JPS6070093A - 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−チロシンの製造法Info
- Publication number
- JPS6070093A JPS6070093A JP58180031A JP18003183A JPS6070093A JP S6070093 A JPS6070093 A JP S6070093A JP 58180031 A JP58180031 A JP 58180031A JP 18003183 A JP18003183 A JP 18003183A JP S6070093 A JPS6070093 A JP S6070093A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tyrosine
- coryneform
- dna
- gene
- glutamic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるＬ−チロシンの製造法に関する。
発酵法によｊ５Ｌ−チロシンを製造しようとする場合、
野性株は殆んど菌体外にＬ−チロシンを生産しないで、
野性株に人工的に突然変異を生起せしめてＬ−チロシン
生産能を付与する方法がとられている。
野性株は殆んど菌体外にＬ−チロシンを生産しないで、
野性株に人工的に突然変異を生起せしめてＬ−チロシン
生産能を付与する方法がとられている。
従来知られているＬ−チロシン生産能を有スル人工変異
株としては、コリネバクテリウム属のフェ＝ ルア ラ
ニンを要求し３−アミノチロシン、ｐ−アミノフェニル
アラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒ
ドロキサメートに耐性を有する変異株Ｈ０Ｈａｇｉｎｏ
、に、Ｎａｋａｙａｍａ：Ａｇｒｉｃ’、Ｂｉｏｌ 。
株としては、コリネバクテリウム属のフェ＝ ルア ラ
ニンを要求し３−アミノチロシン、ｐ−アミノフェニル
アラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒ
ドロキサメートに耐性を有する変異株Ｈ０Ｈａｇｉｎｏ
、に、Ｎａｋａｙａｍａ：Ａｇｒｉｃ’、Ｂｉｏｌ 。
Ｃｈｅｍ、 ＪＪ、２００１（１９７３）、ゾルビパク
テリウム属のｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示
す変異株Ｓｕｇｉｍｏ ｔｏ ＋ＮａｋａｇａＷａ 、
Ｔｓｕｃｈｉ ｄａ 、Ｓｈｉ ｉｏ 、 ＋Ａｇｒ
ｉ ｃ。
テリウム属のｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示
す変異株Ｓｕｇｉｍｏ ｔｏ ＋ＮａｋａｇａＷａ 、
Ｔｓｕｃｈｉ ｄａ 、Ｓｈｉ ｉｏ 、 ＋Ａｇｒ
ｉ ｃ。
Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、 ｔ３Ｊ 、２３２７（１９７
３）等が知られている。
３）等が知られている。
本発明者らは、斜上のような従来の発酵法によるＬ−チ
ロシンの製造法に対し、コリネホルムグルタミン酸生産
菌に属する受容菌にコリネホルムグルタミン酸生産菌よ
）誘導された少なくともＬ−チロシンを要求する変異株
に導入されたときに該変異株のＬ−チロシン要求性を消
去せしめうるような遺伝子（以下チロシン生合成系遺伝
子と記す）を含むＤＮＡ （デオキシ＋Ｊ 、ｐ核酸）
断片が組み込まれているプラスミドを含有せしめること
によシ、高い収率でＬ−チロシンを生産するようになっ
た株が得られることを知った。
ロシンの製造法に対し、コリネホルムグルタミン酸生産
菌に属する受容菌にコリネホルムグルタミン酸生産菌よ
）誘導された少なくともＬ−チロシンを要求する変異株
に導入されたときに該変異株のＬ−チロシン要求性を消
去せしめうるような遺伝子（以下チロシン生合成系遺伝
子と記す）を含むＤＮＡ （デオキシ＋Ｊ 、ｐ核酸）
断片が組み込まれているプラスミドを含有せしめること
によシ、高い収率でＬ−チロシンを生産するようになっ
た株が得られることを知った。
チロシン生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片はコリネホル
ムグルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡよシ得ることがで
きる（チロシン生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片を与え
るものをＤＮＡ供与菌と称する）。
ムグルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡよシ得ることがで
きる（チロシン生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片を与え
るものをＤＮＡ供与菌と称する）。
−ｘ ＩＪ ネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌でアシ、非抗酸性でバーデース・マニュアル・オ
ツ・デターミネイティブバクテリオロジー第８版５９９
頁（１９７４）に記載されている。
性桿菌でアシ、非抗酸性でバーデース・マニュアル・オ
ツ・デターミネイティブバクテリオロジー第８版５９９
頁（１９７４）に記載されている。
本発明の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野性株の例としては次のようなものがあ
げられる。
ミン酸生産菌の野性株の例としては次のようなものがあ
げられる。
ブレビバクテリウム・ディパリカタム ＡＴＣＣ１４０
２０ブレビバクテリウム拳サツカロリテイクム ＡＴＣ
Ｃ１４０６６プレビハクテリウム・インマリオフィルム
ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９フレヒハクテリウム・
ロゼラム ＡＴＣＣ’ １３８２５ブレビバクテリウム
・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウム・
テオグニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウ
ム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０ム コリネバクテリウム・アセトグルタミク＞ ＡＴＣＣ１
５８０６コリネパクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５
９９１コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１
３０３２，１３０６０コリネバクテリウム・リリウム
ＡＴＣＣ１’５９９０コリネバクテリウム・メラセコー
ラ ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニ
アフィラム ＡＴＣＣ１５３５４コリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌にはグルタミン酸生産性を失なった変異株
、あるいは、リジン、アルギニン等のアミノ酸、イノシ
ン等のプリンヌクレオシド、イノシン５′−モノシん酸
等のプリンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。
２０ブレビバクテリウム拳サツカロリテイクム ＡＴＣ
Ｃ１４０６６プレビハクテリウム・インマリオフィルム
ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９フレヒハクテリウム・
ロゼラム ＡＴＣＣ’ １３８２５ブレビバクテリウム
・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウム・
テオグニタリス ＡＴＣＣ１９２４０コリネバクテリウ
ム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０ム コリネバクテリウム・アセトグルタミク＞ ＡＴＣＣ１
５８０６コリネパクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５
９９１コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１
３０３２，１３０６０コリネバクテリウム・リリウム
ＡＴＣＣ１’５９９０コリネバクテリウム・メラセコー
ラ ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニ
アフィラム ＡＴＣＣ１５３５４コリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌にはグルタミン酸生産性を失なった変異株
、あるいは、リジン、アルギニン等のアミノ酸、イノシ
ン等のプリンヌクレオシド、イノシン５′−モノシん酸
等のプリンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。
ＤＮＡ 供与菌としては、チロシン前駆体が二スト耐性
などの変異を付与することによシ、チロシンまたはその
前駆体の生合成活性が高まったような変異株を用いれば
更によい。
などの変異を付与することによシ、チロシンまたはその
前駆体の生合成活性が高まったような変異株を用いれば
更によい。
チロシンアンタゴニストの例としては３−アミノチロシ
ン、チロシンヒドロキサメート、ｍ−フルオロフェニル
アラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−チロシ
ン、β−２−チェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルア
ラニン、ｍ−フルオロチロシン等がある。ここにいうチ
ロシンの前駆体とは３−デヒドロキシ−Ｄ−アラビノ−
へプッロン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−
（５） デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、
５−エノールビルビルシキミ酸３−リン酸、コリズミ酸
、プレフェン酸、プレチロシンなどをいう。
ン、チロシンヒドロキサメート、ｍ−フルオロフェニル
アラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−チロシ
ン、β−２−チェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルア
ラニン、ｍ−フルオロチロシン等がある。ここにいうチ
ロシンの前駆体とは３−デヒドロキシ−Ｄ−アラビノ−
へプッロン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ酸、３−
（５） デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、
５−エノールビルビルシキミ酸３−リン酸、コリズミ酸
、プレフェン酸、プレチロシンなどをいう。
このような変異株の例としては前述のコリネバクテリウ
ム属のフェニルアラニンを要求し、３−アミノチロシン
、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニル
アラニン、テロシンヒドロオロフェニルアラニンに耐性
を有する変異株（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、ＮａｋａｇａＷａ
、Ｔｓｕｃｈｌｄａ、５ｈｉｉｏ−＋Ａｇｒｉｃ−Ｂ１
ｏ１．Ｃｂｅｍ、、３７，２３２７（１９７３））等が
知られている。
ム属のフェニルアラニンを要求し、３−アミノチロシン
、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニル
アラニン、テロシンヒドロオロフェニルアラニンに耐性
を有する変異株（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、ＮａｋａｇａＷａ
、Ｔｓｕｃｈｌｄａ、５ｈｉｉｏ−＋Ａｇｒｉｃ−Ｂ１
ｏ１．Ｃｂｅｍ、、３７，２３２７（１９７３））等が
知られている。
チロシン前駆体の生合成活性が高まったような変異株の
例として、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３７２３
２７チエロ７’ｆＲ−７−リン酸合成酵素のフェニルア
ラニン、チロシンによるフィードバック阻害が解除され
た株が得られている。
例として、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３７２３
２７チエロ７’ｆＲ−７−リン酸合成酵素のフェニルア
ラニン、チロシンによるフィードバック阻害が解除され
た株が得られている。
（６）
ＤＮＡ供与菌としては例えばエシェリヒア・コリなどの
コリネホルム・グルタミン酸生産菌以外の菌株も当然用
いうる。・ チロシン生合成系遺伝子としては３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−へグチュロン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ ）合
成酵素遺伝子、３−デヒドロキナ酸合成酵素遺伝子、３
−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、シキミ酸デヒ
ドロｒナーゼ遺伝子、シキミ酸キナーゼ遺伝子、５−エ
ノールビルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素遺伝子、
コリズＰｉ合成酵素遺伝子、コリスミン酸ムターゼ遺伝
子、ゾレフ；ン酸脱水素酵素遺伝子、プレチロシンアミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子などがあげられる。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌以外の菌株も当然用
いうる。・ チロシン生合成系遺伝子としては３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−へグチュロン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ ）合
成酵素遺伝子、３−デヒドロキナ酸合成酵素遺伝子、３
−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、シキミ酸デヒ
ドロｒナーゼ遺伝子、シキミ酸キナーゼ遺伝子、５−エ
ノールビルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素遺伝子、
コリズＰｉ合成酵素遺伝子、コリスミン酸ムターゼ遺伝
子、ゾレフ；ン酸脱水素酵素遺伝子、プレチロシンアミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子などがあげられる。
これらの遺伝子をコリネホルムグルタミン酸生産菌の菌
体内で自律複製できるベクタープラスミド上に挿入して
コリネホルムグルタミン酸生産菌に属するＤＮＡ受容菌
に導入すれば、チロシン生産能の向上した株を得ること
ができる。用いる遺伝子としては野生型のものの他前述
のようなチロシンアンタゴニスト耐性などによシ誘導さ
れた変異型の遺伝子を用いると更によい。野生型遺伝子
を取得後、これが導入されたＤＮＡ受容菌に変異処理を
施してベクター上の遺伝子を改良するか、野生型遺伝子
を含むプラスミドＤＮＡに試験管内で、修飾を施して遺
伝子を改良することは当然良好な結果を生む場合がある
。ここにいう遺伝子の改良とは遺伝子産物であるチロシ
ン生合成系酵素の合成量が増強される１分子当りの比活
性が上昇する、生成物、最終産物による酵素阻害が軽減
または解除されるなどチロシン生産を促進するような望
ましい影響を与える遺伝子の修飾をいう。
体内で自律複製できるベクタープラスミド上に挿入して
コリネホルムグルタミン酸生産菌に属するＤＮＡ受容菌
に導入すれば、チロシン生産能の向上した株を得ること
ができる。用いる遺伝子としては野生型のものの他前述
のようなチロシンアンタゴニスト耐性などによシ誘導さ
れた変異型の遺伝子を用いると更によい。野生型遺伝子
を取得後、これが導入されたＤＮＡ受容菌に変異処理を
施してベクター上の遺伝子を改良するか、野生型遺伝子
を含むプラスミドＤＮＡに試験管内で、修飾を施して遺
伝子を改良することは当然良好な結果を生む場合がある
。ここにいう遺伝子の改良とは遺伝子産物であるチロシ
ン生合成系酵素の合成量が増強される１分子当りの比活
性が上昇する、生成物、最終産物による酵素阻害が軽減
または解除されるなどチロシン生産を促進するような望
ましい影響を与える遺伝子の修飾をいう。
具体的にはプロモーター領域の変異または変換あるいは
構造遺伝子の変異、修飾によシこれらは達せられうる。
構造遺伝子の変異、修飾によシこれらは達せられうる。
チロシン生合成系遺伝子の複数の遺伝子を同一のベクタ
ーシラスミド上に挿入するか、共存しうる複数のベクタ
ー上に別々に挿入したのち受容菌に導入すればよシよい
結果を与える場合がある。
ーシラスミド上に挿入するか、共存しうる複数のベクタ
ー上に別々に挿入したのち受容菌に導入すればよシよい
結果を与える場合がある。
ＤＮＡ受容菌として用いるコリネホルムグルタミン酸生
産菌に属する菌としては、前述したような各種の菌株を
用いうる。受容菌としてチロシン要求性をもつ菌株を用
いればその要求性の消失によシ容易に、チロシン生合成
系遺伝子の導入された形質転換株を選択することができ
る。またチロシンアンタゴニストに感受性の株を受容菌
として用いた場合、チロシンアンタゴニスト耐性に関与
するチロシン生合成系遺伝子の導入された形質転換株を
チロシンアンタゴニスト耐性株として容易に選択するこ
とができる。よシ高いチロシン生産能をもつ形質転換株
を得るたメニハ、チロシンアンタゴニスト耐性、栄養要
求性などの変異を付与することによってチロシンまたは
その前駆体の生合成活性が高まったような変異株を受容
菌として用いるとよシよい結果を与える。
産菌に属する菌としては、前述したような各種の菌株を
用いうる。受容菌としてチロシン要求性をもつ菌株を用
いればその要求性の消失によシ容易に、チロシン生合成
系遺伝子の導入された形質転換株を選択することができ
る。またチロシンアンタゴニストに感受性の株を受容菌
として用いた場合、チロシンアンタゴニスト耐性に関与
するチロシン生合成系遺伝子の導入された形質転換株を
チロシンアンタゴニスト耐性株として容易に選択するこ
とができる。よシ高いチロシン生産能をもつ形質転換株
を得るたメニハ、チロシンアンタゴニスト耐性、栄養要
求性などの変異を付与することによってチロシンまたは
その前駆体の生合成活性が高まったような変異株を受容
菌として用いるとよシよい結果を与える。
チロシンの菌体外への透過性が改善された変異株、チロ
シンの分解性の低下した変異株、ホスホエノールピルビ
／酸、グルタミン酸などチロシン生合成に素材として供
給される代謝産物の生合成能が高まったような変異株ま
たは組換え体も当然良い結果を生む場合がある。
シンの分解性の低下した変異株、ホスホエノールピルビ
／酸、グルタミン酸などチロシン生合成に素材として供
給される代謝産物の生合成能が高まったような変異株ま
たは組換え体も当然良い結果を生む場合がある。
使用するベクターとしてはコリネホルムグルタ（９）
ミン酸生産菌の中で自律複製できるプラスミドであれば
いかなるものでもよい。
いかなるものでもよい。
例として以下のものがあげられる。
（１３ｐＡＭ３３０ ：特開昭５８−６７６９９参照（
２） ｐＨＭ１５１９ ：特開昭５８−７７８９５参照
（３） １）ＡＪ６５５ （、） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１８８２
（ＦＢＲＭ−Ｐ６５１７−ＦＥＲＭ−ＢＰ１３６など）
（ｂ） 分子量＝６．６メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第１図参照 （ｄ） 性 質： ｐＡＭ３３０とｐＢＲ３２５（Ｇｅ
ｎｅ ４１２１（１９７Ｂ））の複合グラスミド。ク ロラムフェニコール耐性に与る。
２） ｐＨＭ１５１９ ：特開昭５８−７７８９５参照
（３） １）ＡＪ６５５ （、） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１８８２
（ＦＢＲＭ−Ｐ６５１７−ＦＥＲＭ−ＢＰ１３６など）
（ｂ） 分子量＝６．６メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第１図参照 （ｄ） 性 質： ｐＡＭ３３０とｐＢＲ３２５（Ｇｅ
ｎｅ ４１２１（１９７Ｂ））の複合グラスミド。ク ロラムフェニコール耐性に与る。
（４） ｐＡＪ６１１
（ａ） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１８８４
（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ１３８など）
（ｂ） 分子量：６．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第２図参照（ｄ） 性 質
： ｐＡＭ２８１とｐＢＲ３２５の複合シラスミド。ク
ロラムフェニコール耐性 （１０） に与る。
（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ１３８など）
（ｂ） 分子量：６．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第２図参照（ｄ） 性 質
： ｐＡＭ２８１とｐＢＲ３２５の複合シラスミド。ク
ロラムフェニコール耐性 （１０） に与る。
（３） ＰＡＪ４４０
（ＩＬ）宿主菌：バチルスズブチリスＡＪ １１９０１
（ＦＥＲＭ−ＢＰ１４０−ＡＴＣＣ３９１３９など）（
ｂ） 分子量：６６０メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第３図参照（ｄ） 性質：
ｐＡＭ３３０とｐＵＢｌｌｏ（Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、。
（ＦＥＲＭ−ＢＰ１４０−ＡＴＣＣ３９１３９など）（
ｂ） 分子量：６６０メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第３図参照（ｄ） 性質：
ｐＡＭ３３０とｐＵＢｌｌｏ（Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、。
出３１Ｂ（１９７８）の複合プラスミ
ド。カナマイシン耐性に与る。
（４） ｐＡＪ１８４４
（ａ） 宿主ｍＷ：エシェリヒア・コリ ＡＪ １１８
８３（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３
７など）（ｂ） 分子量：５．４メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第４図参照（ｄ） 性 質
： １■１５１９とｐＢＲ３２５の複合プラスミ戸。ク
ロ２ムフエニコール耐 性に与る。
８３（ＦＥＲＭ−Ｐ ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３
７など）（ｂ） 分子量：５．４メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第４図参照（ｄ） 性 質
： １■１５１９とｐＢＲ３２５の複合プラスミ戸。ク
ロ２ムフエニコール耐 性に与る。
（５） ｐＡＪ３１４８
（＆）宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミン酸５Ｒ
８２０３ＡＴＣＣ３９１３７など（ｂ） 分子量：６．
６メガダルトン （、） 制限酵素切断地図：第５図参照（ｄ） 性 質
： ｐＨＭ１５１９とｐＵＢ １１０との複合プラスミ
ド。カナマイシン耐性に与 る。
８２０３ＡＴＣＣ３９１３７など（ｂ） 分子量：６．
６メガダルトン （、） 制限酵素切断地図：第５図参照（ｄ） 性 質
： ｐＨＭ１５１９とｐＵＢ １１０との複合プラスミ
ド。カナマイシン耐性に与 る。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で増殖可能な
プラスミドのその他の例としてはｐＣＧ １（特開昭５
７−１３４５００ ）、Ｉ）ＣＧ ２ （特開昭５８−
３５１９７ ）、ｐＣＧ ４、ＰＣＧ １１ （特開昭
５７−１８３７９９）があシ、これらはいずれも当然使
用可能であろう。
プラスミドのその他の例としてはｐＣＧ １（特開昭５
７−１３４５００ ）、Ｉ）ＣＧ ２ （特開昭５８−
３５１９７ ）、ｐＣＧ ４、ＰＣＧ １１ （特開昭
５７−１８３７９９）があシ、これらはいずれも当然使
用可能であろう。
ＤＮＡ供与菌の染色体ＤＮＡ及び、ベクターＤＮＡは通
常の方法によシ抽出することができる。
常の方法によシ抽出することができる。
染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡはそれぞれ制限酵素を
用いて切断する。ベクターＤＮＡの開裂は当該ベクター
ＤＮＡを一ケ所で切断する制限酵素を用いて切断するか
、複数部位切断する制限酵素を部分的に作用させること
によシ達せられる。染色体ＤＮＡについては、制限エン
ドヌクレアーゼによる切断が部分的に行われるように反
応条件を調節すれば、多くのＳ類の制限酵素が使用でき
る。
用いて切断する。ベクターＤＮＡの開裂は当該ベクター
ＤＮＡを一ケ所で切断する制限酵素を用いて切断するか
、複数部位切断する制限酵素を部分的に作用させること
によシ達せられる。染色体ＤＮＡについては、制限エン
ドヌクレアーゼによる切断が部分的に行われるように反
応条件を調節すれば、多くのＳ類の制限酵素が使用でき
る。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベク
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。
一方、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、染色体
ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤＮＡとにデオキシアデ
ニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
ＤＮＡ断片と開裂したベクターＤＮＡとにデオキシアデ
ニル酸とデオキシチシジル酸、または、デオキシグアニ
ル酸とデオキシチシジル酸をそれぞれ付加し、混合した
のち、アニーリングして連結せしめる方法も利用しうる
。
このようにして得られた、染色体ＤＮＡとベクターシラ
スミドとの連結物のコリネホルムグルタミン酸生産菌に
属する受容菌への導入は、エシェリヒア・コリに−１２
について報告されている様な（Ｍａｎｄａｌ、Ｍ、ａｎ
ｄ ＨｌｇａｐＡ、＊ＪｓＭｏｌ−Ｂｌｏｔ−ｐ５３．
１５９（１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブ
チリスについて報告されている様に（Ｄｕｎｃａｎ、Ｃ
，Ｈ，＋Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ、Ａ、ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、
ＦＪ、ｐＧ＠ｎｅｙｌｙ１５３ （１９７７））細胞が
ＤＮＡを取シ込み得る様になる増殖段１１！’（い（１
３） わゆるコンピテントセル）に導入する方法にょシ可能で
ある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類およ
び酵母について知られている様に（Ｃｈａｎｇ、Ｓ、ａ
ｎｄ ＣｈｏｅｎｙＳ、Ｎ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、。
スミドとの連結物のコリネホルムグルタミン酸生産菌に
属する受容菌への導入は、エシェリヒア・コリに−１２
について報告されている様な（Ｍａｎｄａｌ、Ｍ、ａｎ
ｄ ＨｌｇａｐＡ、＊ＪｓＭｏｌ−Ｂｌｏｔ−ｐ５３．
１５９（１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブ
チリスについて報告されている様に（Ｄｕｎｃａｎ、Ｃ
，Ｈ，＋Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ、Ａ、ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、
ＦＪ、ｐＧ＠ｎｅｙｌｙ１５３ （１９７７））細胞が
ＤＮＡを取シ込み得る様になる増殖段１１！’（い（１
３） わゆるコンピテントセル）に導入する方法にょシ可能で
ある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類およ
び酵母について知られている様に（Ｃｈａｎｇ、Ｓ、ａ
ｎｄ ＣｈｏｅｎｙＳ、Ｎ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、。
１６８．１１１（１９７９）：Ｂｉｂｂ 、Ｍ、Ｊ、
、Ｗａｒｄ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄＨｏｐｗｏｏｄ ｙＯ−Ａ
−ｔＮａｔｕｒｅ ｅ２７４．ｔ ３９８（１９７８）
：Ｈｌ ｎｎｅｎ ＊Ａ、、Ｈ１ｅｋｓ 、Ｊ、Ｂ、
ａｎｄ Ｆｉｎｋ、Ｇ、Ｒ，ｙＰｒｏｅ、Ｎａｔｌ 、
Ａｃａｄ。
、Ｗａｒｄ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄＨｏｐｗｏｏｄ ｙＯ−Ａ
−ｔＮａｔｕｒｅ ｅ２７４．ｔ ３９８（１９７８）
：Ｈｌ ｎｎｅｎ ＊Ａ、、Ｈ１ｅｋｓ 、Ｊ、Ｂ、
ａｎｄ Ｆｉｎｋ、Ｇ、Ｒ，ｙＰｒｏｅ、Ｎａｔｌ 、
Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、戸１９２９（１９７８））、ＤＮＡ受
容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取シ込むプロトプラ
ストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをＤＮＡ
受容菌に導入することも可能である。
容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取シ込むプロトプラ
ストまたはスフェロプラストにしてプラスミドをＤＮＡ
受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスの方
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭５７
−１８３７９９に記載されたコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属のプロトプラストにポリエチレ
ングリコールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にＤＮＡをとシ込ませる方法も自然利用
できる。ぼりエチレンクリコールマタハポリビニルアル
コールのかわシに、カルがキシメチルセルロース、デキ
（１４） ストラン、フィコール、ゾルロニックＦ６８ （セルパ
社）などの添加によってＤＮＡのとシ込みを促進させる
方法でも同等の□結果が得られる。
法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭５７
−１８３７９９に記載されたコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属のプロトプラストにポリエチレ
ングリコールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にＤＮＡをとシ込ませる方法も自然利用
できる。ぼりエチレンクリコールマタハポリビニルアル
コールのかわシに、カルがキシメチルセルロース、デキ
（１４） ストラン、フィコール、ゾルロニックＦ６８ （セルパ
社）などの添加によってＤＮＡのとシ込みを促進させる
方法でも同等の□結果が得られる。
チロシン生合成系遺伝子がベクタープラスミドに接続さ
れて、導入された形質転換株を選択は、チロシン要求株
を受容菌とした場合にはチロシン要求性を失なった株を
選ぶことによシ、チロシンアンタゴニスト感受性菌を受
容菌としてチロシンアンタゴニスト耐性に与るチロシン
生合成系遺伝子を導入する場合は該アンタゴニスト耐性
となった株を選ぶことによシ、容易に達せられるが、チ
ロシン生産性の向上を指標として選択することも可能で
ある。ベクターに薬剤耐性などの遺伝マーカーが存在す
る場合にはこの形質を併せて選択に用いれば、よシ容易
に形質転換株を選ぶことができる。
れて、導入された形質転換株を選択は、チロシン要求株
を受容菌とした場合にはチロシン要求性を失なった株を
選ぶことによシ、チロシンアンタゴニスト感受性菌を受
容菌としてチロシンアンタゴニスト耐性に与るチロシン
生合成系遺伝子を導入する場合は該アンタゴニスト耐性
となった株を選ぶことによシ、容易に達せられるが、チ
ロシン生産性の向上を指標として選択することも可能で
ある。ベクターに薬剤耐性などの遺伝マーカーが存在す
る場合にはこの形質を併せて選択に用いれば、よシ容易
に形質転換株を選ぶことができる。
得られたＬ−チロシン生産菌を培養する方法は、従来の
Ｌ−チロシン生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。
Ｌ−チロシン生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトー
ス等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖
蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、
アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。
ス等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖
蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、
アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地のｐｌ（及び温度を適宜調節
しつつ、実質的にＬ−チロシンの生産蓄積が停止するま
で行なわれる。
しつつ、実質的にＬ−チロシンの生産蓄積が停止するま
で行なわれる。
かくして培養液中には著量のＬ−チロシンが生成蓄積さ
れる。培養液よ１）Ｌ−チロシンを採取するには、通常
の方法が適用できる。
れる。培養液よ１）Ｌ−チロシンを採取するには、通常
の方法が適用できる。
実施例
（１）染色体ＤＮＡの調製
ｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示スフレビパク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＪ３４３７（ＦＥＰ
Ｍ Ｐ−１９１４）を１ｔのＣＭＧ培地（ペゾトン１１
Ｉｌｄへ酵母エキス１１１７ｄｌ、グルコース０．５１
１／ｄｌ、及びＮａＣ４０，５１／ｄｌを含み、ｐＨ７
，２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪
培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。
テリウム・ラクトファーメンタムＡＪ３４３７（ＦＥＰ
Ｍ Ｐ−１９１４）を１ｔのＣＭＧ培地（ペゾトン１１
Ｉｌｄへ酵母エキス１１１７ｄｌ、グルコース０．５１
１／ｄｌ、及びＮａＣ４０，５１／ｄｌを含み、ｐＨ７
，２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪
培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製し
、最終的に３，５９のＤＮＡを得た。
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製し
、最終的に３，５９のＤＮＡを得た。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ１８４４ （分子量５．４メガダ
ルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。
ルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。
まずｐＡＪ１８４４をプラスミドとして保有するブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３７
を１００ｍ７！のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチーム８ＤＳ処理によ
シ溶菌させ、３０，０ＯＯＸ、９３０分の超遠心によシ
上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタノール
を加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少量のＴ烈緩衝
液（２０ｍＭ）リス塩酸塩、２０ｍＭＮａＣＬ１１ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）に溶解後、アガロースゲル
電気泳動にかけ分離後、切シ出してｐＡＪ１８４４プラ
スミドＤＮＡ約１５μＩを得た。
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ １２０３７
を１００ｍ７！のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチーム８ＤＳ処理によ
シ溶菌させ、３０，０ＯＯＸ、９３０分の超遠心によシ
上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタノール
を加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少量のＴ烈緩衝
液（２０ｍＭ）リス塩酸塩、２０ｍＭＮａＣＬ１１ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）に溶解後、アガロースゲル
電気泳動にかけ分離後、切シ出してｐＡＪ１８４４プラ
スミドＤＮＡ約１５μＩを得た。
（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡｌ０μＩと（２）で得たシラスミ（１７
） ）’ＤＮＡ５μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰ８ｔＩ
テそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断した。
た染色体ＤＮＡｌ０μＩと（２）で得たシラスミ（１７
） ）’ＤＮＡ５μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰ８ｔＩ
テそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断した。
６５℃１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及
ヒジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼによって１０’Ｃ１２４時間ＤＮＡ鎖の連結
反応を行った。６５℃５分の熱処理後、反応液に２倍容
のエタノールを加えて連結反を有するＤＮＡ断片のクロ
ーニング ｍ−フルオロフェニルアラニン感受性、及びリジン、ス
レオニン、メチオニン要求性のブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＴＣＣ３９１３４を受容菌として
用いた。
ヒジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼによって１０’Ｃ１２４時間ＤＮＡ鎖の連結
反応を行った。６５℃５分の熱処理後、反応液に２倍容
のエタノールを加えて連結反を有するＤＮＡ断片のクロ
ーニング ｍ−フルオロフェニルアラニン感受性、及びリジン、ス
レオニン、メチオニン要求性のブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＴＣＣ３９１３４を受容菌として
用いた。
形質転換の方法としては、プロトシラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ｍｌのＣＭＧ
液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧ
′Ｉ！１ｌ−０，６ユニ、トン−添加後、さらに１．
５時間振盪培養し、遠心分離にょシ菌体を集め、菌体を
０．５ Ｍビュークロース、２０ｍＭマレ（１８） イン酸、２０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ベナ。
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ｍｌのＣＭＧ
液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧ
′Ｉ！１ｌ−０，６ユニ、トン−添加後、さらに１．
５時間振盪培養し、遠心分離にょシ菌体を集め、菌体を
０．５ Ｍビュークロース、２０ｍＭマレ（１８） イン酸、２０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ベナ。
セイブロス（ｐｉｆｃｏ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐＨ
６，５）Ｑ、 ５ ｍｌで洗浄した。次伝で１０ｍｇ／
ｍｌのリゾチームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で
２０時間グプロトラスト化を図った。６０００Ｘ、Ｆ、
１０分間遠心分離後、プロトシラストをＳＭＭＰで洗浄
し０．５ ｍＡ！のＳＭＶＰに再度懸濁した。この様に
して得られたプロトプラストと（３）で調製したＤＮＡ
１０μＪを５ ｍ ＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ぼり
エチレングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加
した後、ＤＮＡをプロトプラストに取シ込ませる為に室
温に２分間放置した。このプロトシラストをＳＭＭＰ培
地１ ａｌで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１プに再懸濁し、形
質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培養液をｐ
ｉ（７，０のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プ
ロトシラスト再生培地は蒸留水ＩＬあたυトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン１２１！、ＫＣ，ｔｏ、５
１１．グルコース１０ Ｆ ｓ ＭｇＣｌ２ ＠６Ｈ２
０８，１１ｓ ＣａＣｔ２Ｑ２ａ２ｏ ２．２９、ペプ
トンａｙ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Ｄｌｆｃ
ｏ社） １ 、Ｆ １に２ＨＰＯ４０，２，９，コハク
酸ナトリウム１３５ＩＩ、寒天８ｇ及びクロラムフェニ
コール３μｌｌ／ｒｒｔｌを含む。 ・３０℃で２週間
培養後、出現してきたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーをｍ−フルオロフェニルアラニンを１０００μＩ！／
ｍｌ含む培地（２チグルコース、１％硫酸アンモニウム
、０．２５％尿素、０．１％υん酸二水素、カリウム、
０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン
、２ｐｐｍマンガンイオン、２００μｍ１／ｌサイアミ
ン塩酸塩、５０μｍ／／ｌビオチン、リジン、スレオニ
ン、メチオニン各１００ｍ９／ｌ ｐＨ７，０、寒天１
．８％）にレプリカし、クロラムフェニコール耐性テカ
つｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示すコロニー
、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＡＪ１２０
８１ （ＦＥＲＭ−Ｐ ７２４Ｂ）を得た。
６，５）Ｑ、 ５ ｍｌで洗浄した。次伝で１０ｍｇ／
ｍｌのリゾチームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で
２０時間グプロトラスト化を図った。６０００Ｘ、Ｆ、
１０分間遠心分離後、プロトシラストをＳＭＭＰで洗浄
し０．５ ｍＡ！のＳＭＶＰに再度懸濁した。この様に
して得られたプロトプラストと（３）で調製したＤＮＡ
１０μＪを５ ｍ ＭＥＤＴＡ存在下で混合し、ぼり
エチレングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加
した後、ＤＮＡをプロトプラストに取シ込ませる為に室
温に２分間放置した。このプロトシラストをＳＭＭＰ培
地１ ａｌで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１プに再懸濁し、形
質発現の為、３０℃で２時間培養した。この培養液をｐ
ｉ（７，０のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プ
ロトシラスト再生培地は蒸留水ＩＬあたυトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン１２１！、ＫＣ，ｔｏ、５
１１．グルコース１０ Ｆ ｓ ＭｇＣｌ２ ＠６Ｈ２
０８，１１ｓ ＣａＣｔ２Ｑ２ａ２ｏ ２．２９、ペプ
トンａｙ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Ｄｌｆｃ
ｏ社） １ 、Ｆ １に２ＨＰＯ４０，２，９，コハク
酸ナトリウム１３５ＩＩ、寒天８ｇ及びクロラムフェニ
コール３μｌｌ／ｒｒｔｌを含む。 ・３０℃で２週間
培養後、出現してきたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーをｍ−フルオロフェニルアラニンを１０００μＩ！／
ｍｌ含む培地（２チグルコース、１％硫酸アンモニウム
、０．２５％尿素、０．１％υん酸二水素、カリウム、
０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン
、２ｐｐｍマンガンイオン、２００μｍ１／ｌサイアミ
ン塩酸塩、５０μｍ／／ｌビオチン、リジン、スレオニ
ン、メチオニン各１００ｍ９／ｌ ｐＨ７，０、寒天１
．８％）にレプリカし、クロラムフェニコール耐性テカ
つｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示すコロニー
、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＡＪ１２０
８１ （ＦＥＲＭ−Ｐ ７２４Ｂ）を得た。
（５）形質転換株のシラスミド解析
これらの株よシ（２）で述べた方法によシ、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法によシ、シラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、ベクターのｐＡＪ１８４４よシ
も明らかに大きなプラスミドが検出された０ ＡＪ１２０８１株のもつプラスミドを、組換えに用いた
制限酵素Ｐｓｔ ｌで切断すると１．２と１．４メガダ
ルトンのＤＮＡ断片が検出された。
製し、アガロースゲル電気泳動法によシ、シラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、ベクターのｐＡＪ１８４４よシ
も明らかに大きなプラスミドが検出された０ ＡＪ１２０８１株のもつプラスミドを、組換えに用いた
制限酵素Ｐｓｔ ｌで切断すると１．２と１．４メガダ
ルトンのＤＮＡ断片が検出された。
（６） コリスミン酸ムターゼβサブエツト欠損株への
トランスホーメーシ目ン （５）で検出された２、６メガダルトンのＤＮＡ断片を
含む組換えプラスミドｐＡＪ１１を用いフェニルアラニ
ン、チロシン要求性、コリスミン酸ムターゼβサブエツ
ト欠損株ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
Ｊ１２０８２（ＦＥＲＭ−Ｐ７２４９）を形質転換した
Ｏ 生シたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ１０個を釣り上げフェニルアラニン、チロシン要求性
をテストしたところ、これらのいずれも要求性が消失し
ておシ、上記の組換えグラブＩ、ト遺伝子が存在するこ
とが明らかとなった。
トランスホーメーシ目ン （５）で検出された２、６メガダルトンのＤＮＡ断片を
含む組換えプラスミドｐＡＪ１１を用いフェニルアラニ
ン、チロシン要求性、コリスミン酸ムターゼβサブエツ
ト欠損株ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
Ｊ１２０８２（ＦＥＲＭ−Ｐ７２４９）を形質転換した
Ｏ 生シたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ１０個を釣り上げフェニルアラニン、チロシン要求性
をテストしたところ、これらのいずれも要求性が消失し
ておシ、上記の組換えグラブＩ、ト遺伝子が存在するこ
とが明らかとなった。
（７）形質転換株のチロシン生産能
（４）で得た形質転換株ブレビバクテリウムラクト（２
１） フェルメンタムＡＪ１２０８１を培養しチロシン生産能
をしらべたところ第１表に示す結果を得た。
１） フェルメンタムＡＪ１２０８１を培養しチロシン生産能
をしらべたところ第１表に示す結果を得た。
培養はグ／Ｉ／ ：＋ ７１３０１１／ｌｓ （ＮＨ４
）２ ｓｏ４２０１ ／ＬｓＫＨ２ＰＯ４１１／４ Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０１１／／ｌ、 ＭｎＳＯ４・４’Ｈ
２Ｏ１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン５０μＥｌ／ｌ 、サイア
ミン塩酸塩２０００ｆｉｌｌ／ｌ、大豆加水分解物「味
液Ｊ ５０ｍ１／Ｌ、酢酸３ｒｎ１１／ｌ、フマル酸１
２＃／ｌ、炭酸カルシウム５０１１／ｌ。
）２ ｓｏ４２０１ ／ＬｓＫＨ２ＰＯ４１１／４ Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０１１／／ｌ、 ＭｎＳＯ４・４’Ｈ
２Ｏ１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン５０μＥｌ／ｌ 、サイア
ミン塩酸塩２０００ｆｉｌｌ／ｌ、大豆加水分解物「味
液Ｊ ５０ｍ１／Ｌ、酢酸３ｒｎ１１／ｌ、フマル酸１
２＃／ｌ、炭酸カルシウム５０１１／ｌ。
及ヒリジン、スレオニン、メチオニン各１０ｍ９７ｄｉ
を含むｐｉ（７，０の培地２０ｍ１を肩付フラスコに分
注したものに被検菌株を植えつけ３０℃にて７２時間、
振盪下に行なった。培養後、遠心上清中のＬ−チロシン
を液体クロマトグラフィーによシ定量した。
を含むｐｉ（７，０の培地２０ｍ１を肩付フラスコに分
注したものに被検菌株を植えつけ３０℃にて７２時間、
振盪下に行なった。培養後、遠心上清中のＬ−チロシン
を液体クロマトグラフィーによシ定量した。
第１表 チロシン生産量
本発明にベクターとして用いたプラスミドｐＡＪ１８４
４はエシェリヒアコリＡＪ１１８８３に導入された形で
微工研に寄託されておｊ９ （ＦＥＲＭ−Ｐ６５１９＝
ＦＥＲＭ−ＢＰ１３７）ＡＪ１１８Ｂ３株を対数増殖期
後期まで生育させた後、リゾチーム及びＳＤＳによシ溶
菌せしめ、３０．０００ Ｘ １９で遠心分離して得ら
れた上清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させた
ＤＮＡを塩化セシウム・エチジウムプロミド平衡密度勾
配遠心で分画することによシ精製することができる。
４はエシェリヒアコリＡＪ１１８８３に導入された形で
微工研に寄託されておｊ９ （ＦＥＲＭ−Ｐ６５１９＝
ＦＥＲＭ−ＢＰ１３７）ＡＪ１１８Ｂ３株を対数増殖期
後期まで生育させた後、リゾチーム及びＳＤＳによシ溶
菌せしめ、３０．０００ Ｘ １９で遠心分離して得ら
れた上清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させた
ＤＮＡを塩化セシウム・エチジウムプロミド平衡密度勾
配遠心で分画することによシ精製することができる。
第１図・・・複合シラスミドｐＡＪ６５５の制限酵素切
断地図、 第２図・・・複合プラスミドｐＡＪ６１１の制限酵素切
断地図、 第４図・・・複合プラスミドｐＡＪ＃＃Ｉ＞の制限酵素
切断地図、 第５図・・・複合プラスミドｐＡＪ ３１４８の制限酵
素切断地図 （２３） 第１図
断地図、 第２図・・・複合プラスミドｐＡＪ６１１の制限酵素切
断地図、 第４図・・・複合プラスミドｐＡＪ＃＃Ｉ＞の制限酵素
切断地図、 第５図・・・複合プラスミドｐＡＪ ３１４８の制限酵
素切断地図 （２３） 第１図
Claims (4)
- （１） コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属するＤ
ＮＡ供与菌よシ得られコリネホルムグルタミン酸生産菌
の菌体内で自律複製できるベクタープラスぼドに接続さ
れてコリネホルム・グルタミン酸生産菌よシ誘導された
少くともＬ−チロシンを要求する変異株に導入されたと
きに、該変異株のＬ−チロシン要求性を消去せしめりる
ような遺伝子が、コリネホルムグルタミン酸生産菌の菌
体内で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて
コリネホルムグルタミン酸生産菌に属するＤＮＡ受容菌
に導入されて得られるＬ−チロシン生産能を有する微生
物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−チロシ／を採取
することを特徴とするＬ−チロシンの製造法。 - （２）遺伝子がチロシンアンタゴニストに耐性をＷする
コリネホルム・グルタミン酸生産菌より得られたもので
ある特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （３） ＤＮＡ 供与筒＃’チロシンアンタゴニストニ
耐性を有するコリネホルム・グルタミン酸生産菌である
特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （４） ＤＮｐ、受容菌がチロシンアンタゴニストニ耐
性を有するコリネホルム・グルタミン酸生産菌である特
許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58180031A JPH06102030B2 (ja) | 1983-09-28 | 1983-09-28 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58180031A JPH06102030B2 (ja) | 1983-09-28 | 1983-09-28 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6070093A true JPS6070093A (ja) | 1985-04-20 |
| JPH06102030B2 JPH06102030B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=16076258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58180031A Expired - Lifetime JPH06102030B2 (ja) | 1983-09-28 | 1983-09-28 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06102030B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0263515A2 (en) * | 1986-10-09 | 1988-04-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-tyrosine |
| WO2011024583A1 (ja) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2014185430A1 (ja) | 2013-05-13 | 2014-11-20 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| EP3385389A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid from fructose |
| CN116162666A (zh) * | 2023-03-23 | 2023-05-26 | 天津科技大学 | 一种提高l-酪氨酸产量及转化率的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5441392A (en) * | 1977-09-07 | 1979-04-02 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of plasmid |
| JPS56160997A (en) * | 1980-05-16 | 1981-12-11 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-lysine by fermenaition method |
| JPS5877895A (ja) * | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドｐｈｍ１５１９ |
| JPS6034197A (ja) * | 1983-08-04 | 1985-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | チロシンの製造法 |
-
1983
- 1983-09-28 JP JP58180031A patent/JPH06102030B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5441392A (en) * | 1977-09-07 | 1979-04-02 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of plasmid |
| JPS56160997A (en) * | 1980-05-16 | 1981-12-11 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-lysine by fermenaition method |
| JPS5877895A (ja) * | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドｐｈｍ１５１９ |
| JPS6034197A (ja) * | 1983-08-04 | 1985-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | チロシンの製造法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0263515A2 (en) * | 1986-10-09 | 1988-04-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-tyrosine |
| WO2011024583A1 (ja) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2014185430A1 (ja) | 2013-05-13 | 2014-11-20 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| EP3385389A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid from fructose |
| CN116162666A (zh) * | 2023-03-23 | 2023-05-26 | 天津科技大学 | 一种提高l-酪氨酸产量及转化率的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06102030B2 (ja) | 1994-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6279788A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| HU196843B (en) | Process for producing l-lysine | |
| JPH06102024B2 (ja) | 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 | |
| JPS6012995A (ja) | 発酵法によるｌ―スレオニン及び／又はｌ―イソロイシンの製造法 | |
| JPH0728749B2 (ja) | Ｌ−アルギニンの製造法 | |
| US4946781A (en) | Recombinant DNA, bacteria carrying said recombinant DNA and a process for producing L-threonine or L-isoleucine using said bacteria | |
| JPS6066989A (ja) | Ｌ−アルギニンの製造法 | |
| CA1306963C (en) | Process for producing l-threonine and l-isoleucine | |
| EP0183175B1 (en) | Coryneform bacteria carrying recombinant dna and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria | |
| JPH0575390B2 (ja) | ||
| US5426050A (en) | Plasmid vectors for expression of genes in coryneform bacteria | |
| JPH0523751B2 (ja) | ||
| JPS6070093A (ja) | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 | |
| JPS62186795A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| JPH07121227B2 (ja) | Ｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| JPS6368091A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| JPH0724591B2 (ja) | 組換えｄｎａを有するコリネ型細菌を用いる芳香族アミノ酸の製造法 | |
| JPS6178378A (ja) | 芳香族アミノ酸生合成遺伝子を含有する組換えｄｎａ及びそれを有するコリネ型細菌 | |
| EP0170257B1 (en) | Process for producing l-tryptophan | |
| JPH0529437B2 (ja) | ||
| JPS6030693A (ja) | Ｌ−イソロイシンの製造法 | |
| JPS63105688A (ja) | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 | |
| JPH0559710B2 (ja) | ||
| JPH06102031B2 (ja) | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 | |
| JPH055479B2 (ja) |