JPS6030693A

JPS6030693A - Ｌ−イソロイシンの製造法

Info

Publication number: JPS6030693A
Application number: JP58138775A
Authority: JP
Inventors: Ryoichi Katsumata; 勝亦　瞭一; Masako Hara; 原　雅子; Tetsuo Oka; 岡　徹夫
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-07-29
Filing date: 1983-07-29
Publication date: 1985-02-16
Anticipated expiration: 2010-04-12
Also published as: ES534701A0; IL72508A0; ES8506094A1; JPH0732711B2; IT8467751A0; IL72508A; CA1228039A; IT8467751A1; MX7641E; IT1179025B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はアスパラギン酸からスレオニンに到るスレオニ
ン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベク
ターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有せし
め、該微生物を培地中で培養し、培養物中に生成蓄積し
たＬ−イソロイシンを採取することを特徴とするし一イ
ソロイシンの製造法に関する。

コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのい
わゆるグルタミン酸生産菌により直接８酵法でＬ−イソ
ロイシンを生産する方法については野住株から誘導され
たＩ、−イソロイシン生産性の突然変異株を用いる方法
が知られている。Ｌ−イソロイシン生産性変異株として
は、たとえば特公昭４７　３８９９５．特公昭５１−６
２３７．特公昭５４−３２０７０などに記載されている
ようにアミノ酸の栄養要求性変異やアミノ酸のアナログ
に対する耐性変異あるいはそれらの変異を共有した菌株
が知られている。

本発明者らはコリネバクテリウム・属あるいはブレビバ
クテリウム属の細菌を用いるし一イソロイシン生産法に
おいて、従来のし一イソロイシン生産性変異の付与によ
る育種とは全く異なる組換えＤＮＡ技法によるし一イソ
ロイシンの生産方法について研究を重ねた結果Ｌ−イン
ロイシンの前駆体であるスレオニンの生合成に係わる遺
伝子とこれら菌種のベクタープラスミドとの組換え体を
保有せしめた菌株が組換え体非保有株に優るＬ−イソロ
イシン住産能を有することを見出し本発明を完成するに
至った。

コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属に
属するＬ−インロイシン非生産性菌株にスレオニン生合
成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入したとき
、核上がＬ−イソロイシン生産菌株となり、また既にＬ
−インロイシン生産性を有する菌株に導入したときにも
し一インロイシン生産性が向上することについては、本
発明者らが初めて見出した知見である。特開昭５８−８
９３には、イソロイシンアンタゴニスト耐性に関与する
染色体遺伝子領域が組み込まれたコリネバクテリウム属
、ブレビバクテリウム属菌によるし一イソロイシンの製
造法について記載があるが、本発明に係る遺伝子とは異
なるものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明によれば、アスパラギン酸からスレオニンに到る
スレオニン生合成に係る酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せしめたコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物を培地に培養し、培養物中にＬ〜ゼインイシン
を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−インロイシンを採
取することによりＬ−イソロイシンを製造することがで
きる。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全′ζ用い
ることができるが、好適には下記の菌株が用いられる。

コリネバクテリウム・グルタミクム　へＴＣＣ１３０３
２コリネハゲチリウム・アセトアシドフィラムへＴＣＣ
］３８７０コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リグラム　へＴＣＣ１５９９０
ブレビバクテリウム・ディバリカラム　ＡＴＣＣ１４０
２０ブレビバクテリウム・フラブム　へ丁ＣＣｌ４０６
７プレビバクテリウム・イマリオフイラムへＴＣＣ１４
０６，８ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム八ＴＣＣ１
３８６９ブレビバクテリウム・ヂオゲンタリス　へＴＣＣＩ９２
４０宿主としては、イソ−ロイシン生産能を有しない野
生株を用いることもできるが、既にインロイシン生産性
を有する菌株を用いることもできる。イソロイシン生産
性を有する菌株としては、アミノ酸要求性変異株、アミ
ノ酸アナログ耐性変異株など公知の菌株が適用できる。

アスパラギン酸からスレオニンに到るスレオニン生合成
に係る酵素としては、アスパルトキナーゼ、アスパラギ
ン酸セミアルデヒド≠ヒドロケナーゼ、ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼおよびスレオニンシ
ンターゼがある。

（Ａｇｒ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３８．９９３
　（１９７４）　）。

本発明におけるスレオニン生合成に係る酵素の遺伝子と
しては、これら酵素のうち少なくとも一つの酵素の遺伝
情報を担うＤＮＡがあげられる。該ＤＮＡは、原核生物
、真核生物、バタテリオファージ、ウィルスまたはプラ
スミドに由来するいずれをも用いることができる。就中
、原核生物である細菌たとえばエソシェリヒア属、コリ
ネバクテグラム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバク
テグラム属、バチルス属、スタフィロコッカス属。

ストレプトコツカス属またはセラチア属に属する菌株の
スレオニン生合成に係る遺伝子が望ましく、とくにこれ
らの細菌から誘導れさたスレオニンまたはインロイシン
生産性変異株由来の遺伝子が１通である。具体的に好適
な一例としては、大腸菌に−１２のスレオニン・オペロ
ンがあげられる。

該ＤＮＡを組込む為のベクターとしては、本願発明者ら
の開発に係る、ｐｃＧｌ、ｐＣＧ２゜ｐＣＧ４．ｐｃＧ
ｌ１．ｐＣＥ５４およびｐ　ＣＢ　１０１などが好適に
用いられ、これらベクターの製造法は特開昭５７−１３
４５００．特開昭５７−１８３７９９、特開昭５８−３
５１９７および特開昭５８−１０５９９９に記載がある
。

スレオニン生合成に係る酵素の供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制限
酵素で切断した後ＤＮＡリガーゼで再連結反応した後、
この結合反応物を用いてスレオニン生合成にあずかる酵
素をコードする遺伝子が欠損したコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転換し、欠
損形質が相補された形質転換株を選択する組換えＤＮＡ
技法によって得ることができる。この組換えＤＮＡ技法
は特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８（
ｉ４８９に記載の方法に従って行うことができる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のごとく既に遺伝子組換え技法が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、スレオニ
ン生合成に係る酵素の供与体ＤＮ’ＡとベクターＤＮＡ
の試験管内結合反応物を用い、スレオニン生合成にあず
かる酵素をコードする遺伝子が欠損した大腸菌の変異株
を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択
し、この形質転換株からクローン化したＤＮＡとコリネ
バクテリウム属またはブ°レビバクテリウム属菌のベク
ターＤＮＡとを試験管内で制限酵素で切断した後、ＤＮ
Ａリガーゼで再結合反応させ、この結合反応物を用いて
、スレオニン合成にずかる酵素をコードする遺伝子が欠
損したコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転
換株を選択することによっても同様に組換え体ＤＮＡを
取得することができる。

本発明で用いるスレオニン生合成に係わる遺伝子を含む
ＤＮＡの具体的に好適な例として大腸菌に一１２株のス
レオニン・オペロンが挙げられる。

大腸菌のスレオニン・オペロンのＤ　Ｎ　Ａ　ｔ−含ｔ
７［１換え体プラスミドρＥｔｈｒｌを例にあげて本発
明をさらに詳細に説明する。

大腸菌のスレオニンオペロンを含むＤＮＡ断片は大腸菌
の宿主・ベクター系を用いて予めクローン化することが
できる。宿主大腸菌で遺伝子をクローン化する方法は例
えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

６８巻、　Ｒａｙ　Ｗｕ　（Ｅｄ）＾ｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９年）に記載さ
れている。具体的には下記のごとく行う。

野生型スレオニンオペロンを有する大腸菌から抽出した
染色体ＤＮＡと大腸菌ベクタープラスミドｐＧＡ２２を
制限酵素Ｈ４ｎｄｌ［Ｉで消化した後、１゛４フアージ
リガーゼを作用さゼる。この混成液を用いて公知の方法
により大腸菌に一１２株北株ＧＴ−３（３４１ｍ類のア
スパルトキナーゼを欠損した変異株、ホモセリン・ジア
ミノピメリン酸要求性）を形質転換し、ジアミノピメリ
ン酸とｐＧＡ２２の選択マーカーであるカナマイシンを
含む最小培地上で生育する形質転換株を選択する。出現
した形質転換株の保有するプラスミドはその培養菌体か
ら常法により分離でき、ついで各種制限酵素で処理して
生成するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析す
ることにより、その構造を知ることができる。こうして
得られたプラスミドの一つが第１図に示す構造のｐＧＨ
２である。すでに大腸菌のスレオニンオペロンを含むＤ
ＮＡ断片はクローン化されており、制限酵素切断部位も
位置づけられている（Ｃｏｓｓａｒｔ、　Ｐ、　ｅｔ　
ａｊ、：　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７５．３９　（１９７９）
参照）　。ｐＧＨ２はそれに合致するＤＮＡ断片を有し
ており、スレオニンオペロンを含むことが確かである。

ＧＴ−３株のアスバルトキナーゼ欠損はｐＧＨ２のスレ
オニン・オペロン上に存在するアスノ？ルトキナーゼに
よって相補され、ホモセリンおよびジアミノピメリン酸
非要求性となる。

ｐＥｔｈｒｌはｐＧＨ２とコリネバクテリウム属および
ブレビバクテリウム属のベクタープラスミドｐＣＧＩＩ
の組換え体として取得できる。ｐＣＧｌｌは、本発明者
らが先に発明し、特許出願（特開昭５７−１３４５００
）されたプラスミドで、コリネバクテリウム・グルタミ
クム２２５−５７株（ＡＴＣＣ３１８０８，ＦＥＲＭ−
Ｐ５８６５）から分離されたプラスミドｐｃＧｌにおけ
る制限酵素Ｂｇβ■のただ一つの切断部位にコリネバク
テリウム・グルタミクム２’２５−２５０株（ＡＴＣＣ
３１８３０，ＦＥＲＭ−Ｐ５９３９）から分離されたプ
ラスミドｐＣＧ４のストレプトマイシンおよび／または
スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む制限酵素Ｂ　ａ　
ｍ　ＨＩ断片を両省の同一接着末端を利用して結合せし
めたプラスミドである。

ｐｃＧｌｌはそれを保有するコリネバクテリウム・グル
タミクムＡ′ｒＣＣ３９０２２の培養菌株がら本発明者
らが、特開昭５７−１８６４９２に開示した方法で濃縮
単離する。常法によりｐＧＨ２をＢ　ａ　ｍ　ＨＩでｐ
ｃＧＩｌをＢ　ｇ　７！ＩＩで消化した後、混合して′
Ｉ゛４リガーゼを作用させる。次にこのＤ　Ｎ　Ａ　ｍ
酸液を用いてコリネバクテリウム・・グルタミクムＬＡ
２０１（ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損変異株
）を形質転換する。コリネバクテリウム・グルタミクム
ＬＡ２０１はコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ
Ｃ３１８３３（特開昭５’ｌ−１８６４９２）由来のり
ゾヂーム感受性変異株Ｌ−２２株から通常用いられる変
異処理により誘導されたホモセリン（あるいはスレオニ
ンとメヂオニン）、ロイシン要求性の変異株であり、そ
のホモセリン要求性はスレオニン住合成経路上アスパル
トセミアルデヒドがらホモセリンに代謝するホモセリン
デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損に基づいている。

形質転換は、本発明者らが先に発明し特許出願されたコ
リネバクテリウムあるいはブレビバクテリウム属菌種の
プロトプラストを使用する形質転換法（特開昭５７−１
８６４　！ｌ　２および特開昭５７−１８６４８９、具
体的には実施例に示す）により実施することができる。

拳法を用い、コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ２
０１株のプロトプラストを形質転換後、一旦、非選択的
に再生培地上で正常細胞に復帰増殖させる。再生菌をか
き集め、滅菌した生理的食塩水で洗ｄ１条後、ロイシン
を補充した最少培地に再塗布し、生育するコロニーを分
離する。

こうして得られたホモセリン非要求株の中にはｐ　Ｇ　
Ｈ２由来のカナマイシン耐性形侍およびｐＣＧ１１由来
のスペクチノマイシン耐性形質を同時に獲得しているも
のがある。これらの形質転換株の保有するプラスミドＤ
ＮＡは前記ｐｃＧ１１の単離と同様な方法で培養菌体か
ら単離精製でき、それらを各種制限酵素とアガロースゲ
ル電気泳動で解析することにより構造を知ることができ
る。

形質転換株の一株から得られたプラスミドがｐＥｔｈｒ
ｌであり、その制限酵素切断地図とその作製工程を第１
図に示す。ｐＥｔｈｒｌはｐＧＨ２のスレオニンオペロ
ンを含む１３　ａ　ｍ　ＨＩ切断片がｐＣＧｌｌに組み
込まれたプラスミドであることが明らかである。

別の形質転換株からはｐｃＧｌｌに対するスレオニンオ
ペロン含有Ｂ　ａ　ｍ　１４　Ｉ切断片がｐ　Ｅ　Ｌ　
ｂ　ｒｌとは逆向きのプラスミドが取得される。いずれ
の組み換え体プラスミドを用いて再形質転換してもコリ
ネバクテリウム・グルタミクムＬＡ２０１はカナマイシ
ンおよびスペクチノマイシン耐性形質と連関して、ホモ
セリン要求性が相補され、それらの形質転換株は各種制
限酵素切断部位で特徴づけられるイバＪｊプラスミドを
保有することが確かめられる。

ホモセリン要求性の相補能は組換え体プラスミドの有す
る大腸菌スレオニン・オペロン上に位置する大腸菌のポ
モセリンデヒドロゲプ゛−セ遺伝子の形質発現に由来す
る。大腸菌スレオニン・オペロンはアスパルトキナーゲ
、ポモセリンデヒドロゲナーゲ、ホモセリン要求性ゲお
よびスレオニンオンターセの遺伝子をコードし、それら
は一つの転写単位として転写されるＣＴｈｅｚｅ、　Ｊ
、　ｅｔ　ａｌ、　：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、旦５
．９９０　（１９７９）参照〕ことが知られており、そ
の全遺伝子の発現機能は第１図のｐＧＨ２における目盛
約５．４ＫｂＯ）ＨｉｎｄｎＩ部位と目盛約１１．３Ｋ
ｂのＢａｍＨ１部位の間の領域に存在することが明らか
にされている（Ｃｏｓｓａｒｔ。

Ｐ、ｃＬ　ａｌ、　：　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、、　１７５．３９　（１９７９）参照〕。従っ
てｐＥｔｈｒｌは全遺伝子の発現機能を保持しており、
それを保有するコリネバクテリウム・グルタミクム内で
は単にホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子だけでなく、
アスパルトキナーゼ、ホモセリンｓトナーゼおよびスレ
オニンシンターヒ遺伝子も形質発現することは確がであ
る。

コリネバクテリウム属またはプレヒバクテグラム属に屈
し、ｐＥｔｈｒｌを保有するＩ、−イソロイシン仕度菌
は前記と同様にｐ　Ｆ、　ｔ　ｈ　ｒ　ｌを用い°ζコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌のプ
ロトプラストｌの有するスペクチノマイシンおよび／またはストレプ
トマイシン耐性マーカーで選択した形質転換株として得
られる。形質転換株がｐＥＬｈｒｌを保有していること
は、それから抽出単離したプラスミドの構造を前記のご
とく各種制限酵素とアガロースゲル電気泳動で解析する
ことによって俯認できる。具体的に作製したし一イソロ
イシン生産株としてコリネバクテリウム・グルタミクム
に４０　（ＦＥＲＭ　Ｐ−７１６０）とブレビバクテリ
ウム・フラバムのｐＥｔｈｒｌ保有株をあげることがで
きる（実施例参照）。コリネバクテリウム・グルタミク
ムに４０は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ
Ｃ３　１．８　３　３がらＳ−　（２−アミノエチル）
−システィン耐性変異株として誘導されたし一イソロイ
シン生産性菌株で、そのｐＥｔｌ＋ｒｌ保有株に４１　
（ＦＥＲ’Ｍ　Ｐ−７１６１）およびブレビバクテリウ
ム・フラバムのｐＥｔｈｒ１保有株に４２　（ＦＥＲＭ
　Ｉ）−　）とともに、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。

ｐＥｔｈｒＪ保有形質転換株にょるＩ７−イソロイシン
化度は、従来の発酵法によるＬ〜イソロイシン製造に用
いられる培養方法により行うことができる。すなわち、
該形質転換株を炭素源．窒素源，無機物．アミノ酸．ビ
タミンなどを含有する通常の培地中、好気的条件下、温
度，ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中にイ
ンロイシンが精製蓄積するので、これを採取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉，
澱粉加水分解液，糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸，フマール酸，乳酸５酢酸などの各
種有機酸が使用できる。更に菌の資化性によって、炭化
水素，アルコール類なども用いうる。と（に廃糖蜜は好
適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩頬あるいは尿素および他の窒素含作物質ならびにペ
プトン、ＮＺ−アミン３　肉エキス。

酵母エキス、コーン・スチーブ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、脱脂大
豆粕あるいはその消化物、＠加水分解物などの窒素含有
有機物など種々のものが使用可能である。

さらに無機物としては、鱗酸第−水素カリウム１燐酸第
二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微生
物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前
記゛したような他の培地成分に従って培地に供給されれ
ば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの々ｆ気的条
件下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適であ
る。培養中の培地のｐ　Ｈは中性付近に維持することが
望ましい。培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−イ
ンロイシンが蓄積する。

培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からし一イソロイシン
を回収する。

かくしてｐ　Ｉｇ　ｔ　ｈ　ｒ　１を保有せしめたコリ
ネバクテリウム、　Ｉ消；Ｉｊよびブレビバクテリウム
属菌株を用いることにより、非保有株に較べ高い収率で
１、−イソロイシンを生産することができる。

本発明の有用性は、スレオニン生合成に係わる遺伝子と
コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム）尼
菌種のベクターＤＮＡとを形ＪＲ発現できる形で組換え
た組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種に導入ずればし一イソロイシン生産
能を付与あるいは強化できる点にある。本願明細書では
大腸菌のスレオニン・オペロンを用いる例を示したが、
代わりに他の生物のスレオニン生合成に係わる遺伝子を
用いても目的が達成される。それゆえ、スレオニン生合
成に係わる遺伝子は本明細書で例示した大腸菌のスレオ
ニン・オペロンに限定されるものではない。またベクタ
ープラスミドは組換え体として連結されたスレオニン生
合成に係わる遺伝子を安定に遺伝せしめるために、その
自律複製能を提供しているにすぎない。従って、本明細
書に例示したｐｃＧｌ、１に限らずコリネバクテリウム
属あるいはブレビバクテリウム属で自律複製できるプラ
スミドも本願発明方法のプラスミドに包括される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から、各研究者により、種々の菌名
が付されており、屈名までも、コリネバクテリウム属あ
るいはブレビバクテリウム属など、種々である。しかし
ながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＩ）
　Ｎ　Ａの塩基８１１成が画一的であることから、同一
の菌種であることが１行摘されていた。さらに、最近、
これらの菌種間には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同
性があることが明らかにされ、非常１こ近縁な微生物で
あることが明白である。

（ＫｏｍａＬｓｕ　’１．　：　Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　
ｔｈｅ　ＰｃｒｍｅｎｔａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｎｏ、　５５．１　（１９８０
）および５ｕｚｕｋｉ、　Ｋ、、　Ｋａｎｅｋｏ、　Ｔ
、、　ａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａ、　Ｋ、　：Ｉｎｔ、
　Ｊ　５ｙｓｔ、　Ｂａｏｔｅｒｉｏｌ、、３１．１３
１　（１９８１）参照３本明細書では、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムＫ　４０とブレビバクテリウム・フ
ラブムにスレオニン合成に係わる遺伝子の組換え体を導
入し、その遺伝子の形質発現に基づくＬ−イソロイシン
生産性の向」二について例示したが、上記の事実を踏ま
えればグルタミン酸生産菌全般での効果が容易に類推さ
れる。その効果の有無は組換え体ＤＮＡがグルタミン酸
生産菌全般で自律的に複製し、スレオニン合成に係わる
遺伝子が形質発現できるか否かに係わり、グルタミン酸
生産菌間のＤＮＡ相同性などにおける若干の相違は何ら
関係ない。

しかるにこれらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子発現
に係わる機能を等しく保持していることは、本発明者ら
が先に特許出願（特開昭５７−１８３７９９）したコリ
ネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０株から分
離され、スベクヂノマイシンおよび／またはストレプト
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４がコリ
ネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種など
グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、またその耐性
遺伝子が発現される（特開昭５７−１８６４９２）こと
から明らかである。従って、本発明のスレオニン生合成
に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入することに
よるし一イソロイシン生産菌の作製法を適用し得る菌種
は、コリネバクテリウム・グルタミクムに４０およびブ
レビバクテリウム・フラブムに限らずコリネバクテリウ
ム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むグルタミン
酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜（１）大腸菌スレオニン・オペロン含有ＤＮＡ断片のク
ローン化クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施する。ベ
クターとして使用したｐＧＡ２２は本プラスミドを作製
したアンらの方法（Ａｎ、　Ｇ。

ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４
０．４００　（１９７９）　）に従い、本プラスミドを
保有する大腸菌に〜１２株亜株の培養菌体から単離した
。供与体ＤＮＡとなる染色体ＤＮＡは大腸菌に一１２株
Ｈｆｒ株（ＡＴＣＣ２３７４０）の培養菌体から、スミ
スのフェノール抽出法（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍ、　Ｇ、　：
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１２．
　ｐａｒｔ’Ａ、　５４５　（１９６７）　）に従って
単離した。

ｐＧＡ２２プラスミドＤＮＡ４μｇを含む制限酵素Ｈｉ
ｎｄｌｌ１反応液（１０ｍＭ）リス塩酸。

７ｍＭ　ＭｇＣｎ２．６０ｍＭ　ＮａＣｊｌ、ｐＨ７，
５）６０μ６に０．４単位のＨｉｎｄｌｌ＋（宝酒造社
製１６単位／μｍ）を添加し、３７℃で３０分間反応後
、６５℃で１０分間加温して反応を停止した。ｐＧＡ２
２には２個所の）ｌ　ｉ　ｎｄｌｌＩ切断部位があるが
、同一条件でＨｉｎｄｌｌ［消化した試料をアガロース
ゲル電気泳動で調べた結果、−断ハに切断、されている
ことが確認された。

別に染色体Ｄ　Ｎ　／’、　８μｇを含む制限酵素Ｈｉ
　ｎ　ｄ■反応液１４０．ｃｚｎに４単位のＨｉ　ｒｉ
　ｄ　ＩＩＩを添加し、３７℃で６０分間反応後、６５
°Ｃで１０分間加温して反応を停止さセた。再反応消化
物を混合し、′ｌ゛４リガーゼ緩衝液〔ｌ・リス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略ず）６６
０ｍＭ、ＭｇＣｊ！２６６ｍＭ、ジチオスレイＬ−ルｌ
ｏＯｍＭ、ｐＨ７，６）４０μＣＡ”「Ｐ　（５ｍＭ）
４０１１１２．Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１単位／μ
６）０．３μｌおよびＨ２Ｏ１２０μβを加え、１２℃
で１６時間反応させた。この反応混合物をＴＢＳ緩衝液
（０，０３Ｍトリス、０．００５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０
５ＭＮａＣｆｆ、ｐＨ８，０）で飽和したフェノール４
００μρで２回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析して
フェノールを除外した。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株Ｇ’ｒ
−３［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、旦７．１３３　（
＋９７４）　）（ホモセリンおよびジアミノピメリン酸
要求性）の形質転換に供した。ＧＴ−３のコンピテント
セルはダジェルトらの方法（Ｄａｇｅｒｔ、　Ｍ、　ｅ
ｔ　ａｌ。

：　Ｇｅｎｅ６　、２３　（１９７９）　）で調製した
。即ち、１００μｇ／ｍｌとなるようにジアミノピメリ
ン酸を補ったし培地（バク）ｌ・リブトン１０ｇ。

酵母エキス５ｇ、ブドウ糖１ｇおよび塩化ナトリウム５
ｇを水ｌβに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）５０
ｍｌにＧＴ−３株を植菌し、東京光電比色針で６６０μ
ｍにおける吸光度（ＯＤ）が０．５になるまで３７℃培
養した。培養液を氷水中で１０分間冷却してから遠心集
菌する。菌体を冷却した０、１Ｍ塩化カルシウム２０ｍ
１に再懸濁し、０℃に２０分間装いた。菌体を再遠心し
、０．１Ｍ　塩化カルシウム０．５　ｍｌに懸濁し、０
℃で１８時間装いた。塩化カルシウム処理した菌液４０
０μｌに前記リガーゼ反応混合物２００μｌを添加混合
し、０°Ｃに１０分間装いてから３７℃で５分間加温し
た。次いで■、培培地９ｍ合添加し、３７℃で２時間振
盪培養した。

生理食塩水で２回遠心洗＃後、１２．５μｇ／ｍｌ相当
のカナマイシンを添加したＭ９最小寒天培地（ブドウ糖
２ｇ、ＮＨ４Ｃｎ　Ｉｇ、ＮｅＡ２ＨＰＯ４６ｇ、ＫＨ
２ＰＯ４，３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１ｇ、Ｃａ
Ｃｌ１２　・２Ｈ２０１５■、サイアミン塩酸塩４■お
よび寒天１５ｇを水１１に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整し
た培地）に塗布し、３７℃で３日培養した。出現した、
ただ１つのコＩＪニーはｐＧ八へ２の選択マーカーであ
る薬剤アンピシリン２５μｇ７ｍ１．　クロラムフェニ
コール　２５μｇ／ｍ＋あるいはカナマイシン２５μｇ
／ｍｌを含む寒天培地上でも住育することが確認された
。

この形質転換株の培養菌体から前記のｐＧＡ２２を単離
したのと同一の方法によりプラスミドＤＮＡを単離した
。このプラスミドＤＮＡを制限酵素消化とアガロースゲ
ル電気泳動で解析した結果、第１図にｐＧＨ２として示
した構造を有していた。ｐＧＡ２２に挿入されたＤＮＡ
断片は、既にクローン化さた大腸菌オペロン含有ＤＮＡ
断片（Ｃｏｓｓａｒｔ、　Ｐ、　ｃｔ　ａｌ　：　Ｍｏ
１ｅｃ。

Ｇｅｎ、　ＧｅｎｅＬ、、＋７５．３９　（１９７９）
参照〕と同一の制限酵素切断部位を有していることから
ｐ　ＣＨ２がスレオニンメベロンを含有することが確認
された。

（２１ｐＣＧ１１とＰＧＨ２の試験管内組換えｐｃＧｌ
ｌを保有するコリネバクテリウム・グルタミクＪ、ＬＡ
　１０３／ｐ　ｃｃ　１１　（ＡＴ’ＣＣ３９０２２）
を４００ｍ１　ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エ
キス５ｇを水１βに含みｐ　Ｈ７，２にａ整した培地）
でＯＤ約０．８になるまで生育させた。培養液から菌体
を集菌し、ＴＥＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム液（２５
％シコ糖、０．１Ｍ　ＮａＣｌ１．０．０５Ｍ）リス。

０．８ｍｇ／ｍｌリゾチーム：ｐＨ８，０）で１０ｍ１
に懸濁し、３７℃で４時間反応させた。反応液に５Ｍ　
−ＮａＣＩ２　２．４ｍｌ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｌ（
８，５）０．６ｍ１．４％ウラリル硫酸ナトリウムと０
．７Ｍ　ＮａＣＲからなる溶液４．４ｍｌを順次添加し
、緩やかに混和してから氷水りＪに１５時間装いた。溶
解物全量を遠心管に移し、４℃で６０分間６９．４００
Ｘ　ｇの遠心分離にかり上ａ液を回収した。これに重量
ａ分率ｌＯ％相当のポリエチレングリコール（ＰＩＦ、
Ｇ）　６．０００　（半井化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水中に置いた。１０時間後、１，
５００Ｘｇで１０分間遠心分離してベレ゛ソ゛トを回収
した。

Ｔ　Ｆ、　Ｓ緩衝液５ｍｌを加えてペレットを静かに再
溶解してから、１．５■／ｍ＋エチジウムブロマイド２
．０ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに
溶解し、密度を１．５８０に合わせた。

この溶液を　１０５．０００ｘ　ｇ、１８°Ｃで４８時
間超遠心分離にかけた。この密度匂配遠心により共有結
合で閉じられた環状のＤＮＡは、紫外線照射することに
よって遠心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見
出された。このバンドを注射器で遠心チューブの側面か
ら抜きとることによってプラスミドｐｃＧ１１が分離さ
れた。

ついで、分離液を等容量のイソプロピルアルコール液ｃ
容量百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％”Ｉ
’　Ｂ　Ｓ緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシ
ウムを含Ｌ・）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後に、Ｔ　Ｂ　Ｓ緩衝液に対して
透析した。こうしてｐｃｃｉｉプラスミドＤＮＡを得た
。

このｐｃＧｌｌＤＮＡを用い、各種制限酵素による単独
消化および複数の制限酵素による多重消化で生成するＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電　・気泳動で解析し、分子
量およびプラスミド分子中の各制限酵素に対する切断部
位をめた結果、第１図に示す制限酵素切断地図を有する
ことがわかった。

ｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ２μｇを含む制限酵素Ｂｇ
Ａｎ反応緩衝液（１０１ｎＭトリス塩酸、７ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ４２，６０ｍＭ　ＮａＣ４゜７ｍＭ　２−メルカプト
エタノール、ｐＨ７，５）１００μｌに２単位のＢｇＡ
ｎ　（宝酒造社製。

６単位／μｐ）を添加し、３７℃で６０分間反応させた
。別にｐＧＨ２プラスミドＤＮＡ　２Ｍｇを含む制限酵
素ＢａｍＨＴ反応緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸、７ｍＭ
　ＭｇＣｆ１２，１００ｍＭ　ＮａＣｌ２，２ｍＭメル
カプトエタノール。

０．０１％ウシ血ン青アルブミン、ｐＨ８，０）　ｌ　
ＯＯμβに２単位の１３ａｍＨＩ　（宝酒造社製、６単
位／μβ）を添加し、３７℃で６０分間反応させた。両
消化物を６５℃で１０分間加温した後、混合し、′１゛
４リガーゼ緩衝液４０μβ、ＡＴＰ（５ｍＭ）４０ｐ１
．Ｔ４リガーゼ０．２　μ’ｎおよびＨ２Ｏ１２０μｌ
を加え、１２℃で１６時間反応さゼた。この混合物をＴ
　ＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００μｌで２回抽
出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノールを除外
した。

（３１ｐ　Ｅ　ｔ　ｈ　ｒ　ｌの取得形質転換はコリネバクテリウムパグルタミクムＬＡ２０
１株（ホモセリン・ロイシン要求株）のプロトプラスト
を用いて行った。コリネバクテリウム・グルタミクムＬ
Ａ２０１株の種培養をＮＢ培地に植菌し、３０℃で振盪
培養した。

ＯＤ　０．６になった時点で集菌し、該細胞をＲＣＧＰ
培地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ。

酵母エキス２．５　ｇ’＋　Ｋ２　ＨＰＯ４３・５ｇ・
ＫＨ２ＰＯａ　１．５　ｇ、ＭｇＣβ２・６１１２００
．４１ｇ、Ｆｅ５Ｏａ７Ｈ２０１０＋ｎｇ。

Ｍｎ５Ｏ’４　・　４〜６８２０　２ｍｉ＋、ＺｎＳＯ
４７Ｈ２００，９＋ｖ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７０４−４Ｈ
２００，０４ＩＩＩｇ、　ヒオチｙ３（Ｊｕｇ、サイア
ミン塩酸塩２ｍ１ｒ、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、
　ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０ｇ
を水１１に含む培地〕に１■／ｍｌのりゾチームを含む
液（ｐＨ７，６）に約１０９細胞／ｍ１七なるように懸
濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩寸）かに振
盪反応してプロトプラスト化した。

このプ１゛１１・ブラスト菌液０．５ｍｌを小試験管に
とり、２．５００　Ｘ　（ｉ　テ５分間遠心分離し、Ｔ
”ＳＭＣ緩衝液［１０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ
塩化カルシウム、５０ｍＭ１−リス、４００ｍＭシー糖
、ｐｉｆ７．５）　１ｍｌに再懸濁して遠心洗滌後、Ｔ
ｓＭｃＢ衝液０．１ｍｌに再（ひ濁した。

この菌液に２倍濃度の７３ＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反
応ＤＮＡ混合物の１対１混合液１００μｌを加え′Ｃ混
和し、次いでＴ　Ｓ　Ｍ　Ｃ緩衝液中に２０％ＰＥＧ６
，０００を含む液０．８ｍｌを添加して混合した。３分
後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍｌを添加し、２，
５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去し
、沈降したプロトプラストを１ＴｌｌｌのＲＣＧＰ培地
に懸濁してから３０℃で２時間緩やかに振盪した。つい
で、このプロトプラスト懸濁液の０．１ｍｌをカナマイ
シン４００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧ
　Ｐ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗
抹し、３０’ｃで６日間培養した。

寒天培地上全面に生育したカナマイシン耐性形質転換株
をかき集め、住理食塩水で遠心洗滌後、ロイシン５０μ
ｇ／ｍｌをｔ＋ｌｉ充した最少寒天培地Ｍｌ（ブドウ糖
１０　ｇ＋’ＮＨ４Ｈ２１”０４１ｇ；ＫＣｌ　０．２
ｇ、ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２００，２ｇ、Ｆｅ５Ｏａ　・
７Ｈ２０１０＋ｎｇ、Ｍｎ５Ｏａ・４〜６Ｈ２００，２
＋ｎｇ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９１１１ｇ、Ｃｕ
ＳＯ４・５Ｈ２００，４＋＋ｖ、　Ｎａ　２　Ｂａ　０
７　・ＩＯＨ２００，０９ｍｇ。

（ＮＨ４）６ＭＯ７０２４・４Ｈ２ｏ　Ｏ，０４■。

ビオチン５０μｇ、ｐ−アミノ安息香酸２．５■。

サイアミン塩酸塩１ｍｇ、寒天１６ｇを水１β中に含み
、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕上に再塗布して３０℃
で３日間培養した。出現したコロニーの中からカナマイ
シン２０μｇ／ｍｌおよびスペクチノマイシン１００μ
ｇ／ｍ＋を含むＮＢＪＪ天培地上で生育できる株が得ら
れた。

任意に選んだ３株を４００ｍ１ＮＢ培地でＯＤ約０．８
になるまで生育させ、集菌後、その培養細胞から実施例
１（２）記載のエチジウムブロマイド−打シウムクロラ
イド密度匂配遠心により、プラスミドを単離した。いず
れの株からも４０〜５５μｇのプラスミドＤＮＡが取得
された。

これらのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化とアガロース
ゲル電気泳動で解析し、分子量と制限酵素Ｐｓ　ｔ　Ｉ
、ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏ　１の切断点を同定した。

−株から得られたプラスミドをｐ　Ｆ、　１．　ｈ　ｒ
　１と命名し、その構造を第１図に示ず。ｐ　ｌ尤ｔ　
ｈ、ｒ　ｌはｐｃＧｌｌにｐＧＨ２のスレオニンオペロ
ンを含むＢａｍＨＩ切断片を結合した構造を有すること
が判明した。残りの２株中、目ネはｐＥｔｈｒｌと同一
プラスミドを保有しているが、他の一株はｐＥｔｈｒｌ
とはｐ　Ｇ　Ｈ２のスレオニンオペロン含有ＢａｍＨ１
切断ノ１の結合向きが逆向きに挿入されているプラスミ
ドを保有している。

これらのプラスミドＤＮＡを用いてコリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ２０１株を前記と同様に再形質転換
した結果、ホモセリン非要求性株が高頻度（再生した生
菌あたり約１Ｏ−３）で得られ、それらは全てカナマイ
シンとスペクチノマイシン耐性形質を獲得しており、各
種制限酵素切断様式で特徴付けられる供与プラスミドと
同一のプラスミドを保有していた。

ｆ４１ｐＥｔｈｒｌ保有株によるし一イソＵイシンの一
化度コリネバクテリウム・グルタミクムに４０とブレビバク
テリウム・フラブムのプロトプラストを形質転換してｐ
Ｅｔｈｒｌを導入した。コリネバクテリウム・グルタミ
クムに４０およびブレビバクテリウム・フラブムをＮＢ
培地にて３０℃で１６時間振盪培養し、その種培養０．
１ｍｌを１０ｍ１の３３Ｍ培地〔ブドウ糖１０ｇ。

ＮＨ４Ｃｊ！　４ｇ、尿素２ｇ、酵母エキスＩｇ。

ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、に２ＨＰＯ４３ｇ。

ＭｇＣｌ２・６Ｈ２００，４ｇ、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０
１０ｎｖ、ＭｎＳＯ４・４〜６）（２００，２ｍｇ、Ｚ
ｎＳＯ４・ｌＨ２Ｏ（１，９ｍｇ、Ｃｕ３０４　・５Ｈ
２０Ｑ、、４ｍｇ、Ｎａ　２Ｂ４０７　’１０Ｈ２００
，０９■＋　（ＮＨ４）６ＭＯ７０２４・４Ｈ２００，
０４ｍｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩１■を
純水１１に含みｐＨ７，２に調整した培地〕の入ったＬ
字型試験管に接種し、モノー型培養槽にて３０°Ｃで振
盪培養した。

ＯＤが０．１５になった時点で０．５単位／ｍｌになる
ようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、Ｏ
Ｄ約０．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培
地に１■／ｍｌのリゾチームを含む液（ｐＨ７，６）２
ｍｌに懸濁し、Ｌ字型試験管に移して３０℃で１４時時
間中かに振盪してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液１ｍｌを小試験管にとり２．５
００　Ｘ　ｇで１５分間遠心分離し、沈澱物をＴＳＭＣ
緩衝液１ｍｌに再慰濁して遠心（２，５００Ｘｇ）洗滌
後、Ｔ　Ｓ　Ｍ　Ｃ緩衝液（’１０．１ｍｌを加えて再
懸濁した。これに２倍濃度のＴ　Ｓ　Ｍ　Ｃ緩衝液と上
記で単離したｐＥｔｌｔｒｌＤＮＡ液の１対１混合液１
００μｌを加えて混和し、実施例１（３）と同様にＰＥ
Ｇ６，０００を介した形質転換を行い、形質発現させた
後、０．１　ｍｌをスペクチノマイシン４００μｇ／ｍ
ｌを含むＲＣＧＰ寒天培地に塗抹し、３０℃で１０日間
培養した。出現したコロニーの中からスペクチノマイシ
ン１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２ｏμｇ／ｍｌ
を含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が得られメこ。

スペクチノマイシンとカナマイシンとに同時に耐性にな
った形質転換株を４００ｍ１　３３Ｍ培地で振盪培養し
、ＯＤが０．１５になったところで０．５単位／ｍｌと
なるようにペニシリンＧを添加し、さらにＯＤが０．６
５まで培養し、集菌した菌体から実施例１（２）のｐｃ
Ｇ１＋の単離法と同様な方法でプラスミドを単離した。

これらのプラスミドを制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるｐ　Ｅ　ｔ　ｈ　ｒ　ｌと同一の構造を有する
ものがあることがわかった。このような形質転換株がコ
リネバクテリウム・グルタミクムに４１．ＣＦＥＲＭ−
Ｐｌ　１６１）、ブレビバクテリウム・フラバムに４２
　（ＦＥＲＭ−Ｐ）である。

コリネバクテリウム・グルタミクムに４０゜ブレビバク
テリウム・フラブムおよびそれらのｐＥｔｈｒｌ保有株
のし一インロイミン生産試験を行った。ＮＢ培地中で３
０℃、１６時間振盪培養した積項ｔＩｃ０．５ｍｌを生
産培地Ｐ２（ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０４　
２０ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ。

Ｍｇ５Ｏａ　・７Ｈ２０１ｇ、ＦｅＳＯ４Ｈ７Ｈ２０１
０＋ｎｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６０２０１０曙、ビオチン
１００μｇ、炭酸カルシウム３０ｇを水１βに含み、ｐ
　Ｈ７，２に調整した培地）の入った試験管に接種し、
３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養濾液をペ
ーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後
、比色定量してＬ−インロイシン生成量を測定した。

結果をり３１表に示す。

第　１　表コリネバクテリウム・グルタミクムに４０　１．２コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＫ　４１　２．７プレビ
バクテリウム・フラブム

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＥｔｈｒｌの制限酵素切断地図とそれの作製
工程を示す。破線で示したＢ　ｇ　ｊ！ＩＩ　／　Ｂａ
ｍＨＩは両制限酵素切断で生じる同一接着末端での連結
部位である。制限酵素切断地図作製に用いた制限酵素は
Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲＩおよびＸｈ。Ｉである。プラスミドの分子量はキロベース（Ｋｂ）で
表示されている。特β′「出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社手続補
正書（自発）昭和５８年９月２／４１１１、事件の表示昭和５８年特！′［願第１３８７．７５号２、発明の名
称Ｌ−イソロイシンの製造法３、補正をする右事件との関係　特許出願人郵便番号　１００住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社明ＩＩｗの発明の詳細
な説明の欄５、補正の内容１、　明細書第６頁２０行目「再連結反応した後、」を
「再連結反応し、」に訂正する。２、　明細書第７頁１９行目「ずかる酵素」を「あずか
る酵素」に訂正する。３、　明細書第１３頁最下行および同第１４頁７行目の
「フラバノ・」を「フラフ゛ム　八ＴＣＣ１４０６７ｊ
に訂正する。４、明細書第１３頁８行目のｒ（ＦＥＲＭ　Ｐ−）」を
１−（ＦＥＲＭ　１３ｒ’−３５５）Ｊに訂正する。５、明細Ｗ第１１Ｎ２２行目、同１８ＦＪ２３行目、同
２９頁５行目および同２９頁８行目の「フラブム」の後
に「八ＴＣＣ１４０６７Ｊを加入する。６、　明細店第３１頁９−１０行目の［フラバムに４２
　（ＦＥＲＭ　Ｐ−’）Ｊを［フラブムに４２　（ＦＩ
ＥＲＭ　ＢＰ−３５５）Ｊに訂正する。７、　明細書第３２頁第１表を次のとおり訂正する。第１表コリネバクテリウム・グルタミクムに４１　２．７プレ
ビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣＩ４０６１　０Ｇ、
添付書類の目録受　託　証　（写）　１通手続補正書昭和５９年８月ＩＱ日１、事件の表示昭和５８年特許願第１３８７７５号２、発明の名称Ｌ−イソロイシンの製造法３、補正をする者事件との関係　特許出願人郵便番号　１００住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置　：　０３−２０
１−７２１１．　内線２７５１）今一ば５、補正の内容（１）明細書第１３頁下から２行目のｒＰ−７１６０）
Ｊの後にｒ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４５５）Ｊを加入（３）
明細書第１３頁８行目のｒＴ４１Ｊガーゼ」の後に［（
宝酒造社製、４単位／μｌ）」を加入する。（４）明細書第１３１５行目の「Ｐ２」を削除する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　アスパラギン酸からスレオニンに到るスレオニ
ン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベク
ターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有せしめたコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
物を培地中に培養し、培養物中にＩ、−イソロイシンを
生成蓄積せしめ、該培養物からし一インロイシンを採取
することを特徴とするし一イソロイシンの製造法。
（２）該遺伝子が原核生物、真核生物、バクテリオファ
ージ、ウィルスまたはプラスミ゛ドに由来することを特
徴とする特許請求の範囲第１項の製造法。
（３）該原核生物がエソシェリヒア属、コリネバクテグ
ラム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテグラム属
、バチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッ
カス属またはセラチア属に属する細菌由来の遺伝子であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の製造法
。
（４）該ベクターが、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物に由来するベクターな
らびにその誘導体であることを特徴とする特ｆｒ　請求
の範囲第１項記載の製造法。
（５）　該ベクターがｐｃＧＩ、　ｐＣＧ２．ｐＣＧ４
゜ｐｃＧｌｌ、ｐＣＥ５４および、ｐＣＢｌｏｌがら選
ばれることを特徴とする特許請求の＠四節１項記載の製
造法。