JPS6279775A - 発酵法によるレートリプトファンの製造法 - Google Patents
発酵法によるレートリプトファンの製造法Info
- Publication number
- JPS6279775A JPS6279775A JP60221592A JP22159285A JPS6279775A JP S6279775 A JPS6279775 A JP S6279775A JP 60221592 A JP60221592 A JP 60221592A JP 22159285 A JP22159285 A JP 22159285A JP S6279775 A JPS6279775 A JP S6279775A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- gene
- paj
- strain
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、組換えDNAを有するコリネ型細菌に
関する。
従来の技術
L−)リプトファンは、アントラニル酸がアントラニル
酸ホスホリゴシルトランスフェラーゼ、N −(5’−
ホスホリボシル)アントラニル酸イソメラーゼ、インド
ール3−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファ
ンシンターゼの項に各酵素の作用を受け、生産されろ。
酸ホスホリゴシルトランスフェラーゼ、N −(5’−
ホスホリボシル)アントラニル酸イソメラーゼ、インド
ール3−グリセロールリン酸シンターゼ、トリプトファ
ンシンターゼの項に各酵素の作用を受け、生産されろ。
以下、N −(5’−ホスホリボシル)アントラニル酸
イソメラーゼをPRAI 、インドール3−グリセロー
ルリン酸シンターゼをI nGP ト記f。
イソメラーゼをPRAI 、インドール3−グリセロー
ルリン酸シンターゼをI nGP ト記f。
一方、組換えDNA法を用いて、コリネ型細菌における
L−)リプトファン生産菌を育種することは、特開昭5
9−156292で報告てれているが、PRAI −I
nGPをコードする遺伝子(以下、PRAI −rnG
P遺伝子と記す)が組込まれたものではない。
L−)リプトファン生産菌を育種することは、特開昭5
9−156292で報告てれているが、PRAI −I
nGPをコードする遺伝子(以下、PRAI −rnG
P遺伝子と記す)が組込まれたものではない。
発明が解決しようとする問題点
この発明は、L−)リプトファンの生産性がより高い微
生物を得ること、及びそれによってL−トリプトファン
のより効率のよい製造法を見い出すことにある。
生物を得ること、及びそれによってL−トリプトファン
のより効率のよい製造法を見い出すことにある。
問題点を解決するための手段
本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研究の結果
、コリネ型細菌細胞内で発現し、 PRAI−I nG
Pをコードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換えDNA
ft有するコリネ型細菌を分離することに成功し、得ら
れたコリネ型細菌がL−トリプトファンの高い生産性を
有することを見い出した。
、コリネ型細菌細胞内で発現し、 PRAI−I nG
Pをコードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換えDNA
ft有するコリネ型細菌を分離することに成功し、得ら
れたコリネ型細菌がL−トリプトファンの高い生産性を
有することを見い出した。
本発明にいうコリネ型細菌(Coryn@formba
cter1a ) ’d、パーシース・マニエアルφオ
ブ・デターミネイティブ・ノ々クテリオロジー(Bar
gaysManual of Deterrninat
ivs Bacteriology)第8版599頁(
1974)K定義されている一群の微生物であり、好気
性、ダラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌
である。このよりなコリネ型細菌のうち特に以下に述べ
るよりなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明にお
いては、最も好ましいものである。
cter1a ) ’d、パーシース・マニエアルφオ
ブ・デターミネイティブ・ノ々クテリオロジー(Bar
gaysManual of Deterrninat
ivs Bacteriology)第8版599頁(
1974)K定義されている一群の微生物であり、好気
性、ダラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌
である。このよりなコリネ型細菌のうち特に以下に述べ
るよりなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明にお
いては、最も好ましいものである。
コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性法の例としては
次のようなものがあげられる。
次のようなものがあげられる。
ブレビバクテリウム・ディノ々リカタム
ATCC14020ブレビバクテリウム・サラカロリテ
ィクム ATCC14066プレピパクテリウ
ム・インマリオフイルム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム A
TCC13869プレビペクテリウム・ロゼラム
ATCC13825ブレビバクテリウム・
フラバム ATCC13826プレ
ピパクテリウム・チオrニタリス ATC
C19240コリネバクテリウム・アセトアシドフィル
ム ATCC13870コリネバクテリウム・ア
セトグルタミクム ATCC15806コリネ
パクテリウム・カルナエ ATCC
15991コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032,13060コリネバクテ
リウム・リリウム ATCC159
90コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC17965ミクロバクテリウム・アンモニア
フィラム ATCC15354本発明のコリネ
型グルタミン酸生産性細萌には上記のようなグルタミン
酸生産性を有する野性法のほかにグルタミン酸生産性を
有するまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含″
!!れる。
ATCC14020ブレビバクテリウム・サラカロリテ
ィクム ATCC14066プレピパクテリウ
ム・インマリオフイルム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム A
TCC13869プレビペクテリウム・ロゼラム
ATCC13825ブレビバクテリウム・
フラバム ATCC13826プレ
ピパクテリウム・チオrニタリス ATC
C19240コリネバクテリウム・アセトアシドフィル
ム ATCC13870コリネバクテリウム・ア
セトグルタミクム ATCC15806コリネ
パクテリウム・カルナエ ATCC
15991コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032,13060コリネバクテ
リウム・リリウム ATCC159
90コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC17965ミクロバクテリウム・アンモニア
フィラム ATCC15354本発明のコリネ
型グルタミン酸生産性細萌には上記のようなグルタミン
酸生産性を有する野性法のほかにグルタミン酸生産性を
有するまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含″
!!れる。
PRAI−1nGP遺伝子を単離する方法は、コリネ型
細菌のPRAI −InGP遺伝子を有している株より
。
細菌のPRAI −InGP遺伝子を有している株より
。
まず染色体遺伝子を抽出しく例えばH,Sa[to a
ndK、Miura Bioehsm、Biophys
、Acta 72 * 619 +(1963)の方法
が使用できる。)、これを適当な制限酵素で切断する。
ndK、Miura Bioehsm、Biophys
、Acta 72 * 619 +(1963)の方法
が使用できる。)、これを適当な制限酵素で切断する。
ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るブーラスミド
ベクターに接続し、得られた組換えDNAを用いてコリ
ネ型細菌のPRAI −InGP遺伝子の欠損変異株を
形質転換せしめ、PRAI −InGP生成活性を保育
するにいたった菌株を単離し、これより PRAI −
1nGP各遺伝子を分離できる。
ベクターに接続し、得られた組換えDNAを用いてコリ
ネ型細菌のPRAI −InGP遺伝子の欠損変異株を
形質転換せしめ、PRAI −InGP生成活性を保育
するにいたった菌株を単離し、これより PRAI −
1nGP各遺伝子を分離できる。
染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間等を調節
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。
(1) pAM330 ’f!j開昭58−676
99参照(2) pAM1519 %開昭58−77
895参照(3) pAJ 655 特開昭58−
192900参照(4) PAJ 611
同 上(5) pAJ 1844
同 上(6) pCG 1
特開昭57−134500参照(7) pCG 2
特開昭58−35197参照C3)PCG 4
特開昭57−183799参照(9) pcc
11 同 上プラスミドベク
ターDNAの開裂は、当該DNAを一箇所で切断する制
限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制限酵
素を用いて部分的に切断することにより行う。
99参照(2) pAM1519 %開昭58−77
895参照(3) pAJ 655 特開昭58−
192900参照(4) PAJ 611
同 上(5) pAJ 1844
同 上(6) pCG 1
特開昭57−134500参照(7) pCG 2
特開昭58−35197参照C3)PCG 4
特開昭57−183799参照(9) pcc
11 同 上プラスミドベク
ターDNAの開裂は、当該DNAを一箇所で切断する制
限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制限酵
素を用いて部分的に切断することにより行う。
ベクターDNAは染色体遺伝子を切断した際に、用いら
れた制限酵素により切断され、゛または染色体DNA切
断フラグメント及び切断されたベクターDNAのそれぞ
れの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体
DNAフラグメントとのライダーシ1ン反応に付される
。
れた制限酵素により切断され、゛または染色体DNA切
断フラグメント及び切断されたベクターDNAのそれぞ
れの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体
DNAフラグメントとのライダーシ1ン反応に付される
。
このようにして得られた。染色体DNAとベクタープラ
スミドとの組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するKは、エシェリヒア・コリに−12について
報告されている様な(Mandel。
スミドとの組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するKは、エシェリヒア・コリに−12について
報告されている様な(Mandel。
M、and Hlga、 A、、 J、Mo1.、 B
lol、、 53 、159(1970))受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法
、またはバチルス・ズブチリスについて報告されている
様に(])uncan*C,H,r Wil+on、
G、Aa and Young+ F、E、 e G@
ne p 1 +153(1977))細胞がDNAを
取シ込み得る様になる増殖段階(いわゆるコンピテント
セル)に導入する方法により可能である。あるいは、バ
チルス・ズブチリス、放11−菌類および酵母について
知られている様に(Chang+S、 and Cho
en+ 5−N−#MoLec、Gen、+Genet
z 168+ 111(1979) :Bibb +
M、 J、 + Ward+J−M、 and Hop
vood* O,A、 +Nature + 274
+ 398 (1978) : T(innan s
A−*H1eks * J、 B、 and Fink
+ G、R,、Proc、 Natl、 Acad。
lol、、 53 、159(1970))受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法
、またはバチルス・ズブチリスについて報告されている
様に(])uncan*C,H,r Wil+on、
G、Aa and Young+ F、E、 e G@
ne p 1 +153(1977))細胞がDNAを
取シ込み得る様になる増殖段階(いわゆるコンピテント
セル)に導入する方法により可能である。あるいは、バ
チルス・ズブチリス、放11−菌類および酵母について
知られている様に(Chang+S、 and Cho
en+ 5−N−#MoLec、Gen、+Genet
z 168+ 111(1979) :Bibb +
M、 J、 + Ward+J−M、 and Hop
vood* O,A、 +Nature + 274
+ 398 (1978) : T(innan s
A−*H1eks * J、 B、 and Fink
+ G、R,、Proc、 Natl、 Acad。
Se1.USA、75.1929(1978))、DN
A受容菌を、!ラスミドDNAを容易に取り込むゾロド
プラストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをD
NA受容菌に導入することも可能である7 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57−183799に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたは、/ IJビ
ニルアルコールと二価金属イオンとの存在下にDNAを
とり込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリ
コールまたはノリビニルアルコールの代りに、カルがキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾル
ロニツクF68(セルパ社)などの添加によってDNA
のとシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる
。
A受容菌を、!ラスミドDNAを容易に取り込むゾロド
プラストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをD
NA受容菌に導入することも可能である7 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57−183799に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたは、/ IJビ
ニルアルコールと二価金属イオンとの存在下にDNAを
とり込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリ
コールまたはノリビニルアルコールの代りに、カルがキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾル
ロニツクF68(セルパ社)などの添加によってDNA
のとシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる
。
L−)リプトファン生産菌として、PRAI−InGP
欠損株を宿主として形質転換した株を用いることができ
るが、以下に示すような宿主を用いればよfi L −
トIJブトファンの生産性が高い菌株が得られることが
ある。
欠損株を宿主として形質転換した株を用いることができ
るが、以下に示すような宿主を用いればよfi L −
トIJブトファンの生産性が高い菌株が得られることが
ある。
即ち、ブレビバクテリウム属の7エニルアラニン、チロ
シンを要求し、5−メチルトリプトファンに耐性を有す
る変異株(1,5hiio 、 H,5ato 1M、
Nakagawa、s Agric、 Blol、
Chem、 36 * 2315(1972) )、ブ
レビバクテリウム属の7エニルアラニンを要求し1m−
フルオロフェニルアラニン%5−フルオロトリプトファ
ンに耐性を有する変異株(1,Shi to * S、
Suglmoto a M、 Nakagavra*
aAgric、 Blol、 Chem、 、 39
、627(1975) )、ブレビバクテリウム属の
チロシンヲ要求し、5−フルオロトリプトファン、アザ
セリンに耐性を有する変異株、コリネバクテリウム属の
7エニルアラニン、チロシンを要求し、5−メチルトリ
プトファン、4−メチルトリットファン、6−フルオロ
トリプトファン、トリプトファンヒドロキサメート、p
−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロ*tl−
ト、フェニルアラニンヒドロキサメートに耐性を有する
変異株(H,Hagino a K、 NaKayam
assAgrlc、Biol、Chem、、 39,3
45(1975))等がある。
シンを要求し、5−メチルトリプトファンに耐性を有す
る変異株(1,5hiio 、 H,5ato 1M、
Nakagawa、s Agric、 Blol、
Chem、 36 * 2315(1972) )、ブ
レビバクテリウム属の7エニルアラニンを要求し1m−
フルオロフェニルアラニン%5−フルオロトリプトファ
ンに耐性を有する変異株(1,Shi to * S、
Suglmoto a M、 Nakagavra*
aAgric、 Blol、 Chem、 、 39
、627(1975) )、ブレビバクテリウム属の
チロシンヲ要求し、5−フルオロトリプトファン、アザ
セリンに耐性を有する変異株、コリネバクテリウム属の
7エニルアラニン、チロシンを要求し、5−メチルトリ
プトファン、4−メチルトリットファン、6−フルオロ
トリプトファン、トリプトファンヒドロキサメート、p
−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロ*tl−
ト、フェニルアラニンヒドロキサメートに耐性を有する
変異株(H,Hagino a K、 NaKayam
assAgrlc、Biol、Chem、、 39,3
45(1975))等がある。
このようにして得られたL−トリブトファン生産能を有
するコリネ型細菌を培養してL−トリプトファンを生成
蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌によるL −ト
IJシトファンの製造のために使用されて込た方法と特
に大きく違う点はない。
するコリネ型細菌を培養してL−トリプトファンを生成
蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌によるL −ト
IJシトファンの製造のために使用されて込た方法と特
に大きく違う点はない。
即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更
に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源トシては、グルコー
ス、シェフロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩ソの他が使用できる。
に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源トシては、グルコー
ス、シェフロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩ソの他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地の−及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にL −トIJブトファンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。
つ、実質的にL −トIJブトファンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。
実施例
(1) PRAI −InCP遺伝子を含む染色体D
NAの調製ブレピノ々クテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ 12036 (FERM−P7559 )をl
!のCMG培地(−I!プトン11/d1.酵母エキス
111/dt、グ考コース0、5 j9/d1.及びN
aCto、 51/diを含み、−7,2に調整したも
の)に植菌し、30℃で約3時間振盪培養を行ない、対
数増殖期の菌体を集めた。
NAの調製ブレピノ々クテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ 12036 (FERM−P7559 )をl
!のCMG培地(−I!プトン11/d1.酵母エキス
111/dt、グ考コース0、5 j9/d1.及びN
aCto、 51/diを含み、−7,2に調整したも
の)に植菌し、30℃で約3時間振盪培養を行ない、対
数増殖期の菌体を集めた。
この菌体t IJゾチーム・SDSで溶菌させたのち、
通常のフェノール処理法によシ、染色体DNAを抽出精
製し、最終的に3.5ダのDNAを得た。
通常のフェノール処理法によシ、染色体DNAを抽出精
製し、最終的に3.5ダのDNAを得た。
(2)ベクターDNAの調製
ベクターとしてpAJ 1844 (分子量5.4メガ
ダルトン)1に用い、そのDNAを次の様にして調製し
た。
ダルトン)1に用い、そのDNAを次の様にして調製し
た。
を100dのCMG培地に接種し、30℃で対数増殖期
後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理によシ溶
菌させ、30,000X、9.30分の超遠心により上
清を得た。フェノール処理ののち、2容のエタノールを
加えてDNAを沈澱回収した。これを少量のTEN緩衝
液(20mM ) リス塩酸塩、20 mV NaCt
、 1 mM EDTA (pi(8,0) ) K溶
解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出し
てpAJ 1844プラスミドDNA約15μIを得た
。
後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理によシ溶
菌させ、30,000X、9.30分の超遠心により上
清を得た。フェノール処理ののち、2容のエタノールを
加えてDNAを沈澱回収した。これを少量のTEN緩衝
液(20mM ) リス塩酸塩、20 mV NaCt
、 1 mM EDTA (pi(8,0) ) K溶
解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出し
てpAJ 1844プラスミドDNA約15μIを得た
。
(3)染色体DNA断片のベクターへの挿入(1)で得
た染色体DNA 10μIと(2)で得たプラスミドD
NA 5μIとを制限エンドヌクレアーゼPstIでそ
れぞれを37℃に1時間保持し、切断した。
た染色体DNA 10μIと(2)で得たプラスミドD
NA 5μIとを制限エンドヌクレアーゼPstIでそ
れぞれを37℃に1時間保持し、切断した。
65℃に10分子り加熱した後、両反応液を混合し、A
TP及びジチオスレイトール存在下、T4ファージ由来
のDNAリガーゼによって10℃に24時間保持しDN
A鎖を連結せしめた。ついで反応液を、65℃にて5分
間加熱し、反応液に2倍容のエタノールを加えて連結さ
れたDNAの沈#を採取した。
TP及びジチオスレイトール存在下、T4ファージ由来
のDNAリガーゼによって10℃に24時間保持しDN
A鎖を連結せしめた。ついで反応液を、65℃にて5分
間加熱し、反応液に2倍容のエタノールを加えて連結さ
れたDNAの沈#を採取した。
(4) コロニーパンクの作成
アントラニル酸シンターゼが欠損したブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAs 60 (ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 12036tR株
として、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジンにより変異処理することにより、アントラニル酸を
生育に要求する変異株として選択した。)を受容菌とし
て用いた。
ム・ラクトファーメンタムAs 60 (ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 12036tR株
として、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジンにより変異処理することにより、アントラニル酸を
生育に要求する変異株として選択した。)を受容菌とし
て用いた。
形質転換の方法としては、プロトデラストトランスフォ
ーメーシ1ン法を用すた。まず、菌株を51!LlのC
’MG液体培地で対数増殖期の初期まで培警シ、ペニシ
リンG t−0,6ユニツト/ ml 添加後、すらに
1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌
体t−0,5Mシェークロース%20mMマレイン酸、
20mM塩化マグネシウム、3.54 イナッセイプロ
ス(Direo )からなる島HP培地(pH6,5)
0.5at/で洗浄した。次いで10雫匂のリゾチーム
を含むSMVP培地に懸濁し30℃で20時間プロトプ
ラスト化を図った。6000Xg、10分間遠心分離後
、プロトプラストをSMVPで洗浄し0、5 mlのS
MVP Ic再度懸濁し九。この様にして得られたゾロ
ドプラストと(3)で調製したDNA 10μI−f
5 mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30係になる様に添加した後、DN
Aをプロトプラストに取り込ませるため室温に2分間放
置した。このプロトデラストヲSMMP培地1 rll
で洗浄後、SMMP培地1aJ17再懸濁し、形質発現
の之め%30℃で2時間培養した。この培養液t−pH
7,0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。ゾロト
ゲラスト再生培地は蒸留水1tあたシトリス(ヒドロキ
シメチル)アミノメタン12g。
ーメーシ1ン法を用すた。まず、菌株を51!LlのC
’MG液体培地で対数増殖期の初期まで培警シ、ペニシ
リンG t−0,6ユニツト/ ml 添加後、すらに
1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌
体t−0,5Mシェークロース%20mMマレイン酸、
20mM塩化マグネシウム、3.54 イナッセイプロ
ス(Direo )からなる島HP培地(pH6,5)
0.5at/で洗浄した。次いで10雫匂のリゾチーム
を含むSMVP培地に懸濁し30℃で20時間プロトプ
ラスト化を図った。6000Xg、10分間遠心分離後
、プロトプラストをSMVPで洗浄し0、5 mlのS
MVP Ic再度懸濁し九。この様にして得られたゾロ
ドプラストと(3)で調製したDNA 10μI−f
5 mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30係になる様に添加した後、DN
Aをプロトプラストに取り込ませるため室温に2分間放
置した。このプロトデラストヲSMMP培地1 rll
で洗浄後、SMMP培地1aJ17再懸濁し、形質発現
の之め%30℃で2時間培養した。この培養液t−pH
7,0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。ゾロト
ゲラスト再生培地は蒸留水1tあたシトリス(ヒドロキ
シメチル)アミノメタン12g。
KCl 0.511、グルコース1011. MgCl
2・6H208−11/ 、CaCl2−zH2o 2
.2 J’−ペプトン4 y、粉末酵母エキス41カデ
ミノ酸(Direo社)1.9゜K2HPO40,2,
9、コハク豪ナトリウム135.9.寒天8g及びクロ
ラムフェニコール3μm1/rttlを含む。
2・6H208−11/ 、CaCl2−zH2o 2
.2 J’−ペプトン4 y、粉末酵母エキス41カデ
ミノ酸(Direo社)1.9゜K2HPO40,2,
9、コハク豪ナトリウム135.9.寒天8g及びクロ
ラムフェニコール3μm1/rttlを含む。
30℃で2週間培養後、50000個のクロラムフェニ
コール耐性コロニーが出現してきたのでこれを全てかき
あつめ、コロニーパンクを作成した。
コール耐性コロニーが出現してきたのでこれを全てかき
あつめ、コロニーパンクを作成した。
(5)17プトフアン生合成系遺伝子が増幅されたクロ
ーンの選択 コロニーパンクを適当に希釈したもの(約lO3〜10
7m/ )とアンピシリン耐性のプラスミドpUC8(
Mesaing、J、 *G@no 19 、、25
9(1982))を有する大腸菌の生育にトリプトファ
ンを要求する変異株を最少培地(24グルコース、1憾
硫酸アンモニウム、0.34尿素、0.14リン酸二水
素カリウム、0.041硫酸マグネシウム7水塩、2p
pm鉄イオン、 2 ppmマンガンイオン、200μ
I/!サイアミン塩酸塩、50μI/!ビオチン、10
μl/rrtl /ロラムフェニコール、iooμb勺
アンピシリン、3憾カザミノ酸(Difco社裏)、1
00吟qアントラニル酸、pH7,0、寒天1.8係)
上に塗布した。
ーンの選択 コロニーパンクを適当に希釈したもの(約lO3〜10
7m/ )とアンピシリン耐性のプラスミドpUC8(
Mesaing、J、 *G@no 19 、、25
9(1982))を有する大腸菌の生育にトリプトファ
ンを要求する変異株を最少培地(24グルコース、1憾
硫酸アンモニウム、0.34尿素、0.14リン酸二水
素カリウム、0.041硫酸マグネシウム7水塩、2p
pm鉄イオン、 2 ppmマンガンイオン、200μ
I/!サイアミン塩酸塩、50μI/!ビオチン、10
μl/rrtl /ロラムフェニコール、iooμb勺
アンピシリン、3憾カザミノ酸(Difco社裏)、1
00吟qアントラニル酸、pH7,0、寒天1.8係)
上に塗布した。
トリプトファン生合成某遺伝子が増幅され、トリデトフ
ァンが蓄積するようになった形質転換株の周辺には、ト
リプトファン要求性の大腸菌が増殖する。すると大腸菌
が保持しているプラスミドpUC8にコードされるβ−
ラクタマーゼによシ培地中のアンピシリンが分解され、
形質転換株はさらに増殖し、コロニーを作る。一方、ト
リプトファンを蓄積しない形質転換株は、その周辺に大
腸菌を増殖させない。したがってアンピシリンが分解さ
れないので、増殖できず、コロニーパンクしない。この
ような考えをもとに大腸菌とコロニーパンクを適当に希
釈したものとを混合して最少培地に塗布し、30℃にて
4日間培養した0周囲に大腸菌が増殖しているコロニー
を釣り上げ、単コロニー分離し、(2)で用いた方法に
よりプラスミドを分離した。本プラスミドをpAJ 2
34と名付は念。
ァンが蓄積するようになった形質転換株の周辺には、ト
リプトファン要求性の大腸菌が増殖する。すると大腸菌
が保持しているプラスミドpUC8にコードされるβ−
ラクタマーゼによシ培地中のアンピシリンが分解され、
形質転換株はさらに増殖し、コロニーを作る。一方、ト
リプトファンを蓄積しない形質転換株は、その周辺に大
腸菌を増殖させない。したがってアンピシリンが分解さ
れないので、増殖できず、コロニーパンクしない。この
ような考えをもとに大腸菌とコロニーパンクを適当に希
釈したものとを混合して最少培地に塗布し、30℃にて
4日間培養した0周囲に大腸菌が増殖しているコロニー
を釣り上げ、単コロニー分離し、(2)で用いた方法に
よりプラスミドを分離した。本プラスミドをpAJ 2
34と名付は念。
pAJ 234は明らかにベクターグラスミドpAJ
1844よりも犬きく、トリプトファン生合成系遺伝子
が挿入されてbると考えられた。
1844よりも犬きく、トリプトファン生合成系遺伝子
が挿入されてbると考えられた。
(6) pAJ 234が有するトリプトファン生合
成系遺伝子の同定 (6)−17ンスラニル酸ホスホリゼシルトランスフエ
ラーゼ(PRT )遺伝子、及びトリプト7アン合成陣
素(TS)遺伝子の同定 PRT遺伝子、 TSAサブユニット遺伝子(以下TS
A遺伝子と記す)%TSBサブユニット遺伝子(以下T
SB遺伝子と記す)が欠損した各菌株ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムT13(NRRLB −15
34T ) 、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム421.ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムB5、pAJ 234を(4)で述べ九方法を用いて
形質転換した。30℃にて1週間再生培地にて培養後生
じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞれ
10個全釣り上げトスミド上にPRT遺伝子、TSA遺
伝子、TSB遺伝子が存在することが明らかになった。
成系遺伝子の同定 (6)−17ンスラニル酸ホスホリゼシルトランスフエ
ラーゼ(PRT )遺伝子、及びトリプト7アン合成陣
素(TS)遺伝子の同定 PRT遺伝子、 TSAサブユニット遺伝子(以下TS
A遺伝子と記す)%TSBサブユニット遺伝子(以下T
SB遺伝子と記す)が欠損した各菌株ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムT13(NRRLB −15
34T ) 、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム421.ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムB5、pAJ 234を(4)で述べ九方法を用いて
形質転換した。30℃にて1週間再生培地にて培養後生
じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞれ
10個全釣り上げトスミド上にPRT遺伝子、TSA遺
伝子、TSB遺伝子が存在することが明らかになった。
(6) −2PRA/I −InGP遺伝子の同定大腸
菌trpC欠損株CGSCA 5889 (trpC6
0゜ゴ2871匹1.狂咀531匹8.λ−)にpAJ
234を導入した。DNA受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してDNAの透過性を増す方法を用いてpAJ
234を形質転換し、生じ之りロラムフェニルコール
耐生コロニーのうちそれぞれ10個を釣り上げトリプト
ファン要求性を調べた。いずれもが要求性を消失してお
り、上記組換えプラスミド上にPRAI−InCP遺伝
子が存在することが明らかとなった。
菌trpC欠損株CGSCA 5889 (trpC6
0゜ゴ2871匹1.狂咀531匹8.λ−)にpAJ
234を導入した。DNA受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してDNAの透過性を増す方法を用いてpAJ
234を形質転換し、生じ之りロラムフェニルコール
耐生コロニーのうちそれぞれ10個を釣り上げトリプト
ファン要求性を調べた。いずれもが要求性を消失してお
り、上記組換えプラスミド上にPRAI−InCP遺伝
子が存在することが明らかとなった。
(7) PRAI−InGP遺伝子のサブクローニン
グpAJ 234を組換えに用いた制限酵素PstIで
切断すると2.1kb 、 2.0kb 、 1.75
kb 、 1.2 kb 。
グpAJ 234を組換えに用いた制限酵素PstIで
切断すると2.1kb 、 2.0kb 、 1.75
kb 、 1.2 kb 。
0、8 kb 、 0.5 kbの6種の挿入PstI
断片が検出された。このうち2.OkbのPstI断片
を分画し、pAJ 1844のPstIサイトに連結し
、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムT13.B
5 、A21及びm、 coti CGSCA 58
89 (江ハ9を形質転換し念。その結果、2.Okb
のPstI断片を有する組換プラスミドはT13の要求
性を消失させたが、421、B5.及びE、 cotl
CGSCA 5889の要求性は消失させなかった。次
にこの2.0kbのPatI断片をBglで切断し1.
6 kbのPstI−BgtU断片をP s t I
a BamHlで切断したpAJ 224に連結し、T
13を形質転換したところ、その要求性は消失した。
断片が検出された。このうち2.OkbのPstI断片
を分画し、pAJ 1844のPstIサイトに連結し
、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムT13.B
5 、A21及びm、 coti CGSCA 58
89 (江ハ9を形質転換し念。その結果、2.Okb
のPstI断片を有する組換プラスミドはT13の要求
性を消失させたが、421、B5.及びE、 cotl
CGSCA 5889の要求性は消失させなかった。次
にこの2.0kbのPatI断片をBglで切断し1.
6 kbのPstI−BgtU断片をP s t I
a BamHlで切断したpAJ 224に連結し、T
13を形質転換したところ、その要求性は消失した。
従ってPRT遺伝子は1.6 kb Q’PstI−B
gtI[断片上に存在すると考えられる。
gtI[断片上に存在すると考えられる。
次に2.1 kb、のPstI断片をpAJ 1844
のpstlサイトに連結しブレビバクテリウムラクトフ
ァーメンタムB5に形質転換したところクロラムフェニ
コールを含む再生培地上に生じたコロニーはいB5及び
プレピノ々クテリウムラクトフアーメンタムTl 3.
421 、 E、 aott ccsc 45889
(LrpC)を形質転換した。その結果B5の要求性は
消失したが、T13.扁21及びE、cotiの要求性
は消失しなかった。
のpstlサイトに連結しブレビバクテリウムラクトフ
ァーメンタムB5に形質転換したところクロラムフェニ
コールを含む再生培地上に生じたコロニーはいB5及び
プレピノ々クテリウムラクトフアーメンタムTl 3.
421 、 E、 aott ccsc 45889
(LrpC)を形質転換した。その結果B5の要求性は
消失したが、T13.扁21及びE、cotiの要求性
は消失しなかった。
従って2.1 kb、のPstI断片上にTSB遺伝子
が存在法によシ連結し、E、 cadi CGSC45
889の要求性を消失させる組換えプラスミドを得た。
が存在法によシ連結し、E、 cadi CGSC45
889の要求性を消失させる組換えプラスミドを得た。
本プラスミドは2. Okbと2.1kbのPstI断
片を有しており、T13.B5に形質転換したところい
ずれの要求性をも消失させた。
片を有しており、T13.B5に形質転換したところい
ずれの要求性をも消失させた。
次にPRAI−1nGP遺伝子のサブクローニングを行
5stl−EcoRI断片を分画し5atIsEcoR
Iで切断したpUC19(M@ssing+Jz et
at、 +G1n@+ 33103−119.198
5)に連結し、Aacゾロし5stl 、 Hlndn
lで切断したpUC18(M*ailngJ/、 Ss
t mA、 s G@n@ *且、 103−119
(1985))K連結しムCプロモーターからの転写が
可能になるように配置し、E、 eoti CGBCA
5889 ’に形質転換した。その結果、Sst I
−EeoRI断片、或いはSst l−Hlnd m断
片を有する組換えプラスミドは、E* e oL iの
要求性を消失させた。
5stl−EcoRI断片を分画し5atIsEcoR
Iで切断したpUC19(M@ssing+Jz et
at、 +G1n@+ 33103−119.198
5)に連結し、Aacゾロし5stl 、 Hlndn
lで切断したpUC18(M*ailngJ/、 Ss
t mA、 s G@n@ *且、 103−119
(1985))K連結しムCプロモーターからの転写が
可能になるように配置し、E、 eoti CGBCA
5889 ’に形質転換した。その結果、Sst I
−EeoRI断片、或いはSst l−Hlnd m断
片を有する組換えプラスミドは、E* e oL iの
要求性を消失させた。
以上の結果からPRT遺伝子、PRAI−InGP遺伝
子、4士示す位誼に存在していると考えられる@尚PR
T遺伝子のサブクローニングの除用いたプラスミドpA
J 224は以下の禄にして造成した。
子、4士示す位誼に存在していると考えられる@尚PR
T遺伝子のサブクローニングの除用いたプラスミドpA
J 224は以下の禄にして造成した。
pAJ 224はトリメトプリム耐性を有するベクター
プラスミドpAJ 228から造成した。pAJ 22
8の造成は以下の通シである。
プラスミドpAJ 228から造成した。pAJ 22
8の造成は以下の通シである。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12
036よシ変異誘導さn7’j)リメトプリム耐性変異
株AJ 12146(FERM−P7672 )から(
7)で述べた方フリスミド 法により染色体DNAを調製した。一方、ζベクターも
シ六キーpAM 330金保有するブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムATCC13869から(2)
で述べた方法によりpAM 330を調製した。
036よシ変異誘導さn7’j)リメトプリム耐性変異
株AJ 12146(FERM−P7672 )から(
7)で述べた方フリスミド 法により染色体DNAを調製した。一方、ζベクターも
シ六キーpAM 330金保有するブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムATCC13869から(2)
で述べた方法によりpAM 330を調製した。
次に、染色体DNA20μIとPAM 33010μg
とを制限エンドヌクレアーゼ■)OIでそnぞ2113
7℃、30分間処理し、部分切断した。65℃、10分
の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジテオスレ
イトール存在下、T4ファージ由米のDNA リガーゼ
によって10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行った
。65℃、5分の熱処理後、反応液IC2倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のDNA 1i−沈澱採取
した。
とを制限エンドヌクレアーゼ■)OIでそnぞ2113
7℃、30分間処理し、部分切断した。65℃、10分
の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジテオスレ
イトール存在下、T4ファージ由米のDNA リガーゼ
によって10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行った
。65℃、5分の熱処理後、反応液IC2倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のDNA 1i−沈澱採取
した。
DNAの沈澱を適当量TENバッファーに溶解後、トリ
メトゲリム感受性のAJ 12036 t−受容菌とし
て、形質転換に用いた。
メトゲリム感受性のAJ 12036 t−受容菌とし
て、形質転換に用いた。
形質転換の方法としては、(4)で述べた方法を用いた
。トリメトプリム(Slgma社) 25 pg/ml
を含む再生培地にて、30℃で1週間培養後、約100
個のコロニーが出現してきたので、これをトリメトゲリ
ム50μm17m1 を含む最小培地にレプリカし、ト
リメトプリム耐性1株を得た。
。トリメトプリム(Slgma社) 25 pg/ml
を含む再生培地にて、30℃で1週間培養後、約100
個のコロニーが出現してきたので、これをトリメトゲリ
ム50μm17m1 を含む最小培地にレプリカし、ト
リメトプリム耐性1株を得た。
この株の有するプラスミドDNAを検出したところ、ベ
クターのpAM 330よりも明らかに大きなプラスミ
ドが検出された。
クターのpAM 330よりも明らかに大きなプラスミ
ドが検出された。
このプラスミドをpAJ 228と名付け、再度AJ1
2036を形質転換した。
2036を形質転換した。
生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ10個を釣シ上げアガ・−A”a泳動法によシブラ
スミドDNAを検出し念ところ、これらのいずれにもp
AJ 228と同じ大きさのプラスミドが存在していた
。上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現
する遺伝子が存在するシである。
ぞれ10個を釣シ上げアガ・−A”a泳動法によシブラ
スミドDNAを検出し念ところ、これらのいずれにもp
AJ 228と同じ大きさのプラスミドが存在していた
。上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現
する遺伝子が存在するシである。
pAJ 211より制限酵素Pst Iによる部分切断
で切シ出した2、9kbのDNA断片の両端にBamH
I * 5atI 5PstIの切断部位t−4った第
1図に示したような合成オリがヌクレオチドリンカーを
T4ファージ由来のDNAリガーゼを用いて連結させた
後、制限酵素BamHIで切断した。得られたDNA混
合物をアがロース・rルミ気泳動にかけ、約2.9kb
のDNA断片を分離抽出し、エタノール沈澱によりDN
A断片を回収した。こうして得られたDNA断片は2.
9kbの皿遺伝子を含むDNAの両端にPatl、5a
t1 eBambiの切断部位が並んだ構造になってい
る。
で切シ出した2、9kbのDNA断片の両端にBamH
I * 5atI 5PstIの切断部位t−4った第
1図に示したような合成オリがヌクレオチドリンカーを
T4ファージ由来のDNAリガーゼを用いて連結させた
後、制限酵素BamHIで切断した。得られたDNA混
合物をアがロース・rルミ気泳動にかけ、約2.9kb
のDNA断片を分離抽出し、エタノール沈澱によりDN
A断片を回収した。こうして得られたDNA断片は2.
9kbの皿遺伝子を含むDNAの両端にPatl、5a
t1 eBambiの切断部位が並んだ構造になってい
る。
pAJ 211 tri pAJ 1844 (D P
stI f イ) Ic 2.9 kbのHK (ホモ
セリンキナーゼ)遺伝子を有するPstI断片が挿入さ
れたものでAJ 12079 (FERM−P7237
)として寄託されている。
stI f イ) Ic 2.9 kbのHK (ホモ
セリンキナーゼ)遺伝子を有するPstI断片が挿入さ
れたものでAJ 12079 (FERM−P7237
)として寄託されている。
一方、pAJ 228は制限酵素MboIで部分切断し
た後65℃、10分の熱処理をした。この反応液に前述
の方法で得7’j)IK遺伝子を含むDNA断片全加え
、T4DNAリガーゼでDNA鎖の連結反応を行った。
た後65℃、10分の熱処理をした。この反応液に前述
の方法で得7’j)IK遺伝子を含むDNA断片全加え
、T4DNAリガーゼでDNA鎖の連結反応を行った。
反応後、65℃、5分の熱処理をし、2倍容・のエタノ
ールの添加により沈澱採取されるDNAを、(4)と同
様の方法によシトリメトグリム感受性で、かつ、HK遺
伝子が欠損したブレビバクテリウム、・ラクトファーメ
ンタムAJ 12078を受容菌としてグロトデラスト
ランス7オーメーシ1ンヲ行っり後、トリメトプリム1
00μm17m1を含むプロトプラスト再生培地で培養
した結果約200個の再生コロニーが出現してきた。
ールの添加により沈澱採取されるDNAを、(4)と同
様の方法によシトリメトグリム感受性で、かつ、HK遺
伝子が欠損したブレビバクテリウム、・ラクトファーメ
ンタムAJ 12078を受容菌としてグロトデラスト
ランス7オーメーシ1ンヲ行っり後、トリメトプリム1
00μm17m1を含むプロトプラスト再生培地で培養
した結果約200個の再生コロニーが出現してきた。
これをトリメトプリムを200μI/rttlを含み受
容菌の要求物質であるスレオニンを含まない最少培地に
レプリカし、トリメトグリム耐性で、かつスレオニン要
求性が消失した菌株4株を得た。これらの株よシ(2)
に示した方法によシ溶菌液を調製し、アガロース・rル
ミ気泳動によりプラスミドDNAを検出したところ14
.9kb、12.2kb。
容菌の要求物質であるスレオニンを含まない最少培地に
レプリカし、トリメトグリム耐性で、かつスレオニン要
求性が消失した菌株4株を得た。これらの株よシ(2)
に示した方法によシ溶菌液を調製し、アガロース・rル
ミ気泳動によりプラスミドDNAを検出したところ14
.9kb、12.2kb。
9.6 kb 、 6.5 kbのプラスミドが検出さ
れた。このうち最も分子量の小さい6.5 kbのプラ
スミドをpAJ 212と名付けた。pAJ 212
i保持する株を12078− [株と名付けた。
れた。このうち最も分子量の小さい6.5 kbのプラ
スミドをpAJ 212と名付けた。pAJ 212
i保持する株を12078− [株と名付けた。
PAJ 212は、PstIで切断することKより皿遺
伝子を除いて、pAJ 224として、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ 12196 (FE
RM −P4O10)として寄託されている。
伝子を除いて、pAJ 224として、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ 12196 (FE
RM −P4O10)として寄託されている。
(8) PRA4−InCP遺伝子のブレビ/譬りテ
リウム内で複製可能なベクターへの移し変え (8) −1,9AJ 82の造成 pAJ 43 (特開昭58−192900)5μlに
0.25ユニツトの制限酵素Hpaffを37℃、5分
間反応させた。一方pUB 110 (Gryczan
# T、J、 atatJ、Baateriol、、
134.318(1978))5μIIK5ユニツト
のHp a IIを37℃、120分間反応させた。
リウム内で複製可能なベクターへの移し変え (8) −1,9AJ 82の造成 pAJ 43 (特開昭58−192900)5μlに
0.25ユニツトの制限酵素Hpaffを37℃、5分
間反応させた。一方pUB 110 (Gryczan
# T、J、 atatJ、Baateriol、、
134.318(1978))5μIIK5ユニツト
のHp a IIを37℃、120分間反応させた。
両者を混合後、(3)の方法によシ連結し、AJ 12
036K(4)の方法を用いて形質転換した。
036K(4)の方法を用いて形質転換した。
クロラムフェニコール3μg/at、カナマイシン生シ
たコロニーの中からクロラムフェニコール感pAJ 2
35’を制限酵素EcoRI、H1ndnl、Pstl
、Bgt■等で2.0 切断し約−kbのPRAI−InGP遺伝子を有するD
NA断片が挿入されていることを確認した。
たコロニーの中からクロラムフェニコール感pAJ 2
35’を制限酵素EcoRI、H1ndnl、Pstl
、Bgt■等で2.0 切断し約−kbのPRAI−InGP遺伝子を有するD
NA断片が挿入されていることを確認した。
(9)形質転換株のトリプトファン生産能(8)−2で
得た形質転換株AJ 12258 (FERM P−Q
)tyyo のトリプトファン生産能を調べ九ところ第
1表に示す結果を得た。
得た形質転換株AJ 12258 (FERM P−Q
)tyyo のトリプトファン生産能を調べ九ところ第
1表に示す結果を得た。
培養はトリプトファン生産培地(グルコース130.9
、 (NH4)280425 、P、フマル酸121
酢酸3 m/ 、 KH2PO41,9、Mn5O4−
rH201019。
、 (NH4)280425 、P、フマル酸121
酢酸3 m/ 、 KH2PO41,9、Mn5O4−
rH201019。
MgSO4・7H20111,d−ビオチン50μi、
サイアミン塩酸塩2000μ9、メチオニン400■、
チロシン650m9、大豆蛋白酸加水分解液「味液」5
01jLl −CaCO350& ?水1ノに含む、p
il 6.5 、 )2011/を500rILlの坂
ロフラスコに入nたものに被検菌株を植えつけ、30℃
にて72時間、振盪下に行なりた。培養後、遠心上清中
のL−)!Jブトファンをロイコノストック・メセント
ロイデス(L@uconoatoc mes@nt@r
oidas ) ATCC8042を定量菌株として用
いるバイオアッセイ法によって求めた。
サイアミン塩酸塩2000μ9、メチオニン400■、
チロシン650m9、大豆蛋白酸加水分解液「味液」5
01jLl −CaCO350& ?水1ノに含む、p
il 6.5 、 )2011/を500rILlの坂
ロフラスコに入nたものに被検菌株を植えつけ、30℃
にて72時間、振盪下に行なりた。培養後、遠心上清中
のL−)!Jブトファンをロイコノストック・メセント
ロイデス(L@uconoatoc mes@nt@r
oidas ) ATCC8042を定量菌株として用
いるバイオアッセイ法によって求めた。
第1表 形質転換株のL −) IJブトファン蓄積量
尚、M247を得るためには寄託されたAJ12258
(FERM p−’dl+”70 )よシ宿主細胞を損
うことなく宿主細胞中の複合グラスミドを除去すること
が可能である。即ち、プラスミドは宿主よシ自然に失な
われることもあるし、「除去」操作によって除くことも
できる( Bact、R@v、、 36. p361−
405カナマイシンを含有し又は含有しないCMG寒天
培地に塗布し、30℃で1〜3日間培養する。かくして
感受性株として分離される株がM247である。
尚、M247を得るためには寄託されたAJ12258
(FERM p−’dl+”70 )よシ宿主細胞を損
うことなく宿主細胞中の複合グラスミドを除去すること
が可能である。即ち、プラスミドは宿主よシ自然に失な
われることもあるし、「除去」操作によって除くことも
できる( Bact、R@v、、 36. p361−
405カナマイシンを含有し又は含有しないCMG寒天
培地に塗布し、30℃で1〜3日間培養する。かくして
感受性株として分離される株がM247である。
Claims (1)
- (1)コリネ型細菌細胞内で発現し、N−(5−ホスホ
リボシル)アンスラニル酸イメソラーゼ−インドール−
3−グリセロールリン酸合成酵素をコードする遺伝子が
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドベクターに
接続されている組換えDNAを有するコリネ型細菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60221592A JPS6279775A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60221592A JPS6279775A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6279775A true JPS6279775A (ja) | 1987-04-13 |
JPH0476678B2 JPH0476678B2 (ja) | 1992-12-04 |
Family
ID=16769169
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60221592A Granted JPS6279775A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6279775A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01265892A (ja) * | 1988-04-18 | 1989-10-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | L−トリプトファンの製造法 |
EP0401735A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing -L-tryptophan |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
-
1985
- 1985-10-04 JP JP60221592A patent/JPS6279775A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01265892A (ja) * | 1988-04-18 | 1989-10-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | L−トリプトファンの製造法 |
US5563052A (en) * | 1988-04-18 | 1996-10-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Process for producing L-tryptophan |
EP0401735A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing -L-tryptophan |
US5407824A (en) * | 1989-06-06 | 1995-04-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Recombinant coryneform bacterium for producing L-tryptophan |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0476678B2 (ja) | 1992-12-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0143195B1 (en) | Recombinant dna having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant dna and a process for producing amino acids using said bacteria | |
JP2944094B2 (ja) | 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 | |
JPH06102024B2 (ja) | 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 | |
JPS6279788A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
JPS6012995A (ja) | 発酵法によるl―スレオニン及び/又はl―イソロイシンの製造法 | |
EP0137348B1 (en) | Recombinant dna, bacteria carrying said recombinant dna and a process for producing l-threonine or l-isoleucine using said bacteria | |
US4968609A (en) | Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria | |
US5034318A (en) | Method for producing L-tryptophan by fermentation | |
JPS62151184A (ja) | 遺伝子発現調節法 | |
JPS6279775A (ja) | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 | |
EP0215388B1 (en) | Plasmid vector and a method for regulation of gene expression using the same | |
JP2722504B2 (ja) | 新規微生物及びそれを用いるd−ビオチンの製法 | |
JPS6178378A (ja) | 芳香族アミノ酸生合成遺伝子を含有する組換えdna及びそれを有するコリネ型細菌 | |
EP0170257B1 (en) | Process for producing l-tryptophan | |
JPS61195695A (ja) | スレオニン又はイソロイシンの製造法 | |
JPS61149082A (ja) | 発酵法によるl―トリプトファンの製造法 | |
JPS6255089A (ja) | ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ産生遺伝子を含むdna断片 | |
JPS6251980A (ja) | 発酵法によるl―トリプトファンの製造法 | |
JPS62130693A (ja) | 発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法 | |
JPS60210993A (ja) | 発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法 | |
JPS619290A (ja) | プラスミド及びそれを有する細菌 | |
JPH0691829B2 (ja) | 発酵法によるl―リジンの製造法 | |
JPS6062983A (ja) | 発酵法によるl―ヒスチジンの製造法 | |
JPS58216199A (ja) | 複合プラスミド | |
JPS62143682A (ja) | 発酵法によるl―チロシン又はl―フェニルアラニンの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |