。得られた大腸菌を培養してＧ　Ｄ　Ｈ産
生遺伝子をクローニングした。

単離した大腸菌のＧＤＨ活性を、下記の方法で測定する
ことにより、クローニングした遺伝子がＧＤＨ産生遺伝
子であることを確認した。合成液体培地（Ｋ１１□ＰＯ
ａ　　１３．６　ｇ／ｌ、Ｋ、ＳＯ４２，６１ｇ／Ｊ　
、　Ｉ’１ｇＳＯ４・７１１２００．２　ｇ　／　７！
、ＣａＣ（ｌ　ｚ　　１０　ＴＩＮ／β、ＦＴ３ＳＯ４
・７１１２００．５　ｍｇ／　ｌ、グルコース４ｇ／ｌ
、　Ｎｌ１ｎＣｊ！　３　ｇ／　１．、Ｌ−スレオニン
０．３　ｍＭ、Ｌ−ロイシン０．３ｍＭ、Ｌ−ヒスチジ
ン０．１　ｍＭ、Ｌ−アルギニン０．６　ｍＭ、チアミ
ン０．０５ｍＭ、ｐＨ７，２）１００ｎ／！に、エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　１ａｃｏｌｉ）
　Ｋ　１２　ＰＡ３４０　（ｐＡＧ１０３）を植菌し、
３７°Ｃで一日培養した。培養後、大腸菌を集菌し、２
ｍｌの７Ｍ緩衝液（５０ｍＭ）リス−Ｉｌ（１！　、　
１０ｍＭ　２−メルカナトエタノール、ｐＨ７，６）に
）懸濁した。

これを超音波処理した後、１４．００Ｏｒｐｍ　（２０
，０００ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗
酵素液）を調製した。尚、エシェリヒア・コリ（ｌＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ５ヨ９工１ｊ工）Ｋ１２Ｐ八３４０
やエシェリヒア・コリ（口５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ）　　　Ｋ　　１　２　　ＰＡ３４０　　（ｐＢ
Ｒ３２５）　　を培養する場合には、前記合成液体培地
に、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウムを添加した。

ＧＤＨ活性は、２．５１１１１の酵素反応液（５０ｍＭ
トリス−１１Ｃ７！　、　　４０ｍＭ　Ｎ１１４Ｃｊ！
　、　０．２５ｍＭ　ＮＡＤＰＩＩ、５ｍＭα−ケトグ
ルタル酸、１０〜１００μｌ細胞抽出液、ｐＨ７，６）
の３４０ｎｍの吸光度の減少を、日立製作所製分光光度
計（２２８型）で測定することにより求めた。また細胞
抽出液の蛋白質濃度のン且り定には、ローリ−（Ｌｏｗ
ｒい　ら〔オー、エイチ。

ローリ−（０，１１，Ｌｏｗｒｙ）　、エヌ、ジエイ、
ローウェブロー（Ｎ、Ｊ、　Ｒｏｉｖｅｂｒｏｕｇｌ＋
）　＋　アール、ジエイ、ランダル（Ｒ，Ｊ、　Ｒａｎ
ｄａｌｌ）、ジエイ、ハイオル、ケム（Ｊ、　１ｌｉｏ
１．　Ｃｈｅｍ、）　１９３巻２６５頁（１，９５１年
）〕の方法を用いた。尚、上記測定の標【ＪＬ蛋白質と
して、生血清アルブミン（和光純薬工業社より購入）を
用いた。

結果を第２表に示す。第２表のＧ　Ｄ　Ｈ比活性測定結
果より、エシェリヒア・コリ　（均匹旬ぜ士功ｊＡｃｏ
ｌｉ）　　Ｋ　１２　ＰＡ３４０　（ｐＡＧ１０３）は
、極めて高いＧ　Ｄ　Ｈ比活性を有していることが解っ
た。

第　　　２　　　表 注１）　反応液中の蛋白質１■が、１分間に酸化した還
元型β−ニコチンアミドアデニンジスクレオチドリン酸
（β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅｄｉ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｃ　ｐｈｐｓｐｈａｔｅ、　　ｒｅ
ｄｕｃｅｄ　　ｆｏｒｍ。

ＮＡＤＩ’ｌ＋）のマイクロモル数で表示しである。

（へ）プラスミドｐＡＧ１０３の分離と解析エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　
１２ＰＡ３４０　（ｐＡＧ１０３）より、実施例２工程
（１１−（ロ）と実質的に同様の方法でプラスミドｐＡ
Ｇ１０３　Ｄ　Ｎ人１５０μｇを、単離精製した。この
Ｄ　Ｎ　Ａ　０．３μｇに、過剰の制限酵素（ＥｃｏＲ
Ｉ　、　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　、　　Ｂ［！Ｉ　１１　にソ
ボンジーン社より購入）　１ｌｉｎｄｌｌｌ、Ｐｓｔｌ
、５ａｃｌ　　（宝酒造株式会社より購入）、Ｓａｌ　
Ｉ　、Ｘｂａ　ｒ　　（二・７ボンジ一ン社より購入）
、Ｘｈｏｌ（宝酒造株式会社より購入）〕を、それぞれ
の適正条件にて反応させ、その消化した試料を公知の常
法に従い１％ったゲルを１μｇ／ｍｅエチジウムブロマ
イド水溶液に浸漬して３０分間染色した後、紫外線をゲ
ルに照射して生成断片の数を判定し、各断片の泳動距離
から各々の分子量を算出した。尚、分子量は、同一アガ
ロースゲル上で同時に電気泳動したラムダファージ（λ
　ｐｈａｇｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　にソポンジーン社より購
入）、の制限酵素１１ｉｎｄｌによる消化断片の既知分
子量に、または同一ポリアクリルアミドゲル上゛ζ同時
に電気泳動したファイエックス１７／Ｉフアージ（φＸ
１７４　ｐｈａｇｅ）　ＤＮＡの制限酵素１１ａｅｌＴ
Ｉによる消化断片（ベゼスダリサーチラボラＩ・り一社
より購入）の既知分子量に、基づいて算出した。更に、
複数の制限酵素処理によって生じた消化断片を解析する
ことにより、プラスミド分子中の各制限酵素切断部位を
決定した。

その結果、プラスミドｐＡＧ１０３ば、第３図の制限酵
素地図で示される構造を有し、ヘクターｐＢＲ３２５の
制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に、約５．４キロベースの
外来のｕｃｏＲ［断片が組み込まれていることが解った
。この［ＩＣＯＲＩ断片が、コリネバクテリウム・メラ
セコラ（Ｃｏ　ｒｙｎｅｂａＣＬｅ吐些ｍｅ　Ｉａ　ｓ
　ｓｃｃ、ｏ　Ｉ　ａ　）８０１　　（！ｉｎｋ工研条
寄第５５８号）由来のＣＤ　ＩＦ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片である。

プラスミドｐＡＧ１０３　Ｄ　Ｎ　Ａにより、実施例２
工程（１１−（ロ）と実質的に同様の方法で、エシェリ
ヒア・コリ　（ｕｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　
Ｋ　１２　ＰＡ３４０を形質転換し、得られた形質転換
体の薬剤耐性と栄養要求性を調べた結果、調べた形質転
換株は、全てテトラサイクリン耐性アンピシリン耐性り
１」ラムフェニコル惑受性グルタミン酸非要求性であっ
た。

°更に、該形質転換株につい”ζ、それらが保有するプ
ラスミドを解析した結果、それらのプラスミドは供与プ
ラスミドと比べて：１ｉｌｌ　ＩＵ酵素切断様式で同一
と判定されるプラスミドであった。

プラスミドｐＡＧ１０３　Ｄ　Ｎ　Ａ　１５μｇに対し
て、４５単位の制限酵素Ｘｂａ　Ｉを加えて、５０１Ｔ
ＩＭｌ・リス−１１ＣＩ　（ｐＨ７，４）　、１０　ｍ
Ｍ　Ｍｇ５Ｏ，，１００ｍＭ　Ｎａｆ！！を含む緩衝液
１５０μρ中で３７゛Ｃにて、２時間反応させた。その
後、７０°Ｃで１０分間加熱して、反応を停止させた（
ＤＮＡ試料ＩＩＩ）。

（２）　　コリネバクテリウム・メラセコラ（並互皿−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０
１　　（ａｋ工研条寄第５５８号）から全ＤＮＡの調製
とその切断実施例１工程（１）と実質的に同様の操作を
繰返してコリ；画＼クテリウム・メラセコラ（並りμ専
些−ｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｃｃｏｌａ）　　８０
１　　（ｔｉ工研条寄第５５８号）から全１）　Ｎ　Ａ
を得た。

全ＤＮＡの切断の為には、５０μｇの全ＤＮＡに対して
５０単位の制限酵素Ｘｂａ　Ｉを加えて、５０ｍＭトリ
ス−ＩＩｃ　（１（ｐＨ７，４＞　、１０　ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４，１００ｍＭＮａｃＮの緩Ｕｉ液１５０μ／中で
３７°Ｃにて、２時間反応させた。その後、７０°Ｃで
１０分間加熱して、反応を停止させた（ＤＮＡ試料ＩＶ
）。

（３＋ＤＮ八〇に、［１み換え反応 実施例２工程＋１１で得られたＤＮＡ試料Ｉ＋１１．８
μｇと実施例２工程（２）で得られたＤＮＡ試料■２．
５μｇと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼにソポン
ジーン社より購入）とを、５０ｍ門トリスー〇Ｃ１（ｐ
Ｉ（７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ７！ｚ　、ｌ　０ｍ
Ｍジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ　
ＡＴＰ、　０．１ｍｇ／　ｍＡ　Ｉ３　Ｓ　Ａの緩衝液
１００ｕ＃中で、１５°Ｃにて一晩反応させた。その後
、７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を停止
させた。

（４）組換え体プラスミドの大腸菌への移入実施例２工
程（３）と実質的に同様の方法により冑られた反応液４
０μＣを用いて、実施例１工程（４）と同様の操作を行
った。ただし、１０μｇ／ｒｒｌｌのテトラサイクリン
を添加した合成寒天培地を用いた。

（５）　　コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　
８０１　　（ｉＦｉｋ工研条寄第５５８号）のＰＩＥＰ
Ｃｉ１１伝子を有する大腸菌の選択分離 実施例２工程（４）で得られた菌株を、アンピシリン（
３０μｇ／ｍ６）とテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ
）とを含む前記合成寒天培地及びテトラサイクリン（１
０μｓ／ｍ＋２）のみを含む前記合成寒天１μ地でそれ
ぞれ培養した。その結果、アンピシリン耐性テトラサイ
クリン耐性グルタミン酸非要求性を示す菌株を単離した
。’ＪＩ　Ｌ’ｄした菌株は目的のＰＥＰＣ遺伝子を保
有しており大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２３４２−１６７（ｐＡＧ
２０４）と命名した。

分ｚ＋ｔ　Ｌだ大腸菌のｐｃｐｃ活性を、実施例１工程
（５）と同様の方法で測定することにより、クローニン
グした遺伝子がｐｃｐｃ産生遺伝子であることを確認し
た。

第３表に示すＰＥＰＣ比活性測定結果より、エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）　Ｋ　１
２３４２−１６７（ｐＡＧ２０４）は、極めて高いｒ’
ＥＰｃ活性を有していた。

第　　　３　　　表 （６）複合プラスミドｐＡＧ２０４の分離と解析エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　
Ｋ　１２３４２−ＩＧ？　（ｐＡＧ２０４）より実施例
２工程（１１−（ロ）と実質的に同様の方法で、プラス
ミドｐＡＧ２０４のＤＮＡを、１６５μｇ単離精製した
。このＤＮＡを用いて、実施例１工程（６）と実質的に
同様の方法により、プラスミドｐＡＧ２０４の制限酵素
地図（第４図）を作成した。プラスミドｐＡＧ２０４は
、ヘクターｐＡＧ１０３の制限酵素Ｘｂａ　Ｉ切断部位
に約１１．タキロヘースの外来のＸｂａ　Ｉ断片が組み
込まれていた。このＸｂａ　Ｉ断片が、コリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　　８０１　　（ｉ工研条寄
第５５８号）由来のＰＩＥＩ）Ｃ産生ｉｆｆ伝子を含む
ＤＮＡ断片である。

プラスミドｐＡＧ２０４　Ｄ　Ｎ　Ａにより、実施例２
工程（１１−（ロ）と実質的に同様の方法で、エシェリ
ヒア・コリ（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ
　ｌ　２３４２　１６７を形質転換した。得られた形質
転換体の薬剤耐性及び栄養要求性を調べた結果、調べた
形質転換株は、全てアンピシリン耐性テトラサイクリン
耐性りロラムフェニコール怒受性グルタミン酸非要求性
であった。更に、該形質転換菌株について、それらが保
有するプラスミドは、供与プラスミドと比へて制限酵素
切断様式で同一と判定されるプラスミドであった。

＋７）　　Ｐ［ＥＰＣ産律遺伝子を含む約１１．５キロ
ヘースのＤＮＡ断片の分離 プラスミｌ”ｌＩＡ［；２０４から、アガロースゲル電
気泳動により、Ｉ’ＥＰＣ産生遺伝子を含む約１１．５
キロベースのＤＮＡ断片を直接分離することができない
。

なぜならば、該ＤＮＡ断片とこのＤＮＡ断片を組み込ん
でいるベクタープラスミドｐＡＧ１０３とが同程度の分
子量を有しているからである。従って、アガロースゲル
電気泳動で分離可能な別のベクタープラスミドに、この
約１１．５キロベースのＤＮＡ断片を一旦組込み、その
新らたに得られた複合プラスミドからこの約１１．５キ
ロベースのＤＮＡ断片を分月１シた。アガロースゲル電
気泳動で分離可能なベクタープラスミドとして、プラス
ミドｐＢＲ３２５の制限酵素ＥｃｏＲＴ切断部位にＸｂ
ａ　Ｉ　’Ｊンカー（宝酒造株式会社より購入）を組み
込んだプラスミドを用いた。

以下にその方法を述べる。

（イ）プラスミドｐＢＲ３２５の制限酵素Ｅｃａｌｌ　
１切断部位にＸｂａ　Ｉリンカ−を組み込んだプラスミ
ドの作成と調製と開裂 実施例１工程（２）で調製したプラスミドｐＢＲ３２５
ＤＮＡ５μｇに対して２０単位の制限酵素ＥＣＯＲＩを
加えて、５０ｍＭ）リス−Ｉｔ（１（ｐｌ−１７，４）
　、１０ｍＭ　ＦｊｇＳＯａ、１００ｍＭ　ＮａＣ／の
緩衝液１００μｊｌ’中で３７℃にて、２時間反応させ
た。その後、７０℃で１０分間加熱して、反応を停止さ
せた。この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに
なる様に加え、２倍容のエタノールを添加して、−３０
℃にて３時間保持した。次に１２．００Ｏｒｐｍ　（８
，９０ｈ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ１′ｌ
ｔ殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試
料■）。

得られたＤＮＡ試料Ｖと３単位Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｔ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）　（宝
酒造株式会社より購入）とを、３３ｍＭ１−リスＣＩｌ
：Ｉｃ０ＯＩＩ（ｐＨ７，９）、６６ｍＭ　Ｃｌ５ＣＯ
ＯＫ、　　１０ｍＭ（ＣＨ＊ＣＯＣ００）ｚ　。

０、５　ｍＭジチ、ｔ）レイＩ−−／Ｉｚ、０．１　ｍ
ｉｒ／　ｍｌ　Ｂ　ＳＡ、０．１ｍＭ２’−デオキシア
デノシン５′−トリホスフェート（シグマ社、米国より
購入）、０．１ｍＭ２’−デオキシシチジン５′−トリ
ホスフェート（シグマ社、米国より購入）、０．１ｍＭ
２’−デオキシアデンン５’　　ｔ−リホスフェ−１−
（シグマ社、米国より購入）、０．１ｍＭチミジン５′
−トリホスフェート（シグマ社、米国より購入）の反応
液４４μβ中で３０゛Ｃにて２０分間反応させた。この
液に酢酸すトリウムをＱ終濃度３００ｍＭになる様に加
え、２倍容のエタノールを添加しζ、−３０′Ｃにて３
時間保持した。次に１２，０００ｒｐｍ（８，９００ｇ
）で室温で１０分間遠心分■してＤＮＡ沈１殺を回収し
、得られた沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。

Ｘｂａ　Ｉリンカ−（Ｘｂａ　Ｉ　　１ｉｎｋｅｒ）　
（宝酒造株式会社より購入）１．５μｇとＴ４ボリヌク
レオヂドキナーゼ（Ｔ４　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ　ｋｉｎａｓｅ）　（宝酒造株式会社より購入）２．
５単位とを６６ｍＭトリス−１１Ｃ１（ｐＨ７，６）　
、ＩｍＭ　ＡＴＰ、　　１０＋ｎＭ　ＭｇＣ１１’ｚ　
、１ｍＭスペルミジン、１５ｍＭジチオトレイトール、
０．２ｍｇ／ｍ／ＢＳへの反応液１０μβ中で３７°Ｃ
にて１時間反応させた（ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料Ｖｌの１／４■とＤＮＡ試料■全憧とＴ４フ
ァージＤＮＡリガーゼ（Ｔ　ａ　Ｉ’ｈａＬＨｅ　Ｄ　
Ｎ　Ａｌｉｇａｓｅ）　６単位とを、６６ｍＭｈリスー
１１ｃ　１　（ｐ　Ｈ７，６）、１ｍＭ　ＡＴＰ、　　
１０ｍＭ　Ｍｇ（１！ｚ　、１ｍＭスペルミジン、１５
ｍＭジチ第１・レイトール、０．．２　ｒｒｇ／　ｍ　
Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａの反応液２２μ！中で２２°Ｃにて４時
間反応させた。この反応液に等容のフェノール・クロロ
ホルム（１：１　ν／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層
を回収した。更に等容のクロロホルムを添加して撹拌の
後水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３
００ｍＭになる様に加え、次に２倍容のエタノールを添
加して、−３０°Ｃて３時間保持した後、１２．００Ｏ
ｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離して
ＤＮＡ？ｆ：、ｌ１Ｘ２を回収し、これを減圧乾燥し　
　゛た（ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料■全■に対して、１５単位の制限酵素Ｘｂａ
　Ｉを加え、得られた混合物を５０ｍＭ１−リス−ＩＩ
Ｃｊ！　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１０
０ｍＭ　ＮａＣ１を含む緩衝液５０μβ中で３７°Ｃに
て２時間反応させてＤＮＡを消化した。消化した試料は
、実施例１工程（６）と実質的に同様の方法により、１
％（ｗ／ν）アガロースゲル電気泳動に供した。ただし
、電気泳動には、ヘゼスダ・リサーチラボラトリ−社よ
りｉｊ、’ｉ人した！：、　Ｍ　Ｐアガロースを使用し
、４°Ｃで電気泳動した。次にエチジウムブロマイドで
染色後染色したアガロースゲルを紫外線照射下に置き、
６．０キロヘースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付
近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガロー
スゲルにその重■の３倍量のＴＥ緩ｆＪｉ液を加えて、
６５℃で１０分間加熱し、アガロースゲルを完全にとか
した。次に得られた溶液に等容のフェノールを添加して
、攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に、等容の
フェノール・クロロホルム（１：　１　　ｖ／ｖ）液を
添加して、攪拌の後氷層を回収した。得られた水層に等
容のクロロホルムを添加して攪拌の後水層を回収した。

得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終深度３００ｍＭ
になるように添加し、更に２倍容のエタノールを加えて
攪拌の後、−３０°Ｃで３時間保持した。

その後、１０．ＯＯＯｒｐｍ　（９，０００ｇ）で室温
で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収した。次に、
得られた沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。

（ロ）プラスミドｐＡＧ２０４の制限酵素Ｘｂａ　Ｉに
よる開裂 実施例２工程（６）で調製したプラスミドｐＡＧ２０４
のＤＮＡ５μｇに対して、１５単位の制限酵素Ｘｂａ　
１を加えて、５０ＩＩＩＭトリスー１１ｃ７！　（ｐｉ
ｆ　７．４　）　、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ、　１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液１００μｊ２中で３７℃にて
、２時間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱し
て、反応を停止させた。この液に、酢酸ナトリウムを最
終濃度３００ｍＭになるように加え、２倍容のエタノー
ルを添加して、−３０℃にて３時間保持した。次に１２
，０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠
心分離して一３０℃にて３時間保持した。次に１２．０
０Ｏｒｐｍ　（８，９００ｇ　）で１０分間遠心分離し
てＤＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ
試料Ｘ）。

（ハ）ＤＮＡの組換え反応 ＤＮＡ試料Ｘ全量とＤＮＡ試料Ｘ全量と３単位のＴ４フ
ァージ’Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼとを、５０ｍＭ１−リス−
’ｄＣ１（ｐＨ７，４−）　、１０ｍＭ　Ｍｇ（１２、
Ｌ　０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジン、
１ｍＭ＾ＴＰ。

０、ｌ＋ｎｇ／ｍ＃ＢｓＡを含む緩衝液１００．ｕ＃中
で、１５°Ｃにて一晩反応させた。その後７０℃にて１
０分間加熱することにより、反応を停止させた。

（ニ）３■換え体プラスミドの大腸菌への移入実施例２
工程＋７１−（ハ）で得られた反応液４０μｌを実施例
２工程（３）で得られた反応混合物の代わりに用いて、
実施例２工程（４）と実質的に同様の操作を行って形質
転換体を得た。

（ホ）円ＥＰＣ産生遺伝子を含む約１１．５キロベース
のＤＮＡ断片を有する大腸菌の選択分離と該菌株が保有
する複合プラスミドのｉｉｊ、離と解析実施例２工程（
７１−（ニ）で得られた菌株より、グルタミン酸非要求
性で、アンピシリン耐性クロラムフェニコール感受性テ
トラサイクリン耐性を示す菌株を分離した。次に、これ
らの菌株から、実施例２工程（１１−（ロ）と実質的に
同一様の方法により、それぞれの菌株の保有するプラス
ミドを単離精製した。これらのプラスミドＤＮＡを用い
て、実施例２工程（１１−（へ）と実質的に同様の方法
により、各プラスミドの構造を調べた。得られた複合プ
ラスミドをｐＡＧ２２１と命名した。

プラスミドｐＡＧ２２１は、第５図の制限酵素地図で示
される構造を有している。すなわち、該複合プラスミド
は、プラスミドｐ［１Ｒ３２５の制限酵素Ｅｃｏｌｌ　
１切断部位にＸｂａｌリンカ−を組み込んで作成した制
限酵素Ｘｂａ　Ｉ切断部位に、ＰＩＥＰＣ産生遺伝子を
含む約１１．５キロベースのＤＮＡ断片が組の込まれて
いる。この約１１．５キロベースのＤＮＡ断片は、プラ
スミドｐＡＧ２０４のＰＣＰＣ産生遺伝子を含む約１１
．５キロヘースのＤＮＡ断片と比べて、制限酵素切断様
式で同一と判定されるＤＮＡ断片であった。従って、ブ
ラスミｌ’ｐＡＧ２２１の約１１．５　＝１−ロベース
のＸｂａ　Ｔ断片は、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ）　　８０１　　（微工研条寄第５５８号）由来
のＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片である。

（へ）プラスミドｐＡＧ２２１からのＩ’１ＥＰＣ産生
遺伝子を含ム約１１．５キロベースのＤＮＡ断片の分離
実施例２工程（７）　−（ホ）で調製したプラスミドｐ
ＡＧ２２１のＤＮＡ２０μｇに対して、６０単位の制限
酵素Ｘｂａ　Ｉを加えて、５０ｍ１’ｌ）リス−１１Ｃ
Ａ！（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ、１００
＋ｎＭ　ＮａＣＡを含む緩衝液１００μρ中で、３７°
Ｃにて２時間反応させてプラスミドを消化した。消化し
たプラスミドは、前記実施例１工程（６）の方法により
、１％（ｉｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。

ただし、電気泳動には、ベゼスダ・リサーチラボラトリ
−社より購入したＬＭＰアガロースを使用し、４℃で電
気泳動した。次にエチジウムブロマイドで染色後染色し
たアガロースゲルを紫外線照射下に置き、ＰＥＰＣ産生
遺伝子を含む約１１．５キロベースのＤＮＡ断片の存在
を確認し、その付近のアガロースゲルを切り出した。得
られたアガロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液
を加えて、６５°Ｃで１０分間保持し、アガロースゲル
を完全にとかした。

次に得られた溶液に等容のフェノールを添加して、攪拌
の後、水層を回収した。得られた水層に、等容のフェノ
ール・クロロホルム（１：　１　ｖ／ｖ）液を添加して
攪拌の後、水層を回収した。得られた水層に等容のクロ
ロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した。得られ
た水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度を３００ｍ旧こな
るように添加し、更に２倍容のエタノールを加えて攪拌
の後、−３０℃にて３時間保持した。その後、１０．０
０Ｏｒｐｍ　（９，ＯＯＯｇ）で室温で１０分間遠心分
離してＤＮＡの沈殿を回収した。次に、得られた沈殿を
減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液２０μβに溶解した。以上の操
作により、ＰＲＰＣ産生遺伝子を含む約１１．５キロベ
ースのＤＮＡ゛断片を約５μｇ含む溶液を取得した。

（８１Ｐ　Ｅ　Ｐ　Ｃ産生遺伝子を含む約８．３キロベ
ースのＤＮＡ断片の分離 前記実施例２工程（７）　−（ホ）と実質的に同様の方
法により調製したＰＥＰＣ産生遺伝子を含む約１１．５
キロベースのＸｂａ　Ｉ　　　Ｘｂａ　Ｔ断片５μｇに
対して、２０単位の制限酵素５ａｌＩを加えて、５０ｍ
Ｍ）リス−１１Ｃｊ！　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　
ＭｇＳＯ４，１００ｍＭＮａＣ（ｌを含む緩衝液５０μ
ｌ中で３７℃にて２時間反応させてＤＮＡを消化した。

消化した試料は、前記実施例２工程（７）　−（ホ）と
実質的に同様の方法によりアガロースゲル電気泳動に供
し、エチジウムブロマイドで染色後染色したアガロース
ゲルを紫外線照射下に置き、約５．０キロヘースのＸｂ
ａ　ｌ−５ａｉｌ断片と約３．３キロベースのＳａｌ　
Ｉ　−５ａｌ　ｌＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近
のアガロースゲルを切り出した。次に、切り出したアガ
ロースゲルより、前記実施例２工程ｆ７１−（ホ）と実
質的に同様の方法により、前記の約５．０キロヘースの
だ。

ｐｃｐｃ産生遺伝子を含む約８．３キロヘースのＸｂａ
　１−５ａｉｌ断片に含まれる約３．３キロベースの５
ａｉｌ−５ａｉｌ断片は、前記実施例１工程（８）で分
離した約３．３キロヘースのＤＮＡ断片と同一−（？あ
った。

以上の様にして、ＰＥＰＣ産生遺伝子を含む約８．３キ
の２断片として分離することができた。

（９１Ｐ　Ｅ　Ｐ　Ｃ産生遺伝子を含む約６．４キロベ
ースのＤＮＡ断片の分離 前記実施例２工程（８）の方法により分離したＰ　１２
ＰＣ産生遺伝子を含む約５．０キロヘースのＸｂａ　Ｉ
　−３ａｉｌ断片２μｇに対して、１０単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩを加えて、５０ｍＭ）リス−Ｉｌｌ　（ｐＨ
７，４）、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣ
ｆｆを含む緩衝液５０μβ中で３７℃にて２時間反応さ
せてＤ　トＪΔを消化した。消化した試料は、前記実施
例２工程（７）−（ホ）と実質的に同様の方法によりア
ガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで
染色後染色したアガロースゲルを紫外線照射下に置き、
約３．１キロヘースのＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉ断片の
存在を確認し、その付近のアガロースゲルを切り出した
。

次に切り出したアガロースゲルより、前記実施例２工程
（７１−（ホ）と実質的に同様の方法により、前述の約
３．１キロベースのＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　［断片を約
０．５μｇ取得した。以上の様にして、ＰＥＰＣ産生遺
伝子を含む約６．４キロベースのＥｃｏＲｒ　−Ｓａｌ
　Ｉ断片を、約３．１キロベースのＥｃｏＲＩ　−Ｓａ
ｔ　ｒ断片と、実施例２工程（８）で得られた約３．３
キロベースのＳａｌ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ断片の２断片と
して分離することができた。

（ｌｏｔ　　ＰＩＥＰＣ産生逍伝子を含む約４．８　二
ＦロベースのＤＮＡ断片の分離 前記実施例２工程（８）と実質的に同様の方法により得
られた約５．０キロベースのＸｂａ　Ｉ　−Ｓａｌ　ｌ
断片４μｇに対して、２Ｏ単位の制限酵素Ｂａｍ１ｌ　
Ｉを加えて、ｌｏｍＭ）リス−１１ｃＩ！（ｐＨ７，４
）　、１０ｍＭＭｇ５Ｏｎ　、５０ｍＭ　ＮａＣ１，１
ｍＭジチオトレイトールを含む緩衝液５０μ！中で、３
７℃にて２時間反応させてＤＮＡを消化した。消化した
試料は、前記実施例２工程（７１−（ポ）と実質的に同
様の方法によりアガロースゲル電気泳動に供し、エチジ
ウ１、ブロマイドで染色後染色したアガロースゲルを紫
外線照射下に置き、約１．５キロベースのＢａｍ１ｌ　
Ｉ　−３ａｌｌ断片の存在を確認し、その付近のアガロ
ースゲルを切り出した。次に切り出したアガロースゲル
より、前記実施例２工程（７１−（ポ）と実質的に同様
の方法により、前述の約１．５キロベースのＢａｍ１ｌ
　Ｔ　−Ｓａｌ　ｌ断片を約０．５μｇ取得した。以上
の様にして、ＰＥＰＣ産生遺伝子を含む約４．８キロベ
ースのＢａｍ！ｌ　Ｉ　−Ｓａｌ　ｌ断片を、約１．５
キロヘースのＢａｍ１ｌ　Ｔ　−Ｓａｌ　ｌ断片と、実
施例２工程（８）で得られた約３，３キロヘースのＳａ
ｌ　ｌ−５ａｌ　ｌ断片の２断片として分離することが
できた。

００　ＰＥＰＣ産生遺伝子を含む約３．９キロヘースの
ＤＮＡ断片の分離 前記実施例２工程（８）と実質的に同様の方法により分
離したＰＥＰＣ産生遺伝子を含む約５．０キロベースの
Ｘｂａ　Ｔ　　　Ｓａｌ　Ｔ断片４μｇに対して、２Ｏ
単位の制限酵素１１ｉｎｄＩＩＩを加えて、１０ｍＭ　
’ｒリスー１１ｃ／２（ｐＨ７，４）　、１０　ｍＭ　
Ｍｇ５Ｏ，，５０ｍＭ　ＮａＣｆｆ、１ｍＭジチオトレ
イトールを含む緩衝液５０μρ中で、３７°Ｃにて２時
間反応させてＤＮＡを消化した。

消化した試料は、前記実施例２工程＋７）−（ホ）と実
質的に同様の方法によりアガロースゲル電気泳動に供し
、エチジウムブロマイドで染色後染色したアガロースゲ
ルを紫外線照射下に置き、約０．６キロベースの１ｌｉ
ｎｄＩ［［−５ａｌ　ｌ断片の存在を確認し、その付近
のアガロースゲルを切り出した。次に切り出したアガロ
ースゲルより、前記実施例２工程［７１−（ホ）と実質
的に同様の方法により、前述の約０．６キロヘースの１
ｌｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｓａｌ′Ｉ断片を約０．２μｇ取
得した。以トの様にして、ＰＲＰＣ産生遺伝子を含む約
３．９ギロヘースのｔｌｉｎｄＴ［［−Ｓａｌ　ｌ断片
を、約０．６キｌ」ヘースの１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｓ
ａｌ　Ｔ　ＩＩＪ′ｒ片と、実施例２工（７（８１で（
ゴられた約３．３キロベースの５ａｌｌ−３ａｌｌ断片
の２断片として分離することができた。

実施例３ 本実施例は、グルタミン酸生産性コリネバクテリウム屈
細菌由来のＰＩＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断ハを、
該ＩＩ菌のベクターに組込んで、該細菌のｐｃｐｃ強化
株を育種した例である。グルタミン酸化産生コリネバク
テリウム属ｉ■菌由来のｐｒ：ｐｃ産生遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片としては、前記実施例１工程（８）、前記実施
例２工程（７１−（へ）でそれぞれ調整したＰＥＰＣ産
生遺伝子を含む約３．３キロヘースのＳａｌ　ｌ断片と
約１１６５キロベースのＸｂａｌ断片とを使用した。グ
ルタミン酸化産生コリネ型細菌のベクターとしては、プ
杼スミドｐＡＧ５０を使用した。

プラスミドｐＡＧ５０は、該細菌のプラスミドｐＡＧ１
、ｐＡＧ３より、後述する方法により作成されたベクタ
ープラスミドである。プラスミドｐＡＧ１はコリネバク
テリウム・メラセコラ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）２２２４３　（ａ工研
条寄第５６０号）より分離されたテトラサイクリン耐性
プラスミドである。プラスミドｐＡＧ３は、コリネバク
テリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｊａ　）２２２２０　　（ｆ＆
工研条寄第５５９号）より分離されたクリプテイックプ
ラスミドである。

＋１１　　プラスミドｐＡＧ５０の作成と該ブラスミＩ
・保有コリネハクテリウムメラセコラ　（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃ　Ｌｅ−ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　
　８０１　（ｐＡＧ５０）からの該プラスミドの分離。

プラスミドｐＡＧ５０は、次の方法で作成した。先づプ
ラスミドｐＡＧ１を縮小化してプラスミＦ　ｐＡＧ１４
を作成し、該プラスミドよりテトラサイクリン耐性遺伝
子を含むＤＮＡ断片を分離した。次に該ＤＮＡ断片をプ
ラスミドｐＡＧ３に組込んでプラスミドｐＡＧ５０を作
成した。以下、上述の操作について詳細に説明する。

（イ）コリネバクテリウム・メラセコラ（ムＬヒｅ−ｂ
ａｃＬｅｒｉｕｍ　ｍｏｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　２２
２４３　　（９Ｊ工研条寄第５６０号）菌体からのプラ
スミドｐＡＧ１の分離 上記菌株を、半合成培地（（Ｎ１１４）　ｚｓＯ４１０
ｇ、尿素３　ｇ、　　ＫｚＨＩ’０４１　ｇ、　　Ｎａ
Ｃｊ！　５０ｍｇ、Ｍｇ５Ｏ。

・７１１ｚＯ４００ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏｎ　　’　　４−
６１１ｚＯ２ｒｒｙ、　Ｆｅ５Ｏａ・４−６１１□０２
ｍｇ、グルコース２０ｇ１ビオチン５０μｇ１チアミン
塩酸塩２００μｇ、酵母エキス１ｇを純水に溶かして１
１とし、ｐＨ７，２に調整した培地〕で、３２℃、−晩
振盪培養し、その種培養８　ｍＡを２００ｍＡの前記半
合成培地に移植して、３２℃で５時間振盪培養した。

得られた培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液（５０
ｍＭグルコース、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、２５ｍＭ）リ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ（ｈｙ
ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ：
　）リス）、Ｌｏｎｇ／ｍ１２リゾチウム（シグマ社よ
り購入）、ｐＨ８，０）１０ｍ＃に懸濁し４２℃で１時
間反応させた。本反応液にアルカリＳＤＳ液（０，２Ｎ
　Ｎａ０１１．１％（ｗ／　ｖ　）Ｓ　Ｄ　Ｓ　　（Ｓ
ｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ））２０ｍ
ｆｆを添加攪拌の後、水中に５分間置いた。

次に本反応液に、水冷した酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸
カリウム水溶液６０ｍ１、酢酸１１．５ｍｆ、純水２８
．５ｍ／の混合液）１５ｍｌを添加攪拌の後、水中に１
０分間置いた。溶菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５
分間、１２．００Ｏｒｐｍ（１３０００ｇ　）の遠心分
離を行い、上澄液を回収した。これを等容のフェノール
・クロロホルム液（１：　１）を加えて攪拌し水層を回
収した。これに２倍容のエタノールを添加攪拌して、５
分間室温に置き、２０℃、１０分間、１０．００Ｏｒｐ
ｍ（１１，０００ｇ）の遠心分離を行った。得られた沈
澱物を、７０％エタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥し
て、ＴＥ緩衝液〔１１０１ＩＩトリス、　　１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７，５）　　２０　　ｍｌｌで、ふたたび
溶解した。この液に、１０■／ｍａｌエチジウムブロマ
イド水溶液１．２ｍｇと塩化セシウム２３、６　ｇとを
加えて静かに溶解し、４０．００Ｏｒｐｍ（１００，Ｏ
ＯＯｇ）　　１５℃で４８時間遠心分離した。プラスミ
ドｐＡＧ１は、紫外線照射により遠心チューブ中、２本
のバンドの下方として見い出されこのバンドを遠心チュ
ーブの側面から注射器で抜き取ることにより、プラスミ
ドｐＡＧ１画分を分離した。次いでこの分画液を等容量
のイソプロピルアルコールで４回抽出して、得られた抽
出液からエチジウムブロマイドを除去し、その後にＴＥ
緩衝液に対して透析して、Ｄ　Ｎ　Ａ　’ＩＱ度５０μ
ｇ／ｎｕのプラスミドｐＡＧ１の透析完了液１　ｍｌを
得た。得られたプラスミドｐＡＧ１を解析して得られた
制限酵素地図を第６図に示す。

（ロ）プラスミドｐＡＧ１の試験管内ＤＮＡ組換え前記
工程（イ）で調製したプラスミドｐＡＧ１のＤ　Ｎ　Ａ
　０．５μｇに対して、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ
を加え、５０ｍＭ１・リス−１１（１（ｐｌ＋７．４　
）、１０ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４．　１００ｍＭ　Ｎａ（ｌの
緩衝液ｄｏｔｔｌ中テ、３７℃にて２時間反応させた。

その後７０℃で１０分間加熱して反応を停止させた。こ
の反応液２０ｎｕと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガー
ゼにソボンジーン社購入）とを、５０ｍＭ１・す、２．
−１１ｃ　！ｔ　（ｐＨ７，４）、ｌ　ＯｍＭ　Ｍｇｆ
ｌ！ｚ　、１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペル
ミジン、１ｍＭ八Ｔへ。

０．１　ｍｇ／　ｍＩＢ　Ｓ　Ａ　　（Ｂｏｖｉｎｅ　
ｓｅｒｕｍ　ａｌｕｂｕｍｉｎ　Ｘベゼスダ・リサーチ
・ラボラトリ−社、米国より購入）の緩衝液５０μβ中
で、１５°Ｃにて一晩反応させた。

（ハ）プラスミドｐＡＧ１４の取得 前記工程（ロ）で作成したプラスミドρＡＧＩ由来の組
換えＤＮＡにより、コリネバクテリウム・メラセコラ（
Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ　）２２２４３（微工研条寄第５６０号）のプラス
ミドキュアート株を形質転換した。得られたテトラサイ
タリン耐性形質転換株の保有するプラスミドを解析する
ことにより、プラスミドｐＡＧ１４を取得した。以下上
記実験について詳しく説明する。

（プラスミドのキユアリング） コリネバクテリウム・メラセコラ（並ユ匹ユｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　２２２４３（
ｉ工研条寄第５６０号）をＬＧ培地（トリ１Ｉ・ン１０
ｇ、酵母エキス５　ｇ、　　Ｎａ（／！　５　ｇ−グル
コース２ｇ、ｐＬｒ７．２．ユ調整は培地、５□、コ耳
金耳植菌占、３７°Ｃで一晩振盪培養した。この培養液
を無菌水で希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地に１．５重
量％寒天を添加した培地）に塗布し、３２℃で２日間培
養した。生したコロニー１００個を取り、テトラサイク
リン１０μｇ／ｍβを含有するＬ　Ｇ寒天培地に釣菌し
た。３２℃で２０間培養してテトラサイクリン感受性株
を選択した。得られた２株のテトラサイタリン感受性株
について、前記と同様なプラスミドの単離法によりプラ
スミ）’ｐ／Ｉｃｌの存在を調べた。その結果得られた
２株のテトラナイクリン感受性株は、いずれもプラスミ
ドを保持していなかった。これらの一方の株を以後の形
質転換実験の宿主として用いた。

（形質転換） コリネバクテリウム・メラセコラ（他り日！−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　２２２４３
（ｍ工研条寄第５６０号）より前記の操作で分離したプ
ラスミドキュアート株を、前記半合成培地で３２℃、１
２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍｆｆを同じ半合
成培地５０ｍ１に植菌して３２℃で振盪した。日立製作
所製分光光度計（２２８型）で波長６６０ｎｍにおける
培養物の吸光度（ＯＤ）を測定し、０’Ｄが０．２にな
った時点で培養液にペニシリンＧを０．３単位／ｍｌｌ
の濃度になるように添加した。

これを更に３２℃で１．５時間培養を続けた。

その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ、カザ
ミノ酸１０ｇ、酵母エキス１０　ｇ　、　Ｋ２ＨＰＯ４
０，３５ｇ、にＨｚＰ０４０．１５　ｇ、シュークロー
ス１．３７ｇ、Ｎ−）リス（ハイドロキシメチル）メチ
ル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔ　ＥＳ　：　Ｎ　
−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）　ｍｅｔｈ
ｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａ
ｃｉｄ）　　５．７３　ｇ、　　ＭｇＣｊ２ｚ　０．９
５　ｇ、　　ＣａＣｌ２１．１１ｇを純水に溶かして１
Ｎとし、Ｎａ０ＩＩでｐＨ７，２に調整した培地〕　５
ＩＩに懸濁した。この菌懸濁液４．５ｍｌに、３■／ｌ
Ｉ＋７！濃度のりゾチウムを含有するＲ培地（ミリポア
フィルタ−で除菌した）０．５ｍｊ！を添加して、３５
℃で５時間静置反応させてプロトプラスト化細胞を形成
せしめた。

プロトプラスト化した細胞を７．００Ｏｒｐｍ（４５０
０ｇ　）、５℃、７分間で遠心分離して回収し、Ｒ培地
５ｍｌに懸濁した。同様の懸濁及び遠心分離の操作を更
にもう一度行った後、Ｒ培地５　ｍｌに再懸濁してプロ
トプラスト懸濁液とした。

前記工程（ロ）で得られたりガーゼ反応液５゜ｐｉｔと
２倍濃度ＴＳＭＣ液（ＴＳＭＣ液は、ＴＥＳ２５ｍＭ、
シュークロース０．４Ｍ、　　Ｍ３Ｃ１，ｌ　ＯｍＭ、
ＣａＣｌ　２３０ｍＭを含み、Ｎａ０１ｌでｐｌ＋７．
２に調整した水溶液である）５０μｌとの混合液を上記
プロトプラスト懸濁液０．５ｍｊ！に添加混合した。そ
の後火にＰＥＧ液ＣＴＳＭＣ液にポリエチレングリコー
ル６０００（ｒ’ｏｌｙｅＬｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏ
ｌ　６０００）を４０％（Ｗ／Ｖ）濃度に溶解する）１
．５ｍ／を添加してゆるやかに混和し、２分間室温で静
置した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ：Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌ　１
ｄｏｎｅ）　４０　ｇ　／　４２を添加したもの）　　
５　ｍｌ！を添加して、４．００Ｏｒｐｍ（１８００ｇ
）でｉｏ分間遠心分離して上澄液を除去した。同様の懸
濁及び遠心分離をもう一度繰返してプロトプラストを洗
浄した後、得られたプロトプラストを０．５ｍｆｆ（７
）１７−ＰＶＰ液でゆるやかに懸濁した。懸濁液を３時
間、３０℃に保った後、Ｒ−ＰＶＰ液で希釈し、一定量
をテトラサイタリフ１０μ 培地（重層寒天培地を用いる。下層寒天培地は、Ｒ培地
にｐｖｐ４０ｇ／ｆｆ、寒天１５ｇ／ｌを添加して作成
する。上層寒天培地は、ＰＶＰ４０ｇ／ｌ１、寒天６ｇ
／ｌを添加して作成する。プロトプラスト懸濁液を溶け
た上層寒天培地３１１１１と混合して、下層寒天培地上
に重層する）に植菌し、３２℃で４日間培養した。

培地上に出現したテトラサイタリン耐性形質転換株から
任意に１０株を選び、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｇ
濃度を含むＬＧ寒天培地上で純化した後、前記工程（イ
）でプラスミドｐＡＧ１を分離したのと実質的に同様の
方法により、各菌株からプラスミドを分離した。各プラ
スミドＤ　Ｎ　Ａ　０．　５μｇに対して、前記実施例
１工程（６）と実質的に同様の方法により、各プラスミ
ド分子中の各制限酵素切断部位を決定した。その結果、
プラスミドｐＡＧ１４を取得した。プラスミドｐＡＧ１
４の制限酵素地図を第８図に示す。

このプラスミドＤＮＡを用いて、前記と同様な方法で、
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　２２２４
３（（ｉｌ工研条寄第５６０号）のプラスミドキュアー
ト株を形質転換した。得られたテトラサイクリン耐性株
について、それらが保有するプラスミドを解析した結果
、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比べて、制
限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミｌ：であっ
た。

（ニ）プラスミドｐＡＧ１４からのテトラサイクリン耐
性逍伝子を含むＤＮＡ断片の分離 前記工程（ハ）で調製したプラスミドｐＡＧ１４のＤＮ
Ａ２０μｇに対して、１００単位の制限酵素Ｂａｍ１ｌ
　＋及びＢｇｌ　ＩＩをそれぞれ加えて、１０ｍＭ）リ
ス１Ｉ（１！　（ｐＨ７、４）　、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ
イ５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！、１ｍＭジチオトレイトールの
緩衝液１００ｍＪ中で、３７℃にて２時間反応させた。

消化した試料は、前記実施例１工程（６）と実質的に同
様の方法により、１％アガロースゲル電気泳動に供した
。ただし、ベゼスダ・リサーチ・ラボラドリース社、米
国より購入したＬＭＰアガロースを使用し、４°Ｃで電
気泳動した。次に、エチジウムブロマイドで染色後、染
色したアガロースを紫外線照射下に置き、テトラサイク
リン耐性遺伝子を含む約３．１キロベースのＤＮＡ断片
の存在を確認し、その付近のアガロースゲルを切り出し
た。切り出したアガロースゲルにその重量の３倍量のＴ
Ｅ緩衝液を加えて、６５℃で１０分間保持し、アガロー
スゲルを完全にとかした。次に、得られた溶液に等容の
フェノールを添加して、攪拌の後、水層を回収した。回
収した水層に等容のフェノール・クロロポルム（１：　
１）液を添加して、攪拌の後、水層を回収した。回収し
た水層に等容のクロロポルムを添加して、攪拌の後、水
層を回収した。回収した水層に酢酸ナトリウムを最終濃
度３００ｍＭになるように添加し、更に２倍容のエタノ
ールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３時間保持した。

その後、１０．００Ｏｒｐｍ（９，０００ｇ　）で室温
で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈澱を回収し、減圧
乾燥した。

（ホ）プラスミドｐＡＧ３　　の調製と制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１処理 前記工程（イ）と同様の方法により、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅ、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ’
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　２２２２０（Ｆａ工研条
寄第５５９号）から分離精製したプラスミドｐＡＧ３の
ＤＮＡ４μｇに対して、２０単位の制限酵素Ｂａｍ１ｌ
　ｌを加えて、１０ｍＭトリス−ＨＣｊ！　（ｐＨ７、
４）　、１０ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４．５０ｍＭ　ＮａＣ１，
１ｍＭジチオトレイトールを含む緩衝液１００μβ中で
、３７℃にて２時間反応させた。そこへ等容のフェノー
ル・クロロホルム（１：１）液を添加して攪拌の後、水
層を回収した。

回収した水層に等容のクロロホルムを添加して、攪拌の
後、水層を回収した。そごへ酢酸ナトリウムを最終ｔＨ
度３００ｍＭになるように加え、次に２倍容のエタノー
ルを添加して、−３０℃にて３時間保持した後、１２．
００Ｏｒｐｍ（８９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離
してＤＮへの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した。

（へ）プラスミドｐＡＧ５０の取得 前記工程（ニ）、（ホ）で調製したそれぞれのＤＮＡ全
量と３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５０ｍＭ
Ｉ・リス−〇Ｃ１（ｐ！１７．４）　、１０ｍＭＭｇＣ
１ｚ　、１０ｍＭジチオトレイｌ−−ル、１ｍＭスペル
ミジン、１ｍＭＡＴＰ、０．１ｕｇ／ｍｎＢｓＡの緩衝
液５０μβ中で、１５°Ｃにて一晩反応させた。

その後７０°Ｃにて１０分間加熱して反応を停止させた
。

得られたりガーゼ反応液５０μｌを用いて、前記工程（
ハ）と実質的に同様の形質転換操作によりコリネバクテ
リウム・メラセコラ　（垣■匹−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　８０１（微工研条寄第５
５８号）のテトラサイクリン耐性形質転換株を取得した
。ただし、再生培地による培養は、７日間とした。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株について前記工程
〔イ粘実質的に同様の方法により、８株の保有するプラ
スミドを分離し、前記実施例１工程（６）と実質的に同
様の方法によりぞれぞれのプラスミドを解析した結果、
プラスミドｐＡＧ５０を取得することができた。このプ
ラスミドの制限酵素地図を第９図に示す。

このプラスミ）”　Ｄ　Ｎ　Ａを用いて、前記と同様な
方ンｈでコリネバクテリウム・メラセコラ　（Ｃｏｒｙ
ｎｅ−ｂａｃＬｅｒｉｕｍ　ｍｃｌａｓｓｅｃｏｌａ　
）　８０１（［’Ａ工研条寄第５５８号）を、形質転換
した。得られたテトラサイクリン耐性形質転換株につい
て、それらが保有するプラスミドを解析した結果、それ
らのプラスミドは、供与プラスミドと比べて制限酵素切
断様式で同一と判定されるプラスミドであった。

（２）プラスミドｐＡＧ５０への約３．３キロベースの
ＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の組込み前記実施
例３工程（１）で調節したプラスミドｐＡＧ５０のＤＮ
Ａ５　Ｎｇに対して、制限酵素５ａｉｌを１５単位加え
て、５０ｍＭ）リス−１１（Ｊ　（ｐｌ＋７．４　＞、
１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ、１００ｍＭ　ＮａＣｊ！を含む
緩衝液６０μβ中で、３７℃にて２時間反応させた。そ
の後、７０°Ｃで１０分間加熱して、反応を停止させた
。

この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになる様
に加え、２倍容のエタノールを添加して、−３０℃にて
３時間保持した。次に１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００
ｇ　）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈澱を回収
し、減圧乾燥した。得られたＤＮＡ試料をＢＡＰＴ緩衝
液（５０ｍＭＩ−リス−１１（１、、ｐＨ８，４＞２０
０μｌに溶解し、バクチリアル・アルカリ・ホスファタ
ーゼ（ＢａｃＬｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造株式会社より購入）を１単
位添加して６５℃にて３０分間反応させた。更に同じ酵
素を１単位添加して、６５℃で３０分間反応させた。

その後、反応液にＴ　Ｎ　Ｅ　９７４衝液で飽和した等
容のフェノールを加え、混合した弧、１２．０００　ｒ
ｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離して水
層を回収し、更にもう１回同じ条件でフェノールを加え
、遠心分離し水層を回収した。次に回収した水層に等容
のフェノール・クロロホルム（１：１、ｖ　／　ｖ　）
液を添加して混合した後、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９
００ｇ　）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。更
に水層に等容のクロロボルムを添加して攪拌した後、１
２．００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ　）で１０分間遠心分
離し、水層を回収した。該水層に酢酸ナトリウムを最終
濃度３００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノールを
添加し攪拌した後、−３０℃にて３時間保持した。その
後、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ　）で１０分間
遠心分離し、ＤＮＡ沈澱を回収し、これを減圧乾燥した
。得られたＤＮＡ全量と前記実施例１工程（８）で調製
したＤＮＡ１μｇと３単位のＴ、ファージＤＮＡリガー
ゼにソボンジーン社より購入）とを、５０ｍＭＩ・リス
−ＩＩＣ＃　（ｐＨ７、４）、１０ｍＭ　ＭＩ！（Ｊ！
ｚ　、１０ｍＭジチオトレイ１−−ル、１ｍＭスペルミ
ジン、１ｍＭ　ＡＴ　Ｐ、　　０．１　ｍｇ／　ｍｌｌ
　　ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉ
ｎ）（ベゼスダリサーチラボラ）　ＩＪ−社、米国より
購入）を含む緩衝液５０μβ中で、１５“Ｃにて一晩反
応させた。その後、７０℃にて１０分間加熱することに
より、反応を停止させた。

（３１ＰＥＰＣ産生遺伝子を含有した複合プラスミドρ
ΔＧ２００１の取得。

コリネバクテリウム・メラセコラ　（Ｃｙ１咀。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅ！ａｓｓｅｃｏｌａ　）　８
０１（ｍ工研条寄第５５８号）を前記半合成培地で３２
℃、１２時間振盪培養し、その培養液０．５ｎｌを同じ
半合成培地゛５０ｍ６に植菌して３２°Ｃで振盪培養し
た。日立製作所製分光光度計（２２８型）で波長６６０
ｎｍにおける培養物の吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが
０．２になった時点で培養液にペニシリンＧを０．３単
位／ｍ７！の濃度になるように添加した。これを更に３
２℃で１．５時間培養を続けた。

その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ１カザ
ミノ酸１０ｇ１酵母エキス１０　ｇ　１に２１１ＰＯ４
０，３５ｇ、Ｋｌｌ□ｐｏ４０．１５　ｇ、シュークロ
ース１．３７ｇ、Ｎ−）リス（ハイドロキシメチル）メ
チル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ：Ｎ−Ｔｒ
ｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅ　Ｌｈｙ　１）　−ｍｅ　ｔ
ｈｙ　１１−２−ａ　１ｎｏｅ　ｔｈａｎｅｓｕ　Ｉ　
ｆｏｎ　１ｃａｃｉｄ）　　５．７３　ｇ、　　ＭｇＣ
４２ｚ　　０．９５　ｇ、　　Ｃａ（１２゜１、１１　
ｇを純水に溶かして１１とし、Ｎａ０１１でｐｌＴ７．
２に調整した培地３５　ｍｌに懸濁した。得られた懸濁
液４．５ｍｌに、３ｍｇ／ｍｌ濃度のりゾチウムを含有
するＲ培地（ミリポアフィルタ−で除菌した）０．５ｍ
ｊ！を添加して、３５℃で５時間静置反応させてプロト
プラスト化した細胞を形成せしめた。プロトプラスト化
した細胞を７．００Ｏｒｐｍ（４５００ｇ）　、５℃、
７分間で遠心分離して回収し、Ｒ培地５１Ｙ１１に懸濁
した、同様の遠心分離操作を更にもう一度行なった後、
Ｒ培地５１Ｉｌｌに再懸濁してプロトプラス１−懸濁液
とした。前記実施例３工程（２）で得られたりガーゼ反
応液５０μｌと２倍濃度ＴＳＭＣＷＬ（ＴＳＭＣ液は、
ＴＩＥＳ２５．ｍＭ、シュークロース０．４Ｍ、　　Ｍ
ｇｃｌｚ　　１０ｍＭ、ＣａＣ４２ｚ　３０ｍＭを含み
、Ｎａ０ｌｌでｐＨ７，２に調整した水溶液である）５
０μｌとの混合液を上記プロトプラスト懸濁液０．５ｎ
／！に添加混合した。その後火にＰＥＧ液（ＴＳＭＣ液
にポリエチレングリコール６、０００　（Ｐｏｌｙ−ｅ
ｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　６０００）を４０％（
ｗ　／　ｖ　）　濃度に溶解する）１．５ｍＱに添加し
てゆるやかに混和し、２分間室温で静置した。その後Ｒ
−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニルピロリドン（ｔ’ＶＰ
：Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）　４
０　ｇ　／　ｌを添加したもの。３５ｍｊ！添加して、
４．００Ｏｒｐｍ（１８００ｇ　）で室温で１０分間遠
心分離して上澄液を除去した。同様の懸濁及び遠心分離
をもう一度繰返してプロトプラストを洗浄した後、得ら
れたプロトプラストを０．５ｍｌのＲ−ＰＶＰ液でゆる
やかに懸濁した。懸濁液３時間、３０℃に保った後Ｒ−
ＰＶＰ液で希釈し、一定量をテトラサイタリン１０μｇ
７ｍｌ濃度を含む再生培地（重層寒天培地を用いる。下
層寒天培地は、Ｒ培地に４０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／βを
添加して作成する。上層寒天培地は、ＰＶＰ４０ｇ／ｌ
、寒天６ｇ／ｌを添加して作成する。プロトプラスト懸
濁液を溶けた上層寒天培地３　ｍ（ｌと混合して、下層
寒天培地上に重層する）に植菌し、３２℃で７日間培養
した。

このようにして得られたテトラサイクリン耐性形質転換
株を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｊ！を含むＬＧ寒
天培地（Ｌ−寒天培地にグルコース５ｇ／ｌを添加した
培地）上で純化した後、各菌株から前記実施例３工程（
１）と実質的に同様の方法により、プラスミドを分離し
、前記実施例１工程（６）の方法によりそれらのプラス
ミドを解析した。

その結果、プラスミドｐＡＧ２００１を取得した。プラ
スミドｐＡＧ２００１は、第１０図に示した様に、プラ
ＰＩ！ＰＣ産生遺伝子を含む約３．３キロベースのＤＮ
Ａ断片が組込まれた複合プラスミドである。

（４）プラスミドｐＡＧ２００１保有菌株のＰＥＰＣ活
性の測定 プラスミドｐＡＧ２００１を保有するコリネバクテリウ
ム０メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１を、テトラサイクリン１
０μｇ／ｍｌ！含有の前記糖蜜培地５０Ｉｌｌｌ中で、
３２℃にて一晩振盪培養した。ただし、プラスミド非保
持株は、テト　。

ラサイクリン無添加で培養した。この培養液より集菌し
、０．８％ＮａＣ１水溶液２０ｍｊ！で２回洗浄後、前
記ＭＩＥＳ緩衝液１０１Ｉ１１に懸濁した。これを、ブ
ラウン社製（西独）のＭＳＫセルホモジナイザー（８５
３０２１型）で処理して菌体を破砕しオこ後、１４００
０　ｒｐｍ　（２００００ｇ　）で室温で２０分間遠心
分離して、細胞抽出液（粗酵素液）を調製した。この細
胞抽出液を用いて、前記実施例１工程（５）と実質的に
同様の方法により、ＰＥＰＣ活性を測定した。その結果
を後述の工程（５）に記載の第４表に示す。

（５）プラスミドｐＡＧ５０への約１１．５キロベース
のＰＥＰＣ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の組込み前記実
施例３工程（１）−（へ）で調製したプラスミドｐＡＧ
５０のＤＮＡ５μｇに対して、制限酵素Ｘｂａ　　Ｉを
１５単位加えて、５０ｍＭ）リス−■Ｃ１（ｐＨ７，４
）　、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ、１００ｍＭ　ＮａＣｊ！
を含む緩衝液６０μｌ中で、３７°Ｃにて２時間反応さ
せた。その後、７０℃で１０分間加熱して、反応を停止
させた。この液に酢酸ナトリウムを最’ｐ６度３００ｍ
Ｍになる様に力■え、２倍容のエタノールを添加して、
−３０℃にて３時間保持した。次に１２．００Ｏｒｐｍ
（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離してＤＮＡ
沈澱を回収し、減圧乾燥した。得られたＤＮＡ試料をＢ
ＡＰＴ緩衝液（５０ｍＭｌ−リス−１１（１、ｐＨ８，
４）　２００μｌにン容解し、バクチリアル・アルカリ
・ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉ
ｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）　（宝酒造株式会社より
購入）を１単位添加して６５℃にて３０分間反応させた
。更に同じ酵素を１単位添加して、６５℃で３０分間反
応させた。その後、反応液にＴＮＥ緩衝液で飽和した等
容のフェノールを加え、混合した後、１２．０００　ｒ
ｐｍ（８，９００ｇ）で室温で１０分間遠心分離して水
層を回収し、更にもう１回同じ条件でフェノールを加え
遠心分離をし水層を回収した。次に回収した水層に等容
のフェノール・クロロホルム（１：　１．ｖ／ｖ）液を
添加して混合した後、１２．０００　ｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。更に回
収した水層に等容のクロロホルムを添加して攪拌した後
、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で１０分間遠心
分離し、水層を回収した。該水面に酢酸ナトリウムを最
終濃度３００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノール
を添加し攪拌した後、−３０℃にて３時間保持した。そ
の後、１２．０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）で室温で
１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈澱を回収し、これを減圧
乾燥した。

得られたＤＮＡ全量と前記実施例２工程（７）で調製し
たＤＮＡ１μｇと３単位のＴ、ファージＤＮＡリガーゼ
にソポンジーン社より購入）とを、５０ｍＭ）　’Ｊ　
ス−１１ｃ１２（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　Ｍｇ＋Ｊ
’ｚ、１０ｍＭジチオトレイトール、１１スペルミジン
、ｉｍＭ　Ａ　ＴＰ、　０．１＋ｖ／　ｍｌ　Ｂ　ＳＡ
　（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）　　（
ベゼスダリサーチラボラトリー社、米国より購入）を含
む緩衝液５０μｌ中で、１５℃にて一晩反応させた。そ
の後、７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を
停止させた。

（６１Ｐ　Ｅ　Ｐ　Ｃ産生遺伝子を含有した複合プラス
ミドｐＡＧ２００２の取得 前記実施例３工程（５）で得られたりガーゼ反応液を用
いてコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ　）　８０
１（微工研条寄第５５８号）を前記実施例３工程（３）
と実質的に同様の方法により形質転換してテトラサイク
リン耐性形質転換株を取得した。得られたテトラサイク
リン耐性形質転換株から該形質転換体が保有するプラス
ミドを前記実施例３工程（１）と実質的に同様の方法に
より分離し、前記実施例１工程（６）と同様の方法によ
って解析した。得られたプラスミドをｐＡＧ２００２と
命名した。プラスミドｐＡＧ２００２の制限酵素地図を
第１１図に示す。プラスミドｐＡｃ２００２は、第１１
図に示した様に、プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素Ｘｂ
ａ　Ｉ切断部位に、グルタミン酸体産性コリネバクテリ
ウム属細菌由来のＰＥＰＣ産生遺伝子を含む約１１．５
キロベースのＤＮＡ＠片が組込まれた複合プラスミドで
ある。

（７）　　プラスミドｐＡＧ２００２保有形質転換株の
ｐｇｐｃ活性の測定 プラスミドｐＡＧ２００２を保有するコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１を実施例３工程（４）と
実質的に同様の方法で培養し、得られた菌体から細胞抽
出液（粗酵素液）を調製した。この細胞抽出液を用いて
、前記実施例１工程（５）と実質的に同様の方法により
、ＰＣＰＣ活性を測定した。その結果を実施例３工程（
４）で得られた結果とともに、プラスミドｐＡＧ５０を
保有する株及びプラスミドを保有しない株についての結
果と比較して第４表に示す。

第４表から明らかなように、プラスミドｐＡＧ２００１
を保有する細胞とプラスミドｐＡＧ２００２を保有する
細胞は、プラスミドｐＡＧ５０を保有する細胞とプラス
ミドを保有しない細胞に比べて、高いｐ　ｒ：　ｐ　ｃ
活性を有していた。

尚、プラスミドを保有していないコリネノで・７′テリ
ヤム・メラセフラ８０１はテトラサイクリン無添加培地
で培養した。

第４表 注１）第１表の注１）と同じ。

注２）コリネバクテリウム・メラセコラ（７−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕａ＋　ｔａｅｌａｓｓ’ｅｃｏＩａ　）８０１
ｇ本菌株は＼微生物工業技術研究所に、徽工研条寄第５
５８号として寄託されている。

尚、本文中で用いた制限酵素の名称は、次の菌株から得
られる制限酵素の略称である。

ＢｃｏＲＩ：エシェリヒア・コリ　ＲＹ１３（１！５ｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＲＹ　１３　）Ｂａｍ
ｌｌｌ：バチルス・アミロリクエファシェンスＨ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ａｍ　Ｉｏｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓ　
Ｈ）Ｂｇｌ　ＩＩ　：　バチルス・グロビギイ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ旦坦山ｙｉｉ　） １１ａｅｌｌｌ：　ヘモフィラス・エジプティウス（Ｈ
ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ａｅ　　Ｌｉｕｓ　）ＩＩｉｎ
ｄｌ［［：ヘモフィラス・インフルエンザＲｄ）（ｌＩ
ａｃｍｏｐｈＮｕｓ　１ｎｆｕｌｃｎｚａｅ　Ｒｄ）Ｐ
ｓＬＩ：プロビデンシア・スチュアーティー１６４（Ｐ
ｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　５ｔｕａｒＬｉｉ　１６４）Ｓ
ａｃ　Ｉ　：　ストレプトマイセス・アクロモゲネス（
ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
）Ｓａｌ　Ｉ　：ストレプトマイセス・アルバスＧ（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｓ　Ｇ）Ｘｂａ　１
　：キサントモナス・バドリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
　ｂａｄｒｉｉ）Ｘｈｏ　Ｉ　：キサントモナス・ホル
シコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｈｏｌｃｉｃｏｌａ
）（発明の効果） 本発明のＤＮＡ断片をグルタミン酸性産性コリネバクテ
リウム属細菌の宿主ベクター系で用いられるベクターに
組み込み組換え体ＤＮＡを作成し、その組換え体ＤＮＡ
でグルタミン酸性産性コリネバクテリウム属細菌を形質
転換すると、その細菌のＰＥＰＣ産生能力を高めること
ができ、その細菌は大量にＰＥＰＣを細胞内に生産する
ことができるようになる。前述のようにＴＣＡ回路にお
ける反応はＰＲＰＣの作用によって促進されその結果中
間体として有機酸を生成する。生成した中間体から様々
な所望のアミノ酸や核酸等が生産される。従って、ＰＥ
ＰＣ主ＰＣ力が増強した上記細菌を培養することにより
、上述のようなアミノ酸や核酸等を大量に生産すること
ができる。即ち、本発明のＤＮＡ断片はアミノ酸や核酸
等を大量に生産することのできるグルタミン酸化産生コ
リネバクテリウム属細菌を得るために有用である。

本発明の組換え体ＤＮＡは、ＤＮＡ断片（Ｂ）がコリネ
バクテリウム属細菌の宿主ベクター系で用いられるベク
ターを含むＤＮＡ断片である場合には、コリネバクテリ
ウム属細菌を形質転換するのに用いてアミノ酸や核酸等
を大量に生産することのできる前述のコリネバクテリウ
ム属細菌を得ることができる。一方、ＤＮＡ断片断片Ｃ
跡コリネバクテリウム属細菌以外の細菌、例えば、エシ
ェリヒア（ＩＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属、バチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍ
ｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の宿主ベクター系で
用いられるベクターを含むＤＮＡ断片である場合は本発
明のＤＮＡ断片の増幅に有利に用いることができる。

本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する細菌
である場合には、様々なアミノ酸や核酸等を大量に製造
するのに有用である。また、本発明の微生物がコリネバ
クテリウム属細菌以外の細菌である場合は、本発明のＤ
ＮＡ断片を増幅するのに直接用いること台できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＡＧ２０３の制限酵素地図である
。第２図は、プラスミドｐＡＧ２１１の制限酵素地図で
ある。第３図は、プラスミドｐＡＧ１０３の制限酵素地
図である。第４図は、プラスミドｐＡＧ２０４の制限酵
素地図である。第５図は、プラスミドρＡＧ２２１の制
限酵素地図である。第６図は、プラスミドｐＡＧ１の制
限酵素地図である。第７図は、プラスミドｐＡＧ３の制
限酵素地図である。第８図は、プラスミドｐＡＧ１４の
制限酵素地図である。第９図は、プラスミドｐＡＧ５０
の制限酵素地図である。第１０図は、プラスミドｐＡＧ
２００１の制限酵素地図である。第１１図は、プラスミ
ドｐＡＧ２００２の制限酵素地図である。 プラスミドの分子の長さは、キロベース（ｋｂ）で表示
しである。図中記号は、発明の詳細な説明に記した制限
酵素名であり、プラスミド上のその位置は、その制限酵
素切断部位を示す。その様にイ」した数字は、第１図、
第２図、第３図、第４図、第５図、第６図、第７図、第
８図、第９図、第１０図、第１１図において、それぞれ
制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、、　　Ｓａｌ　Ｉ　、ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ　、、　Ｘｂａｌ、１Ｉｉ
ｎｄＩＩ［、Ｘｂａ　Ｉ　％　Ｂａｍ）ｌ　Ｉ　％　Ｓ
ａｌ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉの切断部位を基準としたプラスミ
ド上での位置を、キロベースで表示したものである。ま
たＤＮＡ−（Ａ）　、ＤＮＡ−（Ｂ）、およびＤ　Ｎ　
Ａ−（Ｄ）は、それぞ転子を含むＤＮＡ断片を示しＤＮ
Ａ−（Ｃ）はＧ　Ｄ　Ｈ産生遺伝子を含む約５．４キロ
ベーノ、のＤＮＡ断片を示す。ｐＢＲ３２５−（Ａ）、
ρＢＲ３２５−（Ｂ）、ｐＢ１１３２５−　（Ｃ）およ
びｐｎＲ３２５−（Ｄ）はそれぞれＰｓｔ　ｌ　、　　
Ｓａｔ　ｒ　、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉで消化開環し
たプラスミドｐＢＲ３２５由来のＤＮＡ断片を示し、ｐ
ＡＧｉｏ３−　（Ａ）はプラスミドｐＡＧ１０３のＸｂ
ａ　ｌで開環したＤＮＡを示す。ｐＡＧ５０−（八）　
、ｐＡＧ５０−（Ｂ）は、それぞれ５ａｉｌ、Ｘｂａ　
Ｉで消化開環したブラスミＦ’ｐＡＧ５０のｌ）　Ｎ　
Ａを示す。 特許出願人　　旭化成工業株式会社 第１図 第２図 第３図 第５図 第１０図 第１ｔ図

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細菌由
   来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈ
   ｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙ
   ｌａｓｅ：ＰＥＰＣ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. （２）グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細菌由
   来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈ
   ｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙ
   ｌａｓｅ：ＰＥＰＣ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ
   ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断
   片（Ｂ）とを含む組換え体ＤＮＡ。
3. （３）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主−ベクター
   系で用いられるベクターを含有することを特徴とする特
   許請求の範囲第（２）項記載の組換え体ＤＮＡ。
4. （４）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コリ
   ネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるベクターを含
   有することを特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載
   の組換え体ＤＮＡ。
5. （５）グルタミン酸生産性コリネバクテリウム属細菌由
   来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈ
   ｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙ
   ｌａｓｅ：ＰＥＰＣ）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ
   ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断
   片（Ｂ）とを含む組換え体ＤＮＡを保有した細胞。
6. （６）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主−ベクター
   系で用いられるベクターを含有することを特徴とする特
   許請求の範囲第（５）項記載の細胞。
7. （７）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コリ
   ネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるベクターを含
   有することを特徴とする特許請求の範囲第（５）項記載
   の細胞。
8. （８）該細胞が、エシェリヒア属細菌であることを特徴
   とする特許請求の範囲第（５）項記載の細胞。
9. （９）該細胞が、グルタミン酸生産性コリネ型細菌であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（５）項記載の細
   胞。