JPS6279775A - 発酵法によるレートリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌に 関する。

従来の技術 Ｌ−）リプトファンは、アントラニル酸がアントラニル
酸ホスホリゴシルトランスフェラーゼ、Ｎ　−（５’−
ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ、インド
ール３−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファ
ンシンターゼの項に各酵素の作用を受け、生産されろ。

以下、Ｎ　−（５’−ホスホリボシル）アントラニル酸
イソメラーゼをＰＲＡＩ　、インドール３−グリセロー
ルリン酸シンターゼをＩ　ｎＧＰ　ト記ｆ。

一方、組換えＤＮＡ法を用いて、コリネ型細菌における
Ｌ−）リプトファン生産菌を育種することは、特開昭５
９−１５６２９２で報告てれているが、ＰＲＡＩ　−Ｉ
ｎＧＰをコードする遺伝子（以下、ＰＲＡＩ　−ｒｎＧ
Ｐ遺伝子と記す）が組込まれたものではない。

発明が解決しようとする問題点 この発明は、Ｌ−）リプトファンの生産性がより高い微
生物を得ること、及びそれによってＬ−トリプトファン
のより効率のよい製造法を見い出すことにある。

問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研究の結果
、コリネ型細菌細胞内で発現し、　ＰＲＡＩ−Ｉ　ｎＧ
Ｐをコードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換えＤＮＡ　
ｆｔ有するコリネ型細菌を分離することに成功し、得ら
れたコリネ型細菌がＬ−トリプトファンの高い生産性を
有することを見い出した。

本発明にいうコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎ＠ｆｏｒｍｂａ
ｃｔｅｒ１ａ　）　’ｄ、パーシース・マニエアルφオ
ブ・デターミネイティブ・ノ々クテリオロジー（Ｂａｒ
ｇａｙｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｒｎｉｎａｔ
ｉｖｓ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（
１９７４）Ｋ定義されている一群の微生物であり、好気
性、ダラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌
である。このよりなコリネ型細菌のうち特に以下に述べ
るよりなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明にお
いては、最も好ましいものである。

コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性法の例としては
次のようなものがあげられる。

ブレビバクテリウム・ディノ々リカタム　　　　　　　
ＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・サラカロリテ
ィクム　　　　　ＡＴＣＣ１４０６６プレピパクテリウ
ム・インマリオフイルム　　　　　ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム　　　　Ａ
ＴＣＣ１３８６９プレビペクテリウム・ロゼラム　　　
　　　　　　ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・
フラバム　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１３８２６プレ
ピパクテリウム・チオｒニタリス　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ１９２４０コリネバクテリウム・アセトアシドフィル
ム　　　　ＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・ア
セトグルタミクム　　　　　ＡＴＣＣ１５８０６コリネ
パクテリウム・カルナエ　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ
１５９９１コリネバクテリウム・グルタミクム　　　　
　　　　ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０コリネバクテ
リウム・リリウム　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１５９
９０コリネバクテリウム・メラセコーラ　　　　　　　
　ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニア
フィラム　　　　　ＡＴＣＣ１５３５４本発明のコリネ
型グルタミン酸生産性細萌には上記のようなグルタミン
酸生産性を有する野性法のほかにグルタミン酸生産性を
有するまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含″
！！れる。

ＰＲＡＩ−１ｎＧＰ遺伝子を単離する方法は、コリネ型
細菌のＰＲＡＩ　−ＩｎＧＰ遺伝子を有している株より
。

まず染色体遺伝子を抽出しく例えばＨ，Ｓａ［ｔｏ　ａ
ｎｄＫ、Ｍｉｕｒａ　Ｂｉｏｅｈｓｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ　７２　＊　６１９　＋（１９６３）の方法
が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断する。

ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るブーラスミド
ベクターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコリ
ネ型細菌のＰＲＡＩ　−ＩｎＧＰ遺伝子の欠損変異株を
形質転換せしめ、ＰＲＡＩ　−ＩｎＧＰ生成活性を保育
するにいたった菌株を単離し、これより　ＰＲＡＩ　−
１ｎＧＰ各遺伝子を分離できる。

染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間等を調節
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。

本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。

（１）　　ｐＡＭ３３０　　’ｆ！ｊ開昭５８−６７６
９９参照（２）　　ｐＡＭ１５１９　％開昭５８−７７
８９５参照（３）　　ｐＡＪ　６５５　　特開昭５８−
１９２９００参照（４）　　　ＰＡＪ　　６１１　　　
　　　　　　同　　上（５）　　　ｐＡＪ　　１８４４
　　　　　　　　　同　　上（６）　　ｐＣＧ　１　　
　特開昭５７−１３４５００参照（７）　　ｐＣＧ　２
　　　特開昭５８−３５１９７参照Ｃ３）ＰＣＧ　４　
　　特開昭５７−１８３７９９参照（９）　　　ｐｃｃ
　　１１　　　　　　　　　　同　　上プラスミドベク
ターＤＮＡの開裂は、当該ＤＮＡを一箇所で切断する制
限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制限酵
素を用いて部分的に切断することにより行う。

ベクターＤＮＡは染色体遺伝子を切断した際に、用いら
れた制限酵素により切断され、゛または染色体ＤＮＡ切
断フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞ
れの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体
ＤＮＡフラグメントとのライダーシ１ン反応に付される
。

このようにして得られた。染色体ＤＮＡとベクタープラ
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するＫは、エシェリヒア・コリに−１２について
報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。

Ｍ、ａｎｄ　Ｈｌｇａ、　Ａ、、　Ｊ、Ｍｏ１．、　Ｂ
ｌｏｌ、、　５３　、１５９（１９７０））受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
、またはバチルス・ズブチリスについて報告されている
様に（］）ｕｎｃａｎ＊Ｃ，Ｈ，ｒ　Ｗｉｌ＋ｏｎ、　
Ｇ、Ａａ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ＋　Ｆ、Ｅ、　ｅ　Ｇ＠
ｎｅ　ｐ　１　＋１５３（１９７７））細胞がＤＮＡを
取シ込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテント
セル）に導入する方法により可能である。あるいは、バ
チルス・ズブチリス、放１１−菌類および酵母について
知られている様に（Ｃｈａｎｇ＋Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｈｏ
ｅｎ＋　５−Ｎ−＃ＭｏＬｅｃ、Ｇｅｎ、＋Ｇｅｎｅｔ
ｚ　１６８＋　１１１（１９７９）　：Ｂｉｂｂ　＋　
Ｍ、　Ｊ、　＋　Ｗａｒｄ＋Ｊ−Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｐ
ｖｏｏｄ＊　Ｏ，Ａ、　＋Ｎａｔｕｒｅ　＋　２７４　
＋　３９８　（１９７８）　：　Ｔ（ｉｎｎａｎ　ｓ　
Ａ−＊Ｈ１ｅｋｓ　＊　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｆｉｎｋ
　＋　Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅ１．ＵＳＡ、７５．１９２９（１９７８））、ＤＮ
Ａ受容菌を、！ラスミドＤＮＡを容易に取り込むゾロド
プラストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをＤ
ＮＡ受容菌に導入することも可能である７ プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたは、／　ＩＪビ
ニルアルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡを
とり込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリ
コールまたはノリビニルアルコールの代りに、カルがキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾル
ロニツクＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡ
のとシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる
。

Ｌ−）リプトファン生産菌として、ＰＲＡＩ−ＩｎＧＰ
欠損株を宿主として形質転換した株を用いることができ
るが、以下に示すような宿主を用いればよｆｉ　Ｌ　−
トＩＪブトファンの生産性が高い菌株が得られることが
ある。

即ち、ブレビバクテリウム属の７エニルアラニン、チロ
シンを要求し、５−メチルトリプトファンに耐性を有す
る変異株（１，５ｈｉｉｏ　、　Ｈ，５ａｔｏ　１Ｍ、
　Ｎａｋａｇａｗａ、ｓ　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｌｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　３６　＊　２３１５（１９７２）　）、ブ
レビバクテリウム属の７エニルアラニンを要求し１ｍ−
フルオロフェニルアラニン％５−フルオロトリプトファ
ンに耐性を有する変異株（１，Ｓｈｉ　ｔｏ　＊　Ｓ、
　Ｓｕｇｌｍｏｔｏ　ａ　Ｍ、　Ｎａｋａｇａｖｒａ＊
　ａＡｇｒｉｃ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　３９
　、６２７（１９７５）　）、ブレビバクテリウム属の
チロシンヲ要求し、５−フルオロトリプトファン、アザ
セリンに耐性を有する変異株、コリネバクテリウム属の
７エニルアラニン、チロシンを要求し、５−メチルトリ
プトファン、４−メチルトリットファン、６−フルオロ
トリプトファン、トリプトファンヒドロキサメート、ｐ
−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロ＊ｔｌ−
ト、フェニルアラニンヒドロキサメートに耐性を有する
変異株（Ｈ，Ｈａｇｉｎｏ　ａ　Ｋ、　ＮａＫａｙａｍ
ａｓｓＡｇｒｌｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　３９，３
４５（１９７５））等がある。

このようにして得られたＬ−トリブトファン生産能を有
するコリネ型細菌を培養してＬ−トリプトファンを生成
蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌によるＬ　−ト
ＩＪシトファンの製造のために使用されて込た方法と特
に大きく違う点はない。

即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更
に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源トシては、グルコー
ス、シェフロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩ソの他が使用できる。

培養は好気的条件下で培地の−及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ　−トＩＪブトファンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。

実施例 （１）　　ＰＲＡＩ　−ＩｎＣＰ遺伝子を含む染色体Ｄ
ＮＡの調製ブレピノ々クテリウム・ラクトファーメンタ
ムＡＪ　１２０３６　（ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９　）をｌ
！のＣＭＧ培地（−Ｉ！プトン１１／ｄ１．酵母エキス
１１１／ｄｔ、グ考コース０、５　ｊ９／ｄ１．及びＮ
ａＣｔｏ、　５１／ｄｉを含み、−７，２に調整したも
の）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対
数増殖期の菌体を集めた。

この菌体ｔ　ＩＪゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、
通常のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出精
製し、最終的に３．５ダのＤＮＡを得た。

（２）ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてｐＡＪ　１８４４　（分子量５．４メガ
ダルトン）１に用い、そのＤＮＡを次の様にして調製し
た。

を１００ｄのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増殖期
後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理によシ溶
菌させ、３０，０００Ｘ、９．３０分の超遠心により上
清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタノールを
加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少量のＴＥＮ緩衝
液（２０ｍＭ　）　リス塩酸塩、２０　ｍＶ　ＮａＣｔ
、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐｉ（８，０）　）　Ｋ溶
解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出し
てｐＡＪ　１８４４プラスミドＤＮＡ約１５μＩを得た
。

（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ　１０μＩと（２）で得たプラスミドＤ
ＮＡ　５μＩとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩでそ
れぞれを３７℃に１時間保持し、切断した。

６５℃に１０分子り加熱した後、両反応液を混合し、Ａ
ＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮ
Ａ鎖を連結せしめた。ついで反応液を、６５℃にて５分
間加熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結さ
れたＤＮＡの沈＃を採取した。

（４）　　コロニーパンクの作成 アントラニル酸シンターゼが欠損したブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＡｓ　６０　（ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１２０３６ｔＲ株
として、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンにより変異処理することにより、アントラニル酸を
生育に要求する変異株として選択した。）を受容菌とし
て用いた。

形質転換の方法としては、プロトデラストトランスフォ
ーメーシ１ン法を用すた。まず、菌株を５１！ＬｌのＣ
’ＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培警シ、ペニシ
リンＧ　ｔ−０，６ユニツト／　ｍｌ　添加後、すらに
１．５時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌
体ｔ−０，５Ｍシェークロース％２０ｍＭマレイン酸、
２０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５４　イナッセイプロ
ス（Ｄｉｒｅｏ　）からなる島ＨＰ培地（ｐＨ６，５）
０．５ａｔ／で洗浄した。次いで１０雫匂のリゾチーム
を含むＳＭＶＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプ
ラスト化を図った。６０００Ｘｇ、１０分間遠心分離後
、プロトプラストをＳＭＶＰで洗浄し０、５　ｍｌのＳ
ＭＶＰ　Ｉｃ再度懸濁し九。この様にして得られたゾロ
ドプラストと（３）で調製したＤＮＡ　１０μＩ−ｆ　
５　ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が３０係になる様に添加した後、ＤＮ
Ａをプロトプラストに取り込ませるため室温に２分間放
置した。このプロトデラストヲＳＭＭＰ培地１　ｒｌｌ
で洗浄後、ＳＭＭＰ培地１ａＪ１７再懸濁し、形質発現
の之め％３０℃で２時間培養した。この培養液ｔ−ｐＨ
７，０のプロトプラスト再生培地上に塗布した。ゾロト
ゲラスト再生培地は蒸留水１ｔあたシトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン１２ｇ。

ＫＣｌ　０．５１１、グルコース１０１１．　ＭｇＣｌ
２・６Ｈ２０８−１１／　、ＣａＣｌ２−ｚＨ２ｏ　２
．２　Ｊ’−ペプトン４　ｙ、粉末酵母エキス４１カデ
ミノ酸（Ｄｉｒｅｏ社）１．９゜Ｋ２ＨＰＯ４０，２，
９、コハク豪ナトリウム１３５．９．寒天８ｇ及びクロ
ラムフェニコール３μｍ１／ｒｔｔｌを含む。

３０℃で２週間培養後、５００００個のクロラムフェニ
コール耐性コロニーが出現してきたのでこれを全てかき
あつめ、コロニーパンクを作成した。

（５）１７プトフアン生合成系遺伝子が増幅されたクロ
ーンの選択 コロニーパンクを適当に希釈したもの（約ｌＯ３〜１０
７ｍ／　）とアンピシリン耐性のプラスミドｐＵＣ８（
Ｍｅｓａｉｎｇ、Ｊ、　＊Ｇ＠ｎｏ　　１９　、、２５
９（１９８２））を有する大腸菌の生育にトリプトファ
ンを要求する変異株を最少培地（２４グルコース、１憾
硫酸アンモニウム、０．３４尿素、０．１４リン酸二水
素カリウム、０．０４１硫酸マグネシウム７水塩、２ｐ
ｐｍ鉄イオン、　２　ｐｐｍマンガンイオン、２００μ
Ｉ／！サイアミン塩酸塩、５０μＩ／！ビオチン、１０
μｌ／ｒｒｔｌ　／ロラムフェニコール、ｉｏｏμｂ勺
アンピシリン、３憾カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社裏）、１
００吟ｑアントラニル酸、ｐＨ７，０、寒天１．８係）
上に塗布した。

トリプトファン生合成某遺伝子が増幅され、トリデトフ
ァンが蓄積するようになった形質転換株の周辺には、ト
リプトファン要求性の大腸菌が増殖する。すると大腸菌
が保持しているプラスミドｐＵＣ８にコードされるβ−
ラクタマーゼによシ培地中のアンピシリンが分解され、
形質転換株はさらに増殖し、コロニーを作る。一方、ト
リプトファンを蓄積しない形質転換株は、その周辺に大
腸菌を増殖させない。したがってアンピシリンが分解さ
れないので、増殖できず、コロニーパンクしない。この
ような考えをもとに大腸菌とコロニーパンクを適当に希
釈したものとを混合して最少培地に塗布し、３０℃にて
４日間培養した０周囲に大腸菌が増殖しているコロニー
を釣り上げ、単コロニー分離し、（２）で用いた方法に
よりプラスミドを分離した。本プラスミドをｐＡＪ　２
３４と名付は念。

ｐＡＪ　２３４は明らかにベクターグラスミドｐＡＪ　
１８４４よりも犬きく、トリプトファン生合成系遺伝子
が挿入されてｂると考えられた。

（６）　　ｐＡＪ　２３４が有するトリプトファン生合
成系遺伝子の同定 （６）−１７ンスラニル酸ホスホリゼシルトランスフエ
ラーゼ（ＰＲＴ　）遺伝子、及びトリプト７アン合成陣
素（ＴＳ）遺伝子の同定 ＰＲＴ遺伝子、　ＴＳＡサブユニット遺伝子（以下ＴＳ
Ａ遺伝子と記す）％ＴＳＢサブユニット遺伝子（以下Ｔ
ＳＢ遺伝子と記す）が欠損した各菌株ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＴ１３（ＮＲＲＬＢ　−１５
３４Ｔ　）　、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム４２１．ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＢ５、ｐＡＪ　２３４を（４）で述べ九方法を用いて
形質転換した。３０℃にて１週間再生培地にて培養後生
じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞれ
１０個全釣り上げトスミド上にＰＲＴ遺伝子、ＴＳＡ遺
伝子、ＴＳＢ遺伝子が存在することが明らかになった。

（６）　−２ＰＲＡ／Ｉ　−ＩｎＧＰ遺伝子の同定大腸
菌ｔｒｐＣ欠損株ＣＧＳＣＡ　５８８９　（ｔｒｐＣ６
０゜ゴ２８７１匹１．狂咀５３１匹８．λ−）にｐＡＪ
　２３４を導入した。ＤＮＡ受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法を用いてｐＡＪ
　２３４を形質転換し、生じ之りロラムフェニルコール
耐生コロニーのうちそれぞれ１０個を釣り上げトリプト
ファン要求性を調べた。いずれもが要求性を消失してお
り、上記組換えプラスミド上にＰＲＡＩ−ＩｎＣＰ遺伝
子が存在することが明らかとなった。

（７）　　ＰＲＡＩ−ＩｎＧＰ遺伝子のサブクローニン
グｐＡＪ　２３４を組換えに用いた制限酵素ＰｓｔＩで
切断すると２．１ｋｂ　、　２．０ｋｂ　、　１．７５
ｋｂ　、　１．２　ｋｂ　。

０、８　ｋｂ　、　０．５　ｋｂの６種の挿入ＰｓｔＩ
断片が検出された。このうち２．ＯｋｂのＰｓｔＩ断片
を分画し、ｐＡＪ　１８４４のＰｓｔＩサイトに連結し
、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムＴ１３．Ｂ
　５　、Ａ２１及びｍ、　ｃｏｔｉ　ＣＧＳＣＡ　５８
８９　（江ハ９を形質転換し念。その結果、２．Ｏｋｂ
のＰｓｔＩ断片を有する組換プラスミドはＴ１３の要求
性を消失させたが、４２１、Ｂ５．及びＥ、　ｃｏｔｌ
ＣＧＳＣＡ　５８８９の要求性は消失させなかった。次
にこの２．０ｋｂのＰａｔＩ断片をＢｇｌで切断し１．
６　ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｇｔＵ断片をＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　
ａ　ＢａｍＨｌで切断したｐＡＪ　２２４に連結し、Ｔ
１３を形質転換したところ、その要求性は消失した。

従ってＰＲＴ遺伝子は１．６　ｋｂ　Ｑ’ＰｓｔＩ−Ｂ
ｇｔＩ［断片上に存在すると考えられる。

次に２．１　ｋｂ、のＰｓｔＩ断片をｐＡＪ　１８４４
のｐｓｔｌサイトに連結しブレビバクテリウムラクトフ
ァーメンタムＢ５に形質転換したところクロラムフェニ
コールを含む再生培地上に生じたコロニーはいＢ５及び
プレピノ々クテリウムラクトフアーメンタムＴｌ　３．
４２１　、　Ｅ、　ａｏｔｔ　ｃｃｓｃ　４５８８９　
（ＬｒｐＣ）を形質転換した。その結果Ｂ５の要求性は
消失したが、Ｔ１３．扁２１及びＥ、ｃｏｔｉの要求性
は消失しなかった。

従って２．１　ｋｂ、のＰｓｔＩ断片上にＴＳＢ遺伝子
が存在法によシ連結し、Ｅ、　ｃａｄｉ　ＣＧＳＣ４５
８８９の要求性を消失させる組換えプラスミドを得た。

本プラスミドは２．　Ｏｋｂと２．１ｋｂのＰｓｔＩ断
片を有しており、Ｔ１３．Ｂ５に形質転換したところい
ずれの要求性をも消失させた。

次にＰＲＡＩ−１ｎＧＰ遺伝子のサブクローニングを行
５ｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片を分画し５ａｔＩｓＥｃｏＲ
Ｉで切断したｐＵＣ１９（Ｍ＠ｓｓｉｎｇ＋Ｊｚ　ｅｔ
　ａｔ、　＋Ｇ１ｎ＠＋　３３１０３−１１９．１９８
５）に連結し、Ａａｃゾロし５ｓｔｌ　、　Ｈｌｎｄｎ
ｌで切断したｐＵＣ１８（Ｍ＊ａｉｌｎｇＪ／、　Ｓｓ
ｔ　ｍＡ、　ｓ　Ｇ＠ｎ＠　＊且、　１０３−１１９　
（１９８５））Ｋ連結しムＣプロモーターからの転写が
可能になるように配置し、Ｅ、　ｅｏｔｉ　ＣＧＢＣＡ
　５８８９　’に形質転換した。その結果、Ｓｓｔ　Ｉ
−ＥｅｏＲＩ断片、或いはＳｓｔ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ｍ断
片を有する組換えプラスミドは、Ｅ＊　ｅ　ｏＬ　ｉの
要求性を消失させた。

以上の結果からＰＲＴ遺伝子、ＰＲＡＩ−ＩｎＧＰ遺伝
子、４士示す位誼に存在していると考えられる＠尚ＰＲ
Ｔ遺伝子のサブクローニングの除用いたプラスミドｐＡ
Ｊ　２２４は以下の禄にして造成した。

ｐＡＪ　２２４はトリメトプリム耐性を有するベクター
プラスミドｐＡＪ　２２８から造成した。ｐＡＪ　２２
８の造成は以下の通シである。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１２
０３６よシ変異誘導さｎ７’ｊ）リメトプリム耐性変異
株ＡＪ　１２１４６（ＦＥＲＭ−Ｐ７６７２　）から（
７）で述べた方フリスミド 法により染色体ＤＮＡを調製した。一方、ζベクターも
シ六キーｐＡＭ　３３０金保有するブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９から（２）
で述べた方法によりｐＡＭ　３３０を調製した。

次に、染色体ＤＮＡ２０μＩとＰＡＭ　３３０１０μｇ
とを制限エンドヌクレアーゼ■）ＯＩでそｎぞ２１１３
７℃、３０分間処理し、部分切断した。６５℃、１０分
の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジテオスレ
イトール存在下、Ｔ４ファージ由米のＤＮＡ　リガーゼ
によって１０℃、２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った
。６５℃、５分の熱処理後、反応液ＩＣ２倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のＤＮＡ　１ｉ−沈澱採取
した。

ＤＮＡの沈澱を適当量ＴＥＮバッファーに溶解後、トリ
メトゲリム感受性のＡＪ　１２０３６　ｔ−受容菌とし
て、形質転換に用いた。

形質転換の方法としては、（４）で述べた方法を用いた
。トリメトプリム（Ｓｌｇｍａ社）　２５　ｐｇ／ｍｌ
を含む再生培地にて、３０℃で１週間培養後、約１００
個のコロニーが出現してきたので、これをトリメトゲリ
ム５０μｍ１７ｍ１　を含む最小培地にレプリカし、ト
リメトプリム耐性１株を得た。

この株の有するプラスミドＤＮＡを検出したところ、ベ
クターのｐＡＭ　３３０よりも明らかに大きなプラスミ
ドが検出された。

このプラスミドをｐＡＪ　２２８と名付け、再度ＡＪ１
２０３６を形質転換した。

生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ１０個を釣シ上げアガ・−Ａ”ａ泳動法によシブラ
スミドＤＮＡを検出し念ところ、これらのいずれにもｐ
ＡＪ　２２８と同じ大きさのプラスミドが存在していた
。上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現
する遺伝子が存在するシである。

ｐＡＪ　２１１より制限酵素Ｐｓｔ　Ｉによる部分切断
で切シ出した２、９ｋｂのＤＮＡ断片の両端にＢａｍＨ
Ｉ　＊　５ａｔＩ　５ＰｓｔＩの切断部位ｔ−４った第
１図に示したような合成オリがヌクレオチドリンカーを
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用いて連結させた
後、制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。得られたＤＮＡ混
合物をアがロース・ｒルミ気泳動にかけ、約２．９ｋｂ
のＤＮＡ断片を分離抽出し、エタノール沈澱によりＤＮ
Ａ断片を回収した。こうして得られたＤＮＡ断片は２．
９ｋｂの皿遺伝子を含むＤＮＡの両端にＰａｔｌ、５ａ
ｔ１　ｅＢａｍｂｉの切断部位が並んだ構造になってい
る。

ｐＡＪ　２１１　ｔｒｉ　ｐＡＪ　１８４４　（Ｄ　Ｐ
ｓｔＩ　ｆ　イ）　Ｉｃ　２．９　ｋｂのＨＫ　（ホモ
セリンキナーゼ）遺伝子を有するＰｓｔＩ断片が挿入さ
れたものでＡＪ　１２０７９　（ＦＥＲＭ−Ｐ７２３７
　）として寄託されている。

一方、ｐＡＪ　２２８は制限酵素ＭｂｏＩで部分切断し
た後６５℃、１０分の熱処理をした。この反応液に前述
の方法で得７’ｊ）ＩＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片全加え
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＤＮＡ鎖の連結反応を行った。

反応後、６５℃、５分の熱処理をし、２倍容・のエタノ
ールの添加により沈澱採取されるＤＮＡを、（４）と同
様の方法によシトリメトグリム感受性で、かつ、ＨＫ遺
伝子が欠損したブレビバクテリウム、・ラクトファーメ
ンタムＡＪ　１２０７８を受容菌としてグロトデラスト
ランス７オーメーシ１ンヲ行っり後、トリメトプリム１
００μｍ１７ｍ１を含むプロトプラスト再生培地で培養
した結果約２００個の再生コロニーが出現してきた。

これをトリメトプリムを２００μＩ／ｒｔｔｌを含み受
容菌の要求物質であるスレオニンを含まない最少培地に
レプリカし、トリメトグリム耐性で、かつスレオニン要
求性が消失した菌株４株を得た。これらの株よシ（２）
に示した方法によシ溶菌液を調製し、アガロース・ｒル
ミ気泳動によりプラスミドＤＮＡを検出したところ１４
．９ｋｂ、１２．２ｋｂ。

９．６　ｋｂ　、　６．５　ｋｂのプラスミドが検出さ
れた。このうち最も分子量の小さい６．５　ｋｂのプラ
スミドをｐＡＪ　２１２と名付けた。ｐＡＪ　２１２　
ｉ保持する株を１２０７８−　［株と名付けた。

ＰＡＪ　２１２は、ＰｓｔＩで切断することＫより皿遺
伝子を除いて、ｐＡＪ　２２４として、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１２１９６　（ＦＥ
ＲＭ　−Ｐ４Ｏ１０）として寄託されている。

（８）　　ＰＲＡ４−ＩｎＣＰ遺伝子のブレビ／譬りテ
リウム内で複製可能なベクターへの移し変え （８）　−１，９ＡＪ　８２の造成 ｐＡＪ　４３　（特開昭５８−１９２９００）５μｌに
０．２５ユニツトの制限酵素Ｈｐａｆｆを３７℃、５分
間反応させた。一方ｐＵＢ　１１０　（Ｇｒｙｃｚａｎ
　＃　Ｔ、Ｊ、　ａｔａｔＪ、Ｂａａｔｅｒｉｏｌ、、
　１３４．３１８（１９７８））５μＩＩＫ５ユニツト
のＨｐ　ａ　ＩＩを３７℃、１２０分間反応させた。

両者を混合後、（３）の方法によシ連結し、ＡＪ　１２
０３６Ｋ（４）の方法を用いて形質転換した。

クロラムフェニコール３μｇ／ａｔ、カナマイシン生シ
たコロニーの中からクロラムフェニコール感ｐＡＪ　２
３５’を制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｈ１ｎｄｎｌ、Ｐｓｔｌ
、Ｂｇｔ■等で２．０ 切断し約−ｋｂのＰＲＡＩ−ＩｎＧＰ遺伝子を有するＤ
ＮＡ断片が挿入されていることを確認した。

（９）形質転換株のトリプトファン生産能（８）−２で
得た形質転換株ＡＪ　１２２５８　（ＦＥＲＭ　Ｐ−Ｑ
）ｔｙｙｏ　のトリプトファン生産能を調べ九ところ第
１表に示す結果を得た。

培養はトリプトファン生産培地（グルコース１３０．９
　、　（ＮＨ４）２８０４２５　、Ｐ、フマル酸１２１
酢酸３　ｍ／　、　ＫＨ２ＰＯ４１，９、Ｍｎ５Ｏ４−
ｒＨ２０１０１９。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１１１，ｄ−ビオチン５０μｉ、
サイアミン塩酸塩２０００μ９、メチオニン４００■、
チロシン６５０ｍ９、大豆蛋白酸加水分解液「味液」５
０１ｊＬｌ　−ＣａＣＯ３５０＆　？水１ノに含む、ｐ
ｉｌ　６．５　、　）２０１１／を５００ｒＩＬｌの坂
ロフラスコに入ｎたものに被検菌株を植えつけ、３０℃
にて７２時間、振盪下に行なりた。培養後、遠心上清中
のＬ−）！Ｊブトファンをロイコノストック・メセント
ロイデス（Ｌ＠ｕｃｏｎｏａｔｏｃ　ｍｅｓ＠ｎｔ＠ｒ
ｏｉｄａｓ　）　ＡＴＣＣ８０４２を定量菌株として用
いるバイオアッセイ法によって求めた。

第１表　形質転換株のＬ　−）　ＩＪブトファン蓄積量
尚、Ｍ２４７を得るためには寄託されたＡＪ１２２５８
（ＦＥＲＭ　ｐ−’ｄｌ＋”７０　）よシ宿主細胞を損
うことなく宿主細胞中の複合グラスミドを除去すること
が可能である。即ち、プラスミドは宿主よシ自然に失な
われることもあるし、「除去」操作によって除くことも
できる（　Ｂａｃｔ、Ｒ＠ｖ、、　３６．　ｐ３６１−
４０５カナマイシンを含有し又は含有しないＣＭＧ寒天
培地に塗布し、３０℃で１〜３日間培養する。かくして
感受性株として分離される株がＭ２４７である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネ型細菌細胞内で発現し、Ｎ−（５−ホスホ
   リボシル）アンスラニル酸イメソラーゼ−インドール−
   ３−グリセロールリン酸合成酵素をコードする遺伝子が
   コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドベクターに
   接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌。