JPS61195695A - スレオニン又はイソロイシンの製造法 - Google Patents
スレオニン又はイソロイシンの製造法Info
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- JPS61195695A JPS61195695A JP3716885A JP3716885A JPS61195695A JP S61195695 A JPS61195695 A JP S61195695A JP 3716885 A JP3716885 A JP 3716885A JP 3716885 A JP3716885 A JP 3716885A JP S61195695 A JPS61195695 A JP S61195695A
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- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はスレオニン又はインロイシンの製造法に関し、
詳しくは組換えプラスミドを有するコリネホルム細菌を
用いる発酵法によるスレオニン又はイソロイシンの製造
法に関する。
詳しくは組換えプラスミドを有するコリネホルム細菌を
用いる発酵法によるスレオニン又はイソロイシンの製造
法に関する。
（従来の技術）
従来、発酵法によりＬ−スレオニンやＬ−インロイシン
全製造する場合、微生物としては自然界から分離した菌
株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−ス
レオニンを生産する人工変異株は数多く知られており、
その多くはα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下、
ＡＨＶと略記する。）に耐性があシ、ブレビバクテリウ
ム属またはコリネバクテリウム属に属してｂる。これら
の微生物は収率１０〜２０％でＬ−スレオニ／’ＷＥ産
する。例えば、米国特許第３５８２４７１号明細書、同
第３５８０８１０号明細書及び特公昭４７−３４９５６
号公報にはＡＨＶ耐性を示し、ブレビバクテリウム属、
エシェリヒア属及びコリネバクテリウム属に属する変異
株を用いたスレオニンの製造法が開示されている。また
、ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属に属
する変異株によるスレオニンの生産について特開昭５１
−５４９８４号公報、同５３−ＩＯ１５９１号公報、同
５４−３２６９３号公報、同５４−３５２８５号公報、
同５４−３５２８６号公報、同５４−３５２８８号公報
、同５４−３７８８６号公報及び同５４−９２６９２号
公報にも開示されている。
全製造する場合、微生物としては自然界から分離した菌
株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−ス
レオニンを生産する人工変異株は数多く知られており、
その多くはα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下、
ＡＨＶと略記する。）に耐性があシ、ブレビバクテリウ
ム属またはコリネバクテリウム属に属してｂる。これら
の微生物は収率１０〜２０％でＬ−スレオニ／’ＷＥ産
する。例えば、米国特許第３５８２４７１号明細書、同
第３５８０８１０号明細書及び特公昭４７−３４９５６
号公報にはＡＨＶ耐性を示し、ブレビバクテリウム属、
エシェリヒア属及びコリネバクテリウム属に属する変異
株を用いたスレオニンの製造法が開示されている。また
、ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属に属
する変異株によるスレオニンの生産について特開昭５１
−５４９８４号公報、同５３−ＩＯ１５９１号公報、同
５４−３２６９３号公報、同５４−３５２８５号公報、
同５４−３５２８６号公報、同５４−３５２８８号公報
、同５４−３７８８６号公報及び同５４−９２６９２号
公報にも開示されている。
一方、米国特許第４２７８７６５号明細書、特開昭５５
−１３１３９７号公報及び同５６−１５６９６号公報に
は組換えプラスミドＤＮＡ ’ｊｉ−用いて形質転換さ
れたエシェリヒア・コリを用いてスレオニンを製造する
方法が示されている。
−１３１３９７号公報及び同５６−１５６９６号公報に
は組換えプラスミドＤＮＡ ’ｊｉ−用いて形質転換さ
れたエシェリヒア・コリを用いてスレオニンを製造する
方法が示されている。
さらに、欧州特許出願公開第００６６１２９号明細書に
はＡＨＶに対する耐性をコントロールする染色体ＤＮＡ
断片が挿入されているプラスミドを有するコリネホルム
細菌を使用するスレオニンの生産如ついて記載されてい
る。更に、欧州特許出願公開ｇｏ １３１１７１号には
、ホモセリンデヒドロゲナーゼ全コードする遺伝子が挿
入されているプラスミドを有するコリネホルム細菌を培
養して、インロイシン又はスレオニンを生産することが
記載されている。
はＡＨＶに対する耐性をコントロールする染色体ＤＮＡ
断片が挿入されているプラスミドを有するコリネホルム
細菌を使用するスレオニンの生産如ついて記載されてい
る。更に、欧州特許出願公開ｇｏ １３１１７１号には
、ホモセリンデヒドロゲナーゼ全コードする遺伝子が挿
入されているプラスミドを有するコリネホルム細菌を培
養して、インロイシン又はスレオニンを生産することが
記載されている。
また、イソロイシンに関する状況もスレオニンの場合と
酷似している。イソロイシンを生産する微生物としては
イソロイシンヒドロキサメートに対して耐性を有するセ
ラチアの変異株（特公昭５２−３０５９３号公報）、そ
の生育にロイシン全要求するコリネバクテリウム・グル
タミクムの変異株（％公昭４７−３８９９５号公報）、
ＡＨＶに耐性ヲ有するブレビバクテリウム属及びコリネ
バクテリウム属の変異株（特公昭４０−２８８０号公報
）、ＡＨＶに耐性を有し、かつその生育にリジンを必要
とするブレビバクテリウム属の変異株（特公昭５１−６
２３７号公報）、ＡＨＶ及び＠ −、＋ｌ ｆ ／ｌ／
スＬ／オニンに耐性を有するブレビバクテリウム属の
変異株（特公昭５１−２１０７７号公報）、５−（２−
アミノエチル）−システィンに耐性を有するコリネバク
テリウム属の変異株（特公昭５２−４６２９号公報）、
２−アミノ−３−メチルチオ酪酸に耐性を有するエシェ
リヒア属の変異株（特開昭５３−６９８８１号公報）、
ＡＨｖ及びトリクロロアラニンに耐性を有するブレビバ
クテリウム属の変異株（特開昭５４−３５２８７号公報
）がある。
酷似している。イソロイシンを生産する微生物としては
イソロイシンヒドロキサメートに対して耐性を有するセ
ラチアの変異株（特公昭５２−３０５９３号公報）、そ
の生育にロイシン全要求するコリネバクテリウム・グル
タミクムの変異株（％公昭４７−３８９９５号公報）、
ＡＨＶに耐性ヲ有するブレビバクテリウム属及びコリネ
バクテリウム属の変異株（特公昭４０−２８８０号公報
）、ＡＨＶに耐性を有し、かつその生育にリジンを必要
とするブレビバクテリウム属の変異株（特公昭５１−６
２３７号公報）、ＡＨＶ及び＠ −、＋ｌ ｆ ／ｌ／
スＬ／オニンに耐性を有するブレビバクテリウム属の
変異株（特公昭５１−２１０７７号公報）、５−（２−
アミノエチル）−システィンに耐性を有するコリネバク
テリウム属の変異株（特公昭５２−４６２９号公報）、
２−アミノ−３−メチルチオ酪酸に耐性を有するエシェ
リヒア属の変異株（特開昭５３−６９８８１号公報）、
ＡＨｖ及びトリクロロアラニンに耐性を有するブレビバ
クテリウム属の変異株（特開昭５４−３５２８７号公報
）がある。
そのほか組換えプラスミドＤＮＡ ’ｉ用いて形質転換
されたエシェリヒア・コリはアミノ酸の生産能が高いこ
とが開示されている（例えば米国特許第４２７８７６５
号明細書参照）。更に欧州特許出願公開第００７１０２
３号には、ＡＨＶに対する耐性全コントロールする染色
体ＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを有するコリ
ネホルム細菌全使用するイソロイシンの生産について記
載されてイル。
されたエシェリヒア・コリはアミノ酸の生産能が高いこ
とが開示されている（例えば米国特許第４２７８７６５
号明細書参照）。更に欧州特許出願公開第００７１０２
３号には、ＡＨＶに対する耐性全コントロールする染色
体ＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドを有するコリ
ネホルム細菌全使用するイソロイシンの生産について記
載されてイル。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら上記のスレオニン又はイソロイシン生産能
を有する細菌のスレオニン又はイソロイシン生産能は、
更に改善する必要がある。
を有する細菌のスレオニン又はイソロイシン生産能は、
更に改善する必要がある。
（問題点を解決するための手段）
斜上のような状況下で本発明者らは、ホモセリンキナー
ゼ（以下ｒＨＫＪと記す）をコードする遺伝子（以下「
ＨＫ遺伝子」と記す）が組込まれてｂるプラスミド及び
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下「ＨＤ」と記す）を
コードする遺伝子（以下ｒＨＤ遺伝子」と記す）が組込
まれているプラスミドを有するコリネホルム細菌が、ス
レオニン及びイソロイシンの高い生産性を有することを
見い出した。
ゼ（以下ｒＨＫＪと記す）をコードする遺伝子（以下「
ＨＫ遺伝子」と記す）が組込まれてｂるプラスミド及び
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下「ＨＤ」と記す）を
コードする遺伝子（以下ｒＨＤ遺伝子」と記す）が組込
まれているプラスミドを有するコリネホルム細菌が、ス
レオニン及びイソロイシンの高い生産性を有することを
見い出した。
コリネホルム細菌は、好気性、グラム陽性桿菌であり、
非抗酸性でパーデース・マニュアル・オプ・デターミネ
イティブパクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）
に記載されていて、そのうち特に以下に例示するような
Ｌ−グルタミン酸を大量に生産するものが知られている
。
非抗酸性でパーデース・マニュアル・オプ・デターミネ
イティブパクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）
に記載されていて、そのうち特に以下に例示するような
Ｌ−グルタミン酸を大量に生産するものが知られている
。
ブレビバクテリウム・ディパリカタム ＡＴＣＣ
１４０２０プレピノ々クテリウム・サラカロリティクム
ＡＴＣＣ１４０６６プレビパクテリウム・インマ
リオフィルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブレ
ビバクテリウム・ロゼラム ＡＴＣＣ１
３８２５ブレビバクテリウム・フ５Ａム
ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウム・チオダニタ
リス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・
アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバク
テリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネノ々クテリウム・カルナエ ＡＴ
ＣＣ１５９９１コリネノぐクテリウム・グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０コリネバク
テリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９
０コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴ
ＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラ
ム ＡＴＣＣ１５３５４コリネホルム細菌には上記の
ようなグルタミン酸生産性を有するもののほかに、グル
タミン酸生産性を失ったもの及びリジン、アルギニン等
のアミノ酸を生産する変異株も含まれる。
１４０２０プレピノ々クテリウム・サラカロリティクム
ＡＴＣＣ１４０６６プレビパクテリウム・インマ
リオフィルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ブレ
ビバクテリウム・ロゼラム ＡＴＣＣ１
３８２５ブレビバクテリウム・フ５Ａム
ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウム・チオダニタ
リス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・
アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバク
テリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネノ々クテリウム・カルナエ ＡＴ
ＣＣ１５９９１コリネノぐクテリウム・グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０コリネバク
テリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９
０コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴ
ＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラ
ム ＡＴＣＣ１５３５４コリネホルム細菌には上記の
ようなグルタミン酸生産性を有するもののほかに、グル
タミン酸生産性を失ったもの及びリジン、アルギニン等
のアミノ酸を生産する変異株も含まれる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネホ
ルム細菌細胞内において増殖し得るものであればどのよ
うなものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものが
ある。
ルム細菌細胞内において増殖し得るものであればどのよ
うなものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものが
ある。
（１） ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９
参照（２） ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７
８９５参照（３） ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−
１９２９００参照（４） ｐＡＪ ６１１ 特開昭
５８−１９２９００参照（５） ｐＡＪ １８４４
特開昭５８−１９２９００参照コリネホルム細菌細胞内
で増殖可能なプラスミドのその他の例としてはｐｅＧｌ
（％開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ ２ （特開昭
５８−３５１９７ ）、ｐｃｃ ４ 、 ｐｃＧ １１
（特開昭５７−１８３７９９ ）がある。
参照（２） ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７
８９５参照（３） ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−
１９２９００参照（４） ｐＡＪ ６１１ 特開昭
５８−１９２９００参照（５） ｐＡＪ １８４４
特開昭５８−１９２９００参照コリネホルム細菌細胞内
で増殖可能なプラスミドのその他の例としてはｐｅＧｌ
（％開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ ２ （特開昭
５８−３５１９７ ）、ｐｃｃ ４ 、 ｐｃＧ １１
（特開昭５７−１８３７９９ ）がある。
本発明においては、これらのプラスミドのウチ２種類以
上のプラスミドが用いられる。ＨＫは、Ｌ−スレオニン
及びＬ−インロイシン生成の中間体テするＬ−ホモセリ
ンよりホスホホモセリン全生成する反応を触媒する酵素
である。
上のプラスミドが用いられる。ＨＫは、Ｌ−スレオニン
及びＬ−インロイシン生成の中間体テするＬ−ホモセリ
ンよりホスホホモセリン全生成する反応を触媒する酵素
である。
ＨＫ遺伝子を単離する方法は、コリネホルム細菌のＨＫ
遺伝子を有している株よシ、まず染色体遺伝子を抽出し
く例えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、 ＭｉｕｒａＢ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ ７２．６
１９．（１９６３）の方法が使用できる）、これを適当
な制限酵素で切断する。ついで、コリネホルム細菌で増
殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組換え
ＤＮＡ ’に用いてコリネホルム細菌のＨＫ欠損変異株
を形質転換せしめ、ＨＫ生成活性を保有するにいた−）
た菌株を単離し、これよりＨＫ遺伝子を分離できる。
遺伝子を有している株よシ、まず染色体遺伝子を抽出し
く例えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、 ＭｉｕｒａＢ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ ７２．６
１９．（１９６３）の方法が使用できる）、これを適当
な制限酵素で切断する。ついで、コリネホルム細菌で増
殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組換え
ＤＮＡ ’に用いてコリネホルム細菌のＨＫ欠損変異株
を形質転換せしめ、ＨＫ生成活性を保有するにいた−）
た菌株を単離し、これよりＨＫ遺伝子を分離できる。
ＨＤは、アスノ！ルテートセミアルデヒドよりホモセリ
ンを生成する反応を触媒する酵素である。
ンを生成する反応を触媒する酵素である。
ＨＤ遺伝子を単離する方法も、ＨＫ遺伝子全単離する方
法と同じようにして行うことができる。
法と同じようにして行うことができる。
即ち、コリネホルム細菌のＨＤ欠損変異株を用いること
により、ＨＤ遺伝子を得ることができる。
により、ＨＤ遺伝子を得ることができる。
ＨＫ遺伝子又はＨＤ遺伝子を得るためのコリネホルム細
菌は、野性型のものであってもよめか、スレオニンによ
るフィード・９ツク阻害が解除されたようなＨＫ又はＨ
Ｄ’ｔ−有する変異株’ｉｉ ＤＮＡ供与株として用い
た方がよりよい結果が得られることが多い。このような
変異株は、ＡＨＶに耐性の変異株として得ることができ
る。
菌は、野性型のものであってもよめか、スレオニンによ
るフィード・９ツク阻害が解除されたようなＨＫ又はＨ
Ｄ’ｔ−有する変異株’ｉｉ ＤＮＡ供与株として用い
た方がよりよい結果が得られることが多い。このような
変異株は、ＡＨＶに耐性の変異株として得ることができ
る。
ＨＫ遺伝子又は）（Ｄ遺伝子を得るために染色体遺伝千
金切断する際に、切断反応時間等を調節して切断の程度
を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が使用できる。
金切断する際に、切断反応時間等を調節して切断の程度
を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が使用できる。
ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付される。
れた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付される。
する受容菌へ導入するには、エシェリヒア・コリに−１
２について報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。
２について報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ。
Ｍ、 ａｎｄ ）Ｉｌｇａ、 Ａ、、 Ｊ、 Ｍｏ１．
、 Ｂｉｏｌ、、 ５３．１５９（１９７０）受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法、またはバチルス・ズブチリスについて報告されてい
る様に（Ｄｕｎｃａｎ、Ｃ，Ｈ，、Ｗｌｌｓｏｎ。
、 Ｂｉｏｌ、、 ５３．１５９（１９７０）受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法、またはバチルス・ズブチリスについて報告されてい
る様に（Ｄｕｎｃａｎ、Ｃ，Ｈ，、Ｗｌｌｓｏｎ。
Ｇ、Ａ、 ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、 Ｆ、Ｅ、 、 Ｇｏ
ｎｅ、 １．１５３（１９７７） ）細胞がＤＮＡ ’
Ｉｉ取り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテ
ントセル）に導入する方法により可能である。あるしは
、ノ９チルス・ズブチリス、放線菌類および酵母につい
て知られている様に（Ｃｈａｎｇ。
ｎｅ、 １．１５３（１９７７） ）細胞がＤＮＡ ’
Ｉｉ取り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンピテ
ントセル）に導入する方法により可能である。あるしは
、ノ９チルス・ズブチリス、放線菌類および酵母につい
て知られている様に（Ｃｈａｎｇ。
Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ、 Ｓ、Ｎ、 、 Ｍｏ１ｅ
ｃ、 Ｇｅｎ、 、 Ｇｅｎｅｔ、 、 １６８゜１１
１ （１９７９） ： Ｂｉｂｂ、 Ｍ、Ｊ、、 Ｗａ
ｒｄ、 Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ。
ｃ、 Ｇｅｎ、 、 Ｇｅｎｅｔ、 、 １６８゜１１
１ （１９７９） ： Ｂｉｂｂ、 Ｍ、Ｊ、、 Ｗａ
ｒｄ、 Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ。
０、Ａ、 、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２７４．３９８（１９
７８） ： Ｈｉｎｎｅｎ、 Ａ、 、Ｈｌｃｋｓ。
７８） ： Ｈｉｎｎｅｎ、 Ａ、 、Ｈｌｃｋｓ。
Ｊ、Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ、 Ｇ、”Ｒ，、Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 ７５１９２９（１９７８） ）、ＤＮＡ受容
菌を、プラスミドＤＮＡ ｋ容易に取シ込むプロトプラ
ストまたはスフェロプラストにしてプラスミド’ｉ Ｄ
ＮＡ受容菌に導入することも可能である。
菌を、プラスミドＤＮＡ ｋ容易に取シ込むプロトプラ
ストまたはスフェロプラストにしてプラスミド’ｉ Ｄ
ＮＡ受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡ ’ｉと
り込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールのかわシに、カルがキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、プル
ロニックＦ６８（セルノ々社）などの添加によってＤＮ
Ａのとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得られ
る。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡ ’ｉと
り込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールのかわシに、カルがキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、プル
ロニックＦ６８（セルノ々社）などの添加によってＤＮ
Ａのとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得られ
る。
かくして、Ｈ・遺伝子又はＨＤ遺伝子が組込まれたプラ
スミドが得られる。この二つの組換えプラスミドを有す
るコリネホルム細菌は、二つのプラスミドが細胞内に共
存しうるものであればイソロイシン又はスレオニンを生
産する。共存しえないものであれば、共存しうるプラス
ミドベクターに容易にＨＫ遺伝子及びＨＤ遺伝子を移し
かえることができる。
スミドが得られる。この二つの組換えプラスミドを有す
るコリネホルム細菌は、二つのプラスミドが細胞内に共
存しうるものであればイソロイシン又はスレオニンを生
産する。共存しえないものであれば、共存しうるプラス
ミドベクターに容易にＨＫ遺伝子及びＨＤ遺伝子を移し
かえることができる。
コリネホルム細菌細胞内で二つのプラスミドが共存しう
るためには、本発明者らの研究によれば、プラスミドの
複製開始領域が異なるものであれは共存しうるが、複製
開始領域が同じものであっても、他の領域が大きく異な
れば共存しうろことがある。
るためには、本発明者らの研究によれば、プラスミドの
複製開始領域が異なるものであれは共存しうるが、複製
開始領域が同じものであっても、他の領域が大きく異な
れば共存しうろことがある。
二つのプラスミドを保有するためのコリネホルム細菌宿
主は、スレオニン又はイソロイシン要求株であってもよ
く、又野性株であってもよい。しかしＡＨＶ耐性を有す
る変異株が通常好ましい結果が得られ、特により高いス
レオニン又はイソロイシン生産能を有する菌株が最も好
まし込結果が得られる。
主は、スレオニン又はイソロイシン要求株であってもよ
く、又野性株であってもよい。しかしＡＨＶ耐性を有す
る変異株が通常好ましい結果が得られ、特により高いス
レオニン又はイソロイシン生産能を有する菌株が最も好
まし込結果が得られる。
得られたスレオニン又はイソロイシン生産菌を培養する
方法は、従来のスレオニン又はイソロイシン生産菌の培
養方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである。炭
素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース
等及びこれら全含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜
等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。
方法は、従来のスレオニン又はイソロイシン生産菌の培
養方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである。炭
素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース
等及びこれら全含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜
等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地の−及び温度全適宜調節しつ
つ、実質的にスレオニン又はイソロイシンの生産蓄積が
停止するまで行なわれる。
つ、実質的にスレオニン又はイソロイシンの生産蓄積が
停止するまで行なわれる。
かくして培養液中には著量のスレオニン又はイソロイシ
ンが生成蓄積される。培養液よシスレオニン又はイソロ
イシンを採取するには、通常の方法が適用できる。
ンが生成蓄積される。培養液よシスレオニン又はイソロ
イシンを採取するには、通常の方法が適用できる。
実施例１
１、 ホモセリンキナーゼ（ＨＫ）ａ伝子のクローニン
グ （１）ＨＫ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９（
７） ＡＨＶ耐性突然変異株ＡＪ １１１８８（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ４１９０ ） （特公昭５６−３０３８ ）を１
１のＣＭＧ培地（ペゾトン１１１７ｄｉ 、酵母エキス
１１１７ｄｌ 。
グ （１）ＨＫ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９（
７） ＡＨＶ耐性突然変異株ＡＪ １１１８８（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ４１９０ ） （特公昭５６−３０３８ ）を１
１のＣＭＧ培地（ペゾトン１１１７ｄｉ 、酵母エキス
１１１７ｄｌ 。
グルコース０．５．Ｆ／＃、及びＮａＣｔｏ、 ５１１
／ｄｉ ｋ含み、ｐＨ７，２に調整したもの）ＫＭ菌し
、３０℃で約３時間振盪培養全行ない、対数増殖期の菌
体を集めた。この菌体＋Ｖゾチーム・ＳＤＳで溶菌させ
たのち、通常のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡ
を抽出精製し、最終的に３．５ ｍｇのＤＮＡ ｉ得た
。
／ｄｉ ｋ含み、ｐＨ７，２に調整したもの）ＫＭ菌し
、３０℃で約３時間振盪培養全行ない、対数増殖期の菌
体を集めた。この菌体＋Ｖゾチーム・ＳＤＳで溶菌させ
たのち、通常のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡ
を抽出精製し、最終的に３．５ ｍｇのＤＮＡ ｉ得た
。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ １８４４ （分子量５．４メガ
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した
。
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した
。
ｔ ｆ ｐＡＪ １８４４をシラスミＰとして保有する
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
０３７（ＦＥＲＭ−Ｐ７２３４ ）を１００ｄのＣＭＧ
培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養したの
ち、リゾチームＳＤＳ処理により溶菌させ、３０，００
０Ｘｇ３０分の超遠心により上清を得た。フェノール処
理ののち、２容のエタノールを加えてＤＮＡ ｉ沈澱回
収した。これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭトリス塩
酸塩、２０ ｍＭ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）に溶解後、アガロースダル電気泳動にかけ分
離後、切シ出してｐＡＪ １８４４プラスミドＤＮＡ約
１５μｇを得た〇 （３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ ２０μｇと（２）で得たシラスミ）’
ＤＮＡ １０μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉでそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断し
た。６５℃１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴ
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時間ＤＮＡ鎖の連
結反応を行った。６５℃５分の熱処理後、反応液に２倍
容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡ ’ｉ
沈澱採取した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
０３７（ＦＥＲＭ−Ｐ７２３４ ）を１００ｄのＣＭＧ
培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養したの
ち、リゾチームＳＤＳ処理により溶菌させ、３０，００
０Ｘｇ３０分の超遠心により上清を得た。フェノール処
理ののち、２容のエタノールを加えてＤＮＡ ｉ沈澱回
収した。これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭトリス塩
酸塩、２０ ｍＭ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）に溶解後、アガロースダル電気泳動にかけ分
離後、切シ出してｐＡＪ １８４４プラスミドＤＮＡ約
１５μｇを得た〇 （３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ ２０μｇと（２）で得たシラスミ）’
ＤＮＡ １０μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉでそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断し
た。６５℃１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴ
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時間ＤＮＡ鎖の連
結反応を行った。６５℃５分の熱処理後、反応液に２倍
容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡ ’ｉ
沈澱採取した。
（４）ＨＫ遺伝子のクローニング
ＨＫ遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムＡＪ １２０７８ ’に受容菌として用いた
。
ーメンタムＡＪ １２０７８ ’に受容菌として用いた
。
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ ｍｌのＣＭ
Ｇ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリン
Ｇ ’ｉ ０．６ユニツ） ／ ｍｌ添加後、さらに１
．５時間振盪培養し、遠心分離によシ菌株を集め、菌体
を０．５Ｍシュークロース、２０ ｍＭマレイン酸、２
０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス（
Ｄｌｆｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐＨ６，５）Ｑ
、 ５ ｍｌで洗浄した。次いで１０■／ｍｌのりゾチ
ームを含むＳＭＶＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロ
トプラスト化を図った。６０００Ｘ、９．１０分間遠心
分離後、プロトプラス） ’ｅ ＳＭＭＰで洗浄し９．
５ ｍｌのＳＭＭＰに再度懸濁した。この様にして得ら
れたプロトプラストと（３）で調製したＤＮＡ １０μ
Ｉ ｆ ５ ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレ
ングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加した後
、ＤＮＡをプロトプラストに取り込ませる為に室温に２
分間放置した。このゾロドプラストをＳＭＭＰ培ｊｌｈ
１ ｖｒｌテ洗浄後、ＳＭＭＰ培地１ ｍｌに再懸濁
し、形質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培養
液＝ｉｐＨ７，０のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトシラスト再生培地は蒸留水１１あたシトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ 、 Ｋｃｔ
ｏ、５１１゜グルコース１０１１ 、 ＭｇＣｌ２−
６Ｈ２０８，Ｉ Ｉ 、 ＣａＣｔ２−２Ｈ２０２，２
ＩＩ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Ｄｌｆｃｏ社） ｌ 、９ 、 Ｋ２ＨＰＯ４０，２
，９、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８Ｉ及びクロ
ラムフェニコール３μｇ／Ｉｍ’ｅ含ｔｒ。
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ ｍｌのＣＭ
Ｇ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリン
Ｇ ’ｉ ０．６ユニツ） ／ ｍｌ添加後、さらに１
．５時間振盪培養し、遠心分離によシ菌株を集め、菌体
を０．５Ｍシュークロース、２０ ｍＭマレイン酸、２
０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス（
Ｄｌｆｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐＨ６，５）Ｑ
、 ５ ｍｌで洗浄した。次いで１０■／ｍｌのりゾチ
ームを含むＳＭＶＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロ
トプラスト化を図った。６０００Ｘ、９．１０分間遠心
分離後、プロトプラス） ’ｅ ＳＭＭＰで洗浄し９．
５ ｍｌのＳＭＭＰに再度懸濁した。この様にして得ら
れたプロトプラストと（３）で調製したＤＮＡ １０μ
Ｉ ｆ ５ ｍＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレ
ングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加した後
、ＤＮＡをプロトプラストに取り込ませる為に室温に２
分間放置した。このゾロドプラストをＳＭＭＰ培ｊｌｈ
１ ｖｒｌテ洗浄後、ＳＭＭＰ培地１ ｍｌに再懸濁
し、形質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培養
液＝ｉｐＨ７，０のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトシラスト再生培地は蒸留水１１あたシトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ 、 Ｋｃｔ
ｏ、５１１゜グルコース１０１１ 、 ＭｇＣｌ２−
６Ｈ２０８，Ｉ Ｉ 、 ＣａＣｔ２−２Ｈ２０２，２
ＩＩ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Ｄｌｆｃｏ社） ｌ 、９ 、 Ｋ２ＨＰＯ４０，２
，９、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８Ｉ及びクロ
ラムフェニコール３μｇ／Ｉｍ’ｅ含ｔｒ。
３０℃で２週間培養後、約１０，０００個のクロラムフ
ェニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをスレ
オニンを含まない培地（Ｔｈｒ欠培地）（２Ｎグルコー
ス、１％硫酸アンモニウム、 ０．２５％尿素、０，１
％シん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マグネシウム
７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオン、
２００μｉ／１３サイアミン塩酸塩、５０μｇ／ｌビオ
チン、ｐＨ７，０、寒天１．８％）にレプリカし、クロ
ラムフェニコール耐性であってかつスレオニン要求性が
消失した菌株８株を得た・ （５）形質転換株のプラスミド解析 これらの株よシ（２）で述べた方法によシ、溶菌液全調
製し、アガロースゲル電気泳動法によシ、プラスミドＤ
ＮＡ ’ｉ検出したところ、２株でベクターのｐＡＪ
１８４４よシも明らかに大きなプラスミドが検出された
。
ェニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをスレ
オニンを含まない培地（Ｔｈｒ欠培地）（２Ｎグルコー
ス、１％硫酸アンモニウム、 ０．２５％尿素、０，１
％シん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マグネシウム
７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオン、
２００μｉ／１３サイアミン塩酸塩、５０μｇ／ｌビオ
チン、ｐＨ７，０、寒天１．８％）にレプリカし、クロ
ラムフェニコール耐性であってかつスレオニン要求性が
消失した菌株８株を得た・ （５）形質転換株のプラスミド解析 これらの株よシ（２）で述べた方法によシ、溶菌液全調
製し、アガロースゲル電気泳動法によシ、プラスミドＤ
ＮＡ ’ｉ検出したところ、２株でベクターのｐＡＪ
１８４４よシも明らかに大きなプラスミドが検出された
。
これらのうちの代表株をＡＪ １２０７９ （ＦＥＲＭ
−Ｐ７２３７）と名づけた。
−Ｐ７２３７）と名づけた。
（６） 再トランスホーメーション
ＡＪ １２０７９内の組換えプラスミド（ｐＡＪ ２１
１ ）上にＨＫ遺伝子が存在することを確認するために
このプラスミドＤＮＡ ’ｉ用いブレビバクテリウム・
うストフアーメンタムＡＪ １２０７８を再度形質転換
した。
１ ）上にＨＫ遺伝子が存在することを確認するために
このプラスミドＤＮＡ ’ｉ用いブレビバクテリウム・
うストフアーメンタムＡＪ １２０７８を再度形質転換
した。
生シたクロラムフェニコール耐性コロニーノウち、それ
ぞれ１０個を釣シ上げスレオニン要求性をテストしたと
ころ、これらのいずれも要求性全消失しておシ、上記の
組換えプラスミド上にＨＫ遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
ぞれ１０個を釣シ上げスレオニン要求性をテストしたと
ころ、これらのいずれも要求性全消失しておシ、上記の
組換えプラスミド上にＨＫ遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
２、ＨＫ遺伝子を有する２、 ９ ｋｂ、 Ｐａｔ Ｉ
ＤＮＡ断片のｐＡＪ ２２４への移し変え （１）トリメトプリム耐性を有するベクタープラスミド
ｐＡＪ ２２８の造成 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
０３６よシ変異誘導されたトリメトプリム耐性変異株Ａ
Ｊ １２１４６ （ＦＥＲＭ −Ｐ７６７２ ）を１１
のＣＭＧ培地（ペプトン１１１７ｄｉ、酵母エキス１１
／／ｄｌ、グルコース０．５１／／ｄｌ 、及びＮａＣ
ｔＯ，５１／／ｄｌ ｋ含み、…７．２に調整し友もの
）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。
ＤＮＡ断片のｐＡＪ ２２４への移し変え （１）トリメトプリム耐性を有するベクタープラスミド
ｐＡＪ ２２８の造成 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
０３６よシ変異誘導されたトリメトプリム耐性変異株Ａ
Ｊ １２１４６ （ＦＥＲＭ −Ｐ７６７２ ）を１１
のＣＭＧ培地（ペプトン１１１７ｄｉ、酵母エキス１１
／／ｄｌ、グルコース０．５１／／ｄｌ 、及びＮａＣ
ｔＯ，５１／／ｄｌ ｋ含み、…７．２に調整し友もの
）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。
この菌体全リゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡ ’ｉ抽出精
製し、最終的に３．０■のＤＮＡ ｉ得た。
のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡ ’ｉ抽出精
製し、最終的に３．０■のＤＮＡ ｉ得た。
（２） ベクターとしてｐＡＭ３３０を用いた。ｐＡ
Ｍ３３０は次の様にして調製した。′ まずｐＡＭ ３３０をプラスミドとして保有するブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６
９ｆ １００ ｍｌのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対
数増殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理
によシ溶菌させ、３０，０００ｘＩｉ ３ｏ分の超遠心
によシ上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡ ｉ沈澱物として回収し友。これ
を少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭ ） ＩＪス塩酸塩、
２０ ｍＭ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐｌ（８
，０）に溶解後、アガロースダル電気泳動にかけ分離後
、切シ出してｐＡＭ ３３０プラスミドＤＮＡ約１５μ
ｇを得た口 （３） （１）で得た染色体ＤＮＡ２０μ９と（２）
で得たプラスミドＤＮＡ １０μＩとを制限エンドヌク
レアーゼＭｂｏ ｌでそれぞれを３７℃、３０分間処理
し、部分切断した。６５℃、１０分の熱処理後、両反応
液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ
４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４
時間ＤＤＮＡ鎖連結反応を行った。６５℃、５分の熱処
理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終
了後のＤＮＡ ｉ沈澱採取した。
Ｍ３３０は次の様にして調製した。′ まずｐＡＭ ３３０をプラスミドとして保有するブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６
９ｆ １００ ｍｌのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対
数増殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理
によシ溶菌させ、３０，０００ｘＩｉ ３ｏ分の超遠心
によシ上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡ ｉ沈澱物として回収し友。これ
を少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭ ） ＩＪス塩酸塩、
２０ ｍＭ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐｌ（８
，０）に溶解後、アガロースダル電気泳動にかけ分離後
、切シ出してｐＡＭ ３３０プラスミドＤＮＡ約１５μ
ｇを得た口 （３） （１）で得た染色体ＤＮＡ２０μ９と（２）
で得たプラスミドＤＮＡ １０μＩとを制限エンドヌク
レアーゼＭｂｏ ｌでそれぞれを３７℃、３０分間処理
し、部分切断した。６５℃、１０分の熱処理後、両反応
液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ
４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４
時間ＤＤＮＡ鎖連結反応を行った。６５℃、５分の熱処
理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終
了後のＤＮＡ ｉ沈澱採取した。
（４）トリメトプリム感受性のブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ １２０３６ ’に受容菌とし
て用いた。
クトファーメンタムＡＪ １２０３６ ’に受容菌とし
て用いた。
形質転換の方法としては、１−（４）で述べた方法を用
いた。トリメトプリム（Ｓｉｇｍａ社）２５μＩ／ｍｌ
ｙ含む再生培地にて、３０℃で１週間培養後、約１００
個のコロニーが出現してきたので、これをトリメトプリ
ムを含む最小培地（２％グルコース、ＩＸ硫酸アンモニ
ウム、０．２５％尿素、０．１％シん酸二水素カリウム
、０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオ
ン、２ｐｐｍマンガンイオン、２００μｍ１／１３サイ
アミン塩酸塩、５０μｍ１／ｌビオチン、ｐＨ７，０、
寒天１．８％、トリメトプリム５０μｍ７７ｍｌ ）に
レプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た。
いた。トリメトプリム（Ｓｉｇｍａ社）２５μＩ／ｍｌ
ｙ含む再生培地にて、３０℃で１週間培養後、約１００
個のコロニーが出現してきたので、これをトリメトプリ
ムを含む最小培地（２％グルコース、ＩＸ硫酸アンモニ
ウム、０．２５％尿素、０．１％シん酸二水素カリウム
、０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオ
ン、２ｐｐｍマンガンイオン、２００μｍ１／１３サイ
アミン塩酸塩、５０μｍ１／ｌビオチン、ｐＨ７，０、
寒天１．８％、トリメトプリム５０μｍ７７ｍｌ ）に
レプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た。
（５） これらの株より １− （２）で述べた方法
によ〕、溶菌液を調農し、アガロースゲル電気泳動法に
より、プラスミドＤＮＡ ？ ｋ出したところ、ベクタ
ーのｐＡＭ ３３０よりも明らかに大きなプラスミドが
検出された。この株をＡＪ １２１４７ （ＦＥＲＭ−
Ｐ７６７３ ）と名付けた。
によ〕、溶菌液を調農し、アガロースゲル電気泳動法に
より、プラスミドＤＮＡ ？ ｋ出したところ、ベクタ
ーのｐＡＭ ３３０よりも明らかに大きなプラスミドが
検出された。この株をＡＪ １２１４７ （ＦＥＲＭ−
Ｐ７６７３ ）と名付けた。
（６） 八Ｊ １２１４７が有するプラスミド（ｐＡ
Ｊ ２２８ ）上にトリメトプリム耐性遺伝子が存在す
ること全確認するため、このプラスミドＤＮＡ ’ｉ用
いブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １
２０３６ ’ｉ再度、形質転換した。
Ｊ ２２８ ）上にトリメトプリム耐性遺伝子が存在す
ること全確認するため、このプラスミドＤＮＡ ’ｉ用
いブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １
２０３６ ’ｉ再度、形質転換した。
生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ１０個を釣シ上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドＤＮＡ ’ｉ検出したところ、これらのいずれに
もｐＡＪ ２２８と同じ大きさのプラスミドが存在して
いた。上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を
表現する遺伝子が存在することが明らかとなった。
ぞれ１０個を釣シ上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドＤＮＡ ’ｉ検出したところ、これらのいずれに
もｐＡＪ ２２８と同じ大きさのプラスミドが存在して
いた。上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を
表現する遺伝子が存在することが明らかとなった。
（カ トリメトプリム耐性プラスミド（ｐＡＪ ２２８
）へのＨＫ遺伝子（ＰＡＪ ２１１の２．９ ｋｂ Ｐ
ｓｔ ｌＤＮＡ断片）の移しかえ ｐＡＪ ２２８はＰｓｔ ｌによる切断部位を有さない
ためＨＫ遺伝子を含むｐＡＪ ２１１由来の２．９ｋｂ
のＰｓｔ■断片をそのまま移しかえることは不可能であ
る。
）へのＨＫ遺伝子（ＰＡＪ ２１１の２．９ ｋｂ Ｐ
ｓｔ ｌＤＮＡ断片）の移しかえ ｐＡＪ ２２８はＰｓｔ ｌによる切断部位を有さない
ためＨＫ遺伝子を含むｐＡＪ ２１１由来の２．９ｋｂ
のＰｓｔ■断片をそのまま移しかえることは不可能であ
る。
そこで第１図に示した方法で移しかえを行った。
即ちｐＡＪ ２１１より制限酵素Ｐｓｔ ＩＫよる部分
切断で切シ出し７’ｃ ２．９ ｋｂのＤＮＡ断片の両
端にＢａｍＨＩ。
切断で切シ出し７’ｃ ２．９ ｋｂのＤＮＡ断片の両
端にＢａｍＨＩ。
Ｓａｌ Ｉ 、 Ｐｓｔ Ｉの切断部位をもった第１図
に示したような合成オリゴヌクレオチドリンカーｋＴ４
ファージ由来のＤＮＡ ！Ｊガーゼを用いて連結させた
後、制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。得られたＤＮＡ混
合物をアガロースゲル電気泳動法かけ、約２．９ｋｂの
ＤＮＡ断片全分離抽出し、エタノール沈澱によシＤＮＡ
断片を回収した。こうして得られたＤＮＡ断片は２．９
ｋｂのＨＫ遺伝子全含むＤＮＡの両端にＰｓｔＩ＋Ｓａ
ｌ Ｉ 、 ＢａｍＨｌの切断部位が並んだ構造になっ
ている（第１図）。
に示したような合成オリゴヌクレオチドリンカーｋＴ４
ファージ由来のＤＮＡ ！Ｊガーゼを用いて連結させた
後、制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。得られたＤＮＡ混
合物をアガロースゲル電気泳動法かけ、約２．９ｋｂの
ＤＮＡ断片全分離抽出し、エタノール沈澱によシＤＮＡ
断片を回収した。こうして得られたＤＮＡ断片は２．９
ｋｂのＨＫ遺伝子全含むＤＮＡの両端にＰｓｔＩ＋Ｓａ
ｌ Ｉ 、 ＢａｍＨｌの切断部位が並んだ構造になっ
ている（第１図）。
一方、ｐＡＪ ２２８は制限酵素Ｍｂｏ ｌで部分切断
した後６５℃、１０分の熱処理をした。この反応液に前
述の方法で得７’ｃＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を加え
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
した後６５℃、１０分の熱処理をした。この反応液に前
述の方法で得７’ｃＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を加え
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
反応後、６５℃、５分の熱処理葡し、２倍容の工タノー
ルの添加により沈澱採取されるＤＮＡ ｉ、ｆ−（４）
と同様の方法によりトリメトプリム感受性で、かつ、Ｈ
ＫＫ伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＪ １２０７８ ’ｅ受容菌としてゾロトゾ
ラストトランスフォーメーションを行った後、トリメト
プリム１００μｆｌ ／ｍｌ ２含むプロトシラスト再
生培地で培養した結果約２００個の再生コロニーが出現
してきた。
ルの添加により沈澱採取されるＤＮＡ ｉ、ｆ−（４）
と同様の方法によりトリメトプリム感受性で、かつ、Ｈ
ＫＫ伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＪ １２０７８ ’ｅ受容菌としてゾロトゾ
ラストトランスフォーメーションを行った後、トリメト
プリム１００μｆｌ ／ｍｌ ２含むプロトシラスト再
生培地で培養した結果約２００個の再生コロニーが出現
してきた。
これをトリメトプリム’１２００μｍ１７ｍ１ｔ−含み
受容菌の要求物質であるスレオニンを含まないｆ＆少培
地にレプリカし、トリメトプリム耐性で、かつスレオニ
ン要求性が消失した菌株４株を得た。これらの株よシ１
−（２）に示した方法によシ溶菌液を調製し、アガロー
ス・グル電気泳動によシゾラスミドＤＮＡを検出したと
ころｌ ４．９ ｋｂ 、 １２．２ ｋｂ。
受容菌の要求物質であるスレオニンを含まないｆ＆少培
地にレプリカし、トリメトプリム耐性で、かつスレオニ
ン要求性が消失した菌株４株を得た。これらの株よシ１
−（２）に示した方法によシ溶菌液を調製し、アガロー
ス・グル電気泳動によシゾラスミドＤＮＡを検出したと
ころｌ ４．９ ｋｂ 、 １２．２ ｋｂ。
９．６ ｋｂ 、 ６．５ ｋｂのプラスミドが検出さ
れた。このうち最も分子量の小さい６．５ｋｂのプラス
ミド−ｉ ｐＡＪ ２１２と名付けた。ｐＡＪ ２１２
’Ｉｋ保持する株を１２０７８− ［株と名付けた０ ｐＡＪ ２１２は、ＨＫ遺遺伝子全一て、ｐＡＪ ２２
４として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ １２１９６ （ＦＥＲＭ −Ｐ ８０１５ ）と
して寄託されている。
れた。このうち最も分子量の小さい６．５ｋｂのプラス
ミド−ｉ ｐＡＪ ２１２と名付けた。ｐＡＪ ２１２
’Ｉｋ保持する株を１２０７８− ［株と名付けた０ ｐＡＪ ２１２は、ＨＫ遺遺伝子全一て、ｐＡＪ ２２
４として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ １２１９６ （ＦＥＲＭ −Ｐ ８０１５ ）と
して寄託されている。
遺伝子が存在することを確認するためにこのプラスミド
ＤＮＡ ’ｉ用いブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＡＪ １２０７８ ｔ−再度形質転換した。
ＤＮＡ ’ｉ用いブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＡＪ １２０７８ ｔ−再度形質転換した。
生じたトリメトプリム耐性コロニーのうち、それぞれ１
０個を釣シ上げスレオニン要求性をテストシタところ、
これらのいずれも要求性を消失しておシ、上記の組換え
プラスミド上にＩ（Ｋ遺伝子が存在することが明らかと
なった。
０個を釣シ上げスレオニン要求性をテストシタところ、
これらのいずれも要求性を消失しておシ、上記の組換え
プラスミド上にＩ（Ｋ遺伝子が存在することが明らかと
なった。
３、 ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＤ）遺伝子のク
ローニング （１）ＨＤ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の
α−アミノ−β−ノ為イドロキシ吉草酸耐性突然変異株
ＡＪ １１１８８ （Ｆ震−Ｐ４１９０ ） （特公昭
５６−３０３８ ）を１１のＣＭＧ培地（ペプトン１１
１７ｄｌ、酵母エキス１１１７ｄｉ、グルコース０．５
ｇ／ｄｉ、及びＮａＣｌ ０．５１１ ／ｄｉ ’ｅ含
み、ｐＨ７，２に調整し友もの）に植菌し、３０℃で約
３時間振盪培養を行々い、対数増殖期の菌体を集めた。
ローニング （１）ＨＤ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の
α−アミノ−β−ノ為イドロキシ吉草酸耐性突然変異株
ＡＪ １１１８８ （Ｆ震−Ｐ４１９０ ） （特公昭
５６−３０３８ ）を１１のＣＭＧ培地（ペプトン１１
１７ｄｌ、酵母エキス１１１７ｄｉ、グルコース０．５
ｇ／ｄｉ、及びＮａＣｌ ０．５１１ ／ｄｉ ’ｅ含
み、ｐＨ７，２に調整し友もの）に植菌し、３０℃で約
３時間振盪培養を行々い、対数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡ ’ｉ抽出精
製し、最終的に３．６■のＤＮＡを得た。
のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡ ’ｉ抽出精
製し、最終的に３．６■のＤＮＡを得た。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ １８４４ （特開昭５８−１９
２９００参照）（分子量５．４メガダルトン）を用い、
そのＤＮＡを次の様にして調製した＠ ｐＡＪ １８４４は、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０５８が有していたプラスミドｐＨＭ１
５１９より誘導されたものである。
２９００参照）（分子量５．４メガダルトン）を用い、
そのＤＮＡを次の様にして調製した＠ ｐＡＪ １８４４は、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０５８が有していたプラスミドｐＨＭ１
５１９より誘導されたものである。
−４ｆ ｐＡＪ １８４４ ’にプラスミドとして保有
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ
１２０３７（ＦＥＲＭ−Ｐ７２３４ ） （ＦＥＲＭ−
ＢＰ５７７ ） ｆ １００ ａｔのＣＭＧ培地に接種
し、３０℃で対数増殖期後期まで培養したのち、リゾチ
ームＳＤ８処理により溶菌させ、３０，０ＯＯＸ１ｉ’
３０分の超遠心により上清を得た。フェノール処理の
のち、２容のエタノールを加えてＤＮＡ ’ｉ沈澱回収
し、ｐＡＪ １８４４プラスミドＤＮＡ約８０μｇを得
た。
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ
１２０３７（ＦＥＲＭ−Ｐ７２３４ ） （ＦＥＲＭ−
ＢＰ５７７ ） ｆ １００ ａｔのＣＭＧ培地に接種
し、３０℃で対数増殖期後期まで培養したのち、リゾチ
ームＳＤ８処理により溶菌させ、３０，０ＯＯＸ１ｉ’
３０分の超遠心により上清を得た。フェノール処理の
のち、２容のエタノールを加えてＤＮＡ ’ｉ沈澱回収
し、ｐＡＪ １８４４プラスミドＤＮＡ約８０μｇを得
た。
（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ ４０μｇを、制限酵素Ｐａｔｌ、０．
１２４ユニツトで３０℃、１０分間部分消化した。
た染色体ＤＮＡ ４０μｇを、制限酵素Ｐａｔｌ、０．
１２４ユニツトで３０℃、１０分間部分消化した。
（２）で得たプラスミドＤＮＡ １０μｇは制限エンド
ヌクレアーゼＰｓｔ Ｉで３７℃、２時間処理し、完全
に切断した。６５℃１０分の熱処理後、両反応液を混合
し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼによって２２℃、１５時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行った０６５℃５分の熱処理後、反応
液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮ
Ａ ’ｉ沈澱採、取した。
ヌクレアーゼＰｓｔ Ｉで３７℃、２時間処理し、完全
に切断した。６５℃１０分の熱処理後、両反応液を混合
し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼによって２２℃、１５時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行った０６５℃５分の熱処理後、反応
液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮ
Ａ ’ｉ沈澱採、取した。
（４）ＨＤ遺伝子のクローニング
ＨＤ遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムＡＪ １２０１９ （ＮＲＲＬＢ −１５３
４６）全受容菌として用いた。１−（４）で述べた方法
で形質転換をおこなった。
ーメンタムＡＪ １２０１９ （ＮＲＲＬＢ −１５３
４６）全受容菌として用いた。１−（４）で述べた方法
で形質転換をおこなった。
３０℃で１０日間培養後、クロラムフエニコール耐性で
あってかつホモセリン要求性が消失したＡＪ １２０２
０ （ＦＥＲＭ−ＢＰ２６９ ）を鯖ｂ（５）形質転換
株のプラスミド解析 これらの株よシ（２）で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースダル電気泳動法によシ、プラスミドＤ
ＮＡ ′ｌｔ検出したところ、７．６４Ｍａのプラスミ
ドを検出、し、ｐＡＪ ２１０と名づけた。
あってかつホモセリン要求性が消失したＡＪ １２０２
０ （ＦＥＲＭ−ＢＰ２６９ ）を鯖ｂ（５）形質転換
株のプラスミド解析 これらの株よシ（２）で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースダル電気泳動法によシ、プラスミドＤ
ＮＡ ′ｌｔ検出したところ、７．６４Ｍａのプラスミ
ドを検出、し、ｐＡＪ ２１０と名づけた。
（６）再トランスホーメーション
ＡＪ １２０２０内の組換えプラスオド（ｐＡＪ ２１
０ ’）上にＨＤ遺伝子が存在することを確認するため
にこのプラスミドＤＮＡを用いブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ １２０１９を再度形質転換し
た。
０ ’）上にＨＤ遺伝子が存在することを確認するため
にこのプラスミドＤＮＡを用いブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ １２０１９を再度形質転換し
た。
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーノウち、それ
ぞれ１０個を釣り上げホモセリン要求性をテストしたと
ころ、これらのいずれも要求性を消失しておシ、上記の
組換えプラスミド上にＨＤ遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
ぞれ１０個を釣り上げホモセリン要求性をテストしたと
ころ、これらのいずれも要求性を消失しておシ、上記の
組換えプラスミド上にＨＤ遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
４、 ｐＡＪ ２１０とｐＡＪ ２１２の共存による
Ｌ−スレオニンの生産 １）ＡＪ ２１０ ？ １− （４）で用いた形質転換
法によシ、スレオニン生産菌、ＡＨＶ耐性突然変異株ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １１１
８８（ＦＥＲＭ−Ｐ４１９０ ）中に導入し、形質転換
株をクロラムフェニコール耐性で選択し、菌株ＡＪ １
２０２１（ＦＥＲＭ−ＢＰ２７０ ）株を得た。
Ｌ−スレオニンの生産 １）ＡＪ ２１０ ？ １− （４）で用いた形質転換
法によシ、スレオニン生産菌、ＡＨＶ耐性突然変異株ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １１１
８８（ＦＥＲＭ−Ｐ４１９０ ）中に導入し、形質転換
株をクロラムフェニコール耐性で選択し、菌株ＡＪ １
２０２１（ＦＥＲＭ−ＢＰ２７０ ）株を得た。
同様にｐＡＪ ２１２を形質転換法によりＡＪ １１１
８８株に導入し、形質転換株をトリメトプリム耐性で選
択し、菌株１１１８８−ＨＫ株を得た。
８８株に導入し、形質転換株をトリメトプリム耐性で選
択し、菌株１１１８８−ＨＫ株を得た。
さらにｐＡＪ ２１２ ｆ、ＡＪ １２０２１株に導入
し、クロラムフェニコール耐性かつトリメトプリム耐性
で選択し、二種のプラスミドｐＡＪ ２１０とｐＡＪ
２１２ ｆ：含むＡＪ １２２０９ （ＦＥＲＭ−Ｐ８
１０６ ）株を得た。
し、クロラムフェニコール耐性かつトリメトプリム耐性
で選択し、二種のプラスミドｐＡＪ ２１０とｐＡＪ
２１２ ｆ：含むＡＪ １２２０９ （ＦＥＲＭ−Ｐ８
１０６ ）株を得た。
ＡＪ １１１８８株、 ＡＪ１２０２１株、 １１１８
８−ＨＫ株及びＡＪ １２２０９ 株ｉスレオニン生産
培地（グルコース１０、！ｉｌ／ｄ１．（ＮＨ４）２Ｓ
０４３ＩＩ／ｄｔ、皿２ＰＯ４０，１１／ｄｉ 、 Ｍ
ｇＳＯ４−７Ｈ２００，０４１１／ｄｌ 、 ＦｅＳＯ
４’７Ｈ２０１０ｒｎ９＋ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０１０タ
ｌチアミン−ＨＯ２３００μｍ１／ｌ、ビオチン１００
μＩ！／ｌ 、大豆蛋白酸加水分解液（「味液」）４５
■／ａｔ （全窒素として）、イソロイシン２５ダ／ｄ
ｔ、ロイシン３０■／ｄｌ 、 ｐＨ７，０。
８−ＨＫ株及びＡＪ １２２０９ 株ｉスレオニン生産
培地（グルコース１０、！ｉｌ／ｄ１．（ＮＨ４）２Ｓ
０４３ＩＩ／ｄｔ、皿２ＰＯ４０，１１／ｄｉ 、 Ｍ
ｇＳＯ４−７Ｈ２００，０４１１／ｄｌ 、 ＦｅＳＯ
４’７Ｈ２０１０ｒｎ９＋ＭｎＳＯ４’５Ｈ２０１０タ
ｌチアミン−ＨＯ２３００μｍ１／ｌ、ビオチン１００
μＩ！／ｌ 、大豆蛋白酸加水分解液（「味液」）４５
■／ａｔ （全窒素として）、イソロイシン２５ダ／ｄ
ｔ、ロイシン３０■／ｄｌ 、 ｐＨ７，０。
ＣａＣＯ５５ｆ！ ／ｄｉ （別に殺菌した））３０℃
にて７２時間振盪培養した。培養後、遠心上清中のＬ−
スレオニン、Ｌ−リジン及びＬ−ホモセリンをマイクロ
・９イオアツセイ又は高速液体クロマトグラフィーで定
量した。その結果を第１表に示した。
にて７２時間振盪培養した。培養後、遠心上清中のＬ−
スレオニン、Ｌ−リジン及びＬ−ホモセリンをマイクロ
・９イオアツセイ又は高速液体クロマトグラフィーで定
量した。その結果を第１表に示した。
尚、ｐＡＪ ２１０ 、 ｐＡＪ ２１２は寄託された
ＡＪ １２２０９株から通常の方法を用いて分離しうる
。
ＡＪ １２２０９株から通常の方法を用いて分離しうる
。
又、ＡＪ １２０１９はＡＪ １２０２０よシ、ＡＪ
１２０７８はＡＪ １２０７９又は１２０７８−ＵＫよ
シ、ＡＪ １１１８８はＡＪ １２０２１゜ＡＪ １２
０８０又はＡＪ １２２０９よシ宿主細胞を損なうこと
なく宿主細胞中の複合プラスミド全除去することによシ
容易に得られる。プラスミドは宿主よ）自然に失なわれ
ることもあるし、「除去」操作によって除くこともでき
る（ Ｂａｃｔ、 Ｒｅｖ、、 ３６． ｐ３６１−４
０５（１９７２） ）。
１２０７８はＡＪ １２０７９又は１２０７８−ＵＫよ
シ、ＡＪ １１１８８はＡＪ １２０２１゜ＡＪ １２
０８０又はＡＪ １２２０９よシ宿主細胞を損なうこと
なく宿主細胞中の複合プラスミド全除去することによシ
容易に得られる。プラスミドは宿主よ）自然に失なわれ
ることもあるし、「除去」操作によって除くこともでき
る（ Ｂａｃｔ、 Ｒｅｖ、、 ３６． ｐ３６１−４
０５（１９７２） ）。
除去操作の一例は以下の通シである：宿主の生育を不完
全に阻害する濃度（２−５０勢乍）のアクリジンオレン
ジを含む培地に、１ゴ当シ約１０４細胞程度になる様に
少量の菌株を接種し宿主菌の生育を不完全に阻害してか
ら２７−３７℃で一夜培養する（ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、 ８８．２６１（１９６４） ） ｏ培養液
を寒天培地に塗布し、２７−３７℃で一夜培養する。培
地上に出現したコロニーのうち、クロラムフェニコール
（１０μ！／／ＦＩＬＥ）又はトリメトプリム（５０μ
ｌ／ ／ｍｌ ）に感受性を示す株がプラスミドが除去
されている株で即ち、ＡＪ １２０１９ 。
全に阻害する濃度（２−５０勢乍）のアクリジンオレン
ジを含む培地に、１ゴ当シ約１０４細胞程度になる様に
少量の菌株を接種し宿主菌の生育を不完全に阻害してか
ら２７−３７℃で一夜培養する（ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、 ８８．２６１（１９６４） ） ｏ培養液
を寒天培地に塗布し、２７−３７℃で一夜培養する。培
地上に出現したコロニーのうち、クロラムフェニコール
（１０μ！／／ＦＩＬＥ）又はトリメトプリム（５０μ
ｌ／ ／ｍｌ ）に感受性を示す株がプラスミドが除去
されている株で即ち、ＡＪ １２０１９ 。
ＡＪ １２０７８及びＡＪ １１１８８でおる。
第 １ 表
実施例２
１ ＝（５） 、 ２− （８）及び３−（４）で得た
形質転換株ＡＪ １２０７９株（ＡＪ １２０７８／ｐ
ＡＪ ２１１ ） １２０７８−［株（ＡＪ １２０７
８／ｐＡＪ ２］２ ）及びＡＪ １２０２０株（ＡＪ
１２０１９／ｐＡＪ ２１０）はＬ−インロイシンを
生産した。第・２表は、各菌株の培養液上清中のＬ−イ
ソロイシンをマイクロバイオアッセイで定量した結果で
ある。
形質転換株ＡＪ １２０７９株（ＡＪ １２０７８／ｐ
ＡＪ ２１１ ） １２０７８−［株（ＡＪ １２０７
８／ｐＡＪ ２］２ ）及びＡＪ １２０２０株（ＡＪ
１２０１９／ｐＡＪ ２１０）はＬ−インロイシンを
生産した。第・２表は、各菌株の培養液上清中のＬ−イ
ソロイシンをマイクロバイオアッセイで定量した結果で
ある。
ＡＪ １２０７９ （形質転換株） １１
０１２０７８−ＨＫ（同 上）６５ ＡＪ］２０２０ （同 上） ３１０ＡＪ
１２０１９ （受容株） ＯＡＪ １２０
７８ （同 上） ＯＡＪ １１１８８
（ＤＮＡ供与株） ０なお、培養は
、４．で述べたスレオニン生産培地からイソロイシン及
びロイシンを除去した培地を用い、３０℃、７２時間振
盪培養した。
０１２０７８−ＨＫ（同 上）６５ ＡＪ］２０２０ （同 上） ３１０ＡＪ
１２０１９ （受容株） ＯＡＪ １２０
７８ （同 上） ＯＡＪ １１１８８
（ＤＮＡ供与株） ０なお、培養は
、４．で述べたスレオニン生産培地からイソロイシン及
びロイシンを除去した培地を用い、３０℃、７２時間振
盪培養した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２
０２８ （ＦＥＲＭ ＢＰ−２７２）は、Ｌ−イソロイ
シン生産菌であり、５−（２−アミノエチル−システィ
ン、 ＡＨＶ 、β−ヒドロキシロイシン耐性で、ロイ
シン栄養要求株として育種されたものである。
０２８ （ＦＥＲＭ ＢＰ−２７２）は、Ｌ−イソロイ
シン生産菌であり、５−（２−アミノエチル−システィ
ン、 ＡＨＶ 、β−ヒドロキシロイシン耐性で、ロイ
シン栄養要求株として育種されたものである。
との菌株’ｅ ２− （８）及び３−（５）で得たプラ
スミドｐＡＪ ２１２及びｐＡＪ ２１０ ＤＮＡで形
質転換し、１−（４）と同様の方法でクロラムフェニコ
ール及びトリメトプリム耐性形質転換株１２０２８ Ｄ
Ｋ株を得た。
スミドｐＡＪ ２１２及びｐＡＪ ２１０ ＤＮＡで形
質転換し、１−（４）と同様の方法でクロラムフェニコ
ール及びトリメトプリム耐性形質転換株１２０２８ Ｄ
Ｋ株を得た。
またアガロースダル電気泳動により形質転換株がｐＡＪ
２１０及びｐＡＪ ２１２ ’ｉｉ有していることを
確認した。
２１０及びｐＡＪ ２１２ ’ｉｉ有していることを
確認した。
４、で述べたスレオニン生産培地からインロイシンを除
去した培地で３０℃、７２時間形質転換株した。
去した培地で３０℃、７２時間形質転換株した。
第 ３ 表
１２０２８ ＤＫ （形質転換株） １．
２０ＡＪ １２０２８ （受容株） ０．７６
ＡＪ １１１８８ （ＤＮＡ供与株） ０
．００
２０ＡＪ １２０２８ （受容株） ０．７６
ＡＪ １１１８８ （ＤＮＡ供与株） ０
．００
Claims (1)
- ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子が組込まれてい
るプラスミド及びホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子が
組込まれているプラスミドを有するコリネホルム細菌を
培養することを特徴とするスレオニン又はイソロイシン
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3716885A JPS61195695A (ja) | 1985-02-26 | 1985-02-26 | スレオニン又はイソロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3716885A JPS61195695A (ja) | 1985-02-26 | 1985-02-26 | スレオニン又はイソロイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61195695A true JPS61195695A (ja) | 1986-08-29 |
| JPH0559710B2 JPH0559710B2 (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12490068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3716885A Granted JPS61195695A (ja) | 1985-02-26 | 1985-02-26 | スレオニン又はイソロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61195695A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5919670A (en) * | 1997-06-23 | 1999-07-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
| US6344347B1 (en) | 1999-09-20 | 2002-02-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing L-amino acids by fermentation |
| US7067289B1 (en) | 1999-09-20 | 2006-06-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing histidine by fermentation with E. coli |
| WO2007114465A1 (ja) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS57186496A (en) * | 1981-05-11 | 1982-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| JPS6030693A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-02-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
-
1985
- 1985-02-26 JP JP3716885A patent/JPS61195695A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57186496A (en) * | 1981-05-11 | 1982-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| JPS6030693A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-02-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5919670A (en) * | 1997-06-23 | 1999-07-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
| US6143552A (en) * | 1997-06-23 | 2000-11-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
| US6344347B1 (en) | 1999-09-20 | 2002-02-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing L-amino acids by fermentation |
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| US7067289B1 (en) | 1999-09-20 | 2006-06-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing histidine by fermentation with E. coli |
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| JPH0559710B2 (ja) | 1993-08-31 |
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