DE3486188T2

DE3486188T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin.

Info

Publication number: DE3486188T2
Application number: DE89108172T
Authority: DE
Inventors: Masako Hara; Ryoichi Katsumata; Toru Mizukami; Tetsuo Oka; Akio Ozaki; Haruhiko Yokoi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-02-17
Filing date: 1984-02-16
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2004-02-17
Also published as: DE3484378D1; WO1984003301A1; EP0334391B1; DE3486229T2; EP0332233A1; EP0336452A1; EP0136359A4; AU2572184A; DE3486147D1; DE3486147T2; EP0334391A1; AU568340B2; EP0332233B1; EP0332234B1; DE3486232D1; DE3486232T2; EP0136359A1; DE3486229D1; EP0336452B1; EP0332234A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin durch ein neues Verfahren zur Expression eines Gens. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus mit einer rekombinanten DNA eines DNA-Fragments, das ein eine 3-Desoxy-2- keto-D-arabinose-heptulosonat-7-phosphat-Synthetase (hier nachstehend als DAHPase bezeichnet), Chorismat-Mutase (hier nachstehend als PDGase bezeichnet) und Prephenat- Dehydrogenase (hier nachstehend als CMase bezeichnet) codierendes Gen enthält, und einer Vector-DNA, die Züchtung der Transformante in einem Nährmedium, die Akkumulation des L- Tyrosins im Nährmedium und seine Gewinnung daraus.
Verfahren zur direkten Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung von Wildtypstämmen oder mutierten Stämmen, wie auxotrophen und gegenüber Aminosäure- Analogen resistenten Stämmen der zur Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Serratia und ähnlichen gehörenden Bakterien, sind bekannt.
Zum Beispiel die Herstellung von Histidin unter Verwendung eines gegen Histidin-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichung Nr. 8596/81), die Herstellung von Tryptophan unter Verwendung eines gegen Tryptophan-Anologe resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichungen mit den Nr. 4505/72 und 19037/76), die Herstellung von Isoleucin unter Verwendung eines gegen Isoleucin-Anologe resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichungen mit den Nr. 38995/72, 6237/76 und 32070/79) , die Herstellung von Phenylalanin unter Verwendung eines gegen Phenylalanin-Analoge resistenten Stammes (japanische Patentveröffentlichung Nr. 10035/81), die Herstellung von Tyrosin unter Verwendung eines für sein Wachstum Phenylalanin benötigenden oder gegen Tyrosin resistenten Stammes [Agr. Chem. Soc., Japan 50 (1) (1976), R79-R87], die Herstellung von Arginin unter Verwendung eines gegen L-Arginin-Anologe resistenten Stammes [Agr. Biol. Chem. 36 (1972), 1675-1684, japanische Patentveröffentlichungen mit den Nr. 37235/79 und 150381/82] und ähnliches ist bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von L-Tyrosin zum Zweck einer verbesserten L-Tyrosin- Produktivität durch rekombinante, sich von dem üblichen Mutationszüchtungsverfahren unterscheidende DNA-Technologie, unter Verwendung eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus.
Die hier genannten Erfinder konstruierten Plasmidvektoren, die in einem zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus zur autonomen Replikation befähigt sind und die selektierbare Marker und geeignete Clonierungsstellen aufweisen, und entwickelten ein sehr wirksames Transformationssystem (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldungen mit den Nr. 183799/82, 186492/82 und 186489/82). Die hier genannten Erfinder erkannten ferner den Nutzen der Plasmidvektoren zur Expression eines Fremdgens in einem Wirtsmikroorganismus und zur Erhöhung der Aminosäureproduktivität durch eine den Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie (Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press 1979, US-Patent Nr. 4,237,224) entsprechende Ligierung eines DNA-Fragmentes, das ein an der Biosynthese von Aminosäuren, zum Beispiel von Glutaminsäure und Lysin, beteiligtes Fremdgen enthielt, an die Plasmidvektoren und die Transformation von Corynebacterium glutamicum L-22 oder seiner Abkömmlinge unter Verwendung der von den hier genannten Erfindern entwickelten Transformationsverfahren (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 126789/83).
Die hier genannten Erfinder haben festgestellt, daß die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erzeugten Mikroorganismen eine erhöhte Tyrosin-Produktivität erwerben.
Es gibt keinen Bericht über ein Beispiel eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus, in dem ein gewünschtes Gen exprimiert und die Produktivität von L-Tyrosin erhöht wird, durch Einführung einer das gewünschte Gen und den Vektor, von denen eine(s)r für den Wirtsmikroorganismus fremd ist, enthaltenden rekombinanten DNA in einen solchen Wirtsmikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im einzelnen erläutert.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin durch Züchtung einer Transformante in einem Medium, die durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus mit einer rekombinanten DNA eines DNA- Fragments erhalten wird, das ein DAHPase, CMase und PDGase codierendes Gens enthält.
Bezüglich des DNA-Fragments, das das in der vorliegenden Erfindung verwendete Gen enthält, wird das DNA- Fragment verwendet, das ein DAHPase, CMase und PDGase codierendes Gen der vorliegenden Erfindung enthält, das von Eukaryoten, Prokaryoten, Viren, Bacteriophagen oder Plasmiden stammt. Bezüglich des von Prokaryoten stammenden Gens, wird vorzugsweise das Gen verwendet, das von einem zur Gattung Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus oder Serratia gehörenden Bakterium stammt und DAHPase, CMase und PDGase codiert, oder es wird vorzugsweise der die Biosynthese betreffende Metabolismus verwendet.
Bezüglich der am meisten bevorzugten Quelle für das Gen werden Aminosäure-erzeugende Stämme und Aminosäure- Analoge-resistente Stämme, die von den vorstehend beschriebenen Bakterien stammen, verwendet. Die Resistenz gegenüber Aminosäure-Analoge kann auf einem Plasmid nach seiner Clonierung übertragen werden.
Als Quelle für das Gen der vorliegenden Erfindung, das DAHPase, CMase und PDGase codiert, wird vorzugsweise Escherichia coli JA194 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 487-491] verwendet.
Der Stoffwechselweg und die Regulationssysteme von aromatischen Aminosäuren in Mikroorganismen sind bei Escherichia coli, Bacillus subtilis und Glutaminsäure-erzeugenden Mikroorganismen, zum Beispiel bei Stämmen der Gattung Corynebacterium und Brevibacterium [Agr. Chem. Soc. Japan, 50 (1) (1976), R79-R87, und Ann. Rev. Biochemistry 47 (1978), 533] detailliert untersucht worden. Das DAHPase, CMase und PDGase codierende Gen der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die eine genetische Information von mindestens einem der direkt oder indirekt an der Biosynthese dieser aromatischen Aminosäuren beteiligten Enzyme trägt. Es werden vorzugsweise die Gene verwendet, die die auf dem biosynthetischen Weg regulierten Enzyme codieren, d. h. die DAHPase, CMase, PDGase und Prätyrosin-Aminotransferase. Ferner sind die Gene von Stämmen verwendbar, die von einer a priori- oder a posteriori-Feedback-Hemmung und -Repression befreit sind.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor sollte in Zellen des Wirtsmikroorganismus autonom replizieren. Es werden vorzugsweise Plasmide beschrieben, die von den hier genannten Erfindern aus den zur Gattung Coryne-bacterium gehörenden Mikroorganismen isoliert wurden, oder Abkömmlinge davon, wie pCG1 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82), pCG2 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 35197/83), pCG4 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 183799/82), pCE51, pCE52 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83), pCE53 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 25398/83), pCE54, pCG11, pCB100 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 105999/83) und ähnliche.
Diese Plasmide tragende Mikroorganismen sind unter den nachstehend aufgeführten Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, und bei der American Type Culture Collection, USA, hinterlegt worden. Plasmid Ferm P-
Die Plasmide pCE51, 52, 53 und 54 können, wie nachstehend beschrieben, aus den vorstehend aufgeführten Plasmiden entwickelt werden.
pCE51 wird zum Beispiel wie nachstehend beschrieben hergestellt.
pCG1 wird aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (Ferm P-5865, ATCC 31808) durch das in der Beschreibung der japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82 beschriebene Verfahren isoliert. pGA22 wird durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen isoliert [An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400]. Das Plasmid pCG1 wird mit der Restriktionsendonuclease BglII linearisiert und ein mit BamHI gespaltenes und das Kanamycin-Resistenz-(KmR)-Gen enthaltende Fragment von pGA22 wird unter Verwendung der bei beiden Plasmiden gleichen überstehenden Enden an das linearisierte pCG1 ligiert. Die Isolierung von pCE51 aus dem ligierten DNA-Gemisch wird durch Selektion der Transformanten, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und die von pGA22 stammende KmR enthalten, und durch eine Analyse des Plasmids in der Transformante erreicht.
pCE51 weist ein Molekulargewicht von etwa 6 kb und Spaltstellen für HincII, HindIII, SmaI, XhoI und EcoRI auf und zeigt einen KmR-Phänotyp.
pCE52 und pCE53 werden, wie nachstehend beschrieben, hergestellt.
Das Plasmid pCG1 wird aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (FERM P-5865, ATCC 31808) durch das in der vorstehenden Anmeldung beschriebene Verfahren isoliert und das Plasmid pGA22 wird durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen isoliert. pCG1 mit einer einzigen BglII-Stelle wird mit dem Restriktionsenzyin BglII linearisiert und pGA22 mit zwei BamHI-Stellen mit BamHI partiell gespalten. Die überstehenden Enden beider Plasmide werden aneinandergelagert und zur Herstellung eines zusammengesetzten Moleküls mit T4-Phagen-DNA-Ligase ligiert. Die Selektion der rekombinanten Plasmide im Ligierungsgemisch erfolgt durch Isolierung der Transformanten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium aufgrund der von pGA22 stammenden Arzneimittelresistenzen und durch eine anschließende Analyse der Plasmide in den Transformanten.
pCE52 und pCE53 weisen ein Molekulargewicht von etwa 10,9 kb und Spaltstellen für EcoRI, SalI, SmaI und XhoI auf. Während pCE52 einen Phänotyp mit Chloramphenicolresistenz (CmR) und KmR zeigt, verleiht pCE53 einen Phänotyp mit Tetracyclinresistenz (TcR), cmR und KmR. Die Lage der Spaltstelle für XhoI im KmR-Gen ermöglicht eine Selektion durch Insertions-Inaktivierung (Verhinderung der Genexpression durch Insertion eines DNA-Fragmentes in das Gen).
Die Transformation durch das ligierte DNA-Gemisch wird unter Verwendung von Protoplasten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium und den in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 186492/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Mit Ausnahme des durch Insertion inaktivierten Gens werden die Gene, die die von pGA22 stammende Arzneimittelresistenz verleihen, zur Selektion verwendet. Im System ohne DNA-Zusatz werden die Transformanten als Kolonie gewonnen, die auf einem hypertonischen, üblicherweise 0,4-1,6 ug/ml Tc, 2,5-5 ug/ml Cm, 100-800 ug/ml Km, 100-400 ug/ml Sm oder 200-1000 ug/ml Spec enthaltenden Agarmedium regeneriert wird, das den nicht mit dem Ligierungsgemisch behandelten Empfänger-Protoplasten die Reversion in normale Zellen nicht gestattet. In einer anderen Ausführungsform werden Transformanten auf einem Regenerationsmedium nicht-selektiv regeneriert und die erhaltenen Zellen abgeschabt und resuspendiert, worauf anschließend diejenigen Zellen isoliert werden, die auf einem Agarmedium wachsen, das ein Arzneimittel in einer Konzentration enthält, bei der die normalen Zellen des Empfängers nicht wachsen können, das heißt 0,5-4 ug/ml Tc, 2-15 ug/ml Cm, 2-25 ug/ml Km, 5-50 ug/ml Sm oder 50-500 ug/ml spec. Einige der mit TcR, CmR oder KmR selektierten Transformanten sind gleichzeitig mit weiteren, vom Plasmid pGA22 stammenden Arzneimittelresistenzen ausgestattet.
Die Plasmid-DNA kann nach den in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 134500/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren aus den gezüchteten Zellen der Transformanten isoliert und gereinigt werden. Die Strukturen der DNA-Moleküle können durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen und Analyse der DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Die aus den Transformanten isolierten Plasmide sind pCE51, pCE52 und pCE53. Die Gewinnung der Plasmide aus den Stämmen wird nach den in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 134500/82, 183799/82 und 35197/83 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Herstellung einer rekombinanten DNA von einer Vektor-DNA mit einem ein Gen enthaltenden DNA-Fragment wird durch die übliche Technik der In vitro-DNA-Rekombination durchgeführt.
Die Technik der In vitro-DNA-Rekombination wird durch Spaltung und Ligierung einer ein gewünschtes Gen enthaltenden Donor-DNA an eine Vektor-DNA durchgeführt (vgl. die japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83 und Nr. USP 4,237,224)
Die Ligasereaktion liefert rekombinante Moleküle, die andere Gene als das gewünschte Gen enthalten. Die gewünschte rekombinante DNA kann erhalten werden durch direkte Transformation eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium mit dem ligierten DNA-Gemisch, Selektion der Transformanten, die den vom gewünschten Gen stammenden Phänotyp aufweisen, und Isolierung der gewünschten rekombinanten DNA aus den gezüchteten Zellen der Transformanten. Anstelle der direkten Clonierung des gewünschten Gens in einen Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium kann das gewünschte Gen durch Verwendung eines anderen Wirt-Vektor-Systems, zum Beispiel Escherichia coli, cloniert werden. Es wird dann in einen Vektor der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium zur Transformation dieser Mikroorganismen in vitro umcloniert, und die das gewünschte rekombinante Plasmid enthaltenden Transformanten werden, wie vorstehend beschrieben, selektiert.
Das Verfahren zur Clonierung eines Gens in den Wirtsmikroorganismus Escherichia coli wird, zum Beispiel in Methods in Enzymology 68 (1979), Ray Wu (Hrsg.), Academic Press, New York beschrieben.
Die nachstehend angegebenen Verweise sind bei der Konstruktion rekombinanter DNA hilfreich:
Cohen, S. N. et al., USP Nr. 4,237,224;
Idenshi Sosa Jikkenho, herausgegeben von Yasuyuki Takagi, gedruckt von Kodansha Scientific (1980);
Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press, 1979;
Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83.
In der vorliegenden Erfindung können Mikroorganismen, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und zur Aufnahme von DNA-Molekülen kompetent sind, als Wirtsmikroorganismen verwendet werden. Nachstehend sind Beispiele geeigneter Wirtsmikroorganismen aufgeführt. Hinterlegungsnummer Ferm P- Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium lilium Brevibacterium divaricatum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilium Brevibacterium thiogenitalis
Die Transformation der Wirtsmikroorganismen mit rekombinanten DNA-Molekülen wird in den nachstehend beschriebenen Schritten durchgeführt:
1) Herstellung von Protoplasten aus gezüchteten Zellen;
2) Transformation der Protoplasten mit einer rekombinanten DNA;
3) Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und Selektion einer Transformante.
Diese Schritte sind nachstehend im einzelnen beschrieben.

1. Herstellung von Protoplasten aus gezüchteten Zellen

Die Herstellung von Protoplasten wird durch Züchtung eines Mikroorganismus unter Bedingungen, die eine Empfindlichkeit gegen Lysozym, einem lytischen Enzym, erzeugen und durch Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym zur Entfernung der Zellwände in einer hypertonischen Lösung durchgeführt. Zur Erzeugung Lysozym-empfindlicher mikrobieller Zellen werden die Synthese bakterieller Zellwände verhindernde Reagenzien verwendet. Lysozym-empfindliche mikrobielle Zellen werden zum Beispiel durch eine während der logarithmischen Wachstumsphase zugesetzte, das Wachstum nicht verhindernde oder behindernde Menge Penicillin und durch eine nachfolgende, über mehrere Generationen fortgesetzte Züchtung erhalten.
Zur Züchtung kann jedes Medium, in dem der Mikroorganismus wachsen kann, verwendet werden. Es werden zum Beispiel Nährmedium NB (pH-Wert 7,2) verwendet, das aus 20 g/l pulverförmiger Bouillon und 5 g/l Hefeextrakt besteht, und halbsynthetisches Medium SSM (pH-Wert 7,2), das aus 10 g/l Glucose, 4 g/l NH&sub4;Cl, 2 g/l Harnstoff, 1 g/l Hefeextrakt, l g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,4 g/l MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,2 mg/l MnSO&sub4; · (4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7; · 10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin und 1 mg/l Thiaminhydrochlorid besteht.
Das Medium wird mit mikrobiellen Zellen geimpft und die Züchtung unter Schütteln durchgeführt.
Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums bei 660 nm wird mit einem Colorimeter überwacht und Penicillin, zum Beispiel Penicillin G, im Anfangsstadium der logarithmischen Wachstumsphase (OD: 0,1-0,4) in einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 E/ml zugesetzt. Die Züchtung wird bis zu einem OD- Wert von 0,3-0,5 fortgesetzt, anschließend werden die Zellen geerntet und mit SSM-Medium gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in einem geeigneten hypertonischen Medium resuspendiert, wie PFM-Medium (pH-Wert 7,0-8,5), bei dem 0,4 M Saccharose und 0,01 M MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O einem zweifach verdünnten SSM-Medium zugesetzt werden, RCG-Medium (pH-Wert 7,0- 8,5), das aus 5 g/l Glucose, 5 g/l Caseinhydrolysat, 2,5 g/l Hefeextrakt, 3,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1,6 g/l KH&sub2;PO&sub4;&sub1; 0,41 g/l Mgcl&sub2; · 6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 2 mg/l MnSO&sub4; · (4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7; · 10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin, 2 mg/l Thiaminhydrochlorid und 135 g/l Natriumsuccinat besteht, oder RCGP-Medium, das aus RCG-Medium und 3% Polyvinylpyrrolidon besteht. Der Zusatz von Lysozym zur Zellsuspension erfolgt bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 10 mg/ml, und man läßt das Gemisch sich bei einer Temperatur von 30 bis 37ºC umsetzen. Die Bildung der Protoplasten entwickelt sich mit der Zeit und wird mit einem optischen Mikroskop überwacht. Der zur Umwandlung der meisten Zellen in Protoplasten erforderliche Zeitraum hängt von den Konzentrationen des zur Lysozym-Sensibilisierung verwendeten Penicillins und der verwendeten Lysozymmenge ab. Der Zeitraum beträgt unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen 3-24 Stunden.
Da die gebildeten Protoplasten unter hypotonischen Bedingungen zerstört werden, wird die Menge der gebildeten Protoplasten indirekt aus der Zahl der die hypotonischen Bedingungen überlebenden normalen Zellen bestimmt. Üblicherweise hält man das Verhältnis der überlebenden normalen Zellen unterhalb von 10&supmin;&sup4; pro Lysozym-behandelter normaler Zelle.
Die vorstehend hergestellten Protoplasten sind auf einem geeigneten hypertonischen Agarmedium fähig, Kolonien zu bilden (zu regenerieren). Als Agarmedium wird vorzugsweise ein Nährmedium, ein halbsynthetisches Medium oder ein verschiedene Aminosäuren enthaltendes synthetisches Medium verwendet, das 0,3 bis 0,8 M Natriumsuccinat und 0,5 bis 6% Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 10000 oder 40000 enthält. Üblicherweise wird halbsynthetisches RCGP-Medium (pH-Wert 7,2), bei dem 1,4% Agar zum RCGP-Agarmedium zugesetzt werden, verwendet. Die Regeneration wird bei einer Temperatur von 25 bis 35ºC durchgeführt. Die zur Regeneration von Protoplasten erforderliche Züchtungszeit hängt vom verwendeten Stamm ab, und Kolonien können üblicherweise nach 10 bis 14 Tagen entnommen werden. Die Wirksamkeit der Regeneration von Protoplasten auf RCGP-Medium hängt auch von dem verwendeten Stamm, den während der Züchtung zugesetzten Penicillin-Konzentrationen und der verwendeten Lysozym-Konzentration ab. Die Wirksamkeit liegt üblicherweise bei 10&supmin;² - 10&supmin;&sup4; Zellen pro normaler, mit Lysozym behandelter Zelle.

2. Transformation der Protoplasten mit einer rekombinanten DNA

Die Einführung einer rekombinanten DNA in den Protoplasten wird durch Mischung des Protoplasten und der DNA in einer die Protoplasten schützenden hypertonischen Lösung und durch Zusatz von Polyethylenglycol (PEG, durchschnittliches Molekulargewicht: 1540-6000) oder Polyvinylalkohol (PVA, Polymerisationsgrad: 500-1500) und einem zweiwertigen Metallkation, das die Aufnahme von DNA stimuliert, zu dem Gemisch durchgeführt. Üblicherweise zum Schutz der Protoplasten von anderen Mikroorganismen verwendete Wirkstoffe zur Stabilisierung der hypertonischen Bedingungen, wie Saccharose und Natriumsuccinat, werden auch verwendet. PEG und PVA können in einer Endkonzentration von 5 bis 60% bzw. 1 bis 20% verwendet werden. Zweiwertige Metallkationen, wie Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus;, Ba&spplus;&spplus; und Sr&spplus;&spplus;, werden separat oder kombiniert bei einer Endkonzentration von 1 bis 100 mM wirksam verwendet. Die Transformation wird zufriedenstellend bei 0 bis 25ºC durchgeführt.

3. Die Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und die Selektion einer Transformante

Die Regeneration des mit einer rekombinanten DNA transformierten Protoplasten wird in derselben, vorstehend beschriebenen Weise durch Verteilung des Protoplasten auf einem hypertonischen Agarmedium, wie Natriumsuccinat und Polyvinylpyrrolidon enthaltendem RCGP-Medium, und Inkubation bei einer für das Wachstum normaler Zellen erforderlichen Temperatur, üblicherweise bei 25 bis 35ºC, durchgeführt. Transformanten werden durch Selektion der von Donor-DNA- Molekülen stammenden Phänotypen erhalten. Die Selektion auf einen verliehenen charakteristischen Phänotyp kann gleichzeitig mit der Regeneration auf einem hypertonischen Agarmedium oder auf einem hypotonischen Agarmedium nach einer nicht-selektiven Reversion in normale Zellen auf einem hypertonischen Agarmedium durchgeführt werden.
Bei Verwendung der als bevorzugte Wirtsmikroorganismen beschriebenen Lysozym-empfindlichen Stämme kann die Transformation nach den unter (1) bis (3) beschriebenen Schritten durchgeführt werden, außer daß die direkte Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym ohne eine vorherige Behandlung mit Penicillin in Schritt (1) erfolgt. Unter diesen Umständen werden Transformanten mit einer Effizienz von 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup4; pro regenerierter Zelle erhalten.
Die nachstehend beschriebenen Stämme sind Beispiele für Transformanten, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden.

Tyrosin-produzierende Stämme

Corynebacterium glutamicum K44, FERM P-7163

Corynebacterium glutamicum K45, FERM P-7164

Die Expression des Phänotyps der rekombinanten DNA wird durch Züchtung der Transformanten in einem üblichen Nährmedium durchgeführt. Geeignete Reagenzien können, entsprechend dem von der Gen- oder Vektor-DNA auf der rekombinanten DNA erwarteten Phänotyp, dem Medium zugesetzt werden.
Die so erhaltene Transformante wird in einer üblichen, bei der Produktion von Aminosäuren durch Fermentation verwendeten Weise gezüchtet. Das heißt, die Transformante wird in einem üblichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Stoffe, Aminosäuren, Vitamine etc. enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer eingestellten Temperatur und einem eingestellten pH- Wert gezüchtet. Die so im Medium angereicherten Aminosäuren werden gewonnen.
Als Kohlenstoffquelle können verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse, Polyalkohole und verschiedene organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden. Entsprechend der Assimilationsfähigkeit des verwendeten Mikroorganismenstammes werden Kohlehydrate und Alkohole verwendet. Am meisten bevorzugt wird Restmelasse verwendet.
Als Stickstoffquellen sind Ammoniak, verschiedene anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff und stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder seine Aufschlußprodukte, entfettete Sojabohnen oder ihre Aufschlußprodukte und Chrysalishydrolysat geeignet.
Als anorganische Stoffe können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat verwendet werden. Der Zusatz der für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Vitamine und Aminosäuren kann unterbleiben, sofern sie mit den anderen, vorstehend beschriebenen Komponenten zugesetzt werden.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei geschüttelt oder unter Luftzufuhr gerührt wird. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 20 bis 40ºC. Der pH-Wert des Mediums wird bei der Züchtung etwa auf dem Neutralpunkt gehalten. Die Züchtung wird bis zur Anreicherung einer beträchtlichen Menge einer Aminosäure fortgesetzt, üblicherweise 1 bis 5 Tage.
Nach Abschluß der Züchtung werden die Zellen entfernt und die Aminosäure wird in üblicher Weise, zum Beispiel durch Behandlung mit Aktivkohle oder Ionenaustauscherharz aus der Kulturflüssigkeit gewonnen.
Trotz ihrer sehr ähnlichen microbiologischen Eigenschaften werden sogenannte Glutaminsäure-produzierende Mikroorganismen, die Glutaminsäure in großen Mengen produzieren- wahrscheinlich aufgrund ihrer industriellen Bedeutung in verschiedene Arten und sogar in verschiedene Gattungen, wie Corynebakterium und Brevibakterium eingeteilt. Es ist jedoch darauf hingewiesen worden, daß diese Mikroorganismen aufgrund der beinahe gleichen Aminosäurezusammensetzung in der Zellwand und der Basenzusammensetzung der DNA-Moleküle zu einer Art gehören sollten. Es ist vor kurzem berichtet worden, daß diese Mikroorganismen bei der DNA-DNA- Hybridisierung mindestens zu 70 bis 80% homolog sind, ein Hinweis auf die enge Verwandtschaft dieser Mikroorganismen. Vgl. z. B. Komatsu, Y., Report of the Fermentation Research Institute 55 (1980), 1, und Suzuki, K., Kaneko, T. und Komagata, K., Int. J. Syst. Bacteriol. 31 (1981), 131.
Unter Berücksichtigung der vorstehend beschriebenen Tatsachen liegt die Vermutung nahe, daß der Nutzen der vorliegenden Erfindung für sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen gilt. Für den stabilen Erhalt der rekombinanten DNA-Moleküle und die Expression der DNA in diesen Arten können geringfügig unterschiedliche Eigenschaften der Wirtsmikroorganismen wie DNA-Homologie vernachlässigt werden, und es genügt, daß die Wirtsmikroorganismen die autonome Replikation von Plasmiden und die Expression der darauf enthaltenen Gene ermöglichen. Diese Fähigkeit der Mikroorganismen geht aus der Tatsache hervor, daß das aus Corynebacterium glutamicum 225-250 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 183799/82) isolierte und ein Streptomycin- und/oder Spectinomycin-Resistenzgen aufweisende Plasmid pCG4 in Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, die zum Beispiel zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, repliziert und das für die Resistenz verantwortliche Gen exprimiert werden konnte (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 186492/82). Ferner ist es nach der in der Stammanmeldung dieser Anmeldung, auf die das Europäische Patent Nr. 136 359 erteilt wurde, beschriebenen Histidin- Produktion klar, daß der in Corynebacterium glutamicum exprimierte Gen in einem breiten Spektrum von Wirtsmikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium und ähnlichen exprimiert werden kann. Daher sind sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, einschließlich der zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, sowie die zur Art Corynebacterium glutamicum gehörigen, als Wirtsmikroorganismen der vorliegenden Erfindung geeignet.
Für die Stämme, die in der vorliegenden Beschreibung erscheinen, lauten die Hinterlegungsnummern, das Hinterlegungsdatum und das Transferdatum der Hinterlegungen gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren, wie nachstehend angegeben. Hinterlegungsnummer Ferm P (Transferdatum) Tag/Monat/Jahr Corynebacterium glutamicum Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium herculis
Fig. 1 stellt eine Restriktionskartierung des Plasmids pEaroF-1 mit Restriktionsendonucleasen dar.
Fig. 2 stellt eine Restriktionskartierung des Plasmids pKmlaroF1 mit Restriktionsendonucleasen dar.
Die horizontalen Pfeile in den Fig. 1 und 2 zeigen die Richtung der Gen-Transkription.

Beispiel 1

Herstellung von Tyrosin

(1) Herstellung der chromosomalen und Plasmid-DNA

Die chromosomale DNA von Escherichia coli JA194 [Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1977), 487-491] wurde durch das nachstehend beschriebene Verfahren hergestellt.
Eine Saatkultur wurde in 400 ml LB (pH-Wert 7,0, dasselbe LB wurde hier nachstehend verwendet) geimpft. Die Züchtung erfolgte unter Schütteln bei 37ºC und wurde bis zu einem späten Stadium der logarithmischen Wachstumsphase fortgesetzt. Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe geerntet, und durch das Verfahren von Saito et al. hochmolekulare chromosomale DNA-Moleküle aus den Zellen isoliert.
Das als Vektor verwendete pBR322 wurde gesondert davon durch das nachstehend beschriebene Verfahren aus den gezüchteten, pBR322-tragenden Zellen von Escherichia coli JA194 hergestellt.
Der Stamm wurde unter Schütteln bei 37ºC in 400 ml 100 ug/ml Ampicillin enthaltendem LB bis zu einem späten Stadium der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe geerntet und durch das Verfahren von Tanaka et al. lysiert [J. Bacteriol. 121 (1975), 354-362].
Das gesamte Lysat wurde 1 Stunde bei 4ºC mit 28000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen und ein fünftel des Volumens an wäßriger 50% (Gew.-V) Polyethylenglycol (PEG) 6000-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde langsam gerührt und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die gebildeten' Niederschläge wurden durch eine 5-minütige Zentrifugation mit 3000 Upm bei 4ºC gesammelt und in 5 ml einer aus 10 mM Tris und 1 mM EDTA · Na&sub2; bestehenden TE-Pufferlösung (pH-Wert 7,5) gelöst (die gleiche TE-Pufferlösung wurde hier nachstehend verwendet). Anschließend wurden 1,0 ml 1,5 mg/ml Ethidiumbromid und TE- Pufferlösung zum Gesamtvolumen von 7,5 ml zugesetzt. 7,875 g Cäsiumchlorid wurden dem Gemisch zugesetzt und vollständig gelöst. Die Lösung wurde 40 Stunden bei 20ºC mit 105000 · g zentrifugiert. Eine unter UV-Strahlung nachgewiesene Plasmid-Bande wurde mit einem Injektor entnommen. Ethidiumbromid wurde dreimal mit 15% (V/V) TE-Pufferlösung enthaltendem Isopropanol extrahiert. Der Rückstand wurde bei 4ºC über Nacht gegen TE-Pufferlösung dialysiert und als Plasmid-DNA verwendet.

(2) Clonierung eines das DAHPase, CMase und PDGase codierende Gen enthaltenden DNA-Fragments

In diesem Schritt wurden jeweils 5 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII zu 100 ul einer 3 ug der vorstehend hergestellten pBR322-Plasmid-DNA enthaltenden HindIII-Reaktionslösung gegeben, und 5 Einheiten EcoRI bzw. HindIII wurden zu 100 ul einer 9 ug der chromosomalen DNA enthaltenden Reaktionslösung des Restriktionsenzyms HindIII. Die Gemische ließ man jeweils 60 Minuten bei 37ºC reagieren, und zum Abbruch der Umsetzung wurde 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Beide Gemische wurden miteinander vermischt. Anschließend wurden 40 ul T4-Ligase-Pufferlösung II, 40 ul 5 mM ATP, 0,4 ul T4-Ligase und 120 ul H&sub2;O zugesetzt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei 12ºC umgesetzt.
Das vorstehend beschriebene Ligations-Gemisch wurde zur nachstehend beschriebenen Transformation bereitgestellt. Als Empfänger der Transformation wurden der DAHPase-defiziente Escherichia coli-Stamm AB3248 [J. Bact. 93 (1967), 237- 244) oder der tyrA-Gen (CMase)- und PDGase-defiziente Escherichia coli-Stamm AT2273 [J. Bact. 91 (1966), 1494) verwendet. Die Saatkultur des Stamms wurde in LB-Medium geimpft, und kompetente Zellen nach dem Verfahren von M. Dagert [Gene 6 (1979), 23-28] hergestellt.
Fünfzig Microliter des Ligierungsgemisches wurden 0,2 ml einer 10&sup9;/ml kompetente Zellen enthaltenden Lösung zugesetzt, und die Kultur wurde 10 Minuten unter Eiskühlung stehen gelassen. Nach einer 5-minütigen Erhitzung auf 37ºC wurden 2 ml LB zugesetzt, worauf man sie 90 bis 120 Minuten bei 37ºC stehenließ. Die Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zweimal zentrifugiert. Die Zellen wurden auf einem M9-Plattenmedium (pH-Wert 7,0) verteilt, das aus 1 g/l NH&sub4;Cl, 6 g/l Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 5 g/l NaCl, 0,1 g/l MgSO&sub4; · 7 /H&sub2;O, 0,015 g/l CaCl&sub2; · 2 H&sub2;O, 3 g/l Glucose, 4 mg/l Vitamin B1 und 15 g/l Agar bestand [J. Bact. 121 (1975), 354-362, das gleiche M9-Plattenmedium wurde hier nachstehend verwendet] und jeweils 50 ug/ml Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthielt. Die auf dem M9- Plattenmedium gezüchteten Kolonien wurden auf 100 ug/ml Ampicillin bzw. 20 ug/ml Tetracyclin enthaltendem LB-Plattenmedium ausplattiert. Es wurden die Kolonien selektiert, die auf Ampicillin-enthaltendem Medium, jedoch nicht auf Tetracyclin-enthaltendem Medium wuchsen. Plasmid-DNA-Moleküle wurden durch dasselbe Verfahren, wie vorstehend beschrieben, aus den so selektierten Transformanten isoliert, die auf Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthaltendem M9-Plattenmedium wuchsen und Ampicillin-resistent und Tetracyclin-empfindlich waren. Das aus einer der Transformanten isolierte Plasmid pEaroF1 wurde mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte, daß ein EcoRI-HindIII-gespaltenes DNA-Fragment von etwa 4,2 kb in das größere EcoRI-HindIII-gespaltene Fragment von pBR322 inseriert worden war.
Escherichia coli AB3248 und Escherichia coli AT2273 wurden durch dasselbe Verfahren, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung des vorstehend erhaltenen pEaroF1 transformiert. Beide Transformanten wuchsen auf Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthaltendem M9-Medium und waren gleichzeitig Ampicillin-resistent. Dies zeigte, daß die Transformanten die gleichen Plasmide wie pEaroF1 aufwiesen.
Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigten, daß die DAHPase, CMase und PDGase codierenden Gene auf dem in pEaroF1 clonierten DNA-Fragment von etwa 4,2 kb liegen.
Ferner wurde pEaroF1, das, wie in Fig. 1 dargestellt, Spaltstellen für verschiedene Restriktionsendonucleasen, zum Beispiel EcoRI, BamHI, HindIII und ähnliche aufweist, mit dem von G. Zurawski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 4271 beschriebenen Plasmid pKB45 verglichen, um zu zeigen, daß das DNA-Fragment von etwa 4,2 kb in pEaroF1 aroF-, tyrA- und pheA-Gene von Escherchia coli trägt.

(3) Subclonierung des aroFtyrA-Gens

Ein das aroFtyrA-Gen enthaltendes DNA-Fragment wurde aus der vorstehend hergestellten Plasmid pEaroF1-DNA gewonnen und an pCE51 ligiert, das ein Shuttle-Vektor für Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum ist.
pCE51 ist ein rekombinantes Plasmid, in dem das Plasmid pCG1 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82) von Corynebacterium glutamicum mit dem Plasmid pGA22 von Escherichia coli [vgl. An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400] ligiert ist. Die Ligierung wird unter Verwendung derselben überstehenden Enden des BglII-gespaltenen pcG1 und des BamHI-Fragments von pGA22, das das Kanamycin-Resistenzgen enthält, durchgeführt.
pCE51 wird zweckmäßigerweise durch das in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 105999/83 und 126789/83 beschriebene Verfahren hergestellt.
Fünf Einheiten HincII wurden 100 ul HincII- Reaktionslösung, die aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 7 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl bestand und 3 ug Plasmid-pEaroF1-DNA enthielt, zugesetzt, und die Reaktion wurde 60 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Dreizehntel Einheiten HincII wurden 100 ul HincII-Reaktionslösung zugesetzt, die 3 ug der durch dasselbe vorstehend beschriebene Verfahren aus dem pCE51-tragenden Escherichia coli-Stamm JA194 hergestellten PlasmidpCE51-DNA enthielt, und die Umsetzung wurde zur Spaltung von pCE51 an einer von zwei HincII-Spaltstellen 60 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Beide Reaktionsgemische wurden miteinander gemischt und 40 ul T4-Ligase-Pufferlösung II, 40 ul 5 mM ATP, 0,4 ul T4-Ligase und 120 ul Wasser zugesetzt. Man ließ sich das Gemisch 16 Stunden bei 12ºC umsetzen, und die Umsetzung wurde durch 10-minütige Erwärmung auf 65ºC gestoppt.
Das Ligierungsgemisch wurde zur nachstehend beschriebenen Transformation bereitgestellt. Als Empfänger der Transformation wurde der Escherichia coli-Stamm AB3248 verwendet. Die Transformation wurde zum Erhalt von Kolonien, die auf Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthaltendem M9-Plattenmedium wuchsen, durch dasselbe Verfahren, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Kolonien, die auf 20 ug/ml Kanamycin enthaltendem LB-Plattenmedium wuchsen, wurden aus den vorstehend erhaltenen Kolonien selektiert.
Plasmid-DNA-Moleküle wurden durch dasselbe Verfahren, wie vorstehend beschrieben, aus den Transformanten isoliert, die auf Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthaltendem M9-Plattenmedium wuchsen und Kanamycin-resistent waren. Das aus einem der Transformanten erhaltene Plasmid pKmlaroF1 wurde mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte, daß ein HincII-gespaltenes DNA-Fragment von etwa 3,8 kb, das aroFtyrA von pEaroF1 trug, in eine der zwei HincII-Spaltstellen von pCE51 inseriert war.
Das vorstehend erhaltene Plasmid pKmlaroF1 weist das in Fig. 2 dargestellte Restriktionsmuster auf.

(4) Herstellung von Tyrosin- und Tyrosin-Analoge-resistentem Plasmid pKmlaroF1-m-18 von einem pKmlaroF1-tragenden Stamm

Der pKmlaroF1-tragende Stamm AB3248 wurde auf 20 ug/ml Kanamycin enthaltendem LB-Medium bis zu einem späten Stadium der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 50 mM Tris- Malat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) zweimal gewaschen und mit 400 ug/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in 50 mM Tris- Malat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die behandelten Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit 50 mM Tris-Malat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden auf 20 ug/ml Kanamycin enthaltendem LB-Medium 16 Stunden bei 30ºC gezüchtet, und die Plasmid-DNA-Moleküle durch dasselbe Verfahren, wie vorstehend beschrieben, isoliert.
Escherichia coli AB3248 wurde unter Verwendung der isolierten Plasmide transformiert. Die Selektion der Transformanten wurde auf 0,25 mg/ml Tyrosin und jeweils 50 ug/ml Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthaltendem M9-Plattenmedium durchgeführt. Die Kolonien, die auf 0,25 mg/ml Tyrosin und jeweils 50 ug/ml Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthaltendem M9-Plattenmedium und auf 20 ug/ml Kanamycin enthaltendem LB-Plattenmedium wuchsen, selektierte man aus den entwickelten Kolonien.
Die so erhaltenen Kolonien waren gegen 3-Aminotyrosin (3AT), einem Tyrosin-Analogen (Produkt der Shigma Co.), resistent, da sie auf M9-Plattenmedium wachsen konnten, das 0,2 mg/ml 3AT und jeweils 50 ug/ml Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthielt.
Die von den so hergestellten Transformanten erhaltenen Plasmide können eine Tyrosin- oder Tyrosin-Analoge-Resistenz auf einen Mikroorganismus übertragen. Der eines solcher Plasmide, pKmlaroF-m-18, tragende Escherichia coli- Stamm AB3248 konnte auf M9-Plattenmedium wachsen, das 1 mg/ml Tyrosin oder 0,5 mg/ml 3AT und jeweils 50 ug/ml Histidin, Prolin, Arginin, Isoleucin und Valin enthielt.

(5) Transformation von Corynebacterium glutamicum K43 mit pKmlaroF1 und pKmlaroF1-m-18

Eine Saatkultur von Corynebacterium glutamicum K43 (FERM P-7162, FERM BP-457) wurde auf ein halbsynthetisches, 50 ug/ml Phenylalanin enthaltendes Medium SSM überimpft und die Züchtung bei 30ºC unter Schütteln durchgeführt. NB- Medium wurde zur Saatkultur verwendet. Die optische Dichte (OD) bei 660 nm wurde mit einem Tokyo Koden-Colorimeter überprüft und bei einem OD-Wert von 0,2 Penicillin G bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Einheiten/ml zur Brühe zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD-Wert von etwa 0,6 fortgesetzt.
Die Zellen wurden bei einem OD-Wert von 0,6 geerntet. Die Zellen wurden mit etwa 10&sup9; Zellen/ml in einem 1 mg/ml Lysozym enthaltenden RCGP-Medium suspendiert. Die Suspension wurde in ein L-Röhrchen gegeben und zur Herstellung von Protoplasten 5 Stunden bei 30ºC langsam geschüttelt. Anschließend wurden 0,5 ml der Protoplastensuspension in ein kleines Röhrchen gegeben und 5 Minuten bei 2500 · g zentrifugiert. Die Protoplasten wurden in 1 ml TSMC-Puffer resuspendiert und anschließend erneut zentrifugiert und gewaschen. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC- Pufferlösung resuspendiert. Der Protoplasten-Suspension wurden einhundert Microliter eines Gemisches (1 : 1 nach Volumen) aus zweifach konzentriertem TSMC-Puffer und dem vorstehend beschriebenen, ligierten DNA-Gemisch zugesetzt. Anschließend wurden 0,8 ml einer Lösung, die 20% PEG 6000 in TSMC- Pufferlösung enthielt, dem Gemisch zugesetzt. Die Plasmid- DNA-Moleküle pKmlaroF1 und pKmlaroF1-m-18 wurden, wie vorstehend beschrieben, aus diese Plasmide tragenden Escherichia coli AB3248 hergestellt. Nach 3 Minuten wurden 2 ml RCGP-Medium (pH-Wert 7,2) zugesetzt, und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 2500 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, und die ausgefällten Protoplasten wurden in 1 ml RCGP-Medium suspendiert. Anschließend wurden 0,2 ml der Suspension auf 200 ug/ml Kanamycin enthaltendem RCGP-Agarmedium verteilt und 7 Tage bei 30ºC inkubiert. Kanamycin-resistente Kolonien wurden auf einer Selektionsplatte gezüchtet.

(6) Produktion von Tyrosin durch die Transformante

Die so erhaltenen, pKmlaroF1 und pKmlaroF1-m-18 tragenden Transformanten sind als Corynebacterium glutamicum K44 (FERM P-7163, FERM BP-458) bzw. Corynebacterium glutamicum K45 (FERM P-7164, FERM BP-460) beim Fermentation Research Institute hinterlegt worden.
Die L-Tyrosin-Produktion durch pKmlaroF1 und pKmlaroF1-m-18 tragende Stämme wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt.
Der Stamm wurde 16 Stunden bei 30ºC in wäßrigem NB- Medium gezüchtet, und 0,5 ml der Kulturbrühe wurden in 5 ml eines 0,25% NZ-Amin enthaltenden P4-Produktionsmediums (pH- Wert 7,2), bestehend aus 100 g/l Melasse, 20 g/l (NH4)2SO4, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,25 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 20 g/l CaCO&sub3;&sub1; überimpft. Die Züchtung wurde 96 Stunden bei 30ºC durchgeführt.
Nach der Züchtung wurde der Brühe eine 6 N NaOH- Lösung zu einer Konzentration von 50 ul/ml zugesetzt, und das Gemisch zur vollständigen Auflösung des Tyrosin-Niederschlags 5 Minuten auf 65ºC erwärmt. Mit dem Kulturfiltrat wurden eine Papierchromatographie und eine Farbreaktion mit Ninhydrin durchgeführt, und die Menge an erzeugtem L-Tyrosin wurde kolorimetrisch bestimmt. Als Kontrolle wurde Corynebacterium glutamicum K43 in ähnlicher Weise behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.

Tabelle I

Stamm Menge an L-Tyrosin (mg/ml)
Corynebacterium glutamicum K43 4,8
Corynebacterium glutamicum K44 5,3
Corynebacterium glutamicum K45 7,7.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin, bei dem man in einem Medium einen Mikroorganismus züchtet, der durch das Transformieren eines zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus mit einer rekombinanten DNA erhältlich ist, wobei ein DNA-Fragment, das ein 3-Desoxy-2-keto-D-arabino-heptulosonat-7- phosphat-Synthase, Chorismat-Mutase und Prephenat- Dehydrogenase codierendes Gen enthält, in eine Vektor-DNA inseriert wird, L-Tyrosin in der Kultur ansammelt und L- Tyrosin daraus gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA das Plasmid pkmlaroF1 (FERM BP-458) oder das Plasmid pkmlaroF1-m-18 (FERM BP-460) ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum K44, FERM BP-458 oder Corynebacterium glutamicum K45 FEPM BP-460 ist.

4. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum K44, FERM BP-458 oder Corynebacterium glutamicum K45, FERM BP-460.